JP2008233002A

JP2008233002A - 反応チップ及びそれを用いた反応方法

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Publication number: JP2008233002A
Application number: JP2007076473A
Authority: JP
Inventors: Daisuke Numai; 大輔沼井
Original assignee: Toppan Printing Co Ltd
Current assignee: Toppan Inc
Priority date: 2007-03-23
Filing date: 2007-03-23
Publication date: 2008-10-02

Abstract

【課題】本発明は、コンタミネーションの発生を防止することが可能であり、また信頼ある反応データを測定することが可能な、反応チップおよびそれを用いた反応方法を提供するものである。
【解決手段】基板上に少なくとも試液貯留部、ウェル状反応容器および試液流路とを有し、該ウェル状反応容器および該試液流路が蓋部材を備える反応チップにおいて、該ウェル状反応容器内に反応試薬固定化磁気ビーズを配置することを特徴とする反応チップを提供する。また、前記反応チップを用いる反応方法において、該反応試薬固定化磁気ビーズを磁気発生手段により該ウェル状反応容器底面に固定する工程、該試液貯留部に反応試液を注入し、該試液流路を介して該ウェル状反応容器に反応試液を供給する工程、該試液流路を流路封止手段により封止する工程とを有することを特徴とする反応方法を提供する。
【選択図】図１

Description

本発明は、化学反応やＤＮＡ反応、たんぱく質反応などの生化学反応を行うための反応チップ及び反応方法に関するものである。

近年、化学反応やＤＮＡ反応、たんぱく質反応などの生化学反応をチップ上で行うμ−ＴｏｔａｌＡｎａｌｙｓｉｓＳｙｓｔｅｍ技術やＬａｂ−ｏｎ−Ｃｈｉｐ技術が盛んに研究され実現してきており、今まで大型の実験装置や大量の反応試薬が必要であった反応実験が数ミリ角以下のチップを用いて少量の試薬で高効率に行えるようになってきている。

このタイプの反応チップ上には、ウェルと呼ばれる微小な穴やくぼみが複数形成される例も多く、これらは反応容器として用いられている。複数のウェル状反応容器は、試液貯留部から延設された試液流路により接続されている（特許文献１参照）。
この反応チップを用いて反応を行うには、まず複数のウェル状反応容器内に反応試薬を配置する。次に、試液貯留部に反応試液を注入することで、試液流路を介して、複数のウェル状反応容器に反応試液を供給する。これにより、反応試薬と反応試液とが接触して反応が開始する。なお必要に応じて、反応時にウェル状反応容器を加熱することもある。
特開２００５−３０９２７号公報

しかし、上述した反応方法では、試液流路を介してウェル状反応容器内に反応試液を供給する際に、予めウェル状反応容器内に配置されていた反応試薬が、隣接するウェル状反応容器に流出するおそれがある。これにより、異なる反応試薬間のコンタミネーションが発生するという問題が生じる。
また、各ウェル状反応容器における反応進行中に、反応試薬や反応試液、検出用の蛍光物質等が隣接するウェル状反応容器に流出するおそれがある。これにより、信頼ある反応データを測定することができなくなるという問題が生じる。

本発明は、上記の課題を解決するもので、コンタミネーションの発生を防止することが可能であり、また信頼ある反応データを測定することが可能な、反応チップおよび反応方法を提供するものである。

請求項１に記載の発明は、基板上に少なくとも試液貯留部、ウェル状反応容器および試液流路とを有し、該ウェル状反応容器および該試液流路が蓋部材を備える反応チップにおいて、該ウェル状反応容器内に反応試薬固定化磁気ビーズを配置することを特徴とする反応チップである。

請求項２に記載の発明は、前記基板が少なくとも熱可塑性樹脂からなることを特徴とする請求項１に記載の反応チップである。

請求項３に記載の発明は、前記蓋部材が少なくとも熱可塑性樹脂からなることを特徴とする請求項１に記載の反応チップである。

請求項４に記載の発明は、前記試液貯留部から、一または複数の試液流路が延設されていることを特徴とする請求項１に記載の反応チップである。

請求項５に記載の発明は、前記反応試薬固定化磁気ビーズに、生体高分子の断片が固定されていることを特徴とする請求項１に記載の反応チップである。

請求項６に記載の発明は、前記反応試薬固定化磁気ビーズが乾燥状態で配置されていることを特徴とする請求項１および５のいずれかに記載の反応チップである。

請求項７に記載の発明は、請求項１から６のいずれかに記載の反応チップを用いる反応方法において、反応試薬固定化磁気ビースを磁気発生手段によりウェル状反応容器底面に固定する工程、試液貯留部に反応試液を注入し、該試液流路を介して該ウェル状反応容器に反応試液を供給する工程、該試液流路を流路封止手段により封止する工程とを有することを特徴とする反応方法である。

請求項８に記載の発明は、前記流路封止手段が基板と蓋部材とを溶着する工程を含むことを特徴とする請求項７に記載の反応方法である。

請求項１に記載の発明は、基板上に少なくとも試液貯留部、ウェル状反応容器および試液流路とを有し、該ウェル状反応容器および該試液流路が蓋部材を備える反応チップにおいて、該ウェル状反応容器内に反応試薬固定化磁気ビーズを配置することを特徴とする反応チップである。反応試薬を固定化した磁気ビーズを用いることにより、後述するように磁気発生手段により反応試薬固定化ビーズをウェル状反応容器底面に固定化することが可能となり、反応試薬が隣接するウェル状反応容器に流出することがなくなり、コンタミネーションの発生を防止することができる。また、磁気ビーズに反応試薬を固定化することにより、平板に試薬を固定する場合よりも、試薬を固定化できる表面積が大幅に増加し、検出の高感度化が可能となる。

請求項２に記載の発明は、前記基板が少なくとも熱可塑性樹脂からなることを特徴とする請求項１に記載の反応チップである。基板が少なくとも熱可塑性樹脂からなることにより、後述するように蓋部材と溶着することで簡単に試液流路を封止することが可能となる。

請求項３に記載の発明は、前記蓋部材が少なくとも熱可塑性樹脂からなることを特徴とする請求項１に記載の反応チップである。蓋部材が少なくとも熱可塑性樹脂からなることにより、後述するように基板と溶着することで簡単に試液流路を封止することが可能となる。

請求項４に記載の発明は、前記試液貯留部から、一または複数の試液流路が延設されていることを特徴とする請求項１に記載の反応チップである。前記試液貯留部から、一または複数の試液流路が延設されていることにより、試液貯留部に反応試液を注入することで、試液流路に連結された一または複数のウェル状反応容器に連続して一気に反応試薬を供給することが可能となる。

請求項５に記載の発明は、前記反応試薬固定化磁気ビーズに、生体高分子の断片が固定されていることを特徴とする請求項１に記載の反応チップである。前記反応試薬固定化磁気ビーズに、生体高分子の断片が固定されていることにより、ウェル状反応容器内で例えば抗原抗体反応や核酸プローブのハイブリダイゼーションによるＤＮＡ検出反応などを実現することができる。

請求項６に記載の発明は、前記反応試薬固定化磁気ビーズが乾燥状態で配置されていることを特徴とする請求項１および５のいずれかに記載の反応チップである。反応試薬固定化磁気ビーズを乾燥状態で配置することで、反応試薬の保存性を高めることが可能となる。

請求項７に記載の発明は、請求項１から６のいずれかに記載の反応チップを用いる反応方法において、反応試薬固定化磁気ビーズを磁気発生手段によりウェル状反応容器底面に固定する工程、試液貯留部に反応試液を注入し、試液流路を介して該ウェル状反応容器に反応試液を供給する工程、該試液流路を流路封止手段により封止する工程とを有することを特徴とする反応方法である。磁気発生手段により反応試薬固定化ビーズをウェル状反応容器底面に固定化することが可能となり、反応試薬が隣接するウェル状反応容器に流出することがなくなり、コンタミネーションの発生を防止することができる。また、ウェル状反応容器間の試液流路を流路封止手段により完全に封止することで、反応試薬および反応試液が隣接するウェル状反応容器に流出することがなくなる。従って、信頼ある反応データを測定することができる。

請求項８に記載の発明は、前記流路封止手段が基板と蓋部材とを溶着する工程を含むことを特徴とする請求項７に記載の反応方法である。基板と蓋部材とを溶着することにより、より簡単かつ確実に試液流路を封止することが可能となる。

以下、本発明の実施形態について、図面を参照して詳細を説明する。
図１は、本発明の実施形態の一例の反応チップの平面図である。この反応チップ１は、長方形状の基板２に、反応試液を貯留する試液貯留部３と、反応試薬固定化磁気ビーズが配置された複数のウェル状反応容器４と、複数のウェル状反応容器４に対して順に反応試液を供給する試液流路５と、ウェル状反応容器４および試液流路５を覆う蓋部材６とを備えたものである。

基板２は、全体的に略長方形状を呈しており、使用中に容易に折れ曲がることのない程度の厚みを持たせて形成される。この基板２は、少なくとも熱可塑性樹脂からなる。例えば、ポリプロピレン、ポリカーボネート、アクリル樹脂、ポリエチレンテレフタレート、ポリエチレン、ポリ塩化ビニル、ポリスチレン等の樹脂材料で構成されおり、このような合成樹脂は、耐熱性、耐薬品性、成形加工性などに優れているため好ましい。
また、２種類以上の樹脂を接合して複数の層構成からなる基板２とすることも可能である。この場合、それぞれの樹脂の特徴を活かして基板２を作製することにより、反応試薬や試料等の特性に応じた多様な基板２を得ることが可能となり、用途ごとに使い分けることも可能である。例えば、基板２を、試液貯留部、ウェル状反応容器および試液流路を有する上層とその下の下層とで材料を分け、２層構造の基板とすることもでき、この場合、例えば、上層には反応系の種類に応じて溶出等による反応阻害の生じない樹脂を選定し、下層には熱伝導の良い金属を用いて、２層構造の基板とすることが好ましい。また、複数の層構成からなる基板とする場合は、試液貯留部、ウェル状反応容器および試液流路を有する最上層は少なくとも熱可塑性樹脂からなることが好ましい。最上層が少なくとも熱可塑性樹脂からなることにより、後述するように溶着による試液流路の封止が可能となる。
また、基板２の素材として、石英ガラスを用いてもよい。

基板２には、反応試液を貯留する試液貯留部３と反応試液内の特定物質を検出する検出部とを設ける。検出部では、反応試液内の特定物質を検出するため、反応試薬を用いた検出反応が実施される。そこで、検出部には複数のウェル状反応容器４を形成し、各ウェル状反応容器４内に反応試薬固定化磁気ビーズを配置する。このウェル状反応容器４に反応試液を供給するために、試液貯留部３から複数の試液流路５を延設するとともに、マイクロポンプ等の強制的な送液装置（不図示）を設ける。それぞれの試液流路５には、複数のウェル状反応容器４が接続される。

また、ウェル状反応容器４および試液流路５を覆うように、蓋部材６を設ける。蓋部材６は少なくとも熱可塑性樹脂からなり、上述した基板２と同じ樹脂から構成されていてもよい。この蓋部材６を、溶着法などにより基板２と貼り合わせ、凹部（ウェル状反応容器４および試液流路５）以外の平坦部を密閉する。溶着法としては、高周波溶着、熱溶着、超音波溶着など、公知の方法を用いることが可能である。

図２（ａ）は、ウェル状反応容器の説明図であり、図１のＡ−Ａ線における側面断面図である。図２（ａ）に示すように、ウェル状反応容器４は、半球状（椀状）や逆円錐台状（鉢状）等に形成する。ウェル状反応容器４の開口部の直径は０．０１ｍｍ以上５ｍｍ以下であることが好ましい。０．０１ｍｍ以上５ｍｍ以下の直径を持つ開口部であることにより、ウェル状反応容器４に対する反応試液の供給が容易になり、気泡の混入を防止することができる。

ウェル状反応容器４は、樹脂材料からなる基板２を切削する方法や、金型内で樹脂材料を射出成形する方法等によって形成する。基板２をポリカーボネートなどの硬質の樹脂材料で構成する場合には、切削法を用いてウェル状反応容器４を形成することができる。また、基板２をポリプロピレンなどの軟質な樹脂材料で構成する場合には、射出成型法を用いてウェル状反応容器４を形成することが好ましい。また、射出成型法によりポリカーボネートでウェル状反応容器４を形成することもできる。

ウェル状反応容器４に対して反応試液を供給するため、基板２の表面に試液流路５を形成する。この試液流路５により、複数のウェル状反応容器４が連結されている。この試液流路５も、ウェル状反応容器４と同様に、切削法や射出成型法等によって形成することができる。

上述したように、ウェル状反応容器４および試液流路５が形成された基板２の表面に、反応試液を円滑に流動させるための表面処理を施してもよい。表面処理としては、プラズマ処理、コロナ処理、バフ処理などの各種親水化処理が挙げられる。基板２に表面処理を施すことにより、試液貯留部３から試液流路５を介してウェル状反応容器４に反応試液を供給し易くなり、送液装置の消費電力を低減することが可能となる。さらに、ウェル状反応容器４中や試液流路５中に存在していた空気がうまく逃げるようになり、反応試液内への気泡の混入を防止することが可能となる。

また、図２（ａ）に示すように、ウェル状反応容器４の内部には、生体高分子等の反応試薬を固定化した反応試薬固定化磁気ビーズ７が乾燥状態で配置されている。磁気ビーズは表面または内部のみ、あるいは全体が磁性体でできた球状の微粒子であり、ビーズの表面には核酸プローブや抗体などの生体高分子が固定化されている。生体高分子を固定化する技術としては、ビーズ表面に生体高分子が共有結合できる反応基を導入する方法が広く知られている。
本発明では、反応試薬の保存性を高めるために試薬固定化磁気ビーズ７を乾燥状態でウェル状反応容器４内に配置する。乾燥させる手段としては、糖類などの安定剤と共に凍結乾燥あるいは加熱乾燥を施すことにより、試薬固定化磁気ビーズ７を乾燥させることができる。
試薬固定化磁気ビーズ７は磁気発生手段によりウェル状反応容器４に固定する。このように、ウェル状反応容器４内に試薬固定化磁気ビーズ７を配置した後に、蓋部材６を設置する。

次に、上述した反応チップを用いた反応方法について、図１および図２を用いて説明する。図２（ｂ）および図２（ｃ）は、反応工程の一例の工程図であり、図１のＡ−Ａ線における側面断面図である。
まず、図１に示す試薬貯留部３に、反応試液８を注入する。次に送液装置を運転し、試液貯留部３から試液流路５に反応試液を流出させる。反応試液は、試液流路５を通って、ウェル状反応容器４に順に供給される。この反応溶液の供給は、常温または常温以下の送液可能なまでの低温で行う。

図２（ｂ）に示すように、ウェル状反応容器４の内部には、反応試薬固定化磁気ビーズ７が乾燥状態で配置され、磁気発生装置により底面に固定されている。そのため、ウェル状反応容器４に供給された反応試液８は、反応試薬固定化磁気ビーズ７を流出させることなくウェル状反応容器内４に配置される。したがって、反応試薬が隣接するウェル状反応容器４に流出することがなく、コンタミネーションの発生を防止することが可能となる。

次に、図２（ｃ）に示すように、ウェル状反応容器４間の試液流路５を流路封止手段により完全に封止する。ここで流路封止手段とは、例えば、基板と蓋部材とを溶着法などにより、局所的に封止する手段が挙げられる。溶着法としては、高周波溶着、熱溶着、超音波溶着など、公知の方法を用いることが可能である。
試液流路５を流路封止手段により完全に封止した後、試薬固定化磁気ビーズ７にかかる磁気吸引力を解除し、ウェル状反応容器４中の反応試液８中に試薬固定化磁気ビーズ７を分散させ、加熱手段により反応開始温度に応じてウェル状反応容器４を加熱することにより、反応を開始させる。試薬固定化磁気ビーズ７に固定化された試薬は、蛍光色素などで修飾されており、反応系の種類に応じて蛍光検出により反応の進行、ひいては目的物質の検出を確認することができる。

以上、本発明の反応チップを用いることにより、反応中に反応試薬および反応試液等が隣接するウェル状反応容器に流出することがなくなる。したがって、コンタミネーションの発生を防止することができるとともに、信頼ある反応データを測定することが可能となる。

本発明の反応チップの一例の平面図である。本発明のウェル状反応容器の一例の説明図および反応方法の工程図である。

符号の説明

１反応チップ
２基板
３試液貯留部
４ウェル状反応容器
５試液流路
６蓋部材
７反応試薬固定化磁気ビーズ
８反応試液

Claims

基板上に少なくとも試液貯留部、ウェル状反応容器および試液流路とを有し、該ウェル状反応容器および該試液流路が蓋部材を備える反応チップにおいて、該ウェル状反応容器内に反応試薬固定化磁気ビーズを配置することを特徴とする反応チップ。
前記基板が少なくとも熱可塑性樹脂からなることを特徴とする請求項１に記載の反応チップ。
前記蓋部材が少なくとも熱可塑性樹脂からなることを特徴とする請求項１に記載の反応チップ。
前記試液貯留部から、一または複数の試液流路が延設されていることを特徴とする請求項１に記載の反応チップ。
前記反応試薬固定化磁気ビーズに、生体高分子の断片が固定されていることを特徴とする請求項１に記載の反応チップ。
前記反応試薬固定化磁気ビーズが乾燥状態で配置されていることを特徴とする請求項および５のいずれかに記載の反応チップ。
請求項１から６のいずれかに記載の反応チップを用いる反応方法において、反応試薬固定化磁気ビーズを磁気発生手段によりウェル状反応容器底面に固定する工程、試液貯留部に反応試液を注入し、試液流路を介して該ウェル状反応容器に反応試液を供給する工程、該試液流路を流路封止手段により封止する工程とを有することを特徴とする反応方法。
前記流路封止手段が基板と蓋部材を溶着する工程を含むことを特徴とする請求項７に記載の反応方法。