CN107868787B - 具有灵敏荧光各向异性响应的免疫球蛋白e的荧光染料标记核酸适配体 - Google Patents

具有灵敏荧光各向异性响应的免疫球蛋白e的荧光染料标记核酸适配体 Download PDF

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Abstract

本发明公开了具有灵敏荧光各向异性(荧光偏振)响应的免疫球蛋白E的荧光染料标记核酸适配体。本发明的核酸适配体可以与免疫球蛋白E(IgE)特异性结合，产生显著的荧光各向异性(荧光偏振)信号变化。本发明将荧光染料荧光素或四甲基罗丹明修饰到IgE的核酸适配体的特定核苷酸的碱基位点上，所得到的荧光染料标记适配体保持较高的亲和力，同时能对IgE产生灵敏的信号响应。采用这些荧光染料标记的核酸适配体可以灵敏快速检测IgE。荧光各向异性(荧光偏振)检测法操作简单，重现性好。

Description

具有灵敏荧光各向异性响应的免疫球蛋白E的荧光染料标记 核酸适配体
技术领域
本发明属于分析检测领域，具体涉及具有灵敏荧光各向异性(荧光偏振)响应的免疫球蛋白E的荧光染料标记核酸适配体。
背景技术
免疫球蛋白E(immunoglobulin E，IgE)是和多种疾病如过敏、特异性皮炎、哮喘等相关的重要的免疫抗体，可作为一些疾病诊断的标志物。灵敏检测免疫球蛋白E对于检测IgE的水平变化，疾病诊断和治疗，药物筛选等都具有重要意义。
核酸适配体是从寡聚核苷酸文库中筛选得到的可以与目标分子高特异高亲和力结合的单链核酸分子。它的筛选无需动物，序列已知后可通过化学方法进行合成制备，制备成本低，纯度高，稳定性好，可在核酸序列上引入多种官能团用于标记或固定化。很容易将荧光染料分子标记到核酸适配体的特定位点上。核酸适配体在分析检测、生物传感、疾病治疗等领域都显示出很大的潜力和优势，在很多领域都有应用，引起研究者的广泛关注。
IgE的核酸适配体已经被筛选得到，一种DNA适配体的序列如下：5'-GGGGCACGTTTATCCGTCCCTCCTAGTGGCGTGCCCC-3'，将其简称为IgE37。它可特异性地与IgE结合，具有很高的亲和力。利用IgE的适配体可以发展检测IgE的分析方法，如亲和毛细管电泳法、电化学传感法、石英晶体微天平法等。
荧光偏振(fluorescence polarization)或荧光各向异性(fluorescenceanisotropy)分析采用偏振的激发光来激发荧光分子，测定偏振发射荧光在垂直方向的荧光强度和水平方向的荧光强度，然后根据相应的公式计算出荧光偏振值(p)或荧光各向异性值(r)。荧光偏振值或荧光各向异性值往往反映了荧光分子在特定荧光寿命时间内转动的快慢，转动快的荧光分子其荧光偏振值(荧光各向异性值)低，而转动慢的荧光分子往往给出较高的荧光偏振(荧光各向异性)值。分子的转动快慢与分子的体积，溶液的粘度和温度等相关。当一个荧光标记的小分子配体和大分子结合后，往往会产生升高的荧光偏振(荧光各向异性)值。荧光偏振分析/荧光各向异性分析在分子间相互作用分析、临床药物检测、药物筛选、配体筛查等方面有重要的应用。荧光偏振/荧光各向异性分析具有重现性好、灵敏、操作简单、易于高通量分析等特点。荧光染料标记的适配体与蛋白质结合后，通常会引起荧光偏振(荧光各向异性)的变化。然而，一些常用的荧光染料(如荧光素、四甲基罗丹明等)标记在适配体的末端时，荧光染料具有很大的局部运动。当末端标记了荧光素或四甲基罗丹明等的适配体与蛋白质结合时，引起的荧光偏振(荧光各向异性)的变化有时并不显著，影响了荧光偏振(荧光各向异性)分析的灵敏度，甚至会导致没有明显的信号变化。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种可用于检测人免疫球蛋白E并具有灵敏荧光信号响应的荧光染料标记的核酸适配体。
本发明提供的可用于检测人免疫球蛋白E并具有灵敏荧光信号响应的荧光染料标记的核酸适配体为将人免疫球蛋白E的核酸适配体的特定碱基进行荧光标记得到的适配体；
所述特定碱基为所述人免疫球蛋白E的核酸适配体的核苷酸序列中的碱基T、碱基C或碱基A。
上述核酸适配体中，所述人免疫球蛋白E的核酸适配体为核酸适配体IgE37；
所述核酸适配体IgE37的核苷酸序列如序列1所示；
所述特定碱基为序列1第5位所示的碱基C、第9位所示的碱基T、第10位所示的碱基T、第11位所示的碱基T、第13位所示的碱基T、第15位所示的碱基C、第17位所示的碱基T、第22位所示的碱基C、第23位所示的碱基C或第30位所示的碱基C。
上述核酸适配体中，所述荧光标记所用的荧光染料为荧光素FAM或四甲基罗丹明TMR。
上述核酸适配体中，所述核酸适配体为如下(a1)-(a13)中任一种：
(a1)将核酸适配体IgE37第10位所示的碱基T进行FAM标记得到的适配体，并将该核酸适配体记作IgE37-T10-FAM；
(a2)将核酸适配体IgE37第11位所示的碱基T进行FAM标记得到的适配体，并将该核酸适配体记作IgE37-T11-FAM；
(a3)将核酸适配体IgE37第13位所示的碱基T进行FAM标记得到的适配体，并将该核酸适配体记作IgE37-T13-FAM；
(a4)将核酸适配体IgE37第10位所示的碱基T进行TMR标记得到的适配体，并将该核酸适配体记作IgE37-T10-TMR；
(a5)将核酸适配体IgE37第9位所示的碱基T进行FAM标记得到的适配体，并将该核酸适配体记作IgE37-T9-FAM；
(a6)将核酸适配体IgE37第15位所示的碱基C进行FAM标记得到的适配体，并将该核酸适配体记作IgE37-C15-FAM；
(a7)将核酸适配体IgE37第17位所示的碱基T进行FAM标记得到的适配体，并将该核酸适配体记作IgE37-T17-FAM；
(a8)将核酸适配体IgE37第23位所示的碱基C进行FAM标记得到的适配体，并将该核酸适配体记作IgE37-C23-FAM；
(a9)将核酸适配体IgE37第30位所示的碱基C进行FAM标记得到的适配体，并将该核酸适配体记作IgE37-C30-FAM；
(a10)将核酸适配体IgE37第5位所示的碱基C进行TMR标记得到的适配体，并将该核酸适配体记作IgE37-C5-TMR；
(a11)将核酸适配体IgE37第11位所示的碱基T进行TMR标记得到的适配体，并将该核酸适配体记作IgE37-T11-TMR；
(a12)将核酸适配体IgE37第17位所示的碱基T进行TMR标记得到的适配体，并将该核酸适配体记作IgE37-T17-TMR；
(a13)将核酸适配体IgE37第22位所示的碱基C进行TMR标记得到的适配体，并将该核酸适配体记作IgE37-C22-TMR。
本发明的另一个目的是提供用于检测人免疫球蛋白E的核酸适配体的衍生物。
本发明提供的用于检测人免疫球蛋白E的核酸适配体的衍生物为如下(b1)-(b3)中任一种：
(b1)将上述(a1)-(a13)中任一所示的核酸适配体删除或增加一个或几个核苷酸，得到的与所述核酸适配体具有相同功能的核酸适配体的衍生物；
(b2)将上述(a1)-(a13)中任一所示的核酸适配体进行核苷酸取代或修饰，得到的与所述核酸适配体具有相同功能的核酸适配体的衍生物；
(b3)将上述(a1)-(a13)中任一所示的核酸适配体的骨架改造为硫代磷酸酯骨架，得到的与所述核酸适配体具有相同功能的核酸适配体的衍生物。
本发明还有一个目的是提供用于检测人免疫球蛋白E的试剂盒。
本发明提供的试剂盒包括上述核酸适配体或上述核酸适配体的衍生物。
上述核酸适配体或上述核酸适配体的衍生物或上述试剂盒在如下(c1)-(c6)中任一种中的应用也属于本发明的保护范围：
(c1)制备识别或结合人免疫球蛋白E的产品；
(c2)识别或结合人免疫球蛋白E；
(c3)制备检测或辅助检测人免疫球蛋白E的产品；
(c4)检测或辅助检测人免疫球蛋白E；
(c5)制备诊断和/或治疗与人免疫球蛋白E相关的疾病的产品；
(c6)诊断和/或治疗与人免疫球蛋白E相关的疾病。
本发明的最后一个目的是提供一种检测或辅助检测人免疫球蛋白E的方法。
本发明提供的检测或辅助检测人免疫球蛋白E的方法包括如下步骤：
(d1)将上述(a1)-(a13)中任一所示的核酸适配体和待测样品在结合缓冲液中混匀，得到混合溶液；
(d2)将所述混合溶液进行温育，温育结束后，检测荧光各向异性值或荧光偏振值，从而实现对所述待测溶液中人免疫球蛋白E的检测。
上述方法中，所述对所述待测溶液中人免疫球蛋白E的检测为定量检测或定性检测；
若为定量检测时，按照如下确定所述待测溶液中人免疫球蛋白E的含量：当所述温育结束后，将所测定的荧光各向异性值或荧光偏振值代入标准曲线方程，从而计算所述待测溶液中人免疫球蛋白E的含量；所述标准曲线方程按照如下获得：用系列已知浓度的人免疫球蛋白E标准品溶液替代所述待测溶液进行步骤(d1)-(d2)，测得各浓度的人免疫球蛋白E标准品溶液对应的荧光各向异性值或荧光偏振值，从而获得人免疫球蛋白E的浓度与荧光各向异性值或荧光偏振值之间的标准曲线方程；
若为定性检测时，按照如下确定所述待测溶液中是否含有人免疫球蛋白E：当所述温育结束后，若所测定的荧光各向异性值或荧光偏振值显著高于对照值，则所述待测溶液中含有或候选含有人免疫球蛋白E；反之，则所述待测溶液中不含有或候选不含有人免疫球蛋白E；
所述对照值为用不含有人免疫球蛋白E的溶液替代所述待测溶液进行步骤(d1)-(d2)所测得的荧光各向异性值或荧光偏振值。
上述方法中，若所述核酸适配体采用FAM作为标记的荧光染料时，激发波长为492nm，发射波长为520nm；若所述核酸适配体采用TMR作为标记的荧光染料时，激发波长为560nm，发射波长为578nm。
上述方法中，所述温育的条件为1-25℃温育10-30min，在本发明的具体实施例中，所述温育的条件为4℃温育20min。
上述方法中，可通过现有技术中用于检测荧光各向异性或荧光偏振的仪器来检测荧光各向异性值或荧光偏振值，如荧光光度计等。
本发明在IgE的核酸适配体(IgE37)的特定位点上标记了荧光染料：荧光素(fluorescein，简称FAM)或四甲基罗丹明(tetramethylrhodamine，简称TMR)，所得到的荧光染料标记到特定位点的核酸适配体与IgE结合后会产生明显的荧光各向异性(荧光偏振)变化，信号变化幅度大，而且相应的核酸适配体具有很好的亲和力。本发明提供的具有灵敏荧光各向异性(荧光偏振)信号响应的荧光染料标记的核酸适配体，可用于灵敏检测IgE。这种基于核酸适配体荧光偏振(荧光各向异性)分析方法的步骤是：将荧光染料标记的核酸适配体探针与IgE在结合缓冲液中混合，温育，然后采用荧光光度计测定荧光染料的荧光偏振(荧光各向异性)值。
本发明具有如下的优点和效果：采用特定位点上(如序列中核苷酸T或C的碱基)标记了荧光染料(FAM或TMR)的IgE的核酸适配体作为荧光探针，荧光探针与IgE结合后可产生明显的荧光偏振(荧光各向异性)变化。与常用的序列末端上标记荧光染料(FAM或TMR)的核酸适配体探针相比，荧光各向异性(荧光偏振)信号变化更显著。本发明筛选出的荧光染料标记到特定位点的核酸适配体具有很好的亲和力，对IgE的检测具有灵敏的荧光信号响应。这种基于荧光染料标记的核酸适配体检测IgE的方法简单，重现性好，灵敏度高。
附图说明
图1为采用IgE37-T9-FAM、IgE37-T10-FAM、IgE37-T11-FAM、IgE37-T13-FAM或IgE37-C15-FAM荧光各向异性(荧光偏振)检测IgE。
图2为采用IgE37-T17-FAM、IgE37-C23-FAM或IgE37-C30-FAM荧光各向异性(荧光偏振)检测IgE。
图3为3’端标记了FAM的适配体探针对IgE的荧光各向异性信号响应。
图4为采用IgE37-C5-TMR荧光各向异性(荧光偏振)检测IgE。
图5为采用IgE37-T10-TMR、IgE37-T11-TMR、IgE37-T17-TMR或IgE37-C22-TMR荧光各向异性(荧光偏振)检测IgE。
图6为采用IgE37-T10-FAM荧光各向异性(荧光偏振)检测IgE的选择性考察。
具体实施方式
为了便于更好地理解发明，提供以下实施例。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的实验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂公司购买得到的。
下述实施例中的人α凝血酶(humanα-thrombin)购自Haematologic TechnologiesInc.(Essex Junction,VT,USA)。人IgE和Immunoglobulin G(IgG)均购自AthensResearch&Technology(USA)。血红蛋白和溶菌酶均购自Sigma公司。在特定位点上标记了荧光染料(FAM或TMR)的核酸适配体均由生工生物工程(上海)股份有限公司和宝生物工程(大连)有限公司合成制备。
下述实施例中采用荧光光度计测定荧光染料的荧光偏振(荧光各向异性)值时，若采用FAM作为标记的荧光染料时，激发波长为492nm，发射波长为520nm，若采用TMR作为标记的荧光染料时，激发波长为560nm，发射波长为578nm。
下述实施例中的结合缓冲液的溶剂为水，溶质及其在缓冲液中的终浓度分别如下：20mM Tris-HCl(pH 7.5)，150mM NaCl，5mM KCl，1mM MgCl2和1mg/mL BSA。
下述实施例中的核酸适配体IgE37的序列如下：5'-GGGGCACGTTTATCCGTCCCTCCTAGTGGCGTGCCCC-3'(序列1)。
实施例1：采用IgE37-T9-FAM荧光各向异性(荧光偏振)检测IgE
1、将IgE37-T9-FAM、IgE和结合缓冲液混匀，得到反应体系。其中，IgE37-T9-FAM在反应体系中的终浓度为10nM。IgE在反应体系中的终浓度分别为0nM、0.01nM、0.02nM、0.05nM、0.1nM、0.2nM、0.5nM、1nM、2nM、5nM、10nM、20nM、50nM、100nM和200nM。
上述IgE37-T9-FAM为将核酸适配体IgE37的第9个核苷酸T进行FAM标记得到的适配体。
2、将反应体系在冰盒(4℃)中温育20分。
3、采用荧光光度计在25℃下测定IgE37-T9-FAM的荧光各向异性值(r)。
结果如图1所示。图1显示了IgE37-T9-FAM随IgE浓度增加，其荧光各向异性逐渐增加，在高浓度的IgE下，荧光各向异性值达到平台，不再明显改变。检测限为0.2nM，检测范围为0.2nM到100nM。
实施例2：采用IgE37-T10-FAM荧光各向异性(荧光偏振)检测IgE
1、将IgE37-T10-FAM、IgE和结合缓冲液混匀，得到反应体系。其中，IgE37-T10-FAM在反应体系中的终浓度为10nM。IgE在反应体系中的终浓度分别为0nM、0.01nM、0.02nM、0.05nM、0.1nM、0.2nM、0.5nM、1nM、2nM、5nM、10nM、20nM、50nM、100nM和200nM。
上述IgE37-T10-FAM为将核酸适配体IgE37的第10个核苷酸T进行FAM标记得到的适配体。
2、将反应体系在冰盒(4℃)中温育20分。
3、采用荧光光度计在25℃下测定IgE37-T10-FAM的荧光各向异性值(r)。
结果如图1所示。图1显示了IgE37-T10-FAM随IgE浓度增加，其荧光各向异性逐渐增加，在高浓度的IgE下，荧光各向异性值达到平台，不再明显改变。检测限为0.1nM，检测范围为0.1nM到100nM。
实施例3：采用IgE37-T11-FAM荧光各向异性(荧光偏振)检测IgE
1、将IgE37-T11-FAM、IgE和结合缓冲液混匀，得到反应体系。其中，IgE37-T11-FAM在反应体系中的终浓度为10nM。IgE在反应体系中的终浓度分别为0nM、0.01nM、0.02nM、0.05nM、0.1nM、0.2nM、0.5nM、1nM、2nM、5nM、10nM、20nM、50nM、100nM和200nM。
上述IgE37-T11-FAM为将核酸适配体IgE37的第11个核苷酸T进行FAM标记得到的适配体。
2、将反应体系在冰盒(4℃)中温育20分。
3、采用荧光光度计在25℃下测定IgE37-T11-FAM的荧光各向异性值(r)。
结果如图1所示。图1显示了IgE37-T11-FAM随IgE浓度增加，其荧光各向异性逐渐增加，在高浓度的IgE下，荧光各向异性值达到平台，不再明显改变。检测限为0.2nM，检测范围为0.2nM到100nM。
实施例4：采用IgE37-T13-FAM荧光各向异性(荧光偏振)检测IgE
1、将IgE37-T13-FAM、IgE和结合缓冲液混匀，得到反应体系。其中，IgE37-T13-FAM在反应体系中的终浓度为10nM。IgE在反应体系中的终浓度分别为0nM、0.01nM、0.02nM、0.05nM、0.1nM、0.2nM、0.5nM、1nM、2nM、5nM、10nM、20nM、50nM、100nM和200nM。
上述IgE37-T13-FAM为将核酸适配体IgE37的第13个核苷酸T进行FAM标记得到的适配体。
2、将反应体系在冰盒(4℃)中温育20分。
3、采用荧光光度计在25℃下测定IgE37-T13-FAM的荧光各向异性值(r)。
结果如图1所示。图1显示了IgE37-T13-FAM随IgE浓度增加，其荧光各向异性逐渐增加，在高浓度的IgE下，荧光各向异性值达到平台，不再明显改变。检测限为0.2nM，检测范围为0.2nM到100nM。
实施例5：采用IgE37-C15-FAM荧光各向异性(荧光偏振)检测IgE
1、将IgE37-C15-FAM、IgE和结合缓冲液混匀，得到反应体系。其中，IgE37-C15-FAM在反应体系中的终浓度为10nM。IgE在反应体系中的终浓度分别为0nM、0.01nM、0.02nM、0.05nM、0.1nM、0.2nM、0.5nM、1nM、2nM、5nM、10nM、20nM、50nM、100nM、200nM和1000nM。
上述IgE37-C15-FAM为将核酸适配体IgE37的第15个核苷酸C进行FAM标记得到的适配体。
2、将反应体系在冰盒(4℃)中温育20分。
3、采用荧光光度计在25℃下测定IgE37-C15-FAM的荧光各向异性值(r)。
结果如图1所示。图1显示了IgE37-C15-FAM随IgE浓度增加，其荧光各向异性逐渐增加，在高浓度的IgE下，荧光各向异性值达到平台，不再明显改变。检测限为0.5nM，检测范围为0.5nM到500nM。
实施例6：采用IgE37-T17-FAM荧光各向异性(荧光偏振)检测IgE
1、将IgE37-T17-FAM、IgE和结合缓冲液混匀，得到反应体系。其中，IgE37-T17-FAM在反应体系中的终浓度为10nM。IgE在反应体系中的终浓度分别为0nM、0.01nM、0.02nM、0.05nM、0.1nM、0.2nM、0.5nM、1nM、2nM、5nM、10nM、20nM、50nM、100nM和200nM。
上述IgE37-T17-FAM为将核酸适配体IgE37的第17个核苷酸T进行FAM标记得到的适配体。
2、将反应体系在冰盒(4℃)中温育20分。
3、采用荧光光度计在25℃下测定IgE37-T17-FAM的荧光各向异性值(r)。
结果如图2所示。图2显示了IgE37-T17-FAM随IgE浓度增加，其荧光各向异性逐渐增加，在高浓度的IgE下，荧光各向异性值达到平台，不再明显改变。检测限为0.5nM，检测范围为0.5nM到100nM。
实施例7：采用IgE37-C23-FAM荧光各向异性(荧光偏振)检测IgE
1、将IgE37-C23-FAM、IgE和结合缓冲液混匀，得到反应体系。其中，IgE37-C23-FAM在反应体系中的终浓度为10nM。IgE在反应体系中的终浓度分别为0nM、0.01nM、0.02nM、0.05nM、0.1nM、0.2nM、0.5nM、1nM、2nM、5nM、10nM、20nM、50nM、100nM和200nM。
上述IgE37-C23-FAM为将核酸适配体IgE37的第23个核苷酸C进行FAM标记得到的适配体。
2、将反应体系在冰盒(4℃)中温育20分。
3、采用荧光光度计在25℃下测定IgE37-C23-FAM的荧光各向异性值(r)。
结果如图2所示。图2显示了IgE37-C23-FAM随IgE浓度增加，其荧光各向异性逐渐增加，在高浓度的IgE下，荧光各向异性值达到平台，不再明显改变。检测限为0.5nM，检测范围为0.5nM到100nM。
实施例8：采用IgE37-C30-FAM荧光各向异性(荧光偏振)检测IgE
1、将IgE37-C30-FAM、IgE和结合缓冲液混匀，得到反应体系。其中，IgE37-C30-FAM在反应体系中的终浓度为10nM。IgE在反应体系中的终浓度分别为0nM、0.01nM、0.02nM、0.05nM、0.1nM、0.2nM、0.5nM、1nM、2nM、5nM、10nM、20nM、50nM、100nM和200nM。
上述IgE37-C30-FAM为将核酸适配体IgE37的第30个核苷酸C进行FAM标记得到的适配体。
2、将反应体系在冰盒(4℃)中温育20分。
3、采用荧光光度计在25℃下测定IgE37-C30-FAM的荧光各向异性值(r)。
结果如图2所示。图2显示了IgE37-C30-FAM随IgE浓度增加，其荧光各向异性逐渐增加，在高浓度的IgE下，荧光各向异性值达到平台，不再明显改变。检测限为2nM，检测范围为2nM到100nM。
实施例9：3’端标记了FAM的适配体探针对IgE的荧光各向异性(荧光偏振)响应
为了比较探针的响应能力，本发明以3’端标记了FAM的适配体探针(简称IgE37-3’-FAM)作为对照，检测其对IgE的荧光各向异性(荧光偏振)响应。具体步骤如下：
1、将IgE37-3’-FAM、IgE和结合缓冲液混匀，得到反应体系。其中，IgE37-3’-FAM在反应体系中的终浓度为10nM。IgE在反应体系中的终浓度分别为0nM、0.01nM、0.02nM、0.05nM、0.1nM、0.2nM、0.5nM、1nM、2nM、5nM、10nM、20nM、50nM、100nM和200nM。
上述IgE37-3’-FAM为将核酸适配体IgE37的3’端进行FAM标记得到的适配体。
2、将反应体系在冰盒(4℃)中温育20分。
3、采用荧光光度计在25℃下测定IgE37-3’-FAM的荧光各向异性值(r)。
结果如3所示。图3显示了IgE37-3’-FAM随IgE浓度增加，其荧光各向异性没有明显变化。说明3’端标记了FAM的适配体探针在IgE存在时并不能产生明显的荧光各向异性信号变化。
实施例10：采用IgE37-C5-TMR荧光各向异性(荧光偏振)检测IgE
1、将IgE37-C5-TMR、IgE和结合缓冲液混匀，得到反应体系。其中，IgE37-C5-TMR在反应体系中的终浓度为10nM。IgE在反应体系中的终浓度分别为0nM、0.01nM、0.02nM、0.05nM、0.1nM、0.2nM、0.5nM、1nM、2nM、5nM、10nM、20nM、50nM、100nM、200nM和1000nM。
上述IgE37-C5-TMR为将核酸适配体IgE37的第5个核苷酸C进行TMR标记得到的适配体。
2、将反应体系在冰盒(4℃)中温育20分。
3、采用荧光光度计在25℃下测定IgE37-C5-TMR的荧光各向异性值(r)。
结果如图4所示。图4显示了随着IgE浓度的增加，IgE37-C5-TMR的荧光各向异性逐渐降低。检测限为1nM，检测范围为1-500nM。
实施例11：采用IgE37-T10-TMR荧光各向异性(荧光偏振)检测IgE
1、将IgE37-T10-TMR、IgE和结合缓冲液混匀，得到反应体系。其中，IgE37-T10-TMR在反应体系中的终浓度为10nM。IgE在反应体系中的终浓度分别为0nM、0.01nM、0.02nM、0.05nM、0.1nM、0.2nM、0.5nM、1nM、2nM、5nM、10nM、20nM、50nM、100nM、200nM和1000nM。
上述IgE37-T10-TMR为将核酸适配体IgE37的第10个核苷酸T进行TMR标记得到的适配体。
2、将反应体系在冰盒(4℃)中温育20分。
3、采用荧光光度计在25℃下测定IgE37-T10-TMR的荧光各向异性值(r)。
结果如图5所示。图5显示了随着IgE浓度的增加，IgE37-T10-TMR的荧光各向异性逐渐增加。检测限为0.2nM,检测范围为0.2-200nM。
实施例12：采用IgE37-T11-TMR荧光各向异性(荧光偏振)检测IgE
1、将IgE37-T11-TMR、IgE和结合缓冲液混匀，得到反应体系。其中，IgE37-T11-TMR在反应体系中的终浓度为10nM。IgE在反应体系中的终浓度分别为0nM、0.01nM、0.02nM、0.05nM、0.1nM、0.2nM、0.5nM、1nM、2nM、5nM、10nM、20nM、50nM、100nM、200nM和1000nM。
上述IgE37-T11-TMR为将核酸适配体IgE37的第11个核苷酸T进行TMR标记得到的适配体。
2、将反应体系在冰盒(4℃)中温育20分。
3、采用荧光光度计在25℃下测定IgE37-T11-TMR的荧光各向异性值(r)。
结果如图5所示。图5显示了随着IgE浓度的增加，IgE37-T11-TMR的荧光各向异性逐渐增加。检测限为1nM，检测范围为1-500nM。
实施例13：采用IgE37-T17-TMR荧光各向异性(荧光偏振)检测IgE
1、将IgE37-T17-TMR、IgE和结合缓冲液混匀，得到反应体系。其中，IgE37-T17-TMR在反应体系中的终浓度为10nM。IgE在反应体系中的终浓度分别为0nM、0.01nM、0.02nM、0.05nM、0.1nM、0.2nM、0.5nM、1nM、2nM、5nM、10nM、20nM、50nM、100nM和200nM。
上述IgE37-T17-TMR为将核酸适配体IgE37的第17个核苷酸T进行TMR标记得到的适配体。
2、将反应体系在冰盒(4℃)中温育20分。
3、采用荧光光度计在25℃下测定IgE37-T17-TMR的荧光各向异性值(r)。
结果如图5所示。图5显示了随着IgE浓度的增加，IgE37-T17-TMR的荧光各向异性逐渐增加。检测限为1nM，检测范围为1-100nM。
实施例14：采用IgE37-C22-TMR荧光各向异性(荧光偏振)检测IgE
1、将IgE37-C22-TMR、IgE和结合缓冲液混匀，得到反应体系。其中，IgE37-C22-TMR在反应体系中的终浓度为10nM。IgE在反应体系中的终浓度分别为0nM、0.01nM、0.02nM、0.05nM、0.1nM、0.2nM、0.5nM、1nM、2nM、5nM、10nM、20nM、50nM、100nM、200nM和500nM。
上述IgE37-C22-TMR为将核酸适配体IgE37的第22个核苷酸C进行TMR标记得到的适配体。
2、将反应体系在冰盒(4℃)中温育20分。
3、采用荧光光度计在25℃下测定IgE37-C22-TMR的荧光各向异性值(r)。
结果如图5所示。图5显示了随着IgE浓度的增加，IgE37-C22-TMR的荧光各向异性逐渐增加。检测限为1nM，检测范围为1-200nM。
实施例15：采用IgE37-T10-FAM荧光各向异性(荧光偏振)检测IgE的选择性考察
1、将人α凝血酶、IgE37-T10-FAM和结合缓冲液混匀，得到反应体系A；人α凝血酶在反应体系A中的终浓度为100nM。
将IgE、IgE37-T10-FAM和结合缓冲液混匀，得到反应体系B；IgE在反应体系B中的终浓度为20nM。
将IgG、IgE37-T10-FAM和结合缓冲液混匀，得到反应体系C；IgG在反应体系C中的终浓度为1μM。
将血红蛋白、IgE37-T10-FAM和结合缓冲液混匀，得到反应体系D；血红蛋白在反应体系D中的终浓度为1μM。
将溶菌酶、IgE37-T10-FAM和结合缓冲液混匀，得到反应体系E；溶菌酶在反应体系E中的终浓度为1μM。
将空白对照(不含有IgE的缓冲溶液为空白对照)、IgE37-T10-FAM和结合缓冲液混匀，得到反应体系F。
上述各反应体系中，IgE37-T10-FAM的终浓度均为10nM。
2、将反应体系在冰盒(4℃)中温育20分。
3、采用荧光光度计在25℃下测定各反应体系中IgE37-T10-FAM的荧光各向异性值(r)。
结果如图6所示。图6显示：空白样品的荧光各向异性值低，20nM IgE存在时荧光各向异性信号明显增加，而其他蛋白质如凝血酶(100nM)、免疫球蛋白IgG(1μM)、血红蛋白(1μM)或溶菌酶(1μM)存在时IgE37-T10-FAM的荧光各向异性无显著变化。说明采用IgE37-T10-FAM荧光各向异性(荧光偏振)检测IgE具有很好的特异性。
序列表
<110>中国科学院生态环境研究中心
<120>具有灵敏荧光各向异性响应的免疫球蛋白E的荧光染料标记核酸适配体
<160>1
<170>PatentIn version 3.5
<210>1
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<400>1
ggggcacgtt tatccgtccc tcctagtggc gtgcccc 37

Claims (5)

1.用于检测人免疫球蛋白E的核酸适配体，为如下（a1）-（a13）中任一种：
（a1）将核酸适配体IgE37第10位所示的碱基T进行FAM标记得到的适配体；
（a2）将核酸适配体IgE37第11位所示的碱基T进行FAM标记得到的适配体；
（a3）将核酸适配体IgE37第13位所示的碱基T进行FAM标记得到的适配体；
（a4）将核酸适配体IgE37第10位所示的碱基T进行TMR标记得到的适配体；
（a5）将核酸适配体IgE37第9位所示的碱基T进行FAM标记得到的适配体；
（a6）将核酸适配体IgE37第15位所示的碱基C进行FAM标记得到的适配体；
（a7）将核酸适配体IgE37第17位所示的碱基T进行FAM标记得到的适配体；
（a8）将核酸适配体IgE37第23位所示的碱基C进行FAM标记得到的适配体；
（a9）将核酸适配体IgE37第30位所示的碱基C进行FAM标记得到的适配体；
（a10）将核酸适配体IgE37第5位所示的碱基C进行TMR标记得到的适配体；
（a11）将核酸适配体IgE37第11位所示的碱基T进行TMR标记得到的适配体；
（a12）将核酸适配体IgE37第17位所示的碱基T进行TMR标记得到的适配体；
（a13）将核酸适配体IgE37第22位所示的碱基C进行TMR标记得到的适配体；
所述核酸适配体IgE37的核苷酸序列如序列1所示。
2.用于检测人免疫球蛋白E的试剂盒，该试剂盒包括权利要求1所述的核酸适配体。
3.权利要求1所述的核酸适配体或权利要求2所述的试剂盒在如下（c1）-（c3）中任一种中的应用：
（c1）制备识别或结合人免疫球蛋白E的产品；
（c2）制备检测或辅助检测人免疫球蛋白E的产品；
（c3）制备诊断和/或治疗与人免疫球蛋白E相关的疾病的产品。
4.一种检测或辅助检测人免疫球蛋白E的方法，包括如下步骤：
（d1）将权利要求1所述的核酸适配体和待测样品在结合缓冲液中混匀，得到混合溶液；
（d2）将所述混合溶液进行温育；温育结束后，检测荧光各向异性值或荧光偏振值，从而实现对所述待测溶液中人免疫球蛋白E的检测；
所述方法为非疾病诊断和治疗目的。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述对所述待测溶液中人免疫球蛋白E的检测为定量检测或定性检测；
若为定量检测时，按照如下确定所述待测溶液中人免疫球蛋白E的含量：当所述温育结束后，将所测定的荧光各向异性值或荧光偏振值代入标准曲线方程，从而计算所述待测溶液中人免疫球蛋白E的含量；所述标准曲线方程按照如下获得：用系列已知浓度的人免疫球蛋白E标准品溶液替代所述待测溶液进行步骤（d1）-（d2），测得各浓度的人免疫球蛋白E标准品溶液对应的荧光各向异性值或荧光偏振值，从而获得人免疫球蛋白E的浓度与荧光各向异性值或荧光偏振值之间的标准曲线方程；
若为定性检测时，按照如下确定所述待测溶液中是否含有人免疫球蛋白E：当所述温育结束后，若所测定的荧光各向异性值或荧光偏振值显著高于对照值，则所述待测溶液中含有或候选含有人免疫球蛋白E；反之，则所述待测溶液中不含有或候选不含有人免疫球蛋白E；
所述对照值为用不含有人免疫球蛋白E的溶液替代所述待测溶液进行步骤（d1）-（d2）所测得的荧光各向异性值或荧光偏振值。
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