SE462166B - TOXICITY TEST WITH LUMINESCENTA BACTERIA - Google Patents
TOXICITY TEST WITH LUMINESCENTA BACTERIAInfo
- Publication number
- SE462166B SE462166B SE7810154A SE7810154A SE462166B SE 462166 B SE462166 B SE 462166B SE 7810154 A SE7810154 A SE 7810154A SE 7810154 A SE7810154 A SE 7810154A SE 462166 B SE462166 B SE 462166B
- Authority
- SE
- Sweden
- Prior art keywords
- amount
- suspension
- light emitted
- medium
- toxic
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
- C12Q1/025—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/75—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated
- G01N21/76—Chemiluminescence; Bioluminescence
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/18—Water
- G01N33/186—Water using one or more living organisms, e.g. a fish
- G01N33/1866—Water using one or more living organisms, e.g. a fish using microorganisms
Description
462 166 2 Det har föreslagits att mikroorganismer kan användas för analys av prover för detektering av olika substanser. Således beskriver den amerikanska patentskriften 3.370.175 använd- ningen av luminescenta mikroorganismer för detektion av toxiska substanser i luft. Metabolismen hos de luminiscenta mikroorganismerna påverkas negativt av låga nivåer av toxi- kanter och intensiteten av avgiven ljusmängd påverkas. Genom registrering av ändringar i avgiven ljusmängd kan närvaron och den relativa koncentrationen av en toxikant bestämmas. Lik- nande system beskrives i de amerikanska patentskrifterna 3.849.653 och 3.958.938. 462 166 2 It has been suggested that microorganisms may be used for the analysis of samples for the detection of various substances. Thus, U.S. Pat. No. 3,370,175 discloses the use of luminescent microorganisms for the detection of toxic substances in air. The metabolism of the luminescent microorganisms is adversely affected by low levels of toxins and the intensity of the amount of light emitted is affected. By recording changes in the amount of light emitted, the presence and relative concentration of a toxicant can be determined. Similar systems are described in U.S. Pat. Nos. 3,849,653 and 3,958,938.
De i US-3.370.175 och i andra patent beskrivna systemen är specifikt anpassade för påvisning av toxiska substanser i ånga, aerosol eller gas och erfordrar att mikroorganismkul- turerna föreligger i ett tillväxtstadium på fasta substrat för att maximal kontakt mellan den för testning avsedda luften och kulturen skall åstadkommas. Som en följd därav är dessa system icke anpassade till användning i vätskemiljö och kan icke med lätthet användas för testning av vatten och andra vätskor. Vid användning av dessa system föredrar man att omgivningens be- tingelser ifråga om fuktighet och temperatur upprätthålles vid optimal nivå för att understödja den fortsatta tillväxten av mikroorganismkulturen. Detta är nödvändigt, eftersom samma kultur åter användes ett flertal gånger.The systems described in U.S. 3,370,175 and other patents are specifically adapted for the detection of toxic substances in steam, aerosol or gas and require the microorganism cultures to be in a growth stage on solid substrates in order to maximize contact between the air to be tested and culture must be achieved. As a result, these systems are not adapted for use in the liquid environment and cannot be easily used for testing water and other liquids. When using these systems, it is preferred that the ambient conditions in terms of humidity and temperature be maintained at the optimum level to support the continued growth of the microorganism culture. This is necessary because the same culture was used several times.
Nämnda system är bristfälliga antingen genom att de är tids- ödande, besvärliga och dyrbara att köra eller att de icke är lämpliga att användas vid testning av toxiska substanser i vätskemiljö.Said systems are defective either because they are time consuming, cumbersome and expensive to operate or because they are not suitable for use in testing toxic substances in liquid environments.
Uppfinningen avser en metod för testning av vätskor med av- seende på närvaron av toxiska substanser däri. Enligt metoden användes en biologisk organism som indikator och är särskilt lämplig för påvisning av toxiska föroreningar i vatten. Test- resultat kan korreleras med "fisktester", beskrivna ovan, vi ka för närvarande utgör den lämpligaste biologiska metoden för påvisning av toxiska substanser i vatten. 3 462 166 Enligt uppfinningen blandas ett material misstänkt för att innehålla en toxisk substans med en vattensuspension av luminescenta mikroorganismer valda bland Photobacterium, Vibrio, Achromobacter, Lucibacterium och blandningar därav, såsom P. splendidum, P. mandapamensis, P. phosphoreum, V. fischeri, A. fischeri, L. harveyi och blandningar därav med känd angiven ljusmängd. Efter blandning av materialet och vattensuspensionen uppmätes den avgivna ljusmängden i bland- ningen. Om en substans toxisk mot mikroorganismerna är när- varande kommer den avgivna ljusmängden i blandningen att avvika från den av suspensionen före sammanföringen och stor- leken av avvikelsen är approximativt proportionell mot kon- centrationen av toxisk substans i det för testning avsedda materialet.The invention relates to a method for testing liquids with respect to the presence of toxic substances therein. According to the method, a biological organism is used as an indicator and is particularly suitable for the detection of toxic pollutants in water. Test results can be correlated with "fish tests", described above, which are currently the most suitable biological method for the detection of toxic substances in water. According to the invention, a material suspected of containing a toxic substance is mixed with an aqueous suspension of luminescent microorganisms selected from Photobacterium, Vibrio, Achromobacter, Lucibacterium and mixtures thereof, such as P. splendidum, P. mandapamensis, P. phosphoreum, V. fischeri , A. fischeri, L. harveyi and mixtures thereof with known stated amount of light. After mixing the material and the aqueous suspension, the amount of light emitted in the mixture is measured. If a substance toxic to the micro-organisms is present, the amount of light emitted in the mixture will deviate from that of the suspension before assembly and the magnitude of the deviation is approximately proportional to the concentration of toxic substance in the test material.
Vid praktisk tillämpning av uppfinningen suspenderas mikro- organismerna i ett vattenmedium, såsom en saltvattenlösning under testperioden och eftersom det icke är nödvändigt att kulturen verkligen tillväxer vid tidpunkten för testet, be- redes de luminescenta mikroorganismerna med lätthet för an- vändning genom att man helt enkelt avlägsnar mikroorganismer- na från deras tillväxtkultur och suspenderar dem i vatten- mediet.In the practical application of the invention, the microorganisms are suspended in an aqueous medium, such as a saline solution during the test period, and since it is not necessary for the culture to actually grow at the time of the test, the luminescent microorganisms are easily prepared for use by simply removes the microorganisms from their growth culture and suspends them in the aqueous medium.
Det har vid tillämpning av metoden enligt uppfinningen visat sig att den temperatur vid vilken mikroorganismsuspensionen upprätthålles kan påverka känsligheten och avgiven ljusmängd av mikroorganismen. Ehuru det icke är kritiskt, är det sär- skilt lämpligt att temperaturen i provet och mikroorganism- suspensionen kontrolleras för uppnående av bästa möjliga re- sultat.In applying the method according to the invention, it has been found that the temperature at which the microorganism suspension is maintained can affect the sensitivity and amount of light emitted by the microorganism. Although not critical, it is particularly appropriate that the temperature of the sample and the microorganism suspension be monitored to obtain the best possible results.
Enligt uppfinningen föreligger de som biologisk indikator använda mikroorganismerna i lyofiliserad form före använd- ningen. I en sådan form rekonstitueras mikroorganismerna med lätthet för i huvudsak omedelbar användning genom tillsats av destillerat vatten till den lyofiliserade mikroorganismen.According to the invention, the microorganisms used as a biological indicator are in lyophilized form before use. In such a form, the microorganisms are easily reconstituted for substantially immediate use by adding distilled water to the lyophilized microorganism.
Mikroorganismen kan således med lätthet upprätthållas i 462 166 stabilt tillstånd för transport och förvaring, tills den erfordras för teständamål.Thus, the microorganism can be easily maintained in a stable state for transport and storage until required for testing purposes.
Andra fördelar och kännetecken för uppfinningen framgår av den följande detaljerade beskrivningen av uppfinningen i kombina- tion med de åtföljande ritningarna.Other advantages and features of the invention will become apparent from the following detailed description of the invention when taken in conjunction with the accompanying drawings.
Fig. l avser ett flödesschema av en avgiven ljusmängd-sensor använd enligt uppfinningen.Fig. 1 relates to a flow chart of an emitted amount of light sensor used according to the invention.
Fig. 2 visar sambandet mellan fenolkoncentration och avgiven ljusmängd av en luminescent mikroorganism.Fig. 2 shows the relationship between phenol concentration and the amount of light emitted by a luminescent microorganism.
Uppfinningen avser således ett förfarande för påvisning av toxisk substans eller toxiskt tillstånd i vätskor med använd- ning av luminescenta mikroorganismer såsom biologisk indikator.The invention thus relates to a method for detecting toxic substance or toxic state in liquids using luminescent microorganisms as biological indicator.
Uttrycket "vätska" inkluderar och omfattar varje livsupprätthållande vätska, som typiskt omfattar en väsentlig mängd vatten och en mindre proportion av andra komponenter lösta eller suspenderade däri. Metoden enligt uppfinningen användes således för påvisning av toxiska substanser eller toxiska tillstånd i vattenförråd, avrinnande ytvatten och liknande. Metoden kan dessutom användas för påvisning av toxiska substanser eller toxiskt tillstånd i kroppsvätskor och sera och andra vätskor som uppvisar en vatten- bas och som upprätthåller livsformer; Uttrycket "tillstånd" avser häri den miljö för mikroorganismerna som tillhandahållas av en vätska.The term "liquid" includes and includes any life-sustaining liquid, which typically comprises a substantial amount of water and a minor proportion of other components dissolved or suspended therein. The method according to the invention is thus used for the detection of toxic substances or toxic conditions in water storage, running surface water and the like. The method can also be used for the detection of toxic substances or toxic conditions in body fluids and sera and other liquids which have a water base and which maintain life forms; The term "condition" as used herein refers to the environment of the microorganisms provided by a liquid.
En substans eller ett tillstånd anses toxiskt, om det skadligt påverkar de metaboliska processerna av de biologiska indikatorer som användes enligt uppfinningen, vilket påvisas genom en ändring i avgiven ljusmängd. Ehuru ett stort antal olika toxiska substan- ser och tillstånd kan påvisas med metoden enligt uppfinningen, är vissa substanser särskilt välkända för att vara toxiska mot livsformer i relativt små koncentrationer. Dessa substanser kan man finna i strömmar, floder och andra vattenkällor föro- renade av industriellt och agrikulturellt avfall och såsom en följd därav är toxicitetstester för vatten normalt anpassade för påvisning av närvaron av dessa substanser. s 462 166 Således har oorganiska material, såsom kvicksilver-, krom-, bly- och zinkföreningar, ammoniak, nitrater, forforföreningar, sulfater och kopparföreningar, samtliga identifierats från olika källor såsom närvarande i vatten förorenat av industriellt avfall. Dessutom är organiska föreningar, såsom DDT, fenol, lindan, heptaklor, aldrin, toluen, 7-l2-dimetylbensantracen, 3-metylkolantren, benseden, o-aminoazotoluen, 4-dimetyl-amino- azobensen, pentaklorfenol, koltetraklorid, aceton, timersol, natriumlaurinsulfat och klordan, exempel på olika herbicider, pesticider, ytaktiva medel och andra organiska produkter som kan förväntas vara närvarande i vatten förorenat genom industriella och agrikulturella aktiviteter.A substance or condition is considered toxic if it adversely affects the metabolic processes of the biological indicators used according to the invention, as evidenced by a change in the amount of light emitted. Although a wide variety of toxic substances and conditions can be detected by the method of the invention, certain substances are particularly well known for being toxic to life forms in relatively small concentrations. These substances can be found in streams, rivers and other water sources polluted by industrial and agricultural waste and, as a result, water toxicity tests are normally adapted to detect the presence of these substances. 462 166 Thus, inorganic materials, such as mercury, chromium, lead and zinc compounds, ammonia, nitrates, precursors, sulfates and copper compounds, have all been identified from various sources as present in water contaminated by industrial waste. In addition, organic compounds such as DDT, phenol, lindane, heptachlor, aldrin, toluene, 7-1,2-dimethylbenzanthracene, 3-methylcholanthrene, benzene, o-aminoazotoluene, 4-dimethylaminoazobenzene, pentachlorophenol, carbon tetrachloride, acetone, timersol sodium laurin sulphate and chlordane, examples of various herbicides, pesticides, surfactants and other organic products that can be expected to be present in water polluted by industrial and agricultural activities.
Nämnda lista är icke avsedd att vara uttömmande och exemplifierar endast det stora antalet substanser, vilkas närvaro eller från- varo omfattar tillstånd toxiska för biologiska organismer. Fler- talet industriella avfall omfattar blandningar av material vilka anses vara föroreningar, av vilka ett eller flera är närvarande i tillräcklig koncentration för att skadligt påverka de meta- boliska processerna av den biologiska indikatorn och således ger upphov till toxiska tillstånd.The said list is not intended to be exhaustive and exemplifies only the large number of substances, the presence or absence of which includes conditions toxic to biological organisms. Most industrial waste comprises mixtures of materials which are considered to be pollutants, one or more of which are present in sufficient concentration to adversely affect the metabolic processes of the biological indicator and thus give rise to toxic conditions.
Den toxiska substansen behöver inte vara särskilt löslig i testvätskan. Det bör emellertid beaktas att för att en substans skall vara toxisk eller producera ett toxiskt tillstånd måste den uppvisa tillräckliga fysikaliska eller kemiska egenskaper för att möjliggöra att den antingen absorberas i toxiska mängder eller skadligt påverkar den vätska i vilken den är innesluten, antingen fysikaliskt eller kemiskt för produktion av ett toxiskt tillstånd i vätskan. I huvudsak alla toxiska substanser för vilka ett test önskas uppfyller det ena eller båda av dessa krav.The toxic substance does not have to be very soluble in the test liquid. It should be noted, however, that in order for a substance to be toxic or produce a toxic condition, it must have sufficient physical or chemical properties to enable it to be either absorbed in toxic amounts or adversely affecting the liquid in which it is entrapped, either physically or chemically. for the production of a toxic state in the liquid. Substantially all toxic substances for which a test is desired meet one or both of these requirements.
Det med avseende på toxicitet testade materialet behöver från början icke utgöras av en vattenhaltig vätska. Således kan exempelvis material för testning med avseende på toxicitet föreligga i form av ett finfördelat pulver, som därefter kan solubiliseras eller dispergeras i en vattenbas eller sättas direkt till vattensuspensionen av mikroorganismer. 462 166 6 Luminescenta mikroorganismer är i hög grad känsliga för toxiska substanser eller tillstånd utan hänsyn till stammen eller arten av mikroorganismen. Vissa mikroorganismstammar har emellertid visat sig vara känsligare för en speciell substans eller ett givet tillstånd och uppvisar således en mera uttalad ändring av den avgivna ljusmängden, när de föreligger i kontakt med sådana substanser eller sådana tillstånd, än stammar som är mindre känsliga för samma substans eller tillstånd. Det är där- för särskilt lämpligt att använda en mikroorganismstam som väljes med avseende på sin känslighet vid exponering mot en given sub- stans resp. tillstånd. Det ligger även inom ramen för uppfinningen att använda en blandning av mikroorganismstammar, av vilka de individuella stammarna är särskilt känsliga för givna sub- stanser eller tillstånd. Den totala effekten av blandningen av stammar är att tillhandahålla förbättrad och breddad känslig- het för valda varianter av substanser eller betingelser.The material tested for toxicity need not initially be an aqueous liquid. Thus, for example, toxicity testing materials may be in the form of a finely divided powder, which may then be solubilized or dispersed in an aqueous base or added directly to the aqueous suspension of microorganisms. 462 166 6 Luminescent microorganisms are highly sensitive to toxic substances or conditions without regard to the strain or species of the micro-organism. However, some microorganism strains have been found to be more sensitive to a particular substance or condition and thus show a more pronounced change in the amount of light emitted, when in contact with such substances or conditions, than strains which are less sensitive to the same substance or state. It is therefore particularly suitable to use a microorganism strain which is selected with respect to its sensitivity when exposed to a given substance resp. state. It is also within the scope of the invention to use a mixture of microorganism strains, of which the individual strains are particularly sensitive to given substances or conditions. The overall effect of the mixture of strains is to provide improved and broadened sensitivity to selected variants of substances or conditions.
Det är emellertid icke nödvändigt att känna den exakta toxiska substansen resp. tillståndet i testmaterialet. Såsom nämnts ovan är luminescenta mikroorganismer i hög grad känsliga för toxiska substanser och oavsett stam eller art kommer de att ge en ändring av den avgivna ljusmängden i närvaro av en toxisk sub- stans resp. tillstånd i testvätskan. Såsom närmare förklaras i det följande utgör ändringen av avgiven ljusmängd av mikro- organismerna en lämplig indikation på koncentrationen av toxisk substans i testvätskan.However, it is not necessary to know the exact toxic substance resp. the condition of the test material. As mentioned above, luminescent microorganisms are highly sensitive to toxic substances and regardless of strain or species, they will cause a change in the amount of light emitted in the presence of a toxic substance resp. condition of the test fluid. As will be explained in more detail below, the change in the amount of light emitted by the microorganisms is a suitable indication of the concentration of toxic substance in the test liquid.
Flera bakteriestammar är kända för att uppvisa kraftig lumine- scens inom förloppet av sin tillväxtcykel. Särskilt välkända och med lätthet tillgängliga arter av luminescenta bakterier omfattar Photobacterium, såsom P. splendidum, P. mandapamensis och P. phosphoreum. Stammar av bakterier från släktet Vibrio uppvisar likaledes luminescens, såsom exempelvis V. fischeri, såväl som mikroorganismer från släktet Lucibacterium, såsom L. harveyi och Achromobacter.Several bacterial strains are known to show strong luminescence within the course of their growth cycle. Particularly well known and readily available species of luminescent bacteria include Photobacterium, such as P. splendidum, P. mandapamensis and P. phosphoreum. Strains of bacteria from the genus Vibrio also show luminescence, such as, for example, V. fischeri, as well as microorganisms from the genus Lucibacterium, such as L. harveyi and Achromobacter.
Lmmnesuanz.bædæmieUa, och fungala mikroorganismer är tillgäng- liga från the American Type Culture Collection, 12301 Parkland 'l 7 462 166 Drive, Rockville, Maryland eller Northern Regional Research Laboratories, U.S. Department of Agriculture, Peoria, Illinois, såväl som från många komersiella och universitetslaboratorier.Limmnesuanz.bædæmieUa, and fungal microorganisms are available from the American Type Culture Collection, 12301 Parkland '7 7 462 166 Drive, Rockville, Maryland or Northern Regional Research Laboratories, U.S. Department of Agriculture, Peoria, Illinois, as well as from many commercial and university laboratories.
Typiskt får förrådskulturerna av bakterierna eller fungi till- växa från en tidigare kultur genom att man överför en portion av cellerna från den gamla kulturen till ett näringsmedium, vari de tillåtes tillväxa och mångfaldigas. Valet av medium an- vänt för odling av kulturen är beroende av den typ av kultur som användes och det sätt på vilket mikroorganismerna därefter skall behandlas vid beredning av deras användning enligt upp- finningen.Typically, the stock cultures of the bacteria or fungi are allowed to grow from a previous culture by transferring a portion of the cells from the old culture to a nutrient medium, in which they are allowed to grow and multiply. The choice of medium used for culturing the culture depends on the type of culture used and the manner in which the microorganisms are subsequently to be treated in preparing their use according to the invention.
Ett särskilt lämpligt tillväxtmedium för de mera vanliga luminescenta organismerna omfattar typiskt upp till ungefär 2 % agar, ungefär 0,25 till 0,7 % natrium- eller kaliumpyro- fosfat, ungefär 0,5 % glycerol, mellan 0,5 % och ungefär l % peptoner (animaliska och/eller vegetabiliska), upp till unge- fär l % hydrolyserat kasein och ungefär 0,5 % till 5 % natrium- klorid, varvid resten utgöres av vatten. pH i tillväxtmediet varierar företrädesvis ungefär mellan 6,5 och 7,5, och ligger företrädesvis vid ungefär 7,0. För marina mikroorganismer kan sjövatten användas i stället för vattnet i näringsmediet. Vidare kan alltefter den stam av mikroorganismer som odlas ett extrakt, såsom köttextrakt, bläckfisk- eller fiskextrakt, vara i hög grad fördelaktigt i näringsmediet.A particularly suitable growth medium for the more common luminescent organisms typically comprises up to about 2% agar, about 0.25 to 0.7% sodium or potassium pyrophosphate, about 0.5% glycerol, between 0.5% and about 1%. % peptones (animal and / or vegetable), up to about 1% hydrolysed casein and about 0.5% to 5% sodium chloride, the remainder being water. The pH of the growth medium preferably varies approximately between 6.5 and 7.5, and is preferably at about 7.0. For marine microorganisms, seawater can be used instead of the water in the nutrient medium. Furthermore, depending on the strain of microorganisms grown an extract, such as meat extract, squid or fish extract, can be highly beneficial in the nutrient medium.
Luminescenta fungi odlas lämpligen i en odlingsvätska på vatten- basis med ungefär lO % brödsmulor och artificiellt näringsmedel eller kokt körsbärsodlingsvätska. De kan även odlas på ett fast agarnäringsmedel, omfattande exempelvis 2 % agar och lO % bröd- smulor och vatten.Luminescent fungi are suitably grown in a water-based culture broth with about 10% breadcrumbs and artificial nutrient or boiled cherry broth. They can also be grown on a solid agar nutrient, comprising for example 2% agar and 10% breadcrumbs and water.
Enligt förfarandet enligt uppfinningen tas en viss mängd celler ur en växande kultur av luminescenta mikroorganismer och mikroorganismerna suspenderas i en salt- vattenlösning för bildning av en användbar suspension av cellerna i och för användning i en ljusavkännande apparat. Koncentrationen av celler i suspensionen är icke kritisk och kan variera inom ett 462 166 s brett intervall. En tillräcklig mängd celler bör emellertid vara närvarande i suspensionen så att den totalt avgivna ljus- mängden av den använda suspensionen ligger inom det påvisnings- bara intervallet för ljusavkänningsanordningen använd vid metoden. För bildning av en användbar suspension av celler från en växande kultur är det lämpligt att först bereda en förråds- suspension, som är mycket mer koncentrerad än nödvändigt.According to the method of the invention, a certain amount of cells are taken from a growing culture of luminescent microorganisms and the microorganisms are suspended in a saline solution to form a useful suspension of the cells for use in a light sensing apparatus. The concentration of cells in the suspension is not critical and can vary within a 462 166 s wide range. However, a sufficient amount of cells should be present in the suspension so that the total amount of light emitted by the suspension used is within the detectable range of the light sensing device used in the method. In order to form a useful suspension of cells from a growing culture, it is convenient to first prepare a stock suspension, which is much more concentrated than necessary.
Den användbara suspensionen beredes därefter genom utspädning av portioner från förrådslösningen, tills en önskad nivå av inten- siteten av avgiven ljusmängd (avgiven baslinjeljusmängd) erhålles.The useful suspension is then prepared by diluting portions of the stock solution until a desired level of the intensity of light emitted (emitted baseline light) is obtained.
Vid arbete med lyofiler inställes koncentrationen av celler före lyofiliseringen och en arbetssuspension med den önskade baslinjen framställes genom att man helt enkelt sätter destillerat vatten till lyofilen. Den avgivna baslinjeljusmängden registreras för varje suspension före införing av testvätskan. Baslinjen har till uppgift att vara en referens för den avgivna ljusmängden, från vilken sedan avvikelser i avgiven ljusmängd uppmätes, Det är uppenbart att en variation eller fluktuation i baslinjen på grund av orsaker andra än den toxiska substansen resp. till- ståndet som testas med avseende på sådana variationer inte är önskvärd och kan leda till missvisande eller falska avläsningar, såvida man icke kompenserar detta med det ljusavkännande medlet.When working with lyophiles, the concentration of cells is adjusted before lyophilization and a working suspension with the desired baseline is prepared by simply adding distilled water to the lyophil. The amount of baseline light emitted is recorded for each suspension before introduction of the test liquid. The purpose of the baseline is to be a reference for the amount of light emitted, from which deviations in the amount of light emitted are then measured. It is obvious that a variation or fluctuation in the baseline due to causes other than the toxic substance resp. the condition being tested for such variations is not desirable and may lead to misleading or false readings unless this is compensated for by the light sensing means.
Det är icke onormalt att den avgivna baslinjeljusmängden kan variera från arbetssuspensionen under en viss tidrymd. Ändringen av avgiven ljusmängd i frånvaro av en toxisk substans resp. till- stånd betraktas såsom baslinjedrift och bsstämmes typiskt med användning av en kontroll för varje serie av tester med använd- ning av en speciell stam av mikroorganismer. När testprocedurerna tillåter, bestämes baslinjedriften företrädesvis för varje arbets- suspension. Baslinjedriften är icke ovanlig vid många fotometriska analytiska system och kan kompenseras med lämpliga medel, såsom elektronisk eller manuell kontroll eller kompenserande instrumenta- tion, såsom är allmänt känt. Baslinjedriften upprätthålles före- trädesvis vid ett minimum, eftersom en låg baslinjedrift möjlig- gör användningen av enklare och typiskt mindre dyrbar instrumen- tation såsom ljusavkännande medel.It is not uncommon for the amount of baseline light emitted to vary from the working suspension over a period of time. The change in the amount of light emitted in the absence of a toxic substance resp. conditions are considered as baseline operation and are typically determined using a control for each series of tests using a specific strain of microorganisms. When the test procedures allow, baseline operation is preferably determined for each working suspension. Baseline operation is not uncommon in many photometric analytical systems and can be compensated by appropriate means, such as electronic or manual control or compensatory instrumentation, as is well known. Baseline operation is preferably maintained at a minimum, since low baseline operation enables the use of simpler and typically less expensive instrumentation as light sensing means.
Det har visat sig att det suspenderade mediet kan ha en väsentlig effekt på omfattningen av driften i baslinjen. Goda resultat upp- 'x 9 462 166 nås, när det suspenderade mediet innehåller ungefär 0,5 till 6 viktprocent natriumklorid, varvid ungefär 2-6 % natriumklorid är lämpligt, speciellt 3 % natriumklorid. Dessa saltkoncentra- tioner liknar i huvudsak de saltkoncentrationer som användes i näringsmediet under odlingscykeln av cellerna. Man har även funnit att goda resultat uppnås, när det suspenderade vatten- mediet omfattar mindre mängder av andra salter, såsom natrium- sulfat och natriumpyrofosfat, och näringsmedel, såsom jästex- trakt. Ehuru det icke är fullständigt känt varför tillsatsen av nämnda komponenter i det suspenderade mediet förbättrar stabiliteten av avgiven ljusmängd och reducerar baslinjedrift i suspensionen, förmodar man att då cellerna icke är aktivt tillväxande i antal, bör det suspenderade mediet fortfarande tillhandahålla en miljö för upprätthållande av cellmetabolism vid en acceptabel nivå, så att avgiven ljusmängd förblir relativt stabil. Ett särskilt lämpligt suspenderande medium omfattar förutom natriumklorid, mellan l och ungefär 10 mikro- gram/ml jästextrakt och ungefär mellan 50 och 250 mikrogram/ml natriumpyrofosfat.It has been found that the suspended medium can have a significant effect on the extent of operation at the baseline. Good results are obtained when the suspended medium contains about 0.5 to 6% by weight of sodium chloride, with about 2-6% of sodium chloride being suitable, especially 3% of sodium chloride. These salt concentrations are essentially similar to the salt concentrations used in the nutrient medium during the culture cycle of the cells. It has also been found that good results are obtained when the suspended aqueous medium comprises minor amounts of other salts, such as sodium sulphate and sodium pyrophosphate, and nutrients, such as yeast extracts. Although it is not entirely known why the addition of said components to the suspended medium improves the stability of the amount of light emitted and reduces baseline drift in the suspension, it is believed that since the cells are not actively growing in number, the suspended medium should still provide an environment for maintaining cell metabolism. at an acceptable level, so that the amount of light emitted remains relatively stable. A particularly suitable suspending medium comprises, in addition to sodium chloride, between 1 and about 10 micrograms / ml of yeast extract and about between 50 and 250 micrograms / ml of sodium pyrophosphate.
När man framställt suspensionen av luminescenta mikroorganismer enligt ovan och avkänt och registrerat den avgivna baslinje- ljusmängden av suspensionen införes ett prov misstänkt för att innehålla en toxisk substans eller uppvisar toxiskt tillstånd i kehållaren tillsammans med arbetssuspensionen. Innehållet omröres för omsorgsfull blandning av suspensionen och det in- förda materialet. En ändring av den avgivande ljusmängden bestämmas antingen genom uppmätning av den totala ändringen av avgiven ljusmängd under en given tidsperiod eller omfatt- ningen av ändringen av avgiven ljusmängd. om ändringen av avgiven ljusmängd uppmätes såsom omfattningen av ändringen eller såsom den totala ändringen under en given tidsperiod beror på faktorer såsom typen och koncentrationen av den toxiska substansen, känsligheten av mikroorganismen, medel för avkänning av den avgivna ljusmängden och liknande, och den metod som användes kan med lätthet fastställas genom på förhand utförda försök med mikroorganismen och testvätskan. 462 166 l° Närvaron av en toxisk substans resp. tillstånd indikeras av en ändring i den avgivna ljusmängden av mikroorganismsuspensionen jämfört med den avgivna baslinjeljusmängden. I allmänhet med- för den toxiska substansen resp. tillståndet en reduktion av avgiven ljusmängd, även om, beroende på stammen av mikroorga- nism, vissa toxiska substanser eller tillstånd kan förorsaka åtminstone en temporär ökning av den avgivna ljusmängden av mikroorganismsuspensionen. Omfattningen av ändringen av den avgivna ljusmängden står i relation till koncentrationen av den toxiska substansen eller omfattningen av det toxiska till- ståndet.After preparing the suspension of luminescent microorganisms as above and sensing and recording the amount of baseline light emitted by the suspension, a sample suspected of containing a toxic substance or having a toxic state is introduced into the keel holder together with the working suspension. The contents are stirred to thoroughly mix the suspension and the introduced material. A change in the amount of light emitted is determined either by measuring the total change in the amount of light emitted during a given period of time or the extent of the change in the amount of light emitted. whether the change in amount of light emitted is measured as the extent of the change or as the total change over a given period of time depends on factors such as the type and concentration of the toxic substance, the sensitivity of the microorganism, means of sensing the amount of light emitted and the like, and the method used can be easily determined by pre-performed experiments with the microorganism and the test liquid. 462 166 l ° The presence of a toxic substance resp. condition is indicated by a change in the amount of light emitted by the microorganism suspension compared to the amount of baseline light emitted. In general, the toxic substance resp. the condition a reduction in the amount of light emitted, although, depending on the strain of microorganism, certain toxic substances or conditions may cause at least a temporary increase in the amount of light emitted by the microorganism suspension. The extent of the change in the amount of light emitted is related to the concentration of the toxic substance or the extent of the toxic condition.
Med användning av standardkurvor kan man således bestämma kon- centrationen av en given toxisk substans under antagande att den toxiska substansen är identifierad. Vidare kan en korrela- tion fastställas mellan resultaten av föreliggande metod och de resultat som man erhåller enligt det s.k. "fisk"-testet, det test som vanligen användes för närvarande vid försök att bestämma närvaron av en toxisk substans i vatten.Using standard curves, one can thus determine the concentration of a given toxic substance on the assumption that the toxic substance is identified. Furthermore, a correlation can be established between the results of the present method and the results obtained according to the so-called the "fish" test, the test commonly used at present in attempts to determine the presence of a toxic substance in water.
Varje lämpligt ljusavkänningsmedel kan användas enligt upp- finningen för avkänning av den avgivna ljusmängden från vat- tensuspensionen av mikroorganismer och den därefter bildade blandningen av mikroorganismer och testmaterialet. Såsom är allmänt känt inom detta område finns det olika typer av foto- metriska och optiska analytiska instrument, vilka samtliga arbetar enligt samma allmänna principer.Any suitable light sensing means can be used according to the invention for sensing the amount of light emitted from the aqueous suspension of microorganisms and the subsequently formed mixture of microorganisms and the test material. As is generally known in the art, there are various types of photometric and optical analytical instruments, all of which operate in accordance with the same general principles.
I fig. l visas i diagramform ett fotometriskt system lämpligt för påvisning av den avgivna ljusmängden från de luminescenta mikroorganismerna och indikeras allmänt genom hänvisning till siffran 10. I sina bredaste aspekter inkluderar systemet 10 en lämplig cell, kyvett eller behållare 12, vari suspensionen av luminescenta mikroorganismer och testprovet bevaras för mät- ning av den avgivna ljusmängden. En ljusdetektor, såsom en multiplikatorfotocell 14, eller en fotocell, anbringas i ett ljusinverkande samband med behållaren l2 under alstring av en ström av låg spänning, som står i relation till intensiteten ll 462 166 av ljusets inverkan på detektorn. Den från cellen l4 avgivna ljusmängden föres igenom en fotocellförstärkare l6, vari den avgivna ljusmängden förstärkes och därefter föres till ett indikatormedel, såsom en mätare 18. Valet av indikatormedel är icke kritiskt och istället för eller i anslutning till mäta- ren 18 kan man i systemet inkludera ett registreringsdiagram eller en digital avläsningsanordning av konventionell typ.Fig. 1 shows in diagrammatic form a photometric system suitable for detecting the amount of light emitted from the luminescent microorganisms and is generally indicated by reference to the figure 10. In its broadest aspects, the system 10 includes a suitable cell, cuvette or container 12, wherein the suspension of luminescent microorganisms and the test sample are preserved for measuring the amount of light emitted. A light detector, such as a multiplier photocell 14, or a photocell, is placed in a light acting relationship with the container 12 while generating a low voltage current, which is related to the intensity ll 462 166 of the light effect on the detector. The amount of light emitted from the cell 14 is passed through a photocell amplifier 16, where the amount of light emitted is amplified and then fed to an indicator means, such as a meter 18. The choice of indicator means is not critical and instead of or in connection with the meter 18 the system include a recording chart or a conventional digital reading device.
Det bör även observeras att temperaturen i arbetssuspensionen påverkar känsligheten och den aktuella från mikroorganismerna avgivna ljusmängden i arbetssuspensionen. Det är således sär- skilt fördelaktigt att köra alla tester med en speciell stam av mikroorganismer och en speciell toxikant vid samma tempera- tur för tillförsäkrande av reproducerbarhet av resultaten. Med toxikanter såsom fenol har det således visat sig att för en given koncentration av toxikanten minskar den aktuella procen- tuella minskningen av den avgivna ljusmängden av en arbets- suspension av mikroorganismen med ökande temperatur. Med andra toxikanter, såsom isopropylalkohol, ökar den procentuella av- givna ljusmängden i arbetssuspensionen med ökande temperatur.It should also be noted that the temperature in the working suspension affects the sensitivity and the actual amount of light emitted by the microorganisms in the working suspension. It is thus particularly advantageous to run all tests with a special strain of microorganisms and a special toxicant at the same temperature to ensure reproducibility of the results. Thus, with toxicants such as phenol, it has been found that for a given concentration of the toxicant, the actual percentage decrease in the amount of light emitted by a working suspension of the microorganism decreases with increasing temperature. With other toxicants, such as isopropyl alcohol, the percentage of light emitted in the working suspension increases with increasing temperature.
Det är således särskilt lämpligt, särskilt när man arbetar med nya testprover, att registrera ändringen av avgiven ljusmängd i arbetssuspensionen inom ett intervall av temperaturer mellan ungefär l0°C och ungefär 30°C. Den lämpligaste testtempera- turen är den temperatur vid vilken den maximala ändringen i avgiven ljusmängd registreras. Detta indikerar den temperatur vid vilken mikroorganismen har maximal känslighet för toxi- kanten eller blandningen av toxikanter i testlösningen.Thus, it is particularly convenient, especially when working with new test specimens, to record the change in amount of light emitted in the working suspension within a range of temperatures between about 10 ° C and about 30 ° C. The most suitable test temperature is the temperature at which the maximum change in the amount of light emitted is registered. This indicates the temperature at which the micro-organism has maximum sensitivity to the toxin or mixture of toxicants in the test solution.
När reproducerbarheten av resultat eller maximal känslighet icke är av större betydelse, kan metoden utföras med en arbets lösning vid rumstemperatur inom fotometern. I vilket fall som helst bör arbetssuspensionen tillåtas antaga en stabil tempe- ratur före avläsningen av den avgivna ljusmängden på grund av att ändringar i temperaturen även påverkar den avgivna baslin- jeljusmängden och resulterar i en onödigt ökad baslinjedrift.When the reproducibility of results or maximum sensitivity is not of major importance, the method can be performed with a working solution at room temperature within the photometer. In any case, the working suspension should be allowed to assume a stable temperature before the reading of the amount of light emitted, because changes in temperature also affect the amount of baseline light emitted and result in an unnecessarily increased baseline operation.
I följande exempel stabiliserades arbetssuspensionen vid rums- temperatur i fotometern innan man registrerade den avgivna ljusmängden. 462 166 12 Uppfinningen åskådliggöres närmare medelst följande exempel, vari de angivna temperaturerna avser Celsius-grader.In the following example, the working suspension was stabilized at room temperature in the photometer before the amount of light emitted was registered. The invention is further illustrated by the following examples, in which the temperatures indicated refer to degrees Celsius.
ExemBel'l.ExemBel'l.
Luminescenta bakterieceller för användning vid toxicitets- testning bereddes genom att man ympade agarmedier för bildning av kulturer av V. fischeri, P. phosphoreum, ATCC 11040; P. mandapamensis, ATCC 27561; L. harveyi, ATCC 14126 och A. fischeri, NRRL B-lll77. Agarmediet innehöll följande komponenter: KHZPO4 0,25 viktprocent NaCl 3,0 " Glycerol 0,5 " Jästextrakt 0,1 " Polypepton 0,5 " Hydrolyserad kasein 1,0 " Bläckfiskextrakt 10,0 volymprocent Agar 1,5 viktprocent Destillerat vatten 90,0 volymprocent Bläckfiskextraktet framställdes genom att man homogeniserade 454 g hel bläckfisk med en tillräcklig mängd destillerat vatten för att inställa den slutliga volymen på 1 liter. Upp- slamningen autoklaverades 15 minuter vid 1210 och den bildade suspensionen klarades genom centrifugering.Luminescent bacterial cells for use in toxicity testing were prepared by inoculating agar media to form cultures of V. fischeri, P. phosphoreum, ATCC 11040; P. mandapamensis, ATCC 27561; L. harveyi, ATCC 14126 and A. fischeri, NRRL B-ll77. The agar medium contained the following components: KHZPO4 0.25% by weight NaCl 3.0 "Glycerol 0.5" Yeast extract 0.1 "Polypeptone 0.5" Hydrolyzed casein 1.0 "Octopus extract 10.0% by volume Agar 1.5% by weight Distilled water 90, 0% by volume The octopus extract was prepared by homogenizing 454 g of whole squid with a sufficient amount of distilled water to set the final volume of 1 liter, the slurry was autoclaved for 15 minutes at 1210 and the resulting suspension was clarified by centrifugation.
Efter 24 timmars tillväxt vid 220 avlägsnades cellerna från var och en av kulturerna och suspenderades i 3 %-ig vattenlös- ning av natriumklorid (pH 7,1) för bildning av en förrâds- suspension av var och en av cellkulturerna. Förrådssuspensionen omrördes kraftigt för att tillförsäkra homogen suspension.After 24 hours of growth at 220, the cells were removed from each of the cultures and suspended in 3% aqueous sodium chloride solution (pH 7.1) to form a stock suspension of each of the cell cultures. The stock suspension was stirred vigorously to ensure homogeneous suspension.
En arbetssuspension framställdes ur var och en av förrâds- lösningarna genom att man utspädde portioner om 10 mikroliter av varje förrâdslösning i 2 ml av ett suspenderande vatten- medium. Det suspenderande mediet bestod av en natriumklorid- vattenlösning (3 viktprocent) som innehöll 135 mikrogram/ml natriumpyrofosfat och 5 mikrogram/ml i handeln tillgängligt jästextrakt (Diffco Laboratories, Detroit, Michigan).A working suspension was prepared from each of the stock solutions by diluting 10 microliter portions of each stock solution in 2 ml of a suspending aqueous medium. The suspending medium consisted of a sodium chloride aqueous solution (3% by weight) containing 135 micrograms / ml sodium pyrophosphate and 5 micrograms / ml of commercially available yeast extract (Diffco Laboratories, Detroit, Michigan).
B 462 166 Den avgivna baslinjeljusmängden i arbetslösningarna bestämdes med suspensionerna i huvudsak vid rumstemperatur i en foto- meter försedd med en multiplikatorfotocell och en diagram- registreringsanordning.B 462 166 The amount of baseline light emitted in the working solutions was determined with the suspensions mainly at room temperature in a photometer equipped with a multiplier photocell and a diagram recording device.
Exempel 2.Example 2.
Luminescenta bakteriecellkulturer odlades i vätskemedier.Luminescent bacterial cell cultures were grown in liquid media.
Kulturer av P. phosphoreum, ATCC llO4l; P. mandapamensis, ATCC 2756l; L. harveyi, ATCC l4l26 och A. fischeri, NRRL B-lll77 odlades såsom skakkolvskulturer. Odlingsmediet var detsamma som användes i exempel l, med det undantaget att ingen agar användes i odlingsmedierna. Kulturerna odlades i 500 ml tre- dubbelt räfflade kolvar av DeLong-typ, innehållande 100 ml per kolv. Kulturerna odlades l8 timmar vid 220 och under tillväxt- perioden omrördes kulturerna vid 240 varv/minut på en "New Brunswick gyrotary"-skakanordning. Cellerna skördades under den logaritmiska fasen av tillväxt och avskildes från odlings- mediet genom centrifugering. Resulterande pellets av celler från var och en av kulturerna upprätthölls vid 40 före bild- ning av respektive förrâdssuspension på det i exempel l beskriv- na sättet.Cultures of P. phosphoreum, ATCC l1041; P. mandapamensis, ATCC 2756l; L. harveyi, ATCC 1426 and A. fischeri, NRRL B-1117 were grown as shake flask cultures. The culture medium was the same as used in Example 1, except that no agar was used in the culture media. The cultures were grown in 500 ml triple-ribbed DeLong-type flasks, containing 100 ml per flask. The cultures were grown for 18 hours at 220 and during the growth period the cultures were stirred at 240 rpm on a "New Brunswick gyrotary" shaker. The cells were harvested during the logarithmic phase of growth and separated from the culture medium by centrifugation. Resulting pellets of cells from each of the cultures were maintained at 40 before the formation of the respective stock suspension in the manner described in Example 1.
Varje förrådssuspension utspäddes för bildning av en arbets- suspension i och för användning i fotometern på samma sätt som i exempel l och baslinjedriften registrerades för var och en av arbetssuspensionerna.Each stock suspension was diluted to form a working suspension for use in the photometer in the same manner as in Example 1 and the baseline operation was recorded for each of the working suspensions.
Exempel 3.Example 3.
Kulturer av P. mandapamensis, ATCC 27561; L. harveyi, ATCC l4l26 och A. fischeri, NRRL B-lll77 framställdes i ett odlings- medium enligt exempel 2. Kulturerna avskildes från odlings- vätskan under den logaritmiska tillväxtfasen genom centrifuge- ring och de bildade cellpellets kyldes till 4O_ Kylda cell- pellets suspenderades i en 3%-ig natriumkloridlösning, upprätt- hållen vid en temperatur av 40. Natriumkloridlösningen sattes till suspensionen, till en homogen cellsuspension med en slutlig optisk densitet av l60 erhölls. 462 166 14 Cellsuspensionen blandades med en mjölkvattenlösning (20 vikt- procent skummjölk, 2 viktprocent NaCl, pH 7,1) i ett volymför- hållande av en del cellsuspension per 19 delar mjölklösning.Cultures of P. mandapamensis, ATCC 27561; L. harveyi, ATCC 1426 and A. fischeri, NRRL B-11177 were prepared in a culture medium according to Example 2. The cultures were separated from the culture fluid during the logarithmic growth phase by centrifugation and the cell pellets formed were cooled to 40 was suspended in a 3% sodium chloride solution, maintained at a temperature of 40. The sodium chloride solution was added to the suspension, until a homogeneous cell suspension with a final optical density of 160 was obtained. 462 166 14 The cell suspension was mixed with a milk aqueous solution (20% by weight of skimmed milk, 2% by weight of NaCl, pH 7.1) in a volume ratio of one part of the cell suspension per 19 parts of milk solution.
Cellmjölksuspensionen fördelades i portioner om l ml i 10 ml- vialer och frystes snabbt vid en temperatur av -50°. Cellerna torkades sedan vid -50 under 18 timmars 55 mikron-vakuum. Vialerna vakuumförseglades sedan.The cell milk suspension was distributed in 1 ml portions in 10 ml vials and frozen rapidly at a temperature of -50 °. The cells were then dried at -50 under an 18 hour 55 micron vacuum. The vials were then vacuum sealed.
Arbetssuspensionena av var och en av de lyofiliserade proverna framställdes genom tillsats av l ml destillerat vatten till via- lerna. De bildade suspensionerna uppvisade en god avgiven bas- linjeljusmängd.The working suspensions of each of the lyophilized samples were prepared by adding 1 ml of distilled water to the vials. The suspensions formed showed a good amount of baseline light emitted.
Exempel 4.Example 4.
Arbetssuspensioner av flera arter av luminescenta bakterier odlade och framställda enligt exempel l, 2 och 3 försattes med olika koncentrationer av substanser kända för att vara toxiska mot biologiska organismer för bestämning av inverkan på den avgivna ljusmängden i det åstadkomna systemet.Working suspensions of several species of luminescent bacteria grown and prepared according to Examples 1, 2 and 3 were added with different concentrations of substances known to be toxic to biological organisms to determine the effect on the amount of light emitted in the system produced.
Följande toxiska substanser användes för att skapa toxiska tillstånd: fenol, natriumlaurinsulfat, en blandning av olika substanser benämnd blandning 401 och ett träkonserverings- medel såsom penta, som bestod av 3,5 % pentaklorfenol, 65 % mineralterpentin och 32,5 % inerta komponenter.The following toxic substances were used to create toxic conditions: phenol, sodium laurin sulphate, a mixture of various substances called mixture 401 and a wood preservative such as penta, which consisted of 3.5% pentachlorophenol, 65% mineral turpentine and 32.5% inert components.
Referensblandningen 401 framställdes genom tillsats av 3,82 g NH4Cl, 0,093 g K2CrO4, O,l28 g Na2S.9H2O, 0,20 g kaolin, 0,1 g fenol och 1,28 ml brännolja nr. 2 till 100 ml destillerat vatten.The reference mixture 401 was prepared by adding 3.82 g of NH 4 Cl, 0.093 g of K 2 CrO 4, 0.28 g of Na 2 S 9 H 2 O, 0.20 g of kaolin, 0.1 g of phenol and 1.28 ml of fuel oil no. 2 to 100 ml of distilled water.
Testerna utfördes genom nedföring av mellan 10 och 100 mikro- liter av lösningar av den toxiska substansen i en kyvett, innehållande en arbetssuspension av celler för vilken baslinjen och baslinjedriften registreras. Efter införing av den toxiska substansen vändes kyvetterna flera gånger upp och ned för till- försäkrande av omblandning av suspensíonen och det material som innehöll den toxiska substansen. Kyvetterna insattes i foto- metern och den procentuella sänkningen av ljusmängden bestämdes 15 462 166 efter en period av två minuter från tillsatsen av den toxiska substansen. Kontrollprover bestående av en arbetssuspension av var och en av kulturerna och lO mikroliter av en 3%-ig natrium- kloridlösning kördes parellellt med testproverna.The tests were performed by depositing between 10 and 100 microliters of solutions of the toxic substance in a cuvette, containing a working suspension of cells for which the baseline and baseline operation are recorded. After introduction of the toxic substance, the cuvettes were turned upside down several times to ensure mixing of the suspension and the material containing the toxic substance. The cuvettes were inserted into the photometer and the percentage decrease in the amount of light was determined after a period of two minutes from the addition of the toxic substance. Control samples consisting of a working suspension of each of the cultures and 10 microliters of a 3% sodium chloride solution were run in parallel with the test samples.
Resultaten anges i tabellerna A, B och C. I varje enskilt fall uttryckes koncentrationerna av de toxiska substanserna i mg/liter, med undantag för blandning 401, som uttryckes i volymprocent av blandningen i testlösningen.The results are given in Tables A, B and C. In each case, the concentrations of the toxic substances are expressed in mg / liter, with the exception of mixture 401, which is expressed as a percentage by volume of the mixture in the test solution.
Tabell A visar resultaten för luminescenta celler odlade enligt exempel l. Tabellerna B och C uppvisar resultaten för celler odlade och beredda enligt exemplen 2 resp. 3. 462 166 16 Tabell A Procentuell sänkning av ljusmängd Koncentrationer av ATCC ATCC ATCC NRRL Vibrio testade toxikanter -~ 27561 14126 11040 B-11177 Fischeri 3 % NaCl (kontroll) 0 0 0 0 O Fenol 50 mg/1 20 26 9 13 10 100 mg/1 55 40 18 23 20 250 mg/1 95 91 33 51 41 Natriumlaurylsulfat 25 mg/1 20 19 17 67 21 50 mg/1 40 36 31 90 81 100 mg/1 94 33 12 89 83 Referensblandning 401 0,5 % 9 2 3 7 1,0 % 14 2,5 % 24 18 23 26 Pentaklorfenol 5 mg/1 11 71 85 71 - 10 mg/1 31 73 95 84 - 25 mg/1 61 89 99 90 - Tabell B Celler Procentuell sänkning av ljusmängd Koncentrationer av ATCC ATCC NRRL Vibrio testade toxikanter 27561 14126 B-11177 Fischeri 3 % NaCl (kontroll) 0 0 0 0 Fenol 50 mg/1 36 10 19 26 100 mg/1 50 29 29 37 250 mg/1 37 57 55 52 Natriumlaurylsulfat 25 mg/1 22 48 83 15 50 mg/1 30 45 89 28 100 mg/1 76 69 78 70 Referensblandning 401 0,5 % 7 0 12 12 1,0 % 7 4 14 14 2,5 % 11 1o 16 15 17 462 166 Tabell C Procentuell sänkning av ljusmängd Koncentrationer av ATCC ATCC NRRL Vibrio testade toxikanter 27561 14126 B-11177 Fischeri 3 % NaCl (kontroll) 0 0 0 0 Fenol (PPM) 50 mg/1 7 12 25 13 100 mg/l 20 21 40 27 250 mg/l 28 35 63 50 Natriumlaurylsulfat 25 mg/l 12 33 33 41 50 mg/l 14 40 40 43 100 mg/1 31 56 40 43 Referensblandning 401 0,5 % 3 6 17 ll 1,0 % 10 19 17 2,5 % 9 13 42 23 Ett frystorkat prov av A. fischeri, NRRL B-11177, som odlats och lyofiliserats enligt exempel 3, användes för åskådlig- görande av sambandet mellan koncentration av toxiska substanser och sänkningen av den avgivna ljusmängden efter tvâ minuters exponering.Table A shows the results for luminescent cells grown according to Example 1. Tables B and C show the results for cells grown and prepared according to Examples 2 and 2, respectively. 3. 462 166 16 Table A Percentage reduction of light amount Concentrations of ATCC ATCC ATCC NRRL Vibrio tested toxicants - ~ 27561 14126 11040 B-11177 Fischeri 3% NaCl (control) 0 0 0 0 O Phenol 50 mg / 1 20 26 9 13 10 100 mg / 1 55 40 18 23 20 250 mg / 1 95 91 33 51 41 Sodium lauryl sulphate 25 mg / 1 20 19 17 67 21 50 mg / 1 40 36 31 90 81 100 mg / 1 94 33 12 89 83 Reference mixture 401 0, 5% 9 2 3 7 1.0% 14 2.5% 24 18 23 26 Pentachlorophenol 5 mg / 1 11 71 85 71 - 10 mg / 1 31 73 95 84 - 25 mg / 1 61 89 99 90 - Table B Cells Percentage decrease in amount of light ATCC concentrations ATCC NRRL Vibrio tested toxicants 27561 14126 B-11177 Fischeri 3% NaCl (control) 0 0 0 0 Phenol 50 mg / 1 36 10 19 26 100 mg / 1 50 29 29 37 250 mg / 1 37 57 55 52 Sodium lauryl sulphate 25 mg / 1 22 48 83 15 50 mg / 1 30 45 89 28 100 mg / 1 76 69 78 70 Reference mixture 401 0.5% 7 0 12 12 1.0% 7 4 14 14 2.5% 11 1o 16 15 17 462 166 Table C Percentage reduction of light amount Concentrations of ATCC ATCC NRRL Vibrio tested toxicants 27561 14126 B-11177 Fischeri 3% NaCl (control) 0 0 0 0 Phenol (PPM) 50 mg / 1 7 12 25 13 100 mg / l 20 21 40 27 250 mg / l 28 35 63 50 Sodium lauryl sulfate 25 mg / l 12 33 33 41 50 mg / l 14 40 40 43 100 mg / 1 31 56 40 43 Reference mixture 401 0.5% 3 6 17 ll 1.0% 10 19 17 2.5% 9 13 42 23 A freeze-dried sample of A. fishery, NRRL B-11177, grown and lyophilized according to Example 3, was used to illustrate the relationship between the concentration of toxic substances and the decrease in the amount of light emitted after two minutes of exposure.
I kyvetter innehållande l ml av en arbetssuspension av den rekonstituerade luminescenta mikroorganismen (A. fischeri), på vilken baslinjen bestämts på förhand, nedfördes 10 mikroliter av proverna innehållande fenol i olika koncentrationer och kyvetterna vändes upp och ned för tillförsäkrande av god omblandning. Efter två minuter observeredes reduktionen av den avgivna ljusmängden och registrerades såsom procentuell sänkning av ljusmängden. Resultaten visas i tabell D: 462 166 18 Tabell D Fenolkoncentration (PPM) Procentuell sänkning av ljus- mängden efter 2 minuters expone- ring 5 l l0 3 20 10 30 18 40 21 50 25 60 30 70 31 80 37 90 40 lOO 40 Fig. 2 visar ett diagram avseende data i tabell D med koncentrationen av fenol på den vertikala logskalan och den procentuella sänkningen av den avgivna ljusmängden på den horisontella linjära skalan. Vid behandling på så sätt fast- ställes ett direkt samband mellan koncentration av fenol och sänkning av den avgivna ljusmängden.In cuvettes containing 1 ml of a working suspension of the reconstituted luminescent microorganism (A. fischeri), on which the baseline was determined in advance, 10 microliters of the samples containing phenol were lowered in different concentrations and the cuvettes were turned upside down to ensure good mixing. After two minutes, the reduction of the amount of light emitted was observed and recorded as a percentage decrease of the amount of light. The results are shown in Table D: 462 166 18 Table D Phenol concentration (PPM) Percentage reduction of the amount of light after 2 minutes of exposure 5 l l0 3 20 10 30 18 40 21 50 25 60 30 70 31 80 37 90 40 lOO 40 Fig. 2 shows a graph of the data in Table D with the concentration of phenol on the vertical log scale and the percentage decrease in the amount of light emitted on the horizontal linear scale. When treated in this way, a direct connection is established between the concentration of phenol and the reduction of the amount of light emitted.
I de föregående exemplen sattes materialet innehållande de toxiska substanserna till suspensionen av luminescenta mikro- organismer i det suspenderande vattenmediet. Det har emellertid visat sig att när koncentrationen av toxisk substans i vätska är låg, uppnås goda resultat genom att man suspenderar cellerna direkt i vätskan, innehållande den toxiska substansen för bild- ning av arbetssuspensionen. I detta fall sättes en tillräcklig mängd natriumklorid till materialet misstänkt för att innehålla den toxiska substansen för bildning av en 3%-ig lösning av saltet. Den avgivna ljusmängden uppmätes och jämföres med den avgivna ljusmängden i en arbetssuspension av de luminescenta cellerna i endast det suspenderande mediet.In the previous examples, the material containing the toxic substances was added to the suspension of luminescent microorganisms in the suspending aqueous medium. However, it has been found that when the concentration of toxic substance in liquid is low, good results are obtained by suspending the cells directly in the liquid, containing the toxic substance to form the working suspension. In this case, a sufficient amount of sodium chloride is added to the material suspected of containing the toxic substance to form a 3% solution of the salt. The amount of light emitted is measured and compared with the amount of light emitted in a working suspension of the luminescent cells in the suspending medium only.
W 12'W 12 '
Claims (1)
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US83749877A | 1977-09-28 | 1977-09-28 |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| SE7810154L SE7810154L (en) | 1979-03-29 |
| SE462166B true SE462166B (en) | 1990-05-14 |
| SE462166C SE462166C (en) | 1997-01-16 |
Family
ID=25274625
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| SE7810154A SE462166C (en) | 1977-09-28 | 1978-09-27 | Toxicity test with luminescent bacteria |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS5458492A (en) |
| BE (1) | BE870833A (en) |
| CA (1) | CA1103050A (en) |
| DE (1) | DE2841896C3 (en) |
| FR (1) | FR2404847A1 (en) |
| GB (1) | GB2005018B (en) |
| NL (1) | NL7809821A (en) |
| SE (1) | SE462166C (en) |
Families Citing this family (21)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA1153218A (en) * | 1980-03-25 | 1983-09-06 | Malbone W. Greene | Method and apparatus for monitoring light signals from liquid medium |
| WO1985000890A1 (en) * | 1983-08-16 | 1985-02-28 | Battelle Development Corporation | Bioluminescent chemical system and method for detecting the presence of chemical agents in a medium |
| DE3833628A1 (en) * | 1988-10-03 | 1990-04-12 | Genlux Forschungsgesellschaft | METHOD FOR DETECTING AND IDENTIFYING TOXIC SUBSTANCES USING CLONED MICROORGANISMS |
| DE3878697D1 (en) * | 1988-10-10 | 1993-04-01 | Siemens Ag | DEVICE FOR ELECTROPOLISHING SURFACES. |
| FR2680247B1 (en) * | 1991-08-07 | 1993-11-12 | Anjou Recherche Gie | AUTOMATED POLLUTION DETECTOR IN AQUEOUS MEDIA USING A MICROORGANISM TEST. |
| GB9119382D0 (en) * | 1991-09-11 | 1991-10-23 | Knight Scient Ltd | Apparatus for monitoring liquids |
| FR2686350B1 (en) * | 1992-01-17 | 1996-12-27 | Rochas | METHOD FOR EVALUATING THE SAFETY OF PRODUCTS USING BIOLUMINESCENCE MEASUREMENTS. |
| DE4230264A1 (en) * | 1992-09-10 | 1994-03-17 | Bayer Ag | Analytical method for the investigation of mixtures for toxic components |
| GB2279738A (en) * | 1993-06-18 | 1995-01-11 | Yorkshire Water Plc | Determining toxicity in fluid samples |
| DE4325482C1 (en) * | 1993-07-29 | 1994-12-15 | Lange Gmbh Dr Bruno | Medium for reactivating preserved microorganisms |
| WO1995007346A1 (en) * | 1993-09-08 | 1995-03-16 | Merck Patent Gmbh | Cell reagent and assay |
| DE4332165A1 (en) * | 1993-09-22 | 1995-03-23 | Kolibri Umweltanalytik Und On | Method and apparatus for pollutant analysis of water samples |
| AU7819494A (en) * | 1993-10-15 | 1995-05-04 | Merck Patent Gmbh | Assay method |
| DE4401169C2 (en) * | 1994-01-17 | 2003-01-09 | Buehler Ag | Process for distinguishing the quality of liquids |
| DE4401868C1 (en) * | 1994-01-22 | 1995-02-16 | Lobbe Xenex Gmbh | Microbial method for detecting pollutants |
| GB2293878A (en) * | 1994-10-06 | 1996-04-10 | Stephen John Shore | Monitoring biocide content of industrial waters |
| WO1996014570A1 (en) * | 1994-11-07 | 1996-05-17 | Idexx Laboratories, Inc. | Self-contained signal generating sampling device and methods of use of same |
| GB0510709D0 (en) * | 2005-05-26 | 2005-06-29 | Cymtox Ltd | Water monitoring system |
| US7704731B2 (en) * | 2006-10-10 | 2010-04-27 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy | System and method for quantifying toxicity in water, soil, and sediments |
| CN112198150B (en) * | 2020-07-07 | 2022-10-25 | 山东省临沂生态环境监测中心 | Method for monitoring polluted water body by bioluminescence method |
| CN113340885B (en) * | 2021-06-23 | 2022-08-09 | 同济大学 | Formaldehyde biological monitoring device and monitoring method |
Family Cites Families (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3370175A (en) * | 1965-01-28 | 1968-02-20 | North American Rockwell | Toxicant detector |
| US3797999A (en) * | 1970-05-20 | 1974-03-19 | Aerojet General Co | Method and apparatus for indicating micro-organic matter by means of chemiluminescence |
| US3679312A (en) * | 1971-06-16 | 1972-07-25 | Technicon Instr | Method and apparatus for measuring bioluminescence or chemiluminescence for quantitative analysis of samples |
| US3849653A (en) * | 1973-09-27 | 1974-11-19 | Bausch & Lomb | Multichannel bioluminescent sensors |
| US3958938A (en) * | 1974-12-16 | 1976-05-25 | Bausch & Lomb Incorporated | Bioluminescent sensor system |
| AU508807B2 (en) * | 1975-10-20 | 1980-04-03 | University Of Sydney, The | Photoelectric analysis using luminous bacteria |
| GB1571466A (en) * | 1976-12-14 | 1980-07-16 | Univ California | Assay mehtod |
-
1978
- 1978-09-22 CA CA311,855A patent/CA1103050A/en not_active Expired
- 1978-09-26 DE DE2841896A patent/DE2841896C3/en not_active Expired - Lifetime
- 1978-09-27 SE SE7810154A patent/SE462166C/en not_active IP Right Cessation
- 1978-09-28 JP JP11868878A patent/JPS5458492A/en active Granted
- 1978-09-28 NL NL7809821A patent/NL7809821A/en not_active Application Discontinuation
- 1978-09-28 GB GB7838480A patent/GB2005018B/en not_active Expired
- 1978-09-28 BE BE190765A patent/BE870833A/en not_active IP Right Cessation
- 1978-09-28 FR FR7827822A patent/FR2404847A1/en active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| FR2404847A1 (en) | 1979-04-27 |
| GB2005018A (en) | 1979-04-11 |
| SE462166C (en) | 1997-01-16 |
| GB2005018B (en) | 1982-07-14 |
| JPS5728272B2 (en) | 1982-06-15 |
| JPS5458492A (en) | 1979-05-11 |
| BE870833A (en) | 1979-01-15 |
| DE2841896A1 (en) | 1979-03-29 |
| SE7810154L (en) | 1979-03-29 |
| CA1103050A (en) | 1981-06-16 |
| FR2404847B1 (en) | 1984-12-28 |
| DE2841896C2 (en) | 1991-10-24 |
| DE2841896C3 (en) | 1996-09-26 |
| NL7809821A (en) | 1979-03-30 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| SE462166B (en) | TOXICITY TEST WITH LUMINESCENTA BACTERIA | |
| CA1125152A (en) | Selective determination of viable somatic and microbial cells | |
| Warkentin et al. | New and fast method to quantify respiration rates of bacterial and plankton communities in freshwater ecosystems by using optical oxygen sensor spots | |
| Hagström et al. | Frequency of dividing cells, a new approach to the determination of bacterial growth rates in aquatic environments | |
| KR0183402B1 (en) | Device and method for detecting microorganisms | |
| US5441873A (en) | Apparatus for monitoring liquids | |
| FI67725B (en) | FOERFARANDE FOER FRAMSTAELLNING AV ENHETER AVSEDDA FOER BESTAEMNING AV ANTIBIOTIKA- OCH SULFARESTER I BIOLOGISKA VAETSKOR OCH FRAMSTAELLDA ENHETER | |
| Hewitt et al. | An evaluation of the anti-bacterial action of ceramic powder slurries using multi-parameter flow cytometry | |
| Vetter et al. | Extracellular enzyme activity in the Arctic Northeast Water polynya | |
| Singh et al. | Rapid enumeration of viable bacteria by image analysis | |
| EP1529213B1 (en) | The method and apparatus for determining the number of living cells in a test fluid | |
| Lee et al. | A novel microbial sensor using luminous bacteria | |
| CA2107994C (en) | A method for the direct determination of the toxicity of particulate solids | |
| G A Burton et al. | Sediment microbial activity tests for the detection of toxicant impacts | |
| Ghosh et al. | Toxicity of zinc in three microbial test systems | |
| Lee et al. | Microbial detection of toxic compounds utilizing recombinant DNA technology and bioluminescence | |
| EP0173428B1 (en) | Processes and materials for carrying out microchemical and microbiological tests | |
| Ghosh et al. | Toxicity screening of phenol using Microtox | |
| Endo et al. | Application of flow cytometry for rapid determination of cell number of viable bacteria | |
| Joannis et al. | Comparison of four methods for quantification of biofilms in biphasic cultures | |
| van Hoof et al. | The evaluation of bacterial biosensors for screening of water pollutants | |
| Dougherty et al. | Anaerobic subsurface soil microcosms: methods to monitor effects of organic pollutants on indigenous microbial activity | |
| Ronco | Development of a bioassay reagent using Photobacterium phosphoreum as a test for the detection of aquatic toxicants | |
| Navrátil et al. | Bioluminescence in immobilized cells for biomass detection and biosensor applications | |
| CN105803039A (en) | Application of gene engineering bacteria in detecting total toxicity of water |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| NUG | Patent has lapsed |
Ref document number: 7810154-0 Format of ref document f/p: F |