KR100930974B1 - 레티놀 결합 단백질(ｒｂｐ4)에 특이적으로 결합하는ｄｎａ 앱타머 및 그 제조방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 RBP4(Retinol Binding Protein 4)에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머에 관한 것으로, 더욱 구체적으로 랜덤 DNA 라이브러리로부터 선택된 RBP4에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머 및 그 제조방법에 관한 것이다.
본 발명에 따르면, 랜덤 DNA pool로부터 제 2형 당뇨병의 바이오마커인 RBP4에 대해 특이적으로 높은 친화도를 보이는 DNA 앱타머를 SELEX process의 변형된 방법인 FluMag-SELEX process를 이용하여 선별하고, 선별된 DNA 앱타머들의 염기서열, 특성 및 RBP4에 대한 결합력을 분석하였다. 따라서 본 발명의 DNA 앱타머를 이용하여 제 2형 당뇨병을 보다 효과적으로 진단할 수 있다.
RBP4, DNA 앱타머, 제 2형 당뇨병, 바이오마커, 친화도, SELEX

Description

레티놀 결합 단백질(ＲＢＰ4)에 특이적으로 결합하는 ＤＮＡ 앱타머 및 그 제조방법 {DNA aptamer binding to Retinol Binding Protein 4 with specificity and production method thereof}
본 발명은 RBP4(Retinol Binding Protein 4)에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머에 관한 것으로, 더욱 구체적으로 랜덤 DNA 라이브러리로부터 선택된 RBP4에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머 및 그 제조방법에 관한 것이다.
비만과, 제 2형 당뇨 환자의 지방세포에서는 GLUT4 glucose transporter가 선택적으로 감소되는 현상이 있다. 실험용 쥐의 지방세포의 GLUT4 glucose transporter gene(Glut4)을 넉아웃(knockout)시킨 결과, 쥐의 지방세포에서는 retinol binding protein-4(RBP4)가 증가하는 것이 확인이 되며, 비만에 의해 제 2형 당뇨를 가진 인슐린 저항성인 쥐와 사람 또한 혈액 내의 RBP4 레벨이 증가되었음이 이미 알려져 있다. 또한 사람의 RBP4 유전자가 과잉발현 되거나 정상적인 쥐에 RBP4를 주사하면 인슐린 저항성이 야기된다 (도 6 참조). 이것은 혈중 RBP4 레 벨이 증가하면 간에서의 gluconeogenic enzyme phosphoenolpyruvate carboxykinase(PEPCK)의 발현을 유도하고 근육에서의 인슐린 신호를 악화시키는 것으로 이어진다. 그러므로 지방세포에서 유래된 RBP4는 제 2형 당뇨의 발병에 있어, 그 원인이 되므로 RBP4를 바이오마커로 이용하여 혈중의 RBP4 레벨을 측정함으로써 제 2형 당뇨를 빠르고 정확하게 진단할 수 있다.
앱타머(Aptamer)는 특정 타겟에 대해 높은 특이성과 친화도를 가지는 단일가닥 DNA 또는 RNA의 구조체를 말한다. 앱타머는 타겟에 대한 친화도가 높고 열 안정성이 우수하며 시험관 내(in vitro)에서 합성이 가능하기 때문에, 비용면에서도 기존의 센서 분야에서 이용되는 감지물질들 보다도 우위에 있다. 또한 타겟물질에 제약이 없어 단백질, 아미노산 같은 생분자나 환경호르몬이나 항생제 같은 작은 유기화학 물질, 박테리아 등의 다양한 타겟에 대한 앱타머를 합성할 수 있다. 이렇게 표적 물질과 특이적으로 결합하는 앱타머의 특성으로 인해 최근 들어 앱타머를 신약개발, 약물전달 시스템, 그리고 바이오센서 등의 연구에 이용하기 위해 많은 연구가 이루어지고 있다. 본 발명은 RBP4에만 특이적으로 결합하는 핵산 구조체인 DNA 앱타머를 개발해냄으로써, 선진국병이라 불리는 비만에 의한 발병되는 제 2형 당뇨를 보다 정확하고 신속하게 진단하는데 기여할 수 있을 것으로 판단된다.
기존 바이오센서 분야에서 이용되는 다양한 감지물질 중 민감도 면에서 우위에 있는 것이 항체를 이용한 타겟물질의 검출이다. 이는 검출하고자 하는 타겟물질(항원)을 동물의 몸에 주입하여 생체의 면역시스템을 통해 만들어지는 항체를 확보한 후 정제 과정을 거치기 때문에 시간이 많이 들고 고비용이라는 점이 첫 번째 문제점이라 할 수 있다. 또한 타겟물질에 있어 제약이 거의 없는 앱타머에 비해 항원으로 사용할 수 있는 타겟물질이 제한적이어서 독성물질과 같은 저분자 화학물질들에 대한 항체의 제작에 어려움이 있다. 일반적으로 항체는 그 크기가 100KDa 이상인 매우 큰 단백질이기 때문에 전기화학 기반 바이오센서로 응용 시에 신호 검출 부분에 있어 제약이 있고, 열 안전성이 DNA나 다른 화학물질에 비해 현저히 떨어지는 문제가 있다. 그러므로 기존의 혈중 바이오마커의 진단에 있어 항체를 이용한 기술은 비용과 시간적인 면에서 효율적이지 않고, 적용범위가 다양하지 않으며 바이오센서로 응용하는 데에 있어 제한적인 문제점들이 있다. 이러한 문제점들을 개선하기 위한 새로운 감지물질로서 다양한 타겟물질에 대해 특이적으로 높은 친화도를 보이는 핵산 구조체인 앱타머를 이용하는 연구가 많이 이루어지고 있다.
이에, 본 발명자들은 상기 종래기술들의 문제점들을 극복하기 위하여 예의 연구노력한 결과, 제 2형 당뇨병의 바이오마커인 RBP4에 대해 특이적으로 높은 친화도를 보이는 핵산 구조체인 DNA 앱타머를 개발하였다. 또한, 상기 RBP4에 특이적으로 결합 가능한 DNA 앱타머를 포함하는 조성물을 제조하여 제 2형 당뇨병을 효과적으로 진단할 수 있음을 확인하고, 본　발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 주된 목적은 제 2형 당뇨병의 바이오마커인 RBP4에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머 및 그 제조방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 RBP4에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머를 이용한 제 2형 당뇨병 진단용 조성물을 제공하는데 있다.
본 발명의 한 양태에 따르면, 본 발명은 RBP4(Retinol Binding Protein 4)에 특이적으로 결합 가능한 DNA 앱타머를 제공한다. 본 발명에서는 상기 RBP4(Retinol Binding Protein 4)에 특이적으로 결합 가능한 DNA 앱타머를 SELEX process를 이용하여 타겟물질에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머를 선택하였다.
본 발명에 사용된 SELEX process란 임의적으로 합성된 DNA 또는 RNA의 집합에서 특정 분자에 대해 높은 결합력을 지니는 DNA 또는 RNA를 선별하여 증폭시킴으로써 해당 분자의 DNA 결합 서열을 알아내는 방법 (Louis C. Bock, Linda C. Griffin, John A. Latham, Eric H. Vermaas, John J. Toole. 1992. Selection of single-stranded DNA molecules that bind and inhibit human thrombin. Nature 355, 564-566)을 말한다.
본 발명의 DNA 앱타머에서, 상기 DNA 앱타머는 상기 SELEX process에 의해 선택된 RBP4에 특이적으로 결합하는 어떠한 염기서열의 DNA 앱타머일 수 있으나, 바람직하게는 서열번호 1 내지 서열번호 10중 어느 하나의 염기서열을 갖는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 RBP4(Retinol Binding Protein 4)에 특이적으로 결합 가능한 DNA 앱타머의 제조방법:
a) RBP4와 자성비드(magnetic beads)를 붕산염(borate) 버퍼용액에서 반응시켜 공유결합을 유도하는 단계;
b) 양끝에 PCR용 프라이머 영역을 포함하고 중앙에 30-50개의 임의의 염기를 가지는 DNA pool과 상기 공유결합으로 얻은 RBP4-자성비드를 버퍼용액에서 혼합하여 상온에서 결합을 유도하는 단계;
c) 상기 RBP4-자성비드에 결합된 DNA를 자석을 이용하여 분리하는 단계;
d) 상기 분리된 RBP4-자성비드로부터 DNA를 분리시키는 단계; 및
e) 상기 PCR용 프라이머 영역에 상보적인 프라이머 쌍을 이용하여 PCR을 수행함으로서 RBP4에 특이적으로 결합하는 DNA를 증폭시키는 단계를 제공한다.
본 발명의 방법에서, 상기 a)단계의 공유결합은 RBP4의 아미노기(amino group)와 자성비드의 토실기(tosyl group)의 공유결합인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 방법에서, 상기 a)단계 후, 공유결합된 RBP4-자성비드에서 RBP4와 결합하지 않은 자성비드의 토실기를 BSA(Bovine Serum Albumin) 용액으로 35-40℃에서 3-5시간 동안 불활성화 시키는 단계를 더 포함하는 것이 바람직하다.
본 발명의 방법에서, 상기 d)단계에서 DNA의 분리는 70-90℃에 3-10분간 두 어 DNA를 RBP4-자성비드로부터 분리시키는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 방법에서, 상기 e)단계에서 프라이머 쌍 중 하나에 플루오레세인(fluorescein)이 붙여진 프라이머를 사용하여 PCR을 수행한 후, 전기영동을 통해 상기 플루오레세인에 의해 변성된 단일가닥 DNA를 분리하는 단계를 더 포함하는 것이 바람직하다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 RBP4(Retinol Binding Protein 4)에 특이적으로 결합 가능한 DNA 앱타머를 포함하는 제 2형 당뇨병 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명의 조성물에서, 상기 DNA 앱타머는 바람직하게는 서열번호 1 내지 서열번호 10 중 어느 하나의 염기서열을 갖는 DNA 앱타머인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 조성물에서, 상기 제 2형 당뇨병은 바람직하게는 상기 DNA 앱타머에 결합하는 혈중 RBP4의 수준을 측정함으로서 진단하는 것을 특징으로 한다. 제 2형 당뇨의 중요한 바이오마커인 RBP4의 혈중농도를 정확하게 측정하는 것은 2형 당뇨를 진단하는데 매우 중요하다. 따라서 혈액 샘플안의 여러 생체 물질 중에서 비특이적이며 적은 양의 RBP4에도 특이적으로 결합할 수 있는 본 발명의 DNA 앱타머를 포함하는 조성물을 이용하여 보다 신속하고 정확하게 2형 당뇨를 진단하는 데에 사용할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 DNA 앱타머를 칩(chip)상에 형광물질, 발색물질 또는 항체 등과 함께 spotting 시킨 후 혈액샘플을 반응시킴으로서 혈액 중에 포함된 미량의 RBP4의 수준을 신속하게 측정할 수 있다. 또 다른 방법으로는 자성비드에 상기 DNA 앱타머를 고정화시켜 RBP4를 결합시키게 되면 결합된 DNA 앱타머- RBP4 complex를 자석을 이용하여 분리할 수 있게 되고, 이 complex로부터 다시 RBP4를 분리함으로써 RBP4만을 선택적으로 검출할 수 있게 된다. 본 발명의 실시예에 기술된 방법 이외에도 본 발명의 DNA 앱타머와 연결자로 연결된 센서를 이용하여 혈액 중의 RBP4를 검출하는 방법 등을 사용할 수 있다.
이하, 본 발명을 단계별로 보다 구체적으로 설명한다.
1) 자성 비드(magnetic bead)에 RBP4 고정
RBP4의 아미노기(amino group)와 자성비드 표면의 토실기(tosyl group)는 공유결합을 형성하게 되는데, 이것을 위해 RBP4와 자성비드를 버퍼용액에 넣고 반응시킨다. 반응 후 RBP4가 결합된 자성비드는 자석을 이용해서 분리가 가능하며 같은 버퍼용액으로 비드를 세척하여 결합하지 않았거나 표면에 약하게 붙어있는 RBP4를 제거한다.
2) RBP4에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머 개발
표적물질 특이적인 앱타머를 개발하기 위한 방법으로는 일반적으로 SELEX(Systematic Evolution of Ligand by Exponential Enrichment) 방법이 널리 사용되고 있다. 본 발명에서는 일반적인 SELEX를 변형한 FluMag-SELEX process를 이용하여 RBP4 결합 특이적인 DNA 앱타머를 개발하였다. 본 발명에 이용된 FluMag-SELEX process는 DNA 증폭단계에서 형광 표지된 프라이머(fluorescence labelled primer)를 사용함으로써 이어지는 PAGE를 이용한 PCR product sepatarion (dsDNA->ssDNA)과정에서 형광을 띠는 밴드만 취하면 되는 이점을 이용하기 위한 변형이며, 타겟과 결합하는/결합하지 않는 DNA를 구별해내는 방법으로 자석(magnet)을 이용한 SELEX 방법이다. 기존의 다른 SELEX의 경우, 방사선 표지(radioactive label), capillary electrophoresis, membrane filter 등을 이용했었는데, 경비가 많이 들고 핸들링 하기가 어려운 단점이 있다. PCR product를 분리하기 위해서는 chromatography, affinity column 등이 이용되었지만 가격이 비싸고, 효율이 떨어지는 문제가 있다(R. Stoltenburg, C. Reinemann, B. Strehlitz (2005) Anal Bioanal Chem 383: 83-91).
이를 위하여 먼저 76개의 임의의 염기를 가진 DNA pool을 합성하였으며, 이 DNA pool을 RBP4가 고정되어 있는 자성 비드와 함께 버퍼용액에 넣고 혼합하여 결합 반응을 시킨 후 자석을 이용해 RBP4와 결합하지 않은 DNA를 제거한다. 고온 처리를 하여 RBP4와 결합한 DNA를 자성비드에서부터 분리시킨 다음 에탄올 침전법으로 용리된 DNA를 확보한다.
RBP4 결합 특이적인 DNA의 양을 증폭하기 위해 PCR을 수행하고 PCR 반응물을 정제한 후 고농도의 요소(urea)가 들어있는 폴리아크릴아마이드 젤로 전기영동을 하여 이중나선 DNA인 PCR 결과물을 두 개의 단일 가닥 DNA로 분리한다.
원래의 단일 가닥 DNA 밴드를 젤 추출(gel extraction)한 후 다시 에탄올 침전법으로 분리된 DNA를 확보한다. 이 때 확보된 DNA pool은 다시 처음의 RBP4가 고정되어 있는 자성비드 용액과 혼합하여 RBP4와 반응시킨다. 이러한 일련의 과정을 반복하여 90% 이상이 RBP4에 결합하는 DNA pool을 얻은 후 DNA pool을 TOPO 클로닝 키트를 이용하여 클로닝(cloning)하고 얻어진 콜로니에서부터 DNA를 추출하여 염기분석을 시행한다.
3) RBP4 결합 특이적 DNA 앱타머 분석
RBP4에 특이적으로 결합하는 앱타머의 다른 단백질에 대한 친화성과 RBP4의 농도에 따른 결합력의 크기를 비교하기 위한 방법으로 표면자기공명장치(SPR)를 이용하였다. 이것을 위하여 금칩(bare gold chip)의 표면을 화학처리하여 각각의 DNA 앱타머를 칩 위에 고정시킨 후 그 위에 RBP4를 농도별로 반응시키고, 특이성 분석을 위해 다른 에디포카인과 BSA에 대한 분석도 테스트한다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.
실시예 1. 자성 비드에 RBP4의 고정
RBP4(Adipogen Inc.)의 아미노기(amino group)와 자성비드(M-280 Tosylactivated magnetic beads, Dynal Biotech ASA, Norway)의 토실기(tosyl group)는 공유결합을 형성하게 되는데, 이것을 위해 RBP4와 자성비드를 버퍼용액(0.1 M borate buffer, pH 9.5)에 넣고 상온에서 48시간 반응시켰다. RBP4가 결 합된 자성비드는 자석을 이용해서 분리가 가능하며, 동일한 버퍼용액으로 비드를 세척하여 결합하지 않은 RBP4를 제거하였다. RBP4가 결합된 자성비드(RBP4-자성비드)는 세척 후 0.1%의 BSA(Bovine Serum Albumin, Sigma Co.) 용액(pH 8.5)으로 37℃에서 4시간 반응시켜 RBP4와 결합하지 않은 토실기(tosyl group)를 불활성화하였다. 활성을 가지고 있는 토실기가 남아있으면 분자간의 여러 가지 상호작용, 예컨대, 반데르발스 결합, hydrophobic interaction 등으로 인해 nonspecific binding이 일어날 수 있기 때문에 활성이 거의 없다고 알려진 BSA로 활성기를 차단(blocking)시켰다. 수차례 세척 후 버퍼용액(0.1 M PBS, pH 7.4)에 자성 비드를 혼합하여 4 ℃에서 보관하였다.
실시예 2. 임의의 염기서열을 가지는 DNA pool 합성
76mer DNA pool로서 양 끝에 PCR을 위한 프라이머 영역(primer region)이 있고 중앙에 40개의 임의의 염기를 가진 DNA pool을 아래와 같은 방법으로 합성하였다. 본 발명에 사용된 DNA pool은 Genotech Inc. Korea에 화학적으로 합성을 의뢰하였다.
ATACCAGCTTATTCAATT-N40-AGATAGTAAGTGCAATCT
실시예 3. RBP4와 결합한 DNA 앱타머의 선별
실시예 2에서 합성된 랜덤 DNA pool을 RBP4가 고정되어 있는 자성비드(RBP4- 자성비드)와 함께 버퍼용액(20mM Tris-Cl buffer, pH 7.6 contained 100mM NaCl, 2mM MgCl2, 5mM KCl, 1mM CaCl2, 및 0.02% Tween20)이 담긴 튜브에 넣고 혼합하여 30분간 상온에서 반응시킨 후 RBP4와 결합하지 않은 DNA를 제거하기 위해 상기 혼합액이 들어있는 튜브를 자석에 고정시켜서 RBP4와 결합하지 않은 DNA를 제거하고, 결합력이 약한 DNA를 제거하기 위하여 버퍼용액으로 5회 세척하였다. RBP4와 결합한 DNA를 용리하기 위하여 튜브를 80℃에서 5분간 두어 DNA를 자성비드에서부터 분리시킨 다음 에탄올 침전법으로 용리된 DNA를 확보하였다. 이렇게 얻어진 RBP4에 결합하는 DNA의 양을 측정하였다. 도 2에서 eluted ssDNA가 각각의 선별단계(selection round)에서 얻어진 RBP4에 결합하는 DNA의 양을 보여준다.
실시예 4. RBP4와 결합 가능한 DNA 앱타머 pool의 제조
RBP4 결합 특이적인 DNA의 양을 늘리기 위해 이미 알고 있는 프라이머 영역을 이용하여 PCR을 수행하였다. PCR 생산물은 두 가닥의 DNA이므로 이를 단일가닥으로 분리하기 위한 과정을 위하여, 아래와 같이 하나의 프라이머에는 플루오레세인(fluorescein)을 고정하였다.
forward FP-fluorescein-ATACCAGCTTATTCAATT
reverse RP-AGATTGCACTTACTATCT
PCR 반응물을 정제키트(purification kit)를 이용하여 정제한 후 이중가닥의 DNA를 단일가닥으로 만들기 위해 폴리아크릴아마이드젤 전기영동을 실시하였다. 10%의 폴리아크릴아마이드 젤에는 6M의 요소(urea), 20%의 포름아마이드가 포함되어 있어 전기영동 후에는 두 개의 밴드가 생기는데, 이는 전기영동 과정에서 두 가닥의 DNA가 변성되어 플루오레세인이 붙어있는 DNA 가닥은 위에, 붙어있지 않은 DNA 가닥은 아래에 각각 위치하게 된다. 플루오레세인이 붙어있는 DNA 밴드를 잘라내어 젤 추출(gel extraction)을 실시한 후 다시 에탄올 침전법으로 분리된 DNA를 확보하였다. 이 때 확보된 DNA pool은 다시 처음의 RBP4가 고정되어 있는 자성비드 용액과 혼합하여 RBP4와 반응시켰다. 이러한 과정의 모식도를 도 1에 나타내었고, 일련의 과정(FluMag-SELEX process)을 한 번의 선별(selection)이라 하면 총 9번의 선별과정을 거쳐 최종적으로 97% 이상이 RBP4에 결합하는 DNA pool을 얻었다. 2번째와 9번째 선별 후에는 각각 BSA(Bovine Serum Albumin, Sigma Co.)와 다른 에디포카인(adipokines)인 아디포넥틴(adiponectin, Adipogen Inc.), 비스파틴(visfatin, Adipogen Inc.)으로 count selection을 실시함으로써 비특이적으로 결합하는 DNA를 차단하고 RBP4에만 높은 친화도를 가지고 특이적으로 결합하는 DNA pool을 확보하였다. 도 2에서 각각의 선별(selection)에서 RBP4가 고정된 자성비드에서부터 용리된 ssDNA의 퍼센트를 제시하였다. 최종적으로 얻어진 DNA pool을 TOPO 클로닝 키트(Invitrogen)를 이용하여 클로닝(cloning)하고 얻어진 콜로니에서부터 DNA를 추출하여 염기분석을 시행한 결과, RBP4에 특이적으로 결합하는 서로 다른 10종의 핵산 구조체(DNA 앱타머)를 확보하였다.
실시예 4. RBP4와 특이적으로 결합 가능한 DNA 앱타머의 특성 분석
RBP4에 높은 친화도를 가지고 특이적으로 결합하는 서로 다른 10종의 DNA의 염기서열을 분석한 결과를 하기 표 1에 제시하였다. 또한 이 10종의 RBP4 앱타머의 2차 구조를 m-fold 프로그램을 이용하여 예측한 결과를 도 3에 나타내었다.
[표 1]. RBP4에 높은 친화도를 가지고 특이적으로 결합하는 서로 다른 10종의 DNA 앱타머의 염기서열
Figure 112007069488556-pat00001
RBP4에 강하게 결합하는 10종의 앱타머들이 다른 혈중 단백질에는 결합하지 않고 오직 RBP4에만 특이적으로 결합한다는 것을 보여주는 실험을 실시하였다. RBP4는 원래 에디포카인 중의 하나이므로 RBP4 앱타머가 RBP4에만 특이적으로 결합하는 것을 보여주기 위한 가장 좋은 대조군으로서 또 다른 에디포카인인 아디포넥틴과 비스파틴, 그리고 BSA가 사용되었다.
이를 위하여 자기공명장치인 SPR(Surface Plasmon Resonance) 장치를 이용하였다. 먼저 50 mM의 3,3'-dithiodipropionic acid로 금칩(bare gold chip)의 표면에 COOH기를 만든 다음 EDC/NHS(N-ethyl-N'-(dimethylaminopropyl)carbodiimide (EDC/Sigma Co.), N-hydroxysuccinimid(NHS/Fluka))를 이용하여 Self Assenmbly Monolayer를 형성시켰다. 그 위에 스트렙타비딘을 고정시키고 바이오틴이 붙어있는 No.38 앱타머를 1 μM로 코팅시켰다. 여기에 1 μM의 RBP4, 아디포넥틴, 비스파틴, BSA를 버퍼용액(150 mM NaCl, 55 mM Tris, pH 8.2)안에서 각각 30분간 반응시킨 후 같은 버퍼용액으로 결합하지 않은 단백질을 씻어내었다. 같은 방법으로 3회 실시한 최종적으로 SPR 결과를 분석하여 상기 앱타머가 다른 단백질들보다 RBP4에 월등하게 잘 결합하는 것을 확인할 수 있었다. 이 결과를 도 4에 제시하였다.
실시예 5. RBP4와 특이적으로 결합 가능한 DNA 앱타머의 특이성 및 결합력 분석
RBP4에 특이적으로 결합하는 서로 다른 10종의 앱타머 중에서 특이성 및 결합력이 가장 높은 No.38 앱타머에 대한 RBP4와의 결합 분석(binding assay)을 실시 하였다. 실시예 4에서와 같이 금칩(bare gold chip)에 1 μM로 앱타머를 고정시킨 후 80 nM 부터 2 μM의 서로 다른 농도의 RBP4를 버퍼용액(150mM NaCl, 55mM Tris, pH 8.2)에서 30분간 반응시켰다. 해리상수를 구하기 위해서 각각의 반응 정도는 비선형 회귀법과 단일 부위 포화형 리간드 결합법으로 Sigmaplot 8.0을 이용하여 plotting되었고, 여기에 y=Bmax* X/Kd + X 식이 이용되었다(y는 포화도, Bmax는 최대 결합 위치, Kd는 해리상수, X 는 결합하지 않은 RBP4). 그 결과로, No.38 앱타머의 Kd 값이 226 nM로서 RBP4와 매우 강력하게 결합하는 것이 확인되었고, 이에 대한 분석 데이터를 도 5에 제시하였다.
이상 설명한 바와 같이, 본 발명에 따르면 RBP4에 특이적으로 결합 가능한 DNA 앱타머를 이용하면 기존에 사용되고 있는 항체 기반 분석보다 더 민감하고 정확하게 혈중 RBP4의 농도를 측정할 수 있을 것으로 기대되며, 또한 상기 DNA 앱타머는 항체에 비해 생산비용이 적고 표면에 고정화하기가 쉬우므로 바이오센서 칩 제작에 유리하다. 따라서 이러한 RBP4에 특이적으로 결합 가능한 DNA 앱타머를 이용하여 혈중 RBP4 농도를 민감하고 정확하게 측정할 수 있는 바이오센서 개발하면 2형 당뇨의 진단의 정확성을 증가시키는데 도움을 줄 수 있을 것으로 기대된다.
도 1은 본 발명에 따른 RBP4(Retinol Binding Protein 4)에 특이적으로 결합하는 핵산 구조체 앱타머의 개발을 위한 FluMag-SELEX process 모식도이다.
도 2는 본 발명에 따른 SELEX process 중 각 selection의 ssDNA pool에서 RBP4에 결합하는 ssDNA의 비율 증가도이다.
도 3은 본 발명에 따른 RBP4에 특이적으로 결합하는 10종의 핵산 구조체 앱타머의 염기서열을 웹서버 기반의 m-fold 프로그램을 이용하여 분석한 DNA 앱타머 2차 구조 모식도이다.
도 4는 본 발명에 따른 RBP4에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머인 No.38 앱타머와 No.40 앱타머의 다른 에디포카인 및 BSA에 대한 특이성 분석 결과이다.
도 5는 본 발명에 따른 결합 특이성이 가장 큰 No.38 앱타머의 RBP4와의 결합 분석(binding assay) 결과이다.
도 6은 에디포카인의 혈중 농도 변화와 유전적 변이에 의해 일어나는 각족 대사성 질환들을 나타낸 것이다.
<110> Korea University Industry-Academy Cooperation Foundation <120> DNA aptamer binding to Retinol Binding Protein 4 with specificity and production method thereof <160> 10 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 76 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RBP4 binding DNA aptamer <400> 1 agattgcact tactatctac accacaccag tagccagcct gcgccctcca tcgtccccaa 60 ttgaataagc tggtat 76 <210> 2 <211> 76 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RBP4 binding DNA aptamer <400> 2 ataccagctt attcaattac ggtgcggagg gggagggtgg cgggttgtgt cggtgtggag 60 atagtaagtg caatct 76 <210> 3 <211> 76 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RBP4 binding DNA aptamer <400> 3 agattgcact tactatctca ccagcccacc cagctccacc gtcacatttg cacacggcaa 60 ttgaataagc tggtat 76 <210> 4 <211> 75 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RBP4 binding DNA aptamer <400> 4 ataccagctt attcaattgg gagcgggggg agggtgtcac aggcgggtgt gttgtggaga 60 tagtaagtgc aatct 75 <210> 5 <211> 76 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RBP4 binding DNA aptamer <400> 5 ataccagctt attcaattac agtagtgagg ggtccgtcgt ggggtagttg ggtcgtggag 60 atagtaagtg caatct 76 <210> 6 <211> 76 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RBP4 binding DNA aptamer <400> 6 ataccagctt attcaattac ggtgtgggca gtccagttcc aatgttgggg tcgtggggag 60 atagtaagtg caatct 76 <210> 7 <211> 75 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RBP4 binding DNA aptamer <400> 7 ataccagctt attcaattgg gggcgggcgg gtggcgttct atttgcggtg tgtgggtaga 60 tagtaagtgc aatct 75 <210> 8 <211> 75 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RBP4 binding DNA aptamer <400> 8 ataccagctt attcaattgg gggcgggcgg gtggcgttct atttgcggtg tgtgggtaga 60 tagtaagtgc aatct 75 <210> 9 <211> 77 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RBP4 binding DNA aptamer <400> 9 ataccagctt attcaattgg ggcggcgggg tggggagcgt ggtggtgagg tgcgggtcga 60 gatagtaagt gcaatct 77 <210> 10 <211> 76 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RBP4 binding DNA aptamer <400> 10 ataccagctt attcaattgg cgacggacct gtgatgtgtg tatggctcat aggggtgtag 60 atagtaagtg caatct 76

Claims (10)

  1. 서열번호 1 내지 서열번호 10 중 어느 하나의 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는 RBP4(Retinol Binding Protein 4)에 특이적으로 결합 가능한 DNA 앱타머.
  2. 삭제
  3. 하기 단계를 포함하는 서열번호 1 내지 서열번호 10 중 어느 하나의 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는 RBP4(Retinol Binding Protein 4)에 특이적으로 결합 가능한 DNA 앱타머의 제조방법:
    a) RBP4와 자성비드(magnetic beads)를 붕산염(borate) 버퍼용액에서 반응시켜 공유결합을 유도하는 단계;
    b) 양끝에 PCR용 프라이머 영역을 포함하고 중앙에 30-50개의 임의의 염기를 가지는 DNA pool과상기 공유결합으로 얻은 RBP4-자성비드를 버퍼용액에서 혼합하여 상온에서 결합을 유도하는 단계;
    c) 상기 RBP4-자성비드에 결합된 DNA를 자석을 이용하여 분리하는 단계;
    d) 상기 분리된 RBP4-자성비드로부터 DNA를 분리시키는 단계; 및
    e) 상기 PCR용 프라이머 영역에 상보적인 프라이머 쌍을 이용하여 PCR을 수행함으로서 RBP4에 특이적으로 결합하는 DNA를 증폭시키는 단계.
  4. 제 3항에 있어서, 상기 a)단계의 공유결합은 RBP4의 아미노기(amino group)와 자성비드의 토실기(tosyl group)의 공유결합인 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제 3항에 있어서, 상기 a)단계 후, 공유결합된 RBP4-자성비드에서 RBP4와 결합하지 않은 자성비드의 토실(tosyl)기를 BSA(Bovine Serum Albumin) 용액으로 35-40℃에서 3-5시간 동안 불활성화 시키는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제 3항에 있어서, 상기 d)단계에서 DNA의 분리는 70-90℃에 3-10분간 두어 DNA를 RBP4-자성비드로부터 분리하는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제 3항에 있어서, 상기 e)단계에서 프라이머 쌍 중 하나에 플루오레세인(fluorescein)이 붙여진 프라이머를 사용하여 PCR을 수행한 후, 전기영동을 통해 상기 플루오레세인에 의해 변성된 단일가닥 DNA를 분리하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 서열번호 1 내지 서열번호 10 중 어느 하나의 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는 RBP4(Retinol Binding Protein 4)에 특이적으로 결합 가능한 DNA 앱타머를 포함하는 제 2형 당뇨병 진단용 조성물.
  9. 삭제
  10. 제 8항에 있어서, 상기 제 2형 당뇨병은 상기 RBP4에 특이적으로 결합 가능한 DNA 앱타머에 결합하는 혈중 RBP4의 수준을 측정함으로서 진단하는 것을 특징으로 하는 조성물.
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