JP2004180687A - ターゲット核酸断片の分析方法及びターゲット核酸断片の分析キット - Google Patents

Abstract

【課題】 特殊な技術、複雑な操作、および特殊な装置を必要とせずに、誰でもが簡便かつ迅速に小型の装置を用いて実施することのできるターゲット核酸断片の分析キットを提供すること。
【解決手段】 分析するターゲット核酸断片の一部と相補的な少なくとも一種のプライマー、少なくとも一種のデオキシヌクレオシド３リン酸、少なくとも一種のポリメラーゼ、及びピロ燐酸定量用乾式分析素子の各要素を含むターゲット核酸断片の分析キットであって、前記ピロ燐酸定量用乾式分析素子が、キサントシンまたはイノシン、ピロホスファターゼ、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ、キサンチンオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ及び発色剤を含有する試薬層を備えるピロ燐酸定量用乾式分析素子であることを特徴とする、ターゲット核酸断片の分析キット。
【選択図】 なし

Description

本発明は、ウイルス、細菌等による感染症の臨床検査、及び個人の遺伝的な特徴による遺伝的疾患の検査等に有効である、特定の塩基配列を有するターゲット核酸断片を分析する方法、及び当該方法を使用する核酸断片の分析キットに関する。より詳細には、本発明は、ターゲット核酸を鋳型とするポリメラーゼ伸長反応が進行したか否かを比色法、好ましくは乾式分析素子を用いて検出することにより、簡便にターゲット核酸断片の存在または存在量あるいはターゲット核酸断片の塩基配列を分析する方法及び当該方法を使用する核酸断片の分析キットに関する。

従来から、ウイルス、細菌等による感染症の臨床検査においては、血液等の体液、糞便、喀痰等を試料として検体の培養を行い、ウイルス、細菌等の病原体を同定することが行われている。しかしながらこれらの方法は、検体を培養するのに非常に長い時間を必要としたり、ウイルス、細菌の種類によっては培養自体がうまく行かないという問題もある。また検体を培養するには特別の技術を要する点でも、必ずしも迅速、簡便に満足のいく結果が得られる方法ではない。

また、抗原抗体反応を利用してウイルス、細菌等の病原体を同定する方法も行われている。この方法は、検査の自動化も可能であり、迅速性、簡便性の点では良い方法である。しかしながら、病原体を抗原として検出する抗原検出方法においては、試料中に存在する病原体の量が不足することにより、病原体を検出できない場合があり、感度的に問題がある。また、病原体の種類に固有な抗原部位を決定することが困難であるという問題もある。一方、病原体の感染により、体内で産生された抗体を検出する抗体検出法においては、病原体の感染から抗体が産生されるまでに時間が必要で、その期間は検出できないという問題がある。

これらに対して、ウイルス、細菌等の病原体の種類に固有な塩基配列を持つ核酸断片（ターゲット核酸断片）を、塩基配列の相補性を利用して検出する方法は、病原体を直接に同定することを可能にする方法であり、ＤＮＡプローブ法または、ＰＣＲ（ポリメラーゼチェーンリアクション）法などの遺伝子検査法として普及している。例えば、ＨＣＶ（Ｃ型肝炎ウイルス）遺伝子検査法は、Ｃ型肝炎のインターフェロン（ＩＮＦ）治療におけるＩＮＦ投与の検討、治癒のモニタリングにおいて、ＨＣＶ量を直接知ることのできる方法として威力を発揮している。

今後さらに、ウイルス、細菌等の病原体の遺伝子的特長（Ｇｅｎｏｔｙｐｅ）が明らかになり、その遺伝子的特徴を利用した新しい治療薬が開発されることが期待できる。その場合には、病原体の同定のみならず、その病原体の遺伝子的特徴を知ることが非常に重要である。まさに遺伝子検査法はその需要を満たすことのできる検査方法である。

一方、病原体の同定に限らず、遺伝子検査法では個人の遺伝子的な特徴を直接検出することが可能であるので、遺伝子疾患の原因である遺伝子の変異の検出、癌や糖尿病などの生活習慣病などの病気にかかりやすさを左右している遺伝子的要因の検出にも用いることができる。特に、ヒトゲノムの全塩基配列が決定された後は、ポストゲノム研究として、今まで以上に遺伝子的特長と疾患の関係が明らかにされていき、さらに遺伝子的特長を利用した治療薬が開発されていくことが期待できる。ポストゲノム研究の進展に伴って、今後ますます遺伝子検査法の需要が大きくなっていくことが予想される。

しかしながら、現在行われている遺伝子検査法には特殊な技術、複雑な操作、及び特殊な装置等が必要であり、遺伝子検査法を実施できる施設は、大規模な検査センターなどに限られている。ウイルス、細菌等による感染症の検査においても、また個人の遺伝子的特長の検査においても、診断、治療の指針の決定がその場で、できるだけ速く行えればより効力を発揮する。そのためには、誰でもが簡単な操作で実施でき、検査結果を迅速に得ることのできる新しい遺伝子検査法が必要である。

これまでも簡便性、迅速性の向上を目指して、ターゲット核酸断片を鋳型としたポリメラーゼ伸長反応の進行の検出を利用した遺伝子検査法が開発されている。ターゲット核酸断片の特定核酸領域をＰＣＲにより増幅する際、増幅産物の生成の過程を蛍光強度の変化としてリアルタイムで検出する方法（Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ ＰＣＲ法）は、ＰＣＲ後に増幅産物を電気泳動し、結果を解析するという工程を必要としないことから迅速性の点で良い方法であり、ＴａｑＭａｎプローブ法（ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）、およびＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｅａｃｏｎ法（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）として商品化されている。しかし、これらの方法は、ＦＲＥＴ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｅｎｅｒｇｙ ｔｒａｎｓｆｅｒ）を利用した方法で、実施には蛍光強度の変化を測定することのできる装置と、蛍光色素とそのクエンチャー（ｑｕｅｎｃｈｅｒ）が組み合わせて標識された特殊なハイブリダイゼーションプローブを用意する必要がある点で問題があり、未だ特殊技術の域を出ていない。

また、インターカレータ性蛍光物質の存在下でターゲット核酸断片の特定核酸領域をＰＣＲで増幅し、その際の蛍光強度の変化を検出する方法（ＩＭ−ＰＣＲ：ｉｎｔｅｒｃａｒａｔｉｏｎ ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ ＰＣＲ法）が「医学のあゆみ Ｖｏｌ.１７３、Ｎｏ.１２、１９９５」に記載されている。この方法は、Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ ＰＣＲ法としては、特別なハイブリダイゼーションプローブを必要としない点で良いが、やはり実施には蛍光強度の変化を測定することのできる装置が必要である。また、ターゲット核酸断片の特定核酸領域のＰＣＲ増幅の有無にかかわらず、インターカレータ性蛍光物質は系内に存在する核酸断片全てに結合するので、特異性の点でも問題がある。

一方、ターゲット核酸断片の特定領域にヌクレアーゼ耐性を有するオリゴヌクレオチドプライマーをハイブリダイズさせ、デオキシヌクレオシド３リン酸（ｄＮＴＰ）、ＤＮＡポリメラーゼ、ヌクレアーゼの存在下で伸長反応、分解反応を繰り返して、生成するピロ燐酸又はデオキシヌクレオシドモノリン酸を検出する方法が、特開平７−２３１７９９号公報に開示されている。ポリメラーゼ伸長反応に伴って生成するピロ燐酸を検出することによるターゲット核酸断片の検出方法は、ポリメラーゼ伸長反応の副産物である一般化学物質を検出することで、ターゲット核酸断片の検出を可能にしている点で優れている。

しかしながら、これまでピロ燐酸を簡便に検出する方法は知られておらず、上記公報においても、ピロ燐酸をアデノシン−５’−ホスホサルフェートおよびアデノシン３燐酸（ＡＴＰ）スルフリラーゼと反応させて生ずるアデノシン３燐酸（ＡＴＰ）が、ルシフェラーゼの存在下、ルシフェリンとの反応時に生じる発光を検出する方法しか記載されていない。この方法では、発光を測定することのできる装置が必要である点で簡便性の点で問題が残る。また、ヌクレアーゼ耐性を有するプライマーを使用し、かつＤＮＡポリメラーゼとヌクレアーゼを併用し、ポリメラーゼ反応とヌクレアーゼ反応を繰り返して実施するこで、実質的に連続して伸長反応が進行しない条件で実施される点では本発明とは異なるものである。

本発明は、特殊な技術、複雑な操作、および特殊な装置を必要とせずに、誰でもが簡便かつ迅速に小型の装置を用いて実施することのできるターゲット核酸断片の分析方法を提供することを課題とする。また、これらの目的を達成するために、省スペースで自動化が可能なターゲット核酸断片の分析方法の提供も課題とする。更に、これらの分析方法を用いたターゲット核酸断片の分析キットの提供も課題とする。

本発明者は、上記課題を解決するために、ターゲット核酸断片の特定の塩基配列に基づくポリメラーゼ伸長反応の際に生成するピロ燐酸を、乾式分析素子を用いて検出することで、特殊な装置を必要とせずに、簡便性、迅速性に優れたターゲット核酸断片の分析を行えることを見出し、本発明を完成するに至った。

即ち、本発明は、少なくとも一部の塩基配列が既知であるターゲット核酸断片、前記ターゲット核酸断片の一部と相補的な少なくとも一種のプライマー、少なくとも一種のデオキシヌクレオシド３リン酸（ｄＮＴＰ）、及び少なくとも一種のポリメラーゼを反応させ、前記ターゲット核酸断片を鋳型にした前記プライマーの３’末端を起点とするポリメラーゼ伸長反応の進行の有無を検出することを含む、前記ターゲット核酸断片を分析する方法において、前記ポリメラーゼ伸長反応に伴って生成するピロ燐酸を検出することによりポリメラーゼ伸長反応の進行の有無を検出することを特徴とするターゲット核酸断片の分析方法、及び当該分析方法を行うためのターゲット核酸断片の分析キットを提供するものである。

本発明によれば、ウイルス、細菌等による感染症の臨床検査、及び個人の遺伝的な特徴による遺伝的疾患の検査等に有効な、特定の塩基配列を有するターゲット核酸断片の分析のための簡便かつ迅速な方法およびキットが提供される。

本発明のターゲット核酸断片の分析方法の好ましい形態は、ピロ燐酸の分析を比色法を用いて行う方法であり、より好ましくは、ピロ燐酸の検出を乾式分析素子を用いて行う方法にある。本発明によるターゲット核酸断片の分析方法では、ターゲット核酸断片の存在または存在量を検出したり、あるいはターゲット核酸断片の塩基配列を検出することができる。なお、ここで言う存在量の検出とは、ターゲット核酸断片の定量を含む概念である。ターゲット核酸断片の塩基配列の検出の具体例としては、ターゲット核酸断片の変異または多型の検出などが挙げられる。図１に、本発明の実施形態を説明する概念図を示す。

本発明に係るターゲット核酸断片の分析方法の第一の好ましい形態を以下に列記する。
(イ) ピロ燐酸の検出を、キサントシンまたはイノシン、ピロホスファターゼ、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ、キサンチンオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ及び発色剤を含有する試薬層を備えることを特徴とするピロ燐酸定量用乾式分析素子を用いて行う。
(ロ) ポリメラーゼが、ＤＮＡポリメラーゼＩ、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノー断片、Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ、及び逆転写酵素（リバーストランスクリプターゼ）からなるグループから選択されるポリメラーゼを用いる。
また、本発明の別の形態は、分析するターゲット核酸断片の一部と相補的な少なくとも一種のプライマー、少なくとも一種のデオキシヌクレオシド３リン酸（ｄＮＴＰ）、少なくとも一種のポリメラーゼ、及びピロ燐酸定量用乾式分析素子の各要素を含むキットにある。

さらに、本発明の第二の好ましい形態は、少なくとも一部の塩基配列が既知であるターゲット核酸断片、前記ターゲット核酸断片の一部と相補的な少なくとも一種のプライマー、少なくとも一種のデオキシヌクレオシド３リン酸、及び少なくとも一種のポリメラーゼを反応させ、前記ターゲット核酸断片を鋳型にした前記プライマーの３’末端を起点とするポリメラーゼ伸長反応の進行の有無の検出を前記ポリメラーゼ伸長反応に伴って生成するピロ燐酸を検出することにより行う際に、ピロ燐酸の検出を、ピロ燐酸を酵素的に無機燐酸に変換した後、次いでキサントシンまたはイノシン、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ、キサンチンオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ及び発色剤を含有する試薬層を備える無機燐定量用乾式分析素子を用いて行うことを特徴とする、ターゲット核酸断片の分析方法にある。

本発明の第二の形態での、ターゲット核酸断片分析方法の好ましい形態を以下に列記する。
(イ) ピロ燐酸を変換する酵素として、ピロホスファターゼを用いる。
(ロ) ポリメラーゼが、ＤＮＡポリメラーゼＩ、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノー断片、Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ、及び逆転写酵素（リバーストランスクリプターゼ）からなるグループから選択されるポリメラーゼを用いる。

また、本発明の別の形態は、分析するターゲット核酸断片の一部と相補的な少なくとも一種のプライマー、少なくとも一種のデオキシヌクレオシド３リン酸（ｄＮＴＰ）、少なくとも一種のポリメラーゼ、ピロホスファターゼ、及び無機燐定量用乾式分析素子の各要素を含むキットにある。

以下に本発明の実施の形態について更に詳細に説明する。

(Ａ) ターゲット核酸断片：本発明において分析の対象となるターゲット核酸断片とは、少なくとも一部の塩基配列が既知であるポリヌクレオチドであり、動物、微生物、細菌、植物などすべての生物から単離されるゲノミックＤＮＡ断片が対象となり得る。またウイルスから単離可能なＲＮＡ断片またはＤＮＡ断片、およびｍＲＮＡを鋳型として合成されたｃＤＮＡ断片も対象とすることが可能である。ターゲット核酸断片はできる限り精製され、核酸断片以外の余分な成分が取り除かれていることが望ましい。例えば、動物（例えば人間）の血液から単離したゲノミックＤＮＡ断片を対象とする場合または血液中に存在する感染細菌やウイルスの核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）断片を対象とする場合、単離の過程で破壊された白血球細胞膜、赤血球中から溶出したヘモグロビン、および血液中存在するその他の一般化学物質は、十分に取り除いておく必要がある。特にヘモグロンビンは、続いておこなうポリメラーゼ伸長反応を阻害する。また血液中に一般生化学物質として存在するピロ燐酸や燐酸は、ポリメラーゼ伸長反応により生成するピロ燐酸の正確な検出の妨害要因になる。

(Ｂ）ターゲット核酸断片と相補的なプライマー：本発明において使用するターゲット核酸断片と相補的なプライマーは、ターゲット核酸断片の塩基配列が既知である目的の部位に対して相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドである。このターゲット核酸断片と相補的なプライマーがターゲット核酸断片の目的の部位にハイブリダイゼーションすることで、プライマーの３’末端を起点に、ターゲット核酸を鋳型としポリメラーゼ伸長反応が進行する。即ち、本発明においてはプライマーがターゲット核酸断片の目的の部位を認識して特異的にハイブリダイゼーションするか否かがポイントとなる。本発明で使用するプライマーの好ましい塩基数は５〜６０塩基である。特に好ましくは１５〜４０塩基である。プライマーの塩基数は少なすぎると、ターゲット核酸断片の目的の部位との特異的性が低下するだけでなく、ターゲット核酸断片とのハイブリッド自体が安定に形成できない。また、プライマーの塩基数は多すぎると、プライマー間またはプライマー内で塩基間の水素結合により２本鎖を形成してしまい、やはり特異性が低下する。

本発明の方法を用いてターゲット核酸断片の存在を検出する場合、ターゲット核酸断片の異なる部位に対して、それぞれの部位に相補的なプライマーを複数使用することも可能である。このようにターゲット核酸断片を複数の部位で認識することで、ターゲット核酸断片の存在の検出において、特異性が向上する。また、ターゲット核酸断片の一部を増幅（例えばＰＣＲ法）する場合には、その増幅法に応じて複数のプライマーを設計することも可能である。
本発明の方法を用いてターゲット核酸断片の塩基配列を検出する場合、特に変異または多型の有無を検出する場合は、目的の変異または多型の部分を含むように、変異または多型に対応する塩基の種類でプライマーを設計する。そうすることで、ターゲット核酸断片の変異または多型の有無により、ターゲット核酸断片へのプライマーのハイブリダイゼーションの有無に差異が生じ、結果的にポリメラーゼ伸長反応の差異として検出することが可能になる。また、変異または多型に対応する部分をプライマーの３'末端付近に設定することでポリメラーゼの反応部位の認識に差異が生じ、結果的にポリメラーゼ伸長反応の差異として検出することも可能である。

(Ｃ) ポリメラーゼ：本発明において使用するポリメラーゼは、ターゲット核酸がＤＮＡの場合は、ターゲット核酸断片の一本鎖に変性された部分にプライマーがハイブリダイゼーションすることで形成された２本鎖の部分を起点として、５’→３’の方向に、デオキシヌクレオシド３リン酸（ｄＮＴＰ）を材料として、ターゲット核酸断片を鋳型にして相補的な伸長反応を触媒するＤＮＡポリメーラーゼである。具体的に使用されるＤＮＡポリメラーゼとしては、ＤＮＡポリメラーゼＩ、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノー断片、Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ等がある。ＤＮＡポリメラーゼは目的に応じて選択または組み合わせることが可能である。例えば、ターゲット核酸断片の一部を増幅（例えばＰＣＲ法）する場合には、耐熱性に優れたＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼを用いることが有効である。また、「ＢＩＯ ＩＮＤＵＳＴＲＹ，Ｖｏｌ．１８，Ｎｏ．２，２００１」に記載されている増幅法（ＬＡＭＰ法：Ｌｏｏｐ−ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＤＮＡ）を用いてターゲット核酸断片の一部を増幅する場合には、５’→３’方向へのヌクレアーゼ活性がなく、かつ鋳型上の２本鎖ＤＮＡを１本鎖ＤＮＡとして遊離させながら伸長反応を触媒する鎖置換型のＤＮＡポリメラーゼとして、Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼを使用することが有効である。その他、目的に応じて、３’→５’方向へのヘキソキナーゼ活性を持つ、ＤＮＡポリメラーゼα、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ、及びＴ７ ＤＮＡポリメラーゼを併用することも可能である。

また、ＲＮＡウイルスのゲノミック核酸またはｍＲＮＡがターゲット核酸断片である場合には、逆転写活性を有するリバーストランスクリプターゼを使用することが可能である。さらにリバーストランスクリプターゼとＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼを併用することも可能である。

(Ｄ) ポリメラーゼ伸長反応：本発明において対象となるポリメラーゼ伸長反応には、前記（Ａ）に記載されているようなターゲット核酸断片の１本鎖に変性された部分の一部に特異的にハイブリダイゼーションした、前記（Ｂ）に記載されているようなターゲット核酸断片と相補的なプライマーの３’末端を起点として、デオキシヌクレオシド３リン酸（ｄＮＴＰ）を材料として、前記（Ｃ）に記載されているようなポリメラーゼを触媒として、ターゲット核酸断片を鋳型にして進行する相補的な核酸の伸長反応の全てが含まれる。この相補的な核酸の伸長反応とは、少なくとも２回（２塩基分）、連続しての伸長反応が起こることをさしている。

以下に、例として代表的なポリメラーゼ伸長反応、およびポリメラーゼ伸長反応を伴うターゲット核酸断片の目的部位の増幅反応の例を示す。ターゲット核酸断片を鋳型にして、５’→３’の方向へのポリメラーゼ伸長反応を一度だけ行う場合が最も単純である。このポリメラーゼ伸長反応は等温の条件で実施することができる。この場合には、ポリメラーゼ伸長反応の結果として生成するピロ燐酸の量は、最初のターゲット核酸断片の量に比例する。即ち定量的にターゲット核酸断片の存在を検出するのに適した方法である。

ターゲット核酸の量が少ない場合は、ポリメラーゼ伸長反応を利用した何らかの手段でターゲット核酸の目的部分を増幅することが好ましい。ターゲット核酸の増幅には、これまで開発、発明されてきた各種の方法を使用することができる。ターゲット核酸の増幅法で最も一般的で普及している方法はＰＣＲ（ポリメラーゼチェーンリアクション）法である。ＰＣＲ法では、反応液の温度の上げ下げを周期的にコントロールすることにより、変性（核酸断片を２本鎖から１本鎖に変性する工程）→アニーリング（１本鎖に変性した核酸断片にプライマーをハイブイリダイズさせる工程）→ポリメラーゼ（ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ）伸長反応→ディネイチャーの周期的な工程を繰り返すことで、ターゲット核酸断片の目的部分を増幅する方法である。最終的に、ターゲット核酸断片の目的部位は初期量の１００万倍にも増幅し得る。そのためＰＣＲ法の増幅過程でのポリメラーゼ伸長反応で生成するピロ燐酸の蓄積量も多くなり、検出が容易になる。

特開平５−１３０８７０号公報に記載されている、エクソヌクレアーゼを用いたサイクリングアッセイ法もポリメラーゼ伸長反応を利用した、ターゲット核酸断片の目的部位の増幅法の一つである。この方法はターゲット核酸断片の目的部位に特異的にハイブリダイゼーションしたプライマーを起点とした、ポリメラーゼ伸長反応とともに、５’→３’エクソヌクレアーゼを作用させて、プライマーを逆方向から分解する方法である。分解したプライマーの代わりに新たなプライマーがハイブリダイゼーションし、再度ＤＮＡポリメラーゼによる伸長反応が進行する。このポリメラーゼによる伸長反応と、この先に伸長した鎖を外すエクソヌクレーアゼによる分解反応が順次、周期的に繰り返される。ここで、ポリメラーゼによる伸長反応とエクソヌクレーアゼによる分解反応は等温条件で実施することが可能である。このサイクリングアッセイ法においても繰り返されるポリメラーゼ伸長反応で生成するピロ燐酸の蓄積量も多くなり、検出が容易になる。

近年開発されたターゲット核酸断片の目的部位の増幅法として、前記ＬＡＭＰ法がある。この方法は、ターゲット核酸断片の少なくとも６個所の特定部位を相補的に認識する少なくとも４種のプライマーと、５’→３’方向へのヌクレアーゼ活性がなく、かつ鋳型上の２本鎖ＤＮＡを１本鎖ＤＮＡとして遊離させながら伸長反応を触媒する鎖置換型のＢｓｔ ＤＮＡポリメラーゼを使用することで、等温条件でターゲット核酸断片の目的部位を、特別な構造として増幅する方法である。このＬＡＭＰ法の増幅効率は高く、ポリメラーゼ伸長反応で生成するピロ燐酸の蓄積量も非常に多くなり、検出が容易になる。

ターゲット核酸断片がＲＮＡ断片の場合は、逆転写活性を有するリバーストランスクリプターゼを使用し、ＲＮＡ鎖を鋳型にして伸長反応を行うことが可能である。さらにリバーストランスクリプターゼとＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼを併用し、ＲＴ（リバーストランスクリプション）反応に引き続いてＰＣＲ反応を行う、ＲＴ−ＰＣＲ法を用いることができる。このＲＴ反応またはＲＴ−ＰＣＲ反応で生成するピロ燐酸を検出することで、ターゲット核酸断片のＲＮＡ断片の存在を検出することができる。この方法は、ＲＮＡウイルスの存在を検出する場合に有効である。

(Ｅ) ピロ燐酸（ＰＰｉ）の検出：従来からピロ燐酸（ＰＰｉ）の検出法としては、式１に示された方法が知られている。この方法では、ピロ燐酸（ＰＰｉ）をスルフリラーゼによりアデノシン３燐酸（ＡＴＰ）に変換し、アデノシン３燐酸がルシフェラーゼによりルシフェリンに作用して生じる発光を検出する。そのため、この方法でピロ燐酸（ＰＰｉ）を検出するには発光を測定できる装置が必要である。

本発明に適したピロ燐酸の検出方法は式２または式３に示した方法である。式２または式３に示した方法は、ピロ燐酸（ＰＰｉ）をピロホスファターゼで無機燐酸（Ｐｉ）に変換し、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ（ＰＮＰ）により無機燐酸（Ｐｉ）をキサントシンまたはイノシンと反応させ、生じたキサンチンまたはヒポキサンチンをキサンチンオキシダーゼ（ＸＯＤ）により酸化して尿酸を生成させ、この酸化過程で生じる過酸化水素（Ｈ₂Ｏ₂）を用いてペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）により発色剤（色素前駆体）を発色させ、これを比色するものである。これら式２または式３に示した方法では結果を比色で検出できるため、目視または簡単な比色測定装置を用いてピロ燐酸（ＰＰｉ）の検出が可能である。

ピロホスファターゼ（ＥＣ３，６，１，１）プリンヌクレオシドホスホリラーゼ（ＰＮＰ，ＥＣ２．４．２．１）、キサンチンオキシダーゼ（ＸＯＤ，ＥＣ１．２．３．２）及びペルオキシダーゼ（ＰＯＤ，ＥＣ１．１１．１．７）は市販のものを使用することができる。発色剤（すなわち色素前駆体）は、過酸化水素とペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）により色素を生成させるものであればよく、例えば、ロイコ色素の酸化によって色素を生成する組成物（例、米国特許４，０８９，７４７等に記載のトリアリールイミダゾールロイコ色素、特開昭５９−１９３３５２号公報（ＥＰ ０１２２６４１Ａ）等に記載のジアリールイミダゾーロイコ色素）；酸化されたときに他の化合物とカップリングにより色素を生成する化合物を含む組成物（例えば４−アミノアンチピリン類とフェノール類又はナフトール類）などを使用することができる。

(Ｆ) 乾式分析素子：本発明において使用することのできる乾式分析素子とは、一層または複数層の機能層からなる分析素子であって、その少なくとも一層（または複数の層に渡って）に検出試薬を含有させ、層内での反応により生じた生成色素を、分析素子の外から反射光あるいは透過光により比色定量するものである。

このような乾式分析素子を用いて定量分析するには、液体試料を展開層の表面に一定量点着する。展開層で展開された液体試料は試薬層に達し、ここで試薬と反応し、発色する。点着後、乾式分析素子を適当な時間、一定温度に保って（インクベーション）発色反応を充分に進行させた後、例えば透明支持体側から照明光を試薬層に照射し、特定波長域で反射光量を測定して反射光学濃度を求め、予め求めておいた検量線に基づいて定量分析を行う。

乾式分析素子においては、検出を行うまでは乾燥状態で貯蔵・保管されるため、試薬を用時調製する必要がなく、また一般に乾燥状態の方が試薬の安定性が高いことから、試薬溶液を用時調製しなければならないいわゆる湿式法より簡便性、迅速性に優れている。また、微量の液体試料で、精度の高い検査を迅速に行うことができる検査方法としても優れている。

(Ｇ) ピロ燐酸定量用乾式分析素子：本発明で使用することのできるピロ燐酸定量用乾式分析素子は、公知の多種の乾式分析素子と同様の層構成とすることができる。乾式分析素子は、前記（Ｅ）項（ピロ燐酸（ＰＰｉ）の検出）における、式２または式３の反応を行うための試薬の他、支持体、展開層、検出層、光遮蔽層、接着層、吸水層、下塗り層その他の層を含む多重層としてもよい。このような乾式分析素子として、例えば特開昭４９−５３８８８号公報（対応米国特許３，９９２，１５８）、特開昭５１−４０１９１号公報（対応米国特許４，０４２，３３５）、及び特開昭５５−１６４３５６号公報（対応米国特許４，２９２，２７２）、特開昭６１−４９５９号公報（対応ＥＰＣ公開特許０１６６３６５Ａ）の各明細書に開示されたものがある。

光透過性水不透過性支持体を用いる場合の乾式分析素子は、実用的に次のような構成を取り得る。ただし、本発明の内容はこれに限定されない。
(１) 支持体上に試薬層を有するもの。
(２) 支持体上に検出層、試薬層をこの順に有するもの。
(３) 支持体上に検出層、光反射層、試薬層をこの順に有するもの。
(４) 支持体上に第２試薬層、光反射層、第１試薬層をこの順に有するもの。
(５) 支持体上に検出層、第２試薬層、光反射層、第１試薬層をこの順に有するもの。

上記（１）ないし（３）において試薬層は異なる複数の層から成ってもよい。例えば第１試薬層には、式２または式３に示すピロホスファターゼ反応に必要な酵素ピロホスファターゼ、ＰＮＰ反応に必要な基質キサントシンまたは基質イノシンと酵素ＰＮＰを、第２試薬層には、式２または式３に示すＸＯＤ反応に必要な酵素ＸＯＤを、そして第３試薬層には、式２または式３に示すＰＯＤ反応に必要な酵素ＰＯＤと発色色素（色素前駆体）を、それぞれ含有させてもよい。あるいは試薬層を２層として、第１試薬層ではピロホスファターゼ反応とＰＮＰ反応を、第２試薬層ではＸＯＤ反応とＰＯＤ反応を進行させてもよい。又は、第１試薬層ではピロホスファターゼ反応とＰＮＰ反応とＸＯＤ反応を、第２試薬層でＰＯＤ反応を進行させてもよい。

なお支持体と試薬層又は検出層との間には吸水層を設けてもよい。また各層の間には濾過層を設けてもよい。また試薬層の上には展開層を設けてもよく、その間に接着層を設けてもよい。

支持体は光不透過性（不透明）、光半透過性（半透明）、光透過性（透明）のいずれのものも用いることができるが、一般的には光透過性で水不透過性の支持体が好ましい。光透過性水不透過性支持体の材料として好ましいものはポリエチレンテレフタレート、ポリスチレンである。親水性層を強固に接着させるため通常、下塗り層を設けるか、親水化処理を施す。

試薬層として多孔性層を用いる場合、その多孔性媒体は繊維質であってもよいし、非繊維質であってもよい。繊維質材料としては、例えば濾紙、不織布、織物布地（例えば平織り布地）、編物布地（例えばトリコット編物布地）、ガラス繊維濾紙等を用いることができる。非繊維質材料としては特開昭４９−５３８８８号公報等に記載の酢酸セルロースなどからなるメンブランフイルター、特開昭４９−５３８８８号公報、特開昭５５−９０８５９号公報（対応米国特許４，２５８，００１）特開昭５８−７０１６３号公報（対応米国特許４，４８６，５３７）等に記載の無機物又は有機物微粒子からなる連続空隙含有粒状構造物層等のいずれでもよい。特開昭６１−４９５９号公報（対応欧州公開ＥＰ ０１６６３６５Ａ）、特開昭６２−１１６２５８号公報、特開昭６２−１３８７５６号公報（対応欧州公開ＥＰ ０２２６４６５Ａ）、特開昭６２−１３８７５７号公報（対応欧州公開ＥＰ ０２２６４６５Ａ）、特開昭６２−１３８７５８号公報（対応欧州公開ＥＰ ０２２６４６５Ａ）等に記載の部分接着された複数の多孔性層の積層物も好適である。

多孔性層は、供給される液体の量にほぼ比例した面積に液体を展開する、いわゆる計量作用を有する展開層であってもよい。展開層としては、これらのうち織物布地、編物布地などが好ましい。織物布地などは特開昭５７−６６３５９号公報に記載されたようなグロー放電処理をしてもよい。展開層には、展開面積、展開速度等を調節するため特開昭６０−２２２７７０号公報（対応：ＥＰ ０１６２３０１Ａ）、特開昭６３−２１９３９７号公報（対応西独特許公開ＤＥ ３７１７９１３Ａ）、特開昭６３−１１２９９９号公報（対応：ＤＥ ３７１７９１３Ａ）、特開昭６２−１８２６５２号公報（対応：ＤＥ ３７１７９１３Ａ）に記載したような親水性高分子あるいは界面活性剤を含有させてもよい。

例えば紙、布、高分子からなる多孔質膜等に本発明の試薬を予め含浸又は塗布した後、支持体上に設けた他の水浸透性層、例えば検出層の上に、特開昭５５−１６４５３５６号公報のような方法で接着させるのも有用な方法である。

こうして作られる試薬層の厚さは特に制限されないが、塗布層として設ける場合には、１μｍ〜５０μｍ程度、好ましくは２μｍ〜３０μｍの範囲が適当である。ラミネートによる積層など、塗布以外の方法による場合、厚さは数十μmから数百μmの範囲で大きく変化し得る。

親水性ポリマーバインダーからなる水浸透性層で試薬層を構成する場合、使用できる親水性ポリマーとしては、例えば、以下のものがある。ゼラチン及びこれらの誘導体（例えばフタル化ゼラチン）、セルロース誘導体（例えばヒドロキシエチルセルロース）、アガロース、アルギン酸ナトリウム、アクリルアミド共重合体やメタアクリルアミド共重合体（例えば、アクリルアミド又はメタアクリルアミドと各種ビニル性モニマーとの共重合体）、ポリヒドロキシエチルメタクリレート、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリアクリル酸ナトリウム、アクリル酸と各種ビニル性モノマーとの共重合体などである。

親水性ポリマーバインダーで構成される試薬層は、特公昭５３−２１６７７号公報（対応米国特許３，９９２，１５８）、特開昭５５−１６４３５６号公報（対応米国特許４，２９２，２７２）、特開昭５４−１０１３９８号公報（対応米国特許４，１３２，５２８）等の明細書に記載の方法に従って本発明の試薬組成物と親水性ポリマーを含む水溶液又は水分散液を支持体又は検出層等の他の層の上に塗布し乾燥することにより設けることができる。親水性ポリマーをバインダーとする試薬層の乾燥時の厚さは約２μｍ〜約５０μｍ、好ましくは約４μｍ〜約３０μｍの範囲、被覆量では約２ｇ／ｍ²〜約５０ｇ／ｍ²、好ましくは約４ｇ／ｍ²〜約３０ｇ／ｍ²の範囲である。

試薬層には式２または式３の試薬組成物の他に、塗布特性、拡散性化合物の拡散性、反応性、保存性等の諸性能の向上を目的として、酵素の活性化剤、補酵素、界面活性剤、ｐＨ緩衝剤組成物、微粉末、酸化防止剤、その他、有機物あるいは無機物からなる各種添加剤を加える事ができる。試薬層に含有させることができる緩衝剤はの例としては、日本化学学会編「化学便覧 基礎」（丸善(株)、１９６６年発行）１３１２−１３２０頁、Ｒ．Ｍ．Ｃ．Ｄａｗｓｏｎ ｅｔ ａｌ編、「Ｄａｔａ ｆｏｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ」第２版（Ｏｘｆｏｒｄ ａｔ ｔｈｅ Ｃｌａｒｅｎｄｏｎ Ｐｒｅｓｓ，１９６９年発行）４７６−５０８頁、「Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」５，４６７−４７７頁（１９６６年）、「Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」１０４，３００−３１０頁（１９８０年）に記載のｐＨ緩衝剤系がある。ｐＨ緩衝剤系の具体例として硼酸塩を含む緩衝剤；クエン酸又はクエン酸塩を含む緩衝剤；グリシンを含む緩衝剤；ビシン（Ｂｉｃｉｎｅ）を含む緩衝剤；ＨＥＰＥＳを含む緩衝剤；ＭＥＳを含む緩衝剤などのグッド緩衝剤等がある。なお燐酸塩を含む緩衝剤は、ピロ燐酸検出用乾式分析素子に使用することはできない。

本発明で使用することのできる、ピロ燐酸定量用乾式分析素子は前述の諸特許明細書に記載の公知の方法により調製することができる。ピロ燐酸定量用乾式分析素子は一辺約５ｍｍから約３０ｍｍの正方形またはほぼ同サイズの円形等の小片に裁断し、特公昭５７−２８３３３１号公報（対応米国特許４，１６９，７５１）、実開昭５６−１４２４５４号公報（対応米国特許４，３８７，９９０）、特開昭５７−６３４５２号公報、実開昭５８−３２３５０号公報、特表昭５８−５０１１４４号公報（対応国際公:ＷＯ０８３／００３９１）等に記載のスライド枠に収めて化学分析スライドとして用いることが製造，包装，輸送，保存，測定操作等の観点で好ましい。使用目的によっては、長いテープ状でカセットまたはマガジンに収めて用いたり、又は小片を開口のある容器内に収めて用いたり、又は小片を開口カードに貼付または収めて用いたり、あるいは裁断した小片をそのまま用いることなどもできる。

本発明で使用することのできるピロ燐酸定量用乾式分析素子は前述の諸特許明細書等に記載の操作と同様の操作により液体試料中の被検物であるピロ燐酸の定量検出ができる。例えば約２μＬ〜約３０μＬ、好ましくは４μＬ〜１５μＬの範囲の水性液体試料液を試薬層に点着する。点着した分析素子を約２０℃〜約４５℃の範囲の一定温度で、好ましくは約３０℃〜約４０℃の範囲内の一定温度で１〜１０分間インキュベーションする。分析素子内の発色又は変色を光透過性支持体側から反射測光し、予め作成した検量線を用いて比色測定法の原理により検体中のピロ燐酸の量を求めることができる。点着する液体試料の量、インキュベーション時間及び温度を一定にすることにより定量分析を高精度に実施できる。

測定操作は特開昭６０−１２５５４３号公報、特開昭６０−２２０８６２号公報、特開昭６１−２９４３６７号公報、特開昭５８−１６１８６７号公報（対応米国特許４，４２４，１９１）などに記載の化学分析装置により極めて容易な操作で高精度の定量分析を実施できる。なお、目的や必要精度によっては目視により発色の度合いを判定して、半定量的な測定を行ってもよい。

本発明で使用することのできる、ピロ燐酸定量乾式分析素子においては、分析を行うまでは乾燥状態で貯蔵・保管されるため、試薬を用時調製する必要がなく、また一般に乾燥状態の方が試薬の安定性が高いことから、試薬溶液を用時調製しなければならないいわゆる湿式法より簡便性、迅速性に優れている。また、微量の液体試料で、精度の高い検査を迅速に行うことができる検査方法としても優れている。

本発明の第二の形態において使用することのできる無機燐定量用乾式分析素子は、前記のピロ燐酸定量乾式分析素子における試薬層からピロホスファターゼを除くことで調製することができる。また、特開平７−１９７号公報に記載の乾式分析素子を使用することも可能である。無機燐定量用乾式分析素子は、試薬層にピロホスファターゼを含有しない以外は、その層構成、製造方法、使用方法において、前記ピロ燐酸定量乾式分析素子と同様である。

(Ｈ) キット：本発明のターゲット核酸の分析は、分析するターゲット核酸断片の一部と相補的な少なくとも一種のプライマー、少なくとも一種のデオキシヌクレオシド３リン酸（ｄＮＴＰ）、少なくとも一種のポリメラーゼ、及びピロ燐酸定量用乾式分析素子の各要素を含むキットを用いて実施することができる。

キットの形態は、少なくとも一部の塩基配列が既知であるターゲット核酸断片を含む液体を供給することのできる開口部、ターゲット核酸断片の一部と相補的な少なくとも一種のプライマー、少なくとも一種のデオキシヌクレオシド３リン酸（ｄＮＴＰ）、及び少なくとも一種のポリメラーゼを保持することのできる少なくとも一つの反応セル部、ピロ燐酸定量用乾式分析素子を保持することのできる検出部、及びそれら前記開口部、反応セル部、検出部の間を連結し、液体を移動させることのできる細管または溝を備えているカートリジであってもよい。

このようなカートリッジとしては、米国特許５，９１９，７１１に記載されているカートリッジ等を利用することが可能である。図２には、本発明におけるカートリッジ形態のキットの一例を示した。キット１０において、開口部３１からターゲット核酸を含有する試料液を供給することができる。開口部３１は細管４１によって、反応セル３２と連結されている。反応セル３２には、予めターゲット核酸断片の一部と相補的な少なくとも一種のプライマー８１、少なくとも一種のデオキシヌクレオシド３リン酸（ｄＮＴＰ）８２、及び少なくとも一種のポリメラーゼ８３が保持されている。さらに、反応セル３２は細管４２によって検出部３３と連結されている。検出部３３には予め乾式分析素子５１が保持されている。反応セル３２でポリメラーゼ伸長反応が進行した試料液は、細管４２を移動して、検出部３３のピロ燐酸定量用乾式分析素子５１上に供給され、ポリメラーゼ伸長反応により生成したピロ燐酸を検出する。上記キット１０において、開口部３１と反応セル３２の間、及び反応セル３２と検出部３３の間の液体の移動は、遠心力、電気泳動または電気浸透などを用いることが可能である。また、反応セル３２、細管４１及び４２、検出部３３は、基体２１と蓋２２によって密封されていることが望ましい。

図２に示したようなカートリッジ形態のキット１０を使用する場合、図３に示したように、反応セル３２および検出部３３の温度コントロール部６１及び６２と、ピロ燐酸定量用乾式分析素子５１内の発色または色変化を反射光により検出することのできる検出部７１及び７２を備えている装置を合わせて使用することが望ましい。

本発明で使用することのできるカートリッジ形態のキットは、図２に示されているものに限らない。ポリメラーゼ伸長反応に必要な試薬はそれぞれ別のスペースに保持されていても良い。その場合は、反応時にそれぞれの試薬が反応セルに移動してくるようにすれば良い。また、反応セルは複数であっても良い。

ポリメラーゼ伸長反応で生成したピロ燐酸の検出を、ピロ燐酸を酵素的に無機燐酸に変換した後に無機燐定量用乾式分析素子を用いて行う場合には、第一の反応セルには、予めターゲット核酸断片の一部と相補的な少なくとも一種のプライマー、少なくとも一種のデオキシヌクレオシド３リン酸（ｄＮＴＰ）、及び少なくとも一種のポリメラーゼを保持しておき、第一の反応セルにおいてポリメラーゼ伸長反応を行い、次いで、第一の反応セルと細管で連結されていて、予めピロホスファターゼが保持されている第二の反応セルに第一の反応セルでの反応液を移動させ、第一の反応セルにおけるポリメラーゼ伸長反応で生成したピロ燐酸を第二反応セルにおいて無機燐酸に変換し、次いで第二の反応セルでの反応液を、第二の反応セルに細管で連結されていて、予め無機燐定量用乾式分析素子が保持されている検出部に移動させ、無機燐を検出することも可能である。

また、１つのカートリッジ上に「開口部−細管−反応セル−細管−検出部」の組を平行に並べて、または同心円の半径方向に並べて、複数組設置することも可能である。この場合、例えば反応セルに保持するターゲット核酸断片の一部と相補的な少なくとも一種のプライマーの塩基配列を、ターゲットとする核酸の種類に応じて変更することで、同時に複数種のターゲット核酸を検出することが可能なキットを提供できる。

以下、実施例にて本発明を詳細に説明する。しかしながら、本実施例により本発明の技術的範囲が限定されるものではない。

実施例１：ピロ燐酸定量用乾式分析素子を用いたＹ染色体短腕上のＳＲＹ遺伝子関連部位の検出
(１) ピロ燐酸定量用乾式分析素子の作製
ゼラチン下塗層が設けられている厚さ１８０μmの無色透明ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）平滑フイルムシート（支持体）上に表１記載の組成（ａ）の水溶液を、以下の被覆率となるように塗布し、乾燥して試薬層を設けた。

この試薬層の上に下記の表２記載の組成（ｂ）の接着層水溶液を以下の被覆率となるように塗布し、乾燥して接着層を設けた。

次いで接着層の上に３０ｇ／ｍ²の割合で水を全面に供給してゼラチン層を膨潤させ、その上に純ポリエステル製のブロード織物布地をほぼ一様に軽く圧力をかけてラミネートして多孔性展開層を設けた。

次にこの展開層の上から下記の表３記載の組成（ｃ）の水溶液を以下の被覆率となるようにほぼ均一塗布し、乾燥させ、ピロ燐酸定量用乾式分析素子を作成した。

(２) ターゲット核酸断片試料液の調製
男性、女性、各々１人づつから採取した血液検体に対して、市販の核酸抽出、精製キット（ＱＩＡＧＥＮ社製、ＱＩＡａｍｐ ＤＮＡ Ｂｌｏｏｄ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ）を用いて抽出、精製したゲノミック核酸断片を１ｍＬの精製蒸留水中に回収することで、ターゲット核酸断片試料液を調製した。

(３) プライマーの調製
プライマーは、Ｙ染色体短腕上のＳＲＹ遺伝子を特異的に認識できるように設計した塩基配列を持つ、オリゴヌクレオチドのプライマーのセット（プライマー１、プライマー２）として合成した。

＜プライマーの塩基配列＞
プライマー１：５’−ＧＡＴＣＡＧＣＡＡＧＧＡＧＣＴＧＧＧＡＴＡＣＡＣＧＴＧ−３’（配列番号１）
プライマー２：５’−ＣＴＧＴＡＧＣＴＴＣＣＣＧＴＴＧＣＧＧＴＧ−３’（配列番号２）

(４) ポリメラーゼ伸長反応によるターゲット核酸断片の増幅
以下に示す反応液の組成で、ＰＣＲによるターゲット核酸断片の増幅を実施した。ＰＣＲは、[デネイチャー：９４℃・３０秒、アニーリング：６５℃・３０秒、ポリメラーゼ伸長反応：７２℃・１分]を３０サイクル繰り返することで実施した。

＜反応液の組成＞
精製水 ３６．５μＬ
１０×ＰＣＲバッファー ５μＬ
２．５ｍＭ ｄＮＴＰ ４μＬ
Ｔａｑ ＦＰ（ニッポンジーン社製） ０．５μＬ
２０μＭ プライマー ２μＬ
３０ｎｇ／μＬターゲット核酸断片試料液 ２μＬ

(５) ピロ燐酸定量用分析素子を用いたピロ燐酸の検出
前記（４）のポリメラーゼ伸長反応によるターゲット核酸断片の増幅反応に、ターゲット核酸断片を含まない試料液を用いた場合（コントロール）、男性から採取した血液から調製したターゲット核酸試料液を用いた場合（サンプルＭ）、及び女性から採取した血液から調製したターゲット核酸試料液を用いた場合（サンプルＦ）の、各々の反応後の液１０μＬを前記（１）で製作したピロ燐酸定量用乾式分析素子上に点着し、ピロ燐酸定量用乾式分析素子を３７℃にて５分間インクベーション後、波長６５０ｎｍにて支持体側から反射濃度（ＯＤ_R）を測定しところ、コントロール、サンプルＭ、サンプルＦについて、各々０．２８７、１．１４３、及び０．２８１であった。

実施例１は、男性に特有に存在するＹ染色体短腕上のＳＲＹ遺伝子関連部位を特異的に検出できることを示している。この実施例１の結果より、ポリメラーゼ伸長反応の進行により生成するピロ燐酸を、ピロ燐酸定量用乾式分析素子を用いて検出する本発明の方法により、ターゲット核酸断片の存在を検出することが可能であることがわかる。

実施例２：ピロ燐酸定量用乾式分析素子を用いたアルデヒド脱水素酵素遺伝子（ＡＬＤＨ２遺伝子）関連部位の１塩基多型（ＳＮＰｓ）検出
(１) ターゲット核酸断片試料液の調製
予め塩基配列のシーケンシングにより、ＡＬＤＨ２遺伝子関連部位の特定の１塩基種が異なることにより、ＡＬＤＨ２活性型またはＡＬＤＨ２不活性型であることが既知である、各々１人から採取した血液検体をもとに、実施例１の（２）に記載されている方法と同様にして、ターゲット核酸断片試料液を、各々サンプルＡＬＤＨ２活性型、及びサンプルルＡＬＤＨ２不活性型として調製した。

(２) プライマーの設計
プライマーは、１２番染色体上のＡＬＤＨ２遺伝子関連部位のなかで、ＡＬＤＨ２の活性を決定する特定部分について、ＡＬＤＨ２活性型の塩基配列に特異的なプライマーとして設計した塩基配列を持つ、オリゴヌクレオチドのプライマー（プライマー１）と、前記特定部位の下流の塩基配列に特異的なプライマーとして設計した塩基配列を持つ、オリゴヌクレオチドのプライマー（プライマー２）のセットとして合成した。

＜プライマーの塩基配列＞
プライマー１：５’−ＣＡＧＧＣＡＴＡＣＡＣＴＧＡＡＧＴＧＡＡＡＡＣＴＧ−３’（配列番号３）（下線部のＧＡＡの塩基配列がＡＡＡになるとＡＬＤＨ２不活性型となる）
プライマー２：５’−ＡＧＧＴＣＣＴＧＡＡＣＴＴＣＣＡＧＣＡＧ−３’（配列番号４）

(３)ピロ燐酸定量用分析素子を用いたピロ燐酸の検出
ピロ燐酸定量用分析素子の作製は実施例１の（１）に、ポリメラーゼ伸長反応によるターゲット核酸断片の増幅（ＰＣＲ）は実施例１の（４）に、及びポリメラーゼ伸長反応を行った後の反応液のピロリン酸分析乾式分析素子を用いての測定は実施例１の（５）に記載されている方法と同様にして、反射濃度（ＯＲＲ）を測定したところ、コントロール、サンプルＡＬＤＨ２活性型、及びサンプルＡＬＤＨ２不活性型について、各々０．２５６、１．００３、及び０．２６２であった。

実施例２は、１２番染色体上のＡＬＤＨ２遺伝子関連部位のなかで、ＡＬＤＨ２の活性を決定する特定部分の塩基配列違いを特異的に検出できることを示している。この実施例２の結果より、ポリメラーゼ伸長反応の進行により生成するピロ燐酸を、ピロ燐酸定量用乾式分析素子を用いて検出する本発明の方法により、ターゲット核酸断片の塩基配列を検出することが可能であることがわかる。

実施例３：無機燐定量用乾式分析素子を用いたＹ染色体短腕上のＳＲＹ遺伝子関連部位の検出
実施例１の（１）に示されたピロ燐酸定量用乾式分析素子の作製において、表１の試薬層水溶液の組成（ａ）からピロホスファターゼを除いた以外は同様にして作製した無機燐定量用乾式分析素子を用いること、ＰＣＲ反応後の反応液１００μＬを、１０ｕｎｉｔｓのピロホスファターゼで処理（ｐＨ７．０、３７℃、１０分）した以外は、同様にして測定を行い、反射濃度（ＯＲ_R）を測定しところ、コントロール、サンプルＭ、サンプルＦについて、各々０．２６８、１．２６８、及び０．２７３であった。

実施例３より、本発明の第二の実施形態である、ポリメラーゼ伸長反応の進行により生成するピロ燐酸を、ピロホスファターゼで無機燐酸に変換後、無機燐定量用乾式分析素子を用いて検出する方法でも、特異的にターゲット核酸断片の存在を検出することが可能であることが判る。

実施例４：ピロ燐酸定量用乾式分析素子を用いたヒト全血中の緑膿菌の検出 (緑膿菌性敗血症の検査をモデルにした実験)
(１) 緑膿菌を添加したヒト全血の調製
ＬＢ培地(Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ ｍｅｄｉｕｍ)で一晩培養した緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｅｍｏｎａｓ Ｓｙｒｉｎｇａｅ）の培養液を元に、ＰＢＳによる希釈で濃度を変化させた溶液を、ＥＤＴＡ採血したヒト全血に添加することで、１ｍＬ当りそれぞれ、０、５×１０⁵、５×１０⁶、２．５×１０⁶、５×１０⁷、１×１０⁸ の菌体個数を含む６水準のヒト全血を調製した。ここで、菌体個数は分光光度計を用いて見積もった値である。

（２）ピロ燐酸定量用乾式分析素子の作製
ゼラチン下塗層が設けられている厚さ１８０μmの無色透明ポリエチレンテレフタレ−ト（ＰＥＴ）平滑フイルムシ−ト（支持体）上に表４記載の組成（ａ）の水溶液を、以下の被覆率となるように塗布し、乾燥して試薬層を設けた。

この試薬層の上に下記の表５記載の組成（ｂ）の接着層水溶液を以下の被覆率となるように塗布し、乾燥して接着層を設けた。

次いで接着層の上に３０ｇ／ｍ²の割合で水を全面に供給してゼラチン層を膨潤させ、その上に純ポリエステル製のブロ−ド織物布地をほぼ一様に軽く圧力をかけてラミネ−トして多孔性展開層を設けた。

次にこの展開層の上から下記の表６記載の組成（ｃ）の水溶液を以下の被覆率となるようにほぼ均一塗布し、乾燥させ、１３ｍｍ×１４ｍｍに裁断し、プラスチック製マウント材内に収めることで、ピロ燐酸定量用乾式分析素子を作成した。

(３）ヒト全血からの核酸の抽出、精製
上記（１）で調製した緑膿菌を添加し調製した６水準のヒト全血を試料とし、そのそれぞれから、市販の核酸抽出、精製キット（ＱＩＡＧＥＮ社製、ＱＩＡａｍｐ ＤＮＡ Ｂｌｏｏｄ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ）を用いて抽出、精製したゲノミック核酸断片を１ｍＬの精製蒸留水中に回収することで、タ−ゲット核酸断片を含む核酸試料液を調製した。

(４)ＰＣＲ増幅
上記（３）で、６水準のヒト全血試料から抽出・精製して得たタ−ゲット核酸断片を含む核酸試料液をそのまま用いて、以下の条件でＰＣＲ増幅を行った。

＜プライマ−＞
緑膿菌のゲノム核酸に特異的(ｉｃｅ ｎｕｃｌｅａｔｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ(Ｉｎａｋ)Ｎ末)な配列を持つ以下のプライマ−セットを使用した。
プライマ−(upper)；
５'-ＧＣＧＡＴＧＣＴＧＴＡＡＴＧＡＣＴＣＴＣＧＡＣＡＡＧＣ-３'（配列番号５）
プライマ−(lower)；
５'-ＧＧＴＣＴＧＣＡＡＡＴＴＣＴＧＣＧＧＣＧＴＣＧＴＣ-３'（配列番号６）

以下に示す反応液の組成で、［変性：９４℃・１分、アニ−リング：５５℃・１分、ポリメラ−ゼ伸長反応：７２℃・１分］を３０サイクル繰り返することでＰＣＲ増幅を実施した。

＜反応液の組成＞
１０×ＰＣＲバッファ− ５μＬ
２．５ｍＭ ｄＮＴＰ ４μＬ
２０μＭ プライマ−(ｕｐｐｅｒ) １μＬ
２０μＭ プライマ−(ｌｏｗｅｒ) １μＬ
Ｐｙｒｏｂｅｓｔ ０．２５μＬ
（３）で得た核酸試料液 ５μＬ
精製水 ３３．７５μＬ

(５)ピロ燐酸定量用分析素子を用いた検出
前記（４）におけるＰＣＲ増幅反応後の溶液をそのまま、上記（２）で製作したピロ燐酸定量用乾式分析素子上に各々２０μＬ点着し、ピロ燐酸定量用乾式分析素子を３７℃にて５分間インキュベ−ション後、波長６５０ｎｍにて支持体側から測定して得られた反射光学濃度（ＯＤ_R）の時間変化を図４に、５分後の反射光学濃度（ＯＤ_R）を図５に、ヒト全血中の緑膿菌個数と５分後の反射光学濃度（ＯＤ_R）の関係を図６に示した。

実施例４の結果より、緑膿菌を含むヒト全血より定法に従って得たターゲット核酸断片を含む核酸試料液を、緑膿菌のゲノム核酸に特異的な配列を持つプライマーセットを使用しＰＣＲを行い、そのＰＣＲ増幅反応後の溶液をそのままもちいて、生成したピロ燐酸を、ピロ燐酸定量用乾式分析素子を用いて反射光学濃度（ＯＤ_R）として測定することで、ヒト全血中に存在する緑膿菌の量に応じた反射光学濃度（ＯＤ_R）が得られることがわかる。

実施例５：ピロ燐酸定量用乾式分析素子を用いたアルデヒド脱水素酵素遺伝子（ＡＬＤＨ２遺伝子）関連部位の１塩基多型（ＳＮＰｓ）検出 (１塩基多型に対応する部分をプライマーの３'末端付近に設定した例)
（１）ターゲット核酸断片を含む核酸試料液の調製
予め塩基配列のシーケンシングにより、ＡＬＤＨ２遺伝子関連部位の特定の１塩基種が異なることにより、ＡＬＤＨ２活性型またはＡＬＤＨ２不活性型であることが既知である、各々１人から採取した血液試料のそれぞれから、市販の核酸抽出、精製キット（ＱＩＡＧＥＮ社製、ＱＩＡａｍｐ ＤＮＡ Ｂｌｏｏｄ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ）を用いて抽出、精製したゲノミック核酸断片を１ｍＬの精製蒸留水中に回収することで、ターゲット核酸断片を含む核酸試料液を調製した。

(２)ピロ燐酸定量用乾式分析素子の作製
実施例４に記載の方法で、ピロ燐酸定量用乾式分析素子を作成した。

(３)ＰＣＲ増幅
上記（１）で、ＡＬＤＨ２活性型またはＡＬＤＨ２不活性型それぞれのヒト全血試料から抽出・精製して得たタ−ゲット核酸断片を含む核酸試料液をそのまま用いて、以下の条件でＰＣＲ増幅を行った。

＜プライマー＞
プライマーは、１２番染色体上のＡＬＤＨ２遺伝子関連部位のなかに、共通のプライマー(ｕｐｐｅｒ)と、ＡＬＤＨ２の活性を決定する１塩基多型に対応する部分を３'末端付近に設定(lower-1とlower-2に記載のプライマー塩基配列の下線部分)した、ＡＬＤＨ２活性型および不活性型に対応する、２種のプライマ−（ｌｏｗｅｒ−１）および、プライマ−（ｌｏｗｅｒ−２）のセットを使用した。

プライマー(upper)：
５'−ＡＡＣＧＡＡＧＣＣＣＡＧＣＡＡＡＴＧＡ−３'（配列番号７）
プライマー(lower-1):
５'−ＧＧＧＣＴＧＣＡＧＧＣＡＴＡＣＡＣＡＧＡ−３'（配列番号８）
または、
プライマ−(upper)：
５'−ＡＡＣＧＡＡＧＣＣＣＡＧＣＡＡＡＴＧＡ−３'（配列番号９）
プライマ−(lower-2):
５'−ＧＧＧＣＴＧＣＡＧＧＣＡＴＡＣＡＣＡＡＡ−３'（配列番号１０）

以下に示す反応液の組成で、[変性：９４℃・２０秒、アニーリング：６０℃・３０秒、ポリメラーゼ伸長反応：７２℃・１分３０秒]を３５サイクル繰り返することでＰＣＲ増幅を実施した。

＜反応液の組成＞
１０×ＰＣＲバッファ− ５μＬ
２．５ｍＭ ｄＮＴＰ ５μＬ
５μＭ プライマ−(ｕｐｐｅｒ) ２μＬ
５μＭ プライマ−(ｌｏｗｅｒ−１または−２) ２μＬ
Ｔａｑ ０．５μＬ
（１）で得た核酸断片試料液 ０．５μＬ
精製水 ３５μＬ

（４）ピロ燐酸定量用分析素子を用いた検出
前記（３）におけるＰＣＲ増幅反応後の溶液をそのまま、上記（２）で製作したピロ燐酸定量用乾式分析素子上に各々２０μＬ点着し、ピロ燐酸定量用乾式分析素子を３７℃にて５分間インキュベーション後、波長６５０ｎｍにて支持体側から測定して得られた反射光学濃度（ＯＤ_R）の時間変化を図７に、５分後の反射光学濃度（ＯＤ_R）を図８に示した。

実施例５の結果より、共通プライマーと、ＡＬＤＨ２の活性を決定する１塩基多型に対応する部分を３'末端付近に設定した、ＡＬＤＨ２活性型および不活性型に対応する２種のプライマーそれぞれとのプライマーセットを使用しＰＣＲを行い、そのＰＣＲ増幅反応後の溶液をそのまま用いて、生成したピロリン酸量を、ピロ燐酸定量用乾式分析素子を用いて反射光学濃度（ＯＤ_R）の大小として測定し、その反射光学濃度（ＯＤ_R）の大小と使用したＡＬＤＨ２活性型および不活性型に対応する２種のプライマ−の関係により、試料のＡＬＤＨ２の活性型、すなわちアルデヒド脱水素酵素遺伝子（ＡＬＤＨ２遺伝子）関連部位の１塩基多型（ＳＮＰｓ）を検出することができることがわかる。

図１は、本発明の実施形態を説明する概念図である。 図２は、本発明のカートリッジ形態でのキットの例を示す斜視図である。 図３は、本発明のカートリッジ形態でのキットを使用する場合のシステム構成を示す斜視図である。 図４は、ヒト全血中の緑膿菌個数と反射光学濃度（ＯＤ_R）の時間変化の関係を示す。 図５は、ヒト全血中の緑膿菌個数と５分後の反射光学濃度（ＯＤ_R）の関係を示す。 図６は、ヒト全血中の緑膿菌個数と５分後の反射光学濃度（ＯＤ_R）の関係を示す。 図７は、試料のＡＬＤＨ−２の活性型／不活性型と反射光学濃度（ＯＤ_R）の時間変化の関係を示す。 図８は、試料のＡＨＤＨ−２の型／プライマー種と５分後の反射光学濃度（ＯＤ_R）の大小関係を示す。

符号の説明

１０…キット
２１…基体
２２…蓋
３１…開口部
３２…反応セル
３３…検出部
４１…細管
５１…乾式分析素子
６１…温度コントロール部
６２…温度コントロール部
７１…検出部
７２…検出部
８１…プライマー
８２…デオキシヌクレオシド３リン酸（ｄＮＴＰ）
８３…ポリメラーゼ

Claims (2)

1. 分析するターゲット核酸断片の一部と相補的な少なくとも一種のプライマー、少なくとも一種のデオキシヌクレオシド３リン酸、少なくとも一種のポリメラーゼ、及びピロ燐酸定量用乾式分析素子の各要素を含むターゲット核酸断片の分析キットであって、前記ピロ燐酸定量用乾式分析素子が、キサントシンまたはイノシン、ピロホスファターゼ、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ、キサンチンオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ及び発色剤を含有する試薬層を備えるピロ燐酸定量用乾式分析素子であることを特徴とする、ターゲット核酸断片の分析キット。
2. 分析するターゲット核酸断片の一部と相補的な少なくとも一種のプライマー、少なくとも一種のデオキシヌクレオシド３リン酸、少なくとも一種のポリメラーゼ、ピロホスファターゼ、及び無機燐定量用乾式分析素子の各要素を含むターゲット核酸断片の分析キットであって、前記無機燐定量用乾式分析素子が、キサントシンまたはイノシン、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ、キサンチンオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ及び発色剤を含有する試薬層を備える無機燐定量用乾式分析素子である、ターゲット核酸断片の分析キット。

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