ES2691734T3 - Procedimiento para la identificación de aptámeros - Google Patents

Abstract

Procedimiento para la identificación de aptámeros, que comprende - La puesta en contacto de una mezcla de oligonucleótidos con una estructura objetivo de aptámero, y el enlace de al menos una parte de los oligonucleótidos a la estructura objetivo, - La separación de oligonucleótidos que se han unido a la estructura objetivo de aptámero, de la estructura objetivo de aptámero y de oligonucleótidos no unidos a la estructura objetivo de aptámero, - La amplificación separada espacialmente de todos los nucleótidos que se han unido a la estructura objetivo de aptámero, y la generación de amplificados separados espacialmente para cada oligonucleótido, conteniendo cada amplificado predominantemente una clase de oligonucleótidos, - La asignación de una identificación de emplazamiento específica en cada amplificado separado espacialmente, de modo que cada uno de los amplificados caracterizados es identificable claramente por medio de su identificación de emplazamiento específica, - La secuenciación de oligonucleótidos de los amplificados caracterizados y la asignación de la identificación de emplazamiento específica para el amplificado respecto a la secuencia de la clase de oligonucleótidos en el amplificado, - Producción de un conjunto de amplificados, aplicándose los oligonucleótidos amplificados al menos en un primer soporte, de modo que el conjunto comprende puntos aislados con secuencias uniformes para cada oligonucleótido seleccionado, - El análisis de las propiedades de enlace de todas las clases de oligonucleótidos asignados a los amplificados en el ensayo en la estructura objetivo de aptámero, y la asignación de las propiedades de enlace analizadas a las identificaciones de emplazamiento específicas de los amplificados y las secuencias de las correspondientes clases de oligonucleótidos, - Poniéndose en contacto el conjunto de amplificados con la estructura objetivo de aptámero para el análisis de las propiedades de enlace.

Description

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DESCRIPCION

Procedimiento para la identificacion de aptameros

La presente invencion se refiere a un procedimiento para la identificacion de aptameros.Los aptameros son oligonucleotidos artificiales que se seleccionaron a partir de una bibliotea de oligonucleotidos respecto a sus propiedades de enlace frente a una estructura objetivo deseada, tambien denominada objetivo. El desarrollo de aptameros de ADN se efectua hasta la fecha segun un procedimiento de seleccion in vitro, seleccionandose a partir de una biblioteca compleja de aproximadamente 1015moleculas diferentes aquellas con las mejores propiedades de enlace con el objetivo. El metodo se llama SELEX (Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment), y las bases para el mismo se describieron en 1990 (Ellington, A. D., Szostak, J. W., Nature 346 (1990) 818-822, Tuerk, C., Gold, L., Science 249 (1990) 505-510, Robertson, D. L., Joyce, G. F., Nature 344 (1990) 467-468). El proceso SELEX se aplica en muchas variaciones para la seleccion de aptameros (Stoltenburg, R., Reinemann, C., Strehlitz, B., Biomol. Eng. 24 (2007) 381-403)).

El proceso SELEX para la obtencion de aptameros de ADN es un proceso iterativo. El punto de partida es una biblioteca de ADN sintetizado quimicamente con aproximadamente 1015secuencias diferentes. Las moleculas de ADN aisladas de la biblioteca disponen en este caso de un intervalo de secuencias randomizado, por ejemplo de 20 a 80 nucleotidos de longitud, flanqueado por secuencias de cebador especificas en cada caso en el extremo 3‘ y 5‘, a modo de ejemplo de 18 a 21 nucleotidos de longitud, que son iguales en cada elemento de la biblioteca. Un ciclo de proceso, que se denomina tambien ronda (de seleccion), esta constituido por los pasos:

- Enlace con el objetivo,

- Eliminacion de ADN no enlazado,

- Elucion de ADN enlazado del objetivo,

- Amplificacion del ADN enlazado previamente por medio de PCR,

- Asi como obtencion del ssADN relevante de los productos de PCR.

El resultado de la ronda previa es respectivamente el material de partida para la siguiente ronda. Despues de aproximadamente 6 a 20 horas se debian haber concentrado motivos de secuencia con alta afinidad y especificidad para el objetivo. Las fuerzas impulsoras de este proceso evolutivo son las condiciones de seleccion, que se determinan a traves de las propiedades del objetivo, su concentracion, las condiciones de tamponado de la disolucion, temperatura, tiempo de incubacion, eficiencia de la separacion de ADN no enlazado, introduccion de pasos de seleccion negativos, entre otros. En este caso, la afinidad y la especificidad de aptameros depende de la estringencia de las condiciones, que se puede adaptar en el transcurso de las rondas de seleccion. La funcionalidad de aptameros, es decir, su capacidad de enlace con el objetivo, se fundamenta mediante su estructura tridimensional, que depende de su secuencia primaria, de la longitud de las moleculas de acido nucleico (preferentemente < 100 nucleotidos), y de las condiciones ambientales. Los aptameros forman motivos estructurales tipicos, como tallos, bucles internos, tetrabucles, triplicados, pseudonudos, estructuras de horquilla, complejos de beso o estructuras G-cuadruplex. En presencia del objetivo, los aptameros estan sujetos a modificaciones de conformacion adaptativas, de modo que su plegamiento tridimensional forma un punto de enlace especifico para el objetivo (ajuste inducido). El enlace entre aptamero y objetivo se basa en diferentes interacciones intermoleculares, como compatibilidad estructural, apilamiento de anillos aromaticos con las bases de acido nucleico de los aptameros, interacciones electrostaticas entre grupos cargados y enlaces por puentes de hidrogeno.

Se desarrollaron aptameros para objetivos muy diferentes: moleculas inorganicas y reducidas, peptidos, proteinas, hidratos de carbono, antibioticos. Tambien se emplearon objetivos completos, como celulas y organismos completos, asi como mezclas objetivo, para la seleccion de aptameros. Tambien se pueden emplear objetivos toxicos y no inmunogenos, que no son accesibles, a modo de ejemplo, a una produccion de anticuerpos. Tras su seleccion y analisis secuencial se efectua la produccion de aptameros por medio de sintesis quimica, asegurandose la reproducibilidad, y no estando la cantidad limitada en principio. Las modificaciones de aptameros son faciles de realizar, por ejemplo para la inmovilizacion sobre superficies de sensor o chip, para la cuantificacion o para la mejora de la estabilidad. El enlace de aptamero es reversible, y los aptameros desnaturalizados son regenerables. Ambas caracteristicas son grandes ventajas para la aplicacion analitica de aptameros. Los aptameros muestran una gran similitud con anticuerpos respecto al comportamiento de enlace. Muchas de sus propiedades hacen de los aptameros alternativas serias, o incluso superiores, a anticuerpos. Esto radica principalmente en la desnaturalizacion reversible, que justifica la almacenabilidad claramente mejor y la estabilidad quimica superior.

Ademas del procedimiento SELEX son conocidos otros dos procedimientos para la seleccion de aptameros. El procedimiento Monolex de la firma Aptares parte igualmente de una biblioteca de oligonucleotidos. Tras una adsorcion por afinidad de la biblioteca de oligonucleotidos se efectua una clasificacion por afinidad de oligonucleotidos en un lecho de adsorcion y una separacion de oligonucleotidos de diferente afinidad en diferentes reservas. Estas reservas se amplifican respectivamente, y se presentan entonces reservas de aptameros policlonales de afinidad determinada en cada caso. Para la obtencion de aptameros aislados (monoclonales) se clona y se secuencia la respectiva reserva de aptameros policlonales (
http://www.aptares.net/html/technologie.html).

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La firma NOXXON emplea un procedimiento para la produccion de especulomeros para el desarrollo de aptameros de ARN como productos farmaceuticos. Con este procedimiento se desarrollan ligandos de ARN, los denominados especulomeros, que contienen L-ribosa en lugar de D-ribosa como componente sacarico. La incorporacion de L- ribosa en el esqueleto de azucar-fosfato del acido nucleico provoca que la estructura tridimensional de un L-ARN se comporte como imagen especular respecto a la estructura de su D-ARN correspondiente. Las moleculas de L-ARN estan protegidas contra la disociacion enzimatica debida a nucleasas, y de este modo son claramente mas estables que el correspondiente D-ARN. En primer lugar se seleccionan ligandos para el enantiomero de la verdadera estructura objetivo bajo empleo de la evolucion in vitro. Si estos ligandos se han hallado, clonado, secuenciado y caracterizado, se sintetiza el correspondiente acido L-ribonucleico, el especulomero, por via quimica. A continuacion, mediante determinacion de las propiedades de enlace del ligando frente a su verdadera molecula objetivo, y tambien frente a su enantiomero, se pueden sacar conclusiones sobre la afinidad y la especificidad del especulomero. El documentoWO 2009/151688da a conocer la produccion de una mezcla de aptameros especial y procedimientos para utilizar esta mezcla de aptameros para la seleccion de buenos enlazantes. En este procedimiento, la mezcla de aptameros para el paso de seleccion esta unida a un microchip. Como se ha mencionado anteriormente, en un proceso SELEX se debian haber concentrado motivos de secuencia con alta afinidad y especificidad para el objetivo despues de aproximadamente 6 a 20 rondas. A continuacion, los oligonucleotidos enlazantes de la reserva de oligonucleotidos concentrada se clonan y se transforman para el aislamiento, por ejemplo en E. coli. Despues siguen otros pasos, como la determinacion de transformantes positivos respecto a la exactitud del ADN de plasmido (pADN) y del inserto incorporado (producto de PCR) y a la preparacion de pADN. En este procedimiento son desfavorables el gasto de tiempo relativamente elevado para recorrer hasta 20 rondas de SELEX y los extensos trabajos a continuacion del proceso SELEX. Si durante una de las hasta 20 rondas de SELEX se eligieran las condiciones de seleccion de modo desfavorable, se podrian perder buenos enlazantes. Tras una clonacion, en el procedimiento anterior la seleccion de los aptameros a caracterizar ulteriormente se efectua de manera accidental, de modo que tambien se pueden perder algunos buenos enlazantes, ya que estos no se seleccionan casualmente, no se caracterizan adicionalmente y, por lo tanto, no se identifican como aptameros. Una tarea de la presente invencion consistia en poner a disposicion un procedimiento que no presentara estos inconvenientes.

Esta tarea se soluciona mediante un procedimiento para la identificacion y/u obtencion de aptameros, que comprende

- La puesta en contacto de una mezcla de oligonucleotidos con una estructura objetivo de aptamero, y el enlace de al menos una parte de los oligonucleotidos a la estructura objetivo,

- La separacion de oligonucleotidos que se han unido a la estructura objetivo de aptamero, de la estructura objetivo de aptamero y de oligonucleotidos no unidos a la estructura objetivo de aptamero,

- La amplificacion separada espacialmente de todos los nucleotidos que se han unido a la estructura objetivo de aptamero, y la generacion de amplificados separados espacialmente para cada oligonucleotido, conteniendo cada amplificado predominantemente una clase de oligonucleotidos,

- La asignacion de una identificacion de emplazamiento especifica en cada amplificado separado espacialmente, de modo que cada uno de los amplificados caracterizados es identificable claramente por medio de su identificacion de emplazamiento especifica,

- La secuenciacion de oligonucleotidos de los amplificados caracterizados y la asignacion de la identificacion de emplazamiento especifica para el amplificado respecto a la secuencia de la clase de oligonucleotidos en el amplificado,

- Produccion de un conjunto de amplificados, aplicandose los oligonucleotidos amplificados al menos en un primer soporte, de modo que el conjunto comprende puntos aislados con secuencias uniformes para cada oligonucleotido seleccionado,

- El analisis de las propiedades de enlace de todas las clases de oligonucleotidos asignados a los amplificados en el ensayo en la estructura objetivo de aptamero, y la asignacion de las propiedades de enlace analizadas a las identificaciones de emplazamiento especificas de los amplificados y las secuencias de las correspondientes clases de oligonucleotidos, poniendose en contacto el conjunto de amplificados con la estructura objetivo de aptamero para el analisis de las propiedades de enlace.

Este procedimiento para la identificacion/obtencion de aptameros transcurre con velocidad sensiblemente mayor que el proceso SELEX. Ya no es necesario llevar a cabo varias rondas de proceso, sino que ya es suficiente una seleccion simple. Los extensos trabajos a continuacion de SELEX, la clonacion para el aislamiento de oligonucleotidos enlazantes de la reserva concentrada, se suprimen. Tras la clonacion, en el procedimiento convencional la seleccion de los aptameros a caracterizar ulteriormente se efectua de manera accidental, de modo que se pueden “perder“ buenos enlazantes individuales, ya que estos no se seleccionan casualmente, ya no se caracterizan y no se identifican como aptameros. Por el contrario, en el nuevo proceso aqui descrito se aislan, se secuencian y se analizan todos los oligonucleotidos enlazados de modo muy similar. Los aptameros se seleccionan como enlazantes con las maximas afinidades al final del proceso en base a las afinidades medidas. Por consiguiente, debido a su estructura, el nuevo metodo alcanza un rendimiento elevado y permite una mejor valoracion de los aptameros obtenidos.

Con el procedimiento es posible identificar aptameros en un tiempo menor y determinar simultaneamente su

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secuencia y su constante de enlace con el objetivo dentro del proceso. En este caso, el procedimiento ofrece todas las ventajas del procedimiento SELEX. No obstante, ya despues de un primer paso de seleccion (enlace, eliminacion de no enlazantes, elucion de enlazantes del objetivo), que se puede llevar a cabo segun los pasos de un procedimiento SELEX conocido, en este caso existe la posibilidad de concluir el proceso e identificar aptameros enlazantes. Mediante el empleo opcional de otro paso de enlace y seleccion para la valoracion, aun durante la preparacion de la secuenciacion se da ademas la posibilidad de una especificidad claramente mas elevada que en el caso de SELEX.

Otras ventajas que se pueden obtener con la invencion y/o con formas de realizacion especiales descritas a continuacion son:

- La posibilidad de secuenciacion paralela e investigacion de las propiedades de enlace de un numero muy elevado de aptameros potenciales. La secuenciacion por medio de variantes descritas a continuacion permite el analisis secuencial paralelo de hasta 106oligonucleotidos. En un paso unico se pueden seleccionar, analizar y validar hasta 106oligonucleotidos, de modo que al final se puede encontrar un grupo de aptameros mediante comparacion de afinidad en el caso de incubacion con el objetivo.

- En el caso de amplificacion separada espacialmente, como se emplea en este caso, cada oligonucleotido se amplifica por separado. En la amplificacion previa, los oligonucleotidos compiten entre si tambien en la amplificacion, de modo que se pueden perder oligonucleotidos con mala eficiencia de amplificacion, independientemente de sus calidades de enlace.

En principio se considera que los pasos de procedimiento enumerados no tienen que tener lugar forzosamente en el orden indicado anteriormente. Si es razonable y posible tecnicamente, se puede variar el orden. Los pasos se pueden variar en especial en el orden que tiene lugar tras los pasos a) puesta en contacto de una mezcla de oligonucleotidos con una estructura objetivo de aptamero predeterminada, y b) la union de al menos una parte de los oligonucleotidos a la estructura objetivo, y la separacion de oligonucleotidos que se han unido a la estructura objetivo de aptamero. A modo de ejemplo, la amplificacion separada espacialmente, la asignacion a una identificacion especifica, la secuenciacion y el analisis de las propiedades de enlace de la estructura objetivo de aptamero pueden tener lugar en diferentes ordenes temporales, o varios de estos pasos pueden tener lugar simultaneamente, como se evidencia a partir de las siguientes explicaciones y los siguientes ejemplos de realizacion.

Los pasos enumerados anteriormente se explican solo en particular.

El concepto "aptameros" designa oligomeros de acido nucleico de hebra simple, que se pueden unir especificamente a una estructura objetivo o a una molecula objetivo, tambien denominada objetivo, a modo de ejemplo a una proteina, a compuestos de bajo peso molecular, como sustancias organicas, aminoacidos y antibioticos, acidos nucleicos, particulas viricas o (micro)organismos, asi como otros objetivos citados de modo preliminar. El enlace de aptamero-objetivo se efectua como se cita de modo preliminar.

Como sustancia de partida se emplea una mezcla de oligonucleotidos en el procedimiento. El concepto “mezcla“ designa una pluralidad de oligonucleotidos con diferentes secuencias.

Los oligonucleotidos presentan preferentemente una o varias zonas variables, preferentemente zonas internas variables. Ademas pueden estar presentes regiones de cebador, preferentemente en el extremo 5‘ y 3‘ de los oligonucleotidos. Una zona variable interna, de las que pueden estar presentes una o varias, es, a modo de ejemplo, una zona secuencial randomizada, en especial una zona que es o presenta una secuencia accidental combinatoria. Una zona variable interna tiene, a modo de ejemplo, una longitud de 10-80, preferentemente 20-80, de modo aun mas preferente 40-80 nucleotidos, indicandose estas longitudes solo de manera ejemplar y no representando estas una limitacion. Entre dos zonas variables puede estar dispuesta una zona con una secuencia determinada. Un ejemplo no limitante a tal efecto es una secuencia capturadora, que se explica aun a continuacion.

Las regiones de cebador sirven como puntos de enlace de cebador para una amplificacion, preferentemente una amplificacion de PCR. Alternativamente o de manera adicional, los cebadores pueden servir para el enlace de los oligonucleotidos a una fase solida, a modo de ejemplo placas, perlas, chips u otros soportes, como se describen aun a continuacion. Ademas, a traves del cebador se pueden introducir modificaciones adicionales, como moleculas fluorescentes, marcadores de biotina, enzimas, etc, durante o tras el procedimiento.

La sustancia de partida, es decir, la mezcla de partida de oligonucleotidos, se denomina tambien biblioteca de partida, biblioteca de oligonucleotidos, biblioteca o biblioteca aleatoria combinatoria. Los oligonucleotidos con la estructura descrita anteriormente se pueden adquirir de proveedores comerciales. La variabilidad de una biblioteca se situa, a modo de ejemplo, en el intervalo de aproximadamente 1015moleculas diferentes.

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En el caso de los oligonucleotidos se puede tratar de ADN de hebra simple (ssADN), RNA, ssADN modificado o ARN modificado o moleculas sinteticas analogas a acidos nucleicos (por ejemplo APN). En el transcurso del procedimiento, en pasos de procedimiento separados, en especial en pasos de amplificacion, se presentan contrahebras complementarias a los oligonucleotidos. Una vez concluida la amplificacion, en los amplificados estan contenidos los oligonucleotidos y sus contrahebras complementarias, a partir de los cuales se obtiene el ssADN deseado para investigaciones ulteriores respecto al enlace con el objetivo. Para la investigacion del enlace con el objetivo se analizan las hebras separadas de oligonucleotido, en especial ssADN.

El procedimiento tambien es apropiado en especial para la aplicacion para acidos nucleicos naturales y artificiales, en especial para especulomeros, moleculas sinteticas analogas a ADN (APN), etc. El principio de los especulomeros se explico al inicio.

La puesta en contacto de los oligonucleotidos con la estructura objetivo de aptamero, el enlace de al menos una parte de los oligonucleotidos con la estructura objetivo y la separacion de los oligonucleotidos que se han unido a la estructura objetivo de aptamero, de la estructura objetivo de aptamero y de oligonucleotidos no unidos a la estructura objetivo de aptamero, se puede efectuar de cualquier modo, en especial como se sabe ya por los procesos SELEX del estado de la tecnica. A continuacion se enumeran algunos procedimientos de manera ejemplar, sin que esto limite el procedimiento de ningun modo.

A modo de ejemplo, el objetivo puede estar unido a una fase solida y se puede poner en contacto con oligonucleotidos liberados, uniendose al objetivo una parte de oligonucleotidos, los aptameros potenciales. La fase solida puede presentar propiedades que permiten una facil separacion de la fase liquida con oligonucleotidos no unidos al objetivo. A modo de ejemplo, la fase solida puede ser magnetica, a modo de ejemplo en forma de particulas magneticas (perlas magneticas). Con un paso de elucion, como se conoce ya por procedimientos SELEX, los oligonucleotidos unidos al objetivo se pueden eluir de la fase solida y del objetivo.

En otra variante, una denominada secuencia de captura esta unida a una fase solida, preferentemente en forma de particulas magneticas. Un enlace de oligonucleotidos de hebra simple de la biblioteca de partida con la fase solida se efectua a traves de la secuencia de captura (capture sequence). La secuencia de captura es complementaria a una zona dentro de los oligonucleotidos de hebra simple de la biblioteca de partida. Con ayuda de la secuencia de captura tiene lugar un enlace reversible entre capturador y oligonucleotidos. El objetivo se presenta libre en disolucion y se encuentra disponible para un enlace con los oligonucleotidos, los aptameros potenciales. Los oligonucleotidos especificos para el objetivo se acoplan mediante formacion de una estructura bi- o tridimensional definida de la secuencia capturadora, y se pueden encontrar en disolucion junto con el objetivo. La fase solida, a la que permanecen unidos los oligonucleotidos especificos para el objetivo se puede separar junto con estos oligonucleotidos.

Otras variantes son metodos de enlace que se emplean en las diferentes modificaciones de procesos SELEX, por ejemplo el enlace entre celulas completas y la biblioteca de oligonucleotidos, a continuacion separacion de los no enlazantes por medio de centrifugado y elucion de enlazantes por medio de calor. Se incluye una sinopsis de procedimientos SELEX en Stoltenburg, R.; Reinemann, C.; Strehlitz, B. (2007) SELEX - a (r)evolutionary method to generate high affinity nucleic acid ligands. Biomolecular Engineering 24, 381-403.

Si el objetivo esta unido a una fase solida, antes de los pasos de procedimiento descritos anteriormente se puede efectuar una seleccion negativa para la fase solida, es decir, una seleccion contra la fase solida sin objetivo enlazado.

Antes de los pasos de procedimiento descritos anteriormente se puede efectuar tambien una seleccion con otras moleculas inespecificas. Asimismo se pueden llevar a cabo selecciones complementarias con moleculas objetivo analogas pero indeseables, para empobrecer en enlazantes correspondientes antes de la seleccion a partir de la biblioteca de oligonucleotidos.

Amplificacion separada espacialmente

El concepto “amplificacion separada espacialmente de todos los oligonucleotidos" tiene el siguiente significado: un oligonucleotido aislado es un oligonucleotido con una determinada secuencia. Todos los oligonucleotidos se amplifican de modo que cada oligonucleotido aislado se amplifica por separado espacialmente de los demas, y el amplificado obtenido permanece asimismo separado espacialmente de todos los demas amplificados. De este modo no tiene lugar un entremezclado de los amplificados aislados.

En este caso, un amplificado comprende una pluralidad de oligonucleotidos, que se obtienen mediante la amplificacion de un oligonucleotido aislado con una determinada secuencia. Cada amplificado contiene

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predominantemente, y segun medios de amplificacion y condiciones, principalmente o casi de manera exclusiva, o exclusivamente, una serie de oligonucleotidos con una secuencia que coincide con la secuencia del oligonucleotido aislado empleado como molecula de partida (matriz). Por consiguiente, el concepto “clase“ se refiere a la secuencia de un oligonucleotido. Una clase esta caracterizada por una secuencia determinada. El amplificado contiene contrahebras complementarias a los oligonucleotidos tras el paso de amplificacion. Segun condiciones externas, como por ejemplo temperatura, pH, contenido en sales, etc., se presentan hebras dobles. Ademas de una determinada clase de oligonucleotidos con secuencia identica, pueden estar contenidos oligonucleotidos con secuencia divergente, y correspondientes contrahebras complementarias, que se forman mediante error de copia en la amplificacion o adicion e incorporacion de monomeros artificiales. No obstante, en esta descripcion, el concepto amplificado se utiliza tambien para un producto a partir del cual se eliminaron las contrahebras de oligonucleotidos, por ejemplo para la secuenciacion o para el analisis del enlace con el objetivo de oligonucleotidos. En este sentido, el concepto “amplificado“ puede significar tambien una pluralidad de oligonucleotidos de hebra simple, que comprenden o estan constituidos predominantemente, casi de manera exclusiva o exclusivamente, por una clase de oligonucleotidos con secuencia identica.

Para la amplificacion separada espacialmente se puede aplicar cualquier procedimiento de amplificacion conocido, siendo preferente la reaccion en cadena de polimerasa (PCR).

La amplificacion separada espacialmente tiene lugar en especial en zonas limitadas espacialmente, que pueden estar completamente cerradas o no. Tales zonas limitadas se pueden generar en especial mediante limites de fases, como por ejemplo estructuras de cuerpo solido y liquidos, o limites de fase lfquido-lfquido o fases liquidas-gaseosas. Son ejemplos de cavidades limitadas espacialmente delimitaciones locales que facilitan la difusion en determinadas direcciones y dificultan la misma en otras direcciones, como por ejemplo una disposicion de columnas o surcos, estructuras porosas o estructuras moleculares que prefieren, o bien limitan una difusion en determinados sentidos, como por ejemplo hidrogeles, aerogeles o superficies polimericas. Tambien son posibles nanoestructuras o estructuras moleculares ordenadas o desordenadas, como ramas polimericas, dendrimeros, conjuntos de particulas, membranas filtrantes, membranas lipidicas (esfericas o planas), para implementar zonas limitadas espacialmente. Del mismo modo, mediante fuerzas y campos, o una combinacion de limites de fases y campos/fuerzas, se pueden crear correspondientes zonas separadas espacialmente, como por ejemplo campos electricos que limitan la difusion en una zona o mantienen unido el ADN a la superficie.

En formas de realizacion especiales, la amplificacion separada espacialmente es una amplificacion en una emulsion, una amplificacion digital, una amplificacion en una cavidad o una amplificacion en una fase solida, en especial una PCR en emulsion, una PCR digital o una PCR en fase solida.

Por el estado de la tecnica son conocidos procedimientos para la amplificacion en una fase solida (amplificacion en fase solida). En este caso se obtienen amplificados de distribucion casual en una superficie de fase solida, a modo de ejemplo una superficie plana. A traves de secuencias de enlace apropiadas, mediante apareamiento de bases, los oligonucleotidos pueden estar unidos a secuencias complementarias, que estan enlazadas a la superficie de fase solida. Las secuencias complementarias son en especial secuencias de cebador para una PCR. Los cebadores directos e inversos estan unidos preferentemente a la superficie de fase solida a traves de enlace covalente para la amplificacion de oligonucleotidos. Se anaden los medios de amplificacion requeridos para la PCR. La proporcion de cebadores respecto a plantillas, asi como el tiempo de PCR, determinan la densidad de amplificados obtenida en la superficie de fase solida. Con tal procedimiento se obtienen en consecuencia amplificados separados espacialmente en la superficie de fase solida. Como fase solida se emplean frecuentemente placas de vidrio. Se describen amplificaciones de fase solida en L. Metzker et al., Nature Reviews, Genetics, Vol. 11, 2010, 31-46, y la literatura aqui citada sobre amplificaciones en fase solida, como por ejemploM. Fedurco et al., Nucleic Acids Res. 34, e22 (2006).

Una variante conocida de la amplificacion en fase solida es la denominada “amplificacion puente“, que se ofrece, a modo de ejemplo, por la firma Illumina en su secuenciador SOLEXA. En una superficie de fase solida estan unidos mediante enlace covalente cebadores directos e inversos para los oligonucleotidos a amplificar. Una vez efectuado el enlace con la superficie tiene lugar una amplificacion de los oligonucleotidos. La nueva hebra complementaria generada de este modo esta unida a la superficie mediante enlace covalente, y dispone de un punto de enlace adicional en su extremo no enlazado. Este se puede unir ahora igualmente al cebador apropiado en la superficie e iniciar una amplificacion ulterior, que genera por su parte una nueva hebra de oligonucleotido, que esta enlazada en un extremo y posee la secuencia de enlace original en el otro extremo libre. De este modo se generan exponencialmente un numero creciente de hebras que estan unidas solidamente en un extremo y cuyo extremo adicional permite un enlace provisional con la superficie. Durante la amplificacion, una hebra esta unida solidamente a un extremo (mediante enlace covalente) y suelta en el otro extremo (mediante enlace no covalente), y genera de este modo un “arco“ molecular, que se denomina puente. A este respecto, el documento US 6,300,070 describe generalmente la amplificacion puente, y Abrams et al., Diagnostic and Gene Detection Ch. (1997) 171-189, describe el empleo de una amplificacion puente para la secuenciacion. Este procedimiento se puede ampliar en el sentido de

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eliminar la contrahebra tras la reaccion de amplificacion y efectuar una secuenciacion, y realizar una medicion de enlace contra el objetivo tras la secuenciacion.

Si para la amplificacion en una fase solida se emplean sistemas disponibles comercialmente, a los que estan unidas determinadas secuencias de cebador, en el procedimiento segun la invencion se emplean preferentemente oligonucleotidos que son compatibles con estas secuencias de cebador, o bien presentan puntos de enlace compatibles con estos cebadores. Si este no es el caso, se efectua un paso de ligazon con los denominados adaptadores, que son compatibles con los cebadores en la fase solida. Opcionalmente, los oligonucleotidos se pueden prolongar tambien en posicion terminal por medio de una amplificacion de modo correspondiente. No obstante, esto podria influir sobre las caracteristicas de enlace. Por lo tanto, es preferente que las secuencias flanqueantes de oligonucleotidos sean compatibles con las secuencias de cebador de los procesos de secuenciacion comerciales.

La amplificacion en emulsion es preferentemente una PCR en emulsion. Como base sirve preferentemente una emulsion de agua en aceite. Las gotitas de fase acuosa sirven como microreactor. Las concentraciones para esta emulsion de agua en aceite se seleccionan de modo que, en el caso ideal, en cada gotita de fase acuosa este incluido exactamente un oligonucleotido en cada caso. Ademas, en la fase acuosa estan contenidos los medios de amplificacion necesarios, como imprimador y polimerasa, para la PCR. Una vez realizada un PCR se obtienen amplificados separados espacialmente, ya que las gotitas de fase acuosa se presentan separadas en la fase oleaginosa. Cada gotita de fase acuosa contienen predominantemente una clase de oligonucleotidos y contrahebras complementarias. Tal variante de PCR en emulsion se describe, a modo de ejemplo, en M. Nakano et al., Journal of Biotechnology 102 (2003) 117-124 und Williams et al., Nature Methods, Vol. 3, No. 7 (2006), 545-550.

En una forma de realizacion de la invencion, los oligonucleotidos se unen a particulas de fase solida antes de, durante o tras la amplificacion separada espacialmente, obteniendose particulas de fase solida a las que esta unido respectivamente solo un amplificado con una clase de oligonucleotidos. En este caso, el oligonucleotido amplificado o la contrahebra complementaria, o ambos, pueden estar unidos opcionalmente a una particula mediante enlace covalente.

Esta forma de realizacion se puede combinar, a modo de ejemplo, con una variante de PCR en emulsion, en la que, ademas de un sistema bifasico, como agua en aceite, se emplean adicionalmente particulas de fase solida. En esta variante de una PCR en emulsion, a traves de secuencias de enlace apropiadas, los oligonucleotidos se unen a secuencias complementarias, que estan unidas a la superficie de particulas de fase solida. Los oligonucleotidos se mezclan en fase acuosa junto con medios de amplificacion de PCR y particulas de fase solida, que tambien se denominan perlas, y se emulsionan en aceite, de modo que se produce una emulsion de agua y particulas en aceite. Para esta emulsion de agua en aceite, las concentraciones se seleccionan de modo que, en el caso ideal, en cada gotita de agua esta incluida exactamente una hebra de ADN y exactamente una particula en cada caso. A la superficie de la particula esta unido covalentemente un cebador, un par de cebadores (directo e inverso). Si solo esta unido un cebador (directo o inverso), el otro cebador se pone a disposicion disuelto en fase acuosa. Si esta presente un par de cebadores, la amplificacion transcurre correspondientemente a la amplificacion puente descrita anteriormente. En el caso de amplificacion puente en la perla, si se desea, tambien tras la reaccion se pueden desprender de nuevo uno de los cebadores y hebras unidas covalentemente por medio del cebador (olibonucleotidos, contrahebras). En consecuencia, en todos los casos se puede cubrir la particula total con copias de oligonucleotido original mediante la amplificacion. Tras la amplificacion, los oligonucleotidos, las contrahebras, o ambos, pueden estar unidos a la superficie mediante enlace covalente. Los oligonucleotidos unidos mediante enlace no covalente o las contrahebras unidas mediante enlace no covalente se pueden transformar en fase liquida mediante condiciones ambientales apropiadas (contenido en sales, temperatura, etc.), permaneciendo en este caso como hebras simples sobre la particula los oligonucleotidos unidos mediante enlace covalente o las contrahebras unidas mediante enlace covalente. En una forma de realizacion preferente, tras una amplificacion y una eliminacion de las contrahebras, una pluralidad de oligonucleotidos estan unidos a la particula mediante enlace covalente. En esta PCR especial es posible amplificar exactamente un oligonucleotido en cada caso, de modo que se “copia“ millones de veces en una bola polimerica (perla). Por lo tanto, al final de la PCR en emulsion se presentan millones de perlas, portando cualquiera de ellas millones de copias identicas de otro oligonucleotido en cada caso. Se describen polimerizaciones y amplificaciones en emulsion, incluyendo particulas de fase solida (perlas), en L. Metzker et al., Nature Reviews, Genetics, Vol. 11, 2010, 31-46, y la literatura citada en la misma, como por ejemplo D. Dressman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2003) 100, 8817-8822, asi como enF. Diehl et al., Nature Methods (2006), Vol.3 N2 7, 551-559.

Si para la amplificacion en emulsion se emplean sistemas con particulas disponibles comercialmente, a los que estan unidas determinadas secuencias de cebador, en el procedimiento segun la invencion se emplean preferentemente oligonucleotidos que son compatibles con estas secuencias de cebador, o bien presentan puntos de enlace compatibles con estos cebadores. Si este no es el caso, se efectua un paso de ligazon con los denominados adaptadores, que son compatibles con los cebadores del sistema disponible comercialmente. O bien los oligonucleotidos se pueden hacer compatibles directamente mediante la seleccion apropiada de cebadores

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durante una PCR. En este caso, estos cebadores contienen secuencias complementarias o identicas, tanto para el sistema comercial como tambien para la biblioteca de oligonucleotidos.

En una PCR digital (dPCR) se distribuyen oligonucleotidos en un gran numero de zonas de amplificacion separadas espacialmente, y la PCR se lleva a cabo por separado en cada zona. En el caso ideal, una zona contiene aun un oligonucleotido aislado (correspondientemente a un 1) o no contiene oligonucleotido (correspondientemente a un 0). Una vez puesta en practica la PCR, las zonas contienen correspondientemente un amplificado de un determinado oligonucleotido o no contienen amplificado. Para el aislamiento de oligonucleotidos individuales en zonas separadas se pueden emplear, a modo de ejemplo, placas con picopocillos, placas con micropocillos, capilares o conjuntos de cavidades miniaturizadas o superficies unidas a acido nucleico. Tambien la PCR en una emulsion, como se describe anteriormente, se calcula ocasionalmente para la PCR digital. La puesta en practica de una PCR digital se describe, a modo de ejemplo, en el documento US 6,143,496, H. Nagai et al., Anal. Chem. 73, 2001; pp. 1043-1047; F. Shen et al., Lab Chip, 2010, vol. 10 (20), pp.2666-2672; B. G. Zimmermann et al., Prenat. Diagn., 2008, vol. 28 (12), pp. 1087-1093; Y. Gong et al., Lab Chip, 2010, vol. 10 (18), pp. 2334-2337; S. Lindstrom et al., Lab Chip, 2009, vol. 9 (24), pp. 3465-3471; J. S. Marcus et al., Anal. Chem., 2006, vol. 78 (3), paginas 956-958. Los procedimientos y medios para la puesta en practica de PCR digital se encuentran disponibles comercialmente, a modo de ejemplo de la firma Fluidigm.

Asignacion de una identificacion especifica

A cada amplificado separado espacialmente se asigna una identificacion de emplazamiento especifica por medio de la que este es identificable claramente. La identificacion se puede efectuar en principio de cualquier modo concebible, y es especialmente una identificacion detectable por via optica, espectroscopica, radioactiva, electronica (por ejemplo por medio de un codigo de barras o un chip RFID), por medio de la posicion espacial o del orden de amplificados. En una variante, los amplificados se pueden dotar de una caracterizacion especifica, a modo de ejemplo una secuencia de ADN adicional, una etiqueta de espectrometro de masas o un marcaje isotopico. Si los amplificados estan unidos al soporte, a modo de ejemplo una particula de fase solida como se describe anteriormente, de modo preferente esta presente una identificacion o un marcaje en el soporte o su posicion. Al estar caracterizado, o bien marcado el soporte que porta el amplificado, tambien esta caracterizado el amplificado enlazado. Identificaciones posibles pero no concluyentes son codigos de barras, codigos de colores, tamano, forma, posicion o disposicion espacial, etiquetas de espectrometro de masas, marcaje isotopico, marcaje de ADN.

En los procedimientos de la invencion, los amplificados se disponen en diferentes lugares, y el lugar adopta una identificacion clara, a modo de ejemplo una numeracion de las coordenadas de emplazamiento. En una forma de realizacion, el procedimiento comprende la disposicion de amplificados en zonas separadas espacialmente con, sobre o en uno o varios soporte(s) primeros, obteniendose un conjunto de amplificados en el que se asigna una identificacion de emplazamiento especifica a cada amplificado como identificacion especifica. En esta forma de realizacion, la secuenciacion de oligonucleotidos se efectua en varios amplificados del conjunto. La secuencia de la clase de oligonucleotidos contenida en un amplificado se asigna a la identificacion de emplazamiento especifica del amplificado en el conjunto. En el analisis de propiedades de enlace de la estructura objetivo de aptamero se asignan la secuencia de la clase de oligonucleotidos contenida en un amplificado y la identificacion de emplazamiento especifica del amplificado a un resultado de enlace positivo o negativo. Son soportes ejemplares, sin limitacion a los mismos, placas, chips, placas con picopocillos, geles, microconjuntos, los denominados soportes de polonio (literatura:
http://en.wikipedia.org/wiki/Polonv). amplificacion puente, disposicion espacial de gotas de agua en un aceite, por ejemplo un manguito (como una serie de perlas ubica gotas tras gotas en el mismo), o una placa con picopocillos, en una coleccion de micro/picocavidades de un chip microfluido o una superficie (con y sin estructura).

La disposicion de los amplificados en diferentes lugares con, sobre o en un soporte puede estar combinada ya con el metodo de amplificacion. En el caso de una amplificacion a una fase solida, ya la fase solida puede ser el soporte, y los amplificados estan dispuestos en un patron regular o irregular en diferentes lugares sobre el soporte. En el caso de una PCR digital, los amplificados pueden estar unidos, a modo de ejemplo, a las paredes internas ya en las respectivas cavidades, o en superficies enlazantes de acidos nucleicos contenidas en las cavidades, de modo que la disposicion de las cavidades permite una asignacion de la secuencia como marcaje espacial.

En el caso de una PCR en emulsion, los amplificados pueden estar presentes, por ejemplo, en forma disuelta en gotitas de fase acuosa, o unidos a particulas de fase solida, que se encuentran en gotas acuosas, como se describio anteriormente. Las gotitas con amplificado disuelto se pueden distribuir e inmovilizar sobre un soporte plano. Las gotitas pueden estar fijadas en las respectivas posiciones en la superficie del soporte, a modo de ejemplo, mediante un revestimiento hidrofilo, de modo que las mismas estan dispuestas sobre el soporte en una disposicion espacial dada. A modo de ejemplo, el soporte puede presentar un patron regular de puntos hidrofilos. Las gotitas pueden estar separadas entre si en el soporte mediante una fase oleaginosa.

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Tambien se pueden introducir gotitas en cavidades de un soporte, en especial una placa con micro-, nano- o picopocillos, o de un chip secuenciador. Se describe un sistema de emulsion con enlace del ADN amplificado a un chip en Q. Ge et al., Molecules 2008, 13, 3057-3068.

En una forma de realizacion especialmente venajosa, los amplificados se presentan en la superficie de particulas de fase solida, a modo de ejemplo tras una PCR en emulsion descrita anteriormente, y las particulas de fase solida (perlas) con los amplificados se disponen en zonas separadas espacialmente con, sobre o en una o varias placas solidas, obteniendose un conjunto de amplificados. Las perlas se pueden disponer, y preferentemente inmovilizar sobre/en un gel, sobre una placa u otro soporte plano, a modo de ejemplo mediante reticulacion quimica sobre una superficie con grupos quimicos funcionales. En una forma de realizacion especialmente preferente, las perlas se introducen en cavidades de una placa con micro- o picopocillos, o de un chip secuenciador, a modo de ejemplo mediante centrifugado. Las dimensiones de perlas y cavidades se ajustan preferentemente de modo que una perla encaje exactamente en una cavidad.

Secuenciacion

Como se ha mencionado, cada amplificado contiene predominantemente o, segun medios de amplificacion y condiciones de amplificacion, de manera predominante o casi exclusivamente una clase de oligonucleotidos con secuencia identica, que coincide con la secuencia del oligonucleotido individual empleado como molecula de partida (matriz). Para descifrar la secuencia de oligonucleotidos en los amplificados se emplean los denominados procedimientos de secuenciacion. Por el estado de la tecnica son conocidas maquinas de secuenciacion que se pueden utilizar en una mayoria de pasos de reaccion y tecnica para capturar en primer lugar oligo- o polinucleotidos obtenidos, en especial ADN, copiary seleccionar estos a continuacion componente por componente. Por medio de la quimica de reaccion seleccionada del metodo de secuenciacion es posible calcular la secuencia de ADN del oligonucleotido contenido en el mismo para cada cavidad individual.

En el procedimiento segun la invencion, los oligonucleotidos se secuencian en amplificados presentes por separado espacialmente y caracterizados especificamente. La secuencia de la clase de oligonucleotidos en un amplificado se asigna a la identificacion de emplazamiento especifica del amplificado.

Antes de la secuenciacion se eliminan contrahebras complementarias al oligonucleotido, contenidas preferentemente en el amplificado. Se obtiene un producto de los que se han eliminado estas contrahebras, y que se denomina ademas amplificado con los fines de la presente invencion.

La eliminacion de contrahebras se puede efectuar por diversos procedimientos, que son conocidos en si por el especialista. En el caso de una PCR en emulsion con perlas o una PCR en fase solida, como se ha descrito anteriormente, las perlas, o bien las superficies, portan, a modo de ejemplo, solo un cebador, y el otro se anade en disolucion. De este modo, la hebra de oligonucleotido, que se obtuvo previamente mediante un enlace positivo contra el objetivo de aptamero, o la contrahebra se puede anclar directamente a la superficie por medio de PCR. Otras posibilidades son posibles mediante sistemas de enlace, como por ejemplo perlas cargadas con estreptavidina y cebadores con biotina. Se pueden generar hebras simples lavandose bajo condiciones desnaturalizantes, de modo que la contrahebra no deseada se libere facilmente. La hebra de oligonucleotido permanece unida a la perla o a la superficie mediante enlace covalente y no se puede perder. Son procedimientos apropiados el lavado con tampon altamente salino, tampon SSC, hidroxido sodico diluido y/o calentamiento.

En el procedimiento segun la invencion se emplean preferentemente tecnicas de secuenciacion en las que los amplificados estan dispuestos en zonas separadas espacialmente con, sobre o en uno o varios soportes solidos, tambien denominados “plantillas“. A este respecto se remite a la anterior divulgacion en este aspecto. Cada amplificado dispuesto sobre el soporte se secuencia por separado.

Tales tecnicas de secuenciacion se denominan tambien “tecnicas de secuenciacion de la siguiente generacion“, o NGS (Next Generation Sequencing) en este caso y en la literatura pertinente. Las tecnicas de secuenciacion NGS se pueden basar en diversas formas de placa, algunas de las las cuales se encuentran disponibles comercialmente, a modo de ejemplo de las firmas Roche (Roche/454), e Illumina/Solexa, Solid e Ion Torrent. Aporta una sinopsis sobre tecnicas NGS L. Metzker et al., Nature Reviews, Genetics, Vol. 11,2010, 31 -46.

La tecnologia NGS, como se aplica en el sistema GS FLX 454 de Roche, se basa, entre otras, en tecnicas que se describen en Wheeler, D.A. et.al, Nature 452 (2008) 872, Shendure J.; Ji H., Nature Biotechnology 26 (2008) 11351145, en los documentos US 7,244,559, US 7,323,305, US 7,335,762, US 7,638,276. La tecnologia Ion Torrent se basa en el mismo sistema de amplificacion y posicionado de los amplificados, pero utiliza un transistor de efecto de campo para seleccionar las reacciones bioquimicas (J. M. Rothberg, Methods and apparatus for measuring analytes using large scale fet arrays, Pub.-Date: 21 .Mai. 2009; Pub.-No.: US 2009/0127589 A1). No obstante, la geometria de la disposicion de amplificados de ambas tecnologias se basa en un principio identico, y permite de este modo una

secuenciacion altamente paralela de hasta 106secuencias de ADN con aproximadamente 500 pares de bases de longitud en cada caso, siendo tambien posibles longitudes de secuencia mas cortas. En esta tecnica se introducen perlas, a cuya superficie esta unido respectivamente un amplificado de un determinado oligonucleotido, en un chip de secuenciacion. El chip contiene millones de pequenas cavidades, que presentan en cada caso una dimensiones 5 tales que en cada cavidad se ajusta exactamente una perla. Despues se puede cargar el chip con perlas menores, que contienen todas las enzimas para la reaccion de secuenciacion. No obstante, esto no es imprescindible, sino una forma de realizacion preferente de la propia tecnica de secuenciacion. En la secuenciacion que sigue ahora se genera una senal luminica en el sistema 454 FLX, una carga electrica por medio de iones H+ en el caso de Ion Torrent, si se incorpora una base de ADN. La senal se registra paralelamente para cada cavidad y, de este modo, 10 para cada perla, y se puede convertir entonces en una secuencia de ADN. Por consiguiente, un unico chip NGS permite el registro de hasta mil millones de pares de bases y mas. El principio de secuenciacion y los procesos que se desarrollan en la secuenciacion se explican, entre otros, en M. Ronaghi, Genome Res. (2001) 11, 3-11yM. Margulies et al., Nature (2005) vol. 437, 376-380.

Alternativamente a los sistemas NGS basados en perlas, tambien existen aquellos que emplean una amplificacion 15 puente (por ejemplo Solexa). En este caso, los oligonucleotidos se unen en distribucion estadistica sobre una superficie, y se amplifican de modo que se producen 105 copias del oligonucleotido original por cada punto de enlace. Estas zonas de amplificacion individuales son casi siempre circulares para disponer el oligonucleotido original. En la forma de realizacion de secuenciacion de la firma Illumina, esta disposicion espacial se analiza por medio de la incorporacion de diferentes nucleotidos fluorescentes (US Pat. App 12878687, NUCLEIC ACID 20 SEQUENCING SYSTEM AND METHOD). Sin embargo, un analisis de esta disposicion espacial es igualmente posible por medio de los principios de deteccion de 454 FLX o Ion Torrent, para deducir la secuencia de la misma. Se remite a las explicaciones en el documento US 6,300,070, asi comoL Metzker et al., Nature Reviews, Genetics, Vol. 11, 2010, 31-46yAbrams et al., Diagnostic and Gene Detection Ch. (1997) 171-189. Adicionalmente, en este diseno de secuenciacion, la secuencia de ADN se determina frecuentemente por medio de una ligazon de diferentes 25 oligonucleotidos con etiqueta fluorescente. Tambien en este caso, la secuencia de oligonucleotidos se puede seleccionar de modo que esta sea accesible a esta secuenciacion y se encuentre disponible para una medida de enlace posterior de los oligonucleotidos/aptameros.

Analisis de las propiedades de enlace

Finalmente, el analisis de las propiedades de enlace de todas las clases de oligonucleotidos dispuestos en el 30 conjunto de amplificados tiene lugar en la estructura objetivo de aptamero. A tal efecto se ponen en contacto oligonucleotidos, que presentan la secuencia de la clase de oligonucleotidos que esta contenida en los amplificados, con la estructura objetivo de aptamero. En una variante de procedimiento, los aptameros separados espacialmente se pueden poner en contacto con la estructura objetivo de aptamero. Esta no es necesariamente el propio amplificado y oligonucleotidos contenidos en el mismo, que se ponen en contacto con la estructura objetivo de 35 aptamero. El concepto “analisis de las propiedades de enlace de todas las clases de oligonucleotidos" comprende tambien la investigacion de oligonucleotidos que presentan la misma secuencia que los oligonucleotidos de una clase determinada y, por consiguiente, se pueden asignar a la clase, pero que ya no estan contenidos en los amplificados caracterizados. A modo de ejemplo, se pueden generar y analizar copias de oligonucleotidos como se indica a continuacion en formas de realizacion espedciales. El concepto “analisis de las propiedades de enlace de 40 todas las clases de oligonucleotidos“ comprende tambien, en especial, que los oligonucleotidos se pongan en contacto con la estructura objetivo de aptamero en los amplificados y/o que las copias de oligonucleotidos se pongan en contacto con la estructura objetivo de aptamero.

El concepto “asignacion de las propiedades de enlace analizadas a las identificaciones especificas de los amplificados“ significa la creacion de una relacion de una clase de oligonucleotidos analizada respecto al amplificado 45 en el que se puede encontrar la clase, con ayuda de su caracterizacion. A partir de la secuenciacion es conocida la secuencia de la clase de oligonucleotidos, su secuencia y la identificacion del correspondiente amplificado.

Las propiedades de enlace se pueden clasificar por medio de una escala de valores seleccionada determinada. Se puede efectuar una clasificacion de manera cualitativa y/o cuantitativa. A modo de ejemplo, se puede efectuar una serie de oligonucleotidos analizados, de la senal mas alta a la mas baja. A modo de ejemplo, una asignacion 50 cualitativa puede llegar de ninguna afinidad a una afinidad muy elevada. Ademas, en base a uno o varios valores limite determinados se puede diferenciar en niveles de calidad. Entre otras, en el caso de una medicion de fluorescencia y RlfS, como se describe a continuacion, las propiedades de enlace se pueden representar como intensidades con unidad relativa.

El procedimiento se puede denominar tambien procedimiento para la investigacion de oligonucleotidos con el fin de 55 caracterizacion, identificacion, obtencion y/o seleccion de aptameros o aptameros potenciales.

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Durante o tras el analisis de las propiedades de enlace, los oligonucleotidos se identifican como aptameros. La identificacion se puede efectuar por medio de una clasificacion, como se describe a modo de ejemplo. Los oligonucleotidos identificados son preferentemente aquellos que presentan una propiedad de enlace para la estructura objetivo, o aquellos en los que es determinable un resultado de enlace. El procedimiento puede comprender un paso de seleccion, seleccionandose oligonucleotidos identificados como aptameros a partir de todos los oligonucleotidos analizados.

Los oligonucleotidos identificados como aptameros se pueden aislar opcionalmente o sintetizar de manera reciente. En una variante, el analisis de las propiedades de enlace puede comprender en especial:

i) La asignacion de un resultado de enlace positivo o negativo para la identificacion especifica del amplificado y de la secuencia de la clase de oligonucleotidos contenida en el amplificado, y

ii) La identificacion de oligonucleotidos, en los cuales se determina un resultado de enlace positivo, como aptameros para la estructura objetivo.

Se puede definir un resultado de enlace positivo, a modo de ejemplo, como una determinada diferencia de senal detectable respecto a la senal basica, o bien un control negativo, en el que no se efectua un enlace. Ademas son posibles diferenciaciones a traves de la altura de senal.

Antes del analisis de las propiedades de enlace se eliminan preferentemente contrahebras contenidas en el amplificado, complementarias al oligonucleotido. Esto se puede efecuar como se describe anteriormente bajo el punto "secuenciacion". Si las contrahebras se eliminaron ya antes de la secuenciacion, como se describe anteriormente, este paso esta de mas.

El analisis de las propiedades de enlace se puede efectuar con todos los metodos que son ya conocidos por el estado de la tecnica para aptameros, en especial con metodos de determinacion de afinidad de aptamero con el objetivo.

Un resultado de enlace de aptamero con el objetivo se puede detectar con diversos metodos comunes que son ya conocidos por el estado de la tecnica, en especial mediciones de afinidad. Si el aptamero se pone en contacto con el objetivo, se forma un complejo aptamero-objetivo mediante union del aptamero al objetivo. El enlace, o bien el resultado de enlace, se puede identificar, a modo de ejemplo, por via visual, optica, fotonica, electronica, acustica, opto-acustica, segun masa, por via electroquimica, electrooptica, espectrometrica, enzimatica o quimica de otro tipo, bioquimica o fisica.

El complejo se puede hacer visible mediante un marcaje, a modo de ejemplo en una reaccion de indicador tras un acoplamiento directo o indirecto de un reactivo complejo con una sustancia de marcaje. El aptamero empleado o el objetivo pueden estar provistos de un marcaje (etiqueta). Marcajes (etiquetas) preferentes son detectables por via visual, optica, fotonica, electronica, acustica, opto-acustica, segun masa, por via electroquimica, electrooptica, espectrometrica, enzimatica o fisica, quimica o bioquimica de otro tipo. En una forma de realizacion del procedimiento, el marcaje se identifica mediante luminiscencia, espectroscopia UV/VIS, por via enzimatica, electroquimica o radioactiva.

Luminiscencia se refiere a la emision de luz. En el procedimiento segun la invencion se aplican, a modo de ejemplo, la fotoluminiscencia, la quimioluminiscencia y la bioluminiscencia para la identificacion del marcaje. En el caso de fotoluminiscencia o fluorescencia, la activacion se efectua mediante absorcion de fotones. Fluoroforos ejemplares son, sin limitacion, bisbenzimidazol, fluoresceina, naranja de acridina, Cy5, Cy3 o yoduro de propidio, que se pueden acoplar a aptameros mediante enlace covalente, tetrametil-6-carboxirodamina (TAMRA), Texas Red (TR), rodamina, colorates de Alexa Fluor (entre otras colorantes fluorescentes de diferentes longitudes de onda de diversas firmas). La valoracion se efectua visualmente o con correspondientes aparatos de medicion, por ejemplo en contador multietiqueta, en microscopio de fluorescencia, o mediante citometria de flujo, por ejemplo en el citofluorimetro. La quimioluminiscencia describe la emision de luz visible como consecuencia de una reaccion quimica. Bioluminiscencia designa la emision de luz visible como consecuencia de una reaccion enzimatica, a modo de ejemplo de una reaccion redox catalizada a traves de la enzima luciferasa.

Otras sustancias de marcaje son catalizadores, particulas metalicas coloidales, por ejemplo nanoparticulas de oro, particulas coloidales no metalicas, puntos cuanticos, polimeros organicos, particulas de latex o liposomas con sustancias generadoras de senal. Las particulas coloidales se pueden identificar por colorimetria.

Como marcadores son tambien empleables enzimas, cuya reaccion enzimatica esta caracterizada por el consumo o la produccion de sustratos o productos detectables, pudiendose aplicar una deteccion optica o electroquimica sin

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limitacion. Una identificacion se puede llevar a cabo, por ejemplo, con enzimas como sustancias de marcaje para transformar los sustratos en productos incoloros, preferentemente peroxidasa, proteina verde fluorescente (GFP), luciferasa, [beta]-galactosidasa o fosfatasa alcalina. A modo de ejemplo, el sustrato incoloro X-Gal se puede transformar en un producto azul, cuya coloracion se registra visualmente, mediante la actividad de [beta]- galactosidasa.

La identificacion se puede efectuar tambien por medio de isotopos radioactivos, con los que esta marcado el aptamero, preferentemente 3H, 14C, 32P, 33P, 35S o 125I, de modo especialmente preferente 32P, 33P o 125I. En el recuento de escintilacion se mide indirectamente la radiacion radioactiva emitida por el complejo aptamero- objetivo con marcaje radioactivo. Una sustancia de escintilacion se activa mediante la radiacion radioactiva. En el caso de paso al estado basico, la energia de excitacion se libera de nuevo como destellos de luz, que se intensifican por medio de un multiplicador de fotoelectrones (fotomultiplicador) y se recuentan.

Los aptameros pueden tambien estar marcados con digoxigenina o biotina, que se unen, a modo de ejemplo, a traves de anticuerpos o estreptavidina, que pueden portar a su vez un marcaje, como por ejemplo un conjugado enzimatico. El enlace covalente previo (conjugacion) de un anticuerpo con una enzima se puede efectuar de diversas maneras conocidas. La identificacion del enlace con anticuerpo se puede efectuar tambien por via radioactiva en un RIA (inmunoensayo radioactivo) con isotopos radioactivos, preferentemente con 125l, o mediante fluorescencia en un FIA (inmuno ensayo de fluor) con fluoroforos, preferentemente con fluoresceina o FITC.

En una forma de realizacion especialmente ventajosa, para la deteccion de un resultado de ensayo se emplea un metodo de deteccion exento de etiqueta, que se basa en la denominada espectroscopia de interferencia reflectometrica basada en imagen (a continuacion iRlfS). El metodo se basa en que, debido a la interferencia en capas delgadas, la adicion de moleculas a una superficie se puede registrar mediante un desplazamiento del patron de interferencia. El procedimiento se puede emplear tambien para la medicion de una cinetica de enlace. Las bases del procedimiento se describen en C. Hanel et al., Analytical and Bioanalytical Chemistry, 372 (2002) 91-100, J. Piehler et al. Analytical Biochemistry, 249 (1997) 94-102y en el documentoUs2010297671. Con el metodo iRlfS se puede llevar a cabo una seleccion de reacciones de enlace en microconjuntos en tiempo real y sin etiqueta. En la presente invencion se puede efectuar un analisis altamente paralelo de resultados de enlace y la determinacion de constantes de enlace. Con iRlfS se puede determinar en tiempo real si tiene lugar, y en que medida y con que parametros cineticos, una interaccion entre las moleculas objetivo y cada amplificado aislado. La cinetica de enlace y las constantes de afinidad de todos los aptameros en el ensayo se pueden determinar paralelamente. Ademas, simultaneamente se pueden efectuar investigaciones paralelas respecto a la afinidad con el objetivo bajo condiciones diferentes (temperatura, pH, contenido en sales, etc.) y respecto a la especificidad, pudiendose analizar hasta 106amplificados en un conjunto.

A continuacion se indican otras formas de realizacion y variantes especiales, asi como complementos del procedimiento descrito anteriormente: la puesta en contacto de oligonucleotidos, que presentan la secuencia de la clase de oligonucleotidos que esta contenido en los amplificados, con la estructura objetivo de aptamero, se puede efectuar de diferentes maneras, como se describe a continuacion.

En una forma de realizacion del procedimiento se pone en contacto un conjunto de amplificados, como se describe anteriormente, con la estructura objetivo de aptamero. A modo de ejemplo, los amplificados, que estan dispuestos en cavidades separadas de un chip de ADN, una placa de microtitracion o una placa con micropocillos, se pueden incubar con un liquido que contiene la estructura objetivo de aptamero.

Generacion de copias y derivados del conjunto

En otra forma de realizacion, el procedimiento comprende:

- La generacion de una copia o de un derivado del conjunto de amplificados con, sobre o en un segundo soporte, asignandose a cada amplificado de la copia o del derivado una identificacion de emplazamiento especifica como identificacion especifica,

- La puesta en contacto de la copia o del derivado del conjunto con la estructura objetivo del aptamero.

En esta forma de realizacion, directamente a partir de un conjunto de amplificados (tambien “conjunto“ a continuacion) sobre, con o en un primer soporte, a modo de ejemplo un chip de secuenciacion, se copian oligonucleotidos o amplificados o derivados de oligonucleotidos o de amplificados sobre un segundo soporte, conservandose la estructura del conjunto y, de este modo, la identificacion de emplazamiento especifica de los amplificados del conjunto. Por consiguiente, la identificacion de emplazamiento especifica que se asigna a los amplificados en la copia o el derivado se basa en la identificacion de emplazamiento especifica de los amplificados en el conjunto, que sirve como alimentacion. Cualquier posicion espacial del original se puede asignar claramente a una informacion de emplazamiento en la copia, y viceversa.

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La forma de realizacion posibilita en especial la produccion de una copia de un microconjunto a partir de una asignacion de secuencias de oligonucleotidos a partir de una secuenciacion (por ejemplo conjunto de partfculas en un secuenciador de ABI o Roche 454, o una superficie plana, como de una Solexa de Illumina).

Segun la invencion, por una copia se puede entender una copia 1 : 1 de los oligonucleotidos originales, mientras que por un derivado se puede entender una modificacion de los oligonucleotidos originales, a modo de ejemplo derivados o subconjuntos de oligonucleotidos originales.

En principio, el proceso de copia se puede repetir varias veces, de modo que se puede producir una pluralidad de copias identicas de microconjunto de oligonucleotidos, por ejemplo a partir de un chip secuenciador. En este caso se conserva la alimentacion. Mediante esta forma de realizacion se facilita de nuevo la identificacion de aptamero y la investigacion en muchas muestras paralelas, ya que se pueden llevar a cabo las mas diversas investigaciones en diferentes copias y se pueden generar nuevas copias en caso necesario. A modo de ejemplo, se pueden determinar paralelamente cineticas de enlace y las constantes de afinidad de todos los aptameros en copias del conjunto. Ademas, se pueden efectuar investigaciones paralelas respecto a la afinidad con el objetivo bajo diversas condiciones (temperatura, pH, contenido en sales, etc.) y respecto a la especificidad.

Una copia se analiza en especial con la tecnica iRlfS exenta de etiqueta, que se explico anteriormente, lo que posibilita, entre otras cosas, un analisis de afinidad de todos los oligonucleotidos en la copia de conjunto generada.

Antes de la puesta en contacto de la copia o del derivado del conjunto con la estructura objetivo de aptamero se eliminan preferentemente contrahebras complementarias a los oligonucleotidos, que pueden estar presentes en los amplificados de la copia o del derivado. Esto se puede efectuar con metodos conocidos, de los que se enumeran algunos en el punto “secuenciacion“.

En esta forma de realizacion, el segundo soporte presenta en especial un adaptador de enlace para oligonucleotidos o propiedades de enlace para oligonucleotidos, y la copia o el derivado se generan uniendose oligonucleotidos de los amplificados al soporte por medio del adaptador de enlace o de las propiedades de enlace. Los adaptadores de enlace son preferentemente oligonucleotidos, en la mayor parte de los casos preferentemente con la longitud y funcion de un cebador para una PCR. Los adaptadores de enlace presentan preferentemente secuencias que son complementarias a una parte de la secuencia de la contrahebra de oligonucleotidos, o bien contienen secuencias que son identicas al oligonucleotido. En el caso de un amplificacion que se lleva a cabo en el segundo soporte, el adaptador de enlace se puede prolongar en una hebra de oligonucleotido, que esta unida a la superficie del segundo soporte mediante enlace covalente. En este caso, el oligonucleotido generado puede ser identico o complementario al oligonucleotido original. Los adaptadores de enlace pueden presentar tambien secuencias que son complementarias a una parte de la secuencia de la hebra de oligonucleotido. En el caso de una amplificacion, que se lleva a cabo en el segundo soporte, el adaptador de enlace se puede prolongar para dar una contrahebra de oligonucleotido, que esta unida a la superficie del segundo soporte mediante enlace covalente.

Esta forma de realizacion posibilita ademas copiar conjuntos de amplificado, tambien sin tener conocimiento de la informacion bioqufmica o de la secuencia. Esto posibilita duplicar una copia de la disposicion de oligonucleotidos de la misma ya antes de, tras o durante un proceso de secuenciacion, y crear de este modo una copia de conjunto sin poseer un conocimiento de las secuencias. Unicamente la asignacion de la informacion de emplazamiento en la copia debe permitir una asignacion a las informaciones de secuencia del sistema secuenciador.

Por consiguiente, la forma de realizacion posibilita la produccion de una copia de conjunto directamente antes de, tras o durante la secuenciacion descrita anteriormente, tambien sin conocimiento de las secuencias de oligonucleotidos individuales. Es posible secuenciar la copia producida en esta forma de realizacion para verificar la identidad de los aptameros en los amplificados copiados. Por consiguiente, en la copia de conjunto se pueden efectuar en principio los mismos pasos que en la alimentacion del conjunto. Por lo tanto, la secuenciacion se puede llevar a cabo antes de, durante o tras la elaboracion de la copia con el original o la copia.

Segun esta forma de realizacion se puede producir una copia o un derivado antes de, durante o tras la secuenciacion o la amplificacion, o una de las copias puede servir a su vez como alimentacion de una secuenciacion. De modo preferente, la union de las copias o derivados al segundo soporte se efectua simultaneamente o tras la amplificacion. Una produccion de la copia o del derivado antes de la amplificacion se puede efectuar, por ejemplo, bajo empleo del sistema Solexa. En este caso, antes de, durante, o tras la amplificacion se generan ulteriormente amplificados del oligonucleotido original, y despues se transfieren a un segundo soporte. Respecto al oligonucleotido original, se pueden transferir amplificados tanto complementarios como tambien identicos. Este segundo soporte puede ser, a modo de ejemplo, un chip de secuenciacion de un 454 de Roche. Tambien es concebible hacer una copia con el sistema 454 der Roche antes de, durante o tras una secuenciacion, y alimentar a un secuenciador SOLEXA y secuenciar de nuevo la misma.

Una variante especial de esta forma de realizacion comprende los siguientes pasos

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- La puesta a disposicion de al menos una zona de medio de amplificacion limitada espacialmente para cada oligonucleotido, que esta separado de las zonas de medio de amplificacion de los demas oligonucleotidos, limitando una superficie del segundo soporte, provista del adaptador de enlace o de propiedades de enlace, con las zonas de medio de amplificacion,

- La amplificacion de oligonucleotidos a traves de medios de amplificacion en las zonas de medio de amplificacion para la generacion de amplificados de los oligonucleotidos,

- La union de hebras simples de amplificados o derivados de amplificados al segundo soporte por medio del adaptador de enlace o de las propiedades de enlace, de modo que una disposicion espacial de las hebras simples en el segundo soporte corresponde a la disposicion espacial de los amplificados en el conjunto del que proceden las hebras simples; y

- La eliminacion del segundo soporte con las hebras simples enlazadas del conjunto.

Las zonas de medio de amplificacion limitadas espacialmente se pueden definir al menos parcialmente mediante micro- o nanoestructuras en el primer soporte que porta el conjunto, o en el segundo soporte que porta la copia o el derivado; la amplificacion segun la anterior forma de realizacion puede ser identica a la amplificacion separada espacialmente, como se describe anteriormente por medio del procedimiento general. En este caso tiene lugar la amplificacion separada espacialmente en las zonas de medio de amplificacion.

La amplificacion segun la anterior forma de realizacion puede ser tambien otro (por ejemplo un segundo) paso de amplificacion, que se lleva a cabo tras la amplificacion separada espacialmente, que se describio previamente por medio del procedimiento general. Por ejemplo, es posible que las perlas, que portan una mayoria de oligonucleotidos unidos mediante enlace covalente tras una primera amplificacion, separada espacialmente, y una eliminacion de hebras simples de oligonucleotido, se pongan en contacto en las zonas de medio de amplificacioncon un medio de amplificacion, que conduce a la sintesis de una contrahebra de oligonucleotido en la amplificacion. Por lo tanto, la amplificacion segun la anterior forma de realizacion puede significar la sintesis de contrahebras. El concepto “amplificado de oligonucleotidos" comprende las contrahebras en este caso. Mediante una seleccion modificada del cebador tambien es posible generar oligonucleotidos identicos al oligonucleotido original como amplificado.

En el caso de las hebras simples de amplificados, que se unen al segundo soporte, se puede tratar de hebras simples de oligonucleotido y/o de sus contrahebras complementarias, preferentemente de las contrahebras. La union se efectua preferentemente mediante hibridacion de hebras simples de oligonucleotido y/o sus contrahebras complementarias en el adaptador de enlace con una secuencia.

Un adaptador de enlace en la superficie del segundo soporte presenta preferentemente una secuencia que es complementaria a una parte de la secuencia de la contrahebra de oligonucleotido. Las contrahebras se unen mediante hibridacion al adaptador de enlace. A continuacion se lleva a cabo preferentemente una amplificacion ulterior en el segundo soporte, en el que el adaptador de enlace se alarga para dar una hebra de oligonucleotido. Como resultado se obtienen oligonucleotidos unidos a la superficie del segundo soporte mediante enlace covalente. Este paso de amplificacion ulterior se puede efectuar antes o despues de la eliminacion del segundo soporte. Las contrahebras ya innecesarias se pueden eliminar, mencionandose ya procedimientos habituales (lavado con tampon, calentamiento).

En una variante, la generacion de al menos una zona de medio de amplificacion limitada espacialmente para cada oligonucleotido presenta una puesta a disposicion de oligonucleotidos en cavidades separadas asignadas en cada caso en el primer soporte que porta el conjunto, una introduccion del medio de amplificacion en las cavidades, y un cierre de las cavidades mediante el segundo soporte. A modo de ejemplo, el segundo soporte puede ser un soporte plano, que se coloca sobre un primer soporte con cavidades, como una placa con micro- o picopocillos, encontrandose en las cavidades los oligonucleotidos a amplificar (por ejemplo en el caso de PCR digital, como se describe anteriormente). El segundo soporte cierra las cavidades, y se forman zonas de medio de amplificacion concluidas. En las cavidades estan presentes los medios de amplificacion necesarios, y en la amplificacion se forma preferentemente una copia de los amplificados en el segundo soporte de manera simultanea. El segundo soporte puede ser un soporte plano, y sobre el mismo se puede producir una copia en forma de un conjunto plano. Tal procedimiento se describe en el documento WO2010100265. En una variante del mismo estan presentes perlas con un oligonucleotido unido a la superficie de una determinada secuencia en cavidades de un primer soporte, y el segundo soporte se coloca como soporte plano sobre el segundo soporte con cavidades. A continuacion se lleva a cabo una amplificacion, y simultaneamente se genera una copia sobre el segundo soporte. Se describe un ejemplo de realizacion en el documento WO2010100265, en relacion con las Fig. 1a a Fig. 1d del mismo.

En otra variante, la generacion de al menos una zona de medio de amplificacion limitada especialmente presenta una puesta a disposicion del segundo soporte con al menos una cavidad asignada a cada oligonucleotido, en la que esta dispuesto el adaptador de enlace, una introduccion del medio de amplificacion en las cavidades y un cierre de las cavidades por medio del primer soporte, de modo que los oligonucleotidos estan expuestos a la zona de medio de amplificacion. Se describe un ejemplo de realizacion en el documento WO2010100265, en relacion con las Fig. 4a-4c del mismo.

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En otra variante de esta forma de realizacion, las zonas de medio de amplificacion limitadas espacialmente estan separadas por lfmites de fase entre dos lfquidos, un lfquido y un gas o un lfmite ffsico. Tambien es concebible disponer gotas de emulsion sobre un primer soporte, conteniendo cada gotita un oligonucleotido de una determinada secuencia y medio de amplificacion, como se describe anteriormente por medio de la PCR en emulsion. Las gotitas se pueden fijar a las respectivas posiciones en la superficie del primer soporte mediante un revestimiento hidrofilo, de modo que estas estan colocadas en una disposicion espacial dada en el soporte. A modo de ejemplo, el soporte puede presentar un patron regular de puntos hidrofilos. El segundo soporte se imprime, de modo que entra en contacto con las gotitas con la superficie, que presenta preferentemente un adaptador de enlace. En el caso de una amplificacion en las gotitas se produce simultaneamente una copia en el segundo soporte. Se describe un ejemplo de realizacion en el documento WO2010100265, en relacion con las Fig. 5a a Fig. 5d del mismo.

Durante diversos pasos de copia se pueden producir modificaciones en forma qufmicadel conjunto, que contiene, a modo de ejemplo, determinados marcadores o secuencias, de modo comparable a una copia de color, en la que se copia solo la proporcion de amarillo.

Se explican otros aspectos de esta forma de realizacion en el documento WO002010100265.

Pasos de procedimiento adicionales con una copia de conjunto, recuperacion y seleccion

En un complemento de la anterior forma de realizacion, el procedimiento comprende la recuperacion de una o varias clases de oligonucleotidos a partir de una copia mediante eliminacion de los oligonucleotidos del primer, del segundo soporte, o de una copia de estos soportes. Copias ulteriores de copias del soporte, que se obtuvieron a partir de un conjunto con/sobre/en un primer soporte, o copias de la copia en el segundo soporte, siendo empleables los procedimientos de copia ya abordados. No obstante, una forma de realizacion preferente preve el empleo de segundos soportes, en especial de copias de ADN de una secuenciacion. En esta forma de realizacion, los oligonucleotidos o sus amplificados estan inmovilizados, de modo que se pueden liberar mediante disolucion local. En el caso de un conjunto de ADN copiado en un segundo soporte bajo empleo de fotorreticulantes, esto se puede aplicar de modo que los oligonucleotidos estan enlazados, pero se pueden desprender mediante irradiacion de un laser de onda corta. Tras el analisis de enlace, a modo de ejemplo por medio de iRlfS, se puede desprender y eluir selectivamente un aptamero mediante irradiacion de laser. El eluato se encuentra disponible directamente para otros pasos, como una PCR. Por consiguiente, el aptamero se puede amplificar directamente, y no se debe sintetizar reiteradamente de nuevo. En tanto este previsto una agrupacion de epftopos, como se describe a continuacion, los aptameros recuperados se pueden someter a ensayo como aptameros secundarios, y de este modo se pueden identificar inmediatamente sus componentes de enlace para una estructura tipo sandwich. Si se liberan simultaneamente otros aptameros en cada caso, esta reserva de aptameros permite ademas la aplicacion de otro paso de seleccion (enlace de la reserva de aptameros con el objetivo, eliminacion de no enlazantes, elucion de enlazantes del objetivo), en especial en combinacion con una mutacion de la reserva. No obstante, en este caso se puede alimentar selectivamente cualquier secuencia a la reserva, o esta puede contener la misma. Por consiguiente, existe una influencia sensiblemente mayor que en el procedimiento SELEX previo sobre la reserva de aptameros para el siguiente paso de seleccion.

En otro complemento de la forma de realizacion previa, el procedimiento comprende la produccion de otros oligonucleotidos mediante amplificacion de oligonucleotidos de la copia, que estan unidos sobre el segundo soporte. Los conjuntos copiados portan todos los aptameros en la superficie. Debido al proceso de produccion de la copia, ahora es posible llevar a cabo una PCR sobre la superficie del conjunto, y obtener de este modo de nuevo una reserva de aptamero para una ronda siguiente, y mutar la misma del mismo modo a continuacion. Mediante seleccion de cebadores apropiados para PCR es posible obtener ademas subreservas de oligonucleotidos.

En otro complemento de la forma de realizacion previa, es posible recuperar y amplificar ADN complementario soluble en relacion con los aptameros, que se produce durante el proceso de copia. De este modo se genera de nuevo una reserva de todos los aptameros que se introdujeron en la secuenciacion. Mediante seleccion apropiada del cebador es posible obtener nuevamente los aptameros como ssADN de manera selectiva. Esta reserva se encuentra entonces disponible para una ronda de SELEX adicional, y tambien se puede mutar para generar de nuevo una nueva biblioteca.

En otro complemento de la forma de realizacion previa, se obtienen subreservas de aptameros a partir de la copia o el exceso del proceso de copia. Ya que, debido a la secuenciacion, las secuencias son conocidas, es posible amplificar selectivamente motivos de secuencia individuales por medio de cebadores apropiados. Esto es posible tanto a partir del exceso del proceso de copia como tambien a partir del conjunto de ADN generado. Por consiguiente, se pueden generar subreservas individuales de la reserva de aptameros secuenciada originalmente.

Paso de seleccion adicional

En otra forma de realizacion del procedimiento, los amplificados estan unidos a partfculas de fase solida, y el

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procedimiento comprende ademas los siguientes pasos:

- La puesta en contacto de partfculas de fase solida a las que esta unido respectivamente un amplificado con una clase de oligonucleotidos, con estructura objetivo de aptamero,

- La determinacion de un resultado de enlace positivo o negativo de la estructura objetivo de aptamero en oligonucleotidos del amplificado, que esta unido a una partfcula de fase solida,

- La seleccion de partfculas de fase solida en las que es verificable un resultado de enlace positivo.

Las partfculas de fase solida seleccionadas, en las que es verificable un resultado de enlace positivo, se pueden disponer en zonas separadas espacialmente, con, sobre o en uno o varios soportes solidos, obteniendose un conjunto de amplificados. En este caso, el concepto "seleccion" significa en especial la separacion de partfculas de fase solida en las que es verificable un resultado de enlace positivo de otras partfculas de fase solida.

No obstante, las partfculas de fase solida pueden estar dispuestas tambien con, sobre o en un soporte solido y formar un conjunto antes de la puesta en practica de los anteriores pasos de procedimiento. En especial, el concepto "seleccion" significa entonces que otros pasos de procedimiento, como la secuenciacion descrita a continuacion, se llevan a cabo con partfculas de fase solida en las que es verificable un resultado de enlace positivo.

Como se ha descrito anteriormente por medio del procedimiento fundamental, se pone en contacto una mezcla de oligonucleotidos con una estructura objetivo de aptamero, y al menos una parte de los oligonucleotidos se unen a la estructura objetivo. A continuacion, los oligonucleotidos que se han unido a la estructura objetivo de aptamero se separan de la estructura objetivo de aptamero y de oligonucleotidos no unidos a la estructura objetivo de aptamero. En este caso se trata de una seleccion analoga a un proceso SELEX, estando preferentemente inmovilizado el objetivo y presentandose los oligonucleotidos en disolucion. Debido a esta seleccion, se puede partir de que el ADN de cada una de las partfculas de fase solida (perlas) a las que estan unidos los amplificados generados de oligonucleotidos seleccionados, presenta una afinidad con el objetivo. No obstante, si los oligonucleotidos se sometieron a ensayo contra el objetivo inmovilizado en la seleccion analoga a SELEX en disolucion, la union de los aptameros puede haber modificado la afinidad. Para verificar esto, el paso de seleccion ulterior contenido en esta forma de realizacion (tambien denominado “seleccion de prueba“) es ventajoso, ya que las perlas se incuban con el objetivo, se seleccionan aquellas perlas en las que es verificable un resultado de enlace positivo, y en procedimientos ulteriores para la secuenciacion y pasos subsiguientes se consideran solo las perlas que se unen contra el objetivo tambien en este paso de seleccion ulterior.

Con esta forma de realizacion se mejora la calidad de los enlazantes y se eliminan de nuevo los no enlazantes. Con este paso opcional se puede seleccionar de nuevo y, de este modo, mejorar en un sentido deseado, o bien optimizar la afinidad de los aptameros ya seleccionados. Mediante la posible seleccion doble, en primer lugar aptamero libre contra objetivo enlazado, y a continuacion aptamero enlazado contra objetivo libre, se puede obtener una tasa de acierto mas elevada para aptameros, que se unen a su objetivo tanto en forma inmovilizada como tambien en forma no enlazada en disolucion. Ademas se garantiza mejor que el aptamero se una al objetivo, tanto presente en disolucion como tambien inmovilizado.

Son concebibles diferentes formas de realizacion de la seleccion de la reserva, de las cuales se enumeran algunas en este caso:

- Por medio de un objetivo con etiqueta fluorescente se puede efectuar una estimacion de afinidad a traves de la fluorescencia de la perla. Esto se puede efectuar, a modo de ejemplo, con un aparato FACS (por ejemplo Fluorescence assisted cell sorting). Despues se pueden clasificar las perlas en reservas con diferente fluorescencia, y a continuacion se pueden secuenciar estas reservas por separado para obtener de este modo aptameros de diferente calidad de enlace.

- En el caso de pequenas perlas magneticas en las que se inmoviliza el soporte se puede efectuar una union de oligonucleotidos al objetivo. De este modo se puede efectuar una separacion magnetica. Solo perlas de amplificado que se unen al objetivo inmovilizado interaccionan con las perlas magneticas y se separan a continuacion. A traves de una separacion en diferentes intensidades de campo magneticas se puede efectuar igualmente una formacion de reserva en zonas de diferente afinidad.

- Ademas son concebibles cargas competitivas, en las que se emplean, a modo de ejemplo, un objetivo y una molecula similar, y a continuacion se selecciona segun afinidad comun o diferente. Por ejemplo, si el objetivo presenta etiqueta fluorescente verde y la molecula similar presenta etiqueta fluorescente roja, se puede diferenciar en perlas que se unen solo al objetivo (verde), solo a la molecula similar (rojo), y que se unen a ambos (amarillo) y, de este modo, aptameros.

- Tambien es concebible una seleccion segun cinetica de activacion o desactivacion. A tal efecto, las perlas se incuban brevemente de modo correspondiente, y despues se miden inmediatamente (cinetica de activacion rapida, decisiva para la elevada intensidad de fluorescencia), o se incuban durante un tiempo prolongado y en alta concentracion, se lavan durante un tiempo muy prolongado y de manera intensiva, y despues se miden (cinetica de desactivacion lenta, decisiva para la elevada intensidad de fluorescencia).

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Identificacion de pares de enlace de aptamero

El procedimiento segun la invencion se puede completar con otros pasos, que sirven para la identificacion de pares de enlace de aptamero. De este modo, la invencion se refiere tambien a un procedimiento para la identificacion de pares de enlace de aptamero que se unen a diversos puntos de una estructura objetivo de aptamero, que comprende los pasos del procedimiento descrito anteriormente, y que comprende ademas:

a) La puesta en contacto del conjunto de amplificados o de la copia del conjunto de amplificados con la estructura objetivo de aptamero y union de la estructura objetivo de aptamero a oligonucleotidos, que estan contenidos en los amplificados del conjunto/de la copia del conjunto,

b) La puesta en contacto del conjunto contenido en a) o de la copia del conjunto con una mezcla de oligonucleotidos, y la union de al menos una parte de oligonucleotidos a la estructura objetivo de aptamero, que ya esta unida al conjunto,

c) La elucion de oligonucleotidos que no se han unido a la estructura objetivo de aptamero en b),

d) La eliminacion de oligonucleotidos unidos en b) de la estructura objetivo de aptamero,

e) La secuenciacion de oligonucleotidos contenidos en d), y la produccion o aislamiento de oligonucleotidos en forma pura segun su clase,

f) La puesta en contacto de un conjunto de amplificados o de la copia del conjunto de amplificados con la estructura objetivo de aptamero, y enlace de la estructura objetivo de aptamero a oligonucleotidos que estan contenidos en amplificados del conjunto/de la copia del conjunto,

g) La puesta en contacto del conjunto contenido en f) o de la copia del conjunto con un oligonucleotido puro segun su clase a partir de e) y la union del oligonucleotido a una o varias estructuras objetivo de aptamero, que ya esta/estan unida(s) al conjunto,

h) El analisis que verifica a que estructura(s) objetivo de aptamero en el conjunto se ha unido el oligonucleotido puro segun su clase, y la asignacion de la estructura objetivo al oligonucleotido del conjunto al que se ha unido este, y su identificacion de emplazamiento especifica en el conjunto,

i) Opcionalmente la repeticion simple o multiple de pasos g) y h).

Este procedimiento se denomina tambien "agrupacion de epitopos". En este procedimiento se lleva a cabo un ensayo tipo sandwich con aptameros. Se identifican dos aptameros que se unen al objetivo en diferentes grupos funcionales (“epitopos“).

Mediante la representacion de todos los aptameros potencialmente enlazantes en una superficie es posible encontrar selectivamentepares de aptameros que enlazan el objetivo con diferentes grupos funcionales en cada caso. Estos aptameros se pueden aplicar entonces en un ensayo tipo sandwich. Los metodos previos no permiten tal analisis altamente paralelo de pares de enlace.

La mezcla de oligonucleotidos empleada en el paso b) se puede obtener mediante una recuperacion a partir de una copia de aptamero, como se describe anteriormente.

Un control de enlace por medio de la tecnica iRlfS descrita anteriormente es ventajoso pero no imprescindible. A tal efecto, el conjunto (con el aptamero inmovilizado) o la copia del mismo se incuba primeramente con el objetivo, de modo que se forma un complejo aptamero-objetivo. Por medio de iRlfS se pueden identificar todos los enlazantes. Ahora se apila este conjunto con una reserva de aptameros, preferentemente de una recuperacion. En los puntos del complejo aptamero-objetivo en los que esta aun presente un grupo funcional se pueden unir aptameros apropiados de la reserva como aptameros secundarios. Por medio de iRlfS se puede determinar la union de aptameros secundarios. Despues se lava la superficie para eliminar los no enlazantes. Los aptameros secundarios se liberan ahora en un paso de elucion y se someten de nuevo a una secuenciacion. Por consiguiente, se cuenta con todas las secuencias de aptameros primarios y las secuencias de aptameros secundarios. Las respectivas secuencias de aptameros secundarios se producen por separado. Ahora se incuba de nuevo un conjunto copiado con el objetivo, y se incuba con los aptameros secundarios. De este modo es posible encontrar el aptamero primario adecuado correspondientemente a cada aptamero secundario, y derivar del mismo un par de enlace para el objetivo. Por medio de iRlfS se pueden analizar a su vez cinetica o comportamiento bajo diferentes condiciones, y seleccionar de nuevo pares de aptameros con propiedades deseadas de este modo.

Conjuntos y sus empleos, dispositivo

En otro aspecto, la divulgacion se refiere a un conjunto descrito anteriormente, constituido por amplificados que contienen respectivamente una clase de oligonucleotidos, o una copia de un conjunto de amplificados, que contienen respectivamente una clase de oligonucleotidos, obtenible segun los procedimientos descritos anteriormente, siendo los oligonucleotidos aptameros. Los oligonucleotidos presentan en especial una o varias zonas y regiones de cebador variables, como se ha descrito ya anteriormente por medio del procedimiento segun la invencion.

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Otros aspectos de la divulgacion se refieren al empleo de tal conjunto o a una copia de tal conjunto para el analisis de las propiedades de enlace de aptameros a una estructura objetivo de aptamero, para la identificacion de aptameros para una estructura objetivo predeterminada o para la identificacion de pares de enlace de aptamero que se unen a diversos puntos de una estructura objetivo de aptamero predeterminada. En esta descripcion se indicaron anteriormente procedimientos para la identificacion de aptameros y de pares de enlace de aptamero.

Finalmente, la divulgacion se refiere tambien a un dispositivo para la obtencion de aptameros, que comprende

- Una instalacion para la puesta en contacto de una mezcla de oligonucleotidos con una estructura objetivo de aptamero, y para la union de al menos una parte de oligonucleotidos a la estructura objetivo,

- Una instalacion para la separacion de oligonucleotidos que se han unido a la estructura objetivo de aptamero de la estructura objetivo de aptamero y de oligonucleotidos no unidos a la estructura objetivo de aptamero,

- Una instalacion para la amplificacion separada espacialmente de oligonucleotidos aislados que se han unido a la estructura objetivo de aptamero, y para la obtencion de varios amplificados separados espacialmente, conteniendo cada amplificado predominantemente una clase de oligonucleotidos,

- Una instalacion para la asignacion de una identificacion especifica a varios de los amplificados separados espacialmente, de modo que cualquiera de los amplificados caracterizados es identificable claramente por medio de su identificacion especifica,

- Una instalacion para la secuenciacion de oligonucleotidos en varios amplificados caracterizados y una instalacion para la asignacion de la identificacion especifica para un amplificado a la secuencia de la clase de oligonucleotidos en el amplificado,

- Una instalacion para el analisis de las propiedades de enlace de clases de oligonucleotidos a la estructura objetivo de aptamero, y la asignacion de las propiedades de enlaze analizadas a las identificaciones especificas de amplificados y las secuencias de las clases de oligonucleotidos.

Ademas, el dispositivo puede estar configurado y presentar dispositivos tales que este sea apropiado para la puesta en practica de todas las formas de realizacion y pasos complementarios del procedimiento descritos anteriormente. Anteriormente se explicaron ejemplos de realizacion de procedimientos segun la invencion. Los ejemplos de realizacion de dispositivos correspondientes, o bien instalaciones para implementar los pasos de procedimiento segun la invencion, resultan de la descripcion, o son evidentes para los expertos. De este modo, no se requiere explicar adicionalmente que un dispositivo puede presentar instalaciones de manejo apropiadas para posicionar las entidades fisicas, por ejemplo los diferentes conjuntos, soportes o sustratos, en caso necesario. Ademas, no se requiere explicar que pueden estar previstos dispositivos de logica fluidica apropiados para poner a disposicion los respectivos liquidos, o bien medios, en las posiciones necesarias. Ademas, para los expertos es evidente que puede estar previsto un correspondiente control para controlar el dispositivo, con el fin de realizar el procedimiento segun la invencion. Pueden estar igualmente previstos dispositivos para la generacion de un entorno necesario para la puesta en practica del procedimiento, a modo de ejemplo indicadores de temperatura.

La invencion se describe a continuacion por medio de ejemplos de realizacion.

1. Descripcion del procedimiento

A continuacion se explica un ejemplo de un procedimiento preferente por medio de la Fig. 1.

- Preparacion: diseno de la biblioteca de oligonucleotidos:

Preferentemente se disena una biblioteca de oligonucleotidos que sea compatible con una secuenciacion de siguiente generacion (NGS). Las regiones de cebador de la biblioteca se seleccionan compatibles para la secuenciacion (NGS) con el fin de introducir oligonucleotidos de ss-ADN que se unen al objetivo directamente en el proceso de secuenciacion por medio de NGS. Esta biblioteca de oligonucleotidos se puede emplear para difererentes procedimientos (por ejemplo para diferentes objetivos).

- Seleccion de aptameros para objetivo inmovilizado

Se pone en contacto una biblioteca de oligonucleotidos 1, constituida por ~1015moleculas de ssADN diferentes, con un objetivo 2, que se presenta inmovilizado en una perla objetivo 3, en un punto de enlace 4. De este modo se pueden unir oligonucleotidos individuales a la molecula objetivo y, de este modo, a las perlas objetivo 3. Mediante un paso de lavado 5 se eliminan los oligonucleotidos 1‘, que se han unido apenas, o no se han unido en absoluto a moleculas objetivo. Alternativamente a una biblioteca de oligonucleotidos de ssADN se puede emplear una biblioteca de oligonucleotidos de ARN.

- Elucion de oligonucleotidos enlazados del objetivo

Los oligonucleotidos enlazados remanentes se liberan de su enlace con el objetivo y, de este modo, de las perlas objetivo 3 mediante un paso de elucion apropiado 6.

- Generacion de perlas de oligonucleotido por medio de PCR en emulsion

Los oligonucleotidos eluidos 7 se someten a una PCR en emulsion 9. En primer lugar se copia exactamente sobre 5 una perla 10, y a continuacion se reproduce cada uno de los oligonucleotidos. Una perla 10 porta el oligonucleotido 7a, una perla adicional 10 porta el oligonucleotido 7b, una perla 10 adicional porta el oligonucleotido 7c, y otra perla adicional 10 porta el oligonucleotido 7d. Las perlas portan secuencias de adaptador unidas mediante enlace covalente (no mostradas), que son identicas en todas las perlas, y a las que se unen los oligonucleotidos por medio de apareamiento de bases. En la representacion seleccionada, dos perlas 10 portan el oligonucleotido 7d, que 10 estaba presente en la reserva reiteradamente. Es decisivo que cada perla 10 porte solo un determinado oligonucleotido. Por medio de una emulsion en aceite se consigue que se incluya respectivamente una hebra de oligonucleotido y una perla. Tras la PCR, cada perla 10 porta 10 millones de copias exactamente de un oligonucleotido, mostrandose cuatro a seis copias exactamente de un oligonucleotido por cada perla 10 en la representacion esquematica seleccionada en este caso. Se produce una reserva de perlas de oligonucleotido 10. De 15 este modo, el aDn se puede reproducir millones de veces en la perla. Si se emplea una biblioteca de oligonucleotidos de ARN, se lleva a cabo una PCR en emulsion de transcriptasa inversa. Segun perla empleada, en la perla se puede alojar opcionalmente un cebador directo o inverso. En el caso de un 454 de Roche se trata del adaptador de secuencia A, o bien B.

En la forma de realizacion mostrada se llevan a cabo un paso de enlace opcional adicional 11 y un paso de 20 seleccion 8 (seleccion de reserva). En el paso de enlace 11 se anade a las perlas 10 el objetivo 2 disuelto con los oligonucleotidos 7, que porta un marcador fluorescente 12. El objetivo marcado se une solo a una parte de oligonucleotidos, en la representacion del principio aqui seleccionada al oligonucleotido 7b, 7c y 7d, pero no a 7a. En el paso de seleccion 8 se seleccionan las perlas 10 con los oligonucleotidos 7b, 7c y 7d y el objetivo enlazado 2.

- Secuenciacion de perlas de oligonucleotido

25 Las perlas de oligonucleotido seleccionadas con los oligonucleotidos 7b, 7c y 7d se alimentan a un proceso de secuenciacion de siguiente generacion. Para la secuenciacion se introducen las perlas con perlas menores adicionales (no mostradas) en las cavidades 15 de una placa con micropocillos 14, en este caso denominada chip, en el paso de carga 13. Las perlas pequenas portan un sistema enzimatico, que genera luz en la incorporacion de componentes de ADN en el siguiente paso de secuenciacion 16. En este caso, la senal luminica es cuantitativa 30 respecto al numero de componentes de ADN incorporados. El chip 14 se asemeja a un panal en ampliacion. Cada celula del panal es una cavidad 15, que esta acoplada con una fibra luminosa (no mostrada, diametro ~ 45 pm), que contiene una perla con oligonucleotido. En resultado se obtienen las secuencias de todos los oligonucleotidos de la reserva seleccionada en el paso de seleccion 8.

En el caso de la tecnica de secuenciacion de rendimiento elevado se trata de una tecnica de secuenciacion de 35 siguiente generacion, en este caso un secuenciador 454 (Roche). Alternativamente, se pueden emplear otros secuenciadores, como los de Illumina, Solexa, Solid, Ion Torrent, ABI etc.

- Copia de oligonucleotidos del chip de secuenciacion para dar un conjunto de oligonucleotidos

Por medio de la tecnica de copia de ADN-a-ADN, los oligonucleotidos de la reserva seleccionada se copian sobre un soporte plano 18 a partir del chip de secuenciacion en forma de un conjunto 20 en un paso de copia 17. El conjunto 40 20 sobre el soporte 18 contiene todos los oligonucleotidos secuenciados, en este caso por ejemplo 7b, 7c, 7d. De

este modo se pueden generar hasta 106puntos (signo de referencia 19) con ADN, en primer lugar de hebra doble. Mediante pasos de elaboracion correspondientes se produce ss-ADN y, de este modo, ADN funcional para un enlace con el objetivo, portando cada punto 19 las secuencias unitarias de un oligonucleotido seleccionado. El paso de copia se explica mas detalladamente a continuacion por medio de las Fig. 2-5.

45 - Medida y analisis del conjunto obtenido

A continuacion se efectua en 21 un analisis del enlace de todos los oligonucleotidos del conjunto 20 para el correspondiente objetivo. Para una primera descripcion, la medicion se puede llevar a cabo, a modo de ejemplo, con un objetivo fluorescente. Los aptameros enlazantes son identificables entonces mediante su fluorescencia elevada.

En la forma de realizacion preferente, la deteccion de enlace se efectua por medio de la tecnica iRlfS explicada en la 50 descripcion general, cuya puesta en practica se describe en C. Hanel et al., Analytical and Bioanalytical Chemistry, 372 (2002) 91-100, J. Piehler et al. Analytical Biochemistry, 249 (1997) 94-102y el documentoUS2010297671. Con ello se puede verificar sin etiqueta y en tiempo real si, y en que intensidad y con que parametros cineticos tiene lugar una interaccion entre las moleculas objetivo y cada punto de ADN separado. La cinetica de enlace y las constantes

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

de afinidad de todos los aptameros en el conjunto se determinan paralelamente. Ademas se pueden efectuar investigaciones paralelas de la afinidad con el objetivo bajo diferentes condiciones (temperatura, pH, contenido en sales, etc.) y de la especificidad, analizandose simultaneamente hasta 106puntos de ADN en el conjunto.

- Asignacion de las secuencias de aptameros

Las constantes de afinidad de los oligonucleotidos separados se valoran de manera comparativa. Los aptameros son aquellos nucleotidos con las maximas afinidades con el objetivo. Sus secuencias se pueden extraer inmediatamente de los resultados del paso de secuenciacion 16, ya que mediante la tecnica de copia ADN-a-ADN en el paso 17 se garantiza que los puntos de aptamero 19 del conjunto de aptameros 20 se encuentran en las mismas posiciones que en el chip de secuenciacion 14. Por consiguiente, se da una clara asignacion entre enlace y secuencia.

2. Paso de copia

El paso de copia 17 empleado en el anterior ejemplo se explica mas detalladamente por medio de otros ejemplos de realizacion a) y b) en base a las Fig. 2A-2D, 3, 4 y 5.

Ejemplo de realizacion a) (Fig. 2A-2D, 3, 4)

Los signos de referencia para objetos identicos se seleccionan como en la Fig. 1.

El chip de secuenciacion 14 presenta una pluralidad de microcavidades 15. En la Fig. 3 se muestra una vista

superior esquematica de un corte del chip secuenciador 14 (primer soporte) con las microcavidades 15. Las

microcavidades pueden presentar, a modo de ejemplo, una medida de 44 pm, como se muestra en la Fig. 3. El chip secuenciador puede ser, a modo de ejemplo, un chip secuenciador (GS Titanium 2005 y GS FLX Titanium 2008) del secuenciador 454 de la firma Roche.

En todas las cavidades 15 se deposita una particula 10, portando cada una de estas particulas millones de copias

de un oligonucleotido 7b, 7c, 7d (vgl. Fig. 1), 7e (no mostrado en la Fig. 1). La variedad de copias se obtiene

mediante una PCR en emulsion, que es una amplificacion separada espacialmente y se explico por medio del anterior ejemplo. En la Fig. 4 se muestra una representacion en seccion transversal esquematica del chip secuenciador 14 con las cavidades 15, en el que se introducen las particulas 10 con los oligonucleotidos 7b, 7c, 7d, 7e.

En el ejemplo de realizacion representado en las Fig. 2 a Fig. 4, este chip se emplea como conjunto principal para la produccion de una copia. Se deben copiar los oligonucleotidos de las cavidades 15. Con este fin, las cavidades se rellenan primeramente con un medio de amplificacion, a modo de ejemplo una mezcla de PCR. Como se muestra en la Fig. 2b, a continuacion se aplica un soporte 18 (segundo soporte), que cierra las cavidades 15 y porta adaptadores de enlace adecuados para el medio de amplificacion, que se muestran esquematicamente como puntos 22 en 2b. Por lo tanto, tras el cierre de las cavidades 15 por medio de la tapa 18, para cada muestra, es decir, cada particula 10 con hebras de ADN unidas a la misma 7b, 7c, 7d, 7e se ha generado una zona de amplificacion limitada espacialmente 24, que esta separada de las zonas de amplificacion 24 de las demas muestras. Los adaptadores de enlace 22 limitan con estas zonas de amplificacion 24. En este ejemplo, los adaptadores de enlace 22 son cebadores, que hibridan con las contrahebras para dar los oligonucleotidos 7b, 7c, 7d, 7e. Estos cebadores 22 son tambien puntos de enlace para la ADN-polimerasa. La Fig. 2b muestra ya el estado tras el paso de amplificacion (en este caso el segundo paso de amplificacion una vez ya efectuada la PCR en emulsion, en la que se obtuvieron perlas con una variedad de oligonucleotidos, vease anteriormente), en el que se producen contrahebras complementarias 7b', 7c', 7d', 7e' de los oligonucleotidos 7b, 7c, 7d, 7e. Estas contrahebras se representan en la Fig. 2b como lineas discontinuas 7. Las contrahebras 7b', 7c', 7d', 7e' constituyen una copia negativa de los oligonucleotidos.

A continuacion se liberan de las particulas 10 las copias negativas creadas 7b', 7c', 7d', 7e' de los oligonucleotidos, lo que se puede efectuar, a modo de ejemplo, mediante calentamiento del chip secuenciador y, por consiguiente, de las cavidades en las que estan dispuestas. A continuacion, las copias liberadas 7b', 7c', 7d', 7e' hibridancon los adaptadores de enlace 22, lo que se puede favorecer, a modo de ejemplo, mediante enfriamiento del chip secuenciador. El resultado del deposito de las copias 7b', 7c', 7d', 7e' en el adaptador de enlace 22 y, por consiguiente, el soporte18, se representa en la Fig. 2c. En este paso de transferencia de copias negativas al soporte 18 se mantiene la informacion de emplazamiento, o bien el registro, ya que para cada muestra esta prevista una zona de amplificacion 24 limitada espacialmente, y las zonas de amplificacion 24 estan separadas entre si.

A continuacion se elimina el soporte 18 con las copias negativas unidas al mismo 7b', 7c', 7d', 7e' del chip secuenciador 14, y este contiene una copia negativa del conjunto de nucleotidos 7b, 7c, 7d, 7e en las cavidades 15 del chip secuenciador 14. El soporte 18 con las copias negativas 7b', 7c', 7d', 7e' se puede someter a un paso de

amplificacion adicional para obtener de nuevo copias positivas 7b, 7c, 7d, 7e, que se obtienen mediante prolongacion del cebador 22. Tal procedimiento se muestra en el siguiente ejemplo b).

Las particulas 10 con los oligonucleotidos 7b, 7c, 7d, 7e permanecen en las cavidades 15, de modo que estas pueden servir de nuevo como conjunto primario para un nuevo proceso de copia con un nuevo soporte. Por 5 consiguiente, se puede elaborar un numero de copias casi arbitrario.

Para preparar de nuevo el conjunto principal (el chip secuenciador 14) para un ciclo de copia ulterior tras el proceso de copia, el medio de amplificacion se puede sustituir o eliminar en las cavidades, a modo de ejemplo la mezcla de PCR.

Ejemplo de realizacion b) (Fig. 5)

10 Las perlas 10 portan respectivamente diferentes oligonucleotidos, pero con las mismas secuencias terminales. Se muestra el proceso por medio del oligonucleotido 7b. Las cavidades se rellenan con mezcla de PCR, que contiene cebador soluble 30 (b) y se cierran con una tapa 18 (segundo soporte) (c), que porta una molecula de adaptador 22 (cebador fijado). Las enzimas de la mezcla de PCR generan en el paso (d) primeramente una copia negativa 7b‘ del oligonucleotido 7b sobre la perla, que se libera mediante calentamiento (e). Mediante un proceso de enfriamiento (f), 15 la copia negativa 7b‘ se une al adaptador de enlace 22 de la copia, y las enzimas generan en el paso (g) una copia negativa 7b de la copia negativa unida solidamente, es decir, una copia positiva 7b del oligonucleotido original 7b. Al final del proceso se retira la tapa 18, sobre la que se encuentra ahora una copia (h) del conjunto (i). Las copias negativas no unidas mediante enlace covalente 7b', 7c', 7d', 7e' se pueden eliminar en un paso de lavado (no mostrado). Despues se emplea la copia del conjunto sobre el soporte 18 para ensayos de enlace con el objetivo.

20 La alimentacion (i) no se consume en este caso, se puede lavar y cargar de nuevo con una mezcla de PCR y reutilizar, por ejemplo para la repeticion del proceso y la produccion de copias adicionales.

Claims (12)

1. 5

   10

   15

   20

   25

   30

   35

   40

   45

   50

   REIVINDICACIONES

   1. - Procedimiento para la identificacion de aptameros, que comprende

   - La puesta en contacto de una mezcla de oligonucleotidos con una estructura objetivo de aptamero, y el enlace de al menos una parte de los oligonucleotidos a la estructura objetivo,

   - La separacion de oligonucleotidos que se han unido a la estructura objetivo de aptamero, de la estructura objetivo de aptamero y de oligonucleotidos no unidos a la estructura objetivo de aptamero,

   - La amplificacion separada espacialmente de todos los nucleotidos que se han unido a la estructura objetivo de aptamero, y la generacion de amplificados separados espacialmente para cada oligonucleotido, conteniendo cada amplificado predominantemente una clase de oligonucleotidos,

   - La asignacion de una identificacion de emplazamiento especifica en cada amplificado separado espacialmente, de modo que cada uno de los amplificados caracterizados es identificable claramente por medio de su identificacion de emplazamiento especifica,

   - La secuenciacion de oligonucleotidos de los amplificados caracterizados y la asignacion de la identificacion de emplazamiento especifica para el amplificado respecto a la secuencia de la clase de oligonucleotidos en el amplificado,

   - Produccion de un conjunto de amplificados, aplicandose los oligonucleotidos amplificados al menos en un primer soporte, de modo que el conjunto comprende puntos aislados con secuencias uniformes para cada oligonucleotido seleccionado,

   - El analisis de las propiedades de enlace de todas las clases de oligonucleotidos asignados a los amplificados en el ensayo en la estructura objetivo de aptamero, y la asignacion de las propiedades de enlace analizadas a las identificaciones de emplazamiento especificas de los amplificados y las secuencias de las correspondientes clases de oligonucleotidos,

   - Poniendose en contacto el conjunto de amplificados con la estructura objetivo de aptamero para el analisis de las propiedades de enlace.
2. 2. - Procedimiento segun la reivindicacion 1, en el que la amplificacion separada espacialmente es una amplificacion en una emulsion, una amplificacion digital o una amplificacion en una fase solida, y/o en el que la identificacion de emplazamiento especifica es una identificacion detectable por via optica, espectroscopica o radioactiva.
3. 3. - Procedimiento segun una de las reivindicaciones precedentes, que comprende la union de oligonucleotidos a particulas de fase solida antes de, durante o tras la amplificacion separada espacialmente, obteniendose particulas de fase solida a las que esta unido respectivamente solo un amplificado con una clase de oligonucleotidos, o que comprende la union de oligonucleotidos antes de, durante o tras la amplificacion separada espacialmente a particulas de fase solida, obteniendose particulas de fase solida a las que esta unido respectivamente solo un amplificado con una clase de oligonucleotidos, que comprende adicionalmente

   - La puesta en contacto de particulas de fase solida, a las que esta unido respectivamente un amplificado con una clase de oligonucleotidos, con estructura objetivo de aptamero,

   - La determinacion de un resultado de enlace positivo o negativo de la estructura objetivo de aptamero en oligonucleotidos del amplificado, que esta unido a una particula de fase solida,

   - La seleccion de particulas de fase solida en las que es verificable un resultado de enlace positivo.
4. 4. - Procedimiento segun una de las reivindicaciones 1-3, que comprende

   - La generacion de una copia o de un derivado del conjunto de amplificados con, sobre o en un segundo soporte, asignandose a cada amplificado de la copia o del derivado una identificacion de emplazamiento especifica,

   - La puesta en contacto de la copia o del derivado del conjunto con la estructura objetivo del aptamero para el analisis de las propiedades de enlace.
5. 5. - Procedimiento segun la reivindicacion 4, presentando el segundo soporte un adaptador de enlace para oligonucleotidos de los amplificados o propiedades de enlace para oligonucleotidos de los amplificados, y generandose la copia uniendose oligonucleotidos de los amplificados al soporte por medio del adaptador de enlace o las propiedades de enlace.
6. 6. - Procedimiento segun la reivindicacion 5, que comprende

   - La puesta a disposicion de al menos una zona de medio de amplificacion limitada espacialmente para cada oligonucleotido, que esta separado de las zonas de medio de amplificacion de los demas oligonucleotidos, limitando una superficie del segundo soporte, provista del adaptador de enlace o de propiedades de enlace, con las zonas de medio de amplificacion,

   - La amplificacion de oligonucleotidos a traves de medios de amplificacion en las zonas de medio de

   5

   10

   15

   20

   25

   30

   35

   40

   45

   50

   55

   amplificacion para la generacion de amplificados de los oligonucleotidos,

   - La union de hebras simples de amplificados o derivados de amplificados al segundo soporte por medio del adaptador de enlace o de las propiedades de enlace, de modo que una disposicion espacial de las hebras simples en el segundo soporte corresponde a la disposicion espacial de los amplificados en el conjunto del que proceden las hebras simples; y

   - La eliminacion del segundo soporte con las hebras simples enlazadas del conjunto.
7. 7. - Procedimiento segun la reivindicacion 6, en el que la union de las copias o los derivados al segundo soporte se efectua al mismo tiempo que la amplificacion.
8. 8. - Procedimiento segun la reivindicacion 6 o 7, en el que las zonas de medio de amplificacion limitadas espacialmente estan definidas al menos parcialmente por micro- o nanoestructuras en el primer soporte que porta el conjunto, o en el segundo soporte, que porta la copia o el derivado.
9. 9. - Procedimiento segun la reivindicacion 6 o 7, en el que las zonas de medio de amplificacion limitadas espacialmente estan separadas al menos parcialmente mediante limites de fase entre dos liquidos, un liquido y un gas, o un limite fisico.
10. 10. - Procedimiento segun la reivindicacion 8, en el que la generacion de al menos una zona de medio de amplificacion limitada espacialmente presenta una puesta a disposicion del segundo soporte con al menos una cavidad asignada a cada oligonucleotido, en el que esta dispuesto el adaptador de enlace, una introduccion del medio de amplificacion en las cavidades y un cierre de las cavidades por medio del primer soporte, de modo que los oligonucleotidos estan expuestos a la zona de medio de amplificacion, o

    En el que la generacion de al menos una zona de medio de amplificacion limitada espacialmente para cada oligonucleotido presenta una puesta a disposicion de los oligonucleotidos en cavidades separadas, asignadas respectivamente, en el primer soporte que porta el conjunto, una introduccion del medio de amplificacion en las cavidades y un cierre de las cavidades mediante el segundo soporte.
11. 11. - Procedimiento segun al menos una de las reivindicaciones precedentes, que comprende la recuperacion de una o varias clases de oligonucleotidos mediante liberacion de los oligonucleotidos del primer soporte, del segundo soporte y/o de copias de estos soportes, o

    Que comprende la produccion de oligonucleotidos adicionales mediante amplificacion de oligonucleotidos, que estan unidos al primer soporte, al segundo soporte y/o a copias de este soporte.
12. 12. - Procedimiento para la identificacion de pares de enlace de aptamero, que se unen a diversos puntos de una estructura objetivo de aptamero, que comprende los pasos del procedimiento segun una de las reivindicaciones 1-8, y comprende ademas:

    a) La puesta en contacto del conjunto de amplificados o de la copia del conjunto de amplificados, como se obtiene a partir de un procedimiento segun una de las reivindicaciones 1-9, con la estructura objetivo de aptamero y union de la estructura objetivo de aptamero a oligonucleotidos, que estan contenidos en los amplificados del conjunto/de la copia del conjunto,

    b) La puesta en contacto del conjunto contenido en a) o de la copia del conjunto con una mezcla de oligonucleotidos, y la union de al menos una parte de oligonucleotidos a la estructura objetivo de aptamero, que ya esta unida al conjunto,

    c) Diferenciandose los respectivos puntos de enlace de los oligonucleotidos enlazantes de la mezcla de los puntos de enlace de los oligonucleotidos que se encuentran en el conjunto, que se unen respectivamente a la misma estructura objetivo,

    d) La elucion de oligonucleotidos que no se han unido a la estructura objetivo de aptamero en b),

    e) La eliminacion de oligonucleotidos unidos en b) de la estructura objetivo de aptamero,

    f) La secuenciacion de oligonucleotidos contenidos en d), y la produccion o aislamiento de oligonucleotidos en forma pura segun su clase,

    g) La puesta en contacto de un conjunto de amplificados o de la copia del conjunto de amplificados, como se obtiene a partir de un procedimiento segun una de las reivindicaciones 1-8, con la estructura objetivo de aptamero, y enlace de la estructura objetivo de aptamero a oligonucleotidos que estan contenidos en amplificados del conjunto/de la copia del conjunto,

    h) La puesta en contacto del conjunto contenido en f) o de la copia del conjunto con un oligonucleotido puro segun su clase a partir de e) y la union del oligonucleotido a una o varias estructuras objetivo de aptamero, que ya esta/estan unida(s) al conjunto,

    i) El analisis que verifica a que estructura(s) objetivo de aptamero en el conjunto se ha unido el oligonucleotido puro segun su clase, y la asignacion de la estructura objetivo al oligonucleotido del conjunto al que se ha unido este, y su identificacion de emplazamiento especifica en el conjunto,

    j) Opcionalmente la repeticion simple o multiple de pasos g) y h).