CN105120849B - 用于检测生物物质的方法和材料 - Google Patents

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Abstract

本文提供检测样品中的生物物质的方法。检测是基于聚集体的形成。公开的组合物包括标记粒子和/或聚集粒子。标记粒子和聚集粒子可各自包括结合于粒子的受体。受体可直接连接于粒子，或通过连接体间接连接于粒子。一种检测方法可为目视的，并且另一检测方法可包括对形成的聚集体的高级定量。

Description

用于检测生物物质的方法和材料
领域
本公开涉及被设计以通过形成可检测和可定量聚集体来检测流体中和表面上的生物物质以及定量它们的浓度的材料，并且涉及制造和使用所述材料的方法。
背景
每年消耗可观资源来测量和检测微生物和生物物质。确保产品、公共场所、血液和组织库、空气和水供应物无微生物污染是重大公共关注问题。在这些中的任一个中出现微生物和有害生物污染都是重大健康风险，并且对其进行检测和控制是必要的。
此外，不存在用于直接检测如体液的样品中的细菌，以及用于诊断感染的测定。当前方法代之以例如通过用以特定确定亚硝酸盐、白细胞或白细胞酯酶的存在的尿分析以及针对葡萄糖或pH的化学测试来间接诊断。如果确认，那么对感染的诊断是通过可为艰巨且耗时的细菌培养来如此进行。类似地，不存在针对脑脊髓液中的细菌的可用于快速诊断细菌性脑膜炎的直接测试，所述细菌性脑膜炎是一种快速进展性中枢神经系统感染，如果不迅速启动抗生素治疗，那么其通常是致命的。培养方法太缓慢以致不适用于诊断所述感染。
常规检测方法也可为误导性的，并且不提供允许立即采取行动的快速结果。尽管当前方法可为有效检测和定量一些类型的微生物的工具，但大多数方法是针对特定微生物和生物物质的基于培养或(如果开发)基于分子的技术。然而，这些方法可为艰难且耗时的。此外，许多微生物未能具有特定、可靠检测方法，如许多病毒。一些微生物也可对处理造成太大危险，因此无检测方法可用。
存在用于基于检测特定细菌性抗原来灵敏检测广泛范围的各种细菌物种的许多测试。然而，所述测试是有限的，因为它们不能直接应用于测试其中细菌性病原体的范围未知的样品。此外，所述测试包括用于预先富集生物物质的额外步骤。在进行通告的测试之前，所述步骤可花费1至3天。因此，仍然需要开发能够检测广泛范围的已知和未知微生物的易于采用的、快速且准确的检测方法。
概述
本公开提供制造和使用标记粒子和制剂来检测靶标样品中的生物物质的方法。由于生物物质连接于标记粒子，一种检测方法可为目视的。使用如磁性分离、过滤或倾析的方法，可使所得生物物质-粒子复合物自样品物理分离。目视检测方法可用裸眼进行。其它检测方法可用于定性或定量生物物质。
一些实施方案涉及检测生物物质的方法，其包括以下步骤：使包含所述生物物质的样品在包含粒子和结合于所述粒子的受体的标记粒子上方通过或与所述标记粒子混合，以及通过使所述生物物质吸附于所述标记粒子来检测所述生物物质。粒子可为各种尺寸的例如金属纳米粒子。受体可为已知或预期会结合靶标生物物质的任何化学部分。在一个示例性实施方案中，组合物可包括在粒子与受体之间桥接的连接体。连接体共价结合于粒子和受体，并且它可为直链或支链分子或聚合物。此外，靶标生物物质可为例如微生物、蛋白质或血液产物。不需要预先富集靶标生物物质。
一些实施方案涉及检测生物物质的方法，其包括以下步骤：使包含所述生物物质的样品在两者均包含粒子和结合于所述粒子的受体的标记粒子和聚集粒子上方通过或与所述标记粒子和所述聚集粒子混合，以及通过使所述生物物质吸附于所述标记粒子以及吸附于所述聚集粒子来检测所述生物物质。使用聚集粒子的一个优势在于增加所得生物物质-粒子聚集体的尺寸。标记粒子和聚集粒子可含有各种尺寸的琼脂糖、砂、织物、金属粒子、磁性粒子或其组合。标记粒子和/或聚集粒子中的受体可为已知或预期会结合靶标生物物质的任何化学部分。在一个示例性实施方案中，标记粒子和/或聚集粒子的组合物可包括在粒子与受体之间桥接的连接体。连接体共价或物理结合于粒子和受体，并且它可为直链或支链小分子或聚合物。标记粒子和聚集粒子可含有相同或不同连接体和/或受体。此外，靶标生物物质可为例如微生物、蛋白质或血液产物。
检测生物物质的方法也可包括目视检测吸附于标记粒子和/或聚集粒子的所述生物物质作为一种检测方法。这个目视检测可在待测试的流体中或表面上进行。
在一些实施方案中，检测生物物质的方法可包括通过过滤装备过滤吸附于标记和/或聚集粒子的所述生物物质作为另一检测方法。在一些实施方案中，方法可包括用磁性分离器分离吸附于磁性粒子的生物物质作为另一检测方法。
方法也可包括定性或定量吸附于标记粒子或聚集粒子或其组合的生物物质或其组合作为一种检测方法。对生物物质-粒子聚集体的检测用裸眼实现，或使用能够定性和定量颜色和它们的强度的工具、软件和应用程序电子实现。所述工具可包括光密度测量装置和软件以及颜色强度测量装置和软件。
本公开也提供制造标记粒子和/或聚集粒子，包括在粒子上固定受体的方法。受体可为肝素或乳糖。
附图简述
附图已被包括在本文中以使本公开的上述特征、优势和目标将变得明晰，并且可被详细理解。这些附图形成说明书的一部分。然而，应注意附图说明适合实施方案，并且不应被视为限制本公开的范围。
图1说明通过形成光散射聚集体来检测生物物质，例如微生物。
图2说明三个不同实施方案：用受体直接或通过连接体间接使粒子官能化。
图3A-D说明使受体直接连接于粒子的实例。
图4A-D说明通过连接体使受体连接于粒子的实例。
图5说明当使用1,1’-羰基二咪唑时的一般性共价偶联途径。
图6说明应用的图示。
图7说明标记粒子官能化金纳米粒子与聚集粒子官能化砂的聚集。
图8说明标记粒子官能化金纳米粒子与聚集粒子官能化PGMA的聚集。
图9说明本公开的应用实例；所述实例被分类为定性生物检测方法。
图10说明本公开的应用实例；所述实例被分类为定量生物检测方法。
图11说明本公开的应用实例；所述实例被分类为已知聚集体检测方法与发明的方法的组合。
图12说明显示大肠杆菌细菌聚集体的吸光度与检查的溶液中的大肠杆菌细菌的滴度之间的关联的结果的实例。
描述
使用地点检测是在实际上使用产品或服务所处的地点进行。当在使用地点处实现对生物物质的检测时会获得重大益处。所述益处的实例包括限制或避免暴露于获取适当测试和检测方法是不可行的偏远或贫困地区的受感染流体，在输注之前检测受感染的血液供应物和它们的产品，以及警告在空气中或在表面上存在感染性粒子。另一实例是在测试地点处诊断异常体液组合物以及警告患者在疾病发作之后立刻采取针对它们的行动。所述早期检测方法可加速康复，并且降低与医学治疗相关的成本。
使用最少材料和装置检测生物物质对于使用地点诊断来说极具吸引力。尽管基于纳米粒子的技术可为适用的，但两种主要方法基于抗原-抗体相互作用和核酸的识别。两种技术均需要昂贵装置和试剂。
现将描述某些示例性实施方案以提供对本文公开的装置和方法的结构、功能、制造和使用的原理的全面了解。这些实施方案的一个或多个实例说明于附图中。本领域技术人员将了解本文明确所述以及附图中明确说明的装置和方法是非限制性示例性实施方案，并且本公开的范围仅由权利要求限定。与一个示例性实施方案关联说明或描述的特征可与其它实施方案的特征组合。所述修改和变化意图包括在本公开的范围内。
本文在上文或下文引用的所有公布、专利和专利申请都据此以引用的方式整体并入本文。除非内容另外明确规定，否则如本说明书和随附权利要求中所用，单数形式“一”和“所述”包括复数个指示物。本公开中所用的术语遵循由本领域普通技术人员通常接受的标准定义。在可能需要任何进一步解释的情况下，以下已进一步阐明一些术语。
公开的方法和材料允许目视检测靶标生物物质。在例如官能化纳米粒子的标记粒子存在下，靶标生物物质可触发吸收、反射或散射光或其任何组合的聚集体的形成。此外，在由标记粒子和生物物质组成的制剂中任选存在聚集粒子可增强归因于光的吸收、反射或散射或其组合的信号。所述灵巧材料可提供关于使用地点处的流体中的生物物质的关键信息。最终，可使聚集体的颜色的强度与特定生物物质的浓度相关联。方法可类似于“针对生物物质的石蕊测试”。
如本文所用的术语“生物物质”是指活生物体和它们的产物，包括但不限于细胞、组织、组织产物、血液、血液产物、蛋白质、疫苗、抗原、抗毒素、病毒、微生物、真菌、酵母、藻类、细菌等。生物物质的一个实例可包括微生物，如病原性或非病原性细菌。生物物质的另一实例可包括病毒、病毒产物、病毒模拟实体或其任何组合。
如本文所用的“微生物”(即微生物)可为单细胞或多细胞生物体，并且包括如原核生物(例如细菌和古细菌)、真核生物(例如原虫、真菌、藻类、微观植物和动物)和病毒的生物体。举例来说，细菌可为革兰氏阴性或革兰氏阳性。在一些实施方案中，微生物选自金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、链球菌属(Streptococcus)、大肠杆菌(E.coli)、绿脓假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、分枝杆菌属(mycobacterium)、腺病毒、鼻病毒、天花病毒、流感病毒、疱疹病毒、人免疫缺陷病毒(HIV)、狂犬病、切昆贡亚热(chikungunya)、重度急性呼吸综合征(SARS)、疟疾、登革热(dengue fever)、结核、脑膜炎、伤寒、黄热病(yellow fever)、埃博拉(ebola)、志贺菌属(shingella)、李斯特菌属(listeria)、耶尔森氏菌属(yersinia)、西尼罗病毒(West Nile virus)、原虫、真菌、肠道沙门氏菌(Salmonella enterica)、白色念珠菌(Candida albicans)、须癣毛癣菌(Trichophytonmentagrophytes)、脊髓灰质炎病毒、产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)、伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumonia)、巴西曲霉(Aspergillus brasiliensis)和甲氧西林抗性金黄色葡萄球菌(MRSA)。
公开的方法和材料可通过形成可见聚集体，如裸眼可见的那些来检测生物物质。标记粒子的光散射、吸收、反射或其任何组合可用于检测靶标生物物质。聚集粒子和其它粒子也可在光散射、吸收或反射制剂或其任何组合中用于检测靶标生物物质。
本公开提供用以产生在存在与不存在靶标生物物质之间以及在靶标生物物质的浓度变化后展现物理差异的标记纳米粒子的方法。所述差异可被目视检测，如用裸眼检测，或可使用能够定性和定量颜色和它们的强度的工具、软件和应用程序来定性和定量。标记粒子的一个实例可包括磁性或金属纳米粒子，如金纳米粒子。不存在靶标生物物质也可抑制所述聚集体的形成。
在一个实施方案中，“标记粒子”可结合靶标生物物质并形成聚集体。在一些实施方案中，所得聚集体可散射、吸收和/或反射光以进行目视检测。在一些实施方案中，聚集体可通过如磁性、过滤、倾析或相分离方法或其任何组合的物理分离技术来分离。也可使用由本领域技术人员所知的其它分离技术。
一些实施方案包括“聚集粒子”以增强由标记粒子结合于生物物质产生的信号。聚集粒子可用于增加聚集体的尺寸。所述增加可导致更易于检测以及在不同浓度的生物物质之间更准确区别(图1)。所述聚集粒子的实例可包括不溶于检查的流体中的材料复合物，如官能化砂、官能化琼脂糖和官能化聚合物。
标记和聚集粒子的三种主要组分的实例包括：1)琼脂糖、砂、织物(如纤维素/棉花、羊毛、尼龙、聚酯)、金属粒子(包括纳米粒子,如金纳米粒子或银纳米粒子)、磁性粒子(包括纳米粒子)、玻璃、纤维玻璃、二氧化硅、木材、纤维、塑料、橡胶、陶瓷、瓷、石料、大理石、水泥、生物聚合物、天然聚合物和合成聚合物[如聚(甲基丙烯酸缩水甘油酯)(PGMA)]或其任何组合的可具有各种尺寸的粒子；2)受体,如乳糖(天然和合成)和它的衍生物(如唾液酰基乳糖)、单糖和多糖、肝素和壳聚糖或多种类型的粒子的任何组合；以及3)连接体,如直链或支链小分子或聚合物,如聚(乙二醇)(PEG,例如多臂支链PEG-胺)和聚(乙烯亚胺)(PEI,各种比率的伯胺基:仲胺基:叔胺基)、枝化单元和树枝状聚合物(例如超支化双-MPA聚酯-16-羟基)和壳聚糖或其任何组合。各材料可并有粒子和受体组分。然而，并有连接体组分是任选的。此外，标记粒子可为含有各种类型的粒子、受体和任选连接体的制剂。
公开的于标记和聚集粒子中的粒子可用捕集基团(“受体”)官能化,所述捕集基团的结构可为或源于细胞受体、抗体,或由描述靶标生物物质与可溶性分子的相互作用的可用数据合成获得。受体可直接连接于粒子(图2,模式A)或通过连接体连接于粒子(图2,模式B)。为保护粒子的分子结构的完整性,特别是在需要再使用标记和聚集粒子时,一种使受体、粒子和任选连接体相互连接的方法是通过共价结合来实现。对于其中不需要附加结构稳定性的某些应用,例如在单次使用材料的情况下,物理结合可替代共价结合。受体通过物理结合捕集生物物质来起直接作用。连接体的一个作用在于使受体定位在离粒子的核心一定有效距离处。通过隔开受体与粒子的核心,受体可易于接近靶标生物物质。连接体的另一作用(特别是在所述连接体是支链时)在于增加受体在粒子的表面上的密度(图2,模式C)。受体的密度增加与捕集较高浓度的生物物质的能力增加相关联。在一些实施方案中,连接于标记粒子的受体和连接于聚集粒子的受体是相同受体(例如乳糖分子可连接于标记粒子以及连接于聚集粒子)。在一些实施方案中,连接于标记粒子的受体和连接于聚集粒子的受体是不同受体(例如乳糖分子可连接于标记粒子,而肝素分子可连接于聚集粒子)。
标记和聚集粒子中的示例性受体可包括:1)肝素,即一种模拟见于宿主细胞的膜中的天生糖胺聚糖的带负电荷聚合物。它可以自猪肠粘膜提取,并且被核准为血液抗凝剂的肝素钠形式商购获得。此外,非动物源性合成肝素模拟磺酸聚合物可以与天然肝素类似的方式起作用；2)壳聚糖,即一种可连接于多种微生物和蛋白质的生态友好生物杀虫剂。它也用作止血剂以及用于经皮药物递送中；以及3)乳糖,即乳品行业的一种副产物。它是可广泛获得的,并且每年以数百万吨产生。乳糖也可通过缩合/脱水两种糖,即半乳糖和葡萄糖,包括所有它们的异构体来合成。
标记和聚集粒子中的示例性粒子可包括金属或磁性粒子，如碱、碱性、过渡、过渡后、镧系和锕系金属元素或化合物。金属或磁性元素或化合物的一些实例包括但不限于锂、钠、钾、铷、铯、钫、铍、镁、钙、锶、钡、镭、铝、镓、铟、锡、铊、铅、铋、钪、钛、钒、铬、锰、铁、钴、镍、铜、锌、钇、锆、铌、钼、锝、钌、铑、钯、银、镉、镧、铪、钽、钨、铼、锇、铱、铂、金、汞、锕、钅卢、钅杜、钅喜、钅波、钅黑、钅麦、钅达、钅仑、铈、镨、钕、钷、钐、铕、钆、铽、镝、钬、铒、铥、镱、镥、钍、镤、铀、镎、钚、镅、锔、锫、锎、锿、镄、钔、锘和铹、它们的衍生物、盐和氧化物或其任何组合，包括用以形成磁性化合物的组合。在一个实施方案中，金纳米粒子可为粒子。在这个实施方案中，纳米粒子的尺寸越小，反射的颜色将越红。此外，在这个实施方案中，纳米粒子的尺寸越大，反射的颜色将越蓝/紫。
标记和聚集粒子中的其它示例性粒子可包括但不限于玻璃、二氧化硅、砂、木材、纤维、天然和合成聚合物、橡胶、铜、金、银、铂、锌、石料、不锈钢、镍、钛、钽、铝、镍钛诺(Nitinol)、因康镍合金(Inconel)、铱、钨、硅、镁、锡、合金和含有任何前述各物的涂料、镀锌钢、热浸渍镀锌钢、电镀锌钢、退火热浸渍镀锌钢或其任何组合。
适于使用的玻璃材料包括但不限于钠钙玻璃、锶玻璃、硼硅酸盐玻璃、钡玻璃、含有镧的玻璃-陶瓷以及其任何组合。
适于使用的砂材料包括但不限于包含二氧化硅(例如石英、熔融石英、结晶二氧化硅、煅制二氧化硅、硅胶和二氧化硅气凝胶)、碳酸钙(例如霰石)或其任何混合物的砂。砂可包含其它组分,如矿物质(例如磁铁矿、绿泥石、海绿石、石膏、橄榄石、石榴石)、金属(例如铁)、壳体、珊瑚、石灰石、岩石或其任何组合。
适于使用的木质材料包括但不限于硬木材和软木材以及自木材、木屑或纤维工程改造的材料(例如胶合板、定向条板、层压胶合板木材、复合物、条木材、碎木板、硬质板、中等密度纤维板)。木材的类型包括但不限于桤木、桦木、榆木、枫木、柳木、胡桃木、樱桃木、橡木、山胡桃木、白杨木、松木、杉木或其任何组合。
适于使用的纤维材料包括但不限于天然纤维(例如源于动物、植物或矿物质)和合成纤维(例如源于纤维素、矿物质或聚合物)。适合天然纤维包括但不限于棉花、大麻、黄麻、亚麻、苎麻、剑麻、甘蔗渣、木质纤维、蚕丝、蜘蛛丝、腱、肠线、羊毛、海丝、羊毛、马海毛、安哥拉山羊毛(angora)和石棉。适合合成纤维包括但不限于人造丝、莫代尔(modal)和莱塞尔(Lyocell)、金属纤维(例如铜、金、银、镍、铝、铁)、碳纤维、碳化硅纤维、竹纤维、海藻纤维(seacell)、尼龙、聚酯、聚氯乙烯纤维(例如维荣(vinyon))、聚烯烃纤维(例如聚乙烯、聚丙烯)、丙烯酸聚酯纤维、芳族聚酰胺(例如TWARONTM、KEVLARTM或NOMEXTM)、斯潘德克斯(spandex)或其任何组合。
适于使用的天然聚合物材料包括但不限于多糖(例如棉花、纤维素)、虫胶、琥珀、羊毛、丝、天然橡胶、生物聚合物(例如蛋白质、细胞外基质组分、胶原蛋白)或其任何组合。
适于使用的合成聚合物材料包括但不限于聚乙烯吡咯烷酮、丙烯酸系物、丙烯腈-丁二烯-苯乙烯、聚丙烯腈、缩醛、聚苯醚、聚酰亚胺、聚苯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、聚(甲基丙烯酸缩水甘油酯)、聚四氟乙烯、聚偏二氟乙烯、聚氯乙烯、聚乙烯亚胺、聚酯、聚醚、聚酰胺、聚原酸酯、聚酸酐、聚砜、聚醚砜、聚己内酯、聚羟基-丁酸酯戊酸酯、聚内酯、聚氨基甲酸酯、聚碳酸酯、聚对苯二甲酸乙二酯以及其共聚物或任何组合。
适于使用的橡胶材料包括但不限于硅酮、氟硅酮、腈橡胶、硅酮橡胶、聚异戊二烯、硫固化橡胶、丁二烯-丙烯腈橡胶、异戊二烯-丙烯腈橡胶等或其任何组合。
适于使用的陶瓷材料包括但不限于氮化硼、氮化硅、氧化铝、二氧化硅等或其任何组合。
适于使用的石料材料包括例如花岗岩、石英、石英岩、石灰石、白云岩、砂岩、大理石、皂石、蛇纹石或其任何组合。
标记和聚集粒子中的示例性连接体可包括但不限于:1)壳聚糖,参见它作为受体的描述；2)直链或支链聚(乙二醇)和它们的衍生物,其自氧化乙烯产生,并且具有许多不同化学、生物学、商业和工业用途；3)直链或支链聚(乙烯亚胺)(PEI,各种比率的伯胺基:仲胺基:叔胺基)；以及4)作为相对新型分子的枝化单元和树枝状聚合物。它们是使用少数起始试剂实现的重复支链化分子。它们通常用于药物递送中以及传感器中。
在一些实施方案中,在“标记粒子”的核心处的粒子可为金纳米粒子。
在一些实施方案中,用于同时检测多种已知和未知微生物的受体可包括肝素和它的衍生物。
在一些实施方案中,受体可直接连接于粒子(图3),或通过化学偶联,通过连接体连接于粒子(图4)。一种类型的偶联试剂是1,1’-羰基二咪唑(CDI)。然而,可使用其它偶联试剂,如N,N’-二环己基碳二亚胺(DCC)或N-(3-二甲基氨基丙基)-N’-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC或EDCI)。
一示例性偶联试剂是CDI。如表面水解的金的碱性质子化末端基团易于与CDI反应以形成酯或酰胺连接。使所得咪唑取代的衍生物与羟基封端的受体反应,从而产生碳酸酯[R-O-C(O)-O-受体]或氨基甲酸酯[R-N(H)-C(O)-O-受体]。也可使所得咪唑取代的衍生物与胺封端的受体反应,从而产生脲衍生物[R-N(H)-C(O)-N(H)-受体](图5)。由于在受体与粒子之间形成共价键(直接结合或通过连接体),所以结合的受体的结构相较于可商购获得的游离受体的结构是不同的。举例来说,如图6中所描绘,受体在与咪唑取代的衍生物反应以形成受体-碳酸酯、受体-氨基甲酸酯或受体-脲衍生物后释放一个氢原子。
如果适当官能团不存在于粒子的表面上，那么通常可通过化学转化来使表面上有适合官能团可用。一般来说，化学转化可为水解、氧化(例如使用柯林斯试剂(Collinsreagent)、戴斯-马丁高碘烷(Dess-Martin periodinane)、琼斯试剂(Jones reagent)和高锰酸钾)、还原(例如使用硼氢化钠或氢化铝锂)、烷基化、去质子化、亲电加成(例如卤化、氢卤化、水合)、氢化、酯化、消除反应(例如脱水)、亲核取代、基团取代或重排反应。如果需要，那么超过一个化学转化(连续或同时)可用于提供适合官能团或一组具有各种身份的异质官能团。或者，可将具有所需官能团的单体接枝于材料。
在一些实施方案中，化学转化是水解。通常，水解用水在无机、有机或有机金属强酸(例如无机强酸，如盐酸、硫酸、磷酸、硝酸、氢碘酸、氢溴酸、氯酸和高氯酸)或无机、有机或有机金属强碱(例如第I族和第II族氢氧化物，如氢氧化锂、氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铷、氢氧化铯、氢氧化镁、氢氧化钙和氢氧化钡；氢氧化铵；以及碳酸钠)存在下进行。举例来说，包含酰卤的材料可经受水解以形成羧酸。
在一些实施方案中，化学转化是取代反应，其中一个官能团被另一官能团置换。举例来说，可使包含卤烷基的材料与强碱反应以形成羟基。
在一些实施方案中，化学转化是烷基化、氢化或还原。举例来说，可使包含羟基或卤烷基(例如碘烷基或溴烷基)部分的材料与氨反应以形成氨基。也可通过使用硫脲进行S-烷基化来使包含卤烷基部分的材料转化成巯基。可使包含腈的材料氢化以形成氨基。可使包含酰胺基的材料还原(例如在氢化铝锂存在下)以形成氨基。可使包含甲酰基或酮基的材料还原以形成氨基或羟基。可同时或连续应用多个均质或异质转化。
可使用适合温度(例如室温、回流)、反应时间、溶剂、催化剂和浓度，通过任何适合方法来形成标记和聚集粒子。在一些实施方案中，过量连接体和受体将用于确保标记和聚集粒子中存在有效量的受体。
在一些实施方案中，在受体、连接体和粒子之间的连接可以物理方式加以确保。这是通过以下方式来实现：混合溶解于溶剂中的受体或连接体或其组合与粒子，接着使溶剂在空气中或在真空下蒸发。
在一些实施方案中，可直接混合粒子与待测试的流体，包括固体和表面的流体冲洗液。粒子通常包括标记粒子。包括聚集粒子是任选的。当应用两种类型的粒子时，粒子与待测试的流体的混合可为同时的，其中使两种类型的粒子同时与流体混合。这也可为连续的，其中首先使一种类型的粒子与流体混合，继之以另一类型。
一示例性应用方法是用以指示测试样品中存在或不存在靶标生物物质的定性测试。直接使待测试的流体与标记粒子混合。在混合和任选孵育之后，使混合物流过聚集粒子床和/或过滤材料床。通过检测聚集粒子床和/或过滤材料床中的聚集体来指示靶标生物物质的存在(图9)。可通过裸眼和/或通过更高级技术(如电子技术)来实现对聚集体的检测。
另一示例性应用方法是用以指示测试样品中的靶标生物物质的滴度的定量测试。滴度可为零或大于零。除待测试的流体之外，在这个示例性应用中也处理含有已知滴度的靶标生物物质的样品。使待测试的含有未知滴度的靶标生物物质的流体和含有已知滴度的流体直接且分别与标记粒子混合。在混合和任选孵育之后，使混合物流过聚集粒子床和/或过滤材料床。可使含有已知滴度的样品的聚集水平与已知滴度的靶标生物物质相关联。通过检测聚集粒子床和/或过滤材料床中的聚集体来指示靶标生物物质在待测试的流体中的存在。此外，通过将由待测试的流体所致的聚集水平与具有已知滴度的样品的聚集水平进行比较来获得靶标生物物质的滴度(图10)。可通过裸眼和/或通过更高级技术来定量样品的聚集水平，所述技术如电子技术，如光密度测量、颜色强度定量应用程序、软件以及相关装置，如照相机和照相电话(图11)。适于检测和/或定量聚集水平的方法是使这个水平的值与聚集体的颜色强度相关联。
在一些实施方案中，材料可用于进行使用地点生物检测(图6)。可检测并定量包括空气和其它气体的流体中的生物物质。流体的实例可包括但不限于水、体液、唾液、呕吐物、尿、泪、汗液、胆汁、母乳、脑脊髓液、粪便、腹泻物、身体精液、身体分泌物、脓液、粘液、淋巴液、胃酸和胃液、耳垢、水疱、汁液、细胞内和细胞外液、血液和血液产物、饮用水、废水、工业水、家居水、工厂流体和空气。
在一些实施方案中,材料可用于在空气和其它气体中进行使用地点生物检测。可检测并定量空气和其它气体中的生物物质。在空气中进行生物检测的方法的一个实例是用流体冲洗与待检查的空气或气体直接接触的表面。在那之后,应用本文所述的方法来检查所得流体冲洗液中的生物物质。在一个实例中,表面可为如医院、商场、旅馆、飞机、船、列车、机场、海港、边界、市场的环境中的空气调节(冷却或加热)装置和系统的空气过滤器。在另一实例中,表面可为呼吸面具的空气过滤器。
在一些实施方案中，材料可用于在固体和表面上进行使用地点生物检测。可检测并定量固体表面上的生物物质。在固体表面上进行生物检测的方法的一个实例是用流体冲洗待检查的表面。在那之后，应用本文所述的方法来检查所得流体冲洗液中的生物物质。涂布和未涂布的固体表面的实例可包括或源于例如像以下各物的任何适合形式：粉末、粉尘、聚集体、非晶固体、薄片、纤维、管、织品等。在一些实施方案中，固体表面可包括不限于金属、玻璃、纤维玻璃、二氧化硅、砂、木材、纤维、天然聚合物、合成聚合物、塑料、橡胶、陶瓷、瓷、石料、大理石、水泥、人体或动物体、植物、食物、水果、蔬菜或肉或其任何组合。在其它实施方案中，固体表面可包括不限于薄片、织物、实验室外套、外套、手套、窗帘、门把手、桌子、电话、导轨、键盘、计算机、屏幕、底板、升降机底板等或其任何组合。
本公开也涉及包含一种或多种本文所述的标记粒子和/或任何一种或多种本文所述的聚集粒子的组合物，以及包括任何一种或多种本文公开的组合物和/或用于制备和/或使用它们的试剂的试剂盒。在一些实施方案中，组合物包含一种或多种本文所述的标记粒子。在一些实施方案中，组合物包含任何一种或多种本文所述的聚集粒子。在一些实施方案中，组合物包含任何一种或多种本文所述的标记粒子和任何一种或多种本文所述的聚集粒子。
受体也可与靶标生物物质，如微生物或病毒可逆地相互作用。可如通过洗脱使生物物质自受体解吸。如高于生理性的氯化钠溶液和含乳糖溶液的洗脱剂能够使生物物质自聚集和标记粒子解吸。
2013年3月14日提交的美国临时申请序列号61/784,820以引用的方式整体并入本文。
实施例
实施例1:合成壳聚糖-PGMA(图3A)
合成遵循这些步骤：通过向400mL水中添加2g酸来制备400mL的含0.5％乙酸的去离子(DI)水。向这个酸溶液中添加2g低分子量壳聚糖，并且使溶液在室温下搅拌5分钟直至它变为单相。接着，添加200mg PGMA，并且使最终混悬液在室温下搅拌2小时。接着经中等玻璃料过滤最终灰白色混悬液，并且用100ml DI水洗涤固体。将分离的湿润固体再混悬于10ml DI水中。它的pH是约4。添加1滴碳酸钠溶液(通过将500mg Na2CO3溶解于9.5g DI水中来制备5wt％碳酸钠溶液)以使pH增加至约9。分离产物，用50ml DI水冲洗，并且保持它的湿润性。
实施例2：合成肝素-
Figure BDA0000800750300000151
(图3B)
合成遵循这些步骤：将0.25g
Figure BDA0000800750300000161
(5wt％于水中)连同搅拌棒一起装载至20ml玻璃小瓶中。添加10ml pH 8.5 20mM硼酸盐缓冲液至固体中，随后添加5mg 1,1’-CDI。使混合物搅拌2.5小时，随后添加12.5mg肝素钠。使最终混合物在室温下搅拌3天。分离产物，用25ml DI水冲洗，并且保持它的湿润性。
实施例3：合成肝素-砂(图3C)
合成遵循这些步骤：将1g砂连同搅拌棒一起装载至20ml玻璃小瓶中。添加10ml pH8.5 20mM硼酸盐缓冲液至固体中，随后添加2.5mg 1,1’-CDI。使混合物搅拌2.5小时，随后添加6.25mg肝素钠。使最终混合物在室温下搅拌3天。分离产物，用50ml DI水冲洗，并且保持它的湿润性。
实施例4：合成肝素-PGMA(图3D)
合成遵循这些步骤：首先制备PGMA-NH2：添加50ml无水四氢呋喃至圆底烧瓶中，随后添加1.24g 1,4-二氨基丁烷。在搅拌溶液下添加200mg PGMA。接着使溶液在室温下搅拌10分钟，随后抽空。向所得产物中添加50ml DI水，从而导致固体沉淀。接着在中等玻璃料上过滤这个固体，并且用300ml DI水冲洗。以下步骤包括肝素-PGMA的制备：将0.05g PGMA-NH2连同搅拌棒一起装载至20ml玻璃小瓶中。加10ml pH 8.5 20mM硼酸盐缓冲液至固体中，随后添加10mg 1,1’-CDI。使混合物搅拌2.5小时，随后添加25mg肝素钠。使最终混合物在室温下搅拌3天。分离最终产物，并且保持它的湿润性。
实施例5：合成肝素-[支化]-砂(图4A)
合成遵循这些步骤：使1克细砂与10ml pH 8.5 20mM硼酸盐缓冲液混合，并且使其在室温下搅拌数分钟。接着添加8mg 1,1’-羰基二咪唑至混悬液中，并且使其搅拌2.5小时，随后添加0.125g超支化双-MPA聚酯-16-羟基。在额外2.5小时之后，添加5mg 1,1’-羰基二咪唑至混悬液中，并且使其搅拌2小时，随后添加12.5mg肝素钠。使最终混合物在室温下搅拌3天。分离最终产物，并且保持它的湿润性。
实施例6：合成肝素-[支化]-
Figure BDA0000800750300000171
(图4B)
合成遵循这些步骤：使250mg
Figure BDA0000800750300000172
(5wt％于水中)与10ml pH 8.5 20mM硼酸盐缓冲液混合，并且使其在室温下搅拌数分钟。接着添加16mg 1,1’-羰基二咪唑至混悬液中，并且使其搅拌2小时，随后添加0.25g超支化双-MPA聚酯-16-羟基。在2.5小时之后，添加10mg 1,1’-羰基二咪唑至混悬液中，并且使其再搅拌2小时，随后添加25mg肝素钠。使最终混合物在室温下搅拌3天。分离产物，用25ml DI水冲洗，并且保持它的湿润性。
实施例7：合成肝素-[支化]-PGMA(图4C)
合成遵循这些步骤：使50mg PGMA-NH2与10ml pH 8.5 20mM硼酸盐缓冲液混合，并且使其在室温下搅拌数分钟。接着添加32mg1,1’-羰基二咪唑至混悬液中，并且使其搅拌1小时，随后添加0.5g超支化双-MPA聚酯-16-羟基。在额外2小时之后，添加20mg 1,1’-羰基二咪唑至混悬液中，并且使其再搅拌2小时，随后添加50mg肝素钠。使最终混合物在室温下搅拌3天。分离产物，用25ml DI水冲洗，并且保持它的湿润性。
实施例8：合成肝素-[支化]-金纳米粒子(图4D)
合成遵循这些步骤：使5ml的金纳米粒子于PBS中的溶液与2ml pH 8.5 20mM硼酸盐缓冲液混合，并且使其在室温下在玻璃小瓶中搅拌30分钟。接着添加8mg 1,1’-羰基二咪唑(0.05mmol，MW 162.15)至混悬液中，并且使其搅拌2小时，随后添加0.133g超支化双-MPA聚酯-16-羟基。在那之后，添加20mg 1,1’-羰基二咪唑至混悬液中，并且使其搅拌2小时，随后添加50mg肝素钠。使最终混合物在室温下搅拌过夜。
实施例9：合成肝素-[支化]-砂
合成将遵循这些步骤：将使1克细砂与10ml pH 8.5 20mM硼酸盐缓冲液混合，并且使其在室温下搅拌数分钟。将接着添加8mg 1,1’-羰基二咪唑至混悬液中，并且使其搅拌2.5小时，随后添加支链聚(乙二醇)(1.14mmol当量OH)。在额外2.5小时之后，将添加5mg 1,1’-羰基二咪唑至混悬液中，并且使其搅拌2小时，随后添加12.5mg肝素钠。将使最终混合物在室温下搅拌3天。将分离最终产物，并且将保持它的湿润性。
实施例10：合成肝素-[支化]-
Figure BDA0000800750300000181
合成将遵循这些步骤：将使250mg
Figure BDA0000800750300000182
(5wt％于水中)与10ml pH 8.520mM硼酸盐缓冲液混合，并且使其在室温下搅拌数分钟。将接着添加16mg 1,1’-羰基二咪唑至混悬液中，并且使其搅拌2小时，随后添加支链聚(乙二醇)(2.28mmol当量OH)。在2.5小时之后，将添加10mg 1,1'-羰基二咪唑至混悬液中，并且使其再搅拌2小时，随后添加25mg肝素钠。将使最终混合物在室温下搅拌3天。将分离产物，用25ml DI水冲洗，并且将保持它的湿润性。
实施例11：合成肝素-[支化]-PGMA
合成将遵循这些步骤：将使50mg PGMA-NH2与10ml pH 8.5 20mM硼酸盐缓冲液混合，并且使其在室温下搅拌数分钟。将接着添加32mg 1,1’-羰基二咪唑至混悬液中，并且使其搅拌1小时，随后添加支链聚(乙二醇)(4.56mmol当量OH)。在额外2小时之后，将添加20mg1,1’-羰基二咪唑至混悬液中，并且使其再搅拌2小时，随后添加50mg肝素钠。将使最终混合物在室温下搅拌3天。将分离产物，用25ml DI水冲洗，并且将保持它的湿润性。
实施例12：合成肝素-[支化]-金纳米粒子
合成将遵循这些步骤:将使5ml的金纳米粒子于PBS中的溶液与2ml pH 8.5 20mM硼酸盐缓冲液混合,并且使其在室温下在玻璃小瓶中搅拌30分钟。将接着添加8mg 1,1’-羰基二咪唑(0.05mmol,MW162.15)至混悬液中,并且使其搅拌2小时,随后添加支链聚(乙二醇)(1.14mmol当量OH)。在那之后,将添加20mg 1,1’-羰基二咪唑至混悬液中,并且使其搅拌2小时,随后添加50mg肝素钠。将使最终混合物在室温下搅拌过夜。
实施例13：受感染的地表水
使100μl来自Lexington,MA的地表水(非可饮用,但澄清)与50μl肝素-[支化]-金纳米粒子溶液混合。所得溶液被指定为溶液A。使100μl可饮用清洁水与50μl肝素-[支化]-金纳米粒子溶液混合。所得溶液被指定为溶液B。混合两种溶液A和B。依次用棉花和肝素-[支化]-砂阻塞两个Pasteur玻璃吸移管。这些吸移管接着用溶液A或B装载。使溶液在砂上搁置10分钟,随后缓慢迫使它们穿过砂床。其中装载溶液A的管柱A中的棉花层显示暗红色条带,而其中装载溶液B的管柱B中的棉花层未显示暗红色条带(图7中的实例)。
实施例14：受感染的地表水
使100μl来自Lexington,MA的地表水(非可饮用,但澄清)与50μl肝素-[支化]-金纳米粒子溶液混合。所得溶液被指定为溶液C。使100μl可饮用清洁水与50μl肝素-[支化]-金纳米粒子溶液混合。所得溶液被指定为溶液D。混合两种溶液C和D。向溶液C和D中的各个中添加5mg肝素-[支化]-PGMA，并且使其混合。用棉花阻塞两个Pasteur玻璃吸移管。将溶液C装载至第一吸移管中，而将溶液D装载至第二吸移管中。使溶液缓慢迁移穿过吸移管。其中装载溶液C的第一吸移管中的出口床显示暗红色至棕色条带，而其中装载溶液D的第二吸移管中的出口床未显示这个暗色条带(图8中的实例)。
实施例15：受感染的地表水
使100μl来自Lexington,MA的地表水(非可饮用,但澄清)与50μl肝素-[支化]-金纳米粒子溶液混合。所得溶液被指定为溶液E。使100μl可饮用清洁水与50μl肝素-[支化]-金纳米粒子溶液混合。所得溶液被指定为溶液F。混合两种溶液E和F。向溶液E和F中的各个中添加5mg肝素-
Figure BDA0000800750300000201
并且使其在200rpm下混合5分钟。用棉花阻塞两个Pasteur玻璃吸移管。将溶液E装载至第一吸移管中，而将溶液F装载至第二吸移管中。使溶液缓慢迁移穿过吸移管。观察到在第一吸移管和第二吸移管中的两个床之间的颜色差异。
实施例16：具有已知细菌滴度的水溶液
制备大肠杆菌(E.coli)接种物:添加溶原性肉汤(LB)(1mL)至15ml细胞培养管中。将七(7)μl的ONE SHOTTM TOP 10大肠杆菌细胞(Life Technologies,Grand Island,NY)的40％甘油储备物接种至1ml LB肉汤中。在37℃下在恒定振荡(约250rpm)下孵育接种物3小时。接着在2500rpm速度下离心接种物4分钟。分离LB肉汤,并且用每次1ml 1X无菌磷酸盐缓冲盐水(PBS)(pH 7.4)洗涤大肠杆菌细胞两次,接着再混悬于1mL相同缓冲液中。使用光密度测量,最终细菌滴度被估计为约5×107个细胞/毫升。这个溶液被标记为溶液84-1。使10μl溶液84-1与990μl无菌1X PBS混合。所得细菌滴度被估计在5×105个细胞/毫升下。这个溶液被标记为溶液84-2。使10μl溶液84-2与990μl无菌1X PBS混合。所得细菌滴度被估计在5×103个细胞/毫升下。这个溶液被标记为溶液84-3。使10μl溶液84-3与990μl无菌1X PBS混合。所得细菌滴度被估计在50个细胞/毫升下。这个溶液被标记为溶液84-4。
实施例17：具有已知细菌滴度的水溶液
大肠杆菌(E.coli)滴度与形成的聚集体的颜色强度的关联:使200μl各以上溶液84-1、84-2、84-3、84-4与25μl肝素-[支化]-金纳米粒子溶液混合。使所得溶液穿过96孔过滤板(Millipore MAFCN0B)。接着使用Tecan板读取器读取这些孔中的吸光度值(图12)。505nm波长下的吸光度读数(Abs.)揭示以下值:1)对于溶液84-1,Abs.1.9505；2)对于溶液84-2,Abs.1.8965；3)对于溶液84-3,Abs.1.8829；4)对于溶液84-4,Abs.1.8527。515nm波长下的吸光度读数(Abs.)揭示以下值:1)对于溶液84-1,Abs.1.9434；2)对于溶液84-2,Abs.1.8853；3)对于溶液84-3,Abs.1.8764；4)对于溶液84-4,Abs.1.8482。525nm波长下的吸光度读数(Abs.)揭示以下值:1)对于溶液84-1,Abs.1.9373；2)对于溶液84-2,Abs.1.8750；3)对于溶液84-3,Abs.1.8685；4)对于溶液84-4,Abs.1.8363。535nm波长下的吸光度读数(Abs.)揭示以下值:1)对于溶液84-1,Abs.1.9202；2)对于溶液84-2,Abs.1.8646；3)对于溶液84-3,Abs.1.8537；4)对于溶液84-4,Abs.1.8288。545nm波长下的吸光度读数(Abs.)揭示以下值:1)对于溶液84-1,Abs.1.9125；2)对于溶液84-2,Abs.1.8573；3)对于溶液84-3,Abs.1.8475；4)对于溶液84-4,Abs.1.8209。

Claims (20)

1.一种用于检测生物物质的方法，其包括：
混合样品与多个粒子，其中所述粒子的每一个均包括能够与所述生物物质相结合的受体，使得如果所述样品中存在所述生物物质，则所述粒子形成一个或多个聚集体；以及
通过检测所述粒子的一个或多个聚集体来确定所述生物物质在所述样品中的存在，
其中，所述粒子中的任一个是光吸收粒子、反射粒子、散射粒子、金属粒子、磁性粒子及其任何组合中的任一种,
其中，所述受体选自由以下组成的组：至少一种乳糖、乳糖衍生物、单糖或多糖、肝素、壳聚糖、或其任何组合，
其中，所述粒子中的至少一个进一步包括使所述受体桥接于所述粒子的共价结合的连接体分子，
其中，所述连接体分子是支链分子，
其中，所述支链分子是支链聚合物、支化单元、树枝状聚合物和葡聚糖中的任一种，或其任意组合，并且
所述生物物质选自由以下组成的组：细胞、组织、组织产物、血液、血液产物、体液、体液产物、蛋白质、疫苗、抗原、抗毒素、生物医药、生物治疗、病毒、微生物、酵母、藻类、细菌、原核生物、真核生物或其任何组合。
2.如权利要求1中所述的方法，其中所述粒子中的至少一个是金纳米粒子。
3.如权利要求1中所述的方法，其中所述粒子中的至少一个是各种粒径的吸收、反射或散射粒子、金属粒子、磁性粒子、琼脂糖、多糖、天然砂、处理的砂、织物、纤维素、棉花、羊毛、尼龙、聚酯、玻璃、纤维玻璃、二氧化硅、木材、纤维、塑料、橡胶、陶瓷、瓷、石料、大理石、水泥、生物聚合物、天然聚合物或合成聚合物或其任何组合。
4.如权利要求3所述的方法，其中所述磁性粒子为纳米粒子。
5.如权利要求3所述的方法，其中所述金属粒子是金粒子和可选的金纳米粒子、或银粒子和可选的银纳米粒子、或其任意组合。
6.如权利要求3所述的方法，其中所述合成聚合物是聚(甲基丙烯酸缩水甘油酯)或PGMA-NH2，并且所述天然聚合物是棉花，或其任何组合。
7.如权利要求1所述的方法，其中所述支链聚合物选自由以下组成的组：支链聚(乙二醇)、支链聚(乙烯亚胺)、或其组合。
8.如权利要求1中所述的方法，其中检测所述生物物质的步骤包括目视、非目视、电子技术或其任何组合。
9.如权利要求8所述的方法，其中所述检测是定性检测、定量检测或两者。
10.如权利要求8所述的方法，其中所述生物物质的检测是基于颜色强度、吸光度、光密度分析或其任何组合。
11.如权利要求1中所述的方法，其中检测所述生物物质的步骤包括分析吸附于所述粒子的生物物质。
12.如权利要求1中所述的方法，进一步包括使用过滤、倾析和磁性中的任一种或其任何组合从所述样品中分离所述一种或多种聚集体。
13.如权利要求1中所述的方法，进一步包括产生与所述生物物质的检测相应的信号。
14.如权利要求13所述的方法，其中所述产生的信号为可听、可视或电子的警报或其任何组合。
15.如权利要求1-14中任一项所述的方法，其中所述样品为选自由以下组成的组的流体：水、果汁、流体提取物、体液、奶、耳垢、水疱、工厂流体、固体和表面的冲洗液、食物的冲洗液、空气和气体或其任何组合；并且其中，所述水为饮用水、废水、工业水、家居水、或其任意组合。
16.如权利要求1-14中任一项所述的方法，其中所述样品为固体和/或其表面，所述样品包括涂布和未涂布的粉末、粉尘、聚集体、非晶固体、结晶固体、薄片、纤维、管、织品、金属、玻璃、二氧化硅、砂、木材、天然聚合物、合成聚合物、陶瓷、瓷、石料、大理石、水泥、人体或动物体、植物、食物、水果、肉、织物、外套、手套、窗帘、门把手、桌子、电话、导轨、键盘、计算机、屏幕、按钮或其任何组合；并且其中，所述合成聚合物是塑料、橡胶或其组合。
17.如权利要求1所述的方法，其中，所述树枝状聚合物为超支化双-MPA聚酯-16-羟基。
18.如权利要求1所述的方法，其中，所述生物物质选自由以下组成的组：金黄色葡萄球菌、链球菌属、大肠杆菌、绿脓假单胞菌、分枝杆菌属、腺病毒、鼻病毒、天花病毒、流感病毒、疱疹病毒、人免疫缺陷病毒、狂犬病毒、切昆贡亚热病毒、重度急性呼吸综合征病毒、脊髓灰质炎、疟原虫、登革热病毒、结核细菌、脑膜炎微生物、伤寒细菌、黄热病病毒、埃博拉病毒、志贺菌属、李斯特菌属、耶尔森氏菌属、西尼罗病毒、原虫、真菌、肠道沙门氏菌、白色念珠菌、须癣毛癣菌、脊髓灰质炎病毒、产气肠杆菌、伤寒沙门氏菌、肺炎克雷伯氏菌、巴西曲霉和甲氧西林抗性金黄色葡萄球菌或其任何组合。
19.如权利要求15所述的方法，其中所述样品为选自由以下组成的组的流体：唾液、呕吐物、尿、泪、汗液、胆汁、母乳、脑脊髓液、粪便、腹泻物、身体精液、身体分泌物、脓液、粘液、淋巴液、胃酸和胃液、细胞内液和细胞外液、血液和血液产物、水果的冲洗液、蔬菜的冲洗液或其任何组合。
20.如权利要求16所述的方法，其中所述样品为固体和/或其表面，所述样品包括纤维玻璃、蔬菜、或其任何组合。
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