JP6387302B2 - アプタマーを同定する方法 - Google Patents
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Description
標的に結合する工程と、
非結合DNAを除去する工程と、
結合DNAを標的から溶出する工程と、
PCRを用いて先に結合したDNAを増幅する工程と、
関連ssDNAをPCR産物から抽出する工程と、
からなる。
オリゴヌクレオチドの混合物をアプタマー標的構造物(以下、アプタマー標的構造という)と接触させるとともに、オリゴヌクレオチドの少なくとも一部を標的構造に結合させることと、
アプタマー標的構造に結合したオリゴヌクレオチドを、アプタマー標的構造及びアプタマー標的構造に結合していないオリゴヌクレオチドから分離することと、
アプタマー標的構造に結合した個々のオリゴヌクレオチドを空間的に分離して増幅するとともに、各々が主に同一の配列を有するオリゴヌクレオチド型を含有する幾つかの空間的に分離されたアンプリコンを生成することと、
空間的に分離されたアンプリコンの複数に対して、好ましくは空間的に分離されたアンプリコンの全てに対して特異的な識別を、マーキングされた各々のアンプリコンがその特異的なマーカーに基づいて明確に識別可能であるように行うことと、
複数のマーキングされたアンプリコン、好ましくは全てのマーキングされたアンプリコンのオリゴヌクレオチドをシークエンシングするとともに、アンプリコン、好ましくはシークエンシングによって調査された各アンプリコンに特異的なマーカーを、アンプリコンのオリゴヌクレオチド型の配列に割り当てることと、
アプタマー標的構造に対するオリゴヌクレオチド型の結合特性を分析するとともに、分析された結合特性を、アンプリコンの特異的なマーカー及びオリゴヌクレオチド型の配列に割り当てることと、
を含む、アプタマーを同定及び/又は作製する方法によって達成される。
非常に多数の潜在的アプタマーの並行したシークエンシング及び結合特性の分析の可能性。下記の変形例を用いたシークエンシングは、最大で106個のオリゴヌクレオチドの並行した配列分析を可能にする。このため、最大で106個のオリゴヌクレオチドを一度に選択し、分析し、検証し、標的とのインキュベーションにおける親和性を比較することによってアプタマー群を最後に見出すことができる。
本明細書で用いられるような空間的に分離された増幅では、各々のオリゴヌクレオチドが個別に増幅される。先の増幅では、オリゴヌクレオチドが増幅において互いに対しても競合し、増幅効率の劣ったオリゴヌクレオチドが、その結合品質にかかわらず失われ得る。
「個々のオリゴヌクレオチドの空間的に分離された増幅」という用語は以下の意味を有する:単一オリゴヌクレオチドが或る特定の配列を有するオリゴヌクレオチドである。全てのオリゴヌクレオチドを、個々のオリゴヌクレオチドが各々互いに空間的に分離されて増幅され、得られるアンプリコンも他の全てのアンプリコンから空間的に分離されたままであるように増幅する。したがって、個々のアンプリコンの混合は起こらない。
各々の空間的に分離されたアンプリコンに基づいて明確に識別可能な特異的なマーカーが生じる。同定は原則として考え得る任意の方法で行うことができ、特に光学的に検出することができるアンプリコンの空間的位置又は配列に基づく、特に光学的、分光学的、放射能による又は電子的な方法(例えばバーコード又はRFIDチップを用いる)である。一変形例では、アンプリコンは特異的なマーカー、例えば付加的なDNA配列、質量分析タグ又は同位体標識を備える。アンプリコンが支持体、例えば上記のような固相粒子に結合する場合、マーカー又は標識が支持体又はその位置に存在するのが好ましい。アンプリコンを担持する支持体がマーキング及び/又は標識されていることから、結合したアンプリコンもしたがって同様にマーキングされている。決定的ではないが可能なマーカーとしては、バーコード、カラーコード、サイズ、形状、空間的位置又は配置、質量分析タグ、同位体標識、DNA標識が挙げられる。
上述のように、各々のアンプリコンは主に若しくは大半が増幅因子及び増幅条件に応じて、又はほぼ排他的に出発分子(マトリックス)として使用される単一オリゴヌクレオチドの配列に対応する同一の配列を有する1つのオリゴヌクレオチド型を含有する。いわゆるシークエンシング法が、アンプリコン内のオリゴヌクレオチドの配列の解読に用いられる。シークエンシング機器には、初めにオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチド、特にそれにより得られるDNAを捕捉し、それらを複製した後、それらを出力して、ビルディングブロックのブロックを構成する様々な反応工程及び技法が用いられる。選択されたシークエンシング法の反応化学を用いて、続いて個々のキャビティの各々についてそれが含有するオリゴヌクレオチドのDNA配列を算出することが可能である。
最後に、マーキングされたアンプリコンのオリゴヌクレオチド型のアプタマー標的構造への結合特性の分析を行う。したがって、アンプリコンに含まれるオリゴヌクレオチド型の配列を有するオリゴヌクレオチドをアプタマー標的構造と接触させる。プロセスの一変形例では、空間的に分離されたアンプリコンをアプタマー標的構造と接触させてもよい。必ずしもアンプリコン自体及びそれに含まれるオリゴヌクレオチドをアプタマー標的構造と接触させる必要はない。「オリゴヌクレオチド型の結合特性の分析」という表現は、或る特定のオリゴヌクレオチド型と同じ配列を有し、したがってその型に帰属するが、マーキングされたアンプリコン中に既に存在しないオリゴヌクレオチドの分析も含む。例えば、下記の特別な実施の形態に記載されているようにオリゴヌクレオチドのコピーを生成し、分析することができる。このため、「オリゴヌクレオチド型の結合特性の分析」という表現は、特にアンプリコン内のオリゴヌクレオチドをアプタマー標的構造と接触させ、及び/又はオリゴヌクレオチドのコピーをアプタマー標的構造と接触させることも含む。
i)陽性結合事象又は陰性結合事象を、アンプリコン及びアンプリコンに含まれるオリゴヌクレオチド型の配列の特異的なマーカーに割り当てることと、
ii)陽性結合事象が検出されるオリゴヌクレオチドを、標的構造のアプタマーとして同定することと、
を含み得る。
別の実施の形態では、この方法は、
第2の支持体内又は支持体上にアンプリコンのアレイのコピー又は誘導体を生成することであって、それにより特異的な位置マーカーを特異的なマーカーとしてコピー又は誘導体の各々のアンプリコンに割り当てることと、
アレイのコピー又は誘導体をアプタマー標的構造と接触させることと、
を含む。
結合アダプター又は結合特性を備える第2の支持体の表面が増幅因子領域に隣接するように、各々のオリゴヌクレオチドについて、他のオリゴヌクレオチドの増幅因子領域から分離された少なくとも1つの空間的に制限された増幅因子領域を設ける工程と、
オリゴヌクレオチドのアンプリコンを生成するのに、オリゴヌクレオチドを増幅因子領域内の増幅因子によって増幅する工程と、
第2の支持体上の一本鎖の空間的配置が、一本鎖が由来するアレイにおけるアンプリコンの空間的配置に対応するように、アンプリコンの一本鎖又はアンプリコンの誘導体を結合アダプター又は結合特性によって第2の支持体に結合する工程と、
一本鎖が結合した第2の支持体をアレイから除去する工程と、
を含む。
先の実施の形態の補足として、このプロセスは、オリゴヌクレオチドを第1の支持体、第2の支持体又はこれらの支持体のコピーから取り出すことによって、1つ又は複数のオリゴヌクレオチド型をコピーから回収することを含む。支持体のコピーとしては、上で既に論考したコピー方法を使用して第1の支持体内若しくは支持体上のアレイから得られる付加的なコピー、又は第2の支持体上のコピーから得られるコピーが挙げられる。しかしながら、好ましい実施の形態は第2の支持体、特に配列のDNAコピーの使用を提供する。この実施の形態では、オリゴヌクレオチド又はそのアンプリコンを、空間分解能によって放出することができるように固定化する。第2の支持体上のコピーされたDNAアレイでは、これはフォトリンカーを使用することによって実行することができ、そのオリゴヌクレオチドは部分的に結合するが、短波長レーザーを用いて放出することができる。このため、例えばiRIfSを用いた結合分析の後、アプタマーを標的化されるようにレーザーを用いて放出させ、溶出することができる。溶出物はその後PCR等の付加的な工程に即座に利用可能である。このため、アプタマーは直接増幅することができ、再度デノボ合成する必要はない。下により詳細に記載されるように、「エピトープビニング」がもたらされる場合、回収されたアプタマーは二次アプタマーとして試験することができ、それによりそのサンドイッチ構造の結合パートナーを直接同定することができる。
本プロセスの別の実施の形態では、アンプリコンを固相粒子に結合し、プロセスは付加的に、
各々がそれに結合する1つのオリゴヌクレオチド型を含むアンプリコンを有する固相粒子を、アプタマー標的構造と接触させる工程と、
固相粒子に結合するアンプリコンのオリゴヌクレオチドに対するアプタマー標的構造の陽性結合事象又は陰性結合事象を確認する工程と、
陽性結合事象を確認することができる固相粒子を選択する工程と、
を含む。
ビーズの蛍光に基づく親和性の簡単な推定を、蛍光標識標的を用いて行うことができる。これはFACS機器を用いて行うことができる(例えば蛍光活性化細胞選別)。次いで、ビーズを蛍光の異なるプールに分けることができ、これらのプールを続いて別個にシークエンシングし、結合能の異なるアプタマーを得ることができる。
標的を小磁性ビーズに固定化する場合、オリゴヌクレオチドを標的に結合させることができる。次いで、磁気分離を行うことができる。固定化された標的に結合するアンプリコンビーズのみが磁性ビーズと相互作用し、続いて分離される。異なる磁場強度での分離を用いてプールを親和性の異なる領域に形成してもよい。
加えて、例えば標的及び類似分子を使用し、続いて選択を同じ又は異なる親和性について行う競合的アプローチも考え得る。例えば、標的を緑色蛍光で標識し、類似分子を赤色蛍光で標識する場合、差別化は標的の結合のみ(緑色)、類似分子の結合のみ(赤色)及び両方の結合(黄色)のビーズ、ひいてはアプタマーとなり得る。
オン/オフ動態による選択も考え得る。これはビーズを短時間インキュベートした後、それらを即座に測定するか(速いオン動態が高い蛍光強度に不可欠である)、又は長時間高濃度でインキュベートし、非常に長時間激しく洗浄した後、測定する(遅いオフ動態が高い蛍光強度に不可欠である)ことによって行われる。
本発明のプロセスにアプタマー対を同定する働きがある付加的な工程を補足することができる。したがって、本発明は、アプタマー標的構造の様々な位置に結合するアプタマー結合対を同定する方法であって、上記のプロセスの工程を含み、付加的に、
a)アンプリコンのアレイ又はアンプリコンのアレイのコピーをアプタマー標的構造と接触させるとともに、アプタマー標的構造をアレイのアンプリコン/アレイのコピーに含まれるオリゴヌクレオチドに結合させることと、
b)工程a)で得られるアレイ又はアレイのコピーをオリゴヌクレオチドの混合物と接触させるとともに、オリゴヌクレオチドの少なくとも一部をアレイに既に結合したアプタマー標的構造に結合させることと、
c)工程b)においてアプタマー標的構造に結合していないオリゴヌクレオチドを溶出させることと、
d)工程b)において結合したオリゴヌクレオチドをアプタマー標的構造から除去することと、
e)工程d)で得られるオリゴヌクレオチドをシークエンシングするとともに、純粋な形態のオリゴヌクレオチド型を作製又は単離することと、
f)アンプリコンのアレイ又はアンプリコンのアレイのコピーをアプタマー標的構造と接触させるとともに、アプタマー標的構造をアレイ/アレイのコピーの増幅時に存在するオリゴヌクレオチドに結合させることと、
g)工程f)で得られるアレイ又は(or)アレイのコピーを工程e)の純粋なオリゴヌクレオチド型と接触させるとともに、オリゴヌクレオチドをアレイに既に結合した1つ又は複数のアプタマー標的構造に結合させることと、
h)アレイ上のどのアプタマー標的構造(複数の場合もあり)に純粋なオリゴヌクレオチド型が結合しているかを分析するとともに、標的構造をそれが結合したアレイのオリゴヌクレオチド及びアレイ内のその特異的な位置マーカーに割り当てることと、
i)任意に工程g)及び工程h)を1回又は複数回繰り返すことと、
を含む、方法にも関する。
別の態様では、本発明は、各々が1つのオリゴヌクレオチド型を含有する上記のアンプリコンのアレイ、又は上記の方法によって得ることができる、各々が1つのオリゴヌクレオチド型を含有するアンプリコンのアレイのコピー(ここでオリゴヌクレオチドはアプタマーである)に関する。特に、オリゴヌクレオチドは、本発明によるプロセスを参照して上に既に説明したように1つ又は複数の可変領域及び一次領域を有する。
オリゴヌクレオチドの混合物をアプタマー標的構造と接触させるとともに、オリゴヌクレオチドの少なくとも一部を標的構造に結合させるユニット、
アプタマー標的構造に結合したオリゴヌクレオチドを、アプタマー標的構造及びアプタマー標的構造に結合していないオリゴヌクレオチドから分離するユニット、
アプタマー標的構造に結合した個々のオリゴヌクレオチドを空間的に分離して増幅するとともに、各々が好ましくは1つのオリゴヌクレオチド型を含有する複数の空間的に分離されたアンプリコンを得るユニット、
空間的に分離されたアンプリコンの複数に対して特異的なマーカーを、マーキングされた各々のアンプリコンがその特異的なマーカーに基づいて明確に識別可能であるように生じさせるユニット、
複数のマーキングされたアンプリコンのオリゴヌクレオチドをシークエンシングするユニット、及びアンプリコンに特異的なマーカーを、アンプリコンのオリゴヌクレオチド型の配列に割り当てるデバイス、
アプタマー標的構造に対するオリゴヌクレオチド型の結合特性を分析するとともに、分析された結合特性を、アンプリコンの特異的なマーカー及びオリゴヌクレオチド型の配列に割り当てるユニット、
を含む、デバイスにも関する。
好ましい方法の一例を図1を参照して下記に説明する。
次世代シークエンシング(NGS)に適合するオリゴヌクレオチドライブラリーを、好ましくは設計する。ライブラリーのプライマー領域をシークエンシング(NGS)に適合するように選択し、標的結合ssDNAオリゴヌクレオチドを直接NGSによるシークエンシングプロセスに供する。このオリゴヌクレオチドライブラリーは、様々なプロセスに(例えば、様々な標的に対して)使用することができる。
結合工程4においては、およそ1015個の異なるssDNA分子からなるオリゴヌクレオチドライブラリー1を、標的ビーズ3に固定化した標的2と接触させる。個々のオリゴヌクレオチドをこのようにして標的分子、ひいては標的ビーズ3に結合することができる。次いで、標的分子に僅かしか又は全く結合していないオリゴヌクレオチド1’を洗浄工程5によって除去する。RNAオリゴヌクレオチドライブラリーを、ssDNAのオリゴヌクレオチドライブラリーの代替物として使用してもよい。
残存する結合オリゴヌクレオチドをその標的結合、ひいては標的ビーズ3から好適な溶出工程6によって放出させる。
溶出したオリゴヌクレオチド7をエマルションPCR9に供する。初めに、各々のオリゴヌクレオチドを正確に1つのビーズ10へとコピーした後、再生する。或るビーズ10はオリゴヌクレオチド7aを担持し、別のビーズ10はオリゴヌクレオチド7bを担持し、また別のビーズ10はオリゴヌクレオチド7cを担持し、更に別のビーズ10はオリゴヌクレオチド7dを担持する。ビーズは、全てのビーズについて同一であり、オリゴヌクレオチドが塩基対合によって結合する共有結合したアダプター配列(図示せず)を担持する。選択図では、2つのビーズ10が、プールに数倍存在していたオリゴヌクレオチド7dを担持する。決定的要因は、各々のビーズ10が或る特定のオリゴヌクレオチドのみを担持することである。油エマルションを使用して、いずれの場合にも1つのオリゴヌクレオチド鎖及び1つのビーズが封入される結果を達成する。PCRの後、各々のビーズが正確に1つのオリゴヌクレオチドの1000万個のコピーを有し、本明細書に示す概要図では、各々のビーズ10についてオリゴヌクレオチドの4個〜6個のコピーが存在する。オリゴヌクレオチドビーズ10のプールが得られる。DNAはビーズ上に何度も複製することができる。RNAオリゴヌクレオチドライブラリーを使用した場合、逆転写酵素エマルションPCRを行う。
オリゴヌクレオチド7b、7c及び7dを有する選択されたオリゴヌクレオチドビーズを、次世代シークエンシングプロセスに送る。シークエンシングのために、充填工程13において、ビーズを付加的なより小さいビーズ(図示せず)とともにピコウェルプレート14(本明細書でチップと称する)のキャビティ15に添加する。小さなビーズは、以下のシークエンシング工程16においてDNAビルディングブロックの組込みの際に光を発生する酵素系を担持する。光シグナルは組み込まれるDNAビルディングブロックの数について定量的である。チップ14はハニカムのように拡大して示される。各々のハニカムセルは、光ファイバー(図示せず、直径およそ45μm)に連結し、オリゴヌクレオチドを有するビーズを含有するキャビティ15を表す。結果として、これにより選択工程8において選択されたプールの全てのオリゴヌクレオチドの配列が得られる。
DNAからDNAへのコピー技法を用いて、選択されたプールのオリゴヌクレオチドを、コピー工程17においてアレイ20の形態でシークエンサーチップから平坦な支持体18へとコピーする。支持体18上のアレイ20は、シークエンシングした全てのオリゴヌクレオチド、すなわち本明細書では例えば7b、7c、7dを含有する。このため、最大で106個のスポット(19として示す)を初めは二本鎖DNAで生成することが可能である。対応する後処理(workup)工程において、ssDNAを作製することにより、標的結合に対して機能的なDNAを作製し、各々のスポット19が、選択されたオリゴヌクレオチドの均一な配列を担持する。図2〜図5を参照してコピー工程を下記により詳細に説明する。
次に、対応する標的に対するアレイ20の全てのオリゴヌクレオチドの結合の分析を工程21において行う。初めの概要については、例えば蛍光標的を用いて測定を行うことができる。次いで、結合アプタマーをその蛍光の増大によって同定することができる。
個々のオリゴヌクレオチドの親和性定数を比較して評価する。アプタマーは、標的に対する親和性が最も高いオリゴヌクレオチドである。DNAからDNAへのコピー技法により、工程17において、アプタマーアレイ20のアプタマースポット19がシークエンサーチップ14と同じ位置に位置することが確実であるため、その配列はシークエンシング工程16の結果から直接導き出すことができる。これにより結合と配列との間で明確な割当てをもたらすことができる。
上記の例に用いられるコピー工程17を、図2A〜図2D、図3、図4及び図5を参照して付加的な例示的な実施形態a)及びb)に基づいてより詳細に説明する。
同一の対象に対する参照番号は図1に使用するものと同じである。
ビーズ10は各々異なるが、同じ末端配列を有するオリゴヌクレオチドを担持する。このプロセスはオリゴヌクレオチド7bに基づいて示される。可溶性プライマー30を含有するPCRミックスでキャビティを充填し(b)、アダプター分子22(固定プライマー)を担持するカバー18(第2の支持体)で閉鎖する(c)。工程(d)において、PCRミックス中の酵素により初めにビーズ上にオリゴヌクレオチド7bのネガコピー7b’を生成し、このネガコピーを続いて加熱によって溶解する(e)。ネガコピー7b’はカバーの結合アダプター22に冷却プロセスによって結合し(f)、工程(g)において酵素により固定されて結合したネガコピーのネガコピー7b、すなわちオリジナルのオリゴヌクレオチド7bのポジコピー7bが生成する。プロセスの終了時に、カバー18を除去すると、アレイ(i)のコピー(h)がカバー上に位置する。非共有結合ネガコピー7b’、7c’、7d’、7e’を洗浄工程(図示せず)において除去することができる。次に、支持体18上のアレイのコピーを標的結合実験に使用する。
7:オリゴヌクレオチド
7a:オリゴヌクレオチド
7b:オリゴヌクレオチド
7c:オリゴヌクレオチド
7d:オリゴヌクレオチド
8:選択工程
9:エマルションPCR
10:ビーズ
11:任意の付加的な結合工程
12:蛍光標識
13:充填工程
14:ピコウェルプレート
14:チップ
15:キャビティ
16:シークエンシング工程
17:コピー工程
18:支持体
20:アレイ
21:分析工程
22:スポット
22:結合アダプター
22:プライマー
22:アダプター分子
24:増幅領域
30:可溶性プライマー
Claims (23)
- アプタマーを同定する方法であって、
(1)複数のオリゴヌクレオチドの混合物を固相担体に結合されたアプタマー標的構造物(以下、アプタマー標的構造という)と接触させるとともに、該オリゴヌクレオチドの少なくとも一部を該標的構造に結合させる工程と、
(2)前記アプタマー標的構造に結合した該オリゴヌクレオチドを、該アプタマー標的構造から及び該アプタマー標的構造に結合していないオリゴヌクレオチドから分離する工程であって、該アプタマー標的構造に結合していないオリゴヌクレオチドを除去するために洗浄する工程と該アプタマー標的構造に結合したオリゴヌクレオチドを溶出する工程からなる連続的な2工程を含む工程と、
(3)前記アプタマー標的構造に結合した複数の個々のオリゴヌクレオチドを空間的に分離して増幅するとともに、複数の幾つかの空間的に分離されたアンプリコンを生成する工程であって、ここで該アンプリコンの各々は同一の塩基配列を持つオリゴヌクレオチドを含有し、個々のアンプリコンは前記空間的分離に基づき混合がない(以下空間的分離とは複数当該物の混合がない状態をいう、以下同様)、工程と、
(4)前記空間的に分離された複数のアンプリコンの各々に対して1つの特異的なマーカーを導入し、該特異的なマーカーによってマーキングされた各々のアンプリコンがその特異的なマーカーの性質に基づいて明確に識別可能であるように調製する工程と、
(5)マーキングされた複数のアンプリコンにおけるオリゴヌクレオチドをシークエンシングするとともに、そのアンプリコンに該特異的なマーカーを、各々の該アンプリコンに含まれる前記オリゴヌクレオチドの該シークエンシングにより得られた配列に、各々割り当てる工程と、
(6)1つ又は複数の第1の支持体内又は支持体上の局所的に分離された領域(場所を意味する)に、複数の前記アンプリコンを配置する工程であって、ここで複数の前記アンプリコンのアレイを得る、工程と、
(7)前記アンプリコンの前記アレイに配置された同一の塩基配列のオリゴヌクレオチドの全てのアプリコンについて、前記アプタマー標的構造に対する、当該同一配列のオリゴヌクレオチドの結合特性、ここで結合特性は相互作用の存在若しくは結合動態若しくは親和性定数から選択できる、を分析するとともに、該分析された結合特性を、前記アンプリコンの特異的なマーカー及び同一の塩基配列の各々のオリゴヌクレオチドの配列に割り当てる工程であって、ここで前記結合特性の分析のために、前記アプリコンの前記アレイが、前記アプタマー標的構造と接触させられる、工程、
を含む、方法。 - 空間的に分離された増幅が、エマルション中での増幅、デジタル増幅又はブリッジ増幅である、請求項1に記載の方法。
- 前記特異的なマーカーが、特異的な位置マーカー、光学的に検出可能なマーカー、分光学的に検出可能なマーカー若しくは放射能により検出可能なマーカーである、請求項1又は2に記載の方法。
- 前記特異的なマーカーが位置配置により検出可能である、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
- 複数の前記オリゴヌクレオチドを複数の固相粒子に結合させる工程であって、同一の塩基配列を持つオリゴヌクレオチドを有する1つのアンプリコンのみが結合する固相粒子を得る、工程を含む、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
- 同一の塩基配列を持つオリゴヌクレオチドを有するアンプリコンが結合する複数の前記固相粒子を、前記アプタマー標的構造と接触させる工程と、
固相粒子に結合する前記アンプリコンのオリゴヌクレオチドに対する前記アプタマー標的構造の陽性結合事象を検出する工程と、
陽性結合事象を検出することができる固相粒子を選択する工程と、
を含む、請求項5に記載の方法。 - 第2の支持体内又は支持体上に前記アンプリコンのアレイのコピーを生成する工程であって、特異的な位置マーカーを特異的なマーカーとして前記コピーの各々のアンプリコンに割り当てる、工程と、
前記アレイのコピーを結合特性の分析のために前記アプタマー標的構造と接触させる工程と、
を含む、請求項4〜6のいずれか一項に記載の方法。 - 前記第2の支持体が、前記アンプリコンのオリゴヌクレオチドに対する結合アダプター、又は前記アンプリコンのオリゴヌクレオチドに対する結合特性を有し、前記コピーは、前記アンプリコンのヌクレオチドを、前記結合アダプター又は結合特性によって、前記支持体に結合させることによって生成される、請求項7に記載の方法。
- 各々のオリゴヌクレオチドについて、少なくとも1つの空間的に制限された増幅因子領域を設ける工程であって、前記結合アダプター又は結合特性を備える前記第2の支持体の表面が、前記増幅因子領域に隣接する、工程と、
前記オリゴヌクレオチドを前記増幅因子領域内の増幅因子によって増幅する工程であって、該オリゴヌクレオチドのアンプリコンを生成する、工程と、
前記アンプリコンの一本鎖を前記結合アダプター又は結合特性によって前記第2の支持体に結合する工程であって、第2の支持体上の前記一本鎖の空間的配置が、該一本鎖が由来する前記アレイにおける前記アンプリコンの空間的配置に対応し、ここで該アンプリコンの一本鎖とは、該オリゴヌクレオチドの一本鎖及び/又はそれらの相補鎖である、工程と、
前記一本鎖が結合した前記第2の支持体を前記アレイから除去する工程と、
を含む、請求項8に記載の方法。 - 前記コピーと前記第2の支持体との結合を増幅と同時に行う、請求項9に記載の方法。
- 前記空間的に制限された増幅因子領域が、前記アレイを担持する前記第1の支持体内のマイクロ又はナノ構造によって規定(設定ともいう、以下同様)される、又は前記コピーを担持する前記第2の支持体内のマイクロ又はナノ構造によって規定される、請求項9又は10に記載の方法。
- 各々のオリゴヌクレオチドについての少なくとも1つの空間的に制限された増幅因子領域の生成が、前記アレイを担持する前記第1の支持体内のそれぞれ割り当てられた複数の別個の凹部に前記オリゴヌクレオチドを供給する工程と、前記増幅因子を該凹部に導入する工程と、該凹部を前記第2の支持体を用いて密封する工程とを含む、請求項11に記載の方法。
- 少なくとも1つの空間的に制限された増幅因子領域の生成が、前記結合アダプターを配置する各々のオリゴヌクレオチドに割り当てられた少なくとも1つの凹部を前記第2の支持体に設ける工程と、前記増幅因子を該凹部に導入する工程と、前記オリゴヌクレオチドが前記増幅因子領域に曝露されるように前記第1の支持体を用いて前記凹部を密封する工程とを含む、請求項11に記載の方法。
- 前記空間的に制限された複数の増幅因子領域が2つの液体の相境界、又は物理的障壁によって分離される、請求項9又は10に記載の方法。
- 複数の前記オリゴヌクレオチドを前記第1の支持体、前記第2の支持体及び/又はこれらの支持体の追加的コピーから放出させることによって、同一の塩基配列のオリゴヌクレオチドの1つ又は複数を回収する工程を含む、請求項4〜14のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第1の支持体、前記第2の支持体及び/又はこれらの支持体のコピーに結合する複数のオリゴヌクレオチドの増幅によって付加的なオリゴヌクレオチドを作製する工程を含む、請求項4〜14のいずれか一項に記載の方法。
- アプタマー標的構造の様々な位置に結合する、アプタマー結合対のいくつかを同定する方法であって、請求項4〜16のいずれか一項に記載の方法の工程を含み、付加的に、
a)請求項4〜16のいずれか一項に記載の方法によって得られる複数のアンプリコンのアレイ又は複数のアンプリコンのアレイのコピーを前記アプタマー標的構造と接触させるとともに、該アプタマー標的構造を該アレイのアンプリコン若しくは該アレイのコピーに含まれるオリゴヌクレオチドに結合させる工程と、
b)a)で得られる前記アレイ又は該アレイのコピーを複数のオリゴヌクレオチドの混合物と接触させるとともに、該オリゴヌクレオチドの少なくとも一部を前記アレイに既に結合した前記アプタマー標的構造に結合させる工程と、
c)b)において前記アプタマー標的構造に結合していないオリゴヌクレオチドを除去する工程と、
d)b)において結合したオリゴヌクレオチドを前記アプタマー標的構造から溶出する工程と、
e)d)で得られるオリゴヌクレオチドをシークエンシングするとともに、その配列が全て同一であることを意味する純粋な形態である同一の塩基配列のオリゴヌクレオチドを調製又は単離する工程と、
f)請求項4〜16のいずれか一項に記載の方法によって得られる複数のアンプリコンのアレイ又は複数のアンプリコンのアレイのコピーを前記アプタマー標的構造と接触させるとともに、該アプタマー標的構造を、該アレイ若しくは該アレイのコピーに結合しているアンプリコンに含まれるオリゴヌクレオチドに結合させる工程と、
g)f)で得られるアレイ又はアレイのコピーをe)の純粋な同一の塩基配列のオリゴヌクレオチドと接触させるとともに、該オリゴヌクレオチドを前記アレイに既に結合した1つ又は複数のアプタマー標的構造に結合させる工程と、
h)前記アレイ上のどのアプタマー標的構造(複数の場合もあり)に前記純粋な同一の塩基配列のオリゴヌクレオチドが結合しているかを分析するとともに、該標的構造をそれが結合した該アレイのオリゴヌクレオチド及び該アレイ内のその特異的な位置マーカーに割り当てる工程と、
を含む、方法。 - 前記工程g)及び工程h)が、1回又は複数回繰り返される、請求項17に記載の方法。
- 請求項4〜18のいずれか一項に記載の方法によって得ることができる、各々が、同一の塩基配列のオリゴヌクレオチドを含有するアンプリコンのアレイ、又は各々が、同一の塩基配列のオリゴヌクレオチドを含有するアンプリコンのアレイのコピーの製造方法であって、前記オリゴヌクレオチドがアプタマーである、複数のアンプリコンのアレイ又は複数のアンプリコンのアレイのコピーの製造方法。
- 前記アプタマーが1つ又は複数のランダム化した領域及びプライマー領域を含み、該プライマー領域はプライマーにハイブリダイズし及びプライマー結合サイトとして役立つ、請求項19に記載の製造法。
- アプタマー標的構造に対するアプタマーの結合特性の分析への請求項19又は20に記載の方法によって製造されたアレイの使用
- 所定のアプタマー標的構造上の様々な位置に結合するアプタマー結合対の同定のための請求項19又は20に記載のアレイの使用。
- 複数のアプタマーを同定するデバイスであって、
(1)オリゴヌクレオチドの混合物を固相担体に結合したアプタマー標的構造と接触させるとともに、該オリゴヌクレオチドの少なくとも一部を該標的構造に結合させるデバイス、
(2)前記アプタマー標的構造に結合したオリゴヌクレオチドを、該アプタマー標的構造及び該アプタマー標的構造に結合していないオリゴヌクレオチドから分離するデバイスであって、該アプタマー標的構造に結合していないオリゴヌクレオチドを除去するために洗浄することと該アプタマー標的構造に結合したオリゴヌクレオチドを溶出することからなる連続的な2工程をおこなうデバイス、
(3)前記アプタマー標的構造に結合した個々のオリゴヌクレオチドを空間的に分離して増幅するとともに、各々のアンプリコンが同一の塩基配列をもつオリゴヌクレオチドを含有する空間的に分離された複数のアンプリコンを得るデバイス、
(4)前記空間的に分離されたアンプリコンの各々に対して一つの特異的なマーカーを生じさせるデバイスであって、マーキングされたアンプリコンの各々がその特異的なマーカーの性質に基づいて明確に識別可能である、デバイス、
(5)マーキングされた複数のアンプリコンにおけるオリゴヌクレオチドをシークエンシングするデバイス、及びそのアンプリコンに該特異的なマーカーを、各々の該アンプリコンに含まれる前記オリゴヌクレオチドの該シークエンシングにより得られた塩基配列に、各々割り当てるデバイス、
(6)1つ又は複数の第一の支持体内の若しくは第一の支持体上の、局所的に分離された複数の領域(場所を意味する)に、前記アンプリコンを配置する装置であって、そこで前記アンプリコンのアレイが得られる、
(7)前記アンプリコンの前記アレイに配置された同一の塩基配列のオリゴヌクレオチドを持つ全てのアンプリコンについて、前記アプタマー標的構造に対する同一の塩基配列のオリゴヌクレオチドの結合特性、ここで結合特性は相互作用の存在若しくは結合動態若しくは親和性定数から選択できる、を分析するとともに、該分析された結合特性を、前記アンプリコンの特異的なマーカー及び同一の塩基配列の該各々のオリゴヌクレオチドの該配列に割り当てる、デバイスであって、ここで前記結合特性の分析のために、前記アプリコンの前記アレイが、前記アプタマー標的構造と接触させられる、
を含む、デバイス。
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