CN111512158A - 用于癌症生物标志物捕获的纳米工程化表面 - Google Patents

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Abstract

本文描述了癌症生物标志物(例如囊泡)捕获表面，其包括：基材；附着至基材的第一多个纳米颗粒；多个双官能系链，其中双官能系链的第一官能团附接至第一多个纳米颗粒的至少一部分；第二多个纳米颗粒，其附接至多个双官能系链的至少一部分的第二官能团；附接至第二多个纳米颗粒的至少一部分的捕获剂；和附接至表面的多个聚合物刷分子，其中聚合物刷分子的分子量低于双官能系链，并且其中聚合物刷分子减少与表面的非特异性结合。还描述了从液体活检样品中捕获癌症生物标志物(诸如囊泡)的方法。

Description

用于癌症生物标志物捕获的纳米工程化表面
技术领域
本公开涉及适用于捕获癌症生物标志物(诸如囊泡，特别是外来体(分泌体，exosomes))的表面以及捕获癌症生物标志物的方法。
背景技术
外来体是在细胞之间转运功能性核糖核酸(RNA)和蛋白质的纳米级囊泡。从肿瘤进入循环的外来体的释放速率和组成与恶性肿瘤和转移有关。因此，外来体是有关癌症状态的潜在丰富信息来源，可从微创血液抽取(称为“液体活检”)获得。然而，由于这些囊泡的小尺寸和浮力，分离和鉴定外来体材料是一个挑战。
与目前通过超速离心分离外来体的金标准相比，免疫亲和分离技术可提供高选择性、高灵敏度和较低的样品破坏可能性。由于外来体膜是细胞内和质膜物质的混合物，因此具有针对癌细胞表面标志物的抗体的捕获表面能够分离肿瘤来源的囊泡的亚群。这使得能够定量相对释放速率，并提高用于下游测定(如RNA测序)的纯度。免疫亲和方法已用于微流体通道和磁珠表面。
需要一种测定表面，其能够从例如作为液体活检的一部分的血清中分离出癌症生物标志物，如外来体。
发明内容
在一个方面，一种癌症生物标志物捕获表面，其包含：
基材，
附接至所述基材的第一多个纳米颗粒，
多个双官能系链(栓链，tether)，其中所述双官能系链的第一官能团(官能度，functionality)附接至所述第一多个纳米颗粒的至少一部分，
第二多个纳米颗粒，其附接至所述多个双官能系链的至少一部分的第二官能团，
附接至所述第二多个纳米颗粒的至少一部分的捕获剂，和附接至所述表面的多个聚合物刷分子(polymer brush molecules)，其中所述聚合物刷分子的分子量低于所述双官能系链，并且其中所述聚合物刷分子减少与所述表面的非特异性结合。
在另一方面，一种从液体活检样品中捕获癌症生物标志物的方法，包括：
使所述液体活检样品与癌症生物标志物捕获表面接触，所述癌症生物标志物捕获表面包含：
基材，
多个双官能系链，其中所述双官能系链的第一官能团附接至所述基材，或任选地所述双官能系链的第一官能团附接至与所述基材共价连接的第一多个纳米颗粒的至少一部分，
第二多个纳米颗粒，其附接至所述多个双官能系链的至少一部分的第二官能团，
附接至所述第二多个纳米颗粒的至少一部分的捕获剂，和
附接至所述表面的多个聚合物刷分子，其中所述聚合物刷分子的分子量低于所述双官能系链，并且其中所述聚合物刷分子减少与所述表面的非特异性结合。
附图说明
图1为本公开的表面的示意图。纳米颗粒介导的多价结合以及可变长度的系链，使多种抗体能够结合诸如直径量级为约20-200nm的外来体的癌症生物标记物。
图2a-c是聚合物表面制备的概述。图2a示出了第7代(G7)聚(酰胺基胺)(PAMAM)树枝状聚合物纳米颗粒的部分羧化。图2b示出了PEG-G7表面的制备。图2c示出了G7-PEG-G7表面的制备。
图3a和b显示了确定足以捕获200nm官能化珠粒的最小PEG系链浓度的初步实验。图3a显示，对于高于2vol％每系链的表面，未观察到捕获效率的提高。图3b显示，与–PEG-G7相比，G7树枝状聚合物预涂层(G7-PEG-G7)显著增强了捕获。
图4a-c显示树枝状聚合物涂层改变了捕获表面的水合作用和形貌特征。图4a显示，根据接触角测量，与其它测试的表面相比，在第一层具有G7 PAMAM树枝状聚合物(G7-PEG和G7-PEG-G7)的表面显著提高了亲水行为。图4b显示了使用AFM成像的G7-PEG-G7表面上纳米尺度特征的程式化渲染。图4c显示，使用AFM测量，具有两层G7树枝状聚合物(G7-PEG-G7)的表面表现出显著更高的粗糙度。柱示出了平均值+/-标准偏差，*表示成对比较的p<.05，而‘ns’表示组之间无统计学差异。
图5a-e显示了接触角结果。图5a和b显示了收集a)前进(advancing)和b)后退(receding)接触角测量时的水滴图像。图5c和d显示，在玻璃上的c)前进和d)后退接触角大于mPEG对照，表明了聚合物成功结合。当在高盐缓冲液中结合甲氧基封端的聚(乙二醇)(mPEG)时，观察到较低的接触角，表明了更致密的刷。图5e显示了互补的前进接触角测量，并显示了相同的统计分组。图显示了n＝8的平均值+/-标准偏差，(e)中的大写字母表示统计分组。
图6a-f显示了聚合物涂覆的表面的代表性高度轮廓。图6a环氧官能化玻璃，图6bmPEG涂覆的玻璃，图6c涂有mPEG和系链的混合物的玻璃，图6d具有PEG-系链的G7的表面，图6e在PEG系链之前涂覆有G7的表面，以及图6f G7-PEG-G7捕获表面。比例尺代表100nm。灰色比例尺的范围为12nm。
图7显示了外来体与多层树枝状聚合物表面的增强的结合。图7a显示，200nm荧光珠的相对捕获在具有G7-PEG-G7配置的2％PEG表面上最大。图7b显示了健康人血清中外来体的相对捕获，该捕获是通过用aCD63官能化的表面上的总蛋白吸附来定量的。图7c显示了aCD63固定的表面上从健康人血清中捕获外来体的确认，其使用靶向CD81的ELISA进行定量。该结果证明了使用减少的捕获抗体的益处。图7d显示了在针对四跨膜蛋白(CD81)和针对细胞表面标志物(HER2和EGFR)进行官能化的表面之间，培养的外来体捕获的比较。尽管官能化表面之间的统计学差异不显著，但两个表面都比没有抗体的表面显示出显著更高的捕获。柱示出了平均值+/-标准偏差，*表示与所有其它组的成对比较p<.05，而‘ns’表示组之间无统计学差异。
图8a和b显示了抗体结合策略。图8a显示了完整抗体与PEG-G7表面的羧基的结合。图8b显示了部分还原的抗体与PEG-G7表面的胺基的结合。
图9显示，Western印迹证实了MDA-MB-231来源的外来体上存在癌细胞表面标志物EGFR和HER2，但不存在EpCAM。
图10显示，Western印迹证实了存在四跨膜蛋白CD81和CD9，它们将外来体与MDA-MB-231来源的外来体中大小相似的细胞外囊泡区分开。
图11是用于检测与AFM多价解结合的概念图。使标称直径为180nm并已用EpCAM官能化的探针与捕获表面接触并以500nm/s的速度缩回。随着探针缩回，从左到中心，发生两个解结合事件，从中心到右，发生三个解结合事件。随着探针挠度的突然变化，可以检测到一对或多对EpCAM抗体对的离散破裂。
图12a-d显示了使用AFM力光谱学对粘合能的量化。来自图12a未官能化的G7-PEG-G7、图12b抗体官能化的PEG和图12c抗体官能化的G7-PEG-G7表面的代表性缩回曲线分别显示了单个非特异性破裂、单个特异性破裂和五个特异性破裂事件。破裂事件由*和垂直线表示。三角形将粘附定义为非特异性(0-12nm)与特异性(>12nm)。灰色实线描绘了用于计算功的值。图12d显示了将探针与每个捕获表面分开所需的总能量。*表示与所有其它组相比，p>0.5。为了清楚起见，省略了其它统计分组。
图13a-d显示了来自非官能化的G7-PEG-G7表面(图13a和b)和官能化的PEG-Ab表面(图13c和d)的代表性缩回曲线。G7-PEG-G7表面倾向于表现出显著的非特异性相互作用，定义为距接触点(由三角形表示)<12nm。官能化的表面倾向于表现出超过12nm的破裂事件。用星号表示检测到的破裂事件，垂直线表示幅度。连续的灰色线表示用于计算功的区域。
图14a-d显示了官能化的G7-PEG-G7-Ab表面的代表性缩回曲线，表明了多价解结合。选定曲线显示了2(14a)、3(14b)、4(14c)和6(14d)个离散的解结合事件。
图15a-d显示AFM力光谱学测量。图15a显示，将探针与非官能化的G7-PEG-G7表面分开需要统计学上与官能化的PEG-Ab表面相当量的非特异性功。图15b显示，超过12nm，抗体和EpCAM之间的相互作用更有可能是特异性的。来自两个捕获表面PEG-Ab和G7-PEG-Ab的功显著大于非官能化的表面。总之，图15a和b表明，G7-PEG-G7-Ab表面上的高捕获率是由于特异性和非特异性相互作用共同导致的。图15c显示，破裂幅度未显示出依赖于表面的统计趋势，然而，图15d显示，与非官能化的表面相比，官能化的表面上的破裂距离显著更高。数据仅显示检测到事件的曲线。大写字母表示统计学显著的分组。
图16显示了使用AFM力光谱学对多价结合测量的定量。官能化的G7-PEG-G7上每个缩回的离散破裂事件数的平均值为2.9，相比之下，官能化的PEG对照上的为1.6。破裂事件定义为与大约8pN幅度对应的挠度的突然变化。
通过下面的具体实施方式、附图和所附权利要求，本领域技术人员将了解和理解上述和其它特征。
具体实施方式
如本文所述，发明人已经使用免疫亲和方法与捕获表面相结合来展示从液体活检中捕获诸如外来体的癌症生物标志物。当多个抗体分子能够与分析物相互作用时，由于多价结合显著降低了解离速率，因此增强了免疫亲和捕获方法的灵敏度和选择性。先前，开发了使用聚酰胺基胺树枝状聚合物纳米颗粒捕获循环肿瘤细胞(CTC)的方法。这些超支化聚合物通过两种方式促进多价结合：高密度的官能团允许将多个抗体分子结合到每个直径约为9nm的纳米颗粒上，和支化结构允许在结合域的方向上具有柔性。然而，CTC的直径比外来体大50-1,000倍。因此，尚不清楚是否也可以使用类似的表面来捕获诸如外来体的癌症生物标志物。
具体地，本文描述了用于捕获癌症生物标志物(诸如癌症来源的囊泡，包括外来体)的表面和装置，特别是从血液样品且更特别地是从血浆中捕获癌症生物标志物。从肿瘤脱落的细胞和囊泡包含有关癌症的大量信息，包括其对特定药物的易感性及其转移的潜力。这种“液体活检”的主要挑战是从全血中鉴定和分离肿瘤来源的物质。本文描述了具有多价结合的表面和装置，其可以高效率和高特异性捕捉癌症生物标志物。通过使用以柔性系链附接至基材表面的抗体涂覆的纳米颗粒的密集包装网络(densely-packed netword)，所述表面出乎意料地对直接范围为20-200nm的小尺寸囊泡实现了多价结合。含有癌症生物标志物(诸如肿瘤来源的囊泡)的有效液体活检可能比其它方法更早地提供癌症诊断、检测转移并根据基因表达的变化指导个性化疗法。
液体活检是一种新兴的无创癌症诊断技术。由于信息是通过抽血收集的，因此液体活检可以比传统技术更早地发现癌症。另外，液体活检可以提供关于太小或难以通过常规活检技术进行采样的肿瘤的信息，并且可以在癌症治疗过程中多次使用。
肿瘤脱落的物质(例如癌症生物标志物)包括核酸(例如DNA)、蛋白质、囊泡和全细胞。
包括囊泡在内的癌性囊泡包含来自细胞的材料的混合物，该混合物包裹在从细胞内和细胞外膜提取的材料的内部。这些囊泡被认为是主要的细胞间通讯途径，并且最近被认为与诱导癌细胞的转移行为和转移前的利基(微环境，niche)形成有关。囊泡有效载荷包括反映基因表达模式的mRNA和小RNA，并可表示在癌症治疗过程中耐药性或药敏性的变化。特别重要的是，健康的血清含有1012个外来体ml-1，携带0.2-2.5ng ml-1的RNA，这是可以测定的。
肿瘤脱落的囊泡本身很小。例如，外来体是用于细胞间通讯的囊泡，其直径范围为20-200nm。外来体分离的最常见方法是超速离心(其通过浮力来分离物质并且需要运行数小时)，或梯度离心(其通过使用聚合物涂覆而污染所收集的物质)。外来体含有部分质膜，因此可以通过其原始细胞表达的相同表面标志物进行鉴定。通过来自内皮网的跨膜蛋白的存在可以将外来体与其它囊泡进一步区分开。从全血中有效分离外来体的新兴方法至少部分依赖于对这些膜蛋白的抗体识别。
将癌症来源的外来体与非癌性物质分离需要免疫学技术。即使通过离心或其它方法成功将外来体与其它血液成分分离，也是如此。分离依赖于抗体，该抗体由免疫系统自然产生以识别异物，但也可以被制造以识别并结合许多其它蛋白质。抗体构成基础科学和医学诊断中许多技术的基础。
虽然所有外来体都表达细胞内蛋白如四跨膜蛋白(尤其是CD63)，但通过特定跨膜蛋白的存在，可以将癌细胞囊泡与白细胞来源的囊泡和其它物质区分开。例如，特异性结合上皮细胞粘附分子(EpCAM)和表皮生长因子受体(EGFR和HER2)的抗体可用于从白血球和其它白血细胞中分离出乳腺癌细胞。将针对在靶材料中过表达的蛋白质的抗体与固相载体(固相支持物，solid support)或其它易于分离的介质(如磁珠)结合。
有利地，本文所述的表面和装置可以包括经选择和调整以特异性识别特定类型癌症脱落的囊泡的抗体或其它捕获剂的混合物(cocktail)。纳米工程化的表面被设计成利用多价结合，这提供了两个益处。第一，多种不同抗体分子对囊泡的识别提高了对关注的癌症的特异性。第二，多个结合事件以指数方式增加了结合能，达到了更高的捕获效率。图1显示了外来体与捕获表面的多价结合的示意图。
在一个方面，一种癌症生物标志物捕获表面，其包含：
基材，
附着至所述基材的第一多个纳米颗粒，
多个双官能系链，其中所述双官能系链的第一官能团附接至所述第一多个纳米颗粒的至少一部分，
第二多个纳米颗粒，其附接至所述多个双官能系链的至少一部分的第二官能团，
附接至所述第二多个纳米颗粒的至少一部分的捕获剂，和
附接至所述表面的多个聚合物刷分子，其中所述聚合物刷分子的分子量低于所述双官能系链，并且其中所述聚合物刷分子减少与所述表面的非特异性结合。
在某些实施方式中，可以在不存在所述第一多个纳米颗粒的情况下将所述系链附接至所述表面，即从所述表面省略了所述第一多个纳米颗粒。
示例性的癌症生物标志物包括循环中的肿瘤细胞、囊泡、蛋白质和DNA。特定的癌症生物标志物是囊泡，例如外来体。
示例性的基材包括玻璃基材，特别是官能化的玻璃基材。可以用作基材的其它表面包括聚合物(例如聚甲基丙烯酸甲酯、聚碳酸酯和环状烯烃聚合物)和硅酮(硅酮晶片和聚(二甲基硅氧烷)(PDMS))。用于基材表面的示例性官能团包括环氧基、羧基、硫醇基(巯基，thiol group)、炔基、叠氮基、马来酰亚胺基、羟基、胺基、醛基或包含前述中至少一种的组合。特定的基材是环氧官能化玻璃，例如
Figure BDA0002547804570000091
ArrayIt Inc、Sunnyvale,Calif。
第一多个纳米颗粒附接至基材，例如通过使纳米颗粒上的官能团与基材上的官能团反应。可以通过共价或非共价键，特别是共价键，将第一多个纳米颗粒附接至基材。例如，在使用环氧官能化基材时，可以通过表面环氧基团与纳米颗粒上的伯胺基团反应来将用伯胺基团官能化的纳米颗粒附接至表面上。所附接的第一多个纳米颗粒可以经修饰以提供第二官能团，诸如N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)官能团，然后其可以与双官能系链的第一端上的官能团反应，诸如与双官能系链第一端上的胺基团反应。然后，可以修饰双官能系链的未结合端以提供第二官能团，诸如NHS官能团，然后其可以与第二多个纳米颗粒(例如用伯胺基团官能化的纳米颗粒)上的官能团反应。最后，第二多个纳米颗粒上的未反应的羧基的一部分可以被修饰以提供NHS官能团，例如，其然后可以与捕获剂反应以提供捕获表面(见图2c)。可以应用使用羧酸、硫醇、羟基、环氧化物、叠氮基、炔烃、异硫氰化物和丙烯酸酯的其它表面化学。
在一个实施方式中，第一多个纳米颗粒和第二多个纳米颗粒均包含相同或不同的树枝状聚合物。树枝状聚合物包括树状物、树枝状星形支化聚合物、树枝状超支化聚合物、致密树枝状星形支化聚合物、超梳状支化的树枝状聚合物或包含前述中至少一种的组合。树枝状聚合物包括多层或多代重复单元，通常称为分支单元(branch cell)，其均含有一个或多个分支点。树状物包含从共同核发出的多个树突，该共同核可以是单个原子或原子组。每个树突通常包括末端表面基团、支化官能度大于或等于2的内部支化接合点、和共价连接相邻支化接合点的二价连接器。树枝状星形支化聚合物具有从核发出的多个臂。超支化的树状物具有非常大量的分支并且可以具有不完美支化的或不规则的结构。制备和表征树状物、树突、超支化聚合物、星形支化聚合物、致密星形支化聚合物和超梳状支化聚合物在本领域中都是众所周知的并且在文献中有详尽的描述。
更具体地，第一多个纳米颗粒和第二多个纳米颗粒包含相同或不同的聚(酰胺基胺)树状物。聚(酰胺基胺)树状物可以包含第3代PAMAM树状物、第4代PAMAM树状物、第5代PAMAM树状物、第6代PAMAM树状物、第7代PAMAM树状物、第8代PAMAM树状物、第9代PAMAM树状物或包含前述中至少一种的组合。
双官能系链的第一官能团附接至第一多个纳米颗粒的至少一部分。附接包括共价或非共价连接，特别是共价连接。
在一个实施方式中，双官能系链包含聚(乙二醇)或其它防污聚合物和肽。聚(乙二醇)具有式H-(O-CH2-CH2)n-OH，其中n优选为10-500。示例性的防污聚合物和肽包括聚(噁唑啉)、丙烯亚砜(propylene suloxide)、聚甘油树突、右旋糖酐、聚甜菜碱、以及亲水不带电的形成α-螺旋的多肽。
在一个实施方式中，多个双官能系链包含低分子量系链和高分子量系链的混合物，其中低分子量系链的分子量为300至5000Da，并且高分子量系链的分子量为5000至100,000Da。低分子量系链与高分子量系链的比率可以为0:20wt/wt至20:0wt/wt。有利地，与单独的低分子量系链相比，使用低分子量系链与高分子量系链的混合物可以通过允许更多的结合位点包裹囊泡周围而改善多价结合(例如，参见图1)。
捕获表面包括附接至表面的多个聚合物刷分子，其中该多个聚合物刷分子的分子量低于双官能系链，并且其中聚合物刷分子减少与表面的非特异性结合。示例性的聚合物刷分子包括分子量为300至5000Da，特别是2000Da的甲氧基聚乙二醇，只要聚合物刷分子的分子量低于低分子量系链即可。
第二多个纳米颗粒附接至多个双官能系链的至少一部分的第二官能团。第二多个纳米颗粒可以共价地或非共价地连接，特别是共价连接。第一和第二多个纳米颗粒可以相同或不同。
与第二多个纳米颗粒的至少一部分附接的是用于待捕获的癌症生物标志物的捕获剂。该捕获剂可以共价地或非共价地连接，特别是共价连接。示例性的捕获剂包括抗体、部分还原的抗体、抗体片段、重组蛋白、肽、适体、小分子或包含至少一种前述物质的组合。
术语“抗体”包括(i)完整抗体(例如，单克隆抗体或多克隆抗体)，(ii)使用还原剂处理以裂解连接抗体两半的至少部分二硫键的部分还原的抗体，(iii)半抗体，每个都有一个结合域，(iv)其抗原结合部分，包括例如Fab片段、Fab'片段、(Fab′)2片段、Fv片段、单链抗体结合位点、sFv，(v)双特异性抗体及其抗原结合部分，和(vi)多特异性抗体及其抗原结合部分。
示例性的抗体包括曲妥珠单抗
Figure BDA0002547804570000121
贝伐单抗
Figure BDA0002547804570000122
抗CD33抗体
Figure BDA0002547804570000123
抗CD20抗体(
Figure BDA0002547804570000124
和
Figure BDA0002547804570000125
)以及它们的片段和工程化形式(例如双抗体、avimer等)。
在一个实施方式中，捕获剂特异性结合外来体表面标志物。示例性的外来体表面标志物包括CD63、CD81、CD9或包含前述中至少一种的组合。
在一个实施方式中，捕获剂特异性结合上皮癌来源的外来体的外来体表面标志物，诸如EpCAM、EGFR、HER2、钙粘蛋白11、PDL1或包含前述中至少一种的组合。上皮细胞粘附分子(EpCAM)经常被各种癌过表达，诸如肺、大肠、乳腺、前列腺、头颈和肝起源的癌，但其在血液细胞中是不存在的。抗EpCAM抗体可从多种来源商购获得，包括例如R&D Systems、Abcam和Millipore。替代地，可用于实施本公开的方法或产生本公开的装置的抗EpCAM抗体可以通过本领域已知的任何方法产生。
在另一个实施方式中，外来体表面标志物包含前列腺癌标志物PSA或黑色素瘤标志物CD146。
例如，捕获剂可以表面固定在捕获剂的图案和混合物中。图案化的载玻片可以根据外来体的表面标志物分别捕获和固定来自不同来源的外来体。图案化的表面根据外来体的表面标志物分别捕获和固定来自不同来源的外来体。例如，可以从间充质来源的外来体中分离出上皮来源的外来体并且分别进行定量和采样。此表面可以在单个载玻片上测定多种疾病状态。可以使用物理掩模、压印、喷墨印刷、微阵列点样和其它方法，通过图案化聚合物层或捕获抗体，来制作图案化的载玻片。可以使用软光刻法来制作图案化的载玻片。例如，可以使用PDMS垫片掩盖玻璃的无图案区域并限定单独的捕获域。可以使用不同的捕获剂混合物处理每个捕获域。可以剥去硅酮垫片并且使用聚合物刷处理整个表面。
在另一个实施方式中，多种捕获剂可以在彼此混合后固定在表面上，从而形成没有图案的表面。
本文还包括包含本文所述的囊泡捕获表面的装置，例如微流体装置。示例性的微流体装置可以包括含囊泡捕获表面的通道。该通道可以具有任何合适的截面形状。例如，通道可以是矩形、三角形、圆形或椭圆形。通道的高度可以为约50μm至约600μm、约100μm至约500μm、约200μm至约400μm。其它适合的高度包括例如约50、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550或600μm。通道的宽度可以为约200μm至约2000μm、约400μm至约1500μm、约500μm至约1000μm或约600μm至约800μm。其它适合的宽度包括例如约200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1500、1600、1700、1800、1900或2000μm。通道的长度可以为约200μm至约5000μm、约400μm至约4000μm、约600μm至约2000μm或约800μm至约1000μm。其它适合的长度包括例如约200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500或5000μm。
一种从液体活检样品中捕获癌症生物标志物(例如癌症囊泡)的方法，包括使液体活检样品与癌症生物标志物捕获表面接触，囊泡捕获表面包括：
多个双官能系链，其中双官能系链的第一官能团附接至基材，或任选地双官能系链的第一官能度附接至与基材共价连接的至少一部分第一多个纳米颗粒，
第二多个纳米颗粒，其附接至多个双官能系链的至少一部分的第二官能团，
附接至第二多个纳米颗粒的至少一部分的捕获剂，和
附接至表面的多个聚合物刷分子，其中聚合物刷分子的分子量低于双官能系链，并且其中聚合物刷分子减少与表面的非特异性结合。
在一个实施方式中，液体活检样品是血浆样品。含CTC的血沉棕黄层样品必须在一天内进行分析。有利地，血浆样品可以长期保存，以允许对同一样品进行多轮分析。
液体活检样品与囊泡捕获表面的接触可以通过本领域已知的方法在静态条件或流动条件下进行。流动条件包括微流体和微流体流动条件。在流动条件下，囊泡捕获表面可以是包含流动室和/或注射器过滤器的装置的一部分。
一旦在表面上捕获了癌症生物标记物(诸如癌症囊泡，例如外来体)，就可以用温和的洗涤剂洗涤来释放出内容物并进行分析。囊泡的分析可包括通过本领域已知方法的RNA序列分析。例如，可以裂解囊泡，并提取RNA进行RT-PCR分析。
确定样品中基因的mRNA水平的方法是本领域众所周知的。例如，在一些实施方式中，可以通过聚合酶链反应(PCR)、qPCR、qRT-PCR、RNA-seq、微阵列分析、SAGE、MassARRAY技术、下一代测序或FISH来确定mRNA水平。
替代地，可以使用免疫细胞化学和其它荧光成像技术来分析捕获表面上的或从捕获表面释放的捕获外来体。在另一个实施方式中，通过巯基化学附接至镀金棱镜玻璃表面的系链与高灵敏度的等离子共振检测兼容，这种检测越来越多地被用作外来体检测的无标记方法。
例如，RNA序列分析的结果可用于指导受试者的治疗。例如，本文所述的方法可用于监测疾病进展。这种监测可以在通过外科手术或疗法治疗癌症之前、期间或之后进行。因此，在一个方面，本方法包括监测受试者的癌症进展。连续测量可以评估癌症是否恶化或恶化的程度，因此，例如允许针对治疗干预是否必要或可取做出更合理的决定。
监测还可以例如在认为有患癌症风险的个体中进行，以便获得早期且理想的临床前癌症指征。如此，该方法可以在“健康”的患者(受试者)或至少没有表现癌症的任何临床症状的患者(受试者)上进行，例如，患有非常早期或临床前阶段癌症的患者，例如原发肿瘤非常小从而无法评估或检测到的患者，或者细胞正在经历与癌症相关的癌前变化但尚未恶变的患者。
本方法提供了对受试者对疗法的响应的预测。在此类方法中，可以通过了解一种或多种基因的表达产物(或相关代谢物)在样品中的水平来指导疗法的选择。
本方法还包括一种确定(或监测)用于治疗癌症的治疗方案的功效的方法。在此类方法中，一种或多种基因的表达产物(或相关代谢物)水平的改变(增加或减少)指示了所用治疗方案的功效。
本方法还包括一种用于检测癌症复发的方法。
通过以下非限制性实施例进一步说明本发明。
实施例
方法
材料：第7代(G7)PAMAM树状物获自Dendritech(Midland,MI)，且所有的聚乙二醇(PEG)均获自JenKem(Plano,TX)。环氧官能化的玻璃表面为获自Tekdon(Myakka City,FL)的标准显微镜载玻片的形式，或处于获自Arrayit(Sunnyvale,CA)的96孔板中。玻璃纤维预过滤器购自Millipore(Cork,Ireland)。
所有捕获抗体和重组EpCAM均获自R&D Systems(Minneapolis,MN)，而ELISA二级检测酶和底物获自Santa Cruz Biotechnology(Dallas,TX)。用于成像的尖锐氮化硅探针(SNL)和用于力光谱学的镀金氮化硅探针(NPG)获自Bruker Probes(Camarillo,CA)。二辛可宁酸(BCA)蛋白质测定和
Figure BDA0002547804570000161
高灵敏度RNA测定获自Thermo Fisher Scientific(Waltham,MA)。SMCC交联剂由CalBioChem(San Diego,CA)供应，并且所有其它试剂由SigmaAldrich(St.Louis,MO)供应。
纳米颗粒羧基化：通过使1mg G7 PAMAM树状物与2ml二甲基亚砜(DMSO)中0.308mg琥珀酸酐反应过夜以将该G7 PAMAM树状物部分羧基化(图2a)，然后在双重蒸馏水中使用10,000分子量截留离心过滤器(Amicon)进行纯化并且冻干。通过NMR光谱证实羧基化程度在60至70％之间。首字母缩略词“G7”是指这些部分羧基化的纳米颗粒。
表面制备：清洁玻璃纤维预过滤器并且在95vol.％乙醇和0.1vol.％乙酸中的2vol.％(3-缩水甘油氧基丙基)三甲氧基硅烷中处理90分钟，用乙醇冲洗，然后在120℃烘烤过夜以引入环氧基。在环氧官能化的玻璃底、黑壁96孔板(Arrayit)或载玻片(Tekdon)上创建所有其它表面。为了限制载玻片的表面处理，用聚二甲基硅氧烷浇铸了硅酮垫片，并使用10mm活检打孔机打孔。
对于G7-PEG-G7表面(图2c)，使用处于1.5M磷酸钾,pH 11中的0.1mg/ml G7将环氧官能化玻璃处理过夜。然后冲洗表面并且使用处于具有150mM氯化钠的100mM 2-(N-吗啉代)乙磺酸缓冲液(MES),pH 5中的15mM 1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)和25mM N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化1小时，之后使用0.5mg/ml PEG处理2小时。除非另有说明，否则PEG溶液由处于具有150mM氯化钠的50mM 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙烷磺酸缓冲液(HBSS),pH 8中的0.48mg/ml 2000Da甲氧基-PEG-胺、0.01mg/ml 5000Da羧基-PEG-胺和0.01mg/ml 20,000Da羧基-PEG-胺组成。类似地制备其它表面，将初始聚合物混合物加入1.5M磷酸钾中以促进玻璃表面上的沉淀。注意在比较SMCC结合的抗体的实验中，使用胺-PEG-胺系链替代羧基-PEG胺。所有表面均使用含有0.1vol.％
Figure BDA0002547804570000171
20的Tris缓冲盐水(TBST)冲洗，以阻断疏水口袋和未反应的环氧基团。
珠粒结合测定：在初步实验中，通过与蛋白涂覆的珠粒温育，比较微孔板中制备的各表面的结合能力，以确定最低充足PEG系链浓度。使用0.5mg ml-1 0至20vol.％的5000MW羧基-PEG-胺和20,000MW羧基-PEG-胺且余量由2,000MW甲氧基-PEG-胺构成的混合物制备表面。根据下述方法，使用抗EpCAM将-PEG-PAMAM表面官能化。使用EDC和NHS将经过羧基官能化的黄绿色荧光0.2μm聚苯乙烯珠粒(Thermo Fisher
Figure BDA0002547804570000172
)活化30分钟，在16,000x g下离心30分钟，并且重悬于1μg ml-1重组EpCAM-Fc中过夜。通过另一次离心去除未结合的蛋白质，并且将珠粒重新悬浮于处于PBS中的1wt％牛血清白蛋白(BSA,SigmaAldrich)中。
PEG-G7表面的比较显示，在高于2vol.％每系链下，对应于2μM 5000MW、0.5μM 20,000MW和240μM 2000MW甲氧基PEG，捕获效率无差异(图3a)。珠粒测定进一步证实，与PEG-G7相比，在G7-PEG-G7表面的吸附速率更高(图3b)。
接触角测量：使用静滴法(sessile drop method)，使用具有SCA 20软件的Dataphysics OCA 15Plus设备(Filderstadt,Germany)记录经修饰的载玻片上的前进和后退接触角。使用1μl s-1喷出的8μl双重蒸馏水(DDI)液滴采集测量。
使用静滴接触角技术来定量各制备的表面的相对亲水性并验证聚合物的结合。接触角是指液滴喷出后(前进，图5a)和液滴大部分缩回之后(后退，图5b)，液滴-空气和液滴-表面界面之间的角度。测量用于验证与DDI水相比，高盐缓冲液中mPEG的增强结合(图5c,d)。图5e显示了前进接触角结果，其可补充后退接触角测量结果。
粗糙度测量：使用Asylum InfinityTM Bio系统(Oxford Instruments,SantaBarbara,CA)，用尖锐氮化硅探针(Bruker SNL)从聚合物修饰的载玻片上采集用于粗糙度定量的高度轮廓。以分流(tapping)(AC)模式收集用磷酸盐缓冲盐水(PBS)水合的样品的测量值。将粗糙度量化为500×500nm2图像的Rq值(均方根)。代表性的高度扫描如图6所示。
蛋白质定量测定：和如上ELISA测试一样，使用抗CD63将微孔板官能化并且使用过滤的人血清处理2小时。用PBS冲洗三遍后，通过二辛可宁测定试剂盒(microBCATM,ThermoFisher)在37℃下温育2小时来定量孔中剩余的蛋白质含量。使用BSA标准曲线对蛋白质进行定量。
抗体官能化：评价了两种结合方法：通过NHS将完整抗体附接至聚合物上的羧基，和通过SMCC将部分还原的抗体附接至聚合物上的胺基。对于完整抗体，将表面与MES缓冲液中的15mM EDC和25mM NHS一起温育30分钟，然后与HBSS(汉克盐)中的捕获抗体在室温下温育4小时或在4℃下温育过夜。在37℃下，在补充有5mM乙二胺四乙酸(EDTA)的PBS中，使用3mg ml-1半胱胺HCl将部分还原的抗体处理30分钟，然后使用离心过滤和3000MWCO过滤器(Amicon)进行纯化。将表面在具有EDTA的PBS中的0.5mg ml-1水溶性SMCC下温育30分钟，然后冲洗并添加抗体。抗体温育为10μg ml-1。图8总结了这两个程序。
抗体密度定量：将人免疫球蛋白G(IgG，Sigma-Aldrich)以10mg/ml溶解于HBSS。将AlexaFluorTM405-NHS(Thermo Fisher)以1mg/ml溶解于DMSO，并且每次10μl添加至IgG混合物中至最终摩尔比为4:1。将混合物在4℃下温育过夜，然后稀释于PBS中，离心过滤分离(10,000MWCO,Amicon)，并重悬于含5mM EDTA的PBS中。用半胱胺还原标记的IgG，并且如上所述结合至官能化的微孔板。使用SynergyTM酶标仪(Biotek)对400nm激发、430nm发射的荧光信号进行定量，并且归一化为未结合蛋白质的标准曲线。假设分子量为150kDa且每个未还原的分子具有两个官能性结合位点，计算结合位点密度。由于胺反应性荧光团阻断了反应性基团，因此无法量化图S5a中完整抗体的结合密度。
ELISA测定：通过0.22μm聚醚砜膜(EMD Millipore)真空过滤人血清(Sigma-Aldrich)，并且在温和搅拌下在用抗CD63官能化的微孔板中(R&D Systems MAB5048)以200μl/孔温育2小时。冲洗微孔板，并在4℃下于4％多聚甲醛中固定过夜。使用1wt％BSA将板封闭，用TBST冲洗，并且在以1:200稀释于PBS中的小鼠抗人CD81(Santa Cruz 166028)下温育90分钟。然后将板在辣根过氧化物酶结合的山羊抗小鼠(Santa Cruz 2031)下温育90分钟，冲洗，并且在100mM磷酸氢二钠和50mM柠檬酸盐缓冲液,pH 5中，使用1.6mg/ml邻苯二胺(Santa Cruz)和1.6vol.％浓过氧化氢(Aqua Solutions)显影15分钟。用酶标仪量化492nm处的吸光度。
为了使用珠粒建立充足PEG系链浓度来补充初步研究，还进行了附加ELISA测定，将2vol.％的PEG系链与10x正文中报道的量进行比较。与珠粒结合测定一致，不存在由于系链浓度引起的差异(数据未示出)。
外来体培养、分离和Western印迹：在补充有10vol.％胎牛血清(Corning)和1vol.％青霉素-链霉素(Corning)的L15培养基(Corning,Tewksbury,MA)中，扩增人类转移性乳腺癌系MDA-MB-231(ATCC,Manassas,VA)。使用0.25％胰蛋白酶-EDTA(Corning)将细胞传代，并且以50-80％的汇合度接种在T-175烧瓶中至少24小时，然后添加含有1wt％BSA的无血清培养基。3天后除去条件培养基，并以300x g离心，然后12,000x g离心以清除细胞和其它大碎片。使所得上清液通过0.2μm膜滤器，浓缩至原始体积的1/3，然后使用BeckmanType 45Ti转子以120,000x g超速离心。使用PBS洗涤收集的球团(团块，pellet)并且再次离心，然后重悬于PBS中以在-80℃下储存。通过BCA测定外来体浓度。
使用Western印迹验证外来体中是否存在EGFR和HER2。通过与等体积含有蛋白酶抑制剂(Protease Inhibitor Cocktail II,Sigma-Aldrich)的2x放射免疫沉淀测定缓冲液(150mM NaCl,1％NP-40,1％脱氧胆酸钠,0.1％SDS,50mM Tris-HCl,2mM EDTA,pH 7.5)混合，将外来体裂解。通过SDS-PAGE从裂解的外来体中分离出15μg总蛋白质，并且转移至PVDF膜。使用用于EGFR(R&D Systems)、HER2(R&D Systems)、EpCAM(R&D Systems)、CD63(R&D Systems)、CD81(Santa Cruz)和CD9(Santa Cruz)的抗体处理外来体裂解物。将从另一乳腺癌细胞系MCF-7(ATCC)分离的外来体用作验证。
RNA测定：使用标称浓度为5μgml-1的还原抗体将微孔板官能化：抗CD63(R&DSystems MAB5048)，或抗EGFR(R&D Systems AF231)与抗HER2(R&D Systems AF1129)的混合物。将培养的外来体重悬于L15培养基中，浓度为20μg/ml(通过microBCA分析测定)，并在平板上于4℃下温育过夜。使用
Figure BDA0002547804570000201
高灵敏度RNA测定试剂盒(Thermo Fisher)和酶标仪在630nm激发、680nm发射下定量总的RNA。
AFM力光谱学：使用5μg/ml靶向EpCAM的抗体(R&D Systems MAB960)，在环氧官能化的载玻片上制备捕获表面。使用处于DDI水中的0.1mg/ml 7500MW羧基-PEG-硫醇(JenKem)和1.9mg/ml 5000MW甲氧基-PEG-硫醇(JenKem)将单个镀金氮化硅探针(BrukerNPG)处理1小时。表面由-mPEG对照、具有部分还原的抗体的-PEG、非官能化的-PAMAM-PEG-PAMAM和用部分还原的抗体官能化的-PAMAM-PEG-PAMAM-Ab组成。用EDC和NHS激活探针，然后以5μg ml-1添加重组人EpCAM(R&D Systems 960-EP)，在4℃下过夜。通过在刚性对照表面上压痕来确定光杆灵敏度，并通过热噪声法来确定弹簧常数。确定弹簧常数为6.85pN nm-1。图11显示了用于检测与AFM多价解结合的概念图。
使用Asylum InfinityTM Bio系统(Oxford Instruments)用浸没在PBS中的探针和样品进行实验。将每个表面固定在5个离散位置，并在每个位置收集15条力曲线。力曲线由以500nm/s的1μm走进、悬臂与表面轻轻接触停留5s(0.2V设定点)和500nm/s的缩回速度组成。在2kHz下进行数据采集。
使用R中的自定义脚本利用“IgorR”和“Shiny”软件包计算破裂事件的数量、距离和幅度，以及从表面分离探针所需的功。将数据校准为虚拟挠度，并且使用虚拟挠度拟合和与接触区域的线拟合将接触点设定为(0,0)。破裂事件定义为挠度大于5x远离表面的挠度RMS的突然变化。功定义为零挠度(即粘合区域)之下探针分离(z–挠度)曲线的面积。
统计分析：假定p<.05为具有显著性，使用R软件通过Tukey事后均值检验通过单向或双向方差分析比较所有测定。由于数据不符合正态分布，使用非参数Kruskal-Wallace检验比较力光谱学结果。使用R软件包“PMCMR”中的Nemenyi事后检验进行成对比较。所有图表均在R中使用“ggplot2”软件包创建。
实施例1：捕获表面的制备
用于捕获外来体的捕获表面包括涂覆有部分羧基化的第7代(G7)聚(酰胺基胺)树枝状聚合物纳米颗粒的环氧官能化玻璃。使用异双官能聚乙二醇系链(PEG)与较短的甲氧基-PEG的混合物将G7层官能化，以最小化非特异性相互作用。然后使用G7将PET系链封端(图2)。使用200nm官能化的聚苯乙烯珠粒进行的初步实验表明，0.5μM 20,000MW羧基-PEG-胺、2μM 5,000MW羧基-PEG-胺和240μM 2,000MW甲氧基-PEG-胺(按质量浓度1:1:48)的混合物产生了足够的捕获率(图3)。在先前的工作中，证明与仅使用PEG的对照(-PEG)相比，与PEG-系链的聚(酰胺基胺)(本文中称为PEG-G7)结合的抗体能更有效地捕获循环肿瘤细胞。在这项工作中，将预涂覆有聚酰胺基胺的表面称为G7-PEG-G7。
通过接触角测量和原子力显微镜(AFM)成像证明了成功的表面官能化。这些测量显示，与PEG-G7表面相比，G7-PEG-G7表面的物理性质存在明显差异。使用静滴技术采集的超纯水的后退接触角显示：i)所有聚合物表面均比基础玻璃基材更亲水(p<.01)；ii)含有G7 PAMAM树状物的表面比仅使用PEG的表面更亲水(p<.01)；和iii)具有树状物底层的表面甚至比不具有树状物作为第一层的表面更亲水(p<.01，图4a，图5)。图4b显示了具有纳米级特征的G7-PEG-G7表面的形貌。使用标称半径为2nm的氮化硅悬臂从水合样品的AFM图像(500nm x 500nm扫描)计算了表面粗糙度(Rq)。预涂有树状物的表面的粗糙度显著大于mPEG和PEG表面(约2.5相对于约1nm，p<.05，图4c，图6)。注意到PEG系链的轮廓长度显著长于报告的粗糙度–20kDa系链超过150nm–并由此与面轮廓测量结果所指示的相比，其应能够在表面上将捕获抗体伸展的更高。AFM无法解析此种柔性特性。相反，所测量的粗糙度值可能反映了下方玻璃或G7涂覆的玻璃基材的形貌，并且与先前报道的表面吸附PAMAM树状物的尺寸一致。尽管如此，两组表面测量结果表明，通过依次添加聚合物层成功修饰了表面。
实施例2：外来体捕获
首先使用外来体大小的珠粒筛选各聚合物表面构型。使用重组上皮细胞粘附分子(EpCAM,R&D Systems)涂覆标称直径为200nm的聚苯乙烯珠粒(Thermo FisherFluoSphereTM)，所述重组上皮细胞粘附分子是循环肿瘤物质通常靶向的表面抗原。使用针对EpCAM的抗体(aEpCAM,R&D Systems)将具有各种G7树状物和PEG构型的捕获表面官能化。图7a示出的我们的结果表明，与只有单层树状物的那些表面(PEG-G7)相比，如通过增加的荧光强度所测量的，具有两层树状物的表面(G7-PEG-G7)上的捕获效率显著更高。当在具有较短PEG(5kDa)的表面上添加2％的系链、较长的PEG(20kDa)时，这种增强最为明显，这表明与我们先前使用胶束的观察结果一致。系链PEG含量的增加(5-20％)并未导致捕获效率的进一步增强。
为了测试从健康人血清中捕获纳米级囊泡，我们将表面官能化为针对CD-63，CD-63是外来体特有的共同靶向的表面标志物，并且使用经过滤的人血清(Sigma Aldrich)温育所述捕获表面。如图7b所示，二辛可宁酸测定(Thermo Fisher BCA测定试剂盒)显示1.71μg cm-2(标准偏差0.55)蛋白质吸附在aCD63-官能化的G7-PEG-G7表面上，该量为mPEG表面的2.5倍并且高于aCD63-官能化的PEG(p<.01)且为PEG-G7捕获表面的1.7倍(p＝.02)。所吸附的蛋白质为mPEG对照的4.5倍(p<.01)且为非官能化的G7-PEG-G7的9.7倍(p<.01)。在无血清的情况下，抗体涂层本身低于测定的灵敏度极限，并在统计学上类似于mPEG对照(p＝0.89)。这些结果表明，两层树状物的表面涂层对人血清中的珠粒和外来体均表现出最高的捕获效率。
我们进一步假设，通过用部分还原的抗体涂覆G7-PEG-G7表面，可以增加外来体捕获(图8)。在这一构型中，通过铰链区中的巯基将盐酸半胱胺还原的抗体结合到用4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺基琥珀酰亚胺基酯(SMCC)活化的表面。使用与我们之前的工作一致的方法将完整抗体共价连接。简言之，使用1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化PEG-或G7 PAMAM树状物-涂覆的表面，然后通过与赖氨酸残基结合而与目标捕获抗体发生反应，产生随机结合。与完整抗体相比，还原的抗体可能具有更一致的方向，并且它们的较小尺寸可促进更大的构象柔性，从而形成多价附接。在本文中，使用人血清评估了用完整和还原的aCD63官能化的表面。在这一测试中，我们使用酶联吸光度测定(ELISA)以定量比较表面构型。ELISA测定比上述的BCA测定更灵敏。此外，因为我们靶向了第二外来体特异性四跨膜蛋白(CD81)，因此该测试提供了官能性外来体捕获的进一步确认。结果显示出还原的抗体的显著益处(图7c)，其为使用完整抗体的G7-PEG-G7表面的1.7倍增长(p<.01)。最后，为了确认还原的抗体可以以足够的密度固定在表面上以介导多价结合作用，使用荧光标记的抗体来测量表面覆盖率。使用胺反应性荧光团(Thermo Fisher AlexaFluor405-NHS)标记用作模型抗体的人免疫球蛋白G(IgG)，部分还原，并且通过SMCC结合至G7-PEG-G7捕获表面。荧光信号显示涂层密度为177±78ng cm-2。该密度对应于在100nm x 100nm正方形内具有约140个结合位点。
随后，我们试图证明G7-PEG-G7表面使用各种表面标志物分离外来体的能力，并且试图表明可以从表面分离出RNA。通过外来体特异性跨膜蛋白(CD81)以及通过转移性乳腺癌细胞过表达的表面标志物(表皮生长因子受体(EGFR)和人类表皮生长因子受体2(HER2))的混合物，我们评估了表面是否可以有效捕获癌细胞产生的外来体。Western印迹证实，在从培养的MDA-MB-231细胞中收集的外来体中，存在EGFR和HER2(图9)以及外来体标志物CD81(图10)。与许多肿瘤来源的细胞(诸如MCF-7)不同，MDA-MB-231细胞不高水平表达EpCAM(图9)。未靶向CD63，因为Western印迹显示，该四跨膜蛋白在这些培养物来源的囊泡中的表达率低于CD81。通过超速离心23从条件培养基中分离外来体，重悬至20μg/ml蛋白(根据BCA测定)，并且在捕获表面上在4℃下温育过夜。使用还原的aCD81以及癌症表面标志物的混合物官能化的表面分别捕获了25.9和21.6pg cm-2RNA(图3d)，两种表面之间无统计学差异(p＝.92)。
最后，为了展示通过增加捕获表面积捕获的RNA的量足以用于下游分析，使用优化的捕获表面以及还原的aCD63和aCD81的混合物将玻璃纤维过滤器(Millipore 25mm直径，标称孔径1.2μm)官能化。与上述平坦玻璃表面相比，过滤器内较大的表面积可实现更高的外来体捕获能力。在搅拌下，将滤膜与用1mL PBS稀释的1mL人血浆温育1小时。每个过滤器中捕获了平均9.77ng RNA(标准偏差2.04)，捕获效率与高效微流技术相当，并且比超速离心的效率高一个数量级。
为了机械理解所观察到的表面捕获行为，随后我们采用AFM力光谱学来表征由G7-PEG-G7表面导致的高捕获率的分子机制。这项技术足够灵敏，足以检测抗体-抗原解结合的力，并且已经用于解析配体-官能化树状物与固定蛋白质之间的多价解结合。通过羧基-PEG-巯基系链附接，使用重组EpCAM将镀金的氮化硅探针官能化。该探针的标称直径为60nm，且实验确定的弹簧常数为6.52pN nm-1(Bruker Probes NPG-D)。在Asylum MFP-3DInfinityTM Bio系统(Oxford Instruments)上进行力光谱学测定。以500nm s-1的接近和收回速度，使官能化的探针与各表面接触5s。从每个表面在五个独立的位置收集总共75条力曲线，并使用定制脚本代码完成了分析。代表性的力曲线如图12a-c所示。
与所有其它表面相比，在具有aEpCAM的G7-PEG-G7上(记为G7-PEG-G7-Ab)，将官能化的AFM探针从捕获表面拉出所需的能量显著更高(p<.01,图12d)，中值为1,980pN nm(平均值为2,500,标准偏差为2,540)。具有aEpCAM的PEG表面(PEG-Ab)所需的能量显著大于不具有aEpCAM的PEG(p<.01)并且略低于非官能化的G7-PEG-G7(p＝.06)。官能化的PEG表面需要中值710pN nm(平均值为1,510,标准偏差为2,140)来分离探针，相比之下，非官能化的PEG和G7-PEG-G7对照的中值分别为240pN nm和390pN nm。
与非官能化的PEG相比，我们在非官能化的G7-PEG-G7表面上观察到显著更大的结合能(p＝.05,图12d)，尽管两个表面均不含可以高特异性与探针上EpCAM结合的抗体。大多数这种粘合能紧邻接触点，表明了聚合物涂层之间通过形成二次分子间作用力的相互作用(图13，14a、b)。相反，具有aEpCAM的两个表面在破裂前均表现出高柔性接头的特征性应变行为(图13，14c、d)。基于这些观察，我们保守地将非特异性功定义为在接触点的12nm内做出的，等于较短的5kDa系链的Flory半径的两倍。在G7-PEG-G7表面上将探针提升到12nm所需的功类似于PEG-Ab(p＝.96)并且接近G7-PEG-G7-Ab(p＝.03,图15a)。相比之下，高于12nm，PEG-Ab表面显示出比G7-PEG-G7显著更高的粘合能(p<.01,图14b)。先前在AFM实验中已经报道了树状物和蛋白质之间类似“非特异性”相互作用，并且其归因于范德华力和静电相互作用。我们得出的结论是，此处观察到的非特异性粘附是由于G7-PEG-G7表面上的聚合物链和树状物的高表面密度引起的。
当多种抗体能够与分析物相互作用时，由于多价结合显著降低了解离速率，因此增强了免疫亲和捕获方法的灵敏度和选择性。超支化树状物通过两种方式促进多价捕获：高密度的官能团允许将多种抗体结合到每个直径约9nm的纳米颗粒，和支化的结构允许结合结构域的理想取向所需的构象柔性。为了量化纳米级的多价结合效应，我们对突然破裂的数目进行了计数，其为力学谱中抗体-抗原解结合事件的特征。这些事件定义为大于远离表面挠度信号的均方根的5倍的挠度突然变化，幅度约为8pN。与所有其它表面相比，抗体官能化的G7-PEG-G7-Ab表面上，每次回缩此类破裂事件的数目显著更大(p<.01,图16)。这些捕获表面表现出每曲线的破裂事件中值为2.9±1.8次，与此相比，PEG-Ab为1.6±1.5。破裂事件的幅度范围为8至370pN(均值为39pN)，在整个捕获表面上，幅度没有统计学差异(图15c)。其他人报告了约60pN的抗体-抗原破裂力。G7-PEG-G7-Ab上的破裂距离也显著大于对照组(p<.01)，表明了聚合物延伸后的特异性抗体解结合(图15d)。AFM结果表明，G7-PEG-G7-Ab捕获表面的性能可归因于形成多价抗体相互作用的能力，并且由于树状物涂层的非特异性粘附而得以增强。
由于囊泡尺寸极小，因此难以对外来体进行多价免疫捕获。此处，我们报告了对设计用于从微米级至纳米的多价免疫捕获的表面重新工程化的三个重大发现。第一，与下方的玻璃相比，G7 PAMAM树状物的初始涂层产生了具有纳米级特征的更水合的表面，和更多潜在数量的用于PEG附接的官能位点。第二，与单独的5kDa系链相比，添加更长的20kDa系链改善了结合位点的柔性。最后，通过SMCC结合至G7树状物的部分还原的抗体性能优于通过NHS结合的完整抗体。这三个因素都有助于我们在本文中报告的高灵敏度和特异性外来体捕获。
不受理论的束缚，相比于我们先前描述的细胞捕获表面，本文所述的外来体捕获表面表现出三个显著差异，这些差异可改善纳米级的多价结合。与下方的玻璃相比，预涂覆的聚酰胺基胺树状物产生了具有纳米级特征的更水合的表面以及更多潜在数量的官能位点。第二，与单独的5,000MW系链相比，添加更长的20,000MW系链改善了结合位点柔性。最后，通过SMCC结合至PAMAM的部分还原的抗体的性能优于通过NHS结合的完整抗体。与完整抗体相比，较小的半抗体可能具有更大的构象柔性，并且正交化学避免了相邻纳米颗粒彼此交联的可能性。
基于外来体材料的液体活检的发展需要能够以高特异性和高效率分离肿瘤来源的外来体的新技术。本文描述的聚酰胺基胺树状物-涂覆的表面通过多价结合增强了纳米级外来体的免疫亲和捕获。蛋白质、ELISA和RNA测定展示了相比于线性PEG对照的增强捕获。使用AFM力光谱学展示了增强的多价结合。该结果证实了先前的结果，表明通过树状物的多价结合增强了对癌细胞的捕获并且确认该效果可以被扩展至纳米级。
使用的术语“一”和“一种”和“该/所述”和类似指称对象(特别是在所附权利要求书的上下文中)应解释为涵盖单数和复数，除非本文另有说明或与上下文明显矛盾。如本文所使用的术语第一、第二等并不意味着表示任何特定的顺序，而只是为了方便表示多个例如层。术语“包含”、“具有”、“包括”和“含有”应被解释为开放性术语(即意指“包括但不限于”)，除非另有说明。除非本文另有说明，描述的数值范围仅旨在用作分别引用落在该范围内的每个单独值的简捷方法，并且每个单独的值都如同在本文中被单独叙述一样包含在本说明书中。所有范围的端点都包含在该范围内，并且可以独立组合。除非本文另有说明或与上下文明显矛盾，否则本文所述的所有方法均可以适当的顺序执行。除非另外声明，否则使用的任何和所有实施例或示例性语言(例如“诸如”)仅是为了更好地描述本发明并且不构成对本发明范围的限制。说明书中的任何语言都不应被解释为表明任何未要求保护的要素对于本文所用发明的实施必不可少。
尽管已经参照示例性实施例描述了本发明，但是本领域技术人员可以理解的是，在不脱离本发明的范围的情况下，可以进行各种改变并且可以用等同物代替其要素。此外，在不脱离本发明的实质范围的情况下，可以做出许多修改以使特定情形或材料适应本发明的教导。因此，意图是本发明不限于作为预期用于实现本发明的最佳模式而公开的特定实施方式，而是本发明可包括落入所附权利要求范围内的所有实施方式。除非本文另有说明或与上下文明显矛盾，本发明包括上述要素以其所有可能变化的任何组合。

Claims (33)

1.一种癌症生物标志物捕获表面，包括：
基材，
附着至所述基材的第一多个纳米颗粒，
多个双官能系链，其中所述双官能系链的第一官能团附接至所述第一多个纳米颗粒的至少一部分，
第二多个纳米颗粒，附接至所述多个双官能系链的至少一部分的第二官能团，
附接至所述第二多个纳米颗粒的至少一部分的捕获剂，和
附接至所述表面的多个聚合物刷分子，其中所述聚合物刷分子的分子量低于所述双官能系链，并且其中所述聚合物刷分子减少与所述表面的非特异性结合。
2.根据权利要求1所述的癌症生物标志物捕获表面，其中所述癌症生物标志物是囊泡、细胞、蛋白质或核酸。
3.根据权利要求2所述的癌症生物标志物捕获表面，其中所述癌症生物标志物是囊泡。
4.根据权利要求1至3中任一项或多项所述的癌症生物标志物捕获表面，其中所述多个双官能系链包含低分子量系链和高分子量系链的混合物，其中所述低分子量系链的分子量为300至5000Da，并且所述高分子量系链的分子量为5000至100,000Da，其中低分子量系链与高分子量系链的比率为0:20至20:0wt/wt。
5.根据权利要求1至4中任一项或多项所述的癌症生物标志物捕获表面，其中所述第一多个纳米颗粒和第二多个纳米颗粒均包含相同或不同的树枝状聚合物。
6.根据权利要求5所述的癌症生物标志物捕获表面，其中所述树枝状聚合物包含树状物、树枝状星形支化聚合物、树枝状超支化聚合物、致密树枝状星形支化聚合物、超梳状支化的树枝状聚合物或包含前述中至少一种的组合。
7.根据权利要求1至6中任一项或多项所述的癌症生物标志物捕获表面，其中所述第一多个纳米颗粒和所述第二多个纳米颗粒包含相同或不同的聚(酰胺基胺)树状物(PAMAM树状物)。
8.根据权利要求7所述的癌症生物标志物捕获表面，其中所述聚(酰胺基胺)树状物包含第3代PAMAM树状物、第4代PAMAM树状物、第5代PAMAM树状物、第6代PAMAM树状物、第7代PAMAM树状物、第8代PAMAM树状物、第9代PAMAM树状物或包含前述中至少一种的组合。
9.根据权利要求1至8中任一项或多项所述的癌症生物标志物捕获表面，其中所述捕获剂包含抗体、部分还原的抗体、抗体片段、重组蛋白、肽、适体、小分子或包含前述中至少一种的组合。
10.根据权利要求1至9中任一项或多项所述的癌症生物标志物捕获表面，其中所述癌症生物标志物是癌症囊泡且所述捕获剂特异性结合外来体表面标志物。
11.根据权利要求10所述的癌症生物标志物捕获表面，其中所述外来体表面标志物包含CD63、CD81、CD9或包含前述中至少一种的组合。
12.根据权利要求10所述的癌症生物标志物捕获表面，其中所述外来体表面标志物包含上皮癌来源的外来体的表面标志物，并且是EpCAM、EGFR、HER2、钙粘蛋白11、PDL1或包含前述中至少一种的组合。
13.根据权利要求10所述的癌症生物标志物捕获表面，其中所述外来体表面标志物包含前列腺癌标志物PSA或黑素瘤标志物CD146。
14.一种包含权利要求1至13中任一项或多项所述的囊泡捕获表面的装置。
15.一种从液体活检样品中捕获癌症生物标志物的方法，包括：
使所述液体活检样品与癌症生物标志物捕获表面接触，所述癌症生物标志物捕获表面包括：
基材，
多个双官能系链，其中所述双官能系链的第一官能团附接至所述基材，或任选地所述双官能系链的第一官能团附接至至少一部分共价连接于所述基材的第一多个纳米颗粒，
第二多个纳米颗粒，附接至所述多个双官能系链的至少一部分的第二官能团，
附接至所述第二多个纳米颗粒的至少一部分的捕获剂，和附接至所述表面的多个聚合物刷分子，其中所述聚合物刷分子的分子量低于所述双官能系链，并且其中所述聚合物刷分子减少与所述表面的非特异性结合。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述癌症生物标志物是囊泡、细胞、蛋白质或核酸。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述癌症生物标志物是囊泡。
18.根据权利要求15至17中任一项或多项所述的方法，其中所述多个双官能系链包含低分子量系链与高分子量系链的混合物，其中所述低分子量系链的分子量为300至5000Da，并且所述高分子量系链的分子量为500至1000,000Da，其中低分子量系链与高分子量系链的比率为0:20至20:0wt/wt。
19.根据权利要求15至18中任一项或多项所述的方法，其中所述第一多个纳米颗粒和所述第二多个纳米颗粒均包含相同或不同的树枝状聚合物。
20.根据权利要求15至19中任一项或多项所述的方法，其中所述树枝状聚合物包含树状物、树枝状星形支化聚合物、树枝状超支化聚合物、致密树枝状星形支化聚合物、超梳状支化的树枝状聚合物或包含前述中至少一种的组合。
21.根据权利要求15至20中任一项或多项所述的方法，其中所述第一多个纳米颗粒和所述第二多个纳米颗粒包含相同或不同的聚(酰胺基胺)树状物(PAMAM树状物)。
22.根据权利要求21所述的方法，其中所述聚(酰胺基胺)树状物包含第3代PAMAM树状物、第4代PAMAM树状物、第5代PAMAM树状物、第6代PAMAM树状物、第7代PAMAM树状物、第8代PAMAM树状物、第9代PAMAM树状物或包含前述中至少一种的组合。
23.根据权利要求15至22中任一项或多项所述的方法，其中所述捕获剂包含抗体、抗体片段、肽、适体或包含前述中至少一种的组合。
24.根据权利要求15至23中任一项或多项所述的方法，其中所述癌症生物标志物是外来体，并且所述捕获剂特异性结合外来体表面标志物。
25.根据权利要求24所述的方法，其中所述外来体表面标志物包含CD63、CD81、CD9或包含前述中至少一种的组合。
26.根据权利要求24所述的方法，其中所述外来体表面标志物包含上皮癌来源的外来体的表面标志物，并且是EpCAM、EGFR、HER2、钙粘蛋白11、PDL1或包含前述中至少一种的组合。
27.根据权利要求24所述的方法，其中所述外来体表面标志物包含前列腺癌标志物PSA或黑素瘤标志物CD146。
28.根据权利要求15至27中任一项或多项所述的方法，其中所述液体活检样品是血浆样品。
29.根据权利要求16所述的方法，进一步包括分离捕获的囊泡，裂解捕获的囊泡，从裂解的囊泡中分离RNA，并对分离出的RNA的至少一部分进行扩增和测序。
30.根据权利要求15至29中任一项或多项所述的方法，进一步包括通过免疫细胞化学或荧光成像技术分析捕获的癌症生物标志物。
31.根据权利要求13所述的方法，其中在静态条件或流动条件下使液体活检样品与囊泡捕获表面接触。
32.根据权利要求27所述的方法，其中流动条件是在包括流动室的设备中进行的。
33.根据权利要求27所述的方法，其中流动条件是在包含注射器过滤器的设备中进行的。
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