JP2005249610A - ウェル中に試料を密封する方法、および試料を密封するための容器 - Google Patents
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【課題】 本発明が解決しようとする課題は、温度変化を加えた場合であっても試料をウェル内で液密に維持しかつ試料に含まれれる分子に損傷を与えることなく試料をウェル内に密封する方法、密封された試料を簡便にウェル内から取り出す方法、ならびにそのための容器を提供することである。
【解決手段】 ウェルを有する容器のウェル中に試料を導入し、ウェルの開口部を覆うことができるフィルムを被せ、容器とフィルムとの接触面に、該接触面と実質的に平行な方向の振動を有する超音波を印加することを特徴とする、試料をウェル中に密封する方法。
【選択図】 図3
【解決手段】 ウェルを有する容器のウェル中に試料を導入し、ウェルの開口部を覆うことができるフィルムを被せ、容器とフィルムとの接触面に、該接触面と実質的に平行な方向の振動を有する超音波を印加することを特徴とする、試料をウェル中に密封する方法。
【選択図】 図3
Description
本発明は、試料をウェル内に密封する方法、試料を密封後取り出す方法、試料を密封するために利用される容器、および試料が密封されてなる容器に関する。
現在、試料の反応を大量に行う場合には、1つのウェル当り数十から数百μLの容積を持つ96ウェルマイクロタイタープレートおよび384ウェルマイクロタイタープレート等に
反応試料を分注し、サーマルサイクラーで熱処理するのが一般的である。加熱する際、ウェルから液体が蒸発することを防止するためにウェルを密閉する必要があり、粘着剤の付いた可撓性を有するシートまたはフィルムでウェルの開口部を覆ったり、マイクロタイタープレートと該シートの接触部を加熱して接着(ヒートシール)したりするのが通常である。特に、DNAを変性する場合には、水の沸点に近い温度(約95℃)で加熱するため、シ
ートまたはフィルムにウェルの内側より大きな圧力がかかる。
反応試料を分注し、サーマルサイクラーで熱処理するのが一般的である。加熱する際、ウェルから液体が蒸発することを防止するためにウェルを密閉する必要があり、粘着剤の付いた可撓性を有するシートまたはフィルムでウェルの開口部を覆ったり、マイクロタイタープレートと該シートの接触部を加熱して接着(ヒートシール)したりするのが通常である。特に、DNAを変性する場合には、水の沸点に近い温度(約95℃)で加熱するため、シ
ートまたはフィルムにウェルの内側より大きな圧力がかかる。
こうした熱処理を伴うアッセイを効率的に行うために、96ウェルマイクロタイタープレートまたは384ウェルマイクロタイタープレートの材質、形状、化学的もしくは物理的特
性については、用途に応じて種々の工夫がなされてきた。例えば、特許文献1には、マイクロタイタープレートの各ウェルをシールする際、弾力圧縮性のリッジがパッドの表面に形成されている可撓性を有するパッドを、ウェルの開口部に押し当てることによって、ウェル内部を液密な状態に保持し、加熱および攪拌工程の後にパッドをウェルから剥がし易くすることを特徴とする発明が示されている。特許文献2は、各ウェルをシールする際のクロスコンタミネーションの低減を目的とした構成を開示するものである。さらに、特許文献3では、容器に形成されたウェルと類似の形状を有して各ウェルの内壁面にほぼフィットする複数の蓋がカバーに形成されており、容器にカバーを装着すると、蓋はそれぞれ対応するウェルに挿入され、容器の内壁面と蓋の外表面との間にわずかな空間を形成して検査対象となる試料をこの空間に収容すると共に、容器が傾斜あるいは振動しても試料が容易に溢れ出ることを防止し、蓋の最下端部に形成された開口を通じて試料へのアクセスを可能にしている。
性については、用途に応じて種々の工夫がなされてきた。例えば、特許文献1には、マイクロタイタープレートの各ウェルをシールする際、弾力圧縮性のリッジがパッドの表面に形成されている可撓性を有するパッドを、ウェルの開口部に押し当てることによって、ウェル内部を液密な状態に保持し、加熱および攪拌工程の後にパッドをウェルから剥がし易くすることを特徴とする発明が示されている。特許文献2は、各ウェルをシールする際のクロスコンタミネーションの低減を目的とした構成を開示するものである。さらに、特許文献3では、容器に形成されたウェルと類似の形状を有して各ウェルの内壁面にほぼフィットする複数の蓋がカバーに形成されており、容器にカバーを装着すると、蓋はそれぞれ対応するウェルに挿入され、容器の内壁面と蓋の外表面との間にわずかな空間を形成して検査対象となる試料をこの空間に収容すると共に、容器が傾斜あるいは振動しても試料が容易に溢れ出ることを防止し、蓋の最下端部に形成された開口を通じて試料へのアクセスを可能にしている。
従来使われてきたチューブまたはマイクロタイタープレートを使うと、恒温水槽中で長時間ウェル内の試料をインキュベート(熱処理)したり、沸騰させたりすることはできない。なぜなら、例えば、水が95℃で沸騰して蒸気になると、常温(25℃)時の体積の約1600倍になるため、試料を密封したウェルの内部から1600倍近くの圧力がかかることになり、ウェルの密閉性を維持することができないからである。
近年、LAMP法やICAN法などが開発され、温度サイクルをかけず、一定の温度でインキュベーションを行うことによってDNAを増幅することができるようになってきている。従っ
て、電子機器による精度の高い温度制御が必要とされなくなってきており、サーマルサイクラー等の高価な装置を使わなくてもインキュベーションが可能であり、今後恒温水槽や一定温度の乾燥機の中で、DNAの増幅が可能になると考えられる。
て、電子機器による精度の高い温度制御が必要とされなくなってきており、サーマルサイクラー等の高価な装置を使わなくてもインキュベーションが可能であり、今後恒温水槽や一定温度の乾燥機の中で、DNAの増幅が可能になると考えられる。
しかしながら、このような新しいアッセイが開発されてきているにもかかわらず、従来使用されてきたウェルの密封方法を使う限り、恒温水槽中で長時間ウェルを液密に維持することが難しいため、こういった新しいアッセイを用いた大量分析は実現していない。
これに対し、特許文献4では、ウェルを有するトレイにカバーを被せ、超音波を印加してウェルとカバーとを溶着させることにより、ウェル中に試料を密封する方法が開示され
ている。当該方法では、超音波による溶着を利用することにより、ウェルを強固に密閉することができるが、酵素などの特定の活性を有するタンパク質をウェル内に導入する場合には、印加した超音波によりタンパク質の立体構造が破壊され、その活性が失われる場合があるという問題があった。
ている。当該方法では、超音波による溶着を利用することにより、ウェルを強固に密閉することができるが、酵素などの特定の活性を有するタンパク質をウェル内に導入する場合には、印加した超音波によりタンパク質の立体構造が破壊され、その活性が失われる場合があるという問題があった。
本発明が解決しようとする課題は、温度変化を加えた場合であっても試料をウェル内で液密に維持しかつ試料に含まれる分子に損傷を与えることなく試料をウェル内に密封する方法、密封された試料を簡便にウェル内から取り出す方法、ならびにそのための容器を提供することである。
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討を行った結果、容器のウェルに試料を導入し、ウェル開口部にフィルムを被せ、フィルムと容器との接触面に、横方向の振動を有する超音波を印加することによって、ウェル中の試料を破壊することなく試料をウェル中に密封できることを見いだし、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は以下の発明を包含する。
(1)ウェルを有する容器のウェル中に試料を導入し、ウェルの開口部を覆うことができるフィルムを被せ、容器とフィルムとの接触面に、該接触面と実質的に平行な方向の振動を有する超音波を印加することを特徴とする、試料をウェル中に密封する方法。
(2)試料がタンパク質を含むものである、(1)に記載の方法。
(3)超音波が金属からなるホーンによって印加される、(1)または(2)に記載の方法。
(4)フィルムがイージーピール性を有するフィルムである、(1)〜(3)のいずれかに記載の方法。
(5)(1)〜(4)のいずれかに記載の方法によって試料をウェル中に密封した後に、ウェルまたはフィルムの一部を剥がすことにより、ウェル内部の試料を取り出すことを特徴とする試料の密封および取り出し方法。
(6)(1)〜(4)のいずれかに記載の方法によって試料がウェル中に密封されてなる容器。
(7)ウェルを有する容器であって、ウェル開口部を囲む平坦な隆起部を有することを特徴とする該容器。
(8)ウェル中にタンパク質を含む試料を導入し、ウェルの開口部をフィルムで覆い、隆起部とフィルムとの接触面に、該接触面と実質的に平行な方向の振動を有する超音波を印加してウェル中に試料を密封するための容器である旨の指示書を伴っている(7)に記載の容器。
(1)ウェルを有する容器のウェル中に試料を導入し、ウェルの開口部を覆うことができるフィルムを被せ、容器とフィルムとの接触面に、該接触面と実質的に平行な方向の振動を有する超音波を印加することを特徴とする、試料をウェル中に密封する方法。
(2)試料がタンパク質を含むものである、(1)に記載の方法。
(3)超音波が金属からなるホーンによって印加される、(1)または(2)に記載の方法。
(4)フィルムがイージーピール性を有するフィルムである、(1)〜(3)のいずれかに記載の方法。
(5)(1)〜(4)のいずれかに記載の方法によって試料をウェル中に密封した後に、ウェルまたはフィルムの一部を剥がすことにより、ウェル内部の試料を取り出すことを特徴とする試料の密封および取り出し方法。
(6)(1)〜(4)のいずれかに記載の方法によって試料がウェル中に密封されてなる容器。
(7)ウェルを有する容器であって、ウェル開口部を囲む平坦な隆起部を有することを特徴とする該容器。
(8)ウェル中にタンパク質を含む試料を導入し、ウェルの開口部をフィルムで覆い、隆起部とフィルムとの接触面に、該接触面と実質的に平行な方向の振動を有する超音波を印加してウェル中に試料を密封するための容器である旨の指示書を伴っている(7)に記載の容器。
本発明により、ウェルを強固かつ完全に密閉することができるため、ウェル内の試料を、加熱器等を使わずに水槽中でインキュベート(熱処理)することが可能である。従って、安価かつ高速な処理が可能となる。
また、試料中の分子を損傷することなくウェル中に密封することができるので、酵素な
どの生体活性分子を、活性を維持したまま密封することができる。
どの生体活性分子を、活性を維持したまま密封することができる。
本発明の密封方法では、ウェルを有する容器を用い、該ウェル中に試料を導入し、密封する。本発明においてウェルとは、容器における試料を受け入れることができる窪みと開口部とを有する構造部分を意味する。本発明においてウェルを有する容器は、マイクロタイタープレートなどのように複数配列されているもの、およびチューブのように個別に構成されているものの双方を包含する。
例えば、従来の96ウェルマイクロタイタープレートは、96個の独立したウェルがプラスチック容器の表面に、縦横の間隔が9.0 mmになるように形成されている。ここで「独立した」とは、別々のウェルに入っている液体が混合することなく、完全に分離されている状態を指す。
本発明の密封方法では、上記のウェルに試料を導入し、ウェル開口部の上方からフィルムを被せて押し付け、フィルムと容器との接触面に超音波を印加することにより、容器とフィルムとを溶着し、ウェルを密閉する。容器とフィルムを超音波によって溶着することによって、容器全体の温度を上昇させることなく、溶着部分のみを局所的に昇温させて数秒以内で液密な接合を実現できるため、作業性および生産性が向上する。
本発明の一実施形態において、試料を導入するためのウェルを有する容器は、ウェルの開口部の周囲にこれを囲むように形成される隆起部を有する。隆起部とは、容器のウェル開口部が存在する面において、その他の部分よりも隆起している部分を意味する。隆起部自体がウェル開口部を形成する場合もある。隆起部を有することにより、容器とフィルムの密着性を容易に確保できるので微量な溶液の封入に好適である。また、容器とフィルムを超音波振動によって溶着させる際に、超音波振動が当該隆起部に集中し、容易に溶着することができるので好適である。このことは特に、ウェルに導入された試料にDNAやタン
パク質などの生体分子が含まれる場合、これらの分子に損傷を与えることなく溶着を行うことが可能になるために好適である。さらに、容器にフィルムを取り付けて密閉する際に、マイクロウェルから液があふれることがあっても、上記隆起部によって、あふれた液が隣接するマイクロウェルの内部に混入してクロスコンタミネーションが起きることが防止される。
パク質などの生体分子が含まれる場合、これらの分子に損傷を与えることなく溶着を行うことが可能になるために好適である。さらに、容器にフィルムを取り付けて密閉する際に、マイクロウェルから液があふれることがあっても、上記隆起部によって、あふれた液が隣接するマイクロウェルの内部に混入してクロスコンタミネーションが起きることが防止される。
上記隆起部は平坦であることが好ましい。平坦とは、該隆起部がフィルムと面で接触することが可能な平面を有することを意味する。該平面は、試料をウェルに導入した容器を超音波溶着装置に設置したときに、実質的に水平になるような面であることが好ましい。隆起部の平面部分にフィルムが接着されることにより、フィルムと隆起部とが広い面積にわたって接触するため、超音波を効果的に印加できるとともに、フィルムと隆起部とが広い面積で溶着するため、高度の密閉性が達成される。また、隆起部が平坦であることにより、該隆起部とフィルムが広い面積にわたって接触するため、該隆起部を覆うフィルムに対するホーンの位置決めも容易になる。
隆起部の大きさや平面の面積等は、特に制限されないが、容器をウェル開口部側から見たときの、開口部の面積に対する隆起部の平坦な面の面積の比は、通常0.1〜10、好まし
くは0.5〜5、より好ましくは0.8〜3となるように形成する。開口部の面積は、通常0.03〜4.0cm2、好ましくは0.05〜0.6cm2、より好ましくは0.1〜0.4cm2であり、隆起部の平坦な
面の面積は、通常0.03〜5.0cm2、好ましくは0.05〜1.0cm2、より好ましくは0.2〜0.5cm2
である。
くは0.5〜5、より好ましくは0.8〜3となるように形成する。開口部の面積は、通常0.03〜4.0cm2、好ましくは0.05〜0.6cm2、より好ましくは0.1〜0.4cm2であり、隆起部の平坦な
面の面積は、通常0.03〜5.0cm2、好ましくは0.05〜1.0cm2、より好ましくは0.2〜0.5cm2
である。
また、隆起部の高さは、ウェルの深さに対して、通常0.001〜1.0、好ましくは0.005〜0
.5、より好ましくは0.01〜0.1である。
.5、より好ましくは0.01〜0.1である。
マイクロタイタープレートのように容器が複数のウェルを有する場合、容器あたりのウェルの個数は、通常2〜24576個、好ましくは6〜6144個、より好ましくは24〜1536個であ
る。容器の形状としては、板状の基板に複数のウェルが整列して設けられているものが好ましく、その場合の基板の大きさは特に制限されないが、通常12.5cm×8.5cm程度である
。
る。容器の形状としては、板状の基板に複数のウェルが整列して設けられているものが好ましく、その場合の基板の大きさは特に制限されないが、通常12.5cm×8.5cm程度である
。
ウェルの垂直断面形状は、液体を分注するスポッティング装置のニードル(針)を入れ易くするため、すり鉢状の形状になっていることが好ましい。しかし、高密度にウェルを配置する際(例えば9600ウェル)には、すり鉢状にするだけのスペースが確保できない場合もあるので、断面形状は台形や長方形でもよい。従って、ウェルの密度とニードルのサイズおよび形状によって、三角形、四角形などの多角形や半円形など、最適な断面形状を決めることができる。
ウェル開口部の外形は、密閉できる構造になっていれば特に限定されず、円形、四角形および三角形などの多角形やその他の形状でもよい。超音波のエネルギーが均等に印加されるため、ウェル開口部は円形であることが好ましい。
さらに、該隆起部の裏側も平坦な構造を有することが好ましい。隆起部裏側とは、容器におけるウェル開口部および隆起部が存在する面と反対側の面における、隆起部の底部に対応する部分を意味する(例えば図1(b)参照)。ここで、平坦とは、平面状の構造を有
することを意味する。
することを意味する。
隆起部裏側が平坦であることにより、隆起部の裏面をアルミニウム等でつくられた固い治具でその平坦部を確実に支えることができ、ホーンから伝えられる超音波の振動エネルギーを隆起部に集中的に印加することが可能である。仮に隆起部の裏面が平坦でない場合、ホーンから隆起部に伝えられる振動エネルギーが逃げてしまい、隆起部上で接触しているフィルムと隆起部が溶着しにくくなる場合もある。
この実施形態において超音波のエネルギーを集中させるための隆起部は容器の表面に形成されているが、フィルムの表面に隆起部が設けられていても同様の効果が期待できる。その場合、フィルム表面の隆起部は、フィルムを容器に被せたときにウェル開口部を囲むように形成される。
本発明のウェルを有する容器は、一般的な射出成形の方法で形成することができる。ウェルおよびフィルム材料としては、耐熱性を有しかつ超音波溶着可能な高分子化合物を用いることが好ましい。このような高分子化合物としては、耐薬品性、耐熱性に優れたポリカーボネート(PC)、ポリプロピレン(PP)、ポリスチレン、メチルペンテンコポリマー(TPX)などのプラスチック材料が挙げられる。特に紫外、可視、赤外光領域など、利用
する波長領域で光の透明性の高いメチルペンテンコポリマーやポリカーボネートが適しているが、ポリカーボネートは材料費がポリプロピレンの4倍近くになる。メチルペンテンコポリマーはポリカーボネートと比較すると柔らかく材料費も高いが、樹脂の流動性が良いため、射出成形の際、肉厚の薄い成形品を作りやすいという長所を有している。従って、求められる特性とコストに応じて、材料と構造を選択することが重要である。本発明においては、ポリプロピレンを用いるのが特に好ましい。
する波長領域で光の透明性の高いメチルペンテンコポリマーやポリカーボネートが適しているが、ポリカーボネートは材料費がポリプロピレンの4倍近くになる。メチルペンテンコポリマーはポリカーボネートと比較すると柔らかく材料費も高いが、樹脂の流動性が良いため、射出成形の際、肉厚の薄い成形品を作りやすいという長所を有している。従って、求められる特性とコストに応じて、材料と構造を選択することが重要である。本発明においては、ポリプロピレンを用いるのが特に好ましい。
容器は、全体の反りの小さいものを用いるのが好ましい。反りを小さくすることにより、フィルムとの溶接が容易になり、液体の密閉性を高度に維持できる。
ウェルを覆うフィルムは、単一の材料からなるものでも良いし、イージーピール性(易開封性)を有するフィルムのように、シーラー層とラミネート層からなるものを使っても良い。イージーピール性とは、内容物を密閉することができ、かつ、容易に開封可能なフィルムの性質を言い、その構造には、界面剥離、層間剥離、凝集剥離の3種類の方法があり、容器形状、内容物、シール条件などによって使いわけることになる。
フィルムの厚さは、接触面に平行に印加される超音波振動によって溶着される薄さであれば特に限定されないが、好ましくは0.005 mm〜0.2 mm、より好ましくは0.01mm〜0.1 mmである。
本発明では、容器とフィルムとの接触面、好ましくは開口部周囲の隆起部とフィルムとの接触面に、該接触面と実質的に平行な方向の振動を有する超音波を印加することにより、容器とフィルムとを溶着させる。接触面と実質的に平行な方向の振動(横振動と称する場合もある)を有するとは、超音波の振動方向と、該接触面とのなす角度が、通常-30〜+30°、好ましくは-10〜+10°、より好ましくは0°であることを意味する。
このような横振動を有する超音波を印加することにより、ウェル内に導入された分子にほとんど損傷を与えることなく、試料をウェル中に密封することができる。タンパク質を密封する場合、横振動とは逆の縦振動を有する超音波を印加すると、タンパク質の立体構造が破壊されることがある。そのため、酵素などの場合は、立体構造の変化により酵素活性が失われる場合もある。これに対し、本発明の方法は、酵素などの生体分子の活性を保持したまま、ウェル中に密封することができる。従って、生体分子の活性を維持したままウェル内で反応を行う必要がある場合、生体分子の活性について分析する場合などに特に有利である。
印加する超音波の周波数は、特に制限されないが、通常5〜1000kHz、好ましくは10〜100kHz、より好ましくは15〜40kHzである。超音波を印加する時間は、通常0.1〜10秒、好ましくは0.2〜4秒、より好ましくは0.5〜2秒である。フィルムを容器に押しつけて超音波を印加するときの圧力は、通常1〜5000kPa、好ましくは50〜1000kPa、より好ましくは100〜500kPaである。
超音波を印加するためのホーンは、特に限定されないが、金属製のものが好ましく、例えば、チタン合金、アルミニウム合金、ジュラルミン、モネル、スティール等を使用することができる。
本発明の方法では、試料は、超音波溶着によりウェルごとに液密に密閉されていることから、たとえウェル内部の試料が沸騰する温度に加熱されようとも十分に密閉性を維持することができ、ウェル内の試料が、ウェル外部に蒸発する危険性はない。すなわち、DNAを変性させるために90〜100℃にマイクロタイタープレートを水槽中で加熱しても、ウェルの密閉性を維持することが可能である。このような完全な密閉が可能になるのは、マイクロタイタープレートを構成するウェルの一部とフィルムの一部を摩擦熱により溶かして溶着するからである。そのため、溶着された各ウェルの密閉性、すなわち、各ウェルの機械的な密閉強さは、マイクロタイタープレートの材料であるプラスチックそのものの機械的な強さと同等となる。この結果、従来実施されてきた粘着剤による密閉の強さとは比較にならないほど強力な密閉が、超音波溶着により実現できる。
以上のことから、本発明の容器を用いれば、ウェル内の試料を、サーマルサイクラー等の専用の加熱器を使わずに、水槽中でインキュベート(熱処理)することが可能である。また、何千枚ものマイクロタイタープレートを、たとえば、恒温水槽中に入れて、同時に大量に熱処理することができ、加熱器を何千台も備える必要なく、安価かつ高速に処理す
ることが可能となる。
ることが可能となる。
本発明の方法においては、容器とフィルムを超音波によって溶着する前に、予め容器とフィルムを簡単に接着させてもよい。それによって、ウェルとフィルムの位置決めを行うことができる。その際に使用する接着方法としては、プラスチック材料どうしの接着に一般的に用いられる方法を使用することができる。具体的には、溶接、溶剤、接着剤による方法がある。溶接は、プラスチックなどを加熱溶融させて接着する方法で、外部加熱式(ガスポットジェット、ヒートシール、赤外線、レーザー、インパルスシール法など)と内部加熱式(高周波ウェルダー、ミシン、マイクロ波など)がある。また振動により溶着する振動溶着法も溶接に含まれる。すなわち、本発明の密封方法においては、超音波溶着とその他の接着法を併用することができる。
本発明において、ウェル内に充填する試料は特に限定されないが、本発明は、特に、大量の分析が必要とされ、分析に際して温度変化や長時間の加熱にさらされるような試料の分析に好適に使用される。そのような試料としては、生体由来の物質を含む試料が挙げられる。具体的には、核酸、例えばDNAおよびRNA、ならびにタンパク質、例えば酵素等が挙げられる。
本発明の方法により、ウェル内に酵素を導入してフィルムを被せ、横振動の超音波を印加溶着しても、ウェル内の酵素の活性が失われないことが明らかとなった。そのため、酵素の活性を維持した状態で酵素と基質との結合および反応等を分析することが可能になり、非常に有利である。従って、本発明の密封方法は、タンパク質、特に、酵素の密封に好適である。本発明の密封方法の対象となる好適な酵素としては、例えば、T4 DNAポリメラーゼ、Taq DNAポリメラーゼ等が挙げられる。本発明の密封方法は、特に、T4 DNAポリメラーゼの密封に好適に使用される。
以下に本発明の好適な実施形態を、図面を参照しつつ説明する。
図1は本発明の一態様における、ウェル周囲の垂直断面形状の例を示す。図1では、ウェル周囲に溶着用の平坦な隆起部が形成されている。ここで、ウェル周囲には、フィルムを押し付け、ホーンで溶着するための十分な幅の平坦部が形成されている。
図1は本発明の一態様における、ウェル周囲の垂直断面形状の例を示す。図1では、ウェル周囲に溶着用の平坦な隆起部が形成されている。ここで、ウェル周囲には、フィルムを押し付け、ホーンで溶着するための十分な幅の平坦部が形成されている。
このような態様において、ウェル深さは、通常2〜40mm、好ましくは15〜25mmであり、ウェル深さを1としたときの溶着用隆起部の外径は、通常0.1〜0.7、好ましくは0.3〜0.5であり、溶着用隆起部内径及びウェル開口部の直径は、通常0.05〜0.50、好ましくは0.15〜0.35であり、隆起部の高さは通常0.005〜0.5、好ましくは0.01〜0.1である。
図2には、図1のマイクロタイタープレートを用いた場合の液体の分注、溶着による密閉、フィルムの引き剥がしによる液体の取り出しの工程を示す。
以下に本発明の実施例を示し、さらに詳細に説明を行うが、本発明の範囲はこれらに限定されるものではない。
実施例
マイクロタイタープレートのウェルに酵素を導入し、超音波装置により、周波数20kHz
の超音波を、溶着用隆起部とフィルムとの接触面に、振動方向が該接触面と平行になるように印加し、酵素活性に与える影響を検証した。
マイクロタイタープレートのウェルに酵素を導入し、超音波装置により、周波数20kHz
の超音波を、溶着用隆起部とフィルムとの接触面に、振動方向が該接触面と平行になるように印加し、酵素活性に与える影響を検証した。
実験:
図1に表される形状のウェルを有する96穴マイクロタイタープレートは、金型を加工し
、ポリプロピレン(PP)をその金型で射出成形することにより作製した。フィルムのサイズは、81 mm×123 mm×0.03 mm、マイクロタイタープレートのサイズは81mm×123 mmである。マイクロタイタープレートの表面に断面が図1(b)のような形状のウェルを96個形
成し、その大きさは、開口部の直径5.5 mm、底面部の直径2.2 mm、深さ20 mm、また隆起
部の高さは1.0 mm、内径を5.5 mm、外径を7.5 mmとした。マイクロタイタープレートのウェルにDNAと酵素を入れ、フィルムで覆い溶着用隆起部とフィルムとの接触面に平行な方
向の振動を有する超音波を印加して溶着し(図3参照)、密閉を行った。印加した超音波の条件は、周波数20kHz、発振時間2.0sec、圧力300kPaであった。溶着時には本発明のマ
イクロタイタープレート8ウェル×12列が同時に処理できるホーンを使用した。2種類の
酵素(T4 DNAポリメラーゼ、Taq DNAポリメラーゼ(ホットスタート法))について以下
のように実験を行った。
図1に表される形状のウェルを有する96穴マイクロタイタープレートは、金型を加工し
、ポリプロピレン(PP)をその金型で射出成形することにより作製した。フィルムのサイズは、81 mm×123 mm×0.03 mm、マイクロタイタープレートのサイズは81mm×123 mmである。マイクロタイタープレートの表面に断面が図1(b)のような形状のウェルを96個形
成し、その大きさは、開口部の直径5.5 mm、底面部の直径2.2 mm、深さ20 mm、また隆起
部の高さは1.0 mm、内径を5.5 mm、外径を7.5 mmとした。マイクロタイタープレートのウェルにDNAと酵素を入れ、フィルムで覆い溶着用隆起部とフィルムとの接触面に平行な方
向の振動を有する超音波を印加して溶着し(図3参照)、密閉を行った。印加した超音波の条件は、周波数20kHz、発振時間2.0sec、圧力300kPaであった。溶着時には本発明のマ
イクロタイタープレート8ウェル×12列が同時に処理できるホーンを使用した。2種類の
酵素(T4 DNAポリメラーゼ、Taq DNAポリメラーゼ(ホットスタート法))について以下
のように実験を行った。
(実施例1) T4 DNAポリメラーゼ
接触面と平行な方向の振動を有する超音波による溶着がT4 DNAポリメラーゼの活性に与える影響を評価した。T4 DNAポリメラーゼの活性測定は以下の手順によった。60merと20merからなる3’末端40mer突出二本鎖DNA 4pmolに、1Unitから1/4倍ずつ1/64 Unitまで連続希釈したT4 DNAポリメラーゼを加えて反応液量を10μlとし、37℃で15分間反応させた後、1% SDS2μl添加して反応を停止させた。1〜1/64Uの結果を図4、各レーンの内容を表1に示す。コントロールがほぼ失活している1/16Uでも超音波溶着処理では若干の活性を示
しているが、これは反応時間の誤差によるものである。この結果から接触面に平行な方向の振動を有する超音波がT4 DNAポリメラーゼにダメージを与えないことは明らかである。
接触面と平行な方向の振動を有する超音波による溶着がT4 DNAポリメラーゼの活性に与える影響を評価した。T4 DNAポリメラーゼの活性測定は以下の手順によった。60merと20merからなる3’末端40mer突出二本鎖DNA 4pmolに、1Unitから1/4倍ずつ1/64 Unitまで連続希釈したT4 DNAポリメラーゼを加えて反応液量を10μlとし、37℃で15分間反応させた後、1% SDS2μl添加して反応を停止させた。1〜1/64Uの結果を図4、各レーンの内容を表1に示す。コントロールがほぼ失活している1/16Uでも超音波溶着処理では若干の活性を示
しているが、これは反応時間の誤差によるものである。この結果から接触面に平行な方向の振動を有する超音波がT4 DNAポリメラーゼにダメージを与えないことは明らかである。
(実施例2)Taq DNAポリメラーゼ(ホットスタート法)
接触面と平行な方向の振動を有する超音波がTaq DNAポリメラーゼの活性に与える影響
を評価した。Taq DNAポリメラーゼの活性測定はPCRによった。PCR条件は反応溶液が20μlになるように、テンプレートDNAヒトゲノム約10ng、2本のプライマー(408bpをターゲット領域)0.5μMずつを混合して行った。ポリメラーゼには抗Taq抗体と結合したものを用いてホットスタート法をとった。酵素量は500、350、245、172mUとした。PCRプログラムは94℃にて5分間加熱した後、94℃、30sec/ 54℃、30sec / 72℃、30secを25サイクル行い、最後に72℃で5分間インキュベーションした。500〜172mUの結果を図5、各レーンの内
容を表1に示す。350mU以上と172mU以下でどの処理でも差は認められず、245mUにて多少
のばらつきはあるもののいずれの処理でも差は誤差の範囲内である。よって接触面に平行な方向の振動を有する超音波による溶着はTaq DNAポリメラーゼにダメージを与えないこ
とが明らかである。
接触面と平行な方向の振動を有する超音波がTaq DNAポリメラーゼの活性に与える影響
を評価した。Taq DNAポリメラーゼの活性測定はPCRによった。PCR条件は反応溶液が20μlになるように、テンプレートDNAヒトゲノム約10ng、2本のプライマー(408bpをターゲット領域)0.5μMずつを混合して行った。ポリメラーゼには抗Taq抗体と結合したものを用いてホットスタート法をとった。酵素量は500、350、245、172mUとした。PCRプログラムは94℃にて5分間加熱した後、94℃、30sec/ 54℃、30sec / 72℃、30secを25サイクル行い、最後に72℃で5分間インキュベーションした。500〜172mUの結果を図5、各レーンの内
容を表1に示す。350mU以上と172mU以下でどの処理でも差は認められず、245mUにて多少
のばらつきはあるもののいずれの処理でも差は誤差の範囲内である。よって接触面に平行な方向の振動を有する超音波による溶着はTaq DNAポリメラーゼにダメージを与えないこ
とが明らかである。
比較例
マイクロタイタープレートのウェルに酵素を導入し、超音波装置により、周波数20kHz
の超音波を、溶着用隆起部とフィルムとの接触面に、振動方向が該接触面と垂直になるように印加し、酵素活性に与える影響を検証した。
マイクロタイタープレートのウェルに酵素を導入し、超音波装置により、周波数20kHz
の超音波を、溶着用隆起部とフィルムとの接触面に、振動方向が該接触面と垂直になるように印加し、酵素活性に与える影響を検証した。
実験:
図1に表される形状のウェルを有する96穴マイクロタイタープレートは、金型を加工し、ポリプロピレン(PP)をその金型で射出成形することにより作製した。フィルムのサイズは、81mm×123 mm×0.03 mm、マイクロタイタープレートのサイズは81 mm×123 mmである。マイクロタイタープレートの表面に断面が図1のような形状のウェルを96個形成し、その大きさは、開口部の直径5.5 mm、底面部の直径2.2 mm、深さ20mm、また隆起部の
高さは1.0 mm、内径を5.5 mm、外径を7.5 mmとした。マイクロタイタープレートのウェルにDNAと酵素を入れ、イージーピールフィルムで覆い超音波により溶着用隆起部とフィル
ムとの接触面に、該接触面と垂直な方向の振動を有する超音波を印加して溶着し、密閉を行った。印加した超音波の条件は、周波数20kHz、溶着深度0.06mm、設定時間0.3sec、発
振時間0.13sec、圧力195kPa、発振開始圧力44Nであった。溶着時には本発明のマイクロタイタープレート8ウェル×12列が同時に処理できるホーンを使用した。2種類の酵素(T4
DNAポリメラーゼ、Taq DNAポリメラーゼ(ホットスタート法))について以下のように実験を行った。
図1に表される形状のウェルを有する96穴マイクロタイタープレートは、金型を加工し、ポリプロピレン(PP)をその金型で射出成形することにより作製した。フィルムのサイズは、81mm×123 mm×0.03 mm、マイクロタイタープレートのサイズは81 mm×123 mmである。マイクロタイタープレートの表面に断面が図1のような形状のウェルを96個形成し、その大きさは、開口部の直径5.5 mm、底面部の直径2.2 mm、深さ20mm、また隆起部の
高さは1.0 mm、内径を5.5 mm、外径を7.5 mmとした。マイクロタイタープレートのウェルにDNAと酵素を入れ、イージーピールフィルムで覆い超音波により溶着用隆起部とフィル
ムとの接触面に、該接触面と垂直な方向の振動を有する超音波を印加して溶着し、密閉を行った。印加した超音波の条件は、周波数20kHz、溶着深度0.06mm、設定時間0.3sec、発
振時間0.13sec、圧力195kPa、発振開始圧力44Nであった。溶着時には本発明のマイクロタイタープレート8ウェル×12列が同時に処理できるホーンを使用した。2種類の酵素(T4
DNAポリメラーゼ、Taq DNAポリメラーゼ(ホットスタート法))について以下のように実験を行った。
(比較例1)T4 DNAポリメラーゼ
60merと20merからなる3’末端突出二本鎖DNA 4 pmolに、1 Unitから1/4倍ずつ1/64Unitまで連続希釈したT4 DNAポリメラーゼを加え、表2の3つの条件で密閉、培養および取り出しを行った。
60merと20merからなる3’末端突出二本鎖DNA 4 pmolに、1 Unitから1/4倍ずつ1/64Unitまで連続希釈したT4 DNAポリメラーゼを加え、表2の3つの条件で密閉、培養および取り出しを行った。
反応試料の入った各ウェルは、サーマルサイクラーまたは恒温水槽にて、37℃で15分間反応させた後、95℃で5分間インキュベートし反応を停止させた。停止させた後、電気泳
動によりDNAの断片の長さを分析した。図7(a)の各図は、ポリメラーゼの量がそれぞれ1Unit(レーン1-6)と1/4Unit(レーン7-12)の場合、図7(b)の各図が、ポリメラーゼの量が1/16Unit(レーン1-6)と1/64Unit(レーン7-12)の場合の電気泳動の結果である。レ
ーン1、2、7、8が超音波の振動を加えていないコントロールの試料、レーン3、4、9、10
が超音波溶着を行った試料、レーン5、6、11、12が超音波溶着後ボルテックス処理を行った試料、レーンMは20bpラダーDNAを表す。
動によりDNAの断片の長さを分析した。図7(a)の各図は、ポリメラーゼの量がそれぞれ1Unit(レーン1-6)と1/4Unit(レーン7-12)の場合、図7(b)の各図が、ポリメラーゼの量が1/16Unit(レーン1-6)と1/64Unit(レーン7-12)の場合の電気泳動の結果である。レ
ーン1、2、7、8が超音波の振動を加えていないコントロールの試料、レーン3、4、9、10
が超音波溶着を行った試料、レーン5、6、11、12が超音波溶着後ボルテックス処理を行った試料、レーンMは20bpラダーDNAを表す。
図7から明らかなように、超音波振動を加えていない試料と比較して超音波溶着を施した試料は、1Unit および1/4Unitの場合には問題がないが、1/16Unitと1/64Unitの際、ボルテックスを行った場合と同程度に活性が低下している(約75%の低下)。この結果から、1/4 Unitを下回る濃度の場合には接触面に垂直な振動を有する超音波を印加すること
により、酵素の活性が低下することが明らかとなった。
により、酵素の活性が低下することが明らかとなった。
(比較例2)Taq DNAポリメラーゼ(ホットスタート法)
ヒトゲノムDNA 約10ngをテンプレートとし、408bpをターゲット領域としてPCRを行った。Taq DNAポリメラーゼの量は500mU、350mU、245mUおよび172mUで、(比較例1)と同じように表2の3つの条件で密閉、培養および取り出しを行った。
ヒトゲノムDNA 約10ngをテンプレートとし、408bpをターゲット領域としてPCRを行った。Taq DNAポリメラーゼの量は500mU、350mU、245mUおよび172mUで、(比較例1)と同じように表2の3つの条件で密閉、培養および取り出しを行った。
PCRプログラムは、抗Taq抗体と結合したTaq DNAポリメラーゼを用いて、以下のように
実施した:94℃で5分加熱後、94℃で30秒/54℃で30秒/72℃で30秒を25サイクル行い、72
℃で5分間インキュベーションを行った。図8(a)に示すのはポリメラーゼの量が500mU(
レーン1-6)と350mU(レーン7-12)の場合、図8(b)に示すのは、245mU(レーン1-6)と172mU(レーン7-12)の場合の結果である。レーン1、2、7、8がコントロール試料、レーン3、4、9、10が超音波溶着により密閉した試料、レーン5、6、11、12が超音波溶着後ボル
テックス処理した試料、レーンMは200bpラダーDNAである。
実施した:94℃で5分加熱後、94℃で30秒/54℃で30秒/72℃で30秒を25サイクル行い、72
℃で5分間インキュベーションを行った。図8(a)に示すのはポリメラーゼの量が500mU(
レーン1-6)と350mU(レーン7-12)の場合、図8(b)に示すのは、245mU(レーン1-6)と172mU(レーン7-12)の場合の結果である。レーン1、2、7、8がコントロール試料、レーン3、4、9、10が超音波溶着により密閉した試料、レーン5、6、11、12が超音波溶着後ボル
テックス処理した試料、レーンMは200bpラダーDNAである。
コントロール試料と比較して、垂直方向の振動を有する超音波を印加した試料は、500m
Unitおよび350m Unitの場合には問題がない。しかしながら、それ以下の濃度では、ボルテックス処理を施した試料ほどではないが活性の低下が見られる(30%の活性低下)。
Unitおよび350m Unitの場合には問題がない。しかしながら、それ以下の濃度では、ボルテックス処理を施した試料ほどではないが活性の低下が見られる(30%の活性低下)。
以上の実施例及び比較例から、溶着用隆起部とフィルムの接触面に、該接触面と垂直な方向の振動を有する超音波を印加すると、ウェル内部の酵素の活性の低下が生じるが、該接触面と平行な方向の振動を有する超音波を印加した場合には、酵素の活性が維持されることが示された。
ここでは、マイクロタイタープレートを利用した場合の実施例を示したが、チューブの場合は、96穴のマイクロタイタープレートの1穴のウェルに該当し、上記内容がそのままチューブを使った密閉、培養および取り出し方法に当てはまることは自明である。
本発明の密閉および取り出し方法は、超音波によってフィルムをウェルに簡便かつ強固に溶着することができるため、粘着剤の付着したフィルムを手動で貼付けるよりも量産性および再現性に優れている。特に、水槽中で大量のマイクロタイタープレートを一度にインキュベートするような大量処理に向いているといえる。そして、このような処理方法は、高価で、処理枚数の少ないサーマルサイクラーを使うよりも生産性が高いことから、非常に有利である。
本発明は、DNAやタンパク質などの生体分子の分析に有用なハイスループットスクリー
ニング技術に利用することができる。
ニング技術に利用することができる。
Claims (8)
- ウェルを有する容器のウェル中に試料を導入し、ウェルの開口部を覆うことができるフィルムを被せ、容器とフィルムとの接触面に、該接触面と実質的に平行な方向の振動を有する超音波を印加することを特徴とする、試料をウェル中に密封する方法。
- 試料がタンパク質を含むものである、請求項1に記載の方法。
- 超音波が金属からなるホーンによって印加される、請求項1または2に記載の方法。
- フィルムがイージーピール性を有するフィルムである、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- 請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法によって試料をウェル中に密封した後に、ウェルまたはフィルムの一部を剥がすことにより、ウェル内部の試料を取り出すことを特徴とする試料の密封および取り出し方法。
- 請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法によって試料がウェル中に密封されてなる容器。
- ウェルを有する容器であって、ウェル開口部を囲む平坦な隆起部を有することを特徴とする該容器。
- ウェル中にタンパク質を含む試料を導入し、ウェルの開口部をフィルムで覆い、隆起部とフィルムとの接触面に、該接触面と実質的に平行な方向の振動を有する超音波を印加してウェル中に試料を密封するための容器である旨の指示書を伴っている請求項7に記載の容器。
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JP2004061231A JP2005249610A (ja) | 2004-03-04 | 2004-03-04 | ウェル中に試料を密封する方法、および試料を密封するための容器 |
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- 2004-03-04 JP JP2004061231A patent/JP2005249610A/ja active Pending
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