KR102352614B1 - 생물제제의 검출을 위한 방법 및 물질 - Google Patents

생물제제의 검출을 위한 방법 및 물질 Download PDF

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Abstract

시료 중 생물제제의 검출 방법이 본원에 제공된다. 검출은 응집체의 형성을 기반으로 한다. 개시된 조성물은 표지화 입자 및/또는 응집화 입자를 포함한다. 표지화 입자 및 응집화 입자는 각각 입자에 결합된 수용체를 포함할 수 있다. 수용체는 입자에 직접적으로 부착되거나, 링커를 통해 입자에 간접적으로 부착될 수 있다. 하나의 검출 방법은 시각적일 수 있으며, 다른 방법은 형성된 응집체의 첨단의 정량화를 포함할 수 있다.

Description

생물제제의 검출을 위한 방법 및 물질{METHODS AND MATERIALS FOR DETECTION OF BIOLOGICALS}
본 개시내용은 유체 중의 및 표면상의 생물제제(biologics)를 검출하도록 설계된 물질, 및 검출가능하고 정량화가능한 응집체(aggregate)를 형성함에 의한 그들의 농도의 정량화, 및 상기 물질의 제조 및 이용 방법에 관한 것이다.
미생물 및 생물제제를 측정하고 검출하기 위해 매년 상당한 자원이 소모된다. 제품, 공공 지역, 혈액 및 조직 은행, 급기 및 급수에 미생물 오염물질이 없는 것을 보장하는 것은 공공의 주요 관심사이다. 이들 중 임의의 것에 미생물 및 유해한 생물학적 오염물질의 존재는 주요하게 건강을 위협하며, 그의 검출 및 제어가 필요하다.
추가로, 시료, 예를 들어, 체액 중 박테리아의 직접적인 검출 및 감염의 진단을 위한 검정이 존재하지 않는다. 현행의 방법은 대신에 예를 들어, 아질산염, 백혈구 또는 백혈구 에스터라제의 존재를 특이적으로 검출하기 위한 소변 검사, 및 글루코스 또는 pH에 대한 화학적 시험에 의해 간접적으로 진단한다. 감염의 진단은 확인된다면, 박테리아 배양에 의해 행해지며, 이는 힘이 들고, 시간이 소모될 수 있다. 유사하게, 항생제 치료가 적절하게 개시되지 않는다면 전형적으로 치명적인 신속하게 진행하는 중추신경계 감염인 세균성 수막염의 신속한 진단을 위해 사용될 수 있는 뇌척수액 중의 박테리아에 대한 직접적인 시험이 존재하지 않는다. 이러한 감염을 진단하는데 사용하기에 배양 방법은 너무 느리다.
종래의 검출 방법은 또한 오해를 불러일으킬 수 있으며, 신속한 결과를 제공하여 즉각적인 조치를 가능하게 하지 않는다. 현행의 방법이 일부 유형의 미생물을 검출하고 정량화하기 위한 효율적인 도구일 수 있지만, 대부분의 방법은 배양 기반이거나, 개발된다면, 특정 미생물 및 생물제제를 위한 분자 기반의 기술이다. 그러나, 이들 방법은 어렵고 시간이 소모될 수 있다. 또한, 많은 미생물, 예를 들어, 많은 바이러스는 특이적이고 신뢰가능한 검출 방법을 가질 수 없다. 또한, 일부 미생물은 다루기 너무 위험할 수 있어서, 검출 방법이 이용가능하지 않다.
특정 박테리아 항원의 검출을 기반으로 한 넓은 스펙트럼의 다양한 박테리아 종의 민감한 검출을 위한 많은 시험이 존재한다. 그러나, 상기 시험은 그것들이 박테리아 병원체의 스펙트럼이 미지의 시료의 시험을 위해 직접적으로 적용될 수 없기 때문에, 제한적이다. 또한, 시험은 생물제제의 사전 농축을 위한 추가의 단계를 포함한다. 이러한 단계는 알려진 시험을 수행하기 전에 1일 내지 3일이 걸릴 수 있다. 따라서, 사용하기 용이하고, 신속하고, 정확한, 알려져 있거나 미지의 넓은 스펙트럼의 미생물을 검출할 수 있는 검출 방법의 개발이 여전히 필요하다.
본 개시내용은 표적 시료 중 생물제제를 검출하기 위한 표지화 입자 및 제형의 제조 및 이용 방법을 제공한다. 하나의 검출 방법은 표지화 입자로의 생물제제의 부착의 결과로서 시각적일 수 있다. 얻어진 생물제제-입자 복합체를 자성 분리, 여과 또는 경사분리(decantation)와 같은 방법을 사용하여 시료로부터 물리적으로 분리할 수 있다. 시각적 검출 방법을 육안으로 수행할 수 있다. 다른 검출 방법을 수행하여, 생물제제를 정성화하거나, 정량화할 수 있다.
일부 실시형태는 생물제제를 포함하는 시료를, 입자 및 상기 입자에 결합된 수용체를 포함하는 표지화 입자에 통과시키거나, 그와 혼합하는 단계, 및 생물제제를 표지화 입자에 흡착시킴으로써 생물제제를 검출하는 단계를 포함하는 생물제제의 검출 방법에 관한 것이다. 입자는 다양한 크기, 예를 들어, 금속성 나노-입자일 수 있다. 수용체는 표적 생물제제에 결합하는 것으로 알려져 있거나, 표적 생물제제에 결합할 것으로 예상되는 임의의 화학적 모이어티(moiety)일 수 있다. 예시적인 일 실시형태에서, 조성물은 입자와 수용체 사이에 가교를 형성하는 링커를 포함할 수 있다. 링커는 입자 및 수용체에 공유적으로 결합되며, 그것은 선형 또는 분지형 분자 또는 폴리머일 수 있다. 또한, 표적 생물제제는 예를 들어, 미생물, 단백질 또는 혈액 산물일 수 있다. 표적 생물제제의 사전-농축은 필요하지 않다.
일부 실시형태는 생물제제를 포함하는 시료를, 표지화 입자 및 응집화 입자에 통과시키거나, 그들과 혼합하는 단계로서, 상기 표지화 입자 및 응집화 입자 둘 모두가 입자 및 상기 입자에 결합된 수용체를 포함하는 단계, 및 생물제제를 표지화 입자 및 응집화 입자에 흡착시킴으로써 생물제제를 검출하는 단계를 포함하는 생물제제의 검출 방법에 관한 것이다. 응집화 입자를 사용하는 것의 하나의 이점은 얻어진 생물제제-입자 응집체의 크기를 증가시키는 것이다. 표지화 입자 및 응집화 입자는 다양한 크기의 아가로스, 모래, 직물, 금속성 입자, 자성 입자 또는 이들의 조합을 함유할 수 있다. 표지화 입자 및/또는 응집화 입자 내의 수용체는 표적 생물제제에 결합하는 것으로 알려져 있거나, 표적 생물제제에 결합할 것으로 예상되는 임의의 화학적 모이어티일 수 있다. 예시적인 일 실시형태에서, 표지화 입자 및/또는 응집화 입자의 조성물은 입자와 수용체 사이에 가교를 형성하는 링커를 포함할 수 있다. 링커는 입자 및 수용체에 공유적으로 또는 물리적으로 결합되며, 그것은 선형 또는 분지형 소분자 또는 폴리머일 수 있다. 표지화 입자 및 응집화 입자는 동일하거나 상이한 링커 및/또는 수용체를 함유할 수 있다. 또한, 표적 생물제제는 예를 들어, 미생물, 단백질 또는 혈액 산물일 수 있다.
또한, 생물제제의 검출 방법은 하나의 검출 방법으로서 표지화 입자 및/또는 응집화 입자에 흡착된 생물제제의 시각적 검출을 포함할 수 있다. 이러한 시각적 검출은 유체 중에서 또는 시험할 표면상에서 일어날 수 있다.
일부 실시형태에서, 생물제제의 검출 방법은 다른 검출 방법으로서 여과 구성을 통해 표지화 및/또는 응집화 입자에 흡착된 생물제제를 여과하는 단계를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 다른 검출 방법으로서 자성 분리기를 사용하여 자성 입자에 흡착된 생물제제를 분리하는 단계를 포함할 수 있다.
또한, 상기 방법은 하나의 검출 방법으로서 표지화 입자 또는 응집화 입자 또는 그의 조합물에 흡착된 생물제제의 정성화 또는 정량화 또는 그의 조합을 포함할 수 있다. 생물제제-입자 응집체의 검출은 육안으로 또는 색 및 그들의 강도를 정성화하고 정량화할 수 있는 툴, 소프트웨어 및 어플리케이션을 사용하여 전자적으로 달성된다. 이러한 툴은 광학 밀도 측정 장치 및 소프트웨어, 및 색 강도 측정 장치 및 소프트웨어를 포함할 수 있다.
또한, 본 개시내용은 입자상에 수용체를 고정화시키는 단계를 포함하는 표지화 입자 및/또는 응집화 입자의 제조 방법을 제공한다. 수용체는 헤파린 또는 락토스일 수 있다.
첨부된 도면은 상기 열거된 개시내용의 특징, 이점 및 목적이 명백해지고, 구체적으로 이해될 수 있도록 본원에 포함된다. 이들 도면은 상세한 설명의 일부를 형성한다. 그러나, 첨부된 도면이 적절한 실시형태를 예시하며, 개시내용의 범주를 제한하는 것으로 여겨져서는 안 되는 것을 주목해야 한다.
도 1은 광산란 응집체를 형성함에 의한 생물제제, 예를 들어, 미생물의 검출을 예시한 도면;
도 2는 입자가 직접적으로 또는 링커를 통해 간접적으로 수용체로 작용화되는 3가지 상이한 실시형태를 예시한 도면;
도 3a 내지 도 3d는 입자로의 수용체의 직접적인 부착의 예를 예시한 도면;
도 4a 내지 도 4d는 링커를 통한 입자로의 수용체의 부착의 예를 예시한 도면;
도 5는 1,1'-카보닐다이이미다졸을 사용하는 경우, 공유 결합에 대한 일반적 경로를 예시한 도면;
도 6은 응용의 개략도를 예시한 도면;
도 7은 표지화 입자, 작용화된 금 나노입자와 응집화 입자, 작용화된 모래의 응집을 예시한 도면;
도 8은 표지화 입자, 작용화된 금 나노입자와 응집화 입자, 작용화된 PGMA의 응집을 예시한 도면;
도 9는 개시내용의 응용의 예를 예시한 것이며; 이러한 예는 정성적인 생물제제 검출 방법으로 분류된다.
도 10은 개시내용의 응용의 예를 예시한 것이며; 이러한 예는 정량적인 생물제제 검출 방법으로 분류된다.
도 11은 개시내용의 응용의 예를 예시한 것이며; 이러한 예는 알려져 있는 응집체 검출 과정과 본 발명의 과정의 조합으로 분류된다.
도 12는 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) 박테리아 응집체의 흡광도와 시험된 용액 중 에스케리키아 콜라이 박테리아의 역가 간의 상호관계를 보여주는 결과의 예를 예시한 것이다.
사용 지점 검출은 제품 또는 서비스가 실제로 사용되는 장소에서 수행된다. 생물제제의 검출이 사용 지점에서 달성되는 경우에 주요 이점이 얻어진다. 이러한 이익의 예는 적절한 시험 및 검출 방법에의 접근이 실행가능하지 않은 원위 또는 빈민 지역에서 감염된 유체에 대한 노출을 제한하거나 피하고, 수혈 전에 혈액 및 그들의 산물의 감염된 공급물을 검출하고, 공기 중의 또는 표면상의 감염성 입자의 존재에 대하여 경고하는 것을 포함한다. 다른 예는 시험 지점에서 체액의 비정상적인 조성을 진단하고, 질환의 발병 직후에 질환에 대한 조치를 취하도록 환자에게 경고하는 것이다. 이러한 조기 검출 방법은 회복을 가속화시키고, 의학적 처치와 관련된 비용을 감소시킬 수 있다.
최소의 물질 및 장치를 사용한 생물제제의 검출은 사용 지점 진단에 극히 매력적이다. 나노입자 기반의 기술이 유용할 수 있지만, 2가지 주요 방법은 항원-항체 상호작용 및 핵산의 인식을 기반으로 한다. 둘 모두의 기술은 고가의 장치 및 시약을 필요로 한다.
예시적인 특정 실시형태가 이제 본원에 개시된 장치 및 방법의 구조, 기능, 제조 및 이용의 원리의 전반적인 이해를 제공하기 위해 기술될 것이다. 이들 실시형태의 하나 이상의 예는 첨부된 도면에 예시되어 있다. 당업자는 본원에 구체적으로 기술되고 첨부된 도면에 예시된 장치 및 방법이 비제한적인 예시적인 실시형태이며, 본 개시내용의 범주가 청구범위에 의해서만 한정되는 것을 이해할 것이다. 예시적인 일 실시형태와 관련하여 예시되거나 기술된 특징이 다른 실시형태의 특징과 조합될 수 있다. 이러한 변형 및 변이는 본 개시내용의 범주 내에 포함되는 것으로 의도된다.
본원에 열거된 모든 간행물, 특허 및 특허 출원은 상기에서든 하기에서든, 그들의 전문이 본원에 참조로 포함된다. 본 명세서 및 첨부된 청구범위에 사용되는 바와 같이, 단수 형태는 내용이 명백하게 다르게 지시하지 않는 한, 복수의 언급 대상을 포함한다. 본 개시내용에 사용되는 용어는 당업자에 의해 일반적으로 용인되는 표준 정의를 따른다. 임의의 추가의 설명이 필요할 수 있는 경우에, 일부 용어가 하기에 추가로 설명되어 있다.
개시된 방법 및 물질은 표적 생물제제의 가시적인 검출을 가능하게 한다. 표지화 입자, 예를 들어, 작용화된 나노입자의 존재 하에, 표적 생물제제는 광을 흡수하거나, 반사시키거나, 산란하거나 또는 이들의 임의의 조합인 응집체의 형성을 촉발시킬 수 있다. 또한, 표지화 입자 및 생물제제로 구성된 제형 중 응집화 입자의 선택적인 존재는 광의 흡수, 반사 또는 산란 또는 이들의 조합으로 인한 신호를 강조할 수 있다. 이러한 효과적인 물질은 사용 지점에서 유체 중 생물제제에 대한 중요한 정보를 제공할 수 있다. 궁극적으로, 응집체의 색의 강도는 특정 생물제제의 농도와 상호관련될 수 있다. 상기 방법은 "생물제제에 대한 리트머스 시험"과 유사할 수 있다.
본원에 사용되는 바와 같은 용어 "생물제제"는 세포, 조직, 조직 산물, 혈액, 혈액 산물, 단백질, 백신, 항원, 항독소, 바이러스, 미생물, 진균, 효모, 조류, 박테리아 등을 포함하나 이들에 한정되지 않는 살아있는 유기체 및 그들의 산물을 지칭한다. 생물제제의 일례는 미생물, 예를 들어, 병원성 또는 비병원성 박테리아를 포함할 수 있다. 생물제제의 다른 예는 바이러스, 바이러스 산물, 바이러스-모방 엔티티 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다.
본원에 사용되는 바와 같은 "미생물"은 단세포 또는 다세포 유기체일 수 있으며, 유기체, 예를 들어, 원핵생물(예를 들어, 박테리아 및 고세균), 진핵생물(예를 들어, 원생동물, 진균, 조류, 미시적 식물 및 동물) 및 바이러스를 포함한다. 예를 들어, 박테리아는 그람 음성 또는 그람 양성일 수 있다. 일부 실시형태에서, 미생물은 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 스트렙토코커스(Streptococcus), 에스케리키아 콜라이(이. 콜라이(E. coii)), 슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa), 마이코박테리움(mycobacterium), 아데노바이러스(adenovirus), 리노바이러스(rhinovirus), 두창 바이러스, 인플루엔자 바이러스, 헤르페스 바이러스, 인간 면역결핍 바이러스(HIV), 광견병, 치쿤군야(chikungunya), 중증 급성 호흡기 증후군(SARS), 말라리아, 뎅기열, 결핵, 수막염, 장티푸스, 황열, 에볼라, 시겔라(shingella), 리스테리아(listeria), 예르시니아(yersinia), 웨스트 나일 바이러스(West Nile virus), 원생동물, 진균, 살모넬라 엔테리카(Salmonella enterica), 칸디다 알비칸스(Candida albicans), 트리코파이톤 멘타그로파이테스(Trichophyton mentagrophytes), 폴리오바이러스, 엔테로박터 아에로게네스(Enterobacter aerogenes), 살모넬라 타이피(Salmonella typhi), 클레브시엘라 뉴모니아(Klebsiella pneumonia), 아스페르길루스 브라실리엔시스(Aspergillus brasiliensis) 및 메티실린 내성 스타필로코커스 아우레우스(MRSA) 또는 이들의 임의의 조합으로부터 선택된다.
개시된 방법 및 물질은 가시적인 응집체, 예를 들어, 육안으로 보이는 것들을 형성함으로써 생물제제를 검출할 수 있다. 표지화 입자의 광 산란, 흡수, 반사 또는 이들의 임의의 조합을 사용하여 표적 생물제제를 검출할 수 있다. 또한, 응집화 입자 및 다른 입자를 광 산란, 흡수 또는 반사 제형 또는 이들의 임의의 조합에 사용하여, 표적 생물제제를 검출할 수 있다.
본 개시내용은 표적 생물제제의 존재 및 부재 간에, 그리고 농도의 변화 시에 물리적 차이를 나타내는 표지화 나노입자의 생산 방법을 제공한다. 이러한 차이는 예를 들어, 육안으로 시각적으로 검출될 수 있거나, 색 및 그들의 강도를 정성화하고 정량화할 수 있는 툴, 소프트웨어 및 어플리케이션을 사용하여 정량화 및 정성화될 수 있다. 표지화 입자의 일례는 자성 또는 금속성 나노입자, 예를 들어, 금 나노입자를 포함할 수 있다. 또한, 표적 생물제제의 부재는 이러한 응집체의 형성을 억제할 수 있다.
일 실시형태에서, "표지화 입자"는 표적 생물제제에 결합하고, 응집체를 형성할 수 있다. 일부 실시형태에서, 얻어진 응집체는 시각적 검출을 위해 광을 산란, 흡수 및/또는 반사할 수 있다. 일부 실시형태에서, 응집체를 자성, 여과, 경사분리 또는 상 분리 과정 또는 이들의 임의의 조합과 같은 물리적 분리 기술에 의해 분리할 수 있다. 또한, 당업자에 의해 공지되어 있는 다른 분리 기술을 사용할 수 있다.
일부 실시형태는 "응집화 입자"를 포함하여, 생물제제에 결합된 표지화 입자로부터 야기되는 신호를 강조한다. 응집화 입자를 사용하여, 응집체의 크기를 증가시킬 수 있다. 이러한 증가는 보다 용이한 검출 및 상이한 농도의 생물제제 간의 보다 정확한 구별을 야기할 수 있다(도 1). 이러한 응집화 입자의 예는 시험된 유체에서 불용성인 물질 복합체, 유사 작용화된 모래, 작용화된 아가로스 및 작용화된 폴리머를 포함할 수 있다.
표지화 및 응집화 입자의 3가지 주요 성분의 예는 다음을 포함한다: 1) 다양한 크기의 아가로스, 모래, 직물(예를 들어, 셀룰로스/면, 울, 나일론, 폴리에스터), 금속성 입자(나노입자, 예를 들어, 금 나노입자 또는 은 나노입자 포함), 자성 입자(나노입자 포함), 유리, 유리섬유, 실리카, 나무, 섬유, 플라스틱, 고무, 세라믹, 자기, 돌, 대리석, 시멘트, 생물학적 폴리머, 천연 폴리머 및 합성 폴리머[예를 들어, 폴리(글라이시딜 메타크릴레이트)(PGMA)] 또는 이들의 임의의 조합일 수 있는 입자; 2) 수용체, 예를 들어, 락토스(천연 및 합성) 및 그의 유도체(예를 들이, 시알릴락토스), 단당류 및 다당류, 헤파린 및 키토산 또는 다중의 유형의 입자의 임의의 조합; 및 3) 링커, 예를 들어, 선형 또는 분지형 소분자 또는 폴리머, 예를 들어, 폴리(에틸렌 글라이콜)(PEG, 예를 들어, 다중-암(arm) 분지형 PEG-아민) 및 폴리(에틸렌이민)(PEI, 다양한 비의 1차:2차:3차 아민기), 덴드론 및 덴드리머(예를 들어, 고차분지형 비스-MPA 폴리에스터-16-하이드록실) 및 키토산 또는 이들의 임의의 조합. 각각의 물질에 입자 및 수용체 성분이 혼입될 수 있다. 그러나, 링커 성분의 혼입은 선택적이다. 또한, 표지화 입자는 다양한 유형의 입자, 수용체 및 선택적 링커를 함유하는 제형일 수 있다.
표지화 및 응집화 입자에서 개시된 입자는 포획기("수용체")로 작용화될 수 있으며, 포획기의 구조는 세포 수용체, 항체이거나, 그로부터 유래되거나, 또는 표적 생물제제와 가용성 분자의 상호작용을 설명하는 입수가능한 데이터로부터 합성에 의해 유래될 수 있다. 수용체는 입자에 직접 부착되거나(도 2, 방식 A), 또는 링커를 통해(도 2, 방식 B) 부착될 수 있다. 입자의 분자 구조의 완전성을 보호하기 위하여, 특히, 표지화 및 응집화 입자의 재사용이 필요조건인 경우에, 수용체, 입자 및 선택적으로 링커를 상호 연결시키는 하나의 방법은 공유 결합을 통한 것이다. 추가되는 구조적 안정성이 필요하지 않은 특정 응용에 있어서, 예를 들어, 단회 사용 물질의 경우에, 물리적 결합이 공유 결합을 대체할 수 있다. 수용체는 물리적 결합을 통해 생물제제를 포획함으로써 직접적인 역할을 수행한다. 링커의 하나의 역할은 입자의 중심으로부터 활성인 거리에 수용체를 배치하는 것이다. 수용체를 입자의 중심으로부터 거리를 유지하게 함으로써, 수용체는 표적 생물제제에 용이하게 접근할 수 있다. 링커의 다른 역할은 특히 그들이 분지화되는 경우, 입자의 표면상에 수용체의 밀도를 증가시키는 것이다(도 2, 방식 C). 수용체의 밀도의 증가는 보다 높은 농도의 생물제제의 포획 능력의 증가와 상호관련이 있다. 일부 실시형태에서, 표지화 입자에 부착된 수용체 및 응집화 입자에 부착된 수용체는 동일한 수용체이다(예를 들어, 락토스 분자는 표지화 입자 및 응집화 입자에 부착될 수 있음). 일부 실시형태에서, 표지화 입자에 부착된 수용체 및 응집화 입자에 부착된 수용체는 상이한 수용체이다(예를 들어, 락토스 분자는 표지화 입자에 부착될 수 있으며, 헤파린 분자는 응집화 입자에 부착될 수 있음).
표지화 및 응집화 입자에서의 예시적인 수용체는 다음을 포함할 수 있다: 1) 헤파린, 숙주 세포의 막에서 관찰되는 선천적 글라이코사미노글라이칸을 모방하는 음으로 하전된 폴리머. 그것은 돼지 장 점막으로부터 추출된 헤파린 나트륨으로 구매가능하며, 혈액 응고 방지제로 입증되어 있음. 또한, 비-동물-유래 합성 헤파린-모방 설폰산 폴리머도 천연 헤파린과 유사한 방식으로 작용할 수 있음; 2) 키토산, 다양한 미생물 및 단백질에 결합할 수 있는 생태 친화적인 바이오-살충제(bio-pesticide). 그것은 또한 지혈제로서, 그리고 경피 약물 전달에 사용됨; 및 3) 락토스, 낙농업의 부산물. 그것은 널리 이용가능하고, 연간 수백만톤이 생산됨. 또한, 락토스는 그들의 모든 이성질체를 포함하여 2가지 당, 갈락토스 및 글루코스의 축합/탈수에 의해 합성될 수 있다.
표지화 및 응집화 입자에서의 예시적인 입자에는 금속성 또는 자성 입자, 예를 들어, 알칼리, 알칼리성, 전이, 전이후, 란탄족 및 악티늄족 금속 원소 또는 화합물이 포함될 수 있다. 금속성 또는 자성 원소 또는 화합물의 일부 예에는 리튬, 나트륨, 칼륨, 루비듐, 세슘, 프랑슘, 베릴륨, 마그네슘, 칼슘, 스트론튬, 바륨, 라듐, 알루미늄, 갈륨, 인듐, 주석, 탈륨, 납, 비스무트, 스칸듐, 타이타늄, 바나듐, 크롬, 망간, 철, 코발트, 니켈, 구리, 아연, 이트륨, 지르코늄, 나이오븀, 몰리브데넘, 테크네튬, 루테늄, 로듐, 팔라듐, 은, 카드뮴, 란타넘, 하프늄, 탄탈럼, 텅스텐, 레늄, 오스뮴, 이리듐, 백금, 금, 수은, 악티늄, 러더포듐, 더브늄, 시보??, 보륨, 하슘, 마이트너륨, 다름슈타튬, 뢴트게늄, 세륨, 프라세오디뮴, 네오디뮴, 프로메튬, 사마륨, 유로퓸, 가돌리늄, 터븀, 디스프로슘, 홀뮴, 에르븀, 툴륨, 이터븀, 루테튬, 토륨, 프로탁티늄, 우라늄, 넵투늄, 플루토늄, 아메리슘, 퀴륨, 버클륨, 캘리포르늄, 아인슈타이늄, 페르뮴, 멘델레븀, 노벨륨 및 로렌슘, 그들의 유도체, 염 및 산화물 또는 자성 화합물을 형성하기 위한 조합을 포함하는 이들의 임의의 조합물이 포함되나 이들에 한정되지 않는다. 일 실시형태에서, 금 나노입자가 상기 입자일 수 있다. 이러한 실시형태에서, 나노입자는 크기가 더 작을수록, 반사되는 색은 더욱 적색일 것이다. 또한, 이러한 실시형태에서, 나노입자의 크기가 더 클수록, 반사되는 색은 더욱 청색/보라색일 것이다.
표지화 및 응집화 입자에서의 다른 예시적인 입자에는 유리, 실리카, 모래, 나무, 섬유, 천연 및 합성 폴리머, 고무, 구리, 금, 은, 백금, 아연, 돌, 스테인리스 강, 니켈, 타이타늄, 탄탈럼, 알루미늄, 니티놀(Nitinol), 인코넬(Inconel), 이리듐, 텅스텐, 규소, 마그네슘, 주석, 합금 및 전술된 것 중 임의의 것을 함유하는 코팅, 아연 도금 강, 용융 아연 도금 강, 전기 아연 도금 강, 소둔형 용융 아연 도금 강 또는 이들의 임의의 조합이 포함될 수 있으나 이들에 한정되지 않는다.
사용하기에 적절한 유리 물질에는 소다 석회 유리, 스트론튬 유리, 붕규산 유리, 바륨 유리, 란타넘을 함유하는 유리-세라믹 및 이들의 임의의 조합이 포함되나 이들에 한정되지 않는다.
사용하기에 적절한 모래 물질에는 실리카(예를 들어, 석영, 용융 석영, 결정질 실리카, 퓸드(fumed) 실리카, 실리카 겔 및 실리카 에어로겔), 탄산칼슘(예를 들어, 아라고나이트) 또는 그들의 임의의 혼합물로 구성된 모래가 포함되나 이들에 한정되지 않는다. 모래에는 다른 성분, 예를 들어, 광물(예를 들어, 자철석, 녹니석, 해록석, 석고, 감람석, 석류석), 금속(예를 들어, 철), 셸(shell), 산호, 석회석, 암석 또는 이들의 임의의 조합이 포함될 수 있다.
사용하기에 적절한 목재에는 경재 및 연재, 및 목재, 목재 칩 또는 섬유로부터 조작된 물질(예를 들어, 합판, 배향성 스트랜드 보드, 단판 적층 럼버, 복합재료, 스트랜드 럼버, 칩보드, 하드보드, 중밀도 섬유판)이 포함되나 이들에 한정되지 않는다. 나무의 유형에는 앨더(alder), 자작나무, 느릅나무, 단풍나무, 버드나무, 호두나무, 벚나무, 참나무, 히코리, 포플러, 소나무, 분비나무(fir) 또는 이들의 임의의 조합이 포함되나 이들에 한정되지 않는다.
사용하기에 적절한 섬유 물질에는 천연 섬유(예를 들어, 동물, 식물 또는 광물로부터 유래) 및 합성 섬유(예를 들어, 셀룰로스, 광물 또는 폴리머로부터 유래)가 포함되나 이들에 한정되지 않는다. 적절한 천연 섬유에는 면, 대마, 황마, 아마, 모시, 사이잘마(sisal), 버개스(bagasse), 목섬유, 잠사, 거미줄, 시뉴(sinew), 장사(catgut), 울, 씨 실크(sea silk), 울, 모헤어, 앙고라 및 석면이 포함되나 이들에 한정되지 않는다. 적절한 합성 섬유에는 레이온, 모달(modal) 및 리오셀(Lyocell), 금속 섬유(예를 들어, 구리, 금, 은, 니켈, 알루미늄, 철), 탄소 섬유, 탄화규소 섬유, 대나무 섬유, 씨셀(seacell), 나일론, 폴리에스터, 폴리염화비닐 섬유(예를 들어, 비니온), 폴리올레핀 섬유(예를 들어, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌), 아크릴계 폴리에스터 섬유, 아라미드(예를 들어, TWARON(상표명), KEVLAR(상표명) 또는 NOMEX(상표명)), 스판덱스(spandex) 또는 이들의 임의의 조합이 포함되나 이들에 한정되지 않는다.
사용하기에 적절한 천연 폴리머 물질에는 다당류(예를 들어, 면, 셀룰로스), 셸락(shellac), 호박(amber), 울, 실크, 천연 고무, 바이오폴리머(예를 들어, 단백질, 세포외 기질 성분, 콜라겐) 또는 이들의 임의의 조합이 포함되나 이들에 한정되지 않는다.
사용하기에 적절한 합성 폴리머 물질에는 폴리비닐피롤리돈, 아릴릭스(acrylics), 아크릴로나이트릴-부타다이엔-스타이렌, 폴리아크릴로나이트릴, 아세탈, 폴리페닐렌 옥사이드, 폴리이미드, 폴리스타이렌, 폴리프로필렌, 폴리에틸렌, 폴리(글라이시딜 메타크릴레이트), 폴리테트라플루오로에틸렌, 폴리비닐리덴 플루오라이드, 폴리비닐 클로라이드, 폴리에틸렌이민, 폴리에스터, 폴리에터, 폴리아마이드, 폴리오르토에스터, 폴리안하이드라이드(polyanhydride), 폴리설폰, 폴리에터 설폰, 폴리카프로락톤, 폴리하이드록시-부티레이트 발레레이트, 폴리락톤, 폴리우레탄, 폴리카보네이트, 폴리에틸렌 테레프탈레이트 및 그들의 코폴리머 또는 이들의 임의의 조합이 포함되나 이들에 한정되지 않는다.
사용하기에 적절한 고무 물질에는 실리콘, 플루오로실리콘, 나이트릴 고무, 실리콘 고무, 폴리아이소프렌, 황-가교 고무, 부타다이엔-아크릴로나이트릴 고무, 아이소프렌-아크릴로나이트릴 고무 등 또는 이들의 임의의 조합이 포함되나 이들에 한정되지 않는다.
사용하기에 적절한 세라믹 물질에는 질화붕소, 질화규소, 알루미나, 실리카 등 또는 이들의 임의의 조합이 포함되나 이들에 한정되지 않는다.
사용하기에 적절한 석재에는 예를 들어, 화강암, 석영, 규암, 석회석, 백운암, 사암, 대리석, 동석, 사문암 또는 이들의 임의의 조합이 포함된다.
표지화 및 응집화 입자에서의 예시적인 링커는 다음을 포함할 수 있으나 이들에 한정되지 않는다: 1) 키토산, 수용체로서의 그의 설명을 참조; 2) 에틸렌 옥사이드로부터 생산되고, 많은 상이한 화학적, 생물학적, 상업적 및 산업적 용도를 갖는 선형 또는 분지형 폴리(에틸렌 글라이콜) 및 그들의 유도체; 3) 선형 또는 분지형 폴리(에틸렌이민)(PEI, 다양한 비의 1차:2차:3차 아민기); 및 4) 덴드론 및 덴드리머, 상대적으로 신규한 분자. 그들은 소수의 출발 시약을 사용한 반복 분지형 분자이다. 그들은 약물 전달에서 그리고 센서에서 통상적으로 사용된다.
일부 실시형태에서, "표지화 입자"의 중심에서의 입자는 금 나노입자일 수 있다.
일부 실시형태에서, 다중의 알려져 있는 및 미지의 미생물의 동시의 검출을 위한 수용체는 헤파린 및 그의 유도체를 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 수용체는 입자에 직접 부착되거나(도 3) 화학적 커플링을 통하여 링커를 통해 부착될 수 있다(도 4). 하나의 유형의 커플링 시약은 1,1'-카보닐다이이미다졸(CDI)이다. 그러나, 다른 것들, 예를 들어, N,N'-다이사이클로헥실카보다이이미드(DCC) 또는 N-(3-다이메틸아미노프로필)-N'-에틸카보다이이미드 하이드로클로라이드(EDC 또는 EDCI)가 사용될 수 있다.
예시적인 커플링 시약은 CDI이다. 양성자화된 염기성 말단기, 예를 들어, 표면-가수분해 금은 CDI와 용이하게 반응하여 에스터 또는 아마이드 결합을 형성한다. 얻어진 이미다졸-치환 유도체를 하이드록실-말단 수용체와 반응시켜, 카보네이트[R-O-C(O)-O-수용체] 또는 카바메이트[R-N(H)-C(O)-O-수용체] 중 어느 하나를 제공한다. 또한, 얻어진 이미다졸-치환 유도체를 아민-말단 수용체와 반응시켜, 유레아 유도체[R-N(H)-C(O)-N(H)-수용체]를 제공할 수 있다(도 5). 수용체와 입자 간의 공유 결합(직접적인 결합 또는 링커를 통함)의 형성 때문에, 결합된 수용체의 구조는 구매가능한 유리 수용체의 구조와 비교하여 상이하다. 예를 들어, 도 6에 도시된 바와 같이, 수용체는 이미다졸-치환 유도체와의 반응 시에 수소 원자를 느슨하게 하여, 수용체-카보네이트, 수용체-카바메이트 또는 수용체-유레아 유도체를 형성한다.
적절한 작용기가 입자의 표면상에 존재하지 않는다면, 전형적으로 적절한 작용기를 화학적 변환에 의해 표면에서 이용가능하게 할 수 있다. 일반적으로, 화학적 변환은 가수분해, 산화(예를 들어, 콜린스(Collins) 시약, 데스-마틴 페리오디난(Dess-Martin periodinane), 존스(Jones) 시약 및 과망간산칼륨을 사용), 환원(예를 들어, 수소화 붕소 나트륨 또는 수소화 알루미늄 리튬을 사용), 알킬화, 탈양성자화, 친전자성 부가(예를 들어, 할로젠화, 수소 첨가 할로젠화, 수화), 수소화, 에스터화, 제거 반응(예를 들어, 탈수), 친핵성 치환, 라디칼 치환 또는 재배열 반응일 수 있다. 필요에 따라, 1가지 초과의 화학적 변환을 연속하여 또는 동시에 사용하여 적절한 작용기 또는 다양한 아이덴티티의 작용기의 이질적 그룹을 제공할 수 있다. 대안적으로, 요망되는 작용기를 갖는 모노머가 상기 물질에 이식될 수 있다.
일부 실시형태에서, 화학적 변환은 가수분해이다. 일반적으로, 가수분해는 무기, 유기 또는 유기-금속성 강산(예를 들어, 무기 강산, 예를 들어, 염산, 황산, 인산, 질산, 요오드화수소산, 브롬화수소산, 염소산 및 과염소산) 또는 무기, 유기 또는 유기-금속성 강염기(예를 들어, I족 및 II족 수산화물, 예를 들어, 수산화리튬, 수산화나트륨, 수산화칼륨, 수산화루비듐, 수산화세슘, 수산화마그네슘, 수산화칼슘 및 수산화바륨; 수산화암모늄; 및 탄산나트륨)의 존재 하에 물을 사용하여 수행된다. 예를 들어, 아실 할라이드를 포함하는 물질은 가수분해로 처리되어 카복실산을 형성할 수 있다.
일부 실시형태에서, 화학적 변환은 하나의 작용기를 다른 것으로 대체하는 치환 반응이다. 예를 들어, 할로알킬기를 포함하는 물질은 강염기와 반응하여 하이드록시기를 형성할 수 있다.
일부 실시형태에서, 화학적 변환은 알킬화, 수소화 또는 환원이다. 예를 들어, 하이드록시 또는 할로알킬(예를 들어, 아이오도알킬 또는 브로모알킬) 모이어티를 포함하는 물질은 암모니아와 반응하여 아미노기를 형성할 수 있다. 또한, 할로알킬 모이어티를 포함하는 물질은 티오유레아를 사용한 S-알킬화에 의해 머캅토기로 전환될 수 있다. 나이트릴을 포함하는 물질은 수소화되어 아미노기를 형성할 수 있다. 아미도기를 포함하는 물질은 (예를 들어, 수소화 알루미늄 리튬의 존재 하에) 환원되어 아미노기를 형성할 수 있다. 포밀 또는 케토기를 포함하는 물질은 환원되어 아미노 또는 하이드록시기를 형성할 수 있다. 다중의 균질적 또는 이질적 변환은 동시에 또는 연속하여 적용될 수 있다.
표지화 및 응집화 입자는 적절한 온도(예를 들어, 실온, 환류), 반응 시간, 용매, 촉매 및 농도를 사용하여 임의의 적절한 방법에 의해 형성될 수 있다. 일부 실시형태에서, 과량의 링커 및 수용체를 사용하여, 표지화 및 응집화 입자에서 수용체의 유효량을 보장할 것이다.
일부 실시형태에서, 수용체, 링커 및 입자 간의 부착은 물리적으로 고정될 수 있다. 이는 용매 중에 용해된 수용체 또는 링커 또는 이들의 조합을 입자와 혼합한 다음, 용매가 공기 중에 또는 진공하에 증발되게 함으로써 달성된다.
일부 실시형태에서, 입자를 고체 및 표면의 세정여액(rinsate)을 포함하는 시험할 유체와 직접 혼합할 수 있다. 입자는 일반적으로 표지화 입자를 포함한다. 응집화 입자의 포함은 선택적이다. 둘 모두의 유형의 입자가 적용되는 경우, 입자와 시험할 유체의 혼합은 동시에 이루어질 수 있으며, 여기서, 둘 모두의 유형의 입자는 동시에 유체와 혼합된다. 또한, 그것은 순차적으로 이루어질 수 있으며, 여기서, 하나의 유형의 입자가 먼저 유체와 혼합된 다음, 다른 유형이 혼합된다.
하나의 예시적인 응용 방법은 시험되는 시료 중 표적 생물제제의 존재 또는 부재를 나타내기 위한 정성적 시험이다. 시험할 유체를 표지화 입자와 직접 혼합한다. 혼합 및 선택적 인큐베이션 후에, 혼합물을 응집화 입자의 층 및/또는 여과재의 층을 통과하여 유동하게 한다. 표적 생물제제의 존재는 응집 입자의 층 및/또는 여과재의 층에서의 응집체의 검출에 의해 나타난다(도 9). 응집체의 검출은 육안으로 및/또는 보다 첨단의 기술, 예를 들어, 전자 기술에 의해 달성될 수 있다.
다른 예시적인 응용 방법은 시험되는 시료 중 표적 생물제제의 역가를 나타내기 위한 정량적 시험이다. 역가는 0이거나 0 초과일 수 있다. 시험할 유체에 더하여, 역가가 알려져 있는 표적 생물제제를 함유하는 시료를 이러한 예시적인 응용에서 처리한다. 역가가 미지의 표적 생물제제를 함유하는 시험할 유체 및 알려져 있는 역가를 함유하는 유체를 개별적으로 표지화 입자와 직접 혼합한다. 혼합 및 선택적 인큐베이션 후에, 혼합물을 응집화 입자의 층 및/또는 여과재의 층을 통과하여 유동하게 한다. 알려져 있는 역가를 함유하는 시료의 응집 수준은 역가가 알려져 있는 표적 생물제제와 상호관련될 수 있다. 시험할 유체 중 표적 생물제제의 존재는 응집화 입자의 층 및/또는 여과재의 층에서의 응집체의 검출에 의해 나타난다. 또한, 표적 생물제제의 역가는 시험할 유체로부터 얻어진 응집 수준을 역가가 알려져 있는 시료의 응집 수준과 비교함으로써 도출된다(도 10). 시료의 응집 수준은 육안으로 및/또는 더욱 첨단의 기술, 예를 들어, 전자 기술, 예를 들어, 광학 밀도 측정, 색 강도 정량화 어플리케이션, 소프트웨어 및 관련 장치, 예를 들어, 카메라 및 카메라 폰에 의해 정량화될 수 있다(도 11). 응집 수준을 검출 및/또는 정량화하는데 적절한 방법은 이러한 수준의 값을 응집체의 색 강도와 상호관련시키는 것이다.
일부 실시형태에서, 상기 물질을 사용 지점 생물제제 검출을 위해 사용할 수 있다(도 6). 공기 및 기타 기체를 포함하는 유체 중 생물제제를 검출하고 정량화할 수 있다. 유체의 예에는 물, 체액, 타액, 토사물, 소변, 눈물, 땀, 담즙, 모유, 뇌척수액, 대변, 설사, 신체 사정물, 신체 분비물, 고름, 콧물, 림프, 위산, 위액, 귀지, 물집, 체액(humour), 세포내 및 세포외액, 혈액 및 혈액 산물, 음료수, 폐수, 공업용수, 가정용수, 공장 유체 및 공기가 포함될 수 있으나, 이들에 한정되지 않는다.
일부 실시형태에서, 상기 물질을 공기 및 기타 기체에서의 사용 지점 생물제제 검출을 위해 사용할 수 있다. 공기 및 기타 기체 중 생물제제를 검출하고 정량화할 수 있다. 공기 중 생물제제 검출 방법의 일례는 시험할 공기 또는 기체와 직접 접촉하는 표면을 유체로 세정하는 것이다. 그 후에, 얻어진 유체 세정여액 중 생물제제를 시험하기 위해 본원에 기술된 방법을 적용한다. 일례에서, 표면은 병원, 몰(mall), 호텔, 비행기, 보트, 기차, 공항, 항구, 하숙집, 마켓과 같은 환경에서, 공기-조화(냉방 또는 난방) 장치 및 시스템의 공기 필터일 수 있다. 다른 예에서, 표면은 호흡 마스크의 공기 필터일 수 있다.
일부 실시형태에서, 상기 물질을 고체 및 표면상의 사용 지점 생물제제 검출을 위해 사용할 수 있다. 고체 표면상의 생물제제를 검출하고 정량화할 수 있다. 고체 표면상의 생물제제 검출 방법의 일례는 시험할 표면을 유체로 세정하는 것이다. 그 후에, 얻어진 유체 세정여액 중 생물제제를 시험하기 위하여 본원에 기술된 방법을 적용한다. 코팅된 및 비-코팅된 고체 표면의 예는 예를 들어, 분말, 분진, 응집체, 무정형 고체, 시트(sheet), 섬유, 관, 패브릭 등의 임의의 적절한 형태를 포함하거나 그로부터 유래될 수 있다. 일부 실시형태에서, 고체 표면에는 제한 없이, 금속, 유리, 유리섬유, 실리카, 모래, 나무, 섬유, 천연 폴리머, 합성 폴리머, 플라스틱, 고무, 세라믹, 자기, 돌, 대리석, 시멘트, 인간 또는 동물 신체, 식물, 식품, 과일, 채소 또는 고기 또는 이들의 임의의 조합이 포함될 수 있다. 다른 실시형태에서, 고체 표면에는 제한 없이, 시트, 직물, 실험실 코트, 코트(coat), 장갑, 커튼, 문손잡이, 테이블, 전화기, 난간, 키보드, 컴퓨터, 스크린, 버튼, 바닥, 엘리베이터 바닥 등 또는 이들의 임의의 조합이 포함될 수 있다.
또한, 본 개시내용은 본원에 기술된 표지화 입자 중 하나 이상 및/또는 본원에 기술된 응집화 입자 중 하나 이상을 포함하는 조성물, 및 본원에 개시된 조성물 및/또는 조성물의 제조 및/또는 사용에 사용되는 시약 중 임의의 하나 이상을 포함하는 키트에 관한 것이다. 일부 실시형태에서, 조성물은 본원에 기술된 표지화 입자 중 하나 이상을 포함한다. 일부 실시형태에서, 조성물은 본원에 기술된 응집화 입자 중 임의의 하나 이상을 포함한다. 일부 실시형태에서, 조성물은 본원에 기술된 표지화 입자 중 임의의 하나 이상 및 본원에 기술된 응집화 입자 중 임의의 하나 이상을 포함한다.
또한, 수용체는 표적 생물제제, 예를 들어, 미생물 또는 바이러스와 가역적으로 상호작용할 수 있다. 생물제제를 예를 들어, 용리를 통해 수용체로부터 탈착시킬 수 있다.
용리액, 예를 들어, 생리학적 수준보다 더 높은 염화나트륨 용액 및 락토스-함유 용액은 생물제제를 응집화 및 표지화 입자로부터 탈착시킬 수 있다.
2013년 3월 14일에 출원된 미국 가출원 제61/784,820호는 그의 전문이 본원에 참조로 포함된다.
실시예
실시예 1: 키토산- PGMA의 합성(도 3a)
합성은 이들 단계를 따랐다: 탈이온수(DI) 중 0.5% 아세트산 400㎖를 2g의 아세트산을 400㎖의 물에 첨가함으로써 제조하였다. 이러한 산 용액에, 2g의 저분자량 키토산을 첨가하고, 용액이 단상이 될 때까지 용액을 5분 동안 실온에서 교반시켰다. 그 다음, 200㎎의 PGMA를 첨가하고, 최종 현탁액을 2시간 동안 실온에서 교반시켰다. 그 다음, 최종 회백색 현탁액을 중간 프릿(frit)을 통해 여과하고, 고체를 100㎖의 탈이온수로 세척하였다. 분리된 젖은 고체를 10㎖의 탈이온수 중에 재현탁화시켰다. 그의 pH는 약 4였다. 1 방울의 탄산나트륨 용액(5 중량% 탄산나트륨 용액을 500㎎의 Na2CO3를 9.5g의 탈이온수 중에 용해시킴으로써 제조함)을 첨가하여 pH를 약 9로 증가시켰다. 산물을 분리하고, 50㎖ 탈이온수로 세정하고, 그의 습도를 유지하였다.
실시예 2: 헤파린- 세파로스 ( Sepharose )(등록상표)의 합성(도 3b)
합성은 이들 단계를 따랐다: 0.25g의 세파로스(등록상표)(수 중 5 중량%)를 교반 막대와 함께 20㎖ 유리 바이얼(vial)에 로딩하였다. 10㎖의 pH 8.5, 20mM 붕산염 완충제를 고체에 첨가한 다음, 5㎎의 1,1'-CDI를 첨가하였다. 2시간 반 동안 혼합물을 교반시킨 후에, 12.5㎎의 헤파린 나트륨을 첨가하였다. 최종 혼합물을 실온에서 3일 동안 교반시켰다. 산물을 분리하고, 25㎖의 탈이온수로 세정하고, 그의 습도를 유지하였다.
실시예 3: 헤파린-모래의 합성(도 3c)
합성은 이들 단계를 따랐다: 1g의 모래를 교반 막대와 함께 20㎖ 유리 바이얼에 로딩하였다. 10㎖의 pH 8.5, 20mM 붕산염 완충제를 고체에 첨가한 다음, 2.5㎎의 1,1'-CDI를 첨가하였다. 6.25㎎의 헤파린 나트륨을 첨가하기 전에 2시간 반 동안 혼합물을 교반시켰다. 최종 혼합물을 실온에서 3일 동안 교반시켰다. 산물을 분리하고, 50㎖의 탈이온수로 세정하고, 그의 습도를 유지하였다.
실시예 4: 헤파린- PGMA의 합성(도 3d)
합성은 이들 단계를 따랐다: 먼저, PGMA-NH2를 제조하였다: 50㎖의 무수 테트라하이드로퓨란을 둥근 바닥 플라스크에 첨가한 다음, 1.24g의 1,4-다이아미노부탄을 첨가하였다. 용액을 교반하면서, 200㎎ PGMA를 첨가하였다. 그 다음, 용액을 10분 동안 실온에서 교반시킨 후에, 배출하였다. 얻어진 산물에, 50㎖의 탈이온수를 첨가하여, 고체의 침전을 야기하였다. 그 다음, 이러한 고체를 중간 프릿에서 여과하고, 300㎖의 탈이온수로 세정하였다. 하기의 단계는 헤파린-PGMA의 제조를 포함하였다: 0.05g의 PGMA-NH2를 교반 막대와 함께 20㎖ 유리 바이얼에 로딩하였다. 10㎖의 pH 8.5, 20mM 붕산염 완충제를 고체에 첨가한 다음, 10㎎의 1,1'-CDI를 첨가하였다. 2시간 반 동안 혼합물을 교반시킨 후에, 25㎎의 헤파린 나트륨을 첨가하였다. 최종 혼합물을 실온에서 3일 동안 교반시켰다. 최종 산물을 분리하고, 그의 습도를 유지하였다.
실시예 5: 헤파린-[분지화]-모래의 합성(도 4a)
합성은 이들 단계를 따랐다: 1g의 미세 모래를 10㎖의 pH 8.5, 20mM 붕산염 완충제와 혼합하고, 실온에서 수 분 동안 교반시켰다. 그 다음, 8㎎의 1,1'-카보닐다이이미다졸을 현탁액에 첨가하고, 2시간 반 동안 현탁액을 교반시킨 후에, 0.125g의 고차분지형 비스-MPA 폴리에스터-16-하이드록실을 첨가하였다. 추가 2시간 반 후에, 5㎎의 1,1'-카보닐다이이미다졸을 현탁액에 첨가하고, 2시간 동안 교반시킨 후에, 12.5㎎의 헤파린 나트륨을 첨가하였다. 최종 혼합물을 실온에서 3일 동안 교반시켰다. 최종 산물을 분리하고, 그의 습도를 유지하였다.
실시예 6: 헤파린-[분지화]- 세파로스(등록상표) 의 합성(도 4b)
합성은 이들 단계를 따랐다: 250㎎의 세파로스(등록상표)(수 중 5 중량%)를 10㎖의 pH 8.5, 20mM 붕산염 완충제와 혼합하고, 실온에서 수 분 동안 교반시켰다. 그 다음, 16㎎의 1,1'-카보닐다이이미다졸을 현탁액에 첨가하고, 2시간 동안 교반시킨 후에, 0.25g의 고차분지형 비스-MPA 폴리에스터-16-하이드록실을 첨가하였다. 2시간 반 후에, 10㎎의 1,1'-카보닐다이이미다졸을 현탁액에 첨가하고, 2시간 이상 동안 교반시킨 후에, 25㎎의 헤파린 나트륨을 첨가하였다. 최종 혼합물을 실온에서 3일 동안 교반시켰다. 산물을 분리하고, 25㎖ 탈이온수로 세정하고, 그의 습도를 유지하였다.
실시예 7: 헤파린-[분지화]- PGMA의 합성(도 4c)
합성은 이들 단계를 따랐다: 50㎎의 PGMA-NH2를 10㎖의 pH 8.5, 20mM 붕산염 완충제와 혼합하고, 실온에서 수 분 동안 교반시켰다. 그 다음, 32㎎의 1,1'-카보닐다이이미다졸을 현탁액에 첨가하고, 1시간 동안 교반시킨 후에, 0.5g의 고차분지형 비스-MPA 폴리에스터-16-하이드록실을 첨가하였다. 추가 2시간 후에, 20㎎의 1,1'-카보닐다이이미다졸을 현탁액에 첨가하고, 2시간 이상 동안 교반시킨 후에, 50㎎의 헤파린 나트륨을 첨가하였다. 최종 혼합물을 실온에서 3일 동안 교반시켰다. 산물을 분리하고, 25㎖ 탈이온수로 세정하고, 그의 습도를 유지하였다.
실시예 8: 헤파린-[분지화]-금 나노입자의 합성(도 4d)
합성은 이들 단계를 따랐다: PBS 중 금 나노입자 용액 5㎖를 2㎖의 pH 8.5, 20mM 붕산염 완충제와 혼합하고, 유리 바이얼에서 실온에서 30분 동안 교반시켰다. 그 다음, 8㎎의 1,1'-카보닐다이이미다졸(0.05 m㏖, 분자량 162.15)을 현탁액에 첨가하고, 2시간 동안 교반시킨 후에, 0.133g의 고차분지형 비스-MPA 폴리에스터-16-하이드록실을 첨가하였다. 그 후에, 20㎎의 1,1'-카보닐다이이미다졸을 현탁액에 첨가하고, 2시간 동안 교반시킨 후에, 50㎎의 헤파린 나트륨을 첨가하였다. 최종 혼합물을 실온에서 하룻밤 교반시켰다.
실시예 9: 헤파린-[분지화]-모래의 합성
합성은 이들 단계를 따를 것이다: 1g의 미세한 모래를 10㎖의 pH 8.5, 20mM 붕산염 완충제와 혼합하고, 실온에서 수 분 동안 교반시킬 것이다. 그 다음, 8㎎의 1,1'-카보닐다이이미다졸을 현탁액에 첨가하고, 2시간 반 동안 교반시킨 후에, 분지형 폴리(에틸렌 글라이콜)(1.14 m㏖.eq. OH)을 첨가할 것이다. 추가 2시간 반 후에, 5㎎의 1,1'-카보닐다이이미다졸을 현탁액에 첨가하고, 2시간 동안 교반시킨 후에, 12.5㎎의 헤파린 나트륨을 첨가하였다. 최종 혼합물을 실온에서 3일 동안 교반시킬 것이다. 최종 산물을 분리하고, 그의 습도를 유지할 것이다.
실시예 10: 헤파린-[분지화]- 세파로스(등록상표) 의 합성
합성은 이들 단계를 따를 것이다: 250㎎의 세파로스(등록상표)(수 중 5 중량%)를 10㎖의 pH 8.5, 20mM 붕산염 완충제와 혼합하고, 실온에서 수 분 동안 교반시킬 것이다. 그 다음, 16㎎의 1,1'-카보닐다이이미다졸을 현탁액에 첨가하고, 2시간 동안 교반시킨 후에, 분지형 폴리(에틸렌 글라이콜)(2.28 m㏖.eq. OH)을 첨가할 것이다. 2시간 반 후에, 10㎎의 1,1'-카보닐다이이미다졸을 현탁액에 첨가하고, 2시간 이상 동안 교반시킨 후에, 25㎎의 헤파린 나트륨을 첨가할 것이다. 최종 혼합물을 실온에서 3일 동안 교반시킬 것이다. 산물을 분리하고, 25㎖의 탈이온수로 세정하고, 그의 습도를 유지할 것이다.
실시예 11: 헤파린-[분지화]- PGMA의 합성
합성은 이들 단계를 따를 것이다: 50㎎의 PGMA-NH2를 10㎖의 pH 8.5, 20mM 붕산염 완충제와 혼합하고, 실온에서 수 분 동안 교반시킬 것이다. 그 다음, 32㎎의 1,1'-카보닐다이이미다졸을 현탁액에 첨가하고, 1시간 동안 교반시킨 후에, 분지형 폴리(에틸렌 글라이콜)(4,56 m㏖.eq. OH)을 첨가할 것이다. 추가 2시간 후에, 20㎎의 1,1'-카보닐다이이미다졸을 현탁액에 첨가하고, 2시간 이상 동안 교반시킨 후에, 50㎎의 헤파린 나트륨을 첨가할 것이다. 최종 혼합물을 실온에서 3일 동안 교반시킬 것이다. 산물을 분리하고, 25㎖의 탈이온수로 세정하고, 그의 습도를 유지할 것이다.
실시예 12: 헤파린-[분지화]-금 나노입자의 합성
합성은 이들 단계를 따를 것이다: PBS 중 금 나노입자 용액 5㎖를 2㎖의 pH 8.5, 20mM 붕산염 완충제와 혼합하고, 유리 바이얼에서 실온에서 30분 동안 교반시킬 것이다. 그 다음, 8㎎의 1,1'-카보닐다이이미다졸(0.05 m㏖, 분자량 162.15)을 현탁액에 첨가하고, 2시간 동안 교반시킨 후에, 분지형 폴리(에틸렌 글라이콜)(1.14 m㏖.eq. OH)을 첨가할 것이다. 그 후에, 20㎎의 1,1'-카보닐다이이미다졸을 현탁액에 첨가하고, 2시간 동안 교반시킨 후에, 50㎎의 헤파린 나트륨을 첨가할 것이다. 최종 혼합물을 실온에서 하룻밤 교반시킬 것이다.
실시예 13: 감염된 지표수
미국 매사추세츠주 렉싱턴으로부터의 100㎕의 지표수(마실 수 없지만 투명함)를 50㎕의 헤파린-[분지화]-금 나노입자 용액과 혼합하였다. 얻어진 용액을 용액 A로 지정하였다. 100㎕의 마실 수 있는 깨끗한 물을 50㎕의 헤파린-[분지화]-금 나노입자 용액과 혼합하였다. 얻어진 용액을 용액 B로 지정하였다. 둘 모두의 용액 A 및 B를 혼합하였다. 2개의 파스퇴르 유리 피펫을 면에 이어서 헤파린-[분지화]-모래로 막았다. 그 다음, 이들 피펫에 용액 A 또는 B 중 어느 하나를 로딩하였다. 용액을 10분 동안 모래 상에 가라앉도록 한 후에, 그들이 천천히 모래 층을 통과하게 강제하였다. 용액 A를 로딩한 컬럼 A 내의 면 층은 암적색 밴드를 보이는 한편, 용액 B를 로딩한 컬럼 B 내의 면 층은 암적색 밴드를 보이지 않았다(도 7의 예).
실시예 14: 감염된 지표수
미국 매사추세츠주 렉싱턴으로부터의 100㎕의 지표수(마실 수 없지만 투명함)를 50㎕의 헤파린-[분지화]-금 나노입자 용액과 혼합하였다. 얻어진 용액을 용액 C로 지정하였다. 100㎕의 마실 수 있는 깨끗한 물을 50㎕의 헤파린-[분지화]-금 나노입자 용액과 혼합하였다. 얻어진 용액을 용액 D로 지정하였다. 둘 모두의 용액 C 및 D를 혼합하였다. 각각의 용액 C 및 D에, 5㎎의 헤파린-[분지화]-PGMA를 첨가하고 혼합되게 하였다. 2개의 파스퇴르 유리 피펫을 면으로 막았다. 용액 C를 제1 피펫에 로딩하고, 용액 D를 제2 피펫에 로딩하였다. 용액이 천천히 피펫을 통과하여 이동하게 하였다. 용액 C를 로딩한 제1 피펫에서의 결과층은 암적색 내지 갈색 밴드를 보이는 한편, 용액 D를 로딩한 제2 피펫에서의 결과층은 이러한 진한 밴드를 보이지 않았다(도 8의 예).
실시예 15: 감염된 지표수
미국 매사추세츠주 렉싱턴으로부터의 100㎕의 지표수(마실 수 없지만 투명함)를 50㎕의 헤파린-[분지화]-금 나노입자 용액과 혼합하였다. 얻어진 용액을 용액 E로 지정하였다. 100㎕의 마실 수 있는 깨끗한 물을 50㎕의 헤파린-[분지화]-금 나노입자 용액과 혼합하였다. 얻어진 용액을 용액 F로 지정하였다. 둘 모두의 용액, E 및 F를 혼합하였다. 각각의 용액 E 및 F에, 5㎎의 헤파린-세파로스(등록상표)를 첨가하고 200 rpm에서 5분 동안 혼합되게 하였다. 2개의 파스퇴르 유리 피펫을 면으로 막았다. 용액 E를 제1 피펫에 로딩하고, 용액 F를 제2 피펫에 로딩하였다. 용액이 천천히 피펫을 통과하여 이동하게 하였다. 제1 및 제2 피펫에서 2개의 층 간에 착색의 차이가 관찰되었다.
실시예 16: 박테리아 역가가 알려져 있는 수용액
에스케리키아 콜라이(이. 콜라이) 접종물의 제조: 라이소제니 브로쓰(Lysogeny broth, LB)(1㎖)를 15㎖ 세포 배양관에 첨가하였다. 원 샷(ONE SHOT)(상표명) TOP10 이. 콜라이 세포의 40% 글라이세롤 원액(미국 뉴욕주 그랜드 아일랜드 소재의 라이프 테크놀로지즈(Life Technologies)) 칠(7)㎕를 1㎖의 LB 브로쓰에 접종하였다. 접종물을 계속 진탕시키면서(약 250 rpm) 37 ℃에서 3시간 동안 인큐베이션시켰다. 그 다음, 접종물을 2500 rpm 속도에서 4분 동안 원심분리하였다. LB 브로쓰를 분리하고, 이. 콜라이 세포를 매번 1㎖의 멸균 인산염 완충 염수(PBS) 1×(pH 7.4)로 2회 세척한 다음, 1㎖의 동일한 완충제에 재현탁화시켰다. 광학 밀도 측정을 사용하여, 최종 박테리아 역가는 약 5×107개 세포/㎖인 것으로 추정되었다. 이러한 용액을 용액 84-1로 표지하였다. 10㎕의 용액 84-1을 990㎕의 멸균 PBS 1×와 혼합하였다. 얻어진 박테리아 역가는 5×105개 세포/㎖로 추정되었다. 이러한 용액을 용액 84-2로 표지하였다. 10㎕의 용액 84-2를 990㎕의 멸균 PBS 1×와 혼합하였다. 얻어진 박테리아 역가는 5×103개 세포/㎖로 추정되었다. 이러한 용액을 용액 84-3으로 표지하였다. 10㎕의 용액 84-3을 990㎕의 멸균 PBS 1×와 혼합하였다. 얻어진 박테리아 역가는 50개 세포/㎖로 추정되었다. 이러한 용액을 용액 84-4로 표지하였다.
실시예 17: 박테리아 역가가 알려져 있는 수용액
에스케리키아 콜라이(이. 콜라이) 역가와 형성된 응집체의 색 강도의 상관관계: 200㎕의 각각의 상기 용액 84-1, 84-2, 84-3, 84-4를 25㎕의 헤파린-[분지화]-금 나노입자 용액과 혼합하였다. 얻어진 용액을 96-웰 필터 플레이터(밀리포어(Millipore) MAFCN0B)를 통과시켰다. 그 다음, 이들 웰에서의 흡광도 값을 테칸(Tecan) 플레이트 판독기를 사용하여 판독하였다(도 12). 505㎚ 파장에서의 흡광도 판독(Abs.)에 의해 하기의 값이 드러났다: 1) 용액 84-1에 있어서, 흡광도 1.9505; 2) 용액 84-2에 있어서, 흡광도 1.8965; 3) 용액 84-3에 있어서, 흡광도 1.8829; 4) 용액 84-4에 있어서, 흡광도 1.8527. 515㎚ 파장에서의 흡광도 판독(Abs.)에 의해, 하기의 값이 드러났다: 1) 용액 84-1에 있어서, 흡광도 1.9434; 2) 용액 84-2에 있어서, 흡광도 1.8853; 3) 용액 84-3에 있어서, 흡광도 1.8764; 4) 용액 84-4에 있어서, 흡광도 1.8482. 525㎚ 파장에서의 흡광도 판독(Abs.)에 의해 하기의 값이 드러났다: 1) 용액 84-1에 있어서. 흡광도 1.9373; 2) 용액 84-2에 있어서, 흡광도 1.8750; 3) 용액 84-3에 있어서, 흡광도 1.8685; 4) 용액 84-4에 있어서, 흡광도 1.8363. 535㎚ 파장에서의 흡광도 판독(Abs.)에 의해 하기의 값이 드러났다: 1) 용액 84-1에 있어서. 흡광도 1.9202; 2) 용액 84-2에 있어서, 흡광도 1.8646; 3) 용액 84-3에 있어서, 흡광도 1.8537; 4) 용액 84-4에 있어서, 흡광도 1.8288. 545㎚ 파장에서의 흡광도 판독(Abs.)에 의해 하기의 값이 드러났다: 1) 용액 84-1에 있어서. 흡광도 1.9125; 2) 용액 84-2에 있어서, 흡광도 1.8573; 3) 용액 84-3에 있어서, 흡광도 1.8475; 4) 용액 84-4에 있어서, 흡광도 1.8209.

Claims (47)

  1. 생물제제(biological)를 검출하기 위한 방법으로서,
    시료를 복수의 입자와 혼합하는 단계 - 상기 복수의 입자 각각은 상기 생물제제에 결합하기 위해 조정된 수용체를 포함하여, 상기 생물제제가 상기 시료에 존재하고 상기 수용체에 결합하는 경우, 상기 입자는 하나 이상의 응집체를 형성함 -; 및
    상기 입자의 하나 이상의 응집체를 검출함으로써 상기 시료에서 상기 생물제제의 존재를 식별하는 단계
    를 포함하고,
    상기 입자 중 적어도 하나는 공유 결합된 링커 분자를 더 포함하고, 상기 수용체는 상기 링커 분자를 통하여 상기 입자에 공유 결합되며,
    상기 링커 분자는 분지형 폴리(에틸렌 글라이콜)(PEG), 분지형 폴리(에틸렌이민)(PEI), 고차분지형 비스-MPA 폴리에스터-16-하이드록실 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 생물제제를 검출하기 위한 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 입자 중 적어도 하나는 광 흡수 입자(light absorbing particle), 반사 입자, 산란 입자, 금속성 입자, 자성 입자 중 임의의 것 또는 이들의 임의의 조합인, 생물제제를 검출하기 위한 방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 수용체는 적어도 하나의 락토스, 락토스 유도체, 단당류 또는 다당류, 헤파린 또는 키토산, 또는 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 생물제제를 검출하기 위한 방법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 입자 중 적어도 하나는 흡수, 반사 또는 산란 입자, 금속성 입자, 자성 입자, 아가로스, 다당류, 세파로스(Sepharose)(등록상표), 천연 모래, 가공 모래, 직물, 셀룰로스, 면, 울, 나일론, 폴리에스터, 나노입자, 유리, 유리섬유, 실리카, 나무, 섬유, 플라스틱, 고무, 세라믹, 자기, 돌, 대리석, 시멘트, 생물학적 폴리머, 천연 폴리머 또는 합성 폴리머, 또는 다양한 입자 크기의 이들의 임의의 조합인, 생물제제를 검출하기 위한 방법.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 금속성 입자는 금 입자 또는 나노입자, 또는 은 입자 또는 나노입자, 또는 이들의 조합인, 생물제제를 검출하기 위한 방법.
  6. 제4항에 있어서,
    상기 합성 폴리머는 폴리(글라이시딜 메타크릴레이트)(PGMA) 또는 PGMA-NH2이고, 상기 천연 폴리머는 면인, 생물제제를 검출하기 위한 방법.
  7. 제1항에 있어서,
    여과, 경사분리(decantation) 및 자력 중 임의의 것 또는 이들의 임의의 조합을 사용하여 상기 시료로부터 상기 하나 이상의 응집체를 분리하는 단계를 더 포함하는, 생물제제를 검출하기 위한 방법.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 생물제제는 세포, 조직, 조직 산물, 혈액, 혈액 산물, 체액, 체액 산물, 단백질, 백신, 항원, 항독소, 생물학적 약제, 생물학적 처리, 바이러스, 미생물, 진균, 효모, 조류, 박테리아, 원핵생물, 진핵생물, 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 스트렙토코커스(Streptococcus), 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)(이. 콜라이(E. coii)), 슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa), 마이코박테리움(Mycobacterium), 아데노바이러스(adenovirus), 리노바이러스(rhinovirus), 두창 바이러스, 인플루엔자 바이러스, 헤르페스 바이러스, 인간 면역결핍 바이러스(HIV), 광견병 바이러스(rabies virus), 치쿤군야 바이러스(chikungunya virus), 중증 급성 호흡기 증후군(SARS) 바이러스, 말라리아 기생충, 뎅기열 바이러스, 결핵 박테리아, 수막염 미생물(meningitis microorganism), 장티푸스 박테리아, 황열 바이러스, 에볼라 바이러스, 시겔라(Shigella), 리스테리아(Listeria), 예르시니아(Yersinia), 웨스트 나일 바이러스(West Nile virus), 원생동물, 진균 살모넬라 엔테리카(Salmonella enterica), 칸디다 알비칸스(Candida albicans), 트리코파이톤 멘타그로파이테스(Trichophyton mentagrophytes), 폴리오바이러스(poliovirus), 엔테로박터 아에로게네스(Enterobacter aerogenes), 살모넬라 타이피(Salmonella typhi), 클레브시엘라 뉴모니아(Klebsiella pneumonia), 아스페르길루스 브라실리엔시스(Aspergillus brasiliensis) 및 메티실린 내성 스타필로코커스 아우레우스(MRSA), 또는 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 생물제제를 검출하기 위한 방법.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 시료는 물, 즙, 유동 추출물(fluid extract), 체액(body fluid), 타액, 토사물, 소변, 눈물, 땀, 담즙, 밀크(milk), 모유, 뇌척수액, 대변, 설사, 사정액, 신체 분비물, 고름, 콧물(mucus), 림프, 위산 및 위액, 귀지, 물집, 체액(humoral fluid), 세포내 및 세포외액, 혈액 및 혈액 산물, 음료수, 폐수, 공업용수, 가정용수, 공장 유체, 고체 및 표면의 세정여액(rinsate), 식품의 세정여액, 과일의 세정여액, 채소의 세정여액, 공기 및 기체 또는 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 유체인, 생물제제를 검출하기 위한 방법.
  10. 제1항에 있어서,
    상기 시료는 코팅 및 비-코팅 분말, 분진, 응집체, 무정형 고체, 결정질 고체, 시트(sheet), 섬유, 관, 패브릭(fabric), 금속, 유리, 유리섬유, 실리카, 모래, 나무, 섬유, 천연 폴리머, 합성 폴리머, 플라스틱, 고무, 세라믹, 자기, 돌, 대리석, 시멘트, 인간 또는 동물 신체, 식물, 식품, 과일, 채소, 고기, 직물(textile), 코트(coat), 장갑, 커튼, 문손잡이, 테이블, 전화기, 난간, 키보드, 컴퓨터, 스크린, 버튼, 또는 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 고체 및/또는 그 표면인, 생물제제를 검출하기 위한 방법.
  11. 제1항에 있어서,
    상기 입자의 상기 하나 이상의 응집체의 검출은 시각적 검사(visual inspection)를 통하여 수행되는, 생물제제를 검출하기 위한 방법.
  12. 제1항에 있어서,
    상기 입자의 상기 하나 이상의 응집체의 검출은 색 강도 측정, 광학 밀도 측정 또는 이들의 임의의 조합을 통하여 수행되는, 생물제제를 검출하기 위한 방법.
  13. 제1항에 있어서,
    상기 시료에서 상기 입자의 응집 수준을 정량화하는 단계를 더 포함하는, 생물제제를 검출하기 위한 방법.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 입자의 상기 응집 수준을 정량화하는 단계는 시각적 검사, 광학 밀도 측정 또는 색 강도 정량화 중 임의의 것에 의해 수행되는, 생물제제를 검출하기 위한 방법.
  15. 제14항에 있어서,
    상기 시료에서 상기 입자의 상기 응집 수준과 상기 시료에서 상기 생물제제의 농도를 수득하기 위하여 역가가 알려진 하나 이상의 시료의 응집 수준을 비교하는 단계를 더 포함하는, 생물제제를 검출하기 위한 방법.
  16. 제1항에 있어서,
    상기 복수의 입자 중 제1 그룹은 제1 유형의 수용체에 결합되고, 상기 복수의 입자 중 제2 그룹은 상기 제1 유형의 수용체와 상이한 제2 유형의 수용체에 결합되는, 생물제제를 검출하기 위한 방법.
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