CN106198982A - 一种树枝状分子修饰的亲水免疫磁球的制备及其在快速高效细胞捕获中的应用 - Google Patents

一种树枝状分子修饰的亲水免疫磁球的制备及其在快速高效细胞捕获中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明为一种树枝状分子修饰的亲水免疫磁球的制备及其在快速高效细胞捕获中的应用。本发明首先通过水热法合成了磁性纳米粒子，再通过正硅酸乙酯的水解和硅烷化试剂的修饰使材料表面富含氨基，然后将树枝状分子偶联到材料表面使材料亲水，最后将抗体固定到材料表面，这样就制备了可特异性识别肿瘤细胞的捕获基底。实验表明，这种经由抗体和树枝状分子修饰的亲水免疫磁球可缩短材料与细胞结合时间，高特异性识别并快速捕获肿瘤细胞，只需15分钟就可达到86%±5%的捕获效率，同时保持细胞的活性，且能在肿瘤细胞标准加入的全血中成功分离出肿瘤细胞。本发明利用无模板，低成本，低毒性材料，将其应用于细胞捕获，新颖便捷，实用高效，具有巨大的临床应用潜力。

Description

一种树枝状分子修饰的亲水免疫磁球的制备及其在快速高效 细胞捕获中的应用
技术领域
本发明属于生物大分子分离分析技术领域，具体涉及一为种树枝状分子修饰的亲水免疫磁球的制备及其在快速高效细胞捕获中的应用。
背景技术
近年来对于循环肿瘤细胞分离分析的研究受到了极大地重视。研究表明，循环肿瘤细胞可以被用作癌症预测标志物，通过对它们的检测可以反映出实体肿瘤的转移、复发和病理机制，有利于肿瘤的及时发现、及早诊断和有效治疗。同时循环肿瘤细胞在血液中的含量极低，约109个血细胞中仅存在1-10个循环肿瘤细胞。因此，发展出高效率、高灵敏度的方法分离肿瘤细胞就成为关键步骤，为其后续检测提供了无限可能。
随着人们对肿瘤细胞分离研究的不断深入，涌现出了种类繁多的新技术和新方法用于捕获和检测肿瘤细胞。根据分离机理的不同，这些新技术新方法可以分为物理分离和生物亲和分离：物理分离法富集肿瘤细胞主要利用的是肿瘤细胞的尺寸、密度和变形性不同于正常血细胞，这种方法简单便捷，但是特异性和灵敏度均较差，限制了其实际应用；生物亲和分离法富集肿瘤细胞则是通过引入抗体、适配体等可与细胞膜表面特异性作用的生物分子来实现，此方法效率高、特异性强、对细胞损伤小，更具有实际应用价值。免疫磁球具有易合成、易分离的优势，是细胞捕获的优良基底，通过对免疫磁球的修饰可改善其性能，有利于实现高选择性和高灵敏度的细胞捕获。
为达到高效快速分离肿瘤细胞并保持细胞活性的目的，本发明设计并制备了一种树枝状分子修饰的亲水免疫磁球，大大提高了材料的亲水性和抗体的修饰量，从而缩短了免疫磁球和细胞的接触时间以及孵育反应时间，保证高效捕获细胞的同时，细胞活性无明显损伤。利用此材料还可将标准加入到全血中的极少量肿瘤细胞分离，模拟了循环肿瘤细胞实际样品，说明材料具有巨大的临床应用前景。
发明内容
本发明的目的在于提供一种高选择性和高灵敏度的树枝状分子修饰的亲水免疫磁球材料，包括它的制备及在快速高效细胞捕获中的应用。
本发明提供的树枝状分子修饰的亲水免疫磁球，所述磁球为水热法合成的且包覆有氨基化二氧化硅壳层的磁性纳米粒子，树枝状大分子通过戊二醛交联法修饰于磁球表面，再通过碳二亚胺交联法将anti-EGFR抗体偶联得到。其中，作为基底的免疫磁球具有纳米结构和磁性，具有大比表面和易分离特性。本发明材料通过引入含128个伯氨基的树枝状分子，大大增强了抗体的修饰量，从而可以快速识别、高效捕获和缩短反应时间，同时树枝大分子也是亲水分子，提高了材料的超亲水性；利用抗原-抗体的特异性结合，将目标细胞成功分离；材料的超亲水性和低毒性使得捕获后的细胞活性高度保持。
本发明提出的树枝状分子修饰的亲水免疫磁球的制备方法，所述亲水免疫磁球为水热法合成的磁性纳米粒子，通过正硅酸乙酯的水解包覆了一层二氧化硅，再经过氨基硅烷化试剂的处理，磁球表面富含氨基，树枝状分子通过戊二醛交联法修饰于磁球表面，最后抗体通过碳二亚胺共价偶联的方法修饰于磁球表面，形成了具有免疫识别和捕获功能的磁性材料；具体步骤如下：
（1）磁性纳米粒子的合成：采用水热法合成磁性纳米粒子；具体为：称取1.3 g 六水合三氯化铁放于干净烧杯中，再向烧杯中加入75 mL乙二醇，磁力搅拌至完全溶解，向所得溶液中加入3.6 g醋酸钠，搅拌至溶解，并继续搅拌30 min，将混合液体转移至反应釜，置于200℃马弗炉中加热反应10-16 h，冷却后水和乙醇交替洗净材料，于50℃真空干燥箱中干燥备用，得到磁性纳米粒子；
（2）氨基化的磁球的合成：称取步骤（1）制备的磁性纳米粒子300 mg，并将其分散于50mL异丙醇和8 mL蒸馏水中，然后加入2 mL正硅酸乙酯和5 mL氨水，机械搅拌反应10-16 h后用乙醇和水交替洗净并干燥，得到二氧化硅包覆的磁球，将所述磁球重新分散于异丙醇中，向其中加入250 μL3-氨丙基三乙氧基硅烷，于80℃加热回流反应4-8 h，洗净后得到氨基化的磁球；
（3）树枝状分子修饰的亲水磁球的合成：采用戊二醛交联法将树枝状分子修饰在氨基化的磁球上，即：先用5%戊二醛的PBS溶液，活化步骤（２）得到的表面氨基化的磁球2-3 h，用PBS清洗后，加入用量为0.1-10 μL的树枝状分子（PAMAM dendrimer 5.0）溶液，30-37℃偶联3-6 h，然后用含1%氰基硼氢化钠的PBS溶液封端0.5-2 h，最后用PBS洗净，即得到树枝状分子修饰的亲水磁球；
（4）抗体的修饰：采用碳二亚胺共价偶联的方法将表皮生长因子受体抗体（anti-EGFR）修饰于表面为树枝状分子修饰的亲水磁球上，即：首先配制得到浓度在5-20 μg/mL的抗体溶液并加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）和N-羟基丁二酰亚胺（NHS），再向其中加入100-300 μg步骤（３）得到的树枝状分子修饰的亲水磁球，25-37℃偶联12-20 h，即可得到抗体修饰的树枝状分子修饰的亲水免疫磁球，其作为细胞捕获的基底；其中：1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）和N-羟基丁二酰亚胺（NHS）的质量比为1:1-1:2。
本发明所述制备方法得到的树枝状分子修饰的亲水免疫磁球在捕获人神经胶质瘤细胞U251、人肝癌细胞（HepG-2）或肺癌细胞（A549）中的应用。由于免疫磁球修饰有anti-EGFR，因此材料对于细胞膜表面表皮生长因子受体过表达的肿瘤细胞均有高效捕获效果，如人神经胶质瘤细胞（U251）、人肝癌细胞（HepG-2）、肺癌细胞（A549）等。
本发明中，亲水免疫磁球捕获人神经胶质瘤细胞U251的操作步骤为：取100-300 μg抗体和树枝状分子共同修饰的磁性材料加入到12孔板的一孔作为一组，每孔中加入1 mL人神经胶质瘤细胞U251悬浮液，细胞密度为105-106，在培养箱孵育5-90 min后，吸取上清液并用PBS浸洗3次，计算细胞的捕获效率。向捕获后的细胞加入10 μg/mL的AO染料，室温染色15 min后洗净，用荧光显微镜观察。
本发明中，肿瘤细胞U251标准加入到全血中的操作步骤为：分别选取10、20、50、100个已经用AO荧光染料预染的U251细胞加入到1 mL全血中，再向其中加入等量的树枝状分子修饰的亲水免疫磁球进行靶向细胞捕获，在孵育相同时间后，PBS 浸洗材料3次，用荧光显微镜观察捕获到的U251细胞数。
本发明所述制备方法得到的树枝状分子修饰的亲水免疫磁球在高效捕获细胞膜含抗体所对应抗原的肿瘤细胞中的应用，采用共价偶联的方法改变材料表面修饰的抗体，则可高效捕获细胞膜含抗体所对应抗原的肿瘤细胞。所述抗体为anti-EpCAM，对应的肿瘤细胞为乳腺癌细胞MCF-7、前列腺癌细胞DU145、非小肺癌细胞或人结直肠腺癌上皮细胞DLD-1中任一种。
细胞捕获的操作步骤为：（1）取100-300 μg抗体和树枝状分子共同修饰的磁性材料加入到12孔板的一孔作为一组，每孔中加入1 mL 人神经胶质瘤细胞U251悬浮液，细胞密度为105-106，在培养箱孵育5-90 min后，吸取上清液并用PBS浸洗3次，计算细胞的捕获效率。向捕获后的细胞加入10 μg/mL的AO染料，室温染色15 min后洗净，用荧光显微镜观察。为验证材料的高效性，设计实验分别用未经修饰的磁球、未经树枝状分子偶联直接修饰抗体的磁球和经树枝状分子偶联的修饰抗体的磁球材料进行细胞捕获实验，结果表明树枝状分子修饰的亲水免疫磁球具有最优的捕获效率，可高达86±5%。同时，还探究了孵育时间对细胞捕获效率的影响，发现只需15min就可实现U251的高效捕获。（2）肿瘤细胞U251标准加入到全血中：分别选取10、20、50、100个已经用AO荧光染料预染的U251细胞加入到1 mL全血中，再向其中加入100-300 μg等量的树枝状分子修饰的亲水免疫磁球进行靶向细胞捕获，在孵育10-45 min后，PBS 浸洗材料3次，用荧光显微镜观察捕获到的U251细胞数。
细胞活性实验：向捕获细胞后的材料按1：1投料比加入吖啶橙（AO）和碘化丙啶（PI）染料，室温染色15 min后洗净，显微镜观察，活细胞呈现黄绿色，死细胞为红色，结果表明捕获后的细胞活性大于99%。
通过上述步骤成功实现了树枝状分子修饰的亲水免疫磁球的制备及应用，材料的进一步表征通过投射电子显微镜（TEM）、红外光谱（FT-IR）、紫外吸收光谱（UV）和荧光图像说明。
本发明的有益效果在于：本发明利用无模板，低成本，低毒性材料，将其应用于细胞捕获，新颖便捷，实用高效，具有巨大的临床应用潜力。
附图说明
图1磁球及磁球包覆二氧化硅后的红外表征图。
图2磁球、磁球包覆二氧化硅、及磁球包覆二氧化硅再修饰上树枝状分子的TEM图像。其中：（a）为磁球的TEM图像，（b）磁球包覆二氧化硅的TEM图像，(ｃ)磁球包覆二氧化硅再修饰上树枝状分子的TEM图像。
图3树枝大分子偶联前后吸光度对比图。
图4孵育时间对捕获效率的影响。
图5未经修饰的磁球、未经树枝状分子偶联直接修饰抗体的磁球和经树枝状分子偶联的修饰抗体的磁球材料捕获效率荧光对比图。其中：（a）为未经修饰的磁球、未经树枝状分子偶联直接修饰抗体的磁球和经树枝状分子偶联的修饰抗体的磁球材料捕获效率图，（b）为未经修饰的磁球捕获细胞后的荧光图，(ｃ) 为未经树枝状分子偶联直接修饰抗体的磁球捕获细胞后的荧光图，(ｄ)为经树枝状分子偶联的修饰抗体的磁球捕获细胞后的荧光图。
图6细胞活性荧光图像。
图7标准加入法模拟实际样的捕获效率图。
图8是本发明的流程图。
具体实施方式
下面通过实施例进一步说明本发明。
实施例1：人表皮生长因子受体抗体修饰的树枝状分子辅助亲水磁性纳米粒子作为细胞捕获基底的合成
采用水热法合成磁性纳米粒子，称取1.3 g 六水合三氯化铁放于干净烧杯中，再向烧杯中加入75 mL乙二醇，磁力搅拌至完全溶解，向所得溶液中加入3.6 g醋酸钠，搅拌至溶解，并继续搅拌30 min，将混合液体转移至反应釜，置于200℃马弗炉中加热反应10-16 h，冷却后水和乙醇交替洗净材料，于50℃真空干燥箱中干燥备用，得到磁性纳米粒子；
称取水热法合成的磁性纳米粒子300 mg并将其分散于50 mL异丙醇和8 mL蒸馏水中，然后加入2 mL正硅酸乙酯和5 mL氨水，机械搅拌反应16 h后用乙醇和水交替洗净并干燥，得到的二氧化硅包覆的磁球重新分散于异丙醇中，向其中加入250 μL3-氨丙基三乙氧基硅烷，于80℃加热回流反应6 h，洗净后得到氨基化的磁球；采用戊二醛交联法将树枝状分子修饰在氨基化的磁球上，先用5%戊二醛的PBS溶液，活化表面氨基化的磁球2 h，用PBS清洗后，加入用量为5.0 μL的树枝状分子（PAMAM dendrimer 5.0）溶液，37℃偶联4 h，然后用含1%氰基硼氢化钠的PBS溶液封端1 h，最后用PBS洗净，即得到树枝状分子修饰的亲水磁球；利用碳二亚胺共价偶联的方法将表皮生长因子受体抗体（anti-EGFR）修饰于表面为树枝状分子的亲水磁球上，首先配制得到浓度在10 μg/mL的抗体溶液并加入质量比为3:4的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）和N-羟基丁二酰亚胺（NHS），再向其中加入200 μg修饰有树枝状分子的磁球，37 ℃偶联16 h后即可得到树枝状分子修饰的亲水免疫磁性微球材料作为细胞捕获的基底。
实施例2：超亲水免疫磁球材料在快速高效捕获人神经胶质瘤细胞U251中的应用
取200 μg抗体和树枝状分子共同修饰的磁性材料加入到12孔板的一孔作为一组，每孔中加入1 mL 人神经胶质瘤细胞U251悬浮液，细胞密度为105，在培养箱孵育15 min后，吸取上清液并用PBS浸洗3次，计算细胞的捕获效率。向捕获后的细胞加入10 μg/mL的AO染料，室温染色15 min后洗净，用荧光显微镜观察。
分别选取10、20、50、100个已经用AO荧光染料预染的U251细胞加入到1 mL全血中，再向其中加入300 μg树枝状分子修饰的亲水免疫磁球进行靶向细胞捕获，在孵育15 min后，PBS 浸洗材料3次，用荧光显微镜观察捕获到的U251细胞数。图1为磁球及磁球包覆二氧化硅后的红外表征图，其中568 cm-1和1080 cm-1处分别为Fe-O和Si-O-Si特征吸收峰，945cm-1和795 cm-1处的特征吸收峰分别归属于Si-OH弯曲振动和Si-O对称伸缩振动。通过红外表征可证明磁球和二氧化硅包覆磁球的成功合成。
图2为磁球、磁球包覆二氧化硅、及磁球包覆二氧化硅再修饰上树枝状分子的TEM图像，通过（a）和（b）图对比可发现磁球外多出一薄层，表面二氧化硅包覆到了磁球表面，图（b）和图（c）对比可发现图（c）处薄层间存在间隙，表明有两种不同的物质包覆在了磁球表面，即说明树枝状分子的成功修饰。
图3为树枝状分子偶联前后吸光度对比图，通过紫外吸光度的下降表明有一部分树枝状分子反应到了材料表面，即树枝分子对材料的成功修饰。
图4为孵育时间对捕获效率的影响，在0-15min内随时间的延长，捕获效率也相应提高，在15min时达到捕获效率最大值，此后随着时间的延长，捕获效率变动不大，因此可得出结论，材料在孵育15min后即可高效捕获肿瘤细胞。
图5为未经修饰的磁球、未经树枝状分子偶联直接修饰抗体的磁球和经树枝状分子偶联的修饰抗体的磁球材料捕获效率荧光对比图，通过对比可以发现，裸露磁球仅能靠非特异性吸附捕获不足10%的肿瘤细胞，而直接修饰抗体的磁球捕获效率只有60%左右，修饰树枝状分子再修饰抗体的免疫磁球则可捕获86% ± 5%的肿瘤细胞，可得出结论，应用本专利所述方法合成的磁性免疫材料具有高效快速分离肿瘤细胞的特性。
图6为捕获后细胞活性荧光图像，图片中A点处为死细胞，其余细胞均为活细胞，细胞活性大于99%，由此表明本发明所述方法可以高度保持捕获后细胞的活性，对细胞活性损伤小。
图7为标准加入法模拟实际样的捕获效率图，通过模拟实际样可以发现即使在目标肿瘤细胞存在数量极少的前提下，本材料仍可捕获到60%-80%的目标肿瘤细胞，标志材料具有临床应用前景。

Claims (6)

1.一种树枝状分子修饰的亲水免疫磁球的制备方法，其特征在于：所述亲水免疫磁球为水热法合成的磁性纳米粒子，通过正硅酸乙酯的水解包覆了一层二氧化硅，再经过氨基硅烷化试剂的处理，磁球表面富含氨基，树枝状分子通过戊二醛交联法修饰于磁球表面，最后抗体通过碳二亚胺共价偶联的方法修饰于磁球表面，形成了具有免疫识别和捕获功能的磁性材料；具体步骤如下：
（1）磁性纳米粒子的合成：采用水热法合成磁性纳米粒子；
（2）氨基化的磁球的合成：称取步骤（1）制备的磁性纳米粒子300 mg，并将其分散于50mL异丙醇和8 mL蒸馏水中，然后加入2 mL正硅酸乙酯和5 mL氨水，机械搅拌反应10-16 h后用乙醇和水交替洗净并干燥，得到二氧化硅包覆的磁球，将所述磁球重新分散于异丙醇中，向其中加入250 μL3-氨丙基三乙氧基硅烷，于80℃加热回流反应4-8 h，洗净后得到氨基化的磁球；
（3）树枝状分子修饰的亲水磁球的合成：采用戊二醛交联法将树枝状分子修饰在氨基化的磁球上，即：先用5%戊二醛的PBS溶液，活化步骤（２）得到的表面氨基化的磁球2-3 h，用PBS清洗后，加入用量为0.1-10 μL的树枝状分子（PAMAM dendrimer 5.0）溶液，30-37℃偶联3-6 h，然后用含1%氰基硼氢化钠的PBS溶液封端0.5-2 h，最后用PBS洗净，即得到树枝状分子修饰的亲水磁球；
（4）抗体的修饰：采用碳二亚胺共价偶联的方法将表皮生长因子受体抗体（anti-EGFR）修饰于表面为树枝状分子修饰的亲水磁球上，即：首先配制得到浓度在5-20 μg/mL的抗体溶液并加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基丁二酰亚胺，再向其中加入100-300 μg步骤（３）得到的树枝状分子修饰的亲水磁球，25-37℃偶联12-20 h，即可得到抗体修饰的树枝状分子亲水免疫磁球，其作为细胞捕获的基底；其中：1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基丁二酰亚胺的质量比为1:1-1:2。
2.一种如权利要求1所述制备方法得到的树枝状分子修饰的亲水免疫磁球在捕获人神经胶质瘤细胞U251、人肝癌细胞HepG-2或肺癌细胞A549中的应用。
3.根据权利要求２所述的应用，其特征在于亲水免疫磁球捕获人神经胶质瘤细胞U251的操作步骤为：取100-300 μg 抗体和树枝状分子共同修饰的磁性材料加入到12孔板的一孔作为一组，每孔中加入1 mL 人神经胶质瘤细胞U251悬浮液，细胞密度为105-106，在培养箱孵育5-90 min后，吸取上清液并用PBS浸洗3次，计算细胞的捕获效率，向捕获后的细胞加入10 μg/mL的AO染料，室温染色15 min后洗净，用荧光显微镜观察。
4.根据权利要求３所述的应用，其特征在于肿瘤细胞U251标准加入到全血中的操作步骤为：分别选取10、20、50、100个已经用AO荧光染料预染的U251细胞加入到1 mL全血中，再向其中加入等量的树枝状分子修饰的亲水免疫磁球进行靶向细胞捕获，在孵育相同时间后，PBS 浸洗材料3次，用荧光显微镜观察捕获到的U251细胞数。
5.一种如权利要求1所述制备方法得到的树枝状分子修饰的亲水免疫磁球在高效捕获细胞膜含抗体所对应抗原的肿瘤细胞中的应用，其特征在于采用共价偶联的方法改变材料表面修饰的抗体，则可高效捕获细胞膜含抗体所对应抗原的肿瘤细胞。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于所述抗体为anti-EpCAM，对应的肿瘤细胞为乳腺癌细胞MCF-7、前列腺癌细胞DU145、非小肺癌细胞或人结直肠腺癌上皮细胞DLD-1中任一种。
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