JP2009515543A - 生体分子の親和性を測定する方法 - Google Patents
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Abstract
Description
基準(Measures):Kd、化学量論(n)、ΔG、ΔN
必要量:10μMの溶液1ml、20nモル、50KDaのタンパク質1mg。
基準 :Kon、Koff、Kd
必要量:100nMの溶液2ml、200pモル、50KDaのタンパク質10μg*。
*典型的な一連の実験に基づく計算は、約10nM範囲の結合親和性を確立するのに必要であった。これらの測定に高レベルのタンパク質が必要なのは、「飽和」結合リガンドの濃度に対する必要量が解離定数より4〜10倍高いためである。このことによって、表1に示される典型的な要件が課せられる。
体と繋がり得る。このような形態において、第1の生体分子及び第2の生体分子は同じ固形担体と別々に繋がっている。代替的には、第1の生体分子及び第2の生体分子は、「Y字型」配列で共に繋がり得る。別の実施の形態では、第1の生体分子及び第2の生体分子は、「直鎖分子」配列ではテザーで連結されるが、固形担体と繋がることができない。例えば、第1の生体分子及び第2の生体分子は共に繋がり、溶液中に存在し得る。
136 ppl68-179.を参照されたい)。
内の有効濃度勾配を調べることができる。
は、全内部反射蛍光顕微鏡(TIRF)を用いてもよい(「Surface fluorescence microscopy with evanescent illumination.」 Axelrod, D., Light Microscopy in Biology, Lacey, A. (ed), Oxford University Press, New York, 399-423 (1999))。
リゴヌクレオチドを、アミノシラン及びp−フェニレン1,4ジイソチオシアネート(PDC)等の作用物質で処理したガラス担体に結合させることを伴う。アガロース及びセファロースを含む、テザーを表面に結合させるように修飾することができる他の基板も考慮される。
p for pathway optimization and in vitro metabolic engineering」Science 304, 428-431に記載の方法に従って産生される。次にこの記載は、Roberts, R. W., and Szostak, J. W. (1997)著「RNA-peptide fusions for the in vitro selection of peptides and proteins」 Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A 94, 12297-12302に記載される元の方法に基づいている。要するに、この方法は、mRNA−DNA接合体の3’末端に近接なそのC末端で新生ペプチドを共有結合させるin vitro翻訳反応の使用を伴う。タンパク質生体分子を核酸テザーと連結させるさらなる種類の方法が、上記の方法と同じく優先して用いられ得る(that can be)。これらの方法は一般的に、修飾酵素に付着する対象の生体分子を含む融合タンパク質の合成を伴う(添付の図23に図示され、A種はX種と融合した)。この種のシステムは、Halo−Tag、AGTタグ及びクチナーゼの3つの異なる酵素に関して記載されている(Hodneland他(2002)著「Selective immobilization of
proteins to self-assembled monolayers presenting active site-directed capture ligands」 Proc Natl Acad Sci USA 99, 5048-5052、Keppler他(2004a)著「Labeling of fusion proteins of O6-alkylguanine-DNA alkyltransferase with small molecules in vivo and in vitro」 Methods 32, 437-444、Keppler他(2004b)著「Labeling of fusion proteins with synthetic fluorophores in live cells」 Proc Natl Acad Sci USA 101, 9955-9959、Temple他(2006)著「From genome to proteome: developing expression clone resources for the human genome」 Hum Mol Genet 15 Spec No 1, R31-43)。合成後に、融合酵素(X)は化学合成基質と不可逆的に共有結合する。記載のシステムでは、広範な修飾基質が生成されている。提案された実施態様では、基質種(図23、Y)を組み込むヘッドセットオリゴヌクレオチドが化学合成される。共有結合したオリゴヌクレオチドのこの合成は、一工程での結合及び標識化プロトコルを可能にするドナー又はアクセプタフルオロフォアを組み込むこともできる。
和性の特異的DNA結合タンパク質(例えばλリプレッサー)である場合、新生タンパク質がDNA結合部を介してテザーと連結することができるように、その同族DNA部位を、ヘッドオリゴヌクレオチド複合体に導入してもよい。代替的に、Xはストレプトアビジン等の分子である可能性があり、対応する結合パートナー(この場合ビオチン)はヘッドオリゴヌクレオチドと化学結合する。
図1は、アンカー14を介して第1のテザー12によって表面16と繋がった単一の第1の生体分子10を示す。第1の生体分子10は、実質的に半球形のボリューム18中のアンカー14の周りをテザー12上で自由に動く。ボリューム18の容積は、第1のテザー長19で決定される。
る。半球形のボリューム18及び26は重複し、反応域28を規定する。
本発明による方法に用いる或る形態の繋留生体分子の調製が図5〜図9で示される。これは、可変長の体テザーを3つの「アダプター」オリゴヌクレオチドに連結させることを伴う。ヘッド、体、テイル及びアンカーオリゴヌクレオチドを下記のように組合せて、固定化テザーを生成する。固定化テザーを含有し、第1のテザー長のテザーと第2のテザー長のテザーとの割合が異なるスポットのアレイが生成される。下記のように、それから核酸−タンパク質共有複合体を固定化テザーにハイブリダイズさせる。
テザー体部分は、特に図6で示されるように二本鎖DNA(dsDNA)から生成される。テザー体部分50は、制限酵素ハーフサイト(half-site)X(テザーヘッド部分38又は40のハーフサイトX’に相補的である)を含む一本鎖の上部を有する。テザー体部分の下部領域には、図6で一般的にYと称される一本鎖部分が含まれる。
テザー体部分は、特に図6で示されるように二本鎖DNA(dsDNA)から生成される。テザー体部分50は、制限酵素ハーフサイトX(テザーヘッド部分38又は40のハーフサイトX’に相補的である)を含む一本鎖の上部を有する。テザー体部分の下部領域には、図6で一般的にYと称される一本鎖部分が含まれる。
テザーテイル部分は、dsDNAテザー体部分にアニーリング及びライゲーションするように、及びまた以下に記載される特異的なアンカーオリゴヌクレオチドにアニーリングするように設計される。図6で示されるテザーテイル部分52及び54それぞれが、上部(upper respective)及び下部を含む。一般的にY’と称される上部は、テザー体部分50の一本鎖部分Yに相補的である。一般的に1及び2と称される下部も一本鎖であり、下記のアンカーにアニーリングするように設計される。
個々のテザー生成反応は、第1のフルオロフォア又は第2のフルオロフォアのプールを生じるように、又はテザーが異なるテザーを標識した量子ドットに対して調整される。テザーヘッド部分38、40、テザー体部分50、及びテザーテイル部分52、54は、図6で示されるような溶液中の好適な条件下の従来の条件により集合化され、テザー55及びテザー57を形成する。典型的な条件は、50mMのNaCl、HEPES緩衝液(pH7.5)(10mM)、及び室温であり得る。
集合化テザー55、57は、アンカーによって表面に固定することができる。アンカーは典型的には、一本鎖のアミノ修飾オリゴヌクレオチドである。好ましい実施形態では、固形担体はアンカーオリゴヌクレオチドと共有結合させるのに標準的技法を用いて調製した修飾ガラス基板である。例えば、Chrisey, L. A., Lee, G. U., and O'Ferrall, E. (1996)著「Covalent attachment of synthetic DNA to self-assembled monolayer films」
Nucleic Acids Res. 24:3031-3039を参照されたい。アミノ修飾アンカーオリゴヌクレオチドは、アミノシラン及びp−フェニレン1,4ジイソチオシアネート(PDC)で処理したガラスと結合する(図7)。
a)in vitro翻訳の利用
テザーにハイブリダイズすることができるタンパク質生体分子/核酸接合体は、in vitro翻訳反応によって、上記のJung, G. Y., and Stephanopoulos, G. (2004)に記載された方法に従って生成され、mRNA−DNA接合体の3’末端に近接するそのC末端によって新生ペプチドと共有結合する。それから、テザータンパク質複合体を、これらの固定化アンカーオリゴクレオチドに付着したアニーリングしたテザーのアレイにハイブリダイズさせる。
代替的には、タンパク質核酸複合体は、初めにmRNA−DNA接合体を固定化されたテザーにアニーリングすること、及びin vitro翻訳抽出物を繋留メッセンジャーRNAに加えることで、テザーと結合しながらメッセンジャーRNAを翻訳することによってin situで生成され得る。
別のアプローチにおいて、メッセンジャーRNAを遺伝子操作し、対象のタンパク質生体分子と、第2のタンパク質ドメインXとの間でタンパク質融合を生じさせる。ドメインXは、テザーヘッド部分のオリゴヌクレオチドの操作成分又はテザーのヘッド端に対する親和性が非常に高くなるように設計される。例えば、Xドメインが親和性の高い特異的DNA結合タンパク質(例えばλリプレッサー)である場合、その同種DNA部位は、ヘッドオリゴヌクレオチド複合体に導入され、新生タンパク質がDNA結合部を介してテザーと結び付くのを可能にする。代替的には、Xはストレプトアビジン等の分子であり、その
結合パートナー(この場合はビオチン)が合成中にテザーヘッド部分のオリゴヌクレオチドと化学結合する。
好ましい方法において、核酸生体分子タンパク質接合体は、図9で示されるように核酸成分の3’末端に近接する相補(complimentary)配列(A又はB)によって、ヘッドテザー部分において相補配列にアニーリングされる。これによって、核酸接合体が、in vitro翻訳に典型的なモル濃度(例えば10nM)から、DNA長と、個別に離れて繋がった分子に関する他のパラメータとの間で関連性を示す実験濃度(例えばテザーの重複が全くない200bpのテザーに基づく3.7μM、表2を参照されたい)まで濃縮される。
第1の生体分子Aと第2の生体分子Bとの間の親和性の測定は溶液中で行うこともでき、図12Aで示される単純なスキームを用いて、繋留原理の根底となる基本原理の研究が可能になる。この方法では、A及びBは単一の可撓性テザーの反対端で付着し、両方の分子がテザー長の三次関数として変わる共有の半球形のボリュームを掃引する。単一テザーの長さが低減されると、A及びBで掃引されるボリュームが低減され、ボリューム内のA及びBの有効濃度がテザー長の三次関数として上昇する。このスキームは、A及びBが、A及びBで掃引されるボリュームが正確に重複するように、連結テザーの長さのちょうど半分の表面に固定されると考えることができるという点で、上記のテザー生体分子の表面固定と形態的に類似している。
a)オリゴヌクレオチド標識化及び「ヘッドセット」の調製
試験システムの詳細が図13で示される。親和性が測定された生体分子は、2つの11塩基対の重複が可逆反応で互いを認識するDNAハイブリッドの相補鎖であった。11塩基対の相互作用領域は、太字で示された塩基に組み込まれたフルオロフォアA(アクセプ
タ)及びフルオロフォアD(ドナー)を含有する長い二本鎖DNA分子の一本鎖DNA伸長部である(図13A)。示されたデータでは、ドナーとして用いられたフルオロフォアはAlexa Fluor488であり、アクセプタとして用いられたフルオロフォアはAlexa Fluor555であり、両方ともMolecular Probes製である。両方のフルオロフォアがオリゴヌクレオチド合成中に組み込まれ、続いて標識化オリゴヌクレオチドをアニーリングして、図6Aで示された構造を形成した。フルオロフォア標識した二本鎖オリゴヌクレオチドは、ドナー又はアクセプタ「ヘッドセット」と称され、アニーリングした11bpの親和性領域及び蛍光染料の存在の両方を示す。
図13Bで示され、図12A及び図12Bで図示されたより長く繋がった分子を作製するために、標準的な手順によって、ドナー及びアクセプタヘッドセットのオリゴヌクレオチドを可変長の二本鎖標準DNA領域にライゲーションした。要するに、「ヘッドセット」オリゴヌクレオチドをBstX1制限酵素で切断し、それぞれが自由BstX1及びXba1部位を含有した可変長の「テザー体」DNAにライゲーションした。BstX1−BstX1及びXba−Xbaのライゲーションを用いて、図5Bで示されるような分子を生成した。これらは、分析の前にゲル精製した。ドナー及びアクセプタヘッド群の両方を組み込む直鎖分子の全長は515bp及び710bpであった。
ヘッドセット又は二重標識した直鎖DNA分子を、70mMのNaCl、10mMのトリス(pH8.0)の最終濃度で示された濃度に希釈した。それぞれの溶液6μlを、22×50mmのカバースリップ(Menzel-Glaser, Germany)と共に、多室(multi-chambered)カバースリップ(Stratech Scientific, UK)を用いて作られた50ウェルスライドのウェルの1つに入れた。
Y字型分子におけるそれぞれの生体分子に対する第1のテザー部分及び第2のテザー部分は、テザーが図12Bで示される直鎖分子について拡散して遊離するように、一本鎖DNAに固定される。単一分子のものに比べて、この形態の繋留の主な利点は、第1のテザー部分及び第2のテザー部分が、介在テザーの長さに関係なく自由に相互作用することである。これに対して、直鎖分子は、約90〜120bpの持続長(P)より短い長さでは、分子自体の上に折り畳むことはできない。
最大結合%を決定するために、初めに本発明者等は、以下の手順を用いて、異なるドナー及びアクセプタ濃度で結合したドナーと結合していないドナーとの割合(R)を決定し
た。異なるアクセプタ濃度で結合した減衰スペクトルと結合していない減衰スペクトルとの間の比を経時的に決定し、自由に標識したヘッドセットオリゴヌクレオチドを用いて図14で示されるようにプロットした(示された3つの曲線は、1. 50nMのアクセプタ:50nMのドナー、2. 200nMのアクセプタ:50nMのドナー、3. 600nM:50nMのドナーを表す)。
結合分子ADを形成するための分子Aと分子Dとの間で化学反応が、
A+D⇔AD (1)であり、且つ可逆反応であり、この系が平衡状態であると仮定した場合、本発明者等は解離定数を
kd=[A][D]/[AD] (2)
と定義することができる。
a)自由オリゴヌクレオチドを用いた11bpの重複の結合親和性の決定
これらの研究の最も重要な最初の目標は、後で本発明のナノテザー方法論を用いた結果と比較することができるように、11bpの親和性の正確な値を決定することであった。図13Aで示されたオリゴヌクレオチドに対する解離定数(Kd)を同定するのに、標準的な滴定反応を行った。本質的に、これは固定濃度の蛍光標識したドナーヘッドセットオリゴヌクレオチド(D 50nM)で、及び可変濃度の蛍光標識したアクセプタヘッドセットオリゴヌクレオチド(A 0nM〜5000nM)で複数のサンプルを作製することを伴う。
予測に従ってテザーの長さが低減した場合、結合形態で見出された直鎖テザー分子の割合が増大した(図12A、図12B)。これを試験するために、一端に11bpの重複のドナーヘッドセット及び他端にアクセプタヘッドセットを有する直鎖分子を上記のように作製した。得られたデータは以下の表で表される。直鎖分子におけるFRET/FLIMの予備データは、図16における白丸及び表5で表される(より多くのDNA長に対するより完全なデータセットが図22に示される)。予備データ点は、それぞれ11bpの重複を有する515bp及び710bpの直鎖DNAに対するものである。各分子の末端は一端をAlexa Fluor488で、及び他端をAlexa Fluor555で標識した。各分子は、球面半径がテザー長になるボリュームを有すると仮定することによって決定されるとき、各分子の正確な濃度は5nMであり、各分子の公称繋留濃度は778nM及び2000nMであった。グラフから分かるように、FRET測定値は、絶対分子濃度(5nM)に基づき予測された値より非常に高く、長分子(710bp)よりも短分子(515bp)でより高かった。このデータは、テザーの長さに反比例して、自由端の濃度を高めるテザーと一致している。加えてこのデータは、テザーの長さが変わることによって濃度を変えることができるという特許請求の範囲と一致している。
ータによって、それぞれのテザーの長さに対して測定されたFLIMの%が、図15で示されたものと同じリガンドを遊離濃度で用いることで得られた%に匹敵することが示され、テザーが可撓性直鎖分子によって作られたものと同様のボリューム内にその末端を維持することが指示される。
実験の詳細:
示されたデータの生成は、フルオロフォア標識直鎖DNA分子の調製及び時間分解型FRETの測定を伴った。
a)ヘッドセットの設定
親和性が測定された生体分子が図19に示される。要点は、時間分解型FRETを用いた自由分子及び結合分子の測定に必要な共有結合フルオロフォアと共に、測定される生物学的親和性を構成する2対のオリゴヌクレオチド間の11bpの重複である。これらの分子は、一本鎖DNA重複で重なる同じ11bpを含有する上記の実施例1(図13A)で示されるものと本質的に同じである。これらの配列と本実施例の配列との間の主な違いは、テザー体DNAへのライゲーションを可能にするBstX1ハーフサイトの存在である(図19C、図19D)。
ドナーヘッドセット又はアクセプタヘッドセットに対する2つの構成オリゴヌクレオチド(最終濃度25μM)は、アニーリング緩衝液(70mMの NaCl、10mMのトリス(pH7.4))中でサーマルサイクラー中で1時間かけて90℃から室温まで冷却することによってアニーリングした。
a)データ獲得
ドナーフルオロフォアの吸収バンドにおける波長(約470nm)によって、76Mhzの繰り返し率で、短光パルス(100fs幅)を与える周波数が倍増したTi:Saレーザーを用いてサンプルを分析した。励起光をサンプルに弱く当てて、均一な照射及び1mmのウェル深度での回収を可能にし、カバースリップの蛍光バックグラウンドにわたるシグナル寄与を最小限にした。非線形性及び光損傷を避けるために、励起強度を低く維持した(直径0.4mmのスポットで0.05〜10mW)。顕微鏡の対物レンズから集めた蛍光を、分光計を用いてスペクトル的に分析し、時間積分FRETスペクトルに関しては冷却CCDカメラで検出した。時間分解型FRETに関して、ドナーフルオロフォアの発光極大の周辺(520±5nm)の蛍光を分光計で選別し、時間相関単一光子計数モジュールと接続した単一チャンネルの高速(fast)光電子増倍管(200ps時間分解型)で検出した。バックグラウンド寄与は、同じ励起条件及び検出条件でフルオロフォアが存在しない緩衝溶液から測定され、適切に差し引いてデータとした。
FRETの時間依存性は、図21で示されるドナー及びアクセプタの動態(dynamics:ダイナミクス)で見ることができる。それぞれのトレースの最大蛍光強度は1に正規化される。予想通り、ドナーフルオロフォアがアクセプタフルオロフォアに近接している(11bpの重複配列の結合のため)ことによって、ライゲーションしていないドナーヘッドセットオリゴヌクレオチドに比べて、ドナー蛍光が迅速に低減された(図21A、実線の曲線)。アクセプタフルオロフォアの動態の対応する増強が、ライゲーションしていないアクセプタヘッドセットとの比較によって観察された。重要なことは、重複が0bpの直鎖分子を伴う類似の実験ではエネルギー移動が観察されなかったことであり(図21B)、11bpの重複が蛍光動態の変化に必要であったことを示していた。
方法を用いた測定感度は、単一対の分子の複数回の測定のみを必要とする。しかし、方法の幾つかの実施態様に際して、多くの分子対(100000超)が同時に精査され、シグナル出力を最大にする。
この結果によって、直鎖DNAテザーのそれぞれの末端と繋がった生体分子が有効容積を占め、これらの輪郭長、d(4/3.pi.(d/2)3)の行程体積に基づいて予測されたものに近いことが示される。このデータは、テザーの長さを変えることによって末端の有効濃度が変わることを示している。
a)スライドガラスのフォーマット
一実施形態において、担体のフォーマットは、オリゴヌクレオチドがスプリットピン配列機を用いてスポットでアレイ上にプリントしているスライドガラスである。
代替的なフォーマットにおいて、担体は、単一ビーズとテザーの組合せとの間に特有の関連性を生じるフォーマットで結合するマイクロビーズによって与えられる。このフォーマットによって、マイクロ流体システムにこの技法を適用させることができる。
上記の6のa)項で言及した好ましいアレイスポットの実施態様を利用して、第1の生体分子及び第2の生体分子に対するアミノ末端のオリゴヌクレオチドアンカーが修飾ガラス基板と共有結合する。非特異的なアミノ末端のオリゴヌクレオチド(テザー成分を結合しないように設計した)をアンカーオリゴヌクレオチド結合混合物に滴定し、必要に応じてアンカー間の結合距離を変える。アンカー間の平均距離は、テザー長よりも大きい長さから最大のオリゴヌクレオチドテザーの能力(最大の能力は、1.6nmの平均アンカー間距離に等しい1cm2当たり20ピコモルの結合DNAである、Chrisey, L. A.他(1996))まで変わる。このアンカー間密度は、(例えば互いの平均30nm内に200bp(60nm)のテザーを運ぶのに30nmの平均距離を必要とする(requires))典型的な範囲のアンカー密度で要求されたものを大きく上回る。
a)スライドマウントシステム
本発明の一実施形態において、アッセイの読み出しは、テザーヘッド部分38及び40、又は図10に示されるようなテザーの核酸部分の他の場所に結合した異なるフルオロフォア42、43間のフォスター共鳴エネルギー移動(FRET)の強度である。フルオロフォアに対する励起極大(λ1)に適切なレーザーを用いて、このフルオロフォアを励起させる。フルオロフォア43からの波長極大(λ2)での発光を記録し、FRETのレベルを評価する(図10)。代替的には、フルオロフォア43は、フルオロフォア42からFRETを通って蛍光を消失させるように選択され得る。実際にFRETが起こるには、エネルギーを移動させるために、1つのフルオロフォアの励起分子が、他のフルオロフォアと分子的に近接である必要があり(10nm未満)、他のフルオロフォアが特有の波長で発光する。第1の生体分子及び第2の生体分子も、第1の生体分子と第2の生体分子との間で複合体を形成するために分子的に近接である場合、本発明の方法ではこれが起こる。したがって、繋留生体分子のスポット内に存在する第1の生体分子と第2の生体分子との割合は、FRETの強度で定量化される。適切な制御(例えばフルオロフォア42及びフルオロフォア43単独のスポット)がシグナルレベルを正規化するのに用いられる。
代替的な溶液において、球又は「量子ドット」(Doty, R. C.他Cell Mol. Life Sci. 61 (15) 1843-9)等のナノスケール固体は、単一のフルオロフォアの代わりに繋がれる。これらの接合体は、蛍光分子の数が増えるために、FRET効率が高くなり得る。代替的に、ナノスケール固体によって、蛍光相関分光法が高解像度の光共焦点顕微鏡を用いて行われる。2Kb(0.6μm)より長いテザーに関して、第1の生体分子と第2の生体分子との複合体の形成は、蛍光ドット対の割合が幾つかの分離を示すものに比例するため、
直接的に記録することができる。
十分に特徴付けられた簡単な平衡結合方程式(ミカエリスメンテン)を用いて、第1の生体分子及び第2の生体分子の濃度、並びに結合しているこれらの生体分子の割合に基づき、分子相互作用のパラメータを導く。
本発明の方法のさらなる用途、全てのフォーマット(直鎖、Y字型及び付着)におけるナノテザー生化学的技法としては以下のものが挙げられる。
例えば、相互作用のKdを正確に決定する典型的な実験では、一連のテザー長及びアンカー間距離は、第1の生体分子及び第2の生体分子に関するアンカー及びテザーの適切な組合せを用いて、アレイのスポットとして配置される。これによって、標準的な範囲の濃度が生成される。これらの濃度が、結合した第1の生体分子と第2の生体分子との複合体の割合に対してプロットされ、最大半量結合で必要な第1の生体分子(又は第2の生体分子)の濃度が決定される(この濃度はKdである)。
本発明の方法によって、単一分子Aと、分子B1、B2、B3〜Bnのライブラリーとの間の相互作用がスクリーニングされる。このフォーマットでは、それぞれのスポットがA及びB1だけ、又はA及びB2〜A及びBnで占められている。タンパク質分子に好ましい実施態様では、メッセンジャーRNA(messages)のB1、B2、B3〜Bnの3’末端から特有の(例えばコード)領域を認識するヘッドテザーが生成され、上記に記載のようにコアテザーと結合する。Bnはトランスクリプトーム/プロテオームを潜在的に表すタンパク質のライブラリーであり得る。代替的に、Bnは、相互作用部位、又は低分子化合物から合成ポリマーのライブラリーまでに及ぶ化合物の繋留ライブラリーを規定するのに用いられるペプチドのライブラリーであり得る。
図11で図示されるように、第1の生体分子及び第2の生体分子の初期飽和濃度で共に切断することができる第2の生体分子にアンカー/テザーを用いることによって、Koffを決定することが可能になる。この配置では、第1の生体分子及び第2の生体分子の複合体のレベルの減衰速度は、第2の生体分子に対するテザーの切断後にリアルタイムでモニタリングされる。この種の分析は、Koffを決定するのに表面プラズモン共鳴で用いられるものに類似している。
Kdに近似である第1の生体分子と第2の生体分子との間の結合定数を確立することによって、Kdに近似である第1の生体分子及び第2の生体分子の濃度で結合反応を設定することが可能になり、このようにしてこれらの相互作用の可溶性調節因子に対するスクリーニングに特に高感度になる。これらの調節分子は、集合的に「C」と呼ばれる。Cの例
としては、精製した相互作用タンパク質、A及びBを修飾するタンパク質(例えばキナーゼ)、薬剤分子又はその候補物、AB複合体形成を変える1つ又は複数の成分を含有するタンパク質の複合体混合物(例えば細胞抽出物、血清、他の生体液)が挙げられる。Cは、単一分子の溶液又は化合物の複合混合物(例えば生体抽出物又は生体液)であり得る。C自体は、第3のテザーと繋がり得るか、又は代替的に例えば用途に応じた溶液中で繋がり得ない。Cの存在は、図18に関して以下で示されるような多くのフォーマットで試験することができる。
Claims (74)
- 第1のテザー部分長を有する第1のテザー部分と繋がる第1の生体分子、及び第2のテザー部分長を有する第2のテザー部分と繋がる第2の生体分子の親和性を測定する方法であって、互いに近接した第1の生体分子及び第2の生体分子の結合を決定し、該第1のテザー部分長及び該第2のテザー部分長の少なくとも一方を変え、該第1の生体分子及び該第2の生体分子の結合を決定する、方法。
- 前記第1の生体分子及び/又は前記第2の生体分子が表面と繋がる、請求項1に記載の方法。
- 前記第1の生体分子及び前記第2の生体分子の両方が表面と繋がる、請求項2に記載の方法。
- 前記第1の生体分子及び前記第2の生体分子が一緒に繋がり、前記表面と繋がる、請求項3に記載の方法。
- 前記表面が固形担体で与えられる、請求項2〜4のいずれか1項に記載の方法。
- 前記固形担体がスライドガラスである、請求項5に記載の方法。
- 前記固形担体がマイクロビーズである、請求項5に記載の方法。
- 前記固形担体がアガロース又はセファロースである、請求項5又は7に記載の方法。
- 前記第1のテザー部分及び前記第2のテザー部分が単一のテザーで与えられる、前記いずれか1項に記載の方法。
- それぞれの生体分子の動きによって規定される実質的に半球形の行程体積が重複し、第1の生体分子及び第2の生体分子が互いに結合することができるように、該第1の生体分子及び該第2の生体分子が互いに密接している、前記いずれか1項に記載の方法。
- 前記第1のテザー部分長及び前記第2のテザー部分長を変えることによって、前記第1の生体分子及び/又は前記第2の生体分子の有効濃度を変えることができる、前記いずれか1項に記載の方法。
- 第3の生体分子が影響を及ぼす結合反応の範囲が、前記第1の生体分子と前記第2の生体分子との結合を決定することによって決定される、請求項11に記載の方法。
- 前記テザー又は前記テザー部分長が約30〜12000nmである、前記いずれか1項に記載の方法。
- 前記テザー部分の長さが60〜6000nmである、請求項13に記載の方法。
- 前記テザー部分の長さが60〜2000nmである、請求項14に記載の方法。
- 少なくとも1つのテザー部分が細長いテザー体部分を含む、前記いずれか1項に記載の方法。
- 少なくとも1つのテザー部分が生体分子結合テザーヘッド部分を含む、前記いずれか1
項に記載の方法。 - 少なくとも1つのテザー部分が表面結合部分を含む、前記いずれか1項に記載の方法。
- 少なくとも1つのテザー部分がヌクレオチドを含む、前記いずれか1項に記載の方法。
- 前記テザー部分又はそれぞれのテザー部分が二本鎖DNAを含む、請求項19に記載の方法。
- 前記テザー長が50塩基対〜50kbである、請求項19又は20に記載の方法。
- 前記テザー長が200kb〜20k塩基対である、請求項21に記載の方法。
- 前記テザー部分又はそれぞれのテザー部分の少なくとも一部がmRNA配列の翻訳によって産生される、請求項20〜22のいずれか一項に記載の方法。
- 前記テザー又はそれぞれのテザーが、カーボンナノチューブ、アミロイドフィブリル又はポリマーを含む、請求項1〜19のいずれか1項に記載の方法。
- 前記ポリマーが、DXハイブリッド等のDNA交差複合体である、請求項24に記載の方法。
- 少なくとも1つのテザー部分の弾性が、化学修飾又は物理的結合によって調節される、前記いずれか1項に記載の方法。
- テザー部分がdsDNAを含み、前記テザーの弾性が化学修飾又は相互キレート化(interchelation)によって調節される、請求項26に記載の方法。
- 前記dsDNAが臭化エチジウムで相互キレート化される、請求項27に記載の方法。
- テザーが、溶液中でテザーヘッド部分及びテザーテイル部分にテザー体部分をライゲーションさせることによって形成される、請求項18〜28のいずれか1項に記載の方法。
- テザーが、テザーヘッド部分及びテザーテイル部分を、テザー体部分のそれぞれの末端に化学的に架橋することによって形成される、請求項16〜27のいずれか1項に記載の方法。
- 少なくとも1つのテザー部分がアンカーによって前記固形担体と繋がる、請求項2〜8又は9〜30のいずれか1項に記載の方法。
- 前記アンカーがオリゴヌクレオチドである、請求項31に記載の方法。
- 前記オリゴヌクレオチドが一本鎖アミノ修飾オリゴヌクレオチドである、請求項32に記載の方法。
- 前記第1のテザー及び前記第2のテザーに対するアンカーオリゴヌクレオチドが連続して合成される、請求項32又は33に記載の方法。
- 第1のテザー部分又は第2のテザー部分が、アンカーオリゴヌクレオチドが固定されている固形担体にハイブリダイズされる、請求項32〜34のいずれか1項に記載の方法。
- 前記固形担体が修飾ガラス基板である、請求項31〜35のいずれか1項に記載の方法。
- 前記アミノ修飾アンカーオリゴヌクレオチドが、カップリング剤で処理したガラス担体に固定される、請求項36に記載の方法。
- 前記カップリング剤がアミノシラン又はp−フェニレン1,4ジイソチオシアネート(PDC)である、請求項37に記載の方法。
- 前記半球形の行程体積がそれぞれ、約2×103〜1×1012nm3である、請求項10〜38のいずれか1項に記載の方法。
- ナノリットル〜ゼプトリットル量の前記第1の生体分子及び/又は前記第2の生体分子が用いられる、前記いずれか1項に記載の方法。
- ピコリットル〜アトリットル量の前記第1の生体分子及び/又は前記第2の生体分子が用いられる、請求項40に記載の方法。
- 互いに分子的に近接である前記第1の生体分子と前記第2の生体分子との割合が、相互作用する第1の生体分子と第2の生体分子との割合を示す、前記いずれか1項に記載の方法。
- 結合する第1の生体分子と第2の生体分子との割合が、該第1の生体分子及び該第2の生体分子それぞれに付着するか、又は一体化した第1のフルオロフォアと第2のフルオロフォアとの間のフォスター共鳴エネルギー移動(FRET)の強度によって決定される、前記いずれか1項に記載の方法。
- 前記第1のフルオロフォアが前記第2のフルオロフォアから10nm未満である、請求項43に記載の方法。
- オリゴヌクレオチドアンカー又はテザーが、前記スライドガラスの表面上にアレイ状にプリントされる、請求項6又は9〜44のいずれか1項に記載の方法。
- 前記第1の生体分子及び前記第2の生体分子に対するアミノ末端のオリゴヌクレオチドアンカー又はテザーが前記スライドガラスと共有結合する、請求項45に記載の方法。
- 前記表面が、特異的に繋がった第1の生体分子と第2の生体分子との組合せと結合するマイクロビーズによって与えられる、請求項7〜42のいずれか1項に記載の方法。
- 一対の第1の生体分子及び第2の生体分子が用いられる、前記いずれか1項に記載の方法。
- 前記第1の生体分子及び前記第2の生体分子の少なくとも一方が、mRNA−DNA接合体の3’末端近く、又は3’末端においてそのC末端で新生ペプチドを共有結合させるin vitro翻訳反応によって第1の核酸テザーと連結されたタンパク質又はポリペプチド生体分子である、請求項19〜48のいずれか1項に記載の方法。
- 前記第1の生体分子及び前記第2の生体分子の少なくとも一方が、テザー部分と化学的に架橋するタンパク質又はポリペプチドである、請求項19〜48のいずれか1項に記載
の方法。 - 前記第1の生体分子及び前記第2の生体分子の少なくとも一方が、mRNA−DNA接合体を固定化テザーにアニーリングし、そして、抽出物を繋留メッセンジャーRNAに翻訳することによって、in situで生成するタンパク質又はポリペプチド/核酸複合体である、請求項19〜48のいずれか1項に記載の方法。
- 第1の生体分子又は第2の生体分子と、第2のタンパク質ドメインとの間でタンパク質融合が起こる、請求項17〜50のいずれか1項に記載の方法。
- 前記第2のタンパク質ドメインが前記ヘッドテザー部分に対し高い親和性を有する、請求項52に記載の方法。
- 第1の生体分子及び/又は前記第2の生体分子は、酵素、抗体、受容体等のタンパク質又はペプチド、ペプチド類似体、低分子、多糖、触媒作用的に活性のあるRNA種、またはそれらの一部である、前記いずれか1項に記載の方法。
- 繋がった第1の生体分子及び第2の生体分子のアレイを含有するスライドガラス上で、共焦点顕微鏡、光電子増倍管又はTIRF顕微鏡/光電子増倍管の組合せを用いてFRETが測定される、請求項43又は44に記載の方法。
- 隣接した第1の生体分子と第2の生体分子との割合が、前記第1の生体分子及び前記第2の生体分子の少なくとも一方に付着するか又は一体化するナノスケールの球又は量子ドットで示される、請求項42に記載の方法。
- 第1の生体分子と第2の生体分子との間の相互作用のKdが、或る濃度範囲の該第1の生体分子及び該第2の生体分子に対して結合した第1の生体分子と第2の生体分子との割合を決定すること、並びに該第1の生体分子及び該第2の生体分子の最大半量結合に必要な該第1の生体分子又は該第2の生体分子の濃度(Kd)を決定することによって決定される、前記いずれか1項に記載の方法。
- 第2の生体分子のライブラリーに対する第1の生体分子の親和性が決定される、請求項56に記載の方法。
- 生体分子の前記ライブラリーが、トランスクリプトーム又はプロテオームの少なくともかなりの部分を含む、請求項58に記載の方法。
- 生体分子の前記ライブラリーがトランスクリプトームの少なくとも10%を含む、請求項59に記載の方法。
- 前記第1の生体分子と前記第2の生体分子との間の相互作用に対するKoff値が、該第1の生体分子及び該第2の生体分子の初期飽和濃度を提供すること、第2のテザー部分又はアンカーを切断すること、並びに結合した第1の生体分子及び第2の生体分子のレベルの任意の変化をモニタリングすることによって決定される、請求項1に記載の方法。
- 前記第2のテザー部分又はアンカー部分が酵素的に切断される、請求項61に記載の方法。
- 前記第2のテザー部分又はアンカー部分に組み込まれた光切断部が、該テザー部分を切断するように光切断される、請求項61に記載の方法。
- 前記第1の生体分子と前記第2の生体分子との間の相互作用の調節因子の効果を決定するときの該第1の生体分子と該第2の生体分子との間の相互作用のKd付近に該第1の生体分子及び該第2の生体分子の濃度を設定することを含む、請求項1〜56のいずれか1項に記載の方法。
- 前記調節因子が、タンパク質、薬剤分子、若しくは候補薬剤分子、又はタンパク質の混合物である、請求項64に記載の方法。
- 前記いずれか1項に記載の方法によって第1の生体分子及び第2の生体分子の親和性を決定する装置であって、第1のテザー部分長を有する第1のテザー部分と繋がる第1の生体分子と、第2のテザー部分長を有する第2のテザー部分と繋がる第2の生体分子と、隣接した第1の生体分子及び第2の生体分子の互いの結合を決定する手段と、第1のテザー部分長及び第2のテザー部分長の少なくとも一方を変える手段とを備える装置。
- 前記第1の生体分子及び前記第2の生体分子の両方が表面と繋がる、請求項66に記載の装置。
- 前記表面が固形担体で与えられる、請求項67に記載の装置。
- 前記固形担体がスライドガラスである、請求項68に記載の装置。
- 前記固形担体がマイクロビーズである、請求項68に記載の装置。
- 前記第1のテザー部分及び前記第2のテザー部分が単一のテザーで与えられる、請求項66〜70のいずれか1項に記載の装置。
- 前記第1の生体分子及び前記第2の生体分子が溶液中にある、請求項66または71に記載の装置。
- 前記第1の生体分子及び前記第2の生体分子が、前記固形担体の表面の別々の部分に配置される、請求項68〜71のいずれか1項に記載の装置。
- 前記第1の生体分子及び/又は前記第2の生体分子が、前記表面上にアレイ状にプリントされる、請求項73に記載の装置。
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Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2013525785A (ja) * | 2010-04-20 | 2013-06-20 | ヒューレット−パッカード デベロップメント カンパニー エル.ピー. | 表面増強発光のための自己配列型発光強化装置 |
JP2014533831A (ja) * | 2011-11-16 | 2014-12-15 | コーニンクレッカ フィリップス エヌ ヴェ | イムノアッセイにおける結合キネティクスを高めるための長く剛直なスペーサー |
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Non-Patent Citations (10)
Title |
---|
JPN6012028350; 高松哲郎 編集: バイオイメージングがわかる 細胞内分子を観察する多様な技術とその原理 , 2005, p.55-57, 株式会社羊土社 * |
JPN6012028351; 田村隆明 編集: 遺伝子工学実験ノート 上 DNA取扱いの基本とサブクローニング , 1997, p.108-127, 株式会社羊土社 * |
JPN6012028353; Biopol. Vol.73, 2004, p.597-605 * |
JPN6012028357; Nuc. Acid. Res. Vol.28, No.12, 2000, p.e66 i-v * |
JPN6012028359; J. Am. Chem. Soc. Vol.127, No.9, 2005, p.3115-3119 * |
JPN6012028362; Appl. Environ. Microbiol. Vol.67, No.10, 2001, p.4708-4716 * |
JPN6012028366; Appl. Environ. Microbiol. Vol.69, No.5, 2003, p.2950-2958 * |
JPN6012028367; Appl. Environ. Microbiol. Vol.66, No.9, 2000, p.4004-4011 * |
JPN6012028371; Nuc. Acid. Res. Vol.22, No.16, 1994, p.3418-3422 * |
JPN6012028377; Mol. Cell Vol.8, 2001, p.1129-1135 * |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2013525785A (ja) * | 2010-04-20 | 2013-06-20 | ヒューレット−パッカード デベロップメント カンパニー エル.ピー. | 表面増強発光のための自己配列型発光強化装置 |
US9001324B2 (en) | 2010-07-30 | 2015-04-07 | Hewlett-Packard Development Company, L.P. | Optical fiber surface enhanced raman spectroscopy (SERS) probe |
JP2014533831A (ja) * | 2011-11-16 | 2014-12-15 | コーニンクレッカ フィリップス エヌ ヴェ | イムノアッセイにおける結合キネティクスを高めるための長く剛直なスペーサー |
Also Published As
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