JP2015065956A - 反応容器、核酸解析装置、および核酸解析方法 - Google Patents

Abstract

【課題】生体試料からの抽出で得られた核酸の定量と、該核酸の解析とが可能な反応容器、該反応容器を備えた核酸解析装置、並びに核酸解析方法の提供。
【解決手段】基材７に、核酸の解析に用いられる核酸解析試薬３が配置され、核酸を含有するサンプルを解析することが可能である解析ウェル１と、核酸を特異的に検出可能な定量試薬４が配置され、該サンプルに含有される核酸の量を定量可能である定量ウェル２と、を備え、該サンプルが含有する核酸が、該定量ウェル２および該解析ウェル１へと分配され得ることを特徴とする反応容器１０。
【選択図】図１

Description

本発明は、反応容器、該反応容器を備えた核酸解析装置、および核酸解析方法に関する。

疫学的・科学的根拠に基づき患者の持つ遺伝的背景に応じた効果的な治療・投薬方法を提供するという「オーダーメイド医療」は、各個人のＱＯＬ（生活の質）を向上させるだけでなく、薬剤の副作用に伴う医療費増加の抑制も期待される。薬剤の効果、副作用等を判定するにあたっては種々の手法が存在するが個人間における遺伝子の違いを解析する遺伝子診断も有効な手法の一つである。オーダーメイド医療は現場で簡便かつ迅速な診断が可能であることが望ましく、それらを実現するための手段として遺伝子を含有する微量の試料溶液を処理する反応装置であるμ−ＴＡＳ（Ｔｏｔａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ）やＬａｂ−ｏｎ−Ｃｈｉｐと呼ばれる技術の利用があげられる。

これは、１個のチップやカートリッジに複数の反応室や流路を備えたものであり、複数の検体の解析、あるいは複数種類の項目を同時処理できる。これらの技術はチップ及びカートリッジを小型化することで扱う薬品を少量にすることが出来るなど様々なメリットがある手法である。遺伝子解析の大筋としては患者から採取した血液や口腔粘膜、喀痰などの生体サンプルから遺伝子解析のための核酸を抽出もしくは精製して取り出し、調べたい遺伝子領域や核酸配列をＰＣＲなどで増幅し、遺伝子型などの検査したい対象固有の配列を検出する過程から成る。
特許文献１や特許文献２、非特許文献１には、生体サンプルからの核酸取り出し後に、増幅・検出という工程が全自動で進行される遺伝子診断装置が開示されている。

特開２００４−２１２０５０号公報 特開２００４−０９３２９７号公報 特許第４９６２６５８号公報 特許第４９１１２６４号公報

Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ５１： ８８２−８９０， ２００５

核酸の抽出工程が以降の増幅および検出の工程から独立している場合、外部の装置を用いた操作で核酸の量を確認できる。しかし、特許文献１や特許文献２、非特許文献１に示される装置では、生体サンプルからの核酸抽出後に増幅・検出という工程が全自動で進行され、得られた核酸の量を確認できない。このため取り出された核酸量は不明確であり、検査対象が遺伝子変異などの検出を目的とした場合は十分ではない。
例えば、癌などに代表される遺伝子変異の場合、全体で９９．９％は正常な野生型で、残り０．１％の変異型を検出したいとき、増幅前に必要な核酸の量は１０００コピー以上でなければ変異が０．１％であることを担保することはできない。
また、特定の核酸配列の有無や遺伝子多型の解析においてもイレギュラーな結果が出力された際に核酸の量が不足しているのか、あるいは系中に反応阻害物などが混入して起きた現象なのか区別できないことも考えられる。
このように、全自動の遺伝子解析システムでは核酸の量が不明確であり、解析結果の信頼性は検査項目の特性に左右されるケースがある。

本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであり、全自動遺伝子解析システムにおいて好適に用いられ、生体試料からの抽出で得られた核酸の定量と、該核酸の解析とが可能な反応容器、該反応容器を備えた核酸解析装置、並びに核酸解析方法の提供を課題とする。

すなわち、本発明は、
（１）基材に、核酸の解析に用いられる核酸解析試薬が配置され、核酸を含有するサンプルを解析することが可能である解析ウェルと、
核酸を特異的に検出可能な定量試薬が配置され、該サンプルに含有される核酸の量を定量可能である定量ウェルと、を備え、
該サンプルが含有する核酸が、該定量ウェルおよび該解析ウェルへと分配され得ることを特徴とする反応容器。
（２）前記基材は、光透過性を有する樹脂である前記（１）に記載の反応容器。
（３）前記基材に、流路と、溶液を注入可能な注入口と、をさらに備え、該流路によって、該サンプルが含有する核酸が、該定量ウェルおよび該解析ウェルへと分配され得る前記（１）又は（２）に記載の反応容器。
（４）前記定量試薬及び／または前記核酸解析試薬が乾燥状態で配置される前記（１）〜（３）のいずれか一つに記載の反応容器。
（５）前記定量試薬及び／または前記核酸解析試薬が乾燥状態で、且つトレハロースとの混合状態で配置される前記（１）〜（４）のいずれか一つに記載の反応容器。
（６）前記（１）〜（５）のいずれか一つに記載の反応容器と、核酸を抽出する抽出部と、を備えたことを特徴とする核酸解析装置。
（７）前記核酸を精製する精製部を、さらに備えた前記（６）に記載の核酸解析装置。
（８）前記（１）〜（５）のいずれか一つに記載の反応容器、又は、前記（６）若しくは（７）に記載の核酸解析装置を用いる核酸解析方法であって、
ｂ１)前記解析ウェルにおいて解析され得る核酸と同一の核酸を含有するサンプルを、前記定量ウェルに注入する工程と、
ｂ２)該定量ウェルにおいて、該サンプルに含有される核酸と前記定量試薬とを会合させた会合状態を形成させる工程と、
ｂ３)該会合状態で発せられるシグナルを測定する測定工程と、
ｂ４)該測定工程で測定されたシグナルから、前記解析ウェルにおいて解析され得るサンプルに含有される核酸の量を算出する工程、
からなる核酸定量工程Ｂを含むことを特徴とする核酸解析方法。
（９）前記核酸定量工程Ｂの前に、生体試料からの核酸抽出を行う核酸抽出工程Ａと、該核酸抽出工程Ａの後に、核酸を含有するサンプルを解析ウェルに注入して解析ウェルにおいて該核酸の識別を行う核酸解析工程Ｃと、を含み、
該核酸が、前記核酸抽出工程Ａにおいて得られた核酸である前記（６）に記載の核酸解析方法。
（１０）前記核酸抽出工程Ａ及び前記核酸定量工程Ｂの後に、
該核酸定量工程Ｂによって算出された核酸の量により核酸解析工程Ｃにより得られた解析結果の妥当性を判断する工程Ｄを含む前記（９）に記載の核酸解析方法。
（１１）前記核酸抽出工程Ａの後且つ前記核酸定量工程Ｂの前に、核酸精製工程Ｐをさらに含む前記（９）又は（１０）に記載の核酸解析方法。
（１２）前記核酸解析工程Ｃが、前記核酸定量工程Ｂの後に含まれており、前記核酸定量工程Ｂの後且つ前記核酸解析工程Ｃの前に、核酸精製工程Ｐを含む前記（９）又は（１０）に記載の核酸解析方法。
（１３）前記核酸解析工程Ｃが、前記核酸定量工程Ｂの後に含まれており、該核酸定量工程Ｂによって算出された核酸の量により該核酸解析工程Ｃへの移行の可否を判断する工程Ｊを、該核酸定量工程Ｂの後且つ該核解析工程Ｃの前にさらに含む前記（９）〜（１２）のいずれか一つに記載の核酸解析方法。
（１４）前記核酸定量工程Ｂによって算出された核酸の量により前記核酸精製工程Ｐへの移行の可否を判断する工程Ｊ´を、該核酸定量工程Ｂの後且つ該核酸精製工程Ｐの前にさらに含む前記（１２）又は（１３）に記載の核酸解析方法。
（１５）前記生体試料が全血、血清、唾液、喀痰、口腔粘膜および組織片からなる群から選ばれる少なくとも１つである前記（９）〜（１４）のいずれか一つに記載の核酸解析方法。
（１６）核酸の解析に用いられる核酸解析試薬が配置され、核酸を含有するサンプルを解析することが可能である解析ウェルと、
該サンプルに含有される核酸の量を定量可能である定量ウェルと、を備え、
該サンプルが含有する核酸が、該定量ウェルおよび該解析ウェルへと分配され得ることを特徴とする反応容器。
（１７）前記基材は、光透過性を有する樹脂である前記（１６）に記載の反応容器。
（１８）前記基材に、流路と、溶液を注入可能な注入口と、をさらに備え、該流路によって、該サンプルが含有する核酸が、該定量ウェルおよび該解析ウェルへと分配され得る前記（１６）又は（１７）に記載の反応容器。
（１９）前記（１６）に記載の反応容器と、核酸を抽出する抽出部と、を備えたことを特徴とする核酸解析装置。
（２０）前記核酸を精製する精製部を、さらに備えた前記（１９）に記載の核酸解析装置。
（２１）前記（１６）〜（１８）のいずれか一つに記載の反応容器、又は、前記（１９）若しくは（２０）に記載の核酸解析装置を用いる核酸解析方法であって、
ｂ´１)前記解析ウェルにおいて解析され得る核酸と同一の核酸を含有するサンプルを、前記定量ウェルに注入する工程と、
ｂ´２)該定量ウェルにおいて、該サンプルの紫外線の吸光度を測定する測定工程と、
ｂ´３)該測定工程で測定された紫外線の吸光度から、前記解析ウェルにおいて解析され得るサンプルに含有される核酸の量を算出する工程、
からなる核酸定量工程Ｂ´を含む核酸解析方法。
（２２）前記核酸定量工程Ｂ´の前に、生体試料からの核酸抽出を行う核酸抽出工程Ａと、該核酸抽出工程Ａの後に、核酸を含有するサンプルを解析ウェルに注入して解析ウェルにおいて該核酸の増幅および識別を行う核酸解析工程Ｃと、を含み、
該核酸が、前記核酸抽出工程Ａにおいて得られた核酸である前記（２１）に記載の核酸解析方法。
（２３）前記核酸抽出工程Ａ及び前記核酸定量工程Ｂ´の後に、
該核酸定量工程Ｂ´によって算出された核酸の量により核酸解析工程Ｃにより得られた解析結果の妥当性を判断する工程Ｄを含む前記（２２）に記載の核酸解析方法。
（２４）前記核酸抽出工程Ａの後且つ前記核酸定量工程Ｂ´の前に、核酸精製工程Ｐをさらに含む前記（２２）又は（２３）に記載の核酸解析方法。
（２５）前記核酸解析工程Ｃが、前記核酸定量工程Ｂ´の後に含まれており、前記核酸定量工程Ｂ´の後且つ前記核酸解析工程Ｃの前に、核酸精製工程Ｐを含む前記（２２）又は（２３）に記載の核酸解析方法。
（２６）前記核酸解析工程Ｃが、前記核酸定量工程Ｂ´の後に含まれており、該核酸定量工程Ｂ´によって算出された核酸の量により該核酸解析工程Ｃへの移行の可否を判断する工程Ｊを、該核酸定量工程Ｂ´の後且つ該核解析工程Ｃの前にさらに含む前記（２２）〜（２５）のいずれか一つに記載の核酸解析方法。
（２７）前記核酸定量工程Ｂ´によって算出された核酸の量により前記核酸精製工程Ｐへの移行の可否を判断する工程Ｊ´を、該核酸定量工程Ｂ´の後且つ該核酸精製工程Ｐの前にさらに含む前記（２５）又は（２６）に記載の核酸解析方法。
（２８）前記生体試料が全血、血清、唾液、喀痰、口腔粘膜および組織片からなる群から選ばれる少なくとも１つである前記（２２）〜（２５）のいずれか一つに記載の核酸解析方法。
を提供するものである。

本発明によれば、生体サンプルからの核酸抽出で得られた核酸の量を確認することが可能となり、核酸の解析結果に対する信頼性を向上させることができる。

本発明の一実施形態の反応容器を示す斜視図である。 蛍光物質を用いた核酸量の測定原理を表す模式図である。 本発明の反応容器における、流路の一態様を示す模式図である。 本発明の核酸解析装置の構成の一例を示す図である。 本発明の核酸解析方法の一実施形態を模式的に説明する図である。 本発明の核酸解析方法の第一実施形態を説明したフローチャートである。 本発明の核酸解析方法の第二実施形態を説明したフローチャートである。 本発明の核酸解析方法の第三実施形態を説明したフローチャートである。 本発明の核酸解析方法の第四実施形態を説明したフローチャートである。 本発明の核酸解析方法の第五実施形態を説明したフローチャートである。 本発明の核酸解析方法の第六実施形態を説明したフローチャートである。 標準ＤＮＡ （０．０５ｎｇ／μｌ）に対する色素濃度最適化を示すグラフである。 標準ＤＮＡ （０．１ｎｇ／μｌ）に対する色素濃度最適化を示すグラフである。 標準ＤＮＡ （２．４ｎｇ／μｌ）に対する色素濃度最適化を示すグラフである。 蛍光強度のＤＮＡ濃度依存性を示すグラフである。 蛍光強度のＤＮＡ濃度依存性の検量線を示すグラフである。

≪反応容器≫
［第一実施形態］
本発明の第一実施形態の反応容器は、基材に、核酸の解析に用いられる核酸解析試薬が配置され、核酸を含有するサンプルを解析することが可能である解析ウェルと、核酸を特異的に検出可能な定量試薬が配置され、該サンプルに含有される核酸の量を定量可能である定量ウェルと、を備え、該サンプルが含有する核酸が、該定量ウェルおよび該解析ウェルへと分配され得るものである。
また、本発明の第一実施形態の反応容器は、前記基材に、流路と、溶液を注入可能な注入口と、をさらに備え、該流路によって、該サンプルが含有する核酸が、該反応ウェルおよび該解析ウェルへと分配され得るものであることが好ましい。

本発明の第一実施形態の反応容器について、図１を参照して説明する。図１に示すように、本発明の第一実施形態の反応容器１０は、核酸の解析に用いられる核酸解析試薬３が配置されており核酸を含有するサンプルを解析することが可能である解析ウェル１と、核酸を特異的に検出可能な定量試薬４が配置されており該サンプルに含有される核酸の量を定量可能である定量ウェル２と、流路５と、溶液を注入可能な注入口６と、が基材７に備えられており、流路５によって、注入口６から流路５へと注入された該サンプルが、定量ウェル２および該解析ウェルへ１と分配され得る。

本発明において、「核酸」とは、ＤＮＡ、ＲＮＡ又はその類縁体を指し、天然のものであってもよく、合成されたものであってもよい。前記類縁体としては、ＰＮＡ、ＬＮＡ等の人工核酸が挙げられる。天然の核酸として、例えば、生物から回収されたゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｈｎＲＮＡ等がある。また、合成された核酸として、β−シアノエチルホスフォロアミダイト法ＤＮＡ固相合成法等の公知の化学的合成法により合成されたＤＮＡや、ＰＣＲ等の公知の核酸増幅法により合成された核酸、逆転写反応により合成されたｃＤＮＡ等がある。

前記「核酸を特異的に検出可能な定量試薬」とは、核酸と会合して会合状態を示すシグナルを発する物質であって、サンプル溶液中の核酸量に応じたシグナルの変化によって、核酸量を定量可能な試薬であれば特に制限されず、核酸特異的に会合して蛍光発光する物質であることが好ましく、二本鎖ＤＮＡ特異的に会合した後、蛍光発光する物質であることがさらに好ましい。上記物質としては、例えばＳＹＢＲＧｒｅｅｎ、ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ、ＥｖａＧｒｅｅｎ、臭化エチジウム、ヘキスト３３２５８（ＣＡＳ番号２３４９１−４５−４；フェノール（４−［５−（４−メチル−１−ピペラジニル）［２，５’−ビ−１Ｈ−ベンゾイミダゾール］−２’−イル］）−三塩酸）、ＴＯＴＯ−１、ＹＯＹＯ−１、ＹＯ−ＰＲＯ−１、ＢＥＢＯ、ＢＥＴＯ、ＢＯＸＴＯなどが挙げられる。図２は、蛍光色素３１が、二本鎖ＤＮＡ３２に特異的に結合し、励起光が照射されることでシグナル３３を発する反応機構を示した模式図である。この場合のシグナルの変化は、蛍光強度の変化である。

「核酸を含有するサンプルを解析する」とは、該サンプルに含有される核酸の塩基配列、核酸修飾等の核酸情報を識別することを云い、核酸の塩基配列、核酸修飾そのものを示す情報の他、当該情報を間接的に示す情報を識別することも包含される。当該情報を間接的に示す情報とは、例えば、塩基配列の差異から生じる二本鎖核酸形成の有無の検出などを例示できる。識別される核酸の塩基配列の情報とは、識別対象の核酸の塩基配列を含む配列からなる遺伝子配列であることが好ましく、当該遺伝子の遺伝子変異が識別されることがより好ましい。遺伝子変異とは、同一生物種の個体間において存在する遺伝子の塩基配列の相違であることが好ましい。具体的には、塩基配列中の１又は複数の塩基が置換・欠失・挿入されていることにより、塩基配列の相違は生じる。このような遺伝子変異として、例えば、ＳＮＰやＣＮＶ（Ｃｏｐｙ Ｎｕｍｂｅｒ ｖａｒｉａｔｉｏｎ）多型、塩基欠損変異、塩基挿入変異、転座変異等が挙げられる。また、本発明において遺伝子変異とは、ＳＮＰ等の遺伝子多型のような先天的な変異に加えて、同一個体中の細胞間において存在する遺伝子の塩基配列の相違である体細胞変異等のように後天的な変異も含む。なお、当該解析においては、解析対象の核酸の増幅が行われることが好ましい。

「核酸解析試薬」としては、上述の核酸情報の識別に用いられる試薬であれば特に制限されず、識別に際しては、核酸の増幅に用いられる試薬であることが好ましい。該試薬に含まれるものとしては、オリゴプライマーセット、核酸合成酵素、ヌクレオシド等が挙げられ、一般的な核酸の増幅に必要な種々の組み合わせを用いればよい。
また、核酸解析試薬には、核酸の増幅に用いられる分子のほか、二本鎖核酸形成の有無の検出が可能な物質が含有されていてもよい。当該物質としては、上述した核酸を特異的に検出可能な物質もこれに含まれる。

「試薬が配置される」とは、該サンプルが含有する核酸が該定量ウェル又は該解析ウェルへと分配されるよりも前に、解析ウェル又は定量ウェル中に試薬が配置されていてもよく、該サンプルが含有する核酸が該定量ウェル又は該解析ウェルへと分配された後に、解析ウェル又は定量ウェル中に試薬が配置されてもよく、該サンプルが含有する核酸が該定量ウェルおよび該解析ウェルへと分配されるよりも前にあらかじめ配置されていることが好ましい。
該サンプルが含有する核酸が該定量ウェル又は該解析ウェルへと分配されるよりも後に試薬が配置される方法としては、例えば、試薬を収容した各試薬ウェルを、定量ウェル又は解析ウェルとは別に設け、該核酸がウェルへと分配された後に各試薬ウェルと定量ウェル又は解析ウェルとを連通させて、試薬を配置させる方法が挙げられる。
該サンプルが含有する核酸が該定量ウェル又は該解析ウェルへと分配されるよりも前に試薬が配置される方法としては、試薬を定量ウェル又は解析ウェル内壁に乾燥固定させる方法が挙げられる。
従って、本実施形態において、前記定量試薬及び／または前記核酸解析試薬が乾燥状態で配置されていることが好ましく、前記定量試薬及び／または前記核酸解析試薬が乾燥状態で、且つトレハロースとの混合状態で配置されることがより好ましい。当該試薬が乾燥状態で配置されていることで、当該試薬の劣化を低減でき、トレハロースとの混合状態で配置されていることで、当該試薬の劣化をより低減することができる。
当該試薬の固定方法としては、例えば第１の基材７のウェル部分に液体試薬をピペット等で滴下し、基材を遠心装置で２０００〜３０００ｒｐｍ、５分程度遠心することで適量の液体試薬が液面を平坦な状態で残存するようにして、これを乾燥させることでウェルに固定することができる。
また、試薬に含まれる全ての物質が、該核酸が該定量ウェル又は該解析ウェルへと分配されるよりも前に試薬が配置されていなくともよく、該核酸が該定量ウェル又は該解析ウェルへと分配されるよりも前と後で分けて配置されてもよい。このような例としては、例えば、核酸解析試薬のうち核酸の増幅に用いられる物質があらかじめ固定された解析ウェルにサンプルを注入し、核酸を増幅させた後、増幅された核酸の量を検出可能な物質を、解析ウェルへと注入させることが挙げられる。

本実施形態の反応容器は、該定量ウェルおよび該解析ウェルへと、前記サンプルが含有する核酸を分配し得る流路を備える。当該流路の分岐の位置、方向等は特に制限されないが、例えば、図３（ａ）〜（ｃ）に示すような態様を例示できる。生体サンプルからの核酸抽出で得られた核酸量を、核酸を含有するサンプルを解析の解析より前の定量可能であるとの観点から、定量ウェル２は、解析ウェル１よりも注入口６の近くに配置されることが好ましい、これにより、解析ウェルへよりも先に定量ウェルへと当該核酸が分配され易くすることができる。
また、例えば図３（ｂ）又は図３（ｃ）であれば、定量ウェルにつながる流路と解析ウェルにつながる流路との分岐点よりも解析ウェル側の流路に、流路の開閉が可能なサンプル溶液の塞き止め手段を設けることで、定量ウェルにおいて算出される核酸の量により定量ウェルへの送液の可否を判断し、送液を制御することができる。

本実施形態の反応容器の基材７は、光透過性を有する樹脂であることが好ましい。基材７の材料としては、光透過性を有する樹脂を好適に使用することができる。また、解析ウェル１又は定量ウェル２内における溶液に対して光学的分析（蛍光測定や比色測定など）をする場合には、基材７の透明性が高いことが好ましい。例えば、基材７の材料は、試料に影響を与えないものであれば特に制限はないが、特にポリプロピレン、ポリカーボネート、アクリルのいずれかを含む樹脂材料を用いれば、良好な可視光透過性を確保することができる。ポリプロピレンとしては、ホモポリプロピレンやポリプロピレンとポリエチレンとのランダム共重合体を使用することができる。また、アクリルとしては、ポリメタクリル酸メチル、または、メタクリル酸メチルとその他のメタクリル酸エステル、アクリル酸エステル、スチレンなどのモノマーとの共重合体を使用することができる。また、これらの樹脂材料を使用する場合、反応容器の耐熱性や強度を確保することもできる。樹脂材料以外としては、アルミニウム、銅、銀、ニッケル、真鍮、金等の金属材料を挙げることができる。金属材料を用いた場合、加えて熱伝導率及び封止性能に優れる。

なお、基材７の解析ウェル１又は定量ウェル２の底部を透明とすることで、蛍光等の検出・分析を外部から行うことができる。なお本実施形態における「透明」及び「光透過性」とは、形成した際の光域（波長２３０〜７８０ｎｍ）の全平均透過率が７０％以上であることが好ましい。

基材７の加工方法としては、樹脂材料の場合には、射出成形、真空成形等の各種樹脂成形法や、機械切削などを用いることができる。金属材料の場合には、厚手の基材を用いた研削加工やエッチング、薄手の金属シートにプレス加工や絞り加工を施すことで形成することができる。

また、基材７の厚みが５０μｍ〜３ｍｍの範囲にある場合、良好な光透過性、耐熱性、強度を確保でき、凹部の加工を確実に行うことができるため好ましい。

［第二実施形態］
本実施形態の反応容器は、核酸の解析に用いられる核酸解析試薬が配置され、核酸を含有するサンプルを解析することが可能である解析ウェルと、該サンプルに含有される核酸の量を定量可能である定量ウェルと、を備え、該サンプルが含有する核酸が、該定量ウェルおよび該解析ウェルへと分配され得るものである。詳細については、上記、第一実施形態で述べたため省略するが、本実施形態の反応容器の定量ウェルには、定量試薬が配置されていなくともよく、試薬を用いずに核酸量を定量する場合に好適に用いられるものであり、例えば紫外線の照射によってサンプル中の核酸量を求める場合が挙げられる。

上記の実施形態で説明したように、同一の基材上に解析ウェル１と定量ウェル２の両方を設け、同一環境下として測定することで、解析ウェルでの核酸の解析がなされる前のサンプル中に含まれる核酸量を、定量ウェルにおいて高い信頼度で得ることができる。

≪核酸解析装置≫
［第一実施形態］
本実施形態の核酸解析装置は、先に記載の反応容器と、核酸を抽出する抽出部と、抽出部において得られた核酸を精製する精製部とを備えるものである。また、本実施形態の核酸解析装置は、解析ウェル１又は定量ウェル２内の溶液を光学的に分析する測定部を備えることが好ましい。当該抽出部および当該精製部は、本発明の反応容器の一部として基材に設けられていてもよいが、反応容器とは別の構成であってもよい。本実施形態の核酸解析装置の構成の模式図を図４に示す。核酸解析装置２０は、反応容器１０と、抽出部２１と、精製部２２と、測定部２３とを備える。抽出部２１、精製部２２、および反応容器１０で得られた核酸を含有する各サンプル溶液が核酸解析装置２０内の他の部または反応容器へと送液され、核酸解析が行われる。

抽出部２１には、試料からの核酸抽出を行うための、試薬が備えられている。このような試薬類は公知であり、核酸が由来する試料の種類に応じて適切な試薬類を適宜選択すればよい。また、精製部２２には、核酸を吸着する性質を有する担体が備えられていることが好ましい。このような担体材料としては、シリカ、ガラスウールなどの繊維材が例示できる。

このように、反応容器１０を備えた核酸解析装置２０は、核酸解析装置２０から当該サンプルを取り出すことなく、抽出部又は精製部において得られたサンプルに含有される核酸量を、容易に、高い信頼度で解析できる。

≪核酸解析方法≫
［第一実施形態］
本実施形態の核酸解析方法は、先に記載の反応容器、又は、先に記載の核酸解析装置を用いる核酸解析方法であって、ｂ１)前記解析ウェルにおいて解析され得る核酸と同一の核酸を含有するサンプルを、前記定量ウェルに注入する工程と、ｂ２)該定量ウェルにおいて、該サンプルに含有される核酸と前記定量試薬とを会合させた会合状態を形成させる工程と、ｂ３)該会合状態で発せられるシグナルを測定する測定工程と、ｂ４)該測定工程で測定されたシグナルから、前記解析ウェルにおいて解析され得るサンプルに含有される核酸の量を算出する工程、を有する核酸定量工程Ｂを含み、前記核酸定量工程Ｂの前に、生体試料からの核酸抽出を行う核酸抽出工程Ａと、該核酸抽出工程Ａの後に、核酸を含有するサンプルを解析ウェルに注入して解析ウェルにおいて該核酸の識別を行う核酸解析工程Ｃと、を含み、該核酸が、前記核酸抽出工程Ａにおいて得られた核酸である核酸解析方法である。「前記解析ウェルにおいて解析され得る核酸と同一の核酸」とは、解析ウェルにおいて解析され得る核酸の量を算出可能な程度に同一の組成を有する核酸のことを指す。

以下、本実施形態の核酸解析方法を、図５を参照して説明する。まず、生体試料から核酸を抽出し、核酸８を得る（工程Ａ）。なお、工程Ｂと工程Ｃとは、同時に行われても、どちらかが先に行われても構わない。例えば、図６左に示すように、工程Ｂの後に工程Ｃを行う場合や、図６右で示すように、工程Ｂと工程Ｃを同時に行ってもよい。工程Ａで得られた核酸８を含有するサンプルを、解析ウェル１へと注入し、核酸解析試薬３によって核酸の識別を行う（工程Ｃ）。同様に、工程Ａで得られた核酸８を含有するサンプルを、定量ウェル２へと注入する（工程ｂ１）。定量ウェル２へと注入されたサンプルに含有される核酸８と定量試薬４とが会合し、会合状態が形成させる（工程ｂ２）。次いで、核酸８と会合状態となった定量試薬４から発せられたシグナル３３を測定する（工程ｂ３）。測定されたシグナル強度をもとに、工程Ｃの核酸の増幅が行われる前のサンプルに含有される核酸８の量を算出する（工程ｂ４）。

核酸解析方法が、工程Ｂを含むことで、解析ウェルにおいて実施される核酸解析に用いられる増幅前の核酸量を算出することができ、解析ウェルにおいて実施される核酸解析結果の信頼度および正確性を向上させることができる。特に遺伝子変異の解析においては核酸の量が重要であるため、工程Ｃの前に核酸の量が十分であることを確認できることは非常に意義がある。

［第二実施形態］
本実施形態の核酸解析方法は、前記核酸抽出工程Ａ及び前記核酸定量工程Ｂの後に、該核酸定量工程Ｂによって算出された核酸の量により核酸解析工程Ｃにより得られた解析結果の妥当性を判断する工程Ｄを含む。
したがって、工程Ｄは、工程Ａ、工程Ｂおよび工程Ｃの後に含まれる。工程Ｄを含む本実施形態の核酸解析方法の一例を図７に示す。核酸解析方法が、工程Ｄを含むことで核酸解析結果の妥当性が判断され、誤った解析結果の採択の回避、再解析の必要性の速やかな提示等を実現することができる。

［第三実施形態］
本実施形態の核酸解析方法は、前記核酸抽出工程Ａの後且つ前記核酸定量工程Ｂの前に、核酸精製工程Ｐをさらに含む。工程Ｐを含む本実施形態の核酸解析方法の一例を図８に示す。核酸解析方法が、工程Ｐを含むことでサンプル中の核酸の純度が向上し、より正確な核酸解析が可能となる。

［第四実施形態］
本実施形態の核酸解析方法は、前記核酸解析工程Ｃが、前記核酸定量工程Ｂの後に含まれており、前記核酸定量工程Ｂの後且つ前記核酸解析工程Ｃの前に、核酸精製工程Ｐを含む。工程Ｐを含む本実施形態の核酸解析方法の一例を図９に示す。前記核酸定量工程Ｂの後且つ前記核酸解析工程Ｃの前に、工程Ｐが含まれることで、工程Ｃにおいて解析されるサンプルに対してのみ核酸精製が行われるため、核酸精製に必要な試薬等を削減できる。

［第五実施形態］
本実施形態の核酸解析方法は、前記核酸解析工程Ｃが、前記核酸定量工程Ｂの後に含まれており、該核酸定量工程Ｂによって算出された核酸の量により該核酸解析工程Ｃへの移行の可否を判断する工程Ｊを、該核酸定量工程Ｂの後且つ該核解析工程Ｃの前にさらに含む。工程Ｊを含む本実施形態の核酸解析方法の一例を図１０に示す。該核酸定量工程Ｂの後且つ該核解析工程Ｃの前に工程Ｊが含まれることで、工程Ｃを行う前に核酸解析の中断を選択でき、不正確な核酸解析結果を得ることを回避できる。また、工程Ｃに必要な試薬等を削減できる。

［第六実施形態］
本実施形態の核酸解析方法は、前記核酸定量工程Ｂによって算出された核酸の量により前記核酸精製工程Ｐへの移行の可否を判断する工程Ｊ´を、該核酸定量工程Ｂの後且つ該核酸精製工程Ｐの前にさらに含む。工程Ｊを含む本実施形態の核酸解析方法の一例を図１１に示す。該核酸定量工程Ｂの後且つ該核解析工程Ｐの前に工程Ｊ´が含まれることで、工程Ｐを行う前に核酸解析の中断を選択でき、不正確な核酸解析結果を得ることを回避できる。また、工程Ｐに必要な試薬等を削減できる。

また、先に記載の各実施形態において、前記生体試料は、全血、血清、唾液、喀痰、口腔粘膜及び組織片からなる群から選ばれる少なくとも１つであることが好ましく、検査対象者の体力的負担と採集の際の労力を考慮し、全血又は血清であることがより好ましく、血清であることがさらに好ましい。
生体サンプルとして全血を用いると取り出される核酸は変異とは無関係な血球成分から得られるものが主であり、遺伝子変異が起きている組織由来の核酸はわずかな量であり検出が困難になり易い。そのため遺伝子変異を標的とした場合は変異が疑われる組織を直接切除してサンプルを得ることで変異の割合と絶対量を確保できる。しかしながら、組織からのサンプル採集は検査対象者の体力的負担と採集の際の労力が大きいため低侵襲な手法が望ましい。このため血球成分を含まない血清中に遊離している組織由来の循環ＤＮＡを用いることが有効であると考えられるが、従来の手法では血清から集めた核酸量が遺伝子解析において目的とする感度を保証できない恐れがある。したがって、本発明の核酸解析方法は、前記生体試料が血清である場合に、より好適である。
また、前述の特定の核酸配列の有無や遺伝子多型の解析におけるイレギュラーな結果に対しても、本発明の核酸解析方法を用いることで、再試験に際しての対策を講じ易くなる。

また、先に記載の各実施形態において、核酸解析方法を、工程Ｂの代わりに、ｂ´１)前記解析ウェルにおいて解析され得る核酸と同一の核酸を含有するサンプルを、前記定量ウェルに注入する工程と、ｂ´２)該定量ウェルにおいて、該サンプルの紫外線の吸光度を測定する測定工程と、ｂ´３)該測定工程で測定された紫外線の吸光度から、前記解析ウェルにおいて解析され得るサンプルに含有される核酸の量を算出する工程、からなる核酸定量工程Ｂ´を含む核酸解析方法としてもよい。
紫外線によって核酸の量を算出は、周知の方法により行うことができる。本実施形態は、工程Ｂの代わりに当該工程Ｂ´を含む核酸解析工程であるから、工程Ｂ´を含む核酸解析工程の説明は先に説明した各核酸解析方法の実施形態の説明と重複するため、説明を省略する。

次に実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。

１）定量試薬濃度の選定
定量試薬として、二本鎖ＤＮＡ特異的に会合する物質であるＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉを選定した。ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉはシアニン系の非対称蛍光物質であり、二本鎖ＤＮＡの塩基間に入り込んだ（インターカレート）際に４８８ｎｍの励起光を照射されると５２２ｎｍを極大とする蛍光を発する特徴を有している。
２） 定量試薬濃度の最適化
ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉの最適倍率選定を行った。組成が６．２５ｍＭ ＭｇＣｌ_２，１５ｍＭ ＮａＣｌ，８０ｍＭ ｔｒｅｈａｌｏｓｅ， ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ （以降ＳＧと表記）， 標準ゲノムＤＮＡ からなる１ウェルあたり１０μｌの反応溶液を必要量調製した。このときＳＧの倍率は各定量ウェルそれぞれ１，２，３，４，５，６，７，８，９，１０，１５，２０，３０，４０，５０，６０，７０，８０，９０，１００Ｘ（倍）となるように調製し、最も蛍光強度が高くなるＳＧ倍率の検討を行った。

また、標準ゲノムＤＮＡ（コリエル研究所より入手）は各倍率のＳＧに対して、定量ウェル１ウェルあたりそれぞれ０．０５，０．４，２．５ｎｇ／μｌになるように調製し、最適なＳＧ倍率がサンプル濃度に依存するかについて同時に確認した。調製した反応溶液をゲノムＤＮＡ濃度の種類ごとに分けた９６穴プレートに注入して、ロッシュ社製Ｌｉｇｈｔ Ｃｙｃｌｅｒ ４８０にて励起波長４８８ｎｍ，検出波長５２０ｎｍ，４０℃，２０分間測定した。

図１２〜１４に示すグラフの縦軸の値は各濃度の標準ゲノムＤＮＡ存在下に得られた蛍光強度であり、横軸はＳＧ倍率を示している。本試験における標準ゲノムＤＮＡ濃度、０．０５ｎｇ／μｌでＳＧ倍率が２Ｘ付近、０．４ｎｇ／μｌでは４Ｘ、２．５ｎｇ／μｌのときはＳＧ倍率が５Ｘで効率が最大となっており、ＤＮＡ濃度の上昇に伴い効率が最大となるＳＧ倍率が高くなっていることが見て取れた。これは図２に示した発光原理から、サンプルＤＮＡの濃度が高くなり色素が入り込む隙間が増加したため蛍光強度が高くなったと考えられる。また、いずれのＤＮＡ濃度においてもＳＧ倍率がある程度高くなると蛍光発光の効率が低下して１Ｘのときの値を下回ることがわかった。これはサンプルＤＮＡに対してＳＧが過飽和であり蛍光色素濃度の上昇による濃度消光であると考えられる。

３） サンプル濃度に対する蛍光強度の直線性
ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉを用いた場合サンプル濃度に対する直線性を確認した。１ウェルあたりの組成が６．２５ｍＭ ＭｇＣｌ_２，１５ｍＭ ＮａＣｌ、標準ゲノムＤＮＡが０．０５，０．１，０．４，０．８，１．２ｎｇ／μｌとなる溶液及び全血から抽出されたゲノムＤＮＡ（Ｐｉｃｏ Ｇｒｅｅｎ法により０．９５ｎｇ／μｌであることを確認）をそれぞれ調製し、予めＳＧが終濃度４Ｘとなるように乾燥固定された遺伝子解析装置および遺伝子解析チップ（特許文献３および特許文献４参照）にそれぞれの濃度からなるサンプルＤＮＡ溶液を注入した。サンプル注入後、乾燥固定したＳＧとサンプルを十分に混合し、さらにサンプル溶液の蒸発防止を目的としてミネラルオイルを注入した。
サンプルＤＮＡを送液されたチップは４０°Ｃで３０秒１サイクルとして１０サイクル、合計５分間、それぞれのサンプル濃度で３回の蛍光測定を行い図１５に示す結果を得た。このとき、この結果をもとに各サンプル濃度で得られた蛍光強度の値を平均して検量線を作成したところ図１６に示すようにＲ^２は０．９９９を超え、高精度でＤＮＡ量を検出することができた。
４）全血から抽出されたＤＮＡ量の定量
上記直線性の確認と同様の操作を行い、全血から抽出されたＤＮＡを定量したところ、図１５に示すように、０．８ｎｇ／μｌと１．２ｎｇ／μｌの標準ゲノムＤＮＡが示す値の間に収まっていた。その検量線を用いて全血から抽出したＤＮＡ濃度を割り出したところ、図１６に示すように、事前のＰｉｃｏ Ｇｒｅｅｎ法で得た値である０．９５ｎｇ／μｌと一致した。

以上、本発明の実施形態について、図面を参照し、実施例を交えて詳述したが、具体的な構成はこれらの実施形態にが着られるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲の設計変更等も含まれる。

本発明の反応容器、核酸解析装置、核酸解析方法によれば、生体試料から取り出された核酸量が分かることで解析結果の信頼性および正確性を高めることができる。そのため、生体試料から得られた核酸の量を確認することの難しい全自動遺伝子解析システムにおいて好適に用いられる。また、医療分野、創薬分野等に広く活用される可能性があり、オーダーメイド医療の質の向上が期待される。

１…解析ウェル、２…定量ウェル、３…核酸解析試薬、４…定量試薬、５…流路、６…注入口、７…基材、８…核酸、１０…反応容器、２０…核酸解析装置、２１…抽出部、２２…精製部、２３…測定部、３１…蛍光色素、３２…ＤＮＡ、３３…シグナル

Claims (28)

1. 基材に、核酸の解析に用いられる核酸解析試薬が配置され、核酸を含有するサンプルを解析することが可能である解析ウェルと、
   核酸を特異的に検出可能な定量試薬が配置され、該サンプルに含有される核酸の量を定量可能である定量ウェルと、を備え、
   該サンプルが含有する核酸が、該定量ウェルおよび該解析ウェルへと分配され得ることを特徴とする反応容器。
2. 前記基材は、光透過性を有する樹脂である請求項１に記載の反応容器。
3. 前記基材に、流路と、溶液を注入可能な注入口と、をさらに備え、該流路によって、該サンプルが含有する核酸が、該定量ウェルおよび該解析ウェルへと分配され得る請求項１又は２に記載の反応容器。
4. 前記定量試薬及び／または前記核酸解析試薬が乾燥状態で配置される請求項１〜３のいずれか一項に記載の反応容器。
5. 前記定量試薬及び／または前記核酸解析試薬が乾燥状態で、且つトレハロースとの混合状態で配置される請求項１〜４のいずれか一項に記載の反応容器。
6. 請求項１〜５のいずれか一項に記載の反応容器と、核酸を抽出する抽出部と、を備えたことを特徴とする核酸解析装置。
7. 前記核酸を精製する精製部を、さらに備えた請求項６に記載の核酸解析装置。
8. 請求項１〜５のいずれか一項に記載の反応容器、又は、請求項６若しくは７に記載の核酸解析装置を用いた核酸解析方法であって、
   ｂ１)前記解析ウェルにおいて解析され得る核酸と同一の核酸を含有するサンプルを、前記定量ウェルに注入する工程と、
   ｂ２)該定量ウェルにおいて、該サンプルに含有される核酸と前記定量試薬とを会合させた会合状態を形成させる工程と、
   ｂ３)該会合状態で発せられるシグナルを測定する測定工程と、
   ｂ４)該測定工程で測定されたシグナルから、前記解析ウェルにおいて解析され得るサンプルに含有される核酸の量を算出する工程と、
   からなる核酸定量工程Ｂを含むことを特徴とする核酸解析方法。
9. 前記核酸定量工程Ｂの前に、生体試料からの核酸抽出を行う核酸抽出工程Ａと、
   該核酸抽出工程Ａの後に、核酸を含有するサンプルを解析ウェルに注入して解析ウェルにおいて該核酸の識別を行う核酸解析工程Ｃと、を含み、
   該核酸が、前記核酸抽出工程Ａにおいて得られた核酸である請求項８に記載の核酸解析方法。
10. 前記核酸定量工程Ｂの後に、
    該核酸定量工程Ｂによって算出された核酸の量により核酸解析工程Ｃにより得られた解析結果の妥当性を判断する工程Ｄを含む請求項９に記載の核酸解析方法。
11. 前記核酸抽出工程Ａの後且つ前記核酸定量工程Ｂの前に、核酸精製工程Ｐをさらに含む請求項９又は１０に記載の核酸解析方法。
12. 前記核酸解析工程Ｃが、前記核酸定量工程Ｂの後に含まれており、
    前記核酸定量工程Ｂの後且つ前記核酸解析工程Ｃの前に、核酸精製工程Ｐを含む請求項９又は１０に記載の核酸解析方法。
13. 前記核酸解析工程Ｃが、前記核酸定量工程Ｂの後に含まれており、
    該核酸定量工程Ｂによって算出された核酸の量により該核酸解析工程Ｃへの移行の可否を判断する工程Ｊを、該核酸定量工程Ｂの後且つ該核解析工程Ｃの前にさらに含む請求項９〜１２のいずれか一項に記載の核酸解析方法。
14. 前記核酸定量工程Ｂによって算出された核酸の量により前記核酸精製工程Ｐへの移行の可否を判断する工程Ｊ´を、該核酸定量工程Ｂの後且つ該核酸精製工程Ｐの前にさらに含む請求項１２又は１３に記載の核酸解析方法。
15. 前記生体試料が全血、血清、唾液、喀痰、口腔粘膜および組織片からなる群から選ばれる少なくとも１つである請求項９〜１４のいずれか一項に記載の核酸解析方法。
16. 基材に、核酸の解析に用いられる核酸解析試薬が配置され、核酸を含有するサンプルを解析することが可能である解析ウェルと、
    該サンプルに含有される核酸の量を定量可能である定量ウェルと、を備え、
    該サンプルが含有する核酸が、該定量ウェルおよび該解析ウェルへと分配され得ることを特徴とする反応容器。
17. 前記基材は、光透過性を有する樹脂である請求項１６に記載の反応容器。
18. 前記基材に、流路と、溶液を注入可能な注入口と、をさらに備え、該流路によって、該サンプルが含有する核酸が、該定量ウェルおよび該解析ウェルへと分配され得る請求項１６又は１７に記載の反応容器。
19. 請求項１６に記載の反応容器と、核酸を抽出する抽出部と、を備えたことを特徴とする核酸解析装置。
20. 前記核酸を精製する精製部を、さらに備えた請求項１９に記載の核酸解析装置。
21. 請求項１６〜１８のいずれか一項に記載の反応容器、又は、請求項１９若しくは２０に記載の核酸解析装置を用いる核酸解析方法であって、
    ｂ´１)前記解析ウェルにおいて解析され得る核酸と同一の核酸を含有するサンプルを、前記定量ウェルに注入する工程と、
    ｂ´２)該定量ウェルにおいて、該サンプルの紫外線の吸光度を測定する測定工程と、
    ｂ´３)該測定工程で測定された紫外線の吸光度から、前記解析ウェルにおいて解析され得るサンプルに含有される核酸の量を算出する工程、
    からなる核酸定量工程Ｂ´を含む核酸解析方法。
22. 前記核酸定量工程Ｂ´の前に、生体試料からの核酸抽出を行う核酸抽出工程Ａと、
    該核酸抽出工程Ａの後に、核酸を含有するサンプルを解析ウェルに注入して解析ウェルにおいて該核酸の識別を行う核酸解析工程Ｃと、を含み、
    該核酸が、前記核酸抽出工程Ａにおいて得られた核酸である請求項２１に記載の核酸解析方法。
23. 前記核酸定量工程Ｂ´の後に、
    該核酸定量工程Ｂ´によって算出された核酸の量により核酸解析工程Ｃにより得られた解析結果の妥当性を判断する工程Ｄを含む請求項２２に記載の核酸解析方法。
24. 前記核酸抽出工程Ａの後且つ前記核酸定量工程Ｂ´の前に、核酸精製工程Ｐをさらに含む請求項２２又は２３に記載の核酸解析方法。
25. 前記核酸解析工程Ｃが、前記核酸定量工程Ｂ´の後に含まれており、
    前記核酸定量工程Ｂ´の後且つ前記核酸解析工程Ｃの前に、核酸精製工程Ｐを含む請求項２２又は２３に記載の核酸解析方法。
26. 前記核酸解析工程Ｃが、前記核酸定量工程Ｂ´の後に含まれており、
    該核酸定量工程Ｂ´によって算出された核酸の量により該核酸解析工程Ｃへの移行の可否を判断する工程Ｊを、該核酸定量工程Ｂ´の後且つ該核解析工程Ｃの前にさらに含む請求項２２〜２５のいずれか一項に記載の核酸解析方法。
27. 前記核酸定量工程Ｂ´によって算出された核酸の量により前記核酸精製工程Ｐへの移行の可否を判断する工程Ｊ´を、該核酸定量工程Ｂ´の後且つ該核酸精製工程Ｐの前にさらに含む請求項２５又は２６に記載の核酸解析方法。
28. 前記生体試料が全血、血清、唾液、喀痰、口腔粘膜および組織片からなる群から選ばれる少なくとも１つである請求項２２〜２７のいずれか一項に記載の核酸解析方法。

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