CN110049817B

CN110049817B - 将材料从第一微加工装置转移到第二微加工装置的方法、和用于其的试剂盒

Info

Publication number: CN110049817B
Application number: CN201780040319.9A
Authority: CN
Inventors: A·哈洛克; M·沙
Original assignee: General Automation Lab Technologies Inc
Current assignee: Separation Biology Co
Priority date: 2016-06-30
Filing date: 2017-06-27
Publication date: 2022-04-15
Anticipated expiration: 2037-06-27
Also published as: JP2019520825A; WO2018005391A1; SG11201811781XA; CN110049817A; AU2017289055A1; AU2017289055A9; EP3478416A4; EP3478416A1; CA3027166A1; IL263869A

Abstract

将材料从第一微加工装置转移到第二微加工装置的方法。在其中培养多个细胞的第一微加工装置的至少一个微孔中加载至少一个磁珠。放置第二微加工装置，使得第一微孔阵列的至少一个微孔与第二微孔阵列的至少一个微孔对齐。施加磁场以将第一微加工装置的至少一个微孔中包含的至少一个磁珠移动到第二微加工装置的至少一个微孔中。以这种方式，来自第一微加工装置的至少一个微孔中的多个细胞的至少一个细胞被转移到第二微加工装置的至少一个微孔中。

Description

将材料从第一微加工装置转移到第二微加工装置的方法、和用于其的试剂盒

相关申请的交叉引用

本申请是于2016年4月21日提交的美国非临时专利申请第15/135,377号的部分延续，并且要求于2016年6月30日提交的美国临时专利申请第62/357,142号的优先权，它们每一个的公开内容通过引用整体并入本文。

技术领域

本公开总体上涉及微生物学、微加工、化学、光学、机器人和信息技术的创新。更具体地，本公开涉及用于高通量培养、筛选、分离、取样和/或鉴定生物实体和/或营养物的系统、设备、试剂盒和方法。

背景技术

用于培养来自环境和其他样品的生物实体的传统技术和工具通常缓慢、费力且昂贵。即使使用这些技术和工具，细胞和其他生物实体仍然常常不能培养成功，造成信息和/或产品机会的缺失。同样，筛选用于特定代谢物、酶、蛋白质、核酸、表型、突变、代谢途径、基因、适应性、能力和/或疗效的生物实体群具有挑战性，需要复杂且昂贵的方法。例如，微生物生活在极其高风险的环境中。为了存活，微生物已经发展出一套令人惊奇的生化工具，包括新的酶、独特的代谢产物、创新的遗传途径，以及操控其环境和微生物邻居的策略，这些强有力的解决方案可以带来新的见解和产品(从拯救生命的抗生素到改善食品生产和安全的肥料)。

发明简述

根据一些实施方案，本公开提供用于精简培养流程、支持高通量筛选和/或开发新的见解和产品的根据一些实施方案的微生物学系统、设备、试剂盒和方法。例如，设备可以包括用于接收含有一个或多个细胞的样品的微加工装置。微加工装置是用于培养一个或多个细胞的高密度微孔阵列。

在一些实施方案中，提供将材料从包含第一微孔阵列的第一微加工装置转移到包含第二微孔阵列的第二微加工装置的方法。该方法包括：将至少一个磁珠加载到第一微孔阵列的至少一个微孔中；孵育第一微加工装置以在第一微孔阵列的至少一个微孔中培养多个细胞；相对于第一微加工装置放置第二微加工装置，使得第一微加工装置的第一微孔阵列的至少一个微孔与第二微加工装置的第二微孔阵列的至少一个微孔对齐；和施加磁场(例如，通过使用永久磁铁或电磁铁)以将第一微孔阵列的至少一个微孔中包含的至少一个磁珠移动到第二微孔阵列的至少一个微孔中，其中来自第一微孔阵列的至少一个微孔中的多个细胞的至少一个细胞被转移到第二微孔阵列的至少一个微孔中。

在一些实施方案中，该方法进一步包括：在孵育第一微加工装置之前，制备第一微加工装置使得第一微孔阵列的至少一个微孔包括至少一个细胞和至少一个磁珠，其中孵育第一微加工装置包括在第一微加工装置的至少一个微孔中从至少一个细胞培养多个细胞。在一些这样的实施方案中，制备第一微加工装置包括将包含溶剂和至少一个磁珠的磁珠溶液加载到至少一个微孔中；和将至少一个细胞加载到所述至少一个微孔中。可以使用磁铁将至少一个磁珠拉到至少一个微孔内，并且可以允许溶剂蒸发。制备第一微加工装置可以包括在至少一个微孔中加载包含至少一个磁珠和至少一个细胞的样品溶液。可以进一步向微加工装置施加膜以在加载珠子和细胞之后密封至少一个微孔。

在一些实施方案中，第一和第二微加工装置的每一个包括上表面，并且相对于第一微加工装置放置第二微加工装置可以是通过将第二微加工装置的上表面放置于第一微加工装置的上表面的对侧并远离第一微加工装置的上表面。

在一些实施方案中，第一和第二微加工装置的每一个包括上表面，并且相对于第一微加工装置放置第二微加工装置包括将第二微加工装置的上表面放置于第一微加工装置的上表面的对侧并与第一微加工装置的上表面接触。

在一些实施方案中，在施加磁场之前，在第一微加工装置的第一微孔阵列的至少一个微孔上施加液体层。液体层可以是与水不混溶的层(例如油层)、水性层或其他层。

在一些实施方案中，方法进一步包括从已经转移到第二微加工装置的至少一个微孔的至少一个细胞获得基因组DNA，和在转移的至少一个磁珠存在下，在第二微加工装置的至少一个微孔中用聚合酶链式反应扩增基因组DNA序列。

在一些实施方案中，提供将材料从包含第一微孔阵列的第一微加工装置转移到包含第二微孔阵列的第二微加工装置的方法。该方法包括：制备第一微加工装置，使得第一微孔阵列的至少一个微孔包括目标材料和至少一个磁珠；相对于第一微加工装置放置第二微加工装置，使得第一微加工装置的第一微孔阵列的至少一个微孔与第二微加工装置的第二微孔阵列的至少一个微孔对齐；和施加磁场以将第一微孔阵列的至少一个微孔中包含的至少一个磁珠移动到第二微孔阵列的至少一个微孔中，其中第一微孔阵列的至少一个微孔中的至少一部分目标材料被转移到第二微孔阵列的至少一个微孔中。目标材料可以是生物实体，例如，它可以包含多个细胞。制备第一微加工装置可以包括：向第一微孔阵列的至少一个微孔提供至少一个细胞和至少一个磁珠；和在施加磁场之前，孵育第一微加工装置以在第一微加工装置的至少一个微孔中从提供的至少一个细胞生长多个细胞。向第一微孔阵列的至少一个微孔提供至少一个细胞和至少一个磁珠可以包括：将包含溶剂和至少一个磁珠的磁珠溶液加载到至少一个微孔中；和将至少一个细胞加载到所述至少一个微孔中。所述至少一个磁珠可以与也包含至少一个细胞的样品溶液一起加载到微孔中。

在一些实施方案中，提供将材料从第一微加工装置转移到第二微加工装置的方法。第一微加工装置包含第一微孔阵列，以及第二微加工装置包含第二微孔阵列。第一微加工装置的第一微孔阵列的至少一个微孔包含至少一个磁珠。该方法包括：在包含至少一个磁珠的至少一个微孔中提供目标材料；相对于第一微加工装置放置第二微加工装置，使得第一微加工装置的第一微孔阵列的至少一个微孔与第二微加工装置的第二微孔阵列的至少一个微孔对齐；和施加磁场以将第一微孔阵列的至少一个微孔中包含的至少一个磁珠移动到第二微孔阵列的至少一个微孔中，其中第一微孔阵列的至少一个微孔中的至少一部分目标材料被转移到第二微孔阵列的至少一个微孔中。

在一些实施方案中，提供将材料从第一微加工装置转移到第二微加工装置的方法。第一微加工装置包含第一微孔阵列，以及第二微加工装置包含第二微孔阵列。第一微加工装置的第一微孔阵列的至少一个微孔包含至少一个磁珠和至少一个细胞。该方法包括：相对于第一微加工装置放置第二微加工装置，使得第一微加工装置的第一微孔阵列的至少一个微孔与第二微加工装置的第二微孔阵列的至少一个微孔对齐；和施加磁场以将第一微孔阵列的至少一个微孔中包含的至少一个磁珠移动到第二微孔阵列的至少一个微孔中，其中第一微孔阵列的至少一个微孔中的至少一部分目标材料被转移到第二微孔阵列的至少一个微孔中。

在一些实施方案中，提供包含第一微加工装置的试剂盒，所述微加工装置包含第一微孔阵列，所述微孔阵列的至少一个微孔包含至少一个磁珠。试剂盒可以进一步包含适于施加于第一微加工装置以密封至少一个微孔的膜。试剂盒可以进一步包括包含第二微孔阵列的第二微加工装置，其中第一微孔阵列的每一个微孔可以与第二微孔阵列的微孔对齐。

在一些实施方案中，提供包含微加工装置的试剂盒，所述微加工装置包含高密度微孔阵列和含有溶剂和多个磁珠的溶液。试剂盒可以进一步包含适于施加于第一微加工装置以密封至少一个微孔的膜。试剂盒还可以包括磁铁。

在使用磁珠和包含磁珠的试剂盒在芯片之间转移材料的上述方法中，膜可以是以下之一：透气的、液体可渗透的或不可渗透的。第一微加工装置(和/或第二微加工装置)的微孔表面密度可以是至少150个微孔/cm²、至少250个微孔/cm²、至少400个微孔/cm²、至少500个微孔/cm²、至少750个微孔/cm²、至少1000个微孔/cm²、至少2500个微孔/cm²、至少5000个微孔/cm²、至少7500个微孔/cm²、至少10000个微孔/cm²、至少50000个微孔/cm²、至少100000个微孔/cm²、或至少160000个微孔/cm²。第一微加工装置的第一(和/或第二)微孔阵列的每个微孔的直径可以为约5μm至约500μm、约10μm至约300μm、或约20μm至约200μm。

应当理解，预期上述概念和以下更详细讨论的其他概念(前提是这些概念互相一致)的所有组合是本文公开的发明主题的一部分。具体地，预期在本公开末尾出现的要求保护的主题的所有组合是本文公开的发明主题的一部分。应当理解，本文明确采用的术语也可以出现在通过引用并入的任何公开内容中，其应被赋予与本文公开的特定概念最一致的含义。

通过检查以下附图和详细描述，其他系统、方法和特征对本领域技术人员而言将是显而易见的。所有这些其他的系统、方法和特征意欲包括于本说明书内，在本发明的范围内，且被所附的权利要求所保护。

附图说明

本领域技术人员将理解，附图主要是说明性目的，而不意欲限制本文描述的发明主题的范围。

附图不一定按比例绘制；一些情况下，本文公开的发明主题的各个方面可能在附图中夸张或放大显示以促进对不同特征的理解。在附图中，类似的参考字符一般是指类似的特征(例如，功能相似和/或结构相似的元件)。

图1是说明根据一些实施方案的微加工装置或芯片的透视图。

图2A-2C分别是说明根据一些实施方案的微加工装置或芯片的维度的顶视图、侧视图和端视图。

图3A和3B分别是说明根据一些实施方案的微加工装置或芯片的分解视图和顶视图。

图4A和4B是说明根据一些实施方案的膜的示意图。图4C是根据一些实施方案的膜表面的图像，所述膜表面具有通过与孔阵列接触而形成的印痕。

图5A是说明根据一些实施方案从样品分离细胞的方法的流程图。图5B是说明根据一些实施方案从土壤样品分离细胞的方法的示意图。

图6是说明根据一些实施方案从样品分离并培养细胞的方法的流程图。

图7是说明根据一些实施方案从复杂样品分离并培养细胞的方法的示意图。

图8A-8C是说明根据一些实施方案通过一个针或多个针选取的示意图。

图9A-9D是示出根据一些实施方案选取孔的图像。

图10A-10D是说明根据一些实施方案用于选取芯片的工具的示意图。

图11是已经通过薄层琼脂选取的孔的图像，说明根据一些实施方案通过膜或密封层的选取。

图12是说明根据一些实施方案的芯片1200的横截面的示意图。

图13是说明根据一些实施方案用于筛选的方法的流程图。

图14是说明根据一些实施方案的筛选方法的示意图。

图15是一系列说明根据一些实施方案的筛选实例的图像。

图16A-16C是说明根据一些实施方案从筛选回收的图像。

图17A是说明根据一些实施方案的用于筛选的芯片的分解图。图17B是根据一些实施方案筛选后的芯片的荧光图像。图17C是示出了根据一些实施方案，筛选后从芯片选取样品的过程的图像。

图18是说明根据一些实施方案的计数方法的流程图。

图19是说明根据一些实施方案的计数方法的示意图。

图20是说明根据一些实施方案的索引系统的示意图。

图21A-21E是说明根据一些实施方案具有孔特异性化学物的芯片的示意图。

图22是说明根据一些实施方案使用磁珠进行转移的示意图。

图23A-23C是说明根据一些实施方案使用磁珠转移材料的图像。

图24A是含有磁珠的源芯片的显微图像；图24B是转移磁珠后目标芯片(其最初是空的)的显微图像。

图25A-25C说明如何借助于磁珠来对齐两个芯片用于在其之间转移材料的实例。

图26A示出了源芯片的不同封闭间隔微孔中的磁珠，其将在没有交叉的情况下被转移到目标芯片；图26B显示了图26A中的磁珠在没有交叉的情况下被转移到目标芯片的相应微孔；图26C示出了源芯片的不同封闭间隔微孔中的磁珠，其将在有交叉的情况下被转移到目标芯片；图26D显示了图26C中的磁珠在有交叉的情况下被转移到目标芯片的微孔。

图27A是微孔加载有大肠杆菌的源芯片的显微图像；图27B是使用磁珠将一些大肠杆菌转移到另一个芯片后源芯片的显微图像；图27C是含有用磁珠从原芯片转移的大肠杆菌并进一步生长的目标芯片的显微图像。

图28是根据本公开的一些实施方案，在各种含量的磁珠存在下的gDNA的芯片上PCR产物的凝胶电泳结果。

图29是根据本公开的一些实施方案，从不同条件获得的一系列PCR产物的凝胶电泳结果。

图30是根据本公开的一些实施方案，在磁珠存在下三个不同种类混合物的芯片上PCR产物的凝胶电泳结果。

发明详述

本公开整体上涉及用于分离、培养、适应性、取样和/或筛选生物实体和/或营养物的系统、试剂盒、设备和方法。公开了用于接收包含至少一个生物实体(例如，至少一个细胞)的样品的微加工装置(或“芯片”)。术语“生物实体”可以包括但不限于生物体、细胞、细胞成分、细胞产物和病毒，术语“种类”可以用于描述一个分类单元，包括但不限于操作分类单元(OTU)、基因型、种系型、表型、生态型、历史、行为或相互作用、产物、变体和进化上显著的单元。

细胞可以是古生菌、细菌和真核生物(例如真菌)。例如，细胞可以是微生物，例如好氧、厌氧或兼性好氧微生物。病毒可以是噬菌体。其他细胞成分/产物可以包括但不限于蛋白质、氨基酸、酶、多糖、三磷酸腺苷(ATP)、脂质、核酸(例如DNA或RNA)、核苷、核苷酸、细胞膜/细胞壁、鞭毛、菌毛、细胞器、代谢物、维生素、激素、神经递质和抗体。

营养物可以是确定的(例如化学上确定的或合成的培养基)或不确定的(例如基础或复合培养基)。营养物可以包括或者是实验室配制的和/或商业制造的培养基(例如，两种或多种化学物的混合物)的成分。营养物可以包括或者是液体营养培养基(即营养肉汤)，例如海生菌肉汤、溶菌肉汤(例如Luria肉汤)等的成分。营养物可以包括或者是液体培养基的成分，其与琼脂混合以形成固体培养基和/或可商购的制造琼脂板，例如血琼脂。

营养物可以包括或是选择性培养基的成分。例如，选择培养基可用于只生长某些生物实体或仅具有某些性质(例如耐抗生素或合成某些代谢物)的生物实体。营养物可以包括或是鉴别培养基的成分，通过使用特定指示剂(例如中性红、苯酚红、曙红Y，或亚甲蓝)存在下的生化特征来区分一种生物实体与另一种生物实体或其他种生物实体。

营养物可以包括或是源自天然环境的提取物或培养基的成分。例如，营养物可以源自对特定类型的生物实体天然的环境，不同环境或多个环境。环境可以包括但不限于一种或多种生物组织(例如结缔组织、肌肉、神经、上皮、植物表皮、血管、基本组织等)、生物流体或其他生物产物(例如羊水、胆汁、血液、脑脊液、耵聍、渗出物、粪便物、胃液、组织间液、细胞内液、淋巴液、奶、粘液、瘤胃内容物、唾液、皮脂、精液、汗液、尿液、阴道分泌物、呕吐物等)、微生物悬浮液、空气(包括例如不同气体含量)、超临界二氧化碳、土壤(包括例如矿物质、有机物、气体、液体、生物体等)、沉积物(例如农业的、海洋的等)、活的有机物(例如植物、昆虫、其他小生物体和微生物)、死的有机物、饲料(例如牧草、豆类、青贮饲料、作物残渣等)、矿物、油或油产品(例如动物、植物、石化)、水(例如天然来源的淡水、饮用水、海水等)和/或污水(例如卫生、商业、工业和/或农业废水和地表径流)。

微加工装置可以界定用于培养至少一种生物实体的高密度微孔阵列。术语“高密度”可以是指系统或方法在恒定区域内分布大量实验的能力。例如，包含“高密度”实验单元的微加工装置可以包括约150个微孔/cm²至约160,000个微孔或更多/cm²，如下进一步讨论。其他实施例示于表1。

表1

微加工装置可以包括具有一系列功能层的基底。所述系列的功能层可以包括第一功能层，其界定第一阵列的实验单元(例如，孔)和至少一个随后的功能层，其界定前述功能层的每个实验单元的随后阵列的实验单元(例如微孔)。每个实验单元可以设置为接收和培养和/或筛选生物实体和/或营养物。具体地，本文所述的系统、试剂盒、设备和方法可用于自动化和/或高通量筛选针对高密度细胞矩阵的不同条件。例如，本文所述的系统、试剂盒、设备和方法可用于测试并比较一种或多种不同营养物对微生物生长的作用，和/或筛选代谢物、酶活性、突变或其他细胞特征。

图1是说明根据一些实施方案的微加工装置或芯片的透视图。芯片100包括以显微镜幻灯片格式成形的基底，其上表面102具有注射成型特征。特征包括四个分开的微孔阵列(微阵列)104以及喷射标记106。每个微阵列中的微孔以格子图案排列，在芯片100的边缘周围和微阵列104之间具有无缝隙的边缘。

图2A-2C分别是说明根据一些实施方案的芯片100的维度的顶视图、侧视图和端视图。图2A中，芯片100的顶面约为25.5mm乘以75.5mm。图2B中，芯片100的末端约为25.5mm乘以0.8mm。图2C中，芯片100的侧面约为75.5mm乘以0.8mm。

将样品加入微加工装置后，可以向至少一部分的微加工装置应用膜。图3A是从根据一些实施方案的图3B中顶视图所示出的微加工装置300的分解视图。装置300包括容纳例如土壤微生物的具有孔302的阵列的芯片。膜304置于孔302阵列上方。垫片306置于膜304上方。具有填充孔310的聚碳酸酯盖308置于垫片306上方。最后，向盖308应用密封带312。

膜可以覆盖至少一部分的微加工装置，包括一个或多个实验单元、孔或微孔。例如，将样品加入微加工装置后，可以向高密度微孔阵列的至少一个微孔应用至少一张膜。可以向微加工装置的多个部分应用多个膜。例如，可以向高密度微孔阵列的单独的分部应用单独的膜。

可以将膜连接、附着、部分附着、固定、密封和/或部分密封至微加工装置，以将至少一种生物实体保留在高密度微孔阵列的至少一个微孔中。例如，可以使用层压将膜可逆地固定至微加工装置。可以将膜刺破、剥离、分离、部分分离、移除和/或部分移除以获取高密度微孔阵列的至少一个微孔中的至少一种生物实体。

至少一个实验单元、孔或微孔中的一部分细胞群可以附着至膜上(经由，例如吸附)。如果这样，可以通过剥离膜取样至少一个实验单元、孔或微孔中的细胞群，使得至少一个实验单元、孔或微孔中的所述部分细胞群仍然附着在膜上。

图4A和4B是说明根据一些实施方案的膜的示意图。图4A示出了芯片400的侧视图，界定了填充有内容物的孔阵列和在孔阵列上密封芯片400的膜402，使得当从芯片400剥离时，与芯片400接触的膜402的表面具有各个孔的印迹且具有附着(例如黏住)于其上的孔内容物的样品，如图4B所示。图4C是根据一些实施方案具有与孔阵列接触形成的印迹的膜表面的图像。

膜可以是不可渗透的、半渗透的、选择性渗透的、差异性渗透的和/或部分渗透的，以允许至少一种营养物扩散至高密度微孔阵列的至少一个微孔中。例如，膜可以包括天然材料和/或合成材料。在一些实施方案中，选择孔径足够小的膜以将至少一些或全部细胞保留在微孔中。对于哺乳动物细胞，孔径可以是几微米，且仍然保留细胞。然而，在一些实施方案中，孔径可以小于或等于约0.2μm，例如0.1μm。膜直径和孔径取决于材料。例如，可以使用亲水性聚碳酸酯膜，其直径可以为约10mm至约3000mm，孔径可以为约0.01μm至约30.0μm。不透性膜的孔径接近于0。在具有不透性膜的实施方案中，任何营养物必须在用膜密封前提供于微孔中。气体可渗透但液体不可渗透的膜可能允许氧气进入微孔，和二氧化碳从微孔出去。膜可以具有复杂结构，其孔径可以确定或不确定。然而，孔可以是纳米尺度。选择膜的其他因素可以包括成本、密封能力和/或灭菌能力。

基底可以界定从第一表面延伸至与所述第一表面相对的第二表面的微通道阵列。微通道可以具有在第一表面的第一开口和在第二表面的第二开口。可以向至少一部分的第一表面应用第一膜，使得至少一个微通道中的至少一些细胞群附着于第一膜。可以向至少一部分的第二表面应用第二可拆卸膜，使得至少一个微通道中的至少一些细胞群附着于第二膜。通过剥离第一膜取样至少一个微通道中的细胞群，使得至少一个微通道中的至少一些细胞群仍然附着于第一膜，和/或剥离第二膜，使得至少一个微通道中的至少一些细胞群仍然附着于第二膜。

术语“高通量”可以是指系统或方法能够实现平行或顺序的大量实验的快速执行的能力。“高通量”系统的实例可以包括具有细胞生物学技术的自动化设备以制备、孵育和/或进行大量化学、遗传性、药理学、光学和/或图像分析，从而筛选一种或多种生物实体的至少一种代谢物、酶、蛋白质、核酸、表型、突变、代谢途径、基因、适应性和能力，如本文所讨论。根据一些实施方案，“高通量”可以是指规模为至少约96个实验至至少约10,000,000个实验的同时或几乎同时的实验。

本文公开的系统、试剂盒、设备和方法可用于针对生物实体(例如细胞)矩阵的不同条件的高通量筛选。“孔中孔”概念可以通过制造(例如，微加工)任何需要或期望的水平的具有多层功能层的基底或芯片来实现(即，在孔中的孔中的孔中的孔)。第一功能层可以界定实验单元(例如孔)阵列。每个实验单元通过界定随后的实验单元(例如微孔)阵列表示第二功能层。这允许在单个芯片上同时进行多个实验或测试，从而允许高通量操作。

例如，在图3A和3B中，垫片306置于膜304上方，所述膜304应用于根据一些实施方案的微加工装置300上的孔302的阵列。垫片306仅具有一个开口。然而，在进一步的实施方案中，可以在装置(具有或不具有膜)上方放置具有更小开口的多个较小垫片或具有超过一个更小开口的单个垫片，从而形成位于其中的功能层或具有随后功能层的较大实验单元阵列或随后的实验单元阵列(例如孔302)。

使用多层功能层，例如可以同时或几乎同时测试超过一种营养物或营养制剂。例如，可以使用相同格式来筛选代谢物或细胞的特殊能力或避免使微生物相较于其他营养物依赖环境衍生的营养物。

实验单元是微加工装置表面的预定位点。例如，可以设计芯片的表面以将细胞固定在第一阵列的预定位点中。这些预定位点可以是孔、微孔、微通道和/或指定的固定位点。例如，可以制造表面以界定微孔阵列。可以通过在基底确定壁或添加壁将阵列分成部分。例如，可以制造表面以首先界定第一阵列的孔，其中又制造每个孔的内表面以界定第二阵列的微孔、微通道或固定位点。在另一个实例中，可以制造表面以界定微孔阵列，向该表面应用另一个基底(例如琼脂、塑料或另一种材料)以将该表面和由其界定的微孔隔开。每个孔、微孔、微通道和/或固定位点可以设置为接收和生长至少一个细胞；然而，在使用中，任何给定的孔、微孔、微通道或固定位点实际上可以接收或不接收和/或生长一个或多个细胞。实验单元的类型可交换。例如，本文明确描述微孔的实施方案也意欲公开其中微孔至少部分替换为微通道、固定位点和/或其他类型的实验单元的实施方案。

微加工装置的一个或多个部分可以用表面化学改性剂选择、处理和/或涂层以具有特定的表面化学。例如，至少一个部分的基底表面可以设置为具有第一表面特征或第二表面特征，所述第一表面特征排斥细胞和/或减少细胞粘附在表面上的倾向，所述第二表面特征吸引细胞和/或增加细胞粘附在表面上的倾向。根据靶细胞的类型，材料和/或涂层可以是疏水和/或亲水的。可以处理基底的至少一部分顶表面以具有第一表面特征，其排斥靶细胞和/或减少靶细胞粘附在表面上的倾向。同时，可以处理各实验单元、孔或微孔的至少一部分内表面以具有第二表面特征，其吸引靶细胞和/或增加靶细胞占据实验单元、孔或微孔的倾向。基底表面可以具有多个部分，其具有不同表面特征。

可以使用化学气相沉积、电穿孔、等离子体处理和/或电化学沉积应用表面化学改性剂。表面化学改性剂可以控制表面电位、Lund电位、ζ电位、表面形态、疏水性和/或亲水性。表面化学改性剂可以包括盐水、聚电解质、金属、聚合物、抗体和/或等离子体。例如，表面化学改性剂可以包括十八烷基三氯硅烷。表面化学改性剂可以包括动态共聚物，例如聚氧乙烯(20)失水山梨醇单月桂酸酯和/或聚乙二醇P(1,13,3-四甲基丁基)-苯基醚。表面化学改性剂可以包括静态共聚物，例如泊洛沙姆407、聚(L-赖氨酸)、和/或聚(乙二醇)-聚(L-赖氨酸)嵌段共聚物。

用于筛选针对细胞矩阵的不同条件的设备可以包括具有界定微孔阵列的表面的基底。微孔阵列的部分可以分成次阵列(例如通过较大孔或壁)。基底可以微加工。每个微孔可以接收并生长至少一种生物实体(例如细胞)。所得生物实体(例如细胞)的矩阵可以是生物实体的高密度矩阵。第一阵列和/或第二阵列可以是平面的、基本上平面的，和/或多平面的(例如在滚轮上)。

术语“高分辨率”可以是指系统或方法区别大量可得实验的能力。例如，“高分辨率”的系统或方法可以从包含高密度实验单元的微加工装置选择一个实验单元，其中所述实验单元的直径为约1nm至约800μm。微加工装置或芯片的基底可以包括约或超过10,000,000个微孔。例如，微孔阵列可以包括至少96个位置、至少1,000个位置、至少5，000个位置、至少10,000个位置、至少50,000个位置、至少100,000个位置、至少500,000个位置、至少1,000,000个位置、至少5,000,000个位置、或至少10,000,000个位置。

微孔的表面密度为约150个微孔/cm²至约160,000个微孔/cm²或更高。微加工装置或芯片的基底的微孔表面密度为至少150个微孔/cm²、至少250个微孔/cm²、至少400个微孔/cm²、至少500个微孔/cm²、至少750个微孔/cm²、至少1,000个微孔/cm²、至少2,500个微孔/cm²、至少5,000个微孔/cm²、至少7,500个微孔/cm²、至少10,000个微孔/cm²、至少50,000个微孔/cm²、至少100,000个微孔/cm²、或至少160,000个微孔/cm²。

微孔的尺寸可以从纳米级(例如直径为约1至约100纳米)到微米级或更大。例如，各微孔的直径可以为1μm至约800μm，直径为约25μm至约500μm，或直径为约30μm至约100μm。微孔的直径可以为约或小于1μm、约或小于5μm、约或小于10μm、约或小于25μm、约或小于50μm、约或小于100μm、约或小于200μm、约或小于300μm、约或小于400μm、约或小于500μm、约或小于600μm、约或小于700μm、或约或小于800μm。

微孔的深度可以为约500μm至约5000μm，深度为约1μm至约500μm，或深度为约25μm至约100μm。微孔的深度可以为约1μm、约5μm、约10μm、约25μm、约50μm、约100μm、约200μm、约300μm、约400μm、约500μm、约600μm、约700μm、约800μm、约1000μm、约1,500μm、约2,000μm、约3,000μm、或约5,000μm。

各微孔的开口或横截面可以是任何形状，例如圆形、六角形或正方形。各微孔可以包括侧壁。对于开口或横截面不是圆形的微孔，本文所述的微孔的直径是指具有同等面积的环形的有效直径。例如，对于边长为10x10微米的正方形微孔，具有同等面积(100平方微米)环的直径为11.3微米。侧壁的横截面图可以是直的、斜的、和/或弯曲的。可以在高密度微孔阵列的至少一个微孔中放入以下进一步描述的至少一种独特的位置特异性标签以促进鉴定种类以及种类与高密度微孔阵列的特定微孔的联系。至少一种独特标签可以放入和/或置于微孔底部和/或微孔的至少一侧。至少一种独特标签可以包括核酸分子，其具有用于与至少一种生物实体的靶标核酸片段退火的具有靶标特异性核苷酸序列的和用于鉴定高密度微孔阵列的至少一个微孔的位置特异性核苷酸序列。

例如，微加工装置或芯片的基底可以具有尺寸为约4英寸乘以4英寸的表面。表面可以界定约1亿个微孔的阵列。微孔阵列可以通过壁分成约100个子部分和/或基底可以界定约100个孔的阵列，其中各子部分或孔内界定的约100万个微孔总计约1亿个微孔。在测试不同营养物的使用情况下，可以在芯片上加载来自环境样品的微生物，使得单个微生物或微生物簇分入芯片的微孔中，各微孔位于较大孔的底部。每个较大孔可以包括实验单元，使得可以在同一芯片上平行或顺序测试约100种不同营养物，其中每个孔提供多达100万个测试例。

靶细胞可以是古生菌、细菌和真核生物(例如真菌、植物或动物)。例如，靶细胞可以是微生物，例如好氧、厌氧和/或兼性好氧微生物。可以在靶细胞的组合物上平行或顺序测试不同营养物以分析并比较例如对细胞群、细胞成分和/或细胞产物的生长或其他影响。可以筛选靶细胞组合物的细胞成分、产物和/或能力，例如一个或多个病毒(例如噬菌体)、细胞表面(例如细胞膜或细胞壁)、代谢物、维生素、激素、神经递质、抗体、氨基酸、酶、蛋白质、多糖、ATP、脂质、核苷、核苷酸、核酸(例如DNA或RNA)、表型、突变、代谢途径、基因和适应性。

细胞组合物可以包括环境样品提取物和/或稀释剂。环境样品提取物和/或稀释剂可以包括但不限于一种或多种生物组织(例如结缔组织、肌肉、神经、上皮、植物表皮、血管、基本组织等)、生物流体或其他生物产物(例如羊水、胆汁、血液、脑脊液、耵聍、渗出物、粪便物、胃液、组织间液、细胞内液、淋巴液、奶、粘液、瘤胃内容物、唾液、皮脂、精液、汗液、尿液、阴道分泌物、呕吐物等)、微生物悬浮液、空气(包括例如不同气体含量)、超临界二氧化碳、土壤(包括例如矿物质、有机物、气体、液体、生物体等)、沉积物(例如农业的、海洋的等)、活的有机物(例如植物、昆虫、其他小生物体和微生物)、死的有机物、饲料(例如牧草、豆类、青贮饲料、作物残渣等)、矿物、油或油产品(例如动物、植物、石化)、水(例如天然来源的淡水、饮用水、海水等)和/或污水(例如卫生、商业、工业和/或农业废水和地表径流)。

向微加工装置应用(例如加载)包含细胞的组合物之前，方法可以包括通过组合细胞与环境样品提取物和/或稀释剂制备组合物。方法可以进一步包括液化环境样品提取物和/或稀释剂。可以将组合物中细胞的浓度调节至每个实验单元、孔或微孔一个细胞的靶标分布。

如果样品包含细胞和/或病毒，可以在向微加工装置应用后将样品中的细胞裂解以释放核酸分子。可以用化学处理例如碱暴露、洗涤剂、超声波、酶蛋白酶K或溶菌酶暴露裂解细胞。也可以通过加热裂解细胞。

图5A是说明根据一些实施方案从样品分离细胞的方法的流程图。在步骤500中，获得样品。在步骤502中，用至少一种物理技术(例如混合和/或超声处理)和化学技术(例如螯合剂、洗涤剂和/或酶)将样品均质化和/或分散。在步骤504中，使用例如

非颗粒培养基(可从Progen Biotechnik GmbH,Heidelberg,Germany获得)通过密度离心分离均质的和/或分散的样品中的细胞。

图5B是说明根据一些实施方案从土壤样品分离细胞的方法的示意图。小图506示出了土壤样品。小图508示出了试管中的均质的和/或分散的样品。小图510示出了离心后的样品，分成可溶碎片512、细胞514、不可溶碎片516和

518。

图6是说明根据一些实施方案从样品分离并培养细胞的方法的流程图。在步骤600中，获得样品。在步骤602中，从所得样品提取至少一个细胞。在步骤604中，在微加工装置或芯片的至少一个高密度微孔阵列中加载至少一个提取的细胞。步骤604可以包括用至少一个提取的细胞制备细胞浓缩物、选择至少一种营养物/培养基，和/或选择至少一张膜。在步骤606中，用至少一张选择的膜密封至少一部分的微孔阵列以将细胞浓缩物保留在微孔中。在步骤608中，孵育芯片。步骤608可以包括选择温度、确定氛围(例如好氧或厌氧)，和/或孵育时间。在步骤610中，根据本文所述的方法，将芯片分开和/或基本上复制(使用例如选取器)，获得两个部分的培养细胞。例如，可以剥离至少一张膜，使得一部分培养细胞仍然附着，或剥离或刺破以取样培养细胞。在操作步骤612中，处死一部分培养细胞用于鉴定。步骤612可以包括PCR、测序和/或各种数据分析。在步骤614中，鉴定目标菌株。可以用例如目标菌株和/或剩余部分的培养细胞进行进一步的培养、测试和/或鉴定。

图7是说明根据一些实施方案从复杂样品分离并培养细胞的方法的示意图。小图700示出了复杂样品的实例，尤其是微生物群样品702和土壤样品704。在小图706中，使用例如图5A和5B示出的方案从样品提取至少一个细胞。在小图708中，将至少一个提取的细胞(和任何环境提取物和/或稀释剂)加载到具有至少一个高密度微孔阵列的微加工装置或芯片710。可以将芯片710和试剂盒712放入孵育器714。试剂可用于添加液体以维持生长和/或各种筛选目的的营养需求。小图716示出了输出：培养细胞的分离的菌株。

鉴定微孔中生长的细胞或微生物的种类或谱系分类需要包括但不限于以下的技术：DNA测序、核酸杂交、质谱、红外光谱、DNA扩增和抗体结合，以鉴定遗传元件或其他种类标识符。很多鉴定方法和处理步骤杀死微生物，从而阻止目标微生物的进一步培养和研究。为了能够鉴定细胞或微生物，同时允许特定目标克隆的随后培养、研究和进一步详尽阐释，设计进一步的实施方案用于取样基底或芯片上的每个实验单元、孔或微孔，同时保持实验单元、孔或微孔的微生物群的局部完整性和分离。

如上所述的基底可以允许使用进一步的系统、试剂盒、设备和方法取样细胞群。例如，可以向基底的第一表面应用选取装置。该装置可以包括面向第一表面的至少一个突起。所述至少一个突起的直径小于各微孔、孔或实验单元的开口直径。可以将至少一个突起插入容纳细胞群的至少一个微孔、孔或实验单元，使得至少一个微孔、孔或实验单元中的一部分细胞群粘附和/或附着于所述至少一个突起。可以通过从基底的第一表面移除装置取出至少一个微孔、孔或实验单元中的细胞群样品，使得至少一个微孔、孔或实验单元中的一部分细胞群粘附和/或附着于所述至少一个突起。各突起可以是针或多个针的组配物。

图8A-8C是说明根据一些实施方案通过一个针或多个针选取的示意图。提供芯片800用于经由显微镜802观察，并经由选取控制装置804选取。在图8A中，选取控制装置804包含具有单个针的臂806。在图8B中，示出了具有多个针的臂808。图8C是选取过程中芯片的透视图。

图9A-9D是示出根据一些实施方案选取孔的图像。在图9A中，孔是满的。在图9B中，将针移动至位置中。在图9C中，选取孔。在图9D中，从孔中取出样品。

图10A-10D是示出根据一些实施方案用于选取芯片的工具的示意图。在图10A中，将包含多个针的工具与具有多个孔的芯片对齐。在图10B中，降低工具使得针浸入孔中。在图10C中，示出了具有附着样品的针，并将样品转移至新芯片。或者，在图10D中，快速翻转工具使得样品可以保留在工具本身上。

或者，当至少一个突起插入至少一个微孔、孔或实验单元时，所述至少一个微孔、孔或实验单元中的一部分细胞群体积向上移位且围绕至少一个突起，使得至少一些体积移位的部分是在基底的第一表面上和/或至少一个微孔、孔或实验单元的内表面上。方法还包括通过收集至少一些体积移位部分的细胞群在至少一个微孔中取样细胞群。

可以向与基底的第一表面相对的第二表面应用类似的选取装置。该装置可以包括面向第二表面的至少一个突起。所述至少一个突起的直径约等于或小于至少一个微孔、孔或实验单元的直径。将所述至少一个突起压靠在所述第二表面上与容纳细胞群的所述至少一个微孔、孔或实验单元相对应的位置，和/或插入容纳细胞群的所述至少一个微孔、孔或实验单元中，使得至少一个微孔、孔或实验单元中的一部分细胞群移动至基底的第一表面和/或至少一个微孔、孔或实验单元的内表面上。然后可以收集移动部分的细胞群。细胞群可以位于至少一个实验单元、孔或微孔中的塞子(例如水凝胶或其他软材料如琼脂)上，使得当将至少一个突起压靠在第二表面且插入至少一个微孔时，塞子被移动，从而移动所述部分的细胞群。

可以将来自至少一个实验单元、孔或微孔的细胞群样品置于第二位置。在进一步取样之前，可以将至少一个突起清洁和/或灭菌。为了有利于细胞附着的表面特征，至少一个突起的至少一部分可以由用表面化学改性剂处理和/或涂覆的材料构成。至少一个突起可以是突起阵列。当向基底的第一表面应用装置时，该突起阵列可以插入相应的实验单元、孔或微孔阵列。突起阵列中突起的数量可以对应于第一阵列中实验单元的数量、一个第二微孔阵列中微孔的数量或基底中微孔的总数。

用于取样基底中细胞群的另一个装置包括至少一个面向第一表面的针和/或纳米吸管。至少一个针和/或纳米吸管的外直径小于各微孔的开口直径，且其内直径能够容纳靶细胞直径。至少一个针和/或纳米吸管插入容纳细胞群的至少一个实验单元、孔或微孔中。使用压力将一部分细胞群从所述至少一个实验单元、孔或微孔引入装置来取出所述至少一个实验单元、孔或微孔中的细胞群样品。

可以将来自至少一个实验单元、孔或微孔的细胞群样品置于第二位置。在进一步取样之前，可以将至少一个针和/或纳米吸管清洁和/或灭菌。至少一个针和/或纳米吸管可以是针和/或纳米吸管阵列。当向微加工基底的第一表面应用装置时，该针和/或纳米吸管阵列可以插入相应的实验单元、孔或微孔阵列。针和/或纳米吸管阵列中针和/或纳米吸管的数量可以对应于第一阵列中实验单元的数量、一个第二微孔阵列中微孔的数量或基底中微孔的总数。

用于取样基底中细胞群的另一种方法包括向容纳液体中的细胞群的至少一个实验单元、孔或微孔应用聚焦的声波能量。可以以有效从至少一个微孔喷射液滴的方式应用聚焦的声波能量，例如诸如声音液滴喷射(ADE)(参见例如Sackmann等,"AcousticalMicro-and Nanofluidics:Synthesis,Assembly and Other Applications,"Proceedingsof the 4th European Conference on Microfluidics(2014年12月))。所述液滴可以包括至少一个实验单元、孔或微孔中细胞群的样品。所述液滴可以导入第二容器或表面或基底。

基底可以包括至少第一片和第二片，所述第一片包括至少一部分第一表面，所述第二片包括至少一部分第二表面。所述第一片和第二片沿着至少一部分与所述第一表面和第二表面平行的平面可拆卸连接。所述平面划分实验单元、孔或微孔。通过拆卸第一片和第二片取样至少一个实验单元、孔或微孔中的细胞群，使得至少一个实验单元、孔或微孔中的第一部分的细胞群仍然附着于第一片，且至少一个实验单元、孔或微孔中的第二部分的细胞群仍然附着于第二片。

图12是说明根据一些实施方案的芯片1200的横截面的示意图。芯片1200包括界定填充有内容物1204的孔1202阵列的基底。基底包含第一片1206和第二片1208。第一片1206和第二片1208沿着与孔1202阵列平行且平分孔1202阵列的平面1210可拆卸连接。当第一片1206和第二片1208拆卸时，孔1202及其内容物1204被分开，造成两份内容物1204，其保留芯片1200上内容物1204的隔离和位置。

各微孔、实验单元或微通道可以包括部分屏障，其将微孔、实验单元或微通道部分分隔成第一部分和底部部分，使得细胞能够在第一部分和底部部分两者中生长。在取样细胞群之前，上述方法可以包括分散和/或降低细胞群中的细胞簇。分散和/或降低细胞群中的细胞簇可以包括但不限于应用超声波、振荡和用小颗粒分散。

上述方法可以进一步包括将细胞群样品从至少一个实验单元、孔或微孔沉积入第二位置。第二位置可以是相应的实验单元、孔或微孔阵列。第二位置可以是单个容器。可以保留来自至少一个实验单元、孔或微孔的细胞群样品用于随后培养。或者，可以保留来自至少一个实验单元、孔或微孔的细胞群的剩余细胞用于随后培养。

上述方法可以进一步包括从细胞群样品和/或细胞群的剩余细胞鉴定至少一个细胞。这可以包括进行DNA、cDNA和/或RNA扩增、DNA和/或RNA测序、核酸杂交、质谱和/或抗体结合。或者或额外的，这可以包括鉴定至少一个细胞来源的实验单元、孔或微孔。可以用包含位置特异性核苷酸序列的独特标签标记每个实验单元、孔或微孔。为鉴定实验单元、孔或微孔，可以在测序和/或扩增反应中鉴定位置特异性核苷酸序列，且位置特异性核苷酸序列可能与至少一个细胞来源的至少一个实验单元、孔或微孔相关。

如上所述的微加工装置能够使用进一步的系统、试剂盒、设备和方法培养源自环境的样品中的细胞。例如，可以向基底的第一表面应用样品，使得至少一个细胞占据至少一个微孔、孔或实验单元。向至少一部分第一表面(例如，至少一部分实验单元或孔的内表面)应用半渗透性膜，使得营养物可以扩散入至少一个微孔、孔或实验单元。同时，防止和/或减轻占据细胞从至少一个微孔、孔或实验单元逃离。半渗透性膜可以是例如水凝胶层。使用例如层压可以将半渗透性膜可逆或不可逆地连接或固定至基底。因此，可以在具有至少一种营养物的至少一个微孔、孔或实验单元中孵育占据细胞。使用进行性部分交换，细胞可以在一段时间内从至少一种营养物逐渐过渡到至少一种其他营养物或营养物制剂，从而经历驯化或适应。

可以使用源自环境的第一营养物孵育占据至少一个第一实验单元、孔或微孔的细胞，和可以使用源自环境的第二营养物孵育占据至少一个第二实验单元、孔或微孔的细胞。上述方法可以包括比较占据至少一个第一实验单元、孔或微孔的细胞和占据至少一个第二实验单元、孔或微孔的细胞，以分析第一营养物和第二营养物。

例如，方法可以包括一个或多个以下步骤：

·获得芯片，其在大量较大孔或流式细胞内界定1000至1000万或更多个微孔，各微孔的直径为约1μm至约800μm，深度为约1μm至约800μm，芯片进一步具有一种或多种设置为促进靶标微生物移动至微孔的表面化学；

·向所述芯片应用环境样品或环境样品的衍生物，使得任何靶标微生物位于微孔中；

·将一种或多种半渗透性滤纸、水凝胶层或其他屏障置于芯片上，使得生成允许营养物扩散入微孔但防止和/或减轻微生物从微孔逃离的屏障；

·用至少一种营养物(例如源自环境)孵育芯片；

·通过进行性部分交换逐渐用至少一种其他营养物(例如制剂)替换所述营养来源；和

·检测微孔中微生物的任何生长。

靶细胞可以是古生菌、细菌或真核生物。靶标病毒可以是噬菌体。当靶向病毒时，芯片的微孔还可以包括其中可以生长病毒的宿主细胞。检测占据细胞或病毒的生长可以包括检测以下方面的变化：生物质(例如DNA/RNA/蛋白质/脂质)、代谢物的存在或不存在、pH、营养物消耗，和/或气体消耗。检测占据细胞或病毒的生长可以包括进行实时顺序成像、显微镜、光学密度、荧光显微镜、质谱、电化学、扩增(DNA、cDNA和/或RNA)、测序(DNA和/或RNA)、核酸杂交和/或抗体结合。

图13是说明根据一些实施方案用于筛选的方法的流程图。在步骤1300中，获得样品。在步骤1302中，从所得样品提取至少一个细胞。在步骤1304中，在微加工装置或芯片的至少一个高密度微孔阵列中加载至少一个提取的细胞。步骤1304可以包括用至少一个提取的细胞制备细胞浓缩物、选择至少一种营养物/培养基，和/或选择至少一张膜。在步骤1306中，用至少一张选择的膜密封至少一部分的微孔阵列以将细胞浓缩物保留在微孔中。在步骤1308中，孵育芯片。步骤1308可以包括选择温度、确定氛围(例如好氧或厌氧)，和/或孵育时间。可以进行遗传筛选和/或功能筛选。在步骤1310中，向芯片应用遗传筛选。在步骤1312中，根据本文所述的方法，将芯片分开和/或基本上复制(使用例如选取器)，获得两个部分的培养细胞。例如，可以剥离至少一张膜，使得一部分培养细胞仍然附着，或剥离或刺破以取样培养细胞。在操作步骤1314中，处死一部分培养细胞用于鉴定。步骤1314可以包括PCR、测序和/或各种数据分析。在步骤1316中，鉴定目标菌株。可以用例如目标菌株和/或剩余部分的培养细胞进行进一步的培养、测试和/或鉴定。或者，在步骤1318中，向芯片应用功能筛选。在步骤1320中，观察一种或多种变量，在步骤1316中鉴定目标菌株。

图14是说明根据一些实施方案的筛选方法的示意图。小图1400示出了复杂样品的实例，尤其是微生物群样品1402和土壤样品1404。在小图1406中，使用例如图5A和5B示出的方案从样品提取至少一个细胞。在小图1408中，将至少一个提取的细胞(和任何环境提取物和/或稀释剂)加载到具有至少一个高密度微孔阵列的微加工装置或芯片1410。可以将芯片1410和试剂盒1412放入孵育器1414。试剂可用于添加液体以维持生长和/或各种筛选目的的营养需求。小图1416示出了输出：筛选结果和培养细胞的分离的菌株。

图15是是一系列说明根据一些实施方案的筛选实例的图像。图像示出了具有膜和其上应用有酸敏感层的芯片的一部分，以筛选低pH。在图像1500中，可见超过1800个50μm微孔，9个清晰命中1502。图像1504是框1504的放大图，图像1506是具有命中1502的一个微孔的放大图。

图16A-16C是说明根据一些实施方案从筛选回收的图像。在图16A中，使用显微镜和具有至少一个针的选取装置选取至少一个孔。在图16B中，将针移除并在培养基中孵育。在图16C中，可见生长。

图17A是说明根据一些实施方案的用于筛选的芯片的分解图。在图17A中，芯片1700包括微孔中具有例如土壤微生物的高密度微孔阵列。向芯片1700应用膜1702。在膜1702上方向芯片1700应用垫片1704。在垫片1704和膜1702上方向芯片应用具有荧光大肠杆菌的琼脂1706。图17B和17C是说明根据一些实施方案的筛选实例的图像。在该实例中，筛选清空区。图17B是筛选后芯片的荧光图像，所述芯片如图17A中的芯片1700一样制备。图17C是示出了从该芯片通过琼脂选取样品的过程的图像。

在一些实施方案中，设备中的位置可能与一部分(或一部分的部分)样品从设备移除后在该位置处存在的所述一部分样品有关。设备可以是微阵列或包括微阵列。微阵列可以包括用于施用样品的多个位置，其中各位置用独特标签标记，所述独特标签用于鉴定在一部分样品从微阵列移除后，该部分样品来自的位置。

本公开涉及用于鉴定在一部分样品从微阵列移除后，所述一部分含有至少一个核酸分子的样品来自微阵列上的哪个位置的方法，该方法包括以下步骤：(a)在微阵列的多个位置的一个或多个上施用一个或多个部分的样品，其中各位置用包含核酸分子的独特标签标记，所述独特标签包含：(i)位置特异性核苷酸序列；和(ii)第一靶标特异性核苷酸序列；(b)允许至少一个部分的样品中发现的靶标核酸分子与标记位置的标签退火；(c)对退火的核酸分子群进行引物延伸、逆转录、单链连接或双链连接，从而将位置特异性核苷酸序列整合入每个通过引物延伸、逆转录、单链连接或双链连接产生的核酸分子；(d)合并步骤(c)中产生的核酸分子群；(e)测序合并的核酸分子群，从而获得一个或多个位置特异性核苷酸序列的序列；和(f)将从合并的核酸分子群获得的至少一个位置特异性核苷酸序列与用包含所述位置特异性核苷酸序列的标签标记的微阵列上的位置相关联，从而鉴定包含至少一个核酸分子的一部分样品来自微阵列的哪个位置。在一些实施方案中，样品可以包括至少一个细胞，且在步骤(a)之后和步骤(b)之前从细胞释放一个或多个核酸分子。样品可以包括至少一个细胞，且在步骤(a)之后和步骤(b)之前所述至少一个细胞复制或分裂。在步骤(b)之前，可以从至少一个位置移除一部分样品的一部分，且所述一部分样品的一部分可以存储于与微阵列上所述一部分样品的初始位置相关的单独容器中。关联或鉴定位置的方法可以进一步包括以下步骤：扩增步骤(c)中产生的核酸分子或步骤(d)中产生的合并的核酸分子群。扩增步骤可以包括聚合酶链式反应扩增、多重聚合酶链式反应扩增、巢式聚合酶链式反应扩增、连接酶链式反应扩增、连接酶检测反应扩增、链置换扩增、基于转录的扩增、基于核酸序列的扩增、滚环扩增或超支化滚环扩增。可以在扩增反应中添加其他引物。例如，PCR反应需要5'和3'引物两者。扩增反应中使用的一个引物可以与样品中的核苷酸序列互补。

在一些实施方案中，在向微加工装置施用组合物之前，可以用核酸酶处理包括细胞和/或病毒的组合物，使得污染核酸分子在随后步骤中不被扩增。

在公开的方法和设备中使用的测序可以是获得序列信息的任何方法，包括杂交和使用序列特异性蛋白(例如酶)。测序可以包括Sanger测序、通过杂交测序、通过连接测序、定量增量荧光核苷酸加法测序(QIFNAS)、逐步连接和切割、荧光共振能量转移、分子信标、TaqMan报告基因探针消化、焦磷酸测序、荧光原位测序(FISSEQ)、摆频测序、多重测序、聚合菌落(POLONY)测序(参见例如美国专利申请公开号2012/0270740,其全文通过引用并入本文)；纳米格滚环(ROLONY)测序(参见例如美国专利申请公开号2009/0018024,其全文通过引用并入本文)、等位基因特异性寡聚连接测定测序，或下一代测序(NGS)平台上的测序。NGS平台的非限制性实例包括来自以下的系统：

(San Diego,California)(例如,MiSeq^TM/NextSeq^TM/HiSeq^TM和HiSeq X^TM)、Life Technologies(Carlsbad,California)(例如,Ion Torrent^TM),和Pacific Biosciences(Menlo Park,California)(例如,

RS II)。

生物体或种类可以通过比较获得自该生物体的核酸序列和含有生物体序列的各种数据库来鉴定。例如，核糖体RNA序列数据可从SILVA rRNA数据库项目(Max PlanckInstitute for Marine Microbiology,Bremen,Germany(www.arb-silva.de)；参见例如,Quast等,"The SILVA Ribosomal RNA Gene Database Project:Improved DataProcessing and Web-Based Tools,"41Nucl.Acids Res.D590-D596(2013),和Pruesse等,"SINA:Accurate High-Throughput Multiple Sequence Alignment of RibosomalRNA Genes,"28Bioinformatics 1823-1829(2012),两者全文均通过引用并入本文)获得。其他核糖体RNA序列数据库包括核糖体数据库项目(Michigan State University,EastLansing,Michigan(www.rdp.cme.msu.edu)；参见例如,Cole等,"Ribosomal DatabaseProject:Data and Tools for High Throughput rRNA Analysis"42Nucl.AcidsRes.D633-D642(2014),其全文通过引用并入本文)和Greengenes(Lawrence BerkeleyNational Laboratory,Berkeley,California(www.greengenes.lbl.gov)；参见例如,DeSantis等,"Greengenes,a Chimera-Checked 16S rRNA Gene Database and WorkbenchCompatible withARB,"72Appl.Environ.Microbiol.5069-72(2006),其全文通过引用并入本文)。

遗传序列数据库包括公众可得的几乎260,000个正式描述的物种的核苷酸序列(National Institutes of Health,Bethesda,Maryland(www.ncbi.nlm.nih.gov)；参见例如,Benson等,"GenBank,"41Nucl.Acids Res.D36-42(2013)。

用于匹配和鉴定的序列可以包括16S核糖体区域、18S核糖体区域或提供鉴定信息的任何其他区域。所需变体可以是基因型(例如单核苷酸多态性(SNP)或其他类型的变体)或包含特定基因序列(例如编码酶或蛋白质的序列)的种类。生物体或种类还可以通过将其序列与定制内部序列数据库匹配来鉴定。在一些情况中，如果从某个位置的一部分样品获得的序列与从该种类或微生物获得的已知DNA、cDNA或RNA序列具有至少特定百分比的同一性(例如至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)，可以断定在微阵列的该位置发现所述种类或微生物。

本公开进一步涉及用于制造包括用于施用样品的多个位置的微阵列的方法，其中至少一个位置用独特标签标记，所述方法包括以下步骤：(a)合成多个标签，其中每个标签包含核酸分子，所述核酸分子包含：(i)位置特异性核苷酸序列；和(ii)靶标特异性核苷酸序列；和(b)将标签置于微阵列上的多个位置的至少一个位置上。在另一个实施方案中，本公开涉及用于制造包括用于施用样品的多个位置的微阵列的方法，其中至少一个位置用独特标签标记，所述方法包括以下步骤：(a)合成多个标签，其中每个标签包含核酸分子，所述核酸分子包含靶标特异性核苷酸序列且不包含位置特异性核苷酸序列；和(b)将标签置于微阵列上的多个位置的至少一个位置上。微阵列每个位置上的靶标特异性序列可以相同。在任一上述实施方案中，步骤(a)可以在步骤(b)之前进行。放置步骤(b)可以包括通过液体操作程序(例如，移液、用实心针头点样、用中空针头点样或用喷墨装置沉积)将标签置于各个位置。至少一个标签可以包括预先合成的核酸分子或核酸分子的一部分。步骤(a)可以与步骤(b)同时进行。在一些实施方案中，至少一个标签包含合成的核酸分子，其在各个位置通过原位合成。合成步骤(a)可以包括喷墨打印合成或光刻合成。

微阵列上的各个位置可以设置为接收一部分样品。可以用核酸分子(例如寡核苷酸)标签或标记位置，所述核酸分子包含至少一种：(i)位置特异性核苷酸序列(条码)；和(ii)靶标特异性核苷酸序列。靶标特异性核苷酸序列可以与样品中发现的核苷酸序列互补或基本上互补。核酸分子中从5'末端至3'末端的核苷酸序列的顺序可以是(i)位置特异性核苷酸序列；和(ii)靶标特异性核苷酸序列。或者，核酸分子中从5'末端至3'末端的核苷酸序列的顺序可以是(2)然后(1)。核酸分子可以在其5'末端连接至微阵列。设备(例如微阵列)上的一个或多个位置可以无标签或未标记。

术语“互补”或“基本上互补”可以是指核苷酸或核酸之间，例如诸如双链DNA分子的两条链之间或寡核苷酸引物和单链核酸上的引物结合位点之间的杂交、碱基配对或形成双链体。通常，互补核苷酸是A和T/U，或C和G。当最佳比对和比较且具有适当核苷酸插入或缺失的一条链的核苷酸与另一条链的至少约80％，通常至少约90％-95％，更优选约98-100％的核苷酸配对时，两个单链RNA或DNA分子称为基本上互补。或者，当RNA或DNA链将在选择性杂交条件下与其补体杂交时，存在基本的互补性。通常，当在一段至少14-25个核苷酸上存在至少约65％互补性、至少约75％或至少约90％互补性时，将发生选择性杂交。

术语“选择性杂交”是指可检测的特异性结合。多核苷酸、寡核苷酸及其片段在大量与非特异性核酸的可检测结合最小化的杂交和洗涤条件下与核酸链选择性杂交。可以使用“高严格”条件来实现本领域已知的本文讨论的选择性杂交条件。“高严格”条件的实例是用一种多核苷酸孵育另一种多核苷酸的方法，其中一个多核苷酸可以在杂交温度42℃下在杂交缓冲液(6x SSPE或SSC、50％甲酰胺、5x Denhardt试剂、0.5％SDS、100μg/ml变性的片段化鲑鱼精子DNA)中固定至固体表面(例如膜)12-16小时，然后用洗涤缓冲液(1x SSC、0.5％SDS)在55℃洗涤两次。

作为位置标签一部分的核酸分子可以包含至少一个脱氧核糖核苷酸或至少一个核糖核苷酸。核酸分子可以是单链或双链。核酸分子可以是具有单链悬端的双链分子。

在一些实施方案中，位置标签可用于扩增与其退火的核酸分子。因此，位置标签可以包含进一步含有扩增引物结合位点的核酸序列。扩增引物结合位点的长度可以是至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个、至少23个、至少24个、至少25个、至少26个、至少27个、至少28个、至少29个或至少30个核苷酸。核酸分子中从5'末端至3'末端的核苷酸序列的顺序可以是例如：(1)扩增引物结合位点；(2)位置特异性核苷酸序列；和(3)靶标特异性核苷酸序列。

在一些实施方案中，核酸分子可以包含靶标特异性核苷酸序列而不包含位置特异性核苷酸序列。在某些实施方案中，核酸分子可以包含靶标特异性核苷酸序列而不包含位置特异性核苷酸序列或扩增结合位点序列。在进一步的实施方案中，核酸分子可以仅包含靶标特异性核苷酸序列。在甚至进一步的实施方案中，核酸分子可以仅包括靶标特异性核苷酸序列。扩增引物结合位点能够结合聚合酶链式反应引物、多重聚合酶链式反应引物、巢式聚合酶链式反应引物、连接酶链式反应引物、连接酶检测反应引物、链置换引物、基于转录的引物、基于核酸序列的引物、滚环引物或超支化滚环引物。扩增反应期间可以向微阵列加入其它引物。例如，PCR反应需要5'和3'引物两者。靶标特异性核苷酸序列可以在含有靶标核酸分子的位置扩增，且可以通过例如qPCR、终点PCR和/或检测扩增核酸分子的染料来检测。

期望将与位置标签退火的核酸分子或基于这种核酸分子的扩增产物进行测序。位置标签可以包含进一步含有适配子核苷酸序列的核酸序列。在某些实施方案中，适配子核苷酸序列不存在于位置标签中，但在二次PCR反应中或通过连接添加至样品核酸分子。适配子核苷酸序列可以是通用适配子或特定测序平台(例如

或Ion Torrent^TM)的适配子。适配子核苷酸序列可以包括测序引物结合位点。测序引物结合位点能够结合用于以下的引物：Sanger测序、通过杂交测序、通过连接测序、定量增量荧光核苷酸加法测序(QIFNAS)、逐步连接和切割、荧光共振能量转移、分子信标、TaqMan报告基因探针消化、焦磷酸测序、荧光原位测序(FISSEQ)、摆频测序、多重测序、聚合菌落(POLONY)测序(参见例如美国专利申请公开号2012/0270740,其全文通过引用并入本文)；纳米格滚环(ROLONY)测序(参见例如美国专利申请公开号2009/0018024,其全文通过引用并入本文)、等位基因特异性寡聚连接测定测序、NGS平台上的测序或任何适合的测序程序。NGS平台的非限制性实例包括来自以下的系统：

RS II)。

位置特异性核苷酸序列(例如条码)的长度为至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个、至少23个、至少24个、至少25个、至少26个、至少27个、至少28个、至少29个或至少30个核苷酸。

靶标特异性核苷酸序列的长度为至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个、至少23个、至少24个、至少25个核苷酸、至少26个、至少27个、至少28个、至少29个、至少30个、至少40个、至少50个、至少75个或至少100个核苷酸。

微阵列上的至少一个位置可以进一步用独特分子标识符标签标记。独特分子标识符可用于定量生长(例如在该位置微生物菌落的生长或细胞复制)。独特分子标识符可以是随机核苷酸序列。现有技术已经描述了使用独特分子标识符的方法和独特分子标识符的实例，参见例如其全文通过引用并入本文的WO 2013/173394。例如，独特分子标识符标签的核苷酸序列可以为NNNANNNCNNNTNNNGNNNANNNCNNN(SEQ ID NO:1)，其中Ns(ACGT的等量随机混合)产生大的编码空格，使得扩增的每个分子获得独特(特定)DNA序列条码(该实例中是4^N个条码,或4^21～40亿)。该序列可以计数，而不受来自扩增偏好或其他技术问题的干扰。SEQ ID NO：1中的固定碱基(A、C、G、T)有助于准确读取条码，例如处理indel。

本公开涵盖使用位置特异性标签来监测样品中超过一个靶标特异性核苷酸序列的存在或含量(例如，多重)。微阵列上的至少一个位置可以进一步用包含核酸分子第二独特标签标记，所述核酸分子包含例如：(i)扩增引物结合位点：(ii)位置特异性核苷酸序列；和(iii)靶标特异性核苷酸序列。

在一些实施方案中，核酸分子可以包含靶标特异性核苷酸序列而不包含位置特异性核苷酸序列。在某些实施方案中，核酸分子可以包含靶标特异性核苷酸序列而不包含位置特异性核苷酸序列或扩增结合位点序列。在进一步的实施方案中，核酸分子可以仅包含靶标特异性核苷酸序列。在甚至进一步的实施方案中，核酸分子可以仅包括靶标特异性核苷酸序列。靶标特异性核苷酸序列的长度可以为至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个、至少23个、至少24个、至少25个核苷酸、至少26个、至少27个、至少28个、至少29个、至少30个、至少40个、至少50个、至少75个或至少100个核苷酸。在某些实施方案中，微阵列中每个位置的靶标特异性序列可以相同。可以监测其他靶标特异性核苷酸序列。例如，可以用至少10个、至少25个、至少50个、至少75个或至少100个独特标签标记一个或多个位置，其中每个标签包含与该位置标签中其他靶标特异性核苷酸序列不同的靶标特异性核苷酸序列。

任何目标基因位置可以提供靶标特异性核苷酸序列。例如以下序列：细菌16S核糖体RNA(rRNA)、18S核糖体RNA、聚(A)RNA、RNA聚合酶基因、DNA聚合酶基因、RecA基因、转座酶基因、核糖体内部转录间隔区(ITS)序列、编码酶的基因、控制区DNA序列、结合位点DNA序列，或可以作为靶标特异性核苷酸序列的任何这些序列的一部分。公开的系统、试剂盒、设备或方法可以使用在以下中描述的一个或多个细菌16S rRNA引物：Sundquist等,"Bacterial Flora-Typing with Targeted,Chip-Based Pyrosequencing,"7:108BMCMicrobiology(2007)和Wang等,"Conservative Fragments in Bacterial 16S rRNAGenes and Primer Design for 16S Ribosomal DNA Amplicons in MetagenomicStudies,"4:10PLoS ONE e7401(2009)，其全文通过引用并入本文。

在公开的设备和方法中使用的样品可以包含多个核酸分子。样品可以包含至少一个DNA分子或至少一个RNA分子。样品可以包含至少一个由限制性酶消化形成的核酸分子。样品可以包含至少一个细胞(例如古细菌细胞、真细菌细胞、真菌细胞、植物细胞和/或动物细胞)。样品可以包含至少一种微生物。样品可以包含一个或多个病毒(例如噬菌体)，对此可能需要提供宿主细胞。微阵列上一个位置的一部分样品可以是单个细胞或从单个细胞生长的菌落。例如，可以将单独的微生物或细胞置于微孔中且允许所述单独的微生物或细胞分裂或复制，使得菌落在各微孔中生长，且其中具有单独的微生物或细胞。因此，微阵列上的位置可以包含单个微生物种类或彼此支持生长的微生物菌株的混合群体。样品可以包含任何合适的稀释剂。在非限制性实例中，样品包含土壤、污水、粪便物、体腔内容物、生物流体、活的有机物、死的有机物、微生物悬浮液、天然淡水、饮用水、海水、废水、超临界二氧化碳、矿物、气体、缓冲液、酒精、有机溶剂和/或油。在一些实施方案中，在将一部分样品置于微阵列的至少一个位置前，将包含以下的核酸分子置于该位置：(a)(i)位置特异性核苷酸序列和(ii)一个或多个靶标特异性核苷酸序列；或(b)一个或多个靶标特异性核苷酸序列(即，不包含位置特异性核苷酸序列)。在其他实施方案中，在将一部分样品置于微阵列的至少一个位置后，将包含以下的核酸分子置于该位置：(a)(i)位置特异性核苷酸序列和(ii)一个或多个靶标特异性核苷酸序列；或(b)一个或多个靶标特异性核苷酸序列(即，不包含位置特异性核苷酸序列)。在一个实例中，将样品或一部分样品置于微阵列上并孵育，然后将包含至少一种以下的核酸分子置于微阵列上：(i)位置特异性核苷酸序列和(ii)靶标特异性核苷酸序列。在一些实施方案中，将所述一部分样品的一部分从微阵列上的至少一个位置移除，并储存在单独的容器中，或在将核酸分子置于微阵列上的至少一个位置之前或之后将微阵列分开。

至少一个位置特异性标签可以包含预先合成且通过液体操作程序置于该位置的核酸分子或核酸分子的一部分。例如，液体操作程序可以是移液、用实心针头点样、用中空针头点样或用喷墨装置沉积。可以使用预先单独合成的多个核酸分子在位置产生标签。至少一个标签可以包含通过原位合成(例如通过喷墨打印合成或光刻合成)在该位置合成的核酸分子。

种类的数字计数

本文描述了包含具有高密度微孔的表面的高密度芯片装置。可以将来自微生物群样品的微生物稀释并向装置施用，使得孔包含约一个微生物/占据孔。然后，孵育芯片使得微生物在孔内复制。进一步，本文描述了基于DNA的位置索引系统，以测定各孔中存在什么种类。该索引系统可能涉及将PCR引物预先加载到各孔，所述PCR引物含有鉴定孔的寻址条码和靶向微生物基因组中的特定基因序列(例如16S)的提供种类信息或靶向所需基因序列的引物序列。孵育后，释放微生物DNA，PCR引物扩增靶标细菌DNA区域，并收集来自芯片上各个孔的扩增子，然后通过下一代测序读取。

本文所述的系统、试剂盒、设备和方法可用于进行样品中各微生物种类或变体的数量的绝对计数。每个孔可以代表一个数字事件，其表示原始稀释样品中单个微生物的存在。位置索引系统允许用户测定孔中是什么细菌种类。测量单位可以是“孔中存在细菌种类”，且可以与孔中细菌的数量无关。

在一个实例中，微生物的混合样品包含50％的种类1、30％的种类2和20％的种类3。稀释样品，然后向芯片施用，使得各占据的孔(大部分)具有一种微生物。微生物复制。注意，不同种类的复制速度可能不同。然后，加工芯片，使得将孔中来自微生物的DNA释放，且将16S或一些其他靶标序列扩增。可以收集来自各孔的DNA扩增产物，并用下一代测序进行测序。可以分析下一代测序数据以测定对于每个孔，在各占据孔中的是什么种类。很多孔可能根本不被占据。可以通过以下测定各种类的丰度：各种类占据的孔的总数除以占据孔的总数。可以通过以下测定绝对丰度：将来自步骤的各种类的丰度％乘以原始样品中微生物的总数。可以将测序数据与公众可得的序列数据库相比较，以测定各占据孔中是什么种类。例如，核糖体RNA序列数据可从上述SILVA rRNA数据库获得。其他核糖体RNA序列数据库还包括上述核糖体数据库项目、Greengenes和

遗传序列数据库。

目前用于估计样品中微生物种类的丰度的方法涉及使用传统技术，例如显微镜、染色、选择性培养基、代谢/生理筛选和用培养皿培养。这些方法通常由于缺乏特异性(显微镜、染色、选择性培养基)或缺乏计数样品中所有种类的能力(选择性培养基、培养)而不精确，而很多种类用传统方法生长不好或根本不生长。

目前用于测定微生物群样品中微生物种类相对丰度的分子方法涉及从样品提取微生物DNA、对提供种类或其他信息的16S或一些其他DNA区域进行PCR扩增，然后对所得PCR产物进行下一代测序(NGS)。从NGS数据中种类特异性DNA序列的相对频率推测原始样品中各种类的相对丰度。文献有关于这类分析的很多实例，该方法为很多微生物群研究打下基础。

目前方法的问题是它不控制以下：存在于不同微生物中的16S基因的数量可能不同，PCR偏好(其中不同微生物种类的序列可能以不同速率扩增)和测序偏好(其中不同微生物种类的序列可能以不同速率被测序)。结果是，用目前方法获得的相对丰度数据的准确度有很多不确定性。

不同种类的计数可以基于单个孔中种类的存在。这与加载期间分入孔中的来自原始样品的单个微生物直接相关。只有PCR/NGS可用于鉴定各孔中存在什么微生物。鉴定的序列的数量不是来自一部分计算。因此，方法中PCR、NGS或靶标序列拷贝数变化或偏好不重要。

一些实施方案可以在以下具有应用：微生物群研究、微生物产品开发和发展、临床诊断、和其中需要精确计数样品中的微生物种类的任何其他领域。

因此，一些实施方案可以提供微生物群样品中各种类相对丰度精确得多的测量以及将该相对丰度测量转化为绝对丰度或原始样品中各种类的直接计数的能力(通过计算稀释和/或结合原始样品中微生物总数的测量)。一些实施方案可以为高密度微加工芯片提供新应用(除了培养和筛选微生物)。

图18是说明根据一些实施方案的计数方法的流程图。在步骤1800中，获得样品。在步骤1802中，从所得样品提取至少一个细胞。在步骤1804中，在微加工装置或芯片的至少一个高密度微孔阵列中加载至少一个提取的细胞。步骤1804可以包括用至少一个提取的细胞制备细胞浓缩物、选择至少一种营养物/培养基，和/或选择至少一张膜。在步骤1806中，用至少一张选择的膜密封至少一部分的微孔阵列以将细胞浓缩物保留在微孔中。在步骤1808中，孵育芯片。步骤1808可以包括选择温度、确定氛围(例如好氧或厌氧)，和/或孵育时间。在步骤1810中，处死一部分培养细胞用于鉴定。步骤1810可以包括PCR、测序和/或各种数据分析。在步骤1812中，可以评估和/或测定关于样品的信息(例如，微生物群体结构)。

图19是说明根据一些实施方案的计数方法的示意图。小图1900示出了复杂样品的实例，尤其是微生物群样品1902和土壤样品1904。在小图1906中，使用例如图5A和5B示出的方案从样品提取至少一个细胞。在小图1908中，至少一个提取的细胞(和任何环境提取物和/或稀释剂)加载到具有至少一个高密度微孔阵列的微加工装置或芯片1910。可以将芯片1910和试剂盒1912放入孵育器1914。试剂可用于添加液体以维持生长和/或各种筛选目的的营养需求。小图1916示出了输出：序列和培养细胞的相对丰度。

基于液滴的平台

基于离散液滴的平台可以用于分离、培养和/或筛选，其与使用芯片的方式基本相同。液滴是微孔类似物，用作纳米或皮升容器。液滴产生方法，尤其当与芯片上细胞分拣器型仪器组合时，可用于从复杂环境样品分离出微生物。液滴添加可用于饲喂微生物。液滴分裂可用于测序或其他破坏性试验，同时留下活样品。测序所需的所有准备工作也可以液滴形式进行。

一些实施方案可用于将微生物从复杂环境取出来，变成液滴。例如，用于制备含有细胞悬浮液的液滴的调控系统可以包括一个或少量细胞。可以将水滴悬浮于不混溶的液体，使它们彼此保持分离，并防止接触或污染任何表面。可以在各微通道中在例如30Hz产生液滴，每天转化为几百万。

基于液滴的微流体系统可以封装、操纵和/或孵育小液滴(例如，约30pL)。注意到细胞存活和增殖与主体溶液中的对照实验类似。可以在数百Hz产生液滴，意味着可以在几个小时内产生数百万液滴。简单的基于芯片的装置可用于产生液滴，且液滴可以工程化以包含单个细胞。

一些实施方案可用于筛选液滴中的细胞。在芯片上可以以例如每秒500个液滴的速率荧光筛选孵育后的液滴。液滴可以流过在可以设置为用于多种不同测量的落射荧光显微镜的焦点处的通道。这可能是筛选代谢物特别有效的方法，因为由于局限于非常小的液滴，所以局部浓度相当高。

一些实施方案可用于分拣液滴。一旦细胞被分离、生长和/或筛选，可以分拣它们使得获得有用的样品。可以以与常用的FACS机器类似的方式对液滴进行分拣。

一些实施方案可用于分裂液滴。一些实施方案可能需要获取样品并将其分裂的能力，从而将一部分送去测序(破坏性方法)，而保留作为活培养物的另一部分。目前有很多分裂液滴的不同方法，包括但不限于用仔细计算的尺寸构造T形交叉，导致在流动或电润湿时产生液滴分裂(注意不要用太高的电压造成细胞裂解)。

一些实施方案可用于合并液滴和/或向液滴添加试剂。例如，细胞的长时间孵育(例如几周)需要添加液体的能力，以维持生长的营养需求。为各种筛选目的而添加试剂也是有用的。液滴筛选依赖于能够将含有化合物密码的液滴与含有单个细胞的液滴合并。然后可以孵育液滴，和/或将其返回分析芯片以通过其密码鉴定化合物。这可能需要根据需要精确合并液滴的能力。

一些实施方案可用于在液滴中进行PCR。PCR可用于最终测序特定遗传元件(例如16S区域)，从而鉴定微生物。这可以用来测定在各孔中生长的是什么类型的微生物。在基于液滴的系统中，该方法可用于测定各液滴中存在的是什么微生物，只要设计了扩增基因组正确区域的正确引物序列。

一些实施方案可用于从液滴测序DNA(例如在PCR步骤中产生)，和/或制备DNA文库。

用于高密度芯片的位置特异性标签

可以使用具有高密度微孔的表面的高密度芯片装置。可以将来自微生物群样品的微生物稀释并向装置施用，使得孔包含约一个微生物/占据孔。可以孵育芯片使得微生物在孔内复制，所得群体代表单个种类。基于DNA的位置索引系统可用于测定各孔中存在什么种类。该索引系统可能涉及将PCR引物预先加载到各孔，所述PCR引物含有鉴定孔的寻址条码和提供种类信息的靶向特定遗传元件的引物序列(例如微生物基因组的16S)。孵育后，释放微生物DNA，PCR引物扩增靶标细菌DNA区域，收集来自芯片上各个孔的扩增子，然后通过下一代测序读取。

上述位置索引系统可能涉及将不同位置密码加入微芯片的各个孔，或将多个位置密码加入各个孔，使得编码特定数量的孔所需的密码总数减少。例如，如果芯片上有100个孔，如果每个孔一个密码，则需要100个密码。如果从每个孔读取两个密码，同一芯片可以仅用20个密码编码(即，10个编码网格的x轴，10个编码y轴)。

表2提供了每个孔加入两个密码的PCR策略的实例。

表2

表3提供了每个孔加入三个密码的PCR策略的实例。

表3

三个寡聚引物用于制造单个PCR产物。该系统使用两个寡核苷酸在分子的一端放置多个分条码的优点可以包括例如减少所需寡核苷酸的最大长度或者制造超长条码。

该方法可以概括为每个反应加入n个条码。该方法也可以有不同实施，使得条码在靶标序列区域的同一侧。可以使用NGS测序适配子，并使用下一代测序读取条码PCR产物群的全部序列。

在另一种实施中，可以加入固定条码以指示样品数量或板数量，并允许在两个条码的运行中汇集多个样品/板，如表4所示。

表4

在另一种实施中，可以加入固定条码以指示样品数量或板数量，并允许在三个条码的运行中汇集多个样品/板，如表5所示。

表5

注意，在所有情况下，条码在序列中的位置传达信息，因此CODE1、CODE2和CODE3条码在特定孔中不一定彼此不同。

制备寡聚核苷酸并用单码编码系统打印芯片成本较高。例如，10,000个孔的芯片需要10,000个单个条码和10,000个单独打印循环以将这些条码置入芯片上的孔中。如果使用双码系统，可能只需要200个条码和200个打印循环以制造芯片。这意味着大量节约了寡核苷酸成本、打印时间和打印资本投入。

使用双重条码PCR引物，随后进行扩增和测序分析，以提供随机分配到微加工芯片上的DNA或含DNA部分的位置数据可能具有很高的实用性和相对较低的成本。

图20是说明根据一些实施方案的索引系统的示意图。微孔芯片2000具有N行和M列，从而产生NxM个独特索引。可以认为芯片2000中微孔的位置具有坐标(N,M)。每列具有常用的反向引物序列(例如,R1、R2、R3..RM)，和每行具有常用的正向引物序列(例如,F1、F2、F3..FN)。例如，靶标例如16S核糖体核苷酸(rRNA)中特定遗传元件的独特标签可以包括正向引物序列F515和反向引物序列R806。将芯片2000进行PCR后，可以基于正向引物序列和反向引物序列的存在，将靶标遗传元件的存在映射回独特的原始微孔。例如，F515和R806的存在将用户导向芯片2000中具有坐标(515,806)的微孔。

含有细菌的微孔的PCR扩增产物的变异性降低

可以使用基于DNA的位置索引系统来测定各孔中存在什么种类。该索引系统可能涉及将PCR引物预先加载到各孔，所述PCR引物含有鉴定孔的寻址条码和靶向微生物基因组的特定遗传元件(例如16S)的提供种类信息的引物序列。孵育后，释放微生物DNA，PCR引物扩增靶标细菌DNA区域，收集来自芯片上各个孔的扩增子，然后通过下一代测序读取。

限制孔之间PCR产物的量的变异的一些实施方案可以包括在制造芯片期间限制孔中PCR引物的量，使得对于大多数可能的样品DNA浓度而言，DNA扩增反应中PCR引物的量是有限的，从而产生的PCR产物的量在各孔之间的差异将更小。

限制孔之间PCR产物的量的变异的一些实施方案可以包括将芯片上PCR的循环数限制为少于3个循环，或少于5个循环，或少于10个循环，或少于15个循环，或少于20个循环，或少于25个循环，或少于30个循环，使得相对于全循环PCR扩增方案，产生的PCR产物的量在各孔之间的差异将更小。

限制孔之间PCR产物的量的变异的一些实施方案可以包括限制反应混合物中的核苷酸的量，使得与原始样品中DNA的量相比，产生的PCR扩增子的数量与核苷酸的量更相关。具有大量靶标DNA的微孔将在循环过程早期耗尽核苷酸，而具有少量靶标DNA的微孔将在循环过程后期耗尽核苷酸，但产生几乎相同量的扩增产物。

限制孔之间PCR产物的量的变异的一些实施方案可以包括限制在孔中生长的微生物可利用的营养物的量，使得细胞复制，直到耗尽培养基然后停止复制。

限制孔之间PCR产物的量的变异的一些实施方案可以包括在各孔中放入鉴定PCR产物的染料，使得产生的PCR产物越多，信号越亮。可以监测各PCR循环期间染料的强度，一旦观察到所需的信号强度，从孔中取出样品。

限制孔之间PCR产物的量的变异的一些实施方案可以包括使用杂交小珠的混合物以与来自各孔的扩增DNA选择性杂交，所述杂交小珠覆盖有与各孔特异性条码互补的寡核苷酸。一旦小珠饱和，洗掉未结合DNA，从小珠释放结合DNA。然后可以将各孔的DNA的量归一化至小珠的饱和极限。

限制孔之间PCR产物的量的变异的一些实施方案可以包括将芯片孵育长时间，使得生长快的微生物快速填满孔并停止复制，生长慢的微生物逐渐填满孔，且一旦孔中具有大约相同数量的细胞则停止生长。

在一些实施方案中，在芯片格式和方法中使用条码引物和下一代测序(NGS)可以用来鉴定哪个种类在高密度微芯片上的哪个孔中生长。当大约相等数量的细菌占据芯片上的每个微孔时，NGS数据中来自每个孔的信号大约相同。

例如，在一个产生1200万个序列读段的典型NGS运行中，如果该运行中测序24张芯片，每张具有10,000个微孔且每个孔中细菌数量相同，则平均每个孔50个读段。

然而，不同细菌生长速度不同，因此一些孔可能具有很少的细菌，而一些孔具有很多细菌。这可能使NGS的运行变得糟糕，因为NGS分析中没有检测到细菌很少的孔。

因此，在一个产生1200万个序列读段的典型NGS运行的实例中，每次运行测序24张芯片，每张具有10,000个微孔，其中一半具有的细菌比另一半多100倍。生长慢的孔中的细菌被检测到的概率显著降低。这种情况下：

(10,000x24)/2x100＝12,000,000 (1)

(10,000x24)72＝120,000 (2)

低频率孔占总数的1％。因此，在一次NGS运行的12,000,000个读段中，120,000个将来自低频率孔，即平均每个孔1个读段。

为使这种现象最小化，需要开发新的方法来使孔之间的PCR产物的量相等，从而NGS运行检测到所有孔。

用于微生物分离、生长、筛选和分析的硅基微孔芯片

替代或除塑料、玻璃和/或聚合物之外，微加工装置或芯片可以由至少一部分硅构成，以允许在逐孔基础上的电学测量。例如，可以分开每个孔的壁以产生微电容。在另一个实例中，每个孔中FET使得门表面暴露于孔的内容物。代替纯的硅基芯片，可以通过电镀、气相沉积、和/或电弧/火焰喷涂在已有芯片顶部上产生薄的金属层。这可以为芯片添加更多的功能性，使用更便宜和/或更清洁的另一种制造方法，和/或允许手持或便携式设备的小型化。

一些实施方案可以允许通过电学测量监测生长。可以应用阻抗监测来测量微生物(例如细菌)的生长。例如，在其全文通过引用并入本文的Ur等,"Impedance Monitoring ofBacterial Activity,"8:1J.Med.Microbiology 19-28(1975)中，将含有大肠杆菌的试管的阻抗与其细胞计数相比较。也可以对其他类型的细菌(包括假单胞菌属、克雷伯菌属和链球菌属)进行测量以证明效果是普遍的。可以用不同培养基填充孔以测试不同制剂的生长条件。

一些实施方案可以允许通过电学测量筛选。可以在逐孔的基础上进行电学测量，以便进行筛选。一个实例将是pH。有许多不同方式在孔中从一个设备的门上获得pH依赖性反应，包括但不限于ISFET和pH计。带有嵌入式pH传感器的孔阵列可以电学测定那些包含产生酸性或碱性代谢物的微生物的孔。一个简单的实例是从乳糖筛选乳酸的产生。将细菌在孔中稀释、生长，然后用乳糖喂饲。记录pH下降的孔含有能够将乳糖代谢为乳酸的微生物。

一些实施方案可以允许电学测量氧化还原探针。另一种利用电学测量的方法是观察孔中的细菌如何影响已知的氧化还原探针。基本上，可以在细菌存在下测量有明确反应的系统，与预期性质的偏差可以归因于细菌样品。典型的氧化还原探针类似铁氰化物：[Fe(CN)6]3-/4-。铁氰化物还原为亚铁氰化物已经被详细表征，使得性质上的小变化，尤其是电极周围的电子转移可以被发现。该系统是“无标签”的，因为它不需要直接改变细菌本身即可检测。

可以将能够识别微生物(例如大肠杆菌)的抗体固定在ITO电极上。可以从电极测量含有铁氰化物的溶液的电子转移的电阻。大肠杆菌结合至电极表面，与表面上大肠杆菌的浓度成比例地增加电阻。这是可以使用氧化还原探针来检测特定类型的微生物或代谢物的一类测量方法的一个实例。

在硅(或至少金属或金属化塑料)中工作提供的优势包括但不限于：生产芯片较便宜(例如，通过改进现有技术)；允许小型和/或便携式版本的综合检测能力；在其他材料(例如LCR、CV等)中没有的额外的测量能力；在现有装置中整合新发现的基于芯片的检测方法；以及与电学测量和测序的组合。这些优势对使用干扰检测的任何消费者而言是有益的。

保护芯片上的孔特异性化学物的可释放屏障

图21A-21E是说明根据一些实施方案具有孔特异性化学物的芯片的示意图。图21A示出了具有多个微孔的微加工装置或芯片。在图21B中，在芯片的各微孔中加入了微孔特异性化学物。在图21C中，在芯片各孔中的微孔特异性化学物上应用密封剂，从而防止化学物与孔中的其他添加物相互作用。在图21D中，加入样品，在微孔中对样品进行实验。在图21E中，触发剂(例如热)释放微孔特异性化学物，与孔中的样品相互作用。

可以制造或清洁微孔芯片，和/或处理其表面。特异性化学物可以分开制备，然后例如使用允许将一组特异性化学物导入特定的一个或多个孔的方法和/或装置加入孔中。然后可以施用密封剂以保护各种化学物不被环境污染，和/或用一些明确的外部触发剂将其移除/释放/发放。

可以将微加工装置或芯片制造为特定设计，例如清洁的和/或表面处理的以促进润湿。可以将PCR引物打印或针点入特定孔。可以允许芯片干燥，然后通过从乙醇溶液蒸发沉积蜡层。最佳浓度为约1％v/v。可以直接施用熔融蜡，或喷雾水性或醇蜡溶液。或者，可以使用旋涂或气相沉积。可以使用各种蜡，包括但不限于：含有和不含聚乙二醇的硬脂酸甘油酯、鲸蜡硬脂醇、1-十六醇、硬脂酸甘油酯、单硬脂酸甘油酯、鲸蜡硬脂醇聚醚-10(CAS登记号68439-49-6)和一些商业产品，包括但不限于Lotionpro^TM165(可从

Eastsound,Washington获得)和Polawax^TM(可从Croda,Inc.,Edison,New Jersey获得)。之后通过例如加热直到蜡融化来释放下面的化学物。对于这些组合物，将为50℃-70℃。重要的是它足够低而不损坏任何化学成分或煮沸我们的水性溶液。

关键概念是孔特异性化学物，其在芯片上被隔离直到实验者触发释放。该方法可以用于孔的编码，但它也可以更广泛地用于一系列不同的问题。可用于密封芯片的不同化学物包括但不限于抗生素、荧光素、染料、PCR引物、溶解促进剂、抗体和/或测试的各种代谢产物。尽管蜡是密封东西的好方法且之后能够通过加热释放，可以使用其他材料密封，其当暴露于光、超声和/或一些其他触发剂时被释放。相比于向芯片简单地添加试剂，该方法的优势之一是基于逐孔(well-by-well)上的控制。进行微生物实验后通过将化学物打印入孔中可以实现类似的效果，但这随着时间会产生问题(打印运行可以长达一天)，事实是，如果微生物在芯片上后分别填充每个孔，每个孔不可能在相同的时间内暴露。使用释放机制，每个孔能够在相同时间暴露。在一个实例中，可以通过溶剂浇铸沉积蜡。

简单和/或控制相对丰度的分离微孔

高密度芯片装置可以包含具有高密度微孔的表面。可以将来自微生物群样品的微生物或其他细胞类型稀释并施用于装置，使得孔包含约一个微生物或细胞/占据孔。可以用半渗透性膜密封这些微孔，所述半渗透性膜允许营养物扩散入微孔，但防止全部或至少一些微生物或细胞从微孔中移动出来。

可以制备微生物或细胞样品，然后用不可渗透的或仅气体可渗透的膜将其密封入芯片。在芯片或膜上没有液体储库，因此密封时只有孔中的营养物可用于支持微孔中微生物或细胞的生长。该特征的两个原因包括：(1)构建和工作流程简单，因为装置不需要半渗透性膜或储库，不需要添加营养物，且污染可能性较小；(2)通过限制快生型获取营养物来检查其相对丰度。对于包含一些快生型和一些慢生型的样品，快生型在其各自微孔中将很快被限制资源，停止生长或生长缓慢，同时慢生型继续生长。与其中快生型没有被限制营养物的量的情况相比，这使得慢生型在芯片上的微生物群体中占较高的相对丰度。当对芯片上的一切进行测序时，这对于下游处理非常重要。这也为稀有种类提供更好的检测极限，因为在某个点稀有种类不会被生长快的种类超越，从而限制系统检测它们的能力。

目前的方法试图让所有种类生长，无论它们本质上生长快或慢。这样不可避免的结果是，快生型主导群落且仅相对丰度随时间增加。很多类型的下游分析，例如测序或荧光筛选无法分辨给定群体中的每个种类，而是仅能分辨高于某一限制相对丰度的那些。如果目标是保留多样性并检测稀有种类，需要以某种方式限制快生型。

举个例子说明该想法，考虑一个简单的情况，样品包含两个种类：一种每天翻倍，另一种每周翻倍，如表6所示。如果慢生型在开始时是稀有的(相对丰度为5％)，随着两个种类的生长，它很快变得非常稀有。

表6

如果通过生长的营养和/或物理空间的竞争来限制快生型，在过一段时间后，慢生型的相对丰度将开始增加，如表7所示。

表7

限制	第0天	第1天	第2天	第3天	第7天	第14天
							快生型	19	38	50	50	50	50
慢生型	1	1	1	1	2	3
							总计	20	39	51	51	52	53
快生型的相对丰度	0.950	0.974	0.980	0.980	0.962	0.943
							慢生型的相对丰度	0.050	0.026	0.020	0.020	0.038	0.057

用于生物库细胞的高密度微加工阵列

设计生物库以使研究人员获取来自大群体的大量样本，以便开展某些类型的研究，例如与疾病相关的生物标志物发现。生物储存领域的现有技术提供的样品储存在试管或低密度板格式中，例如96孔或384孔板。当待存储的样品数量相对较少并且样品本身是离散的分离群体时，这样是有用的。当存储以下样品(如微生物群样品)时：其中样品数量可能较高且各样品中不同种类或变体的数量可能从每个样品数百到数千或数百万个，目前的生物储存方法变得非常繁琐。使用目前的方法，必须进行费力的分离方案，以便在存储步骤之前或之后分离出单个种类或变体，以便获得期望的种类或变体。

本文所述的系统、试剂盒、设备和方法可用于生物储存(biobank)细胞、微生物、病毒和其他生物实体。由具有高密度微孔的表面组成的高密度芯片装置可能具有每芯片数千个、数十万个或数百万个微孔。例如，可以将来自微生物群样品的微生物(或另一种生物实体，如不同类型的细胞或病毒)稀释并施用至装置，使得孔包含约1个微生物/占据孔。然后，孵育芯片使得微生物在孔内复制，所得群体代表单个种类。基于核酸的位置索引系统可用于测定各孔中存在什么种类。该索引系统可能涉及将PCR引物预先加载到各孔。所述PCR引物含有鉴定孔的寻址条码和提供种类信息或靶向目标遗传序列的靶向微生物基因组中的特定遗传元件(例如16S)的引物序列。孵育后，释放微生物DNA，PCR引物扩增靶标细菌DNA区域。收集来自芯片上各个孔的扩增子，然后通过下一代测序读取。

使用高密度微加工芯片进行生物储存使得各样品内的很多种类或变体能作为单独的群体存储，而不需要在存储之前或之后进行费力的分离方案。使用基于DNA的位置索引系统或定制分析允许更简单的通用的方法来鉴定各微孔内容物的遗传签名或特征，以提供信息，例如种类信息。此外，芯片装置提供一种非常空间有效的存储细胞分离物的方法。例如，具有100,000个孔的单个显微镜玻片大小的芯片占据的空间显著低于相应的传统存储格式。芯片格式还可以通过使一个芯片包含来自单个受试者的许多不同样品来适当地归档和策划样本和/或管理受试者(例如，患者)信息数据库。

为使用该设备来储存细胞，可以将细胞加入和/或置于该装置的微孔中。可以处理微孔中的细胞以减轻存储的影响，然后将其置于合适的存储条件。例如，可以用试剂例如甘油处理细胞以减轻冷冻的影响。然后，可以将芯片置于合适的存储条件例如冰箱中。可以将细胞脱水、冻干，和/或冷冻干燥，且可以将芯片置于合适的条件以保护干燥的细胞。可以向芯片加入额外的结构以进一步促进其作为存储装置的用途。例如，可以在芯片上放置膜或另一种结构元件，以便在存储前密封至少一些孔。

芯片可以加载有细胞，使得芯片上的一部分微孔各自被每个大约一个细胞占据。孵育芯片以允许细胞复制。大量复制芯片及其内容物，使用原始芯片或拷贝的芯片来鉴定芯片的各孔中存在的细胞或种类或基因签名(通过例如使用上述的位置索引系统)。将芯片处理，和/或存储在合适条件下。复制步骤和/或鉴定步骤可以在存储之后而不是存储之前进行。

可以将来自预先存在的一组分离菌株的每个菌株的一个或多个细胞置于芯片上的分离的微孔中。可以记录各个菌株或细胞类型放置的微孔位置，并处理芯片，和/或将其存储在合适条件下。

可以制造一种芯片的版本，其中将防腐化学物隔离在每个孔中的蜡屏障之下。允许分离物在芯片内密封生长，之后在储存前通过热诱导释放防腐剂来保存。

此类设备可用于存储/生物储存混合的微生物群样品，例如来自土壤、人肠道、海水、口腔、皮肤等的微生物群样品。芯片可用于存储其他类型的生物实体，例如真菌、古细菌、人细胞(包括增殖细胞)、动物细胞和病毒。

DNA位置索引系统适用于所有生物实体类型，以产生关于各孔内容物的信息。可以使用定制分析(例如基于抗体或底物的分析)筛选整个芯片以获得期望活性。例如，可以筛选具有储存的T细胞群的芯片以获得特定的免疫活性。

在一个说明性实例中，可以从研究参与者收集人粪便微生物群样品。可以将来自每个个体的粪便微生物生物储存在芯片上，以保留该个体微生物群的记录以及之后用作靶标微生物来源的微生物群样品。在另一个实例中，在临床或研究期间或作为治疗工作流程的一部分(例如，使用离体处理细胞的细胞疗法)，可以从个体取样T细胞或其他免疫细胞的混合群体。还在另一个实例中，可以将土壤生物群落与种子库一起存储。

高分辨率选取

可以设计高精度/精确的选取设备或系统以在上述微加工芯片上执行从和/或到微孔的各种选取功能。靶标基底或芯片可以是在一个表面上具有注射成型特征的显微镜玻片格式(大约25mm x 75mm x 1mm)。微孔可以网格模式排列，在芯片的边缘周围具有约4-8mm的无孔边缘。可以基于选取器的能力确定孔的大小和间隔。微孔可以是沿着各边大小为约25μm至约200μm的正方形，孔边缘之间的间隔为约25μm至约100μm。微孔可以是圆形或六边形。孔的深度可以为约25μm至约100μm。例如，75mmx25mm的玻片具有7mm的边缘，100μm的正方形孔，边与边的间隔为100μm，具有约16,775个微孔。

可以设计高精度/精确的选取系统以在上述微加工芯片上执行从和/或到对应于微孔的一部分膜的各种选取功能。膜可以是之前用于将生长的细菌密封入微孔的薄片。当从芯片剥离时，膜可以在从芯片分离后在其表面上保留微孔阵列的印迹以及细菌样品。因此，剥离的膜可以作为在芯片中生长的细菌的复制物。

高分辨率选取器可以从用户接收数据输入。输入可以包括至少一对芯片微孔坐标，使得选取器从至少一对输入的坐标和/或选取到至少一对输入的坐标。在循环之间可以进行灭菌程序。高分辨率选取器能够在厌氧箱中操作。

高分辨率选取器系统可以接收芯片，并例如使用基准标志物和/或参考孔将选取器与芯片对齐。例如，选取器可以选取芯片上的微孔中生长的细胞至含有生长培养基的96孔或384孔板。选取器可以包括单个选取针或多个选取针。

高分辨率选取器系统可以接收膜，并例如使用膜上的参考孔标志物将选取器与膜对齐。例如，选取器可以从膜选取细胞至含有生长培养基的96孔或384孔板。选取针可以具有不同形状(例如蘑菇形)和/或表面(例如纹理)以便从膜选取。系统还可以包括一个或多个保持和/或展平膜的机制(例如漂浮针和/或真空)。

高分辨率选取器系统能够经由芯片到芯片的转移复制芯片。基于基准标志物和/或参考孔，选取器可以接收并对齐第一芯片。基于基准标志物和/或参考孔，选取器还可以接收并对齐第二芯片。例如，选取器可以将在第一芯片上的微孔中生长的细胞转移至第二芯片的微孔。

用于自动选取在微加工装置中培养的至少一种生物实体的多个种类的靶标种类的高通量系统可以包括用于接收微加工装置的接口。微加工装置界定高密度微孔阵列。高密度微孔阵列的每个微孔设制为分离并培养至少一种生物实体的至少一个种类，且包括多个独特标签的至少一个标签。所述多个独特标签的每个标签包括核酸分子和与高密度微孔阵列的至少一个微孔相关的位置特异性核苷酸序列，所述核酸分子包括与所述至少一种生物实体退火的靶标特异性核苷酸序列。系统还包括具有至少一个突起的高分辨率选取设备，其用于从高密度微孔阵列的至少一个微孔选取至少一种生物实体。系统进一步包括用于接收至少一种靶标特异性核苷酸序列指示的输入装置，和与输入装置和高分辨率选取设备通信偶联的至少一个处理器。所述至少一个处理器获取来自输入装置的至少一个靶标特异性核苷酸序列的指示，将所述至少一个靶标特异性核苷酸序列与多个独特标签比较，基于比较结果确定包含靶标种类的高密度微孔阵列的至少一个微孔，并控制高分辨率选取设备从高密度微孔阵列的至少一个确定的微孔选取至少一种生物实体。

公开了用于自动选取在微加工装置中培养的至少一种生物实体的多个种类的靶标种类的高通量系统。微加工装置界定高密度微孔阵列，高密度微孔阵列的每个微孔与多个独特引物的至少一个独特引物相关。系统包括用于接收从微加工装置移除的膜的接口，所述膜密封高密度微孔阵列的各个微孔以将至少一种生物实体保留在高密度微孔阵列中，使得移除膜后，对应于高密度微孔阵列的至少一种生物实体的一部分仍然附着于膜上。系统还包括高分辨率选取设备，其包括：至少一个突起，用于从对应于高密度微孔阵列的至少一个微孔的至少一个膜位置选取至少一种生物实体；输入装置，用于接收与靶标种类相关的至少一个靶标特异性核苷酸序列的指示；和与输入装置和高分辨率选取设备通信偶联的至少一个处理器。所述至少一个处理器获取来自输入装置的至少一个靶标特异性核苷酸序列的指示，将所述至少一个靶标特异性核苷酸序列与多个独特标签比较，基于比较结果确定包含靶标种类的对应于高密度微孔阵列的至少一个微孔的至少一个膜位置，并控制高分辨率选取设备从至少一个确定的膜位置选取至少一种生物实体的一部分。

上述实施方案可以各种方式实现。例如，可以使用硬件、软件或其组合实现实施方案。当用软件实现时，软件代码可以在任何适当的处理器或处理器集合(无论是在单个计算机中提供，还是分布于多个计算机中)上执行。

此外，应当理解，计算机可以多种形式来体现，例如机架式计算机、台式计算机、笔记本计算机或平板计算机。此外，计算机可以嵌入在一般不被视为计算机但具有适当处理能力的装置中，包括个人数字助理(PDA)、智能电话或任何其他合适的便携式或固定电子设备。

并且，计算机可以具有一个或多个输入和输出装置。这些装置可用于呈现用户界面。可用于提供用户界面的输出装置的实例包括打印机或用于输出的视觉呈现的显示屏和扬声器或用于输出的声音呈现的其他声音产生装置。可用于提供用户界面的输入装置的实例包括键盘、指向装置如鼠标、触摸板和数字化平板。作为另一个实例，计算机可以通过声音识别或其他声音形式接收输入信息。

这种计算机可以以任何适当形式通过一个或多个网络互连，包括诸如企业网络、智能网(EST)或因特网之类的局域网或广域网。这种网络可以基于任何适当的技术，且可以根据任何适当的方案操作，且可以包括无线网络、有线网络或光纤网络。

本文列出的各种方法或过程可以编码为软件，其可以在使用各种操作系统或平台的任意之一的一个或多个处理器上执行。此外，这种软件可以用任何各种合适的编程语言和/或编程或脚本工具编写，也可以编译为在框架或虚拟机上执行的可执行机器语言代码或中间代码。

磁珠

在一些实施方案中，上述系统、试剂盒、装置和方法可以使用磁珠。例如，可以使用磁珠将一部分微孔内容物从第一芯片转移到复制的第二芯片的相应微孔，从而基本上复制所述第一芯片。通过基本上复制第一芯片(或源芯片)，原始或复制件可以支持很多不同类型的下游分析，同时另一个剩余的芯片可以用于不同目的，例如回收活细胞。此外，可以以高度平行的方式进行这种磁珠介导的转移，因为可以同时处理所有微孔。当芯片上的微孔阵列的密度很大(例如数千或百万)时，与顺次复制方法相比，这尤其有利。

因此，根据本公开的一个方面，提供将材料(或内容物)从第一微加工装置(或芯片)转移至第二微加工装置(或芯片)的方法。第一微加工装置和第二微加工装置分别包含第一微孔阵列和第二微孔阵列。在一些实施方案中，第一微孔阵列的每个微孔可以与第二微孔阵列的相应微孔对齐(例如，第一和第二微加工装置可以具有相同的微孔模式或构造)。简言之，本公开所述的使用磁珠的各种转移方法通常称为“珠转移”方法或“珠介导的转移”方法。源芯片上的微孔的材料/内容物可以通过物理吸附、吸收、非特异性结合或特异性结合等随着一个或多个磁珠的移动而转移到靶标芯片上的相应微孔。

一部分转移的内容物或材料可以包含例如至少一种溶质、反应产物、液体和生物实体(例如，一种或多种细胞或病毒、细胞表面(例如细胞膜或细胞壁)、代谢物、维生素、激素、神经递质、抗体、氨基酸、酶、肽、蛋白质、糖、ATP、脂质、核苷、核苷酸、核酸(例如DNA或RNA)等)。

在一些实施方案中，该方法包括：制备第一微加工装置，使得第一微孔阵列的至少一个微孔包括目标材料和至少一个磁珠；相对于第一微加工装置放置第二微加工装置，使得第一微加工装置的第一微孔阵列的至少一个微孔与第二微加工装置的第二微孔阵列的至少一个微孔对齐；和施加磁场以将第一微孔阵列的至少一个微孔中包含的至少一个磁珠移动到第二微孔阵列的至少一个微孔中，其中第一微孔阵列的至少一个微孔中的至少一部分目标材料被转移到第二微孔阵列的至少一个微孔中。

在其他实施方案中，该方法包括：在第一微孔阵列的至少一个微孔中加载至少一个磁珠；孵育第一微加工装置以在第一微孔阵列的至少一个微孔中生长多个细胞；相对于第一微加工装置放置第二微加工装置，使得第一微加工装置的第一微孔阵列的至少一个微孔与第二微加工装置的第二微孔阵列的至少一个微孔对齐；和施加磁场以将第一微孔阵列的至少一个微孔中包含的至少一个磁珠移动到第二微孔阵列的至少一个微孔中，其中来自第一微孔阵列的至少一个微孔中的多个细胞的至少一个细胞被转移到第二微孔阵列的至少一个微孔中。

在一些实施方案中，微生物在第一芯片的微孔阵列中生长，然后使用磁珠基本上复制芯片以将一部分微生物转移至第二芯片。在一些实施方案中，在第一芯片的微孔阵列中进行化学反应，然后使用磁珠基本上复制第一芯片以将一部分反应产物转移至第二芯片。

图22是说明根据一些实施方案使用磁珠的一般转移过程的原理图。首先，将具有微孔阵列2215(其包括至少一个磁珠和至少一种目标材料)的第一微加工装置2210与具有复制的微孔阵列的第二微加工装置2220对齐。第一装置的上表面2211和第二装置的上表面2221在对齐中彼此面对，使得微孔的开口彼此直接相对以允许转移。在一些实施方案中，原始微孔阵列包括多个磁珠和/或目标材料。在进一步的实施方案中，一个微孔可包括多个磁珠和/或目标材料。可以施加磁场，例如，通过使用位于第二装置2220的后侧的磁铁2230，使得将磁珠2223从第一装置的微孔拉出，以移动到第二装置2220的对齐的微孔中。结果，第一装置中的第一微孔的至少一部分内容物粘附或以其他方式携带或使其通过磁珠移动到第二装置中的第二微孔。虽然示出了第二设备2220是空白的(即，没有加载的内容物)，但是应该理解它可以根据需要包含培养基或其他内容物。此外，根据需要，第一装置2210和第二装置2220均可用于培养更多细胞和/或进行任何下游实验或测定。

图23A-23C是说明根据一些实施方案通过以下来转移材料的图像：将磁珠放入含有细菌的芯片中，然后在其上对齐新鲜芯片，并用磁铁将珠子拉过来。图23A示出了覆盖之前的两个芯片。图23B示出了对齐的两个芯片，图23C示出了在芯片上方放置磁铁以将磁珠从底部芯片拉出并进入顶部芯片。

图24A是含有磁珠的源芯片的显微图像；图24B是在转移磁珠之后目标芯片(其最初是空的)的显微图像。如本文所用，“磁珠”(或“磁性纳米颗粒”)是指包含响应于施加的磁场的顺磁性或超顺磁性核(例如氧化铁)的珠子。磁珠表面可以是粗糙的/纹理化的。还可以用小分子、生物相容性聚合物、肽、蛋白质等外涂或修饰磁珠，以增强结合或转移。例如，磁珠可以配置为捕获生物实体(例如，用凝集素夹带溶剂、用抗体识别分子，和/或用寡核苷酸选择性地杂交核酸)，和/或可以诱导生物实体在磁珠表面上生长。在本公开的实施例中，测试了两种磁珠。直径约为2.8μM的Thermo Fisher磁珠(

羧酸)(其用聚合物外壳包封的球形超顺磁性核心)和直径为8.79μm的Spherotech Inc的球形羧基磁珠(CM-80-10)，其涂有聚合物并用表面羧基修饰。

可以在珠子转移之前(例如在孵育之后)将磁珠立即引入第一微加工装置的微孔，在微孔的初始内容物之前或与之一起加载，或者在其间的任何时间加入。可以将另外的磁珠组加载到第一芯片的微孔中用于重复转移，以在不同时间制作第一芯片的额外拷贝。

在从源芯片转移材料之前，可以将试剂和/或培养基预先加载到第二(或目标)芯片的微孔中。在一些实施方案中，试剂和/或培养基在微孔中干燥或用可释放的屏障(例如蜡)密封在微孔中。由于毛细作用，可能不需要将试剂和/或培养基密封在微孔中；即，液体和微孔壁之间的表面张力和粘合力用于在外力如重力的情况下将液体保持在微孔中。

可以以不同的方式将磁珠加载到微加工装置上。例如，可以在包含载体溶剂的珠溶液(或悬浮液)中将磁珠加载到芯片上(即，进入芯片的微孔中)。然后蒸发载体溶剂。可以存储该芯片以在将来某天使用，准备加载目标材料(例如，微生物细胞、其他细胞等)，如果需要或必要的话用膜密封，并且正常地孵育芯片，其中珠子留在微孔内。在加载磁珠之前，可以首先对微加工芯片进行表面处理以使其具有亲水性。可以在微加工芯片下面放置磁铁，同时加载磁珠以将磁珠向下拉入微孔中。可以通过施用和剥离胶带来去除未加载到微孔中并保留在微孔之间的表面上的任何磁珠。

或者，可以将磁珠与材料/样品(例如微生物分离物)预混合，然后将混合物加载到微加工芯片上。例如，可以首先对芯片进行表面处理以使其具有亲水性，然后可以将(溶液或悬浮液中)的磁珠添加到样品细胞中以制备混合物，然后将其加载到芯片上。将磁体置于芯片下方，同时将混合物加载到芯片上以将珠子向下拉入微孔中。如果需要，然后可以密封微孔以进一步培养。并且可选地，可以使用液滴打印机将磁珠溶液或其与样品的混合物打印到单独的微孔中。

然后可以孵育加载有样品和磁珠的微加工芯片以培养或生长细胞(或根据需要进行实验或测定)。一些已知菌株的测试结果表明，细胞生长不受珠子(其由于加载期间的磁拉力而在孔底部聚集)存在的影响，并且这可以预期用于其他样品。可能存在优选在表面上生长的微生物种类，在这种情况下，由磁珠提供的额外表面积可以促进生长。可以使珠子官能化以具有不同的表面化学性质，其将用于促进或减少某些类型的生长。例如，已知一些微生物在胺化表面上生长得更好。在这种情况下，可以化学改变磁珠以具有胺表面基团并促进生长。

为了将磁珠从一个芯片转移到另一个芯片(使得原始或源微孔中的一部分内容物被“拖动”到新芯片上的靶标或目标微孔中)，优选地，转移原始微孔中的一些但不是全部内容物。例如，根据需要，将至少一个细胞转移到新芯片，并留下至少一个细胞，以便在另一个生长期后，两个芯片可以具有足够量的相似内容物用于挑选、PCR、筛选或其他测定。

在一些情况下，珠子转移允许原始微孔中的一些液体(具有悬浮在其中的细胞)被磁珠携带进入另一个芯片。在一个微孔，特别是较小的微孔中具有多个珠子的情况下，可以通过磁珠转移大量液体。在一个微孔中存在多个磁珠或磁珠簇也增强了磁拉力。

重要的是在珠子转移期间保留磁珠的相对位置。例如，来自芯片上一个位置的磁珠{第3行，第2列}可以转移到第二个芯片的同一位置{第3行，第2列}，依此类推，从而在第二芯片中保留微孔内容物的相对位置。为了保持位置信息，必须放置芯片使得源微孔和目标微孔完全对齐并彼此面对。为了使该步骤正常工作，需要非常严格的标准制造芯片本身，并且芯片和芯片上的微孔的尺寸不会变化，并且热变形最小。

为了便于对齐，借助于显微镜对齐芯片。图25A-25C示出了两个芯片如何对齐的实例。图25A示出了将第一芯片固定到显微镜台。图26B示出了将第二芯片置于第一芯片上方，其中显微镜聚焦于两个芯片之间。这会产生稍微模糊的图像。图25C示出了在操作顶部芯片之后两个芯片对齐直到所有微孔对齐。可以使用两个芯片的不同方向，例如，珠子可以从顶部到底部、从底部到顶部或从左到右转移。珠密度的影响似乎很小。在极其致密的珠子的情况下，从顶部芯片到底部芯片可能获得轻微的优势。

用于珠子转移的磁铁可以是永久磁铁或电磁铁。关闭和打开磁场的能力可能会有所帮助。珠子转移所需的磁力可取决于许多相关因素，例如磁珠的尺寸、待转移的样品等。所需的相对力可根据Biomicrofluidics 7,014104(2013)；doi:10.1063/1.4788922中概述的计算方法估算。为了在芯片之间转移珠子，可以在两个芯片之间留下气隙，或者可以在芯片之间放置液体层。后者有助于去除微孔之间的界面，因为界面使得使用磁场转移珠子更加困难。液体层可以是水性层，例如培养基或缓冲液、醇，或与水不混溶的溶剂或油，或任何其他液体。

重要的是使来自珠子转移过程的交叉污染最小化。如图26A和26B所示，期望来自源芯片的不同封闭间隔微孔的珠子被转移到目标芯片的对齐微孔。图26C和26D示出了来自源芯片的不同微孔的磁珠在目标芯片的微孔中混合的情况。这可能导致不希望的交叉污染。为了减少这种交叉污染，可以在芯片之间添加用于防止交叉污染的阻挡层，例如油。

转移的材料/内容物可以进一步用于生长和/或进行其他实验或测定。已经显示，转移到新芯片的细菌细胞继续生长。在一个实例中，将大肠杆菌移液到第一芯片(其微孔已加载磁珠)上并生长过夜。第二天，在所有孔中观察到细菌生长。见图27A。将第一个芯片用纸吸干以从孔中除去一些液体并确保孔之间的空间干燥。使用乙醇擦拭第一芯片的顶部以确保芯片之间没有发生接触污染。将其微孔已加载培养基的新芯片与第一芯片对齐，并使用磁铁在几秒钟内拉动磁珠。在珠子被转移出之后，很少有残留在原始芯片上，如图27B所示。经过生长过夜时期后，在新芯片的微孔中很容易观察到生长的大肠杆菌。见图27C。对于不同的孔尺寸，成功地重复该测试。大多数珠子被转移到新芯片中，细菌在那里生长过夜。

通过磁珠转移进行芯片分裂的一个潜在用途是使用一个芯片来获得测序数据，同时保留拷贝以便基于测序结果随后检索活分离物。为了获得测序数据，可以在芯片上运行PCR以构建用于测序的扩增子。在PCR之前，可以将磁珠转移到另一个芯片上，并且在磁珠数量减少的原始芯片上运行PCR。PCR也可以在现在含有转移的珠子的新芯片上运行。磁珠的存在不会抑制芯片上PCR。在测试中，从0直至2400每孔加载不同浓度的珠子。将大肠杆菌gDNA与PCR缓冲液混合，加载到芯片上，并用Qiagen气锁密封芯片上的微孔阵列。结果如图28所示，表明芯片上PCR扩增子存在于所有测试芯片中，并且即使是最高浓度的珠子，珠子也不会干扰PCR。

测试表明，微孔中磁珠的存在不会阻碍细菌细胞的生长。在一个实例中，大肠杆菌在第一芯片上的磁珠存在下生长，将一部分细菌转移到新芯片上，在那里它们生长得更多并且进行芯片上PCR方法，检查其结果的gDNA作为生长的指标。简言之，芯片上PCR如下进行。将一些指定量的磁珠(240个珠子/微孔和2400个珠子/微孔)加载到芯片中。将磁铁置于芯片下方以保持磁珠向下，同时将细菌或gDNA和其他试剂添加到微孔中。将含有16S rRNAV4引物的PCR预混合物移液到芯片表面上。在芯片的微孔上方放置储库(reservoir)，并添加矿物油以避免PCR缓冲液蒸发。使用具有以下参数的热循环程序进行芯片上PCR：96℃10分钟，然后39个循环60℃2分钟，98℃40秒，60℃2分钟，然后保持在10℃。在PCR之后，取出芯片，用PBS洗掉芯片上的扩增子，并用Qiagen Qiaquick试剂盒提取16S rRNA V4扩增子。在更复杂的运行中(其结果如图29的泳道1所示)，将珠子加载到芯片上，然后加载细菌和培养基。密封芯片并生长一段时间。之后，通过磁铁将细菌转移到另一个芯片并运行PCR方法。图29显示，在上述流程的步骤中细菌生长不受磁珠存在的影响。图29中的不同泳道表示以下实验的结果：

1.细菌在具有240个珠子/微孔的芯片上生长，通过磁铁转移到新芯片，允许再生长一天，然后通过PCR运行以在合适位置给出gDNA条带。

2.阴性对照(没有细胞或gDNA，仅有珠子和用于扩增的相关化学物)。没有条带。

3.在没有珠子存在的情况下，在芯片上加载大肠杆菌并通过PCR运行。

4.在没有珠子存在的情况下，在芯片上加载gDNA并通过PCR运行。

5.在存在2400个珠子/孔的情况下，在芯片上加载gDNA并通过PCR运行。

6.在存在240个珠子/孔的情况下，在芯片上加载gDNA并通过PCR运行。

在另一个实施例中，在具有240个磁珠/孔的两个芯片中添加醋酸钙不动杆菌(acinetobacter calcoaceticus)、粘质沙雷氏菌(serratia marcescens)和华氏葡萄球菌(staphylococcys warneri)的混合物。于30℃孵育芯片过夜，然后将磁珠转移到新芯片。允许这些新芯片在30℃生长过夜。运行芯片上PCR，其结果如图30所示。两个芯片清楚地显示了表示16S扩增子的条带。

结论

尽管本文描述并说明了各种发明实施方案，本领域技术人员容易想到各种其他方式和/或结构来执行本文所述的功能和/或获得本文所述的结果和/或一个或多个优势，这种变体和/或修改的每一个认为是本文所述的发明实施方案的范围内。更一般地，本领域技术人员将容易理解，本文所述的所有参数、尺寸、材料和构造意在是示例性的，实际参数、尺寸、材料和/或构造将取决于使用本发明的教导的具体一个或多个应用。本领域技术人员将认识到或能够使用不超过常规实验来确定本文所述的具体的发明实施方案的许多等同物。因此，应当理解，前述实施方案仅以实例的方式表示，且在所附权利要求及其等同物的范围内，发明实施方案可以除具体描述和要求保护之外进行。本公开的发明实施方案要求保护本文所述的每个单独的特征、系统、物件、材料、试剂盒和/或方法。此外，如果这种特征、系统、制品、材料、试剂盒和/或方法没有互相矛盾，两个或多个这种特征、系统、制品、材料、试剂盒和/或方法的任何组合包括在本公开的发明范围内。

并且，各种发明概念可以体现在已经提供实例的一种或多种方法。作为方法的一部分进行的动作可以任何合适的方式排序。因此，可以构建其中以不同于图示的顺序执行动作的实施方案，包括同时执行一些动作，尽管在示例性实施方案中是顺序动作的。

本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献的全文均通过引用并入本文。

本文定义并使用的所有定义应当理解为控制字典定义，通过引用并入的文献中的定义和/或定义术语的普通含义。

除非另有清楚说明，在说明书和权利要求中使用的不定冠词“一”和“一个”应当理解为“至少一个”。

在说明书和权利要求中使用的短语“和/或”应该理解为是指连接的元素“任一个或两者”，即，元素在一些情况下结合存在，其他情况下分别存在。用“和/或”列举的多个元素应当以相同方式理解，即，结合“一个或多个”元素。除了用“和/或”定语特定指出的元素外，任选存在其他元素，无论其与那些特定指出的元素相关或不相关。因此，作为非限制性实例，当与开放式语言例如“包括”一起使用时，“A和/或B”在一个实施方案中，仅指A(任选包含除B之外的元素)；在另一个实施方案中，仅指B(任选包含除A之外的元素)；还在另一个实施方案中，指A和B两者(任选包含其他元素)；等等。

如在说明书和权利要求中所用，“或”应当理解为与上述“和/或”具有相同含义。例如，当分离列表中的项目时，“或”或“和/或”应当解释为包含的，即，包含大量或一系列元素的至少一个，但也包含超过一个，和任选的其他未列出的项目。仅当术语明确指示相反时，例如“仅一个”或“只有一个”或“由……组成”(当在权利要求中使用时)是指仅包含大量或一系列元素的一个元素。通常，当之前是排他性术语(例如“任一个”、“其中一个”、“仅一个”或“只有一个”)时，本文所用的术语“或”应当仅仅理解为表示排他性选择(即，“一个或另一个，但不是两者”)。当在权利要求中使用时，“基本上由……组成”应当具有其在专利法领域使用时的通常含义。

如在说明书和权利要求中所用，当指代一个或多个元素的列表时，短语“至少一个”应当理解为是指从所述元素列表的任何一个或多个元素选择的至少一个元素，而不一定包括在元素列表中具体列举的每个元素，且不排除元素列表中的元素的任何组合。该定义还允许任选存在除短语“至少一个”所指的元素列表内特定指出的元素之外的元素，无论其与特定指出的那些元素相关或不相关。因此，作为非限制性实例，“A和B中的至少一个”(或等同地，“A或B中的至少一个”，或等同地，“A和/或B中的至少一个”)在一个实施方案中，是指至少一个(任选包括超过一个)A而B不存在(且任选包括除B之外的元素)；在另一个实施方案中，是指至少一个(任选包括超过一个)B而A不存在(且任选包括除A之外的元素)；还在另一个实施方案中，是指至少一个(任选包括超过一个)A和至少一个(任选包括超过一个)B(任选包括其他元素)；等等。

在权利要求和上述说明书中，所有过渡短语例如“包含”、“包括”、“携带”、“具有”、“含有”、“涉及”、“容纳”、“由……构成”等应理解为开放式，即，是指包括但不限于。仅有过渡短语“由……组成”和“基本上由……组成”应分别理解为封闭式或半封闭式过渡短语，如美国专利局，专利审查程序手册，第2111.03小节所示。

Claims

1.将材料从包括上表面且包含第一微孔阵列的第一微加工装置转移到包括上表面且包含第二微孔阵列的第二微加工装置的方法，该方法包括：

将至少一个磁珠加载到第一微孔阵列的至少一个微孔中；

孵育第一微加工装置以在第一微孔阵列的至少一个微孔中培养多个细胞；

相对于第一微加工装置放置第二微加工装置，使得第一微加工装置的第一微孔阵列的至少一个微孔与第二微加工装置的第二微孔阵列的至少一个微孔对齐，其中相对于第一微加工装置放置第二微加工装置包括将第二微加工装置的上表面放置于第一微加工装置的上表面的对侧；和

施加磁场以将第一微孔阵列的至少一个微孔中包含的至少一个磁珠移动到第二微孔阵列的至少一个微孔中，其中来自第一微孔阵列的至少一个微孔中的多个细胞的至少一个细胞被转移到第二微孔阵列的至少一个微孔中。

2.权利要求1所述的方法，其中施加磁场包括使用永久磁铁。

3.权利要求1所述的方法，其中施加磁场包括使用电磁铁。

4.权利要求1所述的方法，进一步包括：

在孵育第一微加工装置之前，制备第一微加工装置使得第一微孔阵列的至少一个微孔包括至少一个细胞和至少一个磁珠，其中孵育第一微加工装置包括在第一微加工装置的至少一个微孔中从至少一个细胞培养多个细胞。

5.权利要求4所述的方法，其中制备第一微加工装置包括：

将包含溶剂和至少一个磁珠的磁珠溶液加载到至少一个微孔中；和

将至少一个细胞加载到所述至少一个微孔中。

6.权利要求5所述的方法，进一步包括：

向第一微加工装置施加磁铁使得至少一个磁珠被拉到至少一个微孔内，和

允许溶剂蒸发。

7.权利要求4所述的方法，其中制备第一微加工装置包括：

在至少一个微孔中加载包含至少一个磁珠和至少一个细胞的样品溶液。

8.权利要求4所述的方法，其中制备第一微加工装置包括：

施加膜以密封至少一个微孔。

9.权利要求1所述的方法，其中相对于第一微加工装置放置第二微加工装置包括将第二微加工装置的上表面放置于第一微加工装置的上表面的对侧并远离第一微加工装置的上表面。

10.权利要求1所述的方法，其中相对于第一微加工装置放置第二微加工装置包括将第二微加工装置的上表面放置于第一微加工装置的上表面的对侧并与第一微加工装置的上表面接触。

11.权利要求1所述的方法，进一步包括：

在施加磁场之前，在第一微加工装置的第一微孔阵列的至少一个微孔上施加液体层。

12.权利要求11所述的方法，其中所述液体层是油层。

13.权利要求11所述的方法，其中所述液体层是水性层。

14.将材料从包括上表面且包含第一微孔阵列的第一微加工装置转移到包括上表面且包含第二微孔阵列的第二微加工装置的方法，该方法包括：

制备第一微加工装置，使得第一微孔阵列的至少一个微孔包含目标材料和至少一个磁珠；

施加磁场以将第一微孔阵列的至少一个微孔中包含的至少一个磁珠移动到第二微孔阵列的至少一个微孔中，其中第一微孔阵列的至少一个微孔中的至少一部分目标材料被转移到第二微孔阵列的至少一个微孔中。

15.权利要求14所述的方法，其中所述目标材料是生物实体。

16.权利要求14所述的方法，其中所述目标材料包含多个细胞。

17.权利要求14所述的方法，其中制备第一微加工装置包括：

向第一微孔阵列的至少一个微孔提供至少一个细胞和至少一个磁珠；和

在施加磁场之前，孵育第一微加工装置以在第一微加工装置的至少一个微孔中从提供的至少一个细胞生长多个细胞。

18.权利要求17所述的方法，其中向第一微孔阵列的至少一个微孔提供至少一个细胞和至少一个磁珠包括：

将至少一个细胞加载到所述至少一个微孔中。

19.权利要求17所述的方法，其中向第一微孔阵列的至少一个微孔提供至少一个细胞和至少一个磁珠包括：

20.将材料从包括上表面且包含第一微孔阵列的第一微加工装置转移到包括上表面且包含第二微孔阵列的第二微加工装置的方法，所述第一微孔阵列的至少一个微孔包含至少一个磁珠，该方法包括：

在包含至少一个磁珠的至少一个微孔中提供目标材料；

21.将材料从包括上表面且包含第一微孔阵列的第一微加工装置转移到包括上表面且包含第二微孔阵列的第二微加工装置的方法，所述第一微孔阵列的至少一个微孔包含至少一个磁珠和目标材料，该方法包括：

22.权利要求1-21任一项所述的方法，其中第一微孔阵列的表面密度是至少150个微孔/cm²。

23.权利要求1-21任一项所述的方法，其中第一微孔阵列的表面密度是至少250个微孔/cm²。

24.权利要求1-21任一项所述的方法，其中第一微孔阵列的表面密度是至少400个微孔/cm²。

25.权利要求1-21任一项所述的方法，其中第一微孔阵列的表面密度是至少500个微孔/cm²。

26.权利要求1-21任一项所述的方法，其中第一微孔阵列的表面密度是至少750个微孔/cm²。

27.权利要求1-21任一项所述的方法，其中第一微孔阵列的表面密度是至少1000个微孔/cm²。

28.权利要求1-21任一项所述的方法，其中第一微孔阵列的表面密度是至少2500个微孔/cm²。

29.权利要求1-21任一项所述的方法，其中第一微孔阵列的表面密度是至少5000个微孔/cm²。

30.权利要求1-21任一项所述的方法，其中第一微孔阵列的表面密度是至少7500个微孔/cm²。

31.权利要求1-21任一项所述的方法，其中第一微孔阵列的表面密度是至少10000个微孔/cm²。

32.权利要求1-21任一项所述的方法，其中第一微孔阵列的表面密度是至少50000个微孔/cm²。

33.权利要求1-21任一项所述的方法，其中第一微孔阵列的表面密度是至少100000个微孔/cm²。

34.权利要求1-21任一项所述的方法，其中第一微孔阵列的表面密度是至少160000个微孔/cm²。

35.权利要求1-21任一项所述的方法，其中第一微加工装置的第一微孔阵列的每一个微孔的直径为5μm至500μm。

36.权利要求1-21任一项所述的方法，其中第一微加工装置的第一微孔阵列的每一个微孔的直径为10μm至300μm。

37.权利要求1-21任一项所述的方法，其中第一微加工装置的第一微孔阵列的每一个微孔的直径为20μm至200μm。

38.一种试剂盒，包含：

包括上表面且包含第一微孔阵列的第一微加工装置，所述第一微孔阵列的至少一个微孔包含至少一个磁珠，

包括上表面且包含第二微孔阵列的第二微加工装置，其中第一微孔阵列的每个微孔可以通过将第二微加工装置的上表面放置于第一微加工装置的上表面的对侧而与第二微孔阵列的微孔对齐。

39.权利要求38所述的试剂盒，进一步包含：

适于施加于第一微加工装置以密封至少一个微孔的膜。

40.权利要求39所述的试剂盒，其中所述膜是以下之一：透气的、液体可渗透的或不可渗透的。

41.权利要求38-40任一项所述的试剂盒，其中第一微孔阵列的表面密度是至少150个微孔/cm²。

42.权利要求38-40任一项所述的试剂盒，其中第一微孔阵列的表面密度是至少250个微孔/cm²。

43.权利要求38-40任一项所述的试剂盒，其中第一微孔阵列的表面密度是至少400个微孔/cm²。

44.权利要求38-40任一项所述的试剂盒，其中第一微孔阵列的表面密度是至少500个微孔/cm²。

45.权利要求38-40任一项所述的试剂盒，其中第一微孔阵列的表面密度是至少750个微孔/cm²。

46.权利要求38-40任一项所述的试剂盒，其中第一微孔阵列的表面密度是至少1000个微孔/cm²。

47.权利要求38-40任一项所述的试剂盒，其中第一微孔阵列的表面密度是至少2500个微孔/cm²。

48.权利要求38-40任一项所述的试剂盒，其中第一微孔阵列的表面密度是至少5000个微孔/cm²。

49.权利要求38-40任一项所述的试剂盒，其中第一微孔阵列的表面密度是至少7500个微孔/cm²。

50.权利要求38-40任一项所述的试剂盒，其中第一微孔阵列的表面密度是至少10000个微孔/cm²。

51.权利要求38-40任一项所述的试剂盒，其中第一微孔阵列的表面密度是至少50000个微孔/cm²。

52.权利要求38-40任一项所述的试剂盒，其中第一微孔阵列的表面密度是至少100000个微孔/cm²。

53.权利要求38-40任一项所述的试剂盒，其中第一微孔阵列的表面密度是至少160000个微孔/cm²。

54.权利要求38-40任一项所述的试剂盒，其中第一微加工装置的第一微孔阵列的每一个微孔的直径为5μm至500μm。

55.权利要求38-40任一项所述的试剂盒，其中第一微加工装置的第一微孔阵列的每一个微孔的直径为10μm至300μm。

56.权利要求38-40任一项所述的试剂盒，其中第一微加工装置的第一微孔阵列的每一个微孔的直径为20μm至200μm。