CN105593357B - 反应容器、核酸分析装置及核酸分析方法 - Google Patents

反应容器、核酸分析装置及核酸分析方法 Download PDF

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Abstract

本发明的反应容器具备基材，设置在所述基材上且配置有用于核酸分析的核酸分析试剂、能够对含有核酸的样品进行分析的分析槽，和设置在所述基材上且配置有能够特异性地对核酸进行检测的定量试剂、能够对所述样品中含有的所述核酸的量进行定量的定量槽，其中，所述样品含有的所述核酸被分配到所述定量槽和所述分析槽中。

Description

反应容器、核酸分析装置及核酸分析方法
技术领域
本发明涉及反应容器、具备该反应容器的核酸分析装置及核酸分析方法。
本申请基于2013年9月30日于日本申请的日本特愿2013-205852号主张优先权，其内容援引于此。
背景技术
基于免疫学/科学的依据、提供对应于患者所具有的遗传背景的有效的治疗/给药方法的所谓“定制医疗”不仅会提高每个人的QOL(生活质量)、而且还期待抑制伴随药剂副作用的医疗费用的增加。在判定药剂的效果、副作用等时，存在各种手法，对个人之间的基因差异进行分析的基因诊断也是有效的手段之一。定制医疗期待能够在现场进行简单且迅速的诊断。作为用于实现简单且迅速的诊断的手段，可举出对含有基因的微量的试样溶液进行处理的反应装置的被称作μ-TAS(Total Analysis System，全分析系统)、Lab-on-Chip的技术的利用。
此为在1个芯片或样品盒中具有多个反应室或流路的装置，可以同时处理多个检体的分析或者多种项目。这些技术是具有通过对芯片或样品盒进行小型化而能够使所处理的药品变得少量等的各种优点的手法。基因分析大概具有以下过程：从自患者采集的血液或口腔粘膜、痰等生物体样品中提取或纯化用于基因分析的核酸并取出，利用PCR等对欲研究的基因区域或者核酸序列进行扩增，对基因型等欲检查的对象所固有的序列进行检测。
专利文献1、专利文献2、非专利文献1中公开了自生物体样品取出核酸之后进行扩增、检测的工序全自动地进行的基因诊断装置。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特开2004-212050号公报
专利文献2：日本特开2004-093297号公报
专利文献3：日本专利第4962658号公报
专利文献4：日本专利第4911264号公报
非专利文献
非专利文献1：Clinical Chemistry 51：882-890，2005
发明内容
发明要解决的技术问题
当核酸的提取工序与之后的扩增和检测的工序相独立时，通过使用了外部装置的操作可以确认核酸的量。但是，专利文献1、专利文献2或非专利文献1所示的装置中，由于在自生物体样品的核酸提取后使扩增、检测的工序全自动地进行，因此无法确认所得核酸的量。因此，所取出的核酸量不明确、检查对象在以检测基因突变等为目的时并不足够。
例如，在以癌症等代表的基因突变的情况下，全体中有99.9％为正常的野生型，当要检测剩余0.1％的突变型时，在扩增前所需的核酸的量若不是1000拷贝以上、则无法担保突变为0.1％。
另外还认为，在有无特定的核酸序列或者基因多态的分析中，当输出发生异常的结果时，无法区别是核酸量不足、还是在体系中混入了反应抑制物等而引起的现象。
如此，在全自动的基因分析系统中有核酸的量不明确、有分析结果的可靠性被检查项目的特性所左右的情况。
本发明鉴于上述事实而完成，其目的在于提供适用于全自动基因分析系统、能够进行通过自生物体试样提取而获得的核酸的定量和该核酸的分析的反应容器，具备该反应容器的核酸分析装置以及核酸分析方法。
用于解决技术问题的方法
本发明第一方式的反应容器具备基材，设置在所述基材上且配置有用于核酸的分析的核酸分析试剂、能够对含有核酸的样品进行分析的分析槽(well)，和设置在所述基材上且配置有能够特异性地对核酸进行检测的定量试剂、能够对所述样品中含有的所述核酸的量进行定量的定量槽；所述样品含有的所述核酸被分配到所述定量槽和所述分析槽中。
上述第一方式中，所述基材还可以由具有透光性的树脂形成。
上述第一方式的反应容器还可以进一步具备设置在所述基材上的流路和设置在所述基材上且能够注入溶液的注入口，其中，通过所述流路，所述样品含有的所述核酸被分配到所述定量槽和所述分析槽中。
上述第一方式中，所述定量试剂及所述核酸分析试剂中的至少1个还可以以干燥状态进行配置。
上述第一方式中，所述定量试剂及所述核酸分析试剂中的至少1个还可以以干燥状态且与海藻糖混合的状态进行配置。
本发明的第二方式的核酸分析装置具备上述第一方式的反应容器和用于提取所述核酸的提取部。
上述第二方式的核酸分析装置还可以进一步具备用于对所述核酸进行纯化的纯化部。
本发明第三方式的核酸分析方法使用了上述第一方式的反应容器或上述第二方式的核酸分析装置，所述核酸分析方法包含下述核酸定量工序：将含有与在所述分析槽中分析的核酸相同的核酸的样品注入到所述定量槽中，在所述定量槽中使所述样品所含有的所述核酸与所述定量试剂缔合、形成缔合状态，对以所述缔合状态产生的信号进行测定，由所测定的所述信号计算在所述分析槽中分析的所述核酸的量。
上述第三方式的核酸分析方法还可以包含以下工序：在所述核酸定量工序之前进行的、从生物体试样提取核酸的核酸提取工序，和在所述核酸提取工序之后进行的、将含有所述核酸的所述样品注入到所述分析槽中、在分析槽中进行所述核酸的识别的核酸分析工序；其中，所述核酸是在所述核酸提取工序中获得的。
上述第三方式的核酸分析方法还可以包含以下工序：在所述核酸定量工序之后进行的、基于通过所述核酸定量工序计算的所述核酸的量来判断通过所述核酸分析工序获得的分析结果的妥当性的工序。
上述第三方式的核酸分析方法还可以进一步包含在所述核酸提取工序之后且所述核酸定量工序之前进行的核酸纯化工序。
上述第三方式中还可以所述核酸分析工序在所述核酸定量工序之后进行，并且包含在所述核酸定量工序之后且所述核酸分析工序之前进行的核酸纯化工序。
上述第三方式中还可以所述核酸分析工序在所述核酸定量工序之后进行，并且包含在所述核酸定量工序之后且所述核酸分析工序之前进行、由通过所述核酸定量工序计算的核酸的量来判断可否移行至所述核酸分析工序的工序。
上述第三方式的核酸分析方法可以进一步包含在所述核酸定量工序之后且所述核酸纯化工序之前进行的、由通过所述核酸定量工序计算的核酸的量来判断可否移行至所述核酸纯化工序的工序。
上述第三方式中，所述生物体试样可以为选自全血、血清、唾液、痰、口腔粘膜和组织片中的至少1种。
本发明第四方式的反应容器具备基材，设置在所述基材上且配置有用于核酸分析的核酸分析试剂、能够对含有核酸的样品进行分析的分析槽，和设置在所述基材上且能够对所述样品中含有的所述核酸的量进行定量的定量槽，其中，所述样品含有的所述核酸被分配在所述定量槽和所述分析槽中。
上述第四方式中，所述基材还可以由具有透光性的树脂形成。
上述第四方式的反应容器还可以进一步具备设置在所述基材上的流路和设置在所述基材上且能够注入溶液的注入口，其中，通过所述流路，所述样品所含有的所述核酸被分配到所述定量槽和所述分析槽中。
本发明第五方式的核酸分析装置具备上述第四方式的反应容器和用于提取所述核酸的提取部。
上述第五方式的核酸分析装置还可进一步具备用于对所述核酸进行纯化的纯化部。
本发明第六方式的核酸分析方法使用上述第四方式的反应容器或上述第五方式的核酸分析装置，其包含下述核酸定量工序：将含有与所述分析槽中所分析的核酸相同的核酸的样品注入到所述定量槽中，在所述定量槽中对所述样品的紫外线的吸光度进行测定，由所测定的紫外线的吸光度计算在所述分析槽中分析的所述核酸的量。
上述第六方式的核酸分析方法还可以包含以下工序：在所述核酸定量工序之前进行的、从生物体试样提取核酸的核酸提取工序；和在所述核酸提取工序之后进行的、在将含有所述核酸的所述样品注入到所述分析槽中、在所述分析槽中进行所述核酸的识别的核酸分析工序，其中，所述核酸是在所述核酸提取工序中获得的。
上述第六方式的核酸分析方法还可以包含在所述核酸定量工序之后进行的、基于通过所述核酸定量工序计算的核酸的量来判断通过所述核酸分析工序获得的分析结果的妥当性的工序。
上述第六方式的核酸分析方法还可以进一步包含在所述核酸提取工序之后且所述核酸定量工序之前进行的核酸纯化工序。
上述第六方式中还可以所述核酸分析工序在所述核酸定量工序之后进行，并且包含在所述核酸定量工序之后且所述核酸分析工序之前进行的核酸纯化工序。
上述第六方式中还可以所述核酸分析工序在所述核酸定量工序之后进行，并且包含在所述核酸定量工序之后且所述核酸分析工序之前进行的、由通过所述核酸定量工序计算的核酸的量来判断可否移行至所述核酸分析工序的工序。
上述第六方式的核酸分析方法可以进一步包含在所述核酸定量工序之后且所述核酸纯化工序之前进行的、由通过所述核酸定量工序计算的核酸的量来判断可否移行至所述核酸纯化工序的工序。
上述第六方式中，所述生物体试样可以为选自全血、血清、唾液、痰、口腔粘膜和组织片中的至少1种。
发明效果
通过本发明的上述各方式，能够确认自生物体样品通过核酸提取所获得的核酸的量、能够提高对核酸分析结果的可靠性。
附图说明
图1为表示本发明第一实施方式的反应容器的立体图。
图2为表示使用了荧光物质的核酸量的测定原理的示意图。
图3A为表示本发明第一实施方式或第二实施方式的反应容器中的流路的示意图。
图3B为表示本发明第一实施方式或第二实施方式的反应容器中的流路的示意图。
图3C为表示本发明第一实施方式或第二实施方式的反应容器中的流路的示意图。
图4为表示本发明第三实施方式的核酸分析装置的构成之一例的图。
图5为示意地说明本发明第四实施方式的核酸分析方法的图。
图6为说明本发明的第四实施方式的核酸分析方法的流程图。
图7为说明本发明的第五实施方式的核酸分析方法的流程图。
图8为说明本发明的第六实施方式的核酸分析方法的流程图。
图9为说明本发明的第七实施方式的核酸分析方法的流程图。
图10为说明本发明的第八实施方式的核酸分析方法的流程图。
图11为说明本发明的第九实施方式的核酸分析方法的流程图。
图12为表示相对于标准DNA(0.05ng/μl)的色素浓度最优化的曲线。
图13为表示相对于标准DNA(0.1ng/μl)的色素浓度最优化的曲线。
图14为表示相对于标准DNA(2.4ng/μl)的色素浓度最优化的曲线。
图15为表示荧光强度的DNA浓度依赖性的曲线。
图16为表示荧光强度的DNA浓度依赖性的标准曲线的曲线。
具体实施方式
《反应容器》
[第一实施方式]
本发明第一实施方式的反应容器在基材上具备：配置有用于核酸分析的核酸分析试剂且能够对含有核酸的样品进行分析的分析槽；和配置有能够特异性地对核酸进行检测的定量试剂且能够对所述样品中含有的核酸的量进行定量的定量槽，其中，该样品含有的核酸可被分配到该定量槽和该分析槽中。
另外，本发明第一实施方式的反应容器优选是下述反应容器：在所述基材上进一步具备流路和能够注入溶液的注入口，通过该流路，该样品含有的核酸可以被分配到该反应槽和该分析槽中。
参照图1说明本发明第一实施方式的反应容器。如图1所示，本发明第一实施方式的反应容器10具有基材7，所述基材7具备配置有用于核酸分析的核酸分析试剂3且能够对含有核酸的样品进行分析的分析槽1，配置有能够特异性地检测核酸的定量试剂4且能够对该样品所含有的核酸的量进行定量的定量槽2，流路5，和能够注入溶液的注入口6。通过流路5，自注入口6被注入到流路5中的该样品可以被分配到定量槽2和该分析槽1中。
本发明中，“核酸”是指DNA、RNA或其类似物，可以是天然的核酸、也可以是合成的核酸。作为所述类似物，可举出PNA、LNA等人工核酸。作为天然的核酸，例如有由生物回收的基因组DNA、mRNA、tRNA、rRNA、hnRNA等。另外，作为所合成的核酸，有利用β-氰基乙基亚磷酰胺法DNA固相合成法等公知的化学合成法所合成的DNA或者利用PCR等公知的核酸扩增法所合成的核酸、利用逆转录反应所合成的cDNA等。
所述“能够特异性地检测核酸的定量试剂”是指与核酸缔合而发出表示缔合状态的信号的物质，只要是能够通过对应于样品溶液中的核酸量的信号变化来对核酸量进行定量的试剂，则无特别限定。所述“能够特异性地检测核酸的定量试剂”优选是与核酸特异性地缔合而进行荧光发光的物质，更优选是在与双链DNA特异性地缔合之后进行荧光发光的物质。作为上述物质，例如可举出SYBRGreen、PicoGreen、EvaGreen、溴化乙锭、Hoechst33258(CAS号23491-45-4；苯酚(4-[5-(4-甲基-1-哌嗪基)[2,5’-联-1H-苯并咪唑]-2’-基])-三盐酸)、TOTO-1、YOYO-1、YO-PRO-1、BEBO、BETO、BOXTO等。图2是表示荧光色素31特异性地缔合于双链DNA32、通过照射激发光而发出信号33的反应机制的示意图。此时的信号变化是荧光强度的变化。
“对含有核酸的样品进行分析”是指对样品所含有的核酸的碱基序列、核酸修饰等核酸信息进行识别，除了表示核酸的碱基序列、核酸修饰本身的信息之外，还包含对间接地显示该信息的信息进行识别。间接地显示该信息的信息例如可举出检测有无因碱基序列的差异所产生的双链核酸形成等。所识别的核酸的碱基序列的信息优选是由包含识别对象的核酸的碱基序列的序列构成的基因序列，更优选识别该基因的基因突变。基因突变优选是在同一生物种的个体之间存在的基因的碱基序列的差异。具体而言，通过使碱基序列中的1个或多个碱基取代、缺失、插入，产生碱基序列的差异。作为这样的基因突变，例如可举出SNP或CNV(拷贝数变异，Copy Number variation)多态、碱基缺损突变、碱基插入突变、异位突变等。另外，本发明中，基因突变是指除了如SNP等基因多态的先天性突变之外，还包含如同一个体中的细胞间所存在的基因的碱基序列差异的体细胞突变等那样的后天性突变。另外，在分析中优选进行分析对象的核酸的扩增。
作为“核酸分析试剂”，只要是上述核酸信息的识别中使用的试剂则无特别限定，在识别时优选是核酸的扩增中使用的试剂。作为试剂所含的成分，可举出寡核苷酸引物对、核酸合成酶、核苷等，可以使用通常的核酸扩增所需的各种组合。
另外，核酸分析试剂中除了核酸的扩增中使用的分子之外，还可以含有能够检测出有无形成双链核酸的物质。该物质中还含有能够特异性地检测到上述核酸的物质。
“配置有试剂”是指在将样品所含有的核酸分配到定量槽或分析槽中之前，可以将试剂配置在分析槽或定量槽中。另外，还可以将样品所含有的核酸分配到定量槽或分析槽中之后，将试剂配置在分析槽或定量槽中。优选在将样品所含有的核酸分配到定量槽和分析槽之前，预先将试剂配置在分析槽或定量槽中。
作为在将样品所含有的核酸分配到定量槽或分析槽之后配置有试剂的方法，例如可举出下述方法：将收容了试剂的各试剂槽与定量槽或分析槽分别地设置，在将核酸分配到槽中之后使各试剂槽与定量槽或分析槽相连通，配置试剂。
作为在将样品所含有的核酸分配到定量槽或分析槽中之前配置试剂的方法，例如可举出使试剂干燥固定在定量槽或分析槽内壁的方法。
因此，本实施方式中，优选将所述定量试剂及所述核酸分析试剂中的至少1个以干燥状态进行配置，更优选将所述定量试剂及所述核酸分析试剂中的至少1个以干燥状态且与海藻糖的混合状态进行配置。通过将试剂以干燥状态进行配置，可以减少试剂的劣化。此外，通过将试剂以与海藻糖的混合状态进行配置，可以进一步减少试剂的劣化。
作为试剂的固定方法，例如通过用吸液管等将液体试剂滴加到第1基材7的槽部分中，利用离心装置以2000～3000rpm将基材离心5分钟左右，按照适量的液体试剂以使液面为平坦状态残留的方式将残留的液体试剂干燥，从而可以将试剂固定在槽中。
另外，也可在将核酸分配到定量槽或分析槽之前不配置试剂所含的全部物质。还可以在将核酸分配到定量槽或分析槽之前和之后，将试剂分开配置。作为这样的例子，例如可举出将样品注入到事先固定有核酸分析试剂中在核酸的扩增中使用的物质的分析槽中，使核酸扩增之后，将能够检测所扩增的核酸的量的物质注入到分析槽中。
本实施方式的反应容器具备能够将所述样品含有的核酸分配到定量槽和分析槽中的流路。流路的分支位置、方向等并无特别限定，例如可举出图3A～图3C所示的构成。从在含有核酸的样品分析之前能够对自生物体样品通过核酸提取获得的核酸量进行定量的观点出发，优选将定量槽2配置在较分析槽1更靠近注入口6的位置，由此能够容易地将核酸较分析槽更早地分配到定量槽中。
另外，例如若为图3B或图3C所示的构成，则通过在较连接于定量槽的流路和连接于分析槽的流路的分支点更靠近分析槽的流路的位置上设置能够开关流路的样品溶液的拦阻部，可以通过在定量槽中算出的核酸的量来判断可否向分析槽送液以控制送液。
本实施方式的反应容器的基材7优选是具有透光性的树脂。作为基材7的材料，可以优选使用具有透光性的树脂。另外，当对分析槽1或定量槽2内的溶液进行光学分析(荧光测定或比色测定等)时，优选基材7的透明性高。例如，基材7的材料只要是不对试样造成影响的材料则无特别限定，特别是当使用含有聚丙烯、聚碳酸酯、丙烯酸中的任一者的树脂材料时，可以确保良好的可见光透过性。作为聚丙烯，可以使用均聚丙烯或聚丙烯与聚乙烯的无规共聚物。另外，作为丙烯酸，可以使用聚甲基丙烯酸甲酯或甲基丙烯酸甲酯与其他甲基丙烯酸酯、丙烯酸酯、苯乙烯等单体的共聚物。另外，使用这些树脂材料时，还可以确保反应容器的耐热性或强度。树脂材料以外，还可举出铝、铜、银、镍、黄铜、金等金属材料。使用金属材料时，导热率及密封性能更加优异。
另外，通过使基材7的分析槽1或定量槽2的底部为透明的，还可以从外部进行荧光等的检测、分析。其中，本实施方式中的“透明”及“透光性”是指形成基材7时的光域(波长230～780nm)的总平均透过率优选为70％以上。
作为基材7的加工方法，为树脂材料时，可以使用注射成型、真空成型等各种树脂成型法或者机械切削等。为金属材料时，还可以通过实施使用了厚基材的研削加工或刻蚀、冲压加工或拉深加工成薄的金属片来形成。
另外，基材7的厚度在50μm～3mm的范围内时，可以确保良好的透光性、耐热性、强度，能够确实地进行凹部的加工，因此优选。
[第二实施方式]
本发明第二实施方式的反应容器具备配置有核酸分析中使用的核酸分析试剂且能够对含有核酸的样品进行分析的分析槽，和能够对该样品所含有的核酸的量进行定量的定量槽，并且按照该样品含有的核酸被分配到该定量槽和该分析槽中的方式构成。详细而言，由于在上述第一实施方式中已经叙述过，因此进行省略，但本实施方式的反应容器的定量槽中也可未配置有定量试剂，优选在不使用试剂的情况下对核酸量进行定量时使用。例如可举出通过紫外线照射来求出样品中的核酸量的情况。
如上述实施方式中说明过的那样，在同一基材上设置分析槽1和定量槽2这两者，在相同环境下测定样品中含有的核酸量。因此，能够在定量槽中以高的可靠度获得在分析槽中进行核酸分析之前的样品中所含的核酸量。
《核酸分析装置》
[第三实施方式]
本发明第三实施方式的核酸分析装置具备之前记载的反应容器、对核酸进行提取的提取部、和对提取部中获得的核酸进行纯化的纯化部。另外，本实施方式的核酸分析装置优选具备对分析槽1或定量槽2内的溶液进行光学分析的测定部。提取部及纯化部可以是作为本发明反应容器的一部分设置在基材上，也可以是与反应容器不同的构成。将本实施方式的核酸分析装置的构成的示意图示于图4中。核酸分析装置20具备反应容器10、提取部21、纯化部22和测定部23。将在提取部21、纯化部22和反应容器10中获得的含有核酸的各样品溶液送液至核酸分析装置20内的其他部分或反应容器中进行核酸分析。
提取部21中具备用于进行自试样提取核酸的试剂。这样的试剂类是公知的，可以根据核酸来源的试样的种类来适当选择适合的试剂种类。另外，纯化部22中优选具备具有吸附核酸的性质的载体。作为这样的载体，可以举出二氧化硅、玻璃丝等纤维材料。
如此，具备反应容器10的核酸分析装置20可以在不从核酸分析装置20中将样品取出的情况下，容易且以高可靠度对提取部或纯化部中获得的样品所含有的核酸量进行分析。
《核酸分析方法》
[第四实施方式]
本发明第四实施方式的核酸分析方法使用之前记载的反应容器或之前记载的核酸分析装置，所述核酸分析方法包含核酸定量工序B，所述核酸定量工序B具有以下工序：b1)将含有与可在所述分析槽中分析的核酸相同的核酸的样品注入到所述定量槽中的工序，b2)在该定量槽中形成使该样品含有的核酸与所述定量试剂缔合而成的缔合状态的工序，b3)对以该缔合状态产生的信号进行测定的测定工序，和b4)由通过该测定工序测定的信号算出可在所述分析槽中分析的样品中含有的核酸的量的工序；所述核酸分析方法还包含在所述核酸定量工序B之前进行的、进行自生物体试样提取核酸的核酸提取工序A，和在该核酸提取工序A之后进行的、将含有核酸的样品注入到分析槽中并在分析槽中进行该核酸识别的核酸分析工序C，其中，该核酸是在所述核酸提取工序A中获得的核酸。“与可在所述分析槽中分析的核酸相同的核酸”是指按照能够算出可在分析槽中分析的核酸的量的方式，具有与可在分析槽中分析的核酸相同组成的核酸。
以下参照图5说明本实施方式的核酸分析方法。首先，自生物体试样提取核酸，获得核酸8(工序A)。其中，工序B与工序C可以同时进行，也可以是其中一个先进行。例如，可以是如图6左所示、在工序B之后进行工序C的情况，或者也可以是如图6右所示、同时进行工序B和工序C。将含有工序A中获得的核酸8的样品注入到分析槽1中，利用核酸分析试剂3进行核酸的识别(工序C)。同样，将工序A中获得的含有核酸8的样品注入到定量槽2中(工序b1)。注入到定量槽2中的样品所含有的核酸8与定量试剂4缔合、形成缔合状态(工序b2)。接着，测定自与核酸8形成缔合状态的定量试剂4发出的信号33(工序b3)。
以所测定的信号强度为基础，计算进行工序C的核酸的扩增之前的样品所含有的核酸8的量(工序b4)。
核酸分析方法通过包含工序B，可以算出在分析槽中实施的核酸分析中使用的扩增前的核酸量。因此，可以提高分析槽中实施的核酸分析结果的可靠度和准确性。特别是在基因突变的分析中由于核酸的量重要，因此能够在工序C之前确认核酸的量足够是非常有意义的。
[第五实施方式]
本发明第五实施方式的核酸分析方法包含在所述核酸提取工序A及所述核酸定量工序B之后进行的、利用通过该核酸定量工序B算出的核酸的量来判断通过核酸分析工序C获得的分析结果的妥当性的工序D。
因此，工序D在工序A、工序B和工序C之后进行。将包含工序D的本实施方式的核酸分析方法之一例示于图7中。核酸分析方法通过包含工序D来判断核酸分析结果的妥当性，可以避免采集错误的分析结果、实现再分析必要性的迅速提示等。
[第六实施方式]
本发明第六实施方式的核酸分析方法进一步包含在所述核酸提取工序A之后且所述核酸定量工序B之前进行的核酸纯化工序P。将包含工序P的本实施方式的核酸分析方法之一例示于图8中。核酸分析方法通过包含工序P，样品中的核酸的纯度提高、能够进行更准确的核酸分析。
[第七实施方式]
本发明第七实施方式的核酸分析方法中，所述核酸分析工序C在所述核酸定量工序B之后进行，并包含在所述核酸定量工序B之后且所述核酸分析工序C之前进行的核酸纯化工序P。将包含工序P的本实施方式的核酸分析方法之一例示于图9中。通过在所述核酸定量工序B之后且所述核酸分析工序C之前进行工序P，由于仅对在工序C中进行分析的样品进行核酸纯化，因此可以减少核酸纯化所需的试剂等。
[第八实施方式]
本发明第八实施方式的核酸分析方法中，所述核酸分析工序C在所述核酸定量工序B之后进行，并进一步包含在该核酸定量工序B之后且该核解析工序C之前进行的、通过由该核酸定量工序B算出的核酸的量来判断可否移行至该核酸分析工序C的工序J。将包含工序J的本实施方式的核酸分析方法之一例示于图10。通过在该核酸定量工序B之后且该核酸分析工序C之前进行工序J，可以在进行工序C之前选择中断核酸分析，可以避免获得不准确的核酸分析结果。另外，可以减少工序C所需的试剂等。
[第九实施方式]
本发明第九实施方式的核酸分析方法在该核酸定量工序B之后且该核酸纯化工序P之前进一步包含在该核酸定量工序B之后且该核解析工序P之前进行的、通过由该核酸定量工序B算出的核酸的量来判断可否移行至所述核酸纯化工序P的工序J′。将包含工序J′的本实施方式的核酸分析方法之一例示于图11。通过在该核酸定量工序B之后且该核酸纯化工序P之前进行工序J′，可以在进行工序P之前选择中断核酸分析，可以避免获得不准确的核酸分析结果。另外，可以减少工序P所需的试剂等。
另外，在之前记载的各实施方式中，所述生物体试样优选是选自全血、血清、唾液、痰、口腔粘膜及组织片中的至少1种。考虑到检查对象者的体力负担和采集时的劳力，所述生体试样更优选是全血或血清、进一步优选是血清。
作为生物体样品使用全血时，主要取出从与突变没有关系的血细胞成分中获得的核酸，发生基因突变的组织来源的核酸是微小的量，检查易于变得困难。因此，以基因突变为目标时，通过将怀疑突变的组织直接切除获得样品，可以确保突变的比例和绝对量。但是，自组织采集样品由于检查对象者的体力负担和采集时的劳力大，因此期待低侵袭性的手法。因而，认为有效的是使用游离至不含血细胞成分的血清中的组织来源的循环DNA。但是，通过以往的手法有可能自血清集中的核酸量无法保证达到遗传分析目的的敏感度。因此，本发明实施方式的核酸分析方法在所述生物体试样为血清时更为优选。
另外，通过对有无所述特定的核酸序列或者基因多态的分析中的异常结果也使用本发明实施方式的核酸分析方法，易于找到再试验时的对策。
[第十实施方式]
另外，在之前记载的各实施方式中，核酸分析方法还可代替工序B而包含核酸定量工序B′，所述工序B′包含以下工序：b′1)将含有与可在所述分析槽中分析的核酸相同的核酸的样品注入到所述定量槽中的工序；b′2)在该定量槽中测定该样品的紫外线吸光度的测定工序；和b′3)由该测定工序测定的紫外线的吸光度算出可在所述分析槽中分析的样品中含有的核酸的量的工序。
利用紫外线算出核酸量可利用公知的方法进行。本实施方式是代替工序B而包含该工序B′的核酸分析工序。包含工序B′的核酸分析工序的说明由于与之前说明的各核酸分析方法的实施方式的说明重复，因此省略说明。
实施例
接着，示出实施例更详细地说明本发明，但本发明并不限定于以下的实施例。
1)定量试剂浓度的选择
作为定量试剂，选择与双链DNA特异性地缔合的物质SYBR Green I。SYBR Green I是花青系的非对称荧光物质，其具有在进入到双链DNA的碱基间(插入)时、当照射488nm的激发光时可发出最大达522nm的荧光的特征。
2)定量试剂浓度的最优化
进行SYBR Green I的最佳倍率选择。组成为6.25mM MgCl2、15mM NaCl、80mM海藻糖、SYBR Green I(下文表述为SG)，在每个由标准基因组DNA构成的1个槽中，以所需量制备10μl的反应溶液。此时，SG的倍率按照在各定量槽中分别达到1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、100X(倍)的方式进行制备，进行荧光强度达到最高的SG倍率的探讨。
另外，标准基因组DNA(自Korieru研究所获得)按照相对于各倍率的SG、每个定量槽分别达到0.05、0.4、2.5ng/μl的方式制备，同时确认最佳的SG倍率是否依赖于样品浓度。将所制备的反应溶液注入到以每个基因组DNA浓度的种类进行了区分的96孔板中，使用Roche公司制Light Cycler 480在激发波长为488nm、检测波长为520nm、40℃下测定20分钟。
图12～14所示曲线的纵轴的值是在各浓度的标准基因组DNA存在下获得的荧光强度(单位是任意单位)，横轴表示SG倍率。本试验中的标准基因组DNA浓度为0.05ng/μl时SG倍率在2X附近荧光强度达到最大、为0.4ng/μl时在4X附近荧光强度达到最大、为2.5ng/μl时SG倍率在5X附近荧光强度达到最大。可以确认随着DNA浓度上升，荧光强度达到最大的SG倍率提高。认为由图2所示的发光原理出发，样品DNA的浓度增高、色素进入的空隙增加，因而荧光强度提高。另外，在任意DNA浓度下，SG倍率在增高某种程度时，荧光发光的强度也会下降、降低了1X时的值。认为这是由于相对于样品DNA、SG为过饱和，荧光色素浓度的提高导致了浓度消光。
3)相对于样品浓度的荧光强度的直线性
使用了SYBR Green I时，确认到相对于样品浓度的直线性。分别制备从每个槽的组成为6.25mM MgCl2、15mM NaCl、标准基因组DNA为0.05、0.1、0.4、0.8、1.2ng/μl的溶液及全血中提取的基因组DNA(利用Pico Green法确认为0.95ng/μl)。将各个浓度的样品DNA溶液注入到预先按照SG达到最终浓度4X的方式进行了干燥固定的基因分析装置和基因分析芯片(参照专利文献3和专利文献4)中。注入样品后，将经干燥固定的SG与样品充分地混合，进而以防止样品溶液的蒸发为目的，注入矿物油。
送液了样品DNA的芯片以40℃下30秒为1个循环，进行10个循环、共计5分钟，以各个样品浓度进行3次的荧光测定，获得图15所示的结果。以该结果为基础，对各样品浓度时获得的荧光强度的值进行平均，制作标准曲线，结果如图16所示，R2超过0.999，能够以高精度检测DNA量。
4)自全血提取的DNA量的定量
进行与上述直线性的确认相同的操作，对从全血提取的DNA进行定量，结果如图15所示，控制在0.8ng/μl的标准基因组DNA所显示的荧光强度值与1.2ng/μl的标准基因组DNA所显示的荧光强度的值之间。使用该标准曲线，将从全血提取的DNA浓度除去时，如图16所示，与利用之前的Pico Green法获得的值0.95ng/μl是一致的。
以上参照附图并间插着实施例对本发明的实施方式进行了详细叙述，但具体的构成并不限定于这些实施方式，还包含不脱离本发明主旨的范围内的设计变更等。
产业上的实用性
通过本发明的反应容器、核酸分析装置、核酸分析方法，通过了解从生物体试样中取出的核酸量，可以提高分析结果的可靠性和准确性。因此，适用于难以确认从生物体试样获得的核酸的量的全自动基因分析系统。另外，有可能广泛应用于医疗领域、制药领域等中，期待定制医疗品质的提高。
符号说明
1 分析槽
2 定量槽
3 核酸分析试剂
4 定量试剂
5 流路
6 注入口
7 基材
8 核酸
10 反应容器
20 核酸分析装置
21 提取部
22 纯化部
23 测定部
31 荧光色素
32 DNA
33 信号

Claims (26)

1.一种反应容器，其具备：
基材，
设置在所述基材上且能够注入溶液的注入口，
设置在所述基材上且配置有用于核酸分析的核酸分析试剂、能够对含有核酸的样品进行分析的分析槽，
设置在所述基材上、较所述分析槽更靠近所述注入口且配置有能够特异性地对核酸进行检测的定量试剂、能够对所述样品中含有的所述核酸的扩增前的核酸量进行定量的定量槽，和
设置在所述基材上且具有在所述定量槽和所述分析槽之间分支的分支点的流路，
其中，所述样品含有的所述核酸通过所述分支点被分配到所述定量槽和所述分析槽中。
2.根据权利要求1所述的反应容器，其中，所述基材由具有透光性的树脂形成。
3.根据权利要求1所述的反应容器，其中，所述定量试剂及所述核酸分析试剂中的至少1个以干燥状态进行配置。
4.根据权利要求1所述的反应容器，其中，所述定量试剂及所述核酸分析试剂中的至少1个以干燥状态且与海藻糖混合的状态进行配置。
5.一种核酸分析装置，其具备权利要求1～4中任一项所述的反应容器和用于提取所述核酸的提取部。
6.根据权利要求5所述的核酸分析装置，其进一步具备用于对所述核酸进行纯化的纯化部。
7.一种核酸分析方法，其使用了权利要求1～4中任一项所述的反应容器或者权利要求5或6所述的核酸分析装置，其包含下述核酸定量工序：
将含有与在所述分析槽中分析的核酸相同的核酸的样品注入到所述定量槽中，
在所述定量槽中使所述样品所含有的所述核酸与所述定量试剂缔合、形成缔合状态，
对以所述缔合状态产生的信号进行测定，
由所测定的所述信号计算在所述分析槽中分析的所述核酸的量。
8.根据权利要求7所述的核酸分析方法，其包含以下工序：
在所述核酸定量工序之前进行的从生物体试样提取核酸的核酸提取工序，和
在所述核酸提取工序之后进行的、将含有所述核酸的所述样品注入到所述分析槽中、在分析槽中进行所述核酸的识别的核酸分析工序；
其中，所述核酸是在所述核酸提取工序中获得的。
9.根据权利要求8所述的核酸分析方法，其包含下述工序：
在所述核酸定量工序之后进行的、基于通过所述核酸定量工序计算的所述核酸的量来判断通过所述核酸分析工序获得的分析结果的妥当性的工序。
10.根据权利要求8或9所述的核酸分析方法，其进一步包含在所述核酸提取工序之后且所述核酸定量工序之前进行的核酸纯化工序。
11.根据权利要求8或9所述的核酸分析方法，其中，所述核酸分析工序在所述核酸定量工序之后进行，并且包含在所述核酸定量工序之后且所述核酸分析工序之前进行的核酸纯化工序。
12.根据权利要求8所述的核酸分析方法，其中，所述核酸分析工序在所述核酸定量工序之后进行，并且进一步包含在所述核酸定量工序之后且所述核酸分析工序之前进行的、利用由所述核酸定量工序计算的核酸的量来判断可否移行至所述核酸分析工序的工序。
13.根据权利要求11所述的核酸分析方法，其进一步包含在所述核酸定量工序之后且所述核酸纯化工序之前进行的、利用由所述核酸定量工序计算的核酸的量来判断可否移行至所述核酸纯化工序的工序。
14.根据权利要求8所述的核酸分析方法，其中，所述生物体试样为选自全血、血清、唾液、痰、口腔粘膜和组织片中的至少1种。
15.一种反应容器，其具备：
基材，
设置在所述基材上且能够注入溶液的注入口，
设置在所述基材上且配置有用于核酸分析的核酸分析试剂、能够对含有核酸的样品进行分析的分析槽，
设置在所述基材上、较所述分析槽更靠近所述注入口且能够对所述样品中含有的所述核酸的扩增前的核酸量进行定量的定量槽，和
设置在所述基材上且具有在所述定量槽和所述分析槽之间分支的分支点的流路，
其中，所述样品含有的所述核酸通过所述分支点被分配在所述定量槽和所述分析槽中。
16.根据权利要求15所述的反应容器，其中，所述基材由具有透光性的树脂形成。
17.一种核酸分析装置，其具备权利要求15所述的反应容器和用于提取所述核酸的提取部。
18.根据权利要求17所述的核酸分析装置，其进一步具备用于对所述核酸进行纯化的纯化部。
19.一种核酸分析方法，其使用权利要求15或16所述的反应容器或者权利要求17或18所述的核酸分析装置，所述核酸分析方法包含下述核酸定量工序：
将含有与在所述分析槽中分析的核酸相同的核酸的样品注入到所述定量槽中，
在所述定量槽中对所述样品的紫外线的吸光度进行测定，
由所测定的紫外线的吸光度计算在所述分析槽中分析的所述核酸的量。
20.根据权利要求19所述的核酸分析方法，其包含以下工序：
在所述核酸定量工序之前进行的从生物体试样提取核酸的核酸提取工序，和
在所述核酸提取工序之后进行的、将含有所述核酸的所述样品注入到所述分析槽中、在所述分析槽中进行所述核酸的识别的核酸分析工序，
其中，所述核酸是在所述核酸提取工序中获得的。
21.根据权利要求20所述的核酸分析方法，其包含下述工序：
在所述核酸定量工序之后进行的、基于通过所述核酸定量工序计算的核酸的量来判断通过所述核酸分析工序获得的分析结果的妥当性的工序。
22.根据权利要求20或21所述的核酸分析方法，其进一步包含在所述核酸提取工序之后且所述核酸定量工序之前进行的核酸纯化工序。
23.根据权利要求20或21所述的核酸分析方法，其中，所述核酸分析工序在所述核酸定量工序之后进行，并且包含在所述核酸定量工序之后且所述核酸分析工序之前进行的核酸纯化工序。
24.根据权利要求20所述的核酸分析方法，其中，所述核酸分析工序在所述核酸定量工序之后进行，并且进一步包含在所述核酸定量工序之后且所述核酸分析工序之前进行的、由通过所述核酸定量工序计算的核酸的量来判断可否移行至所述核酸分析工序的工序。
25.根据权利要求23所述的核酸分析方法，其进一步包含下述工序：
在所述核酸定量工序之后且所述核酸纯化工序之前进行的、由通过所述核酸定量工序计算的核酸的量来判断可否移行至所述核酸纯化工序的工序。
26.根据权利要求20所述的核酸分析方法，其中，所述生物体试样为选自全血、血清、唾液、痰、口腔粘膜和组织片中的至少1种。
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