JP2023500602A - ペプチド－ナノ粒子コンジュゲート 〔関連出願の相互参照〕 本出願は、２０１９年１０月２９日に出願されたｐｃｔ／ｕｓ２０１９／０５８４６３の一部継続出願であり、２０１９年１０月２９日に出願された米国仮出願第６２／９２７，２９３号の優先権を主張し、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。 - Google Patents

ペプチド－ナノ粒子コンジュゲート 〔関連出願の相互参照〕 本出願は、２０１９年１０月２９日に出願されたｐｃｔ／ｕｓ２０１９／０５８４６３の一部継続出願であり、２０１９年１０月２９日に出願された米国仮出願第６２／９２７，２９３号の優先権を主張し、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。 Download PDF

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Abstract

本明細書には、複数のβ－ヘアピンペプチドがコンジュゲートされた多価ナノ粒子コアを含むナノ粒子系が記載される。医薬組成物及びナノ粒子系を作製する方法も含まれる。ナノ粒子系を、それを必要とする対象、例えばヒト癌患者に投与することを含む免疫療法方法が更に含まれる。

Description

本開示は、治療用β－ヘアピンペプチドを送達するための組成物及び方法に関する。
標的物質に対するそれらの高い親和性及び選択性のため、抗体は、免疫療法を含む多くの用途のための結合リガンドとしての使用がなされてきた。しかしながら、タンパク質の固有の欠点である低い熱力学的安定性及び高い製造コストは、それらの日常的な用途に対する障害であった。さらに、多くの表面官能基（例えば、アミン、カルボキシル、ヒドロキシル及びスルフヒドリル基）を含有するタンパク質は、部位特異的化学反応と適合しないことが多く、このことは、進歩したナノ生物工学用途におけるそれらの使用を制限する。これらの問題に対処するための１つの潜在的なアプローチは、小分子及びタンパク質の有用な特性を有するペプチドを実施することである。ライブラリースクリーニング及び構造ベースの分子設計等のペプチド設計戦略の進歩は、標的結合においてタンパク質を凌駕することができる人工ペプチドの開発を促進した。さらに、ペプチドは、費用対効果の高い化学的アプローチ、固相ペプチド合成（一度に１つのアミノ酸をコンジュゲートする）によって合成することができ、アミノ酸組成及び高分子トポロジーの容易かつ正確な調整を可能にする。
ペプチドはタンパク質の有望な代替物であるが、短いペプチドの標的結合親和性は一般にタンパク質の標的結合親和性よりも低い。さらに、ペプチドは、多くの場合、それらのタンパク質の状況から分離されたとき、それらの物理化学的特性に著しくに影響を及ぼす生得の折り畳み構造を維持しない。
必要とされているのは、β－ヘアピンペプチドを送達するための新規な組成物及び方法である。
一態様では、ナノ粒子系は、それにコンジュゲートされた複数のβ－ヘアピンペプチドを含む多価ナノ粒子コアを含む。
別の態様では、医薬組成物は、ナノ粒子系及び薬学的に許容され得る賦形剤を含む。
更に別の態様では、ナノ粒子系を作製する方法であって、複数の反応性末端基を含む多価ナノ粒子コアを、複数のβ－ヘアピンペプチドを前記多価ナノ粒子コアにコンジュゲートさせ、前記ナノ粒子系を提供するのに十分な条件下で、１つ以上のβ－ヘアピンペプチドを含む組成物と接触させることを含む。
別の態様では、免疫療法の方法は、ナノ粒子系を、それを必要とする対象に投与することを含む。
ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１アンタゴニストとしての多価デンドリマーペプチドコンジュゲートの開発過程の概略図を示す。
ＰＤ－１の構造、操作されたＰＤ－１及びＰＤ－Ｌ１を標的化するための異なるペプチド構造を示す。配列番号１はβＨ１－ｗｔ配列であり、配列番号２はβＨ１－変異配列であり、配列番号３はβＨ２－ｗｔ配列であり、配列番号４はβＨ２－ｗｔ配列である。結合面が強調表示される（リボン）。
βＨ２＿ｍｔペプチド、Ｇ７ ＰＡＭＡＭデンドリマー、及びＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１界面の間のサイズ比較を示し、デンドリマー表面が、結合のために十分な空間距離だけ離れた複数のペプチドを収容することを示す。
固定化ＰＤ－Ｌ１タンパク質へのＧ７－βＨ２＿ｍｔ（Ａ）、Ｇ７－βＨ２＿ｗｔ（Ｂ）、Ｇ７－βＨ１＿ｍｔ（Ｃ）及び完全アセチル化デンドリマー（Ｄ）の結合についてのＳＰＲセンサーグラムを示す。
９０％（Ａ）、８０％（Ｂ）、及び６０％（Ｃ）アセチル化デンドリマーを使用したＧ７－βＨ２＿ｍｔコンジュゲートのＰＤ－Ｌ１への結合についてのＳＰＲセンサーグラムを示す。
Ｇ７－βＨ２＿ｍｔコンジュゲートのＰＤＬ１への濃度依存性結合動態を、定量的に測定された結合動態（ｋａ：会合速度定数；ｋｄ：解離速度定数；ＫＤ：平衡解離定数）と共に示す。曲線Ａ～Ｄは、それぞれ４５、９０、１８０、２７０ｎＭを表す。
ａＰＤ－Ｌ１抗体のＰＤＬ１への濃度依存性結合動態を、定量的に測定された結合動態（ｋａ：会合速度定数；ｋｄ：解離速度定数；ＫＤ：平衡解離定数）と共に示す。曲線Ａ～Ｄは、それぞれ２５、５０、１００、２００ｎＭを表す。
遊離βＨ２＿ｍｔペプチドのＰＤＬ１への濃度依存性結合動態を、定量的に測定された結合動態（ｋａ：会合速度定数；ｋｄ：解離速度定数；ＫＤ：平衡解離定数）と共に示す。曲線Ａ～Ｄは、それぞれ１７、２５、３３、４２μＭを表す。
Ｇ７－βＨ２＿ｍｔコンジュゲート（Ａ）、βＨ２＿ｍｔペプチド（Ｂ）及び完全アセチル化デンドリマー（Ｃ）のＣＤスペクトルを示す。
Ｇ７－βＨ２＿ｍｔコンジュゲートのＦＴＩＲスペクトル、ならびにβシート及びβターンで標識したそのフーリエ自己逆畳み込み解析を示す。挿入図：βＨ２＿ｍｔペプチド（上）及び完全アセチル化デンドリマー（下）のＦＴＩＲスペクトル。
ペプチドフォールディングのエントロピーコストを減少させる排除体積効果の概略図を示す。
最初に伸長したβＨ２＿ｍｔ（リボン中のβＨ２＿ｍｔ、Ｇ５中の原子）を有するＧ５ ＰＡＭＡＭデンドリマーとのコンジュゲート化時のβＨ２＿ｍｔの折り畳み挙動のＭＤシミュレーション結果を示す。
最初に折り畳まれたβＨ２＿ｍｔ（リボン中のβＨ２＿ｍｔ、Ｇ５中の原子）を有するＧ５ ＰＡＭＡＭデンドリマーとのコンジュゲート化時のβＨ２＿ｍｔの折り畳み挙動のＭＤシミュレーション結果を示す。
ＰＤ－Ｌ１へのｆβＨ２＿ｍｔの結合を示す。
ｆβＨ２＿ｍｔ／ＰＤ－Ｌ１複合体に対するＧ７－βＨ２＿ｍｔ（Ａ）、ａＰＤ－Ｌ１（Ｂ）、βＨ２＿ｍｔ（Ｃ）及び完全アセチル化デンドリマー（Ｄ）の競合アッセイを示す。
複数のＰＤ－Ｌ１タンパク質に結合するＧ７－βＨ２＿ｍｔコンジュゲートの図である。
Ｇ７－βＨ２＿ｍｔで１時間（ローダミンからの蛍光、左；明視野画像、右）で処置した７８６－Ｏ細胞の蛍光顕微鏡画像を示す、スケールバー：５０μｍ。
Ｇ７－βＨ２＿ｍｔで１時間（ローダミンからの蛍光、左；明視野画像、右）で処置したＭＣＦ－７細胞の蛍光顕微鏡画像を示す、スケールバー：５０μｍ。
Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞によるインターロイキン－２（ＩＬ－２）分泌の増加をもたらす免疫チェックポイント遮断の概略図を示す。
様々な群で処置した後の、７８６－Ｏ及びＭＣＦ－７細胞と共培養したＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞からのＩＬ－２分泌を示す。
癌細胞の化学療法抵抗性の低下をもたらす免疫チェックポイントの遮断の概略図を示す。
ドキソルビシン（ＤＯＸ）処置後の癌細胞の生存率を示し、様々な群とのインキュベーション時の癌細胞の化学療法抵抗性を実証する。
βシートに富むタンパク質－タンパク質相互作用界面を示す。
タンパク質コンテクストから単離されたペプチドの折り畳み構造変化を示す。
Ｔｒｐｚｉｐ－ＤＰＣシステムによるβヘアピン安定化の概略図を示す。
ｐＬ１及びｐＬ１ＴＺのペプチド配列及び分子構造を示す。
ｐＬ１のＣＤスペクトルを示す。
ｐＬ１ＴＺのＣＤスペクトルを示す。
Ｇ４－ｐＬ１ＴＺを示す。
排除体積効果の概略図を示す。
ｐＬ１（左）、ｐＬ１ＴＺ（中央）及びＧ７－ｐＬ１ＴＺ（右）のＰＤ－Ｌ１結合についての濃度依存性ＳＰＲセンサーグラムを示す。
ｐＬ１、ｐＬ１ＴＺ及びＧ７－ｐＬ１ＴＺで１時間処置した７８６－Ｏ及びＭＣＦ－７細胞の蛍光顕微鏡画像を示す（ローダミンからの蛍光、左；明視野画像、右）。
腫瘍体積を、４Ｔ１細胞石灰を接種し、遊離ＩｇＧ、遊離ａＰＤ－Ｌ１、Ｇ７－ＰＭＡＭデンドリマー－Ｃｙ－５、Ｇ７－ＰＭＡＭデンドリマー－ｐＰＤ１－ペプチド－Ｃｙ－５、又は遊離ｐＰＤ１ペプチドで処置した雌性Ｂａｌｂ／ｃマウスにおける時間の関数として示す。
体重を、４Ｔ１細胞石灰を接種し、遊離ＩｇＧ、遊離ａＰＤ－Ｌ１、Ｇ７－ＰＭＡＭデンドリマー－Ｃｙ－５、Ｇ７－ＰＭＡＭデンドリマー－ｐＰＤ１－ペプチド－Ｃｙ－５、又は遊離ｐＰＤ１ペプチドで処置した雌性Ｂａｌｂ／ｃマウスにおける時間の関数として示す。
図３３及び３４のマウスについての腫瘍生物発光を示す。
上記及び他の特徴は、以下の詳細な説明、図面、及び添付の特許請求の範囲から当業者によって正しく認識され、理解されるであろう。
発明の詳細な説明
タンパク質表面（表面β－ヘアピンペプチド、ＳβＰｓ）から単離されたβ－ヘアピンペプチドのための新規な工学的アプローチが本明細書に記載される。ナノ粒子骨格にコンジュゲートさせることによってＳβＰを立体配座的に安定化し、ペプチドが多価結合効果を示すことを更に可能にするペプチドナノ粒子コンジュゲートが本明細書に記載される。例えば、デンドリマー－ペプチドコンジュゲート（ＤＰＣ）は、ペプチド構造、特にβ－ヘアピンペプチドに対する最小限の修飾でペプチド構造の安定化を可能にする。β－ヘアピンペプチドは、共有結合架橋によって安定化することができる。しかしながら、化学修飾は、典型的には、ペプチド調製プロセスを複雑にし、次いで、合成収率の著しい低下をもたらすことが多い。鎖間非共有結合の導入は、別の一般的に使用される戦略であるが、それは、ペプチドの物理化学的特性に潜在的に影響を及ぼす実質的なアミノ酸置換を必要とする。本明細書に記載のナノ粒子、例えばＤＰＣプラットフォームは、βシートに富むタンパク質表面を効果的にアンタゴナイズし、標的化する新規な方法を提示する。
タンパク質表面上のペプチドセグメントの使用は、タンパク質の機能性を利用するための効率的なアプローチである。特に、β－ヘアピンペプチドは、二次構造が無数のタンパク質相互作用に関与するため、有望である。配座の類似性に基づいて、ヘアピン構造はまた、βシートが豊富なタンパク質表面（例えば、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１界面）を標的とするアンタゴニストプラットフォームとして機能する可能性を有し、その広い平坦な幾何学的形状は、小分子薬物の場合、一般に新薬の開発に繋がらない（図２３）。そのような表面は、タンパク質－タンパク質相互作用（ＰＰＩ）において遍在的であり、タンパク質凝集関連疾患の進行において重要な役割を果たすので、βシートに富む表面によって媒介されるＰＰＩの調節は、医薬研究において重要で困難な問題であった。しかしながら、ペプチド立体配座は、タンパク質状況（図２４）から単離された場合に容易に不安定化され、これは、それらの標的結合効力にかなり影響を及ぼす。短い血漿循環時間及びプロテアーゼ消化に対する脆弱性は、ペプチドの他の欠点であり、その広範な適用が制限されている。
本明細書に記載のナノ粒子系の利点は、高い水溶性、生体適合性、修飾可能な表面基、及び多価性を有するナノ粒子担体の使用を含む。
或る実施形態では、ナノ粒子系は、それにコンジュゲートされた複数のβ－ヘアピンペプチドを含む多価ナノ粒子コアを含む。複数のβ－ヘアピンペプチドは、複数の同じβ－ヘアピンペプチド、又は同じナノ粒子コアにコンジュゲートされた異なるβ－ヘアピンペプチドを含み得る。具体的な実施形態では、多価ナノ粒子コアが、超分岐ポリマー、デンドリマー、デンドロン、ハイブリッドナノ粒子、又はミセルを含む。多価ナノ粒子コアは、例えば、３～１５０ｎｍの直径を有することができる。
本明細書で使用される場合、超分岐ポリマーは、多分散性であり、それらの分岐及び構造に関して不規則である多価粒子である。対照的に、デンドリマーは、非常に規則的な放射状に対称的な生成構造を有する。デンドリマーは、超分岐ポリマーと比較して、典型的には多段階合成で調製される単分散球状ポリマーである。デンドリマー構造は、対称中心を表す多官能性コア、繰り返し単位（世代）の様々な明確に定義された半径方向に対称な層及び末端基を特徴とする。
超分岐ポリマーとしては、ポリエステル、ポリエステルアミド、ポリエーテル、ポリアミド、ポリエチレンイミン、ポリグリセリン、ポリグリコリド、ポリラクチド、ポリラクチド－コ－グリコリド、ポリタルトレート及び多糖類が挙げられる。超分岐ポリエステルとしては、Ｐｅｒｓｔｏｒｐ ＡＢ製のＢｏｌｔｏｒｎ（登録商標）が挙げられ、超分岐ポリエステルアミドとしては、ＤＳＭ ＢＶ Ｎｉｅｄｅｒｌａｎｄｅ製のＨｙｂｒａｎｅ（登録商標）が挙げられ、ポリグリセリンは、Ｈｙｐｅｒｐｏｌｙｍｅｒｓ ＧｍｂＨによって製造され、超分岐ポリエチレンイミンとしては、ＢＡＳＦ ＡＧ製のＰｏｌｙｉｍｉｎ（登録商標）が挙げられる。
超分岐ポリマーには、ポリカプロラクトン及びコポリマー、例えばポリ（Ｄ，Ｌ－ラクチド－ｃｏ－グリコリド）及びＤｙｎａｐｏ（登録商標）Ｓ及びＤｙｎａｃｏｌｌ（登録商標）製品ファミリーからＤｅｇｕｓｓａ ＡＧによって製造されたポリエステル化合物も含まれる。
超分岐ポリマー、例えば、超分岐ポリグリセロールの調製は、当技術分野で周知である。例えば、グリシドールの制御されたアニオン性開環多分岐重合を行って、超分岐ポリグリセロールを形成する。次いで、超分岐ポリグリセロールをピリジン中で無水コハク酸と反応させて、エステル結合を介してカルボン酸末端基を提供する。一旦、超分岐ポリグリセロール上の官能基含有量が確認されると、ヒドロキシルは、以下のスキーム：ｐＨ８．５のＤＭＳＯ又はＤＭＦ中の超分岐ポリグリセロール－ＯＨ＋Ｎ－（ｐ－マレイミドフェニル）イソシアネート（ＰＭＰＩ １０倍モル過剰）によって更に官能化されて、超分岐ポリグリセロール－マレイミドを得ることができる。したがって、超分岐ポリグリセロールは、対応する架橋剤及び化学基と反応することができるカルボキシル官能基及びマレイミド官能基の両方を有するか、又は利用可能な特定の官能基に適合するように更に誘導体化することができる。
両親媒性の高分岐ポリマーは、ミセル様構造を形成することができる。超分岐ポリマーは、直鎖部分を含み得、ランダム又は非対称分岐を特徴とし得るという点で、「不完全」分子であり得る。超分岐ポリマーは、表面上に複数の官能基を達成するように選択的に修飾され、疎水性を導入するための炭素鎖、及び親水性及びその後の修飾のための活性化のための第一級アミン基等の機能成分に連結され得る。
超分岐ポリマーの利点には、より小さい単位サイズ（典型的には直径６０ｎｍ未満）及び合成のための比較的単純な手順が含まれる。潜在的な欠点としては、広いサイズ分布及び特定の機能性のための表面改質の制御が困難になる可能性が挙げられる。
本明細書で使用される「デンドリマー」という用語は、限定するものではないが、内部コア、この開始剤コアに規則的に付着し、この開始剤コアから延びる反復単位の内部層（又は「世代」）を有する分子構造を含み、各層は１つ以上の分岐点を有し、末端基の外面は最外層に付着している。デンドリマーは、規則的なデンドリマー又は「スターバースト」分子構造を有する。ナノ粒子デンドリマーは、一般に、例えば、３～１０ｎｍの直径を有する。
連続する各デンドリマー生成物は、前の生成物に共有結合することができる。コア構造の反応性基の数は、ｎ方向性を決定し、次世代を形成するために結合することができる構造の数を定義する。
樹枝状構造における分岐の数は、コアを含むモノマー構成要素の分岐価に依存する。例えば、コアが第一級アミンである場合、アミン窒素は二価であり、１－２分岐モチーフをもたらす。
例示的なデンドリマーは、ポリ（アミドアミン）（ＰＡＭＡＭ）、ポリ（エチレンイミン）（ＰＥＩ）、ポリプロピレンイミン（ＰＰＩ）、ジアミノブタンアミンポリプロピレンイミンテトラミン（ＤＡＢ－Ａｍ４）、ポリプロピルアミン（ＰＯＰＡＭ）、ポリリジン、ポリエステル、イプチセン、脂肪族ポリ（エーテル）、芳香族ポリエーテルデンドリマー等のアルキル化デンドリマー、又は前記の１つ以上を含む組み合わせである。
デンドリマーは、カルボキシル末端、アミン末端及びヒドロキシル末端を有することができ、限定されないが、第１世代のデンドリマー（Ｇ１）、第２世代のデンドリマー（Ｇ２）、第３世代のデンドリマー（Ｇ３）、第４世代のデンドリマー（Ｇ４）、第５世代のデンドリマー（Ｇ５）、第６世代のデンドリマー（Ｇ６）、第７世代のデンドリマー（Ｇ７）、第８世代のデンドリマー（Ｇ８）、第９世代のデンドリマー（Ｇ９）、又は第１０世代のデンドリマー（Ｇ１０）を含む任意の世代のデンドリマーであり得る。
ＰＡＭＡＭデンドリマーは、それらの生分解性を向上させることができる内部アミド結合を含み、したがってヒト治療用途に関して耐性を改善する。表面は、極性の高い反応性の第一級アミン基を含む。アミノ官能性ＰＡＭＡＭデンドリマーの表面はカチオン性であり、負に帯電した分子とのイオン相互作用を介して、又は第一級アミンの共有結合官能化のための多くの周知の試薬を使用して誘導体化することができる。
ＰＡＭＡＭデンドリマーが使用される場合、０～７世代のＰＡＭＡＭデンドリマーが典型的に使用される。例えば、ハイブリッドナノ粒子は、世代０のＰＡＭＡＭデンドリマー（Ｇ０）；世代１（Ｇ１）ＰＡＭＡＭデンドリマー；世代２（Ｇ２）ＰＡＭＡＭデンドリマー；世代３（Ｇ３）ＰＡＭＡＭデンドリマー；世代４（Ｇ４）ＰＡＭＡＭデンドリマー；世代５（Ｇ５）ＰＡＭＡＭデンドリマー；世代６（Ｇ６）ＰＡＭＡＭデンドリマー；又は第７世代（Ｇ７）のＰＡＭＡＭデンドリマーから形成され得る。ＰＡＭＡＭは、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（カタログ番号５９７３０９）を含む複数の供給元から市販されている。
ジアミノブタンアミンポリプロピレンイミンテトラミン（ＤＡＢＡｍ４）は、４つの表面第一級アミノ基を有する１，４－ジアミノブタンコア（４－炭素コア）を有するポリマーである。ハイブリッドナノ粒子がＤＡＢ－ＡＭ４デンドリマーから形成される場合、０～７世代のＤＡＢ－ＡＭ４デンドリマーが典型的に使用される。例えば、ハイブリッドナノ粒子は、世代０ＤＡＢ－ＡＭ４デンドリマー（Ｇ０）；世代１（Ｇ１）ＤＡＢ－ＡＭ４デンドリマー；世代２（Ｇ２）ＤＡＢ－ＡＭ４デンドリマー；世代３（Ｇ３）ＤＡＢ－ＡＭ４デンドリマー；世代４（Ｇ４）ＤＡＢ－ＡＭ４デンドリマー；世代５（Ｇ５）ＤＡＢ－ＡＭ４デンドリマー；世代６（Ｇ６）ＤＡＢ－ＡＭ４デンドリマー；又は世代７（Ｇ７）ＤＡＢ－ＡＭ４デンドリマーから形成され得る。ＤＡＢ－Ａｍ４は、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（カタログ番号４６０６９９）を含む複数の供給元から市販されている。
多価ナノ粒子は、１つ以上の異なるデンドリマーから形成され得る。デンドリマー複合体の各デンドリマーは、他のデンドリマーと同様又は異なる化学的性質を有し得る（例えば、第１のデンドリマーはＰＡＭＡＭデンドリマーであり得、第２のデンドリマーはＰＯＰＡＭデンドリマーであり得る）。
デンドロンは、複数の末端基及び焦点における単一の反応性官能基を有する単分散のくさび形デンドリマー部分である。デンドロンは、例えば、表面、別のデンドロン、又は高分子にグラフトされ得る。ビス－ＭＰＡ（ビス－ジメチロールプロピオン酸）デンドロンは、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈから入手可能である。
本明細書で使用される場合、「ミセル」は、内部コア及び外部表面を有する水性媒体中の両親媒性分子の凝集体を指し、両親媒性分子は、主に、それらの疎水性部分がコアを形成し、親水性部分が外部表面を形成するように配向されている。様々なモノクローナル抗体、ペプチド、タンパク質、及び小分子は、ミセルの親水性頭部基に共有結合することができ、より強い結合動態のために複数のコンジュゲートされたＩＣＩでナノ粒子を覆う。ミセルは、典型的には、それらが形成される両親媒性分子又はイオンとの動的平衡状態にあり、溶液中に非凝集形態で存在する。特に洗浄剤、界面活性剤、両親媒性ポリマー、リポポリマー（ＰＥＧ－脂質等）、胆汁酸塩、一本鎖リン脂質及び他の一本鎖両親媒性物質を含む多くの両親媒性化合物、ならびに両親媒性医薬化合物は、臨界ミセル化濃度又はＣＭＣとして知られる特定の濃度を超える水性媒体中でミセルを自発的に形成することが知られている。ミセルの両親媒性成分、例えば脂質成分は、二重層相、非二重層中間相、等方性液相又は固体非晶質相もしくは結晶相を形成しない。ミセルの概念、ならびにそれらの形成のための方法及び条件は、当業者に周知である。ミセルは、溶液中で脂質粒子と共存することができる。
例示的なミセルには、両親媒性デンドロンコイルを含むミセルの開示について参照により組み込まれる米国特許第９，２１２，２５８号に記載されているものが含まれる。各両親媒性デンドロンコイルは、非ペプチジル、疎水性コア形成ブロック、ポリエステルデンドロン及びポリ（エチレン）グリコール（ＰＥＧ）部分を含む。両親媒性デンドロンコイルを含むミセルは、「多価デンドロンコンジュゲート」及び「デンドロンベースナノミセル（ＤＮＭ）」とも呼ばれる。
ミセルの疎水性コア形成ブロックは非ペプチジルであり、すなわち、疎水性コア形成ブロックはペプチドではない。いくつかの実施形態では、ミセルは、単一のタイプの両親媒性デンドロンコイルを含む（すなわち、ミセル中の両親媒性デンドロンコイルは全て同じ３つの成分を有する）。いくつかの実施形態では、ミセルは、２種類以上の両親媒性デンドロンコイルを含む（すなわち、ミセル中の両親媒性デンドンコイルは、それらの３つの成分が異なる）。
いくつかの実施形態では、両親媒性デンドロンコイルの非ペプチジル、疎水性コア形成ブロックは、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）、ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）、ポリ（グリコール酸）（ＰＧＡ）又はポリ（乳酸－ｃｏ－グリコール酸）（ＰＬＧＡ）を含む。いくつかの実施形態では、非ペプチジル、疎水性コア形成ブロックはＰＣＬである。いくつかの実施形態では、ＰＣＬはポリ（ε－カプロラクトン）である。いくつかの実施形態では、非ペプチジル、疎水性コア形成ブロックはＰＬＡである。いくつかの実施形態では、非ペプチジル、疎水性コア形成ブロックはＰＧＡである。いくつかの実施形態では、非ペプチジル、疎水性コア形成ブロックはＰＬＧＡである。非ペプチジル、疎水性コア形成ブロックは、限定されないが、約０．５ｋＤａ～約２０ｋＤａの分子量を含む分子量を有する。いくつかの実施形態では、非ペプチジル、疎水性コア形成ブロックは、約３．５ｋＤａの分子量を有するポリ（ε－カプロラクトン）である。いくつかの実施形態では、非ペプチジル、疎水性コア形成ブロックは、１４ｋＤａの分子量を有するポリ（ε－カプロラクトン）である。
いくつかの実施形態では、両親媒性デンドロンコイルのポリエステルデンドロンは、第３世代～第５世代、すなわち、第３世代（Ｇ３）、第４世代（Ｇ４）又は第５世代（Ｇ５）、アセチレン又はカルボキシレートコアを有するポリエステルデンドロンを含むが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、ポリエステルデンドロンはＧ３デンドロンである。いくつかの実施形態では、ポリエステルデンドロンはＧ５デンドロンである。いくつかの実施形態では、ポリエステルデンドロンはアセチレンコアを有する。いくつかの実施形態では、ポリエステルデンドロンは、第３世代のポリエステル－８－ヒドロキシル－１－アセチレンビス－ＭＰＡデンドロンである。いくつかの実施形態において、ポリエステルデンドロンは、カルボキシレートコアを有する。
いくつかの実施形態では、両親媒性デンドロンコイルのＰＥＧ部分は、メトキシＰＥＧ（ｍＰＥＧ）部分、アミン末端ＰＥＧ（ＰＥＧ－ＮＨ２）部分、アセチル化ＰＥＧ（ＰＥＧ－Ａｃ）部分、カルボキシル化ＰＥＧ（ＰＥＧ－ＣＯＯＨ）部分、チオール末端ＰＥＧ（ＰＥＧ－ＳＨ）部分、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド－ＰＥＧ（ＰＥＧ－ＮＨＳ）部分、ＮＨ２－ＰＥＧ－ＮＨ２部分又はＮＨ２－ＰＥＧ－ＣＯＯＨ部分である。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ部分は、それだけに限らないが、約０．２ｋＤａ～約５ｋＤａの分子量を含む分子量を有する。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ部分はｍＰＥＧ部分である。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ部分は、約２ｋＤａの分子量を有するｍＰＥＧ部分である。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ部分は、約５ｋＤａの分子量を有するｍＰＥＧ部分である。
一実施形態において、ポリエステルデンドロンは、コア－シェル型ミセルの自己集合を補助し、疎水性薬物分子がミセル内に充填されることを可能にする鎖の絡み合い及び分子内相互作用を促進するのを助けるために、直鎖疎水性ポリマーで共有結合的に修飾される。ＰＥＧ部分は、非汚染特性を有する親水性コロナを形成し、ミセルをｉｎ ｖｉｖｏで投与した場合、増加した循環半減期を与える。
生分解性、循環半減期、標的化性、薬物動態及び薬物放出等の生物学的に重要な特性は、両親媒性デンドロンコイルの３つの成分（３つのポリマーブロックとも呼ばれる）を変えることによって制御することができる。さらに、コポリマー構造は柔軟であり、各成分の分子量を変化させて親水性－親油性バランス（ＨＬＢ）を微調整することによって容易に操作することができる。例えば、様々な実施形態は、それぞれ０．５～２０ｋＤａ、Ｇ３～Ｇ５（約０．９～３．５ｋＤａ）、及び０．２～５ｋＤａの範囲の分子量を有するＰＣＬ、ポリエステルデンドロン、及びＰＥＧを使用する。したがって、ＨＬＢ（２０ＭＨ／（ＭＨ＋ＭＬ）、式中、ＭＨは親水性ブロックの質量であり、ＭＬは親油性ブロックの質量である）は、２．２２から１９．９４まで大きく異なる。
デンドロンが、両親媒性デンドロンコイルの生成において、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）、ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）、ポリ（グリコール酸）（ＰＧＡ）、及びポリ（乳酸－ｃｏ－グリコール酸）（ＰＬＧＡ）等の疎水性線状ポリマーと共重合される場合、円錐形の両親媒性デンドロンコイルは、熱力学的に有利であり、血液循環時間を増加させるために高度に充填されたＰＥＧ表面層を有する自己集合ミセルを形成するので、有利な構造的属性を持つ。ミセルを形成する際の熱力学的安定性は、容易に調整可能な独特の構造と共にある。
ナノキャリア系は、超分岐ポリマーと他の生体適合性ナノ粒子とのハイブリッドを含む。例えば、そのようなハイブリッドナノ粒子には、デンドリマー－リポソーム、デンドリマー－ＰＥＧ－ＰＬＡ、デンドリマーの固有の利点（直径２～１０ｎｍ）とより大きなナノ粒子（５０～２００ｎｍ）とを組み合わせたデンドリマー－エキソソームハイブリッドが含まれる。
例示的なハイブリッドナノ粒子（ナノハイブリッドとも呼ばれる）には、ハイブリッドナノ粒子の開示について参照により本明細書に組み込まれる米国特許第９，１６８，２２５号に記載されているものが含まれる。この実施形態では、ハイブリッドナノ粒子は、ナノコアがマトリックス又はシェルに囲まれているか又はカプセル化されている粒子である。言い換えれば、より大きな粒子内のより小さな粒子である。特定の実施形態では、ハイブリッドナノ粒子は、リポソーム内にナノコアを含む。他の実施形態では、ナノコアは、ポリマーマトリックス又はシェル（例えば、ポリマーナノ粒子）によって囲まれている。
ナノコアの最大直径は、好ましくは１ｎｍ～５０ｎｍである。より好ましくは、ナノコアは、その最大直径が１～４０ｎｍ、最も好ましくはその最大直径が３～２０ｎｍの範囲である。ナノコアを動的光散乱及び／又は走査型電子顕微鏡によって分析して、粒子のサイズを決定することができる。ナノコアは、任意の形状及び任意の形態を有することができる。ナノコアの例としては、ナノ粉末、ナノクラスタ、ナノ結晶、ナノスフェア、ナノファイバー及びナノチューブが挙げられる。そのナノスケールのサイズを考えると、ナノコア足場は容易に排出される。したがって、使用されるナノコア足場は生分解性である必要はないが、特定の実施形態では、ナノコア足場は生体適合性があり、すなわち細胞に対して毒性はない。足場が「生体適合性がある」とは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの細胞への添加によって３０％、２０％、１０％、５％、又は１％以下の細胞死が発生する場合、および、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて、炎症又は他のそのような望ましくない有害作用を誘導しない場合を意味する。
例示的なポリマー足場としては、限定されないが、ポリアミド、多糖、ポリ無水物、ポリ－Ｌ－リジン、ポリアクリルアミド、ポリメタクリレート、ポリペプチド、ポリエチレンオキシド、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、若しくはポリ（アミドアミン）（ＰＡＭＡＭ）及びＰＡＭＡＭ（エチレンジアミン－ＥＤＡ）デンドリマー等のデンドリマー、又はそれらの改変バージョン、例えば前記ポリマーのヒドロキシル化、アセチル化、又はカルボキシル化バージョンが挙げられる。他の例示的なポリマー骨格は、例えば、国際公開第９８／４６２７０号（ＰＣＴ／ＵＳ９８／０７１７１）又は国際公開第９８／４７００２号（ＰＣＴ／ＵＳ９８／０６９６３）に記載されている。多価ポリマー足場分子は、直鎖状、分岐状、フォーク状又は星状から選択される構成を有することができる。
いくつかの実施形態では、多価ポリマー足場分子の少なくとも一部は疎水性であり得る。いくつかの実施形態では、多価ポリマー足場分子の少なくとも一部は親水性であり得る。別の実施形態では、多価ポリマー足場分子の一部は疎水性であり得、分子の異なる部分は親水性であり得る。特定の実施形態では、多価ポリマー足場分子はカチオン性である。他の実施形態では、多価ポリマー足場分子は電子的に中性である。更に他の実施形態では、多価ポリマー足場分子はアニオン性である。当業者は、所望の特性を示す多価ポリマー足場分子を得るために様々な出発材料が選択され得ることを認識するであろう。
一実施形態において、シェルは、卵ホスファチジルコリン、卵ホスファチジルエタノールアミン、大豆ホスファチジルコリン、レシチン、スフィンゴミエリン、合成ホスファチジルコリン、リゾホスファチジルコリン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジン酸、ホスファチジルエタノールアミン又はホスファチジルセリン等のリン脂質で構成されたリポソームであり、リン脂質は、長循環剤又は凍結保護剤で修飾することができる。別の実施形態では、シェルは、ポリ－（γ－Ｌ－グルタミルグルタミン）、ポリ－（γ－Ｌ－アスパルチルグルタミン）、ポリ－Ｌ－乳酸、ポリ－（乳酸－コ－グリコール酸）、ポリアルキルシアノアクリレート、ポリ無水物、ポリヒドロキシ酸、ポリプロピルフマレート、ポリアミド、ポリアセタール、ポリエーテル、ポリエステル、ポリ（オルトエステル）、ポリシアノアクリレート、［Ｎ－（２－ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド］コポリマー、ポリビニルアルコール、ポリウレタン、ポリホスファゼン、ポリアクリレート、ポリウレア、ポリアミンポリイプシロン－カプロラクトン、及びそれらのコポリマーの群から選択されるポリマーで構成されるポリマーナノ粒子であり、ポリマーは、タンパク質分解耐性を高め、循環半減期を改善し、抗原性を低下させ、免疫原性を低下させ、毒性を低下させ、溶解性を改善し、又は熱的もしくは機械的安定性を改善するように修飾又は誘導体化される。特定の実施形態では、シェルは生分解性である。特定の実施形態では、多価ポリマー足場はカチオン性であり、ポリアミド、多糖、ポリ無水物、ポリ－Ｌ－リジン、ポリアクリルアミド、ポリメタクリレート、ポリペプチド、ポリエチレンオキシド、ポリエチレンイミン、ポリ（アミドアミン）（ＰＡＭＡＭ）、又はＰＡＭＡＭ（エチレンジアミン－ＥＤＡ）で構成される。
別のハイブリッドナノ粒子は、米国特許出願第１６／０１１，９２２号に記載されているデンドリマー－エキソソームハイブリッドである。デンドリマー－エキソソームハイブリッドは、１つ以上のナノ粒子デンドリマーが負荷投与されたエキソソームである。本明細書中で使用されるとき、エキソソームとは、様々な細胞から分泌される膜構造を有する小胞のことを指す。エキソソームは、約２５～約１５０ｎｍの直径を有する。エキソソームは、ＶＬＡ－４、ＣＤ１６２、ＣＸＣＲ４、ＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１又はそれらの組み合わせ等のマーカーを発現し得る。一実施形態では、エキソソームは、対象、例えばヒト対象から単離される幹細胞又は腫瘍細胞に由来する。
一実施形態では、エキソソームは、対象、例えばヒト対象から単離される幹細胞又は腫瘍細胞に由来する。
幹細胞には、胚性幹細胞又は成体幹細胞、好ましくは成体幹細胞が含まれる。成体幹細胞は、限定されないが、間葉系幹細胞、ヒト組織由来間葉系間質細胞（間葉系間質細胞）、ヒト組織由来間葉系幹細胞、多能性幹細胞又は羊膜上皮細胞、好ましくは間葉系幹細胞であり得る。間葉系幹細胞は、限定されないが、臍帯、臍帯血、骨髄、脂肪、筋肉、神経、皮膚、羊膜、胎盤等に由来し得る。
一実施形態では、幹細胞は間葉系幹細胞である。間葉系幹細胞（ＭＳＣ）は、癌性領域において頻繁に見出される炎症性領域、すなわち、ＭＳＣ腫瘍ホーミングを特異的に標的とすることができる。
別の実施形態では、エキソソームは腫瘍細胞から単離される。腫瘍細胞は、エキソソームを能動的に産生し、放出し、利用して腫瘍成長を促進する。
エキソソームは、対象から腫瘍又は幹細胞を単離し、腫瘍又は幹細胞を増殖させて増殖した細胞集団を提供し、増殖した細胞集団を培養し、増殖した腫瘍又は幹細胞から分泌されたエキソソームを単離することによって産生され得る。内部成分を単離されたエキソソームから除去して、ナノ粒子デンドリマー等の成分を負荷投与するための本質的に空の容器であるいわゆるゴースト型エキソソーム（ｇｈｏｓｔ ｅｘｏｓｏｍｅ）を提供することができる。患者由来のエキソソームは、上記の特徴に加えて、患者に非免疫原性ナノキャリアシェルを提供することができ、個別化医療の選択肢を可能にする。
免疫チェックポイント阻害剤のコンジュゲート化を可能にするために、一態様では、多価ナノ粒子は、アルキルエポキシドとの反応によって修飾され、エポキシドのＲ基は１～３０個の炭素原子を有する。いくつかの実施形態では、アルキルエポキシドは、多価ナノ粒子上に存在するアミノ基と反応して、アルキル化多価ナノ粒子を形成する。
多価ナノ粒子上に存在するアミン基は、限定されるものではないが、ジシクロヘキシルカルボジイミド、ジイソプロピルカルボジイミド、Ｎ－（３－ジメチルアミノプロピル）－Ｎ'－エチルカルボジイミド、１，１'－カルボニルジイミダゾール、Ｎ－スクシンイミジルＳ－アセチルチオアセテート、Ｎ－スクシンイミジル－Ｓ－アセチルチオプロピオネート、２－メルカプトエチルアミン、スルホスクシンイミジル４－（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサン－１－カルボキシレート、スクシンイミジルヨードアセテート、スクシンイミジル３－（２－ピリジルジチオ）プロピオネートを含むカップリングリンカーを使用した様々なアミン系コンジュゲート化反応のための反応部位を提供する。いくつかの実施形態では、反応性エステルを使用して、エステル結合を介して多価ナノ粒子及び他の化合物を連結する。反応性エステルとしては、例えば、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル、Ｎ－ヒドロキシスルホスクシンイミドエステル、Ｎ－γ－マレイミドブチリル－オキシスルホスクシンイミドエステル、ニトロフェニルエステル、テトラフルオロフェニルエステル、ペンタフルオロフェニルエステル、チオピリジルエステル、チオニトロフェニルエステルが挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、反応性エステル基はＮ－ヒドロキシスクシンイミドエステルである。
本明細書に記載のナノ粒子は、チェックポイント阻害剤受容体に対して高い親和性を有するβ－ヘアピンペプチド等のβ－ヘアピンペプチドを含む。
例示的なβ－ヘアピンペプチドには、細胞表面受容体に結合するペプチド、細胞内受容体を標的とするペプチド、及び細胞外マトリックスと相互作用するペプチド等の腫瘍標的化ペプチドが含まれる。例えば、細胞表面受容体に結合する腫瘍標的化ペプチドには、ＲＧＤ結合モチーフを有するαｖβ３インテグリン、ならびに結腸、肝臓、卵巣、膵臓及び扁平上皮の癌細胞の表面に発現されるαｖβ６インテグリン等のインテグリンに結合するペプチドが含まれる。腫瘍標的化ペプチドの更なる標的としては、アミノペプチダーゼＮ、ペプチドトランスポーター１、上皮成長因子受容体、前立腺特異的膜抗原、ムチン１、ウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子受容体、胃放出ペプチド受容体、ソマトスタチン受容体、コレシストキニン受容体、ニューロテンシン受容体、トランスフェリン受容体、血管内皮成長因子受容体、インスリン、エフリン受容体等が挙げられる。細胞内受容体に結合する腫瘍標的化ペプチドには、ＢＣＲ／ＡＢＬ、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）の慢性期を担う病原性融合タンパク質、サイクリンＡ、ＣＤＫ、ミトコンドリア等に結合するペプチドが含まれる。細胞外マトリックスを標的とするペプチドには、フィブロネクチン、線維芽細胞増殖因子、マトリックスメタロプロテイナーゼ、前立腺特異的抗原、カテプシン等に結合するペプチドが含まれる。
細胞透過性ペプチドには、Ｒ８、ＴＡＴ、Ｔｒａｎｓｐｏｒｔａｎ及びＸｅｎｔｒｙが含まれる。
ＺＡβ３等のβ－ヘアピンペプチドは、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、クロイツフェルト・ヤコブ病、嚢胞性線維症、ゴーシェ病ならびに他の多くの変性及び神経変性障害等のタンパク質折り畳み疾患を処置するために使用することができる。
免疫チェックポイント阻害剤β－ヘアピンペプチドは、免疫チェックポイント受容体表面と高い親和性で相互作用する免疫チェックポイント阻害剤リガンドペプチド、例えば表面ペプチドを同定することによって同定することができる。例えば、ＰＤ－Ｌ１と高親和性で相互作用する表面β－ヘアピンＰＤ－１ペプチドが本明細書において同定されている。本明細書で使用される場合、高親和性は、０．１～１０００ｎＭのＫＤを意味する。そのようなペプチドは、５～５０アミノ酸長を有することができ、免疫チェックポイント阻害剤全体に対応しない。
例示的なβ－ヘアピンＰＤ－１ペプチドには、以下が含まれる：
配列番号１：ＴＹＬＣＧＡＩＳＬＡＰＫＬＱＩＫＥＳＬＲＡ（βＨ１－ｗｔ配列）
配列番号２：ＴＹＶＣＧＶＩＳＬＡＰＲＩＱＩＫＥＳＬＲＡ（βＨ１－変異体配列）
配列番号３：ＶＬＮＷＹＲＭＳＰＳＮＱＴＤＲＫＡＡ（βＨ２－ｗｔ配列）
配列番号４：ＨＶＶＷＨＲＥＳＰＳＧＱＴＤＴＫＡＡ（βＨ２－ｗｔ配列）
一態様では、β－ヘアピンペプチドは、トリプトファンジッパーを含む。配列番号４のトリプトファンジッパー類縁体は、配列番号５である。
配列番号５：ＨＫＶＷＨＷＥＳＰＳＧＱＷＤＴＷＡＡ（Ｔｒｐ－Ｚｉｐ βＨ２変異体配列）
本明細書で使用される場合、トリプトファンジッパーは、同じペプチド表面上に配置された４つのトリプトファン残基を含むβ－ヘアピンペプチドであり、これらはβ－ヘアピンペプチドをクラスター化し、安定化する。
ｔｒｐｚｉｐ戦略（例えば、ペプチドの折り畳まれた構造の安定化）は、ナノ粒子へのコンジュゲート化に加えて、ナノ粒子、例えばデンドリマーの表面上のペプチドの折り畳まれた構造の安定化により、ベータヘアピンペプチドの結合動態を更に改善する。ペプチドとナノ粒子表面との間の水素結合、ファンデルワールス力、双極子相互作用を含む分子間力もまた、ペプチドの折り畳み構造の安定化に寄与し、それによって全体的な結合動態を改善する。
多価ナノ粒子コア上の多数の末端基は、β－ヘアピンペプチドに加えて多種多様な分子のコンジュゲート化を可能にする。多価ナノ粒子コアは、治療剤、予防剤又は診断剤の１つ以上と結合し、例えば複合体化又はコンジュゲート化することができる。診断剤には、造影剤が含まれる。
一態様では、治療剤は化学療法剤である。化学療法剤としては、以下のクラスが含まれるが、これらに限定されない：アルキル化剤、代謝拮抗物質、アントラサイクリン、植物アルカロイド、トポイソメラーゼ阻害剤、モノクローナル抗体、及び他の抗腫瘍剤。上記の化学療法薬、すなわちドキソルビシン、パクリタキセルに加えて、他の適切な化学療法薬としては、チロシンキナーゼ阻害剤メシル酸イマチニブ（Ｇｌｅｅｖｅ（登録商標）又はＧｌｉｖｅｃ（登録商標））、シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、メクロエタミン、シクロホスファミド、クロラムブシル、アザチオプリン、メルカプトプリン、ピリミジン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビノレルビン、ビンデシン、ポドフィロトキシン（Ｌ０１ＣＢ）、エトポシド、ドセタキセル、トポイソメラーゼ阻害剤（Ｌ０１ＣＢ及びＬ０１ＸＸ）イリノテカン、トポテカン、アムサクリン、エトポシド、リン酸エトポシド、テニポシド、ダクチノマイシン、ロニダミン、及びモノクローナル抗体、とりわけ、例えばトラスツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標））、セツキシマブ、ベバシズマブ及びリツキシマブ（Ｒｉｔｕｘａｎ（登録商標））が挙げられる。
治療剤の他の例としては、抗菌剤、鎮痛剤、抗炎症剤等が挙げられるが、これらに限定されない。抗生物質を、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）によるものを含む感染症を処置するために頻繁に使用されるバンコマイシン等の粒子に組み込むことができる。粒子は、任意に、患者の免疫系の活性及び臓器拒絶のリスクを低下させるために同種異系臓器移植後に広く使用されている免疫抑制剤である親油性薬物であるシクロスポリン（ＮｏｖａｒｔｉｓによりＳａｎｄｉｍｍｕｎｅ（登録商標）及びＮｅｏｒａｌ（登録商標）の商品名で市販されている）を含む。シクロスポリンを含む粒子は、乾性角結膜炎を処置するための局所エマルジョンにおいても使用することができる。これに関して、そのような薬物を組み込んだ多機能性表面ドメインを有する粒子は、同等の投与量の様々な薬物を癌細胞に直接送達するように設計することができ、したがって、一般に患者に送達される量を潜在的に最小化し、他の組織への付随的な損傷を最小化する。
治療剤としては、遺伝子サイレンシング剤、遺伝子調節剤、アンチセンス剤、ペプチド核酸剤、リボザイム剤、ＲＮＡ剤、及びＤＮＡ剤等の治療用核酸も挙げられる。核酸治療剤としては、標的遺伝子又は配列の発現を低減又は阻害することができる、一本鎖又は二本鎖のＲＮＡ又はＤＮＡ、具体的にはＲＮＡ、例えばトリプレックスオリゴヌクレオチド、リボザイム、アプタマー、ｓｉＲＮＡ（短鎖干渉ＲＮＡ）及びｓｈＲＮＡ（短鎖ヘアピンＲＮＡ）を含む低分子干渉ＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）もしくはその一部、又はその類縁体もしくは模倣体が挙げられる。阻害性核酸は、例えば、干渉ＲＮＡ配列に相補的なｍＲＮＡの分解を媒介するか又は翻訳を阻害することによって作用することができる。
診断薬は、組織又は疾患の検出又は画像化を可能にする薬剤である。診断薬の例としては、放射性標識、フルオロフォア及び色素が挙げられるが、これらに限定されない。
造影剤は、対象における腫瘍、器官又は組織を造影するために本発明のランダムコポリマーに付着される標識を指す。造影剤の例としては、限定されないが、放射性核種、フルオロフォア、例えばフルオレセイン、ローダミン、イソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ、ＦＩＴＣ）、テキサスレッド、Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ５、ＡＰＣ、及びＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州カールスバッド）フルオロフォアの範囲、抗体、ガドリニウム、金、ナノ材料、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、それらの誘導体、及びそれらの混合物が挙げられる。
放射性標識は、放射能を示す核種を指す。「核種」は、炭素１４（１４Ｃ）等、その原子番号、原子質量、及びエネルギー状態によって指定される原子の種類を指す。「放射能」とは、放射性物質によって放出される、アルファ粒子、ベータ粒子、核子、電子、陽電子、ニュートリノ、及びガンマ線を含む放射線を指す。
予防剤の投与は、疾患又は障害が予防されるか、あるいはその進行が遅延されるように、疾患又は障害に特徴的な症状の発現の前に行われ得る。
治療用分子、診断薬、及び予防薬は、化学的コンジュゲート化、物理的カプセル化、及び／又は静電相互作用の方法を介して多価ナノ粒子コアと組み合わせることができる。
本明細書に記載のナノ粒子系を含む医薬組成物も含まれる。医薬組成物は、上記の治療剤、予防剤又は診断剤を更に含み得る。
本明細書で使用される場合、「医薬組成物」は、希釈剤、防腐剤、可溶化剤、乳化剤、及びアジュバント等の薬学的に許容され得る賦形剤と共に治療有効量のナノ粒子を意味する。本明細書で使用される場合、「薬学的に許容され得る賦形剤」は当業者に周知である。
経口投与のための錠剤及びカプセルは、単位用量形態であり得、結合剤、例えばシロップ、アカシア、ゼラチン、ソルビトール、トラガカント又はポリビニルピロリドン；充填剤、例えばラクトース、糖、トウモロコシデンプン、リン酸カルシウム、ソルビトール又はグリシン；打錠潤滑剤、例えばステアリン酸マグネシウム、タルク、ポリエチレングリコール又はシリカ；崩壊剤、例えばジャガイモデンプン、又はラウリル硫酸ナトリウム等の許容され得る湿潤剤等の従来の賦形剤を含有し得る。錠剤は、通常の製薬実務において周知の方法に従ってコーティングされ得る。経口液体製剤は、例えば、水性又は油性の懸濁液、溶液、エマルジョン、シロップ若しくはエリキシルの形態であってもよく、又は使用前に水若しくは他の適切なビヒクルで再構成するための乾燥製品として提供されてもよい。そのような液体調製物は、懸濁化剤、例えばソルビトール、シロップ、メチルセルロース、グルコースシロップ、ゼラチン水素化食用脂肪；乳化剤、例えばレシチン、ソルビタンモノオレエート、又はアカシア；非水性ビヒクル（食用油を含み得る）、例えばアーモンド油、分留ヤシ油、グリセリン、プロピレングリコール又はエチルアルコール等の油性エステル；防腐剤、例えばｐ－ヒドロキシ安息香酸メチルもしくはプロピル、又はソルビン酸、ならびに所望であれば従来の香味剤又は着色剤等の従来の添加剤を含有し得る。
皮膚への局所適用の場合、薬物をクリーム、ローション又は軟膏に構成することができる。薬物に使用され得るクリーム又は軟膏製剤は、当技術分野で周知の従来の製剤である。局所投与には、パッチ等の経皮製剤が含まれる。
眼への局所適用の場合、阻害剤は、適切な滅菌水性又は非水性ビヒクル中の溶液又は懸濁液に構成され得る。添加剤、例えば、メタ重亜硫酸ナトリウム又はエデイン酸二ナトリウム等の緩衝液；酢酸水銀フェニル又は硝酸塩、塩化ベンザルコニウム又はクロルヘキシジン等の殺菌剤及び殺真菌剤、ならびにヒプロメロース等の増粘剤を含む防腐剤も含まれ得る。
有効成分はまた、滅菌注射用水性又は油性懸濁液の形態で、滅菌媒体中で非経口的に、皮下もしくは静脈内、又は筋肉内もしくは胸骨内に、又は注入技術によって投与され得る。使用されるビヒクル及び濃度に応じて、薬物をビヒクルに懸濁又は溶解することができる。有利には、アジュバント、例えば局所麻酔薬、防腐剤及び緩衝剤をビヒクルに溶解することができる。
医薬組成物は、単位剤形で好都合に提供され得、薬学の分野で周知の方法のいずれかによって調製され得る。「単位投与量」又は「単位用量」という用語は、示された活性又は状態を処置するのに有効となるのに十分な有効成分の所定量を意味する。各タイプの医薬組成物を製造することは、活性化合物を担体及び１つ以上の任意選択の補助成分と会合させる工程を含む。一般に、製剤は、活性化合物を液体又は固体の担体と均一かつ密接に会合させ、次いで、必要に応じて、生成物を所望の単位剤形に成形することによって調製される。
一態様では、ナノ粒子系を作製する方法は、複数の反応性末端基を含む多価ナノ粒子コアを、複数の免疫チェックポイント阻害剤を多価ナノ粒子コアにコンジュゲートさせ、ナノ粒子系を提供するのに十分な条件下で、免疫チェックポイント阻害剤を含む組成物と接触させることを含む。例示的な末端基としては、カップリングリンカー及び反応性エポキシド、例えば、ジシクロヘキシルカルボジイミド、ジイソプロピルカルボジイミド、Ｎ－（３－ジメチルアミノプロピル）－Ｎ'－エチルカルボジイミド、１，１'－カルボニルジイミダゾール、Ｎ－スクシンイミジルＳ－アセチルチオアセテート、Ｎ－スクシンイミジル－Ｓ－アセチルチオプロピオネート、２－メルカプトエチルアミン、スルホスクシンイミジル４－（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサン－１－カルボキシレート、スクシンイミジルヨードアセテート、スクシンイミジル３－（２－ピリジルジチオ）プロピオネート、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル、Ｎ－ヒドロキシスルホスクシンイミドエステル、Ｎ－γ－マレイミドブチリル－オキシスルホスクシンイミドエステル、ニトロフェニルエステル、テトラフルオロフェニルエステル、ペンタフルオロフェニルエステル、チオピリジルエステル、チオニトロフェニルエステル、及び前述のうちの少なくとも１つを含む組み合わせが挙げられる。
一実施形態では、多価ナノ粒子コアは、コアの反応性及び／又は特異性を高めるために２つ以上の異なるタイプの反応性末端基を含む。
別の実施形態では、免疫療法方法は、対象、例えばヒト対象に、本明細書に記載のナノ粒子系を投与することを含む。例示的なヒト対象としては、癌患者、ならびに多発性硬化症及び関節リウマチ等の免疫障害を有する患者が挙げられる。ナノ粒子は、Ｔ細胞、癌細胞及び／又は抗原提示細胞と相互作用することによって免疫系を標的とすることができる。
β－ヘアピンペプチドが免疫チェックポイント阻害剤ペプチドである場合、本明細書に記載の組成物及び方法は、固形腫瘍癌、例えば乳房、前立腺、卵巣、肺及び脳の癌、ならびに白血病及びリンパ腫等の液性癌を含む全ての癌に適用可能である。
本明細書に記載の方法は、放射線療法、化学療法、外科手術、及びそれらの組み合わせ等の追加の癌治療法と更に組み合わせることができる。
本発明は、以下の非限定的な実施例によって更に説明される。
〔実施例〕
実施例１：ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１ペプチド阻害剤複合体の合成及び分析
材料及び方法
ペプチド合成。Ｆｍｏｃ－アミノ酸及びカップリング試薬は、Ａｎａｓｐｅｃ（米国）及びＮｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ（ドイツ国）から購入し、一般化学物質は、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（米国）から入手した。Ｒｉｎｋ Ａｍｉｄ ＭＢＨＡ樹脂ＬＬ（Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ、ドイツ国）をペプチド合成の足場として使用した。配列は、標準的なＦｍｏｃ保護基を有する標準的なアミノ酸を使用して合成した。樹脂からのペプチドの最終的な脱保護及び切断は、樹脂結合ペプチドを切断カクテル（トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）：チオアニソール：エタンジチオール（ＥＤＴ）を９５：２．５：２．５）で２時間処置することを伴い、続いて、ｔｅｒｔ－ブチルメチルエーテルで沈殿させた。ペプチドを、逆相ＨＰＬＣ（０．１％ＴＦＡを含む水／アセトニトリルの移動相）を使用して精製した。ペプチド分子量は、マトリックスとしてα－シアノ－４－ヒドロキシケイ皮酸（ＣＨＣＡ）を用いたマトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型（ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ）質量分析（ＡＸＩＭＡ（商標）、Ｓｈｉｍａｄｚｕ、日本国）によって定量した。ペプチド濃度を、２８０ｎｍでのトリプトファン（５５００Ｍ－１ ｃｍ－１）及びチロシン（１２８０Ｍ－１ ｃｍ－１）についてのモル吸光係数を使用して、水／アセトニトリル（１：１）における紫外可視（ＵＶ－Ｖｉｓ）分光光度法によって定量した。
デンドリマーペプチドコンジュゲート（ＤＰＣ）の調製。１ｍｌＬのメタノールに溶解したＧ７ ＰＡＭＡＭデンドリマー（１０ｍｇ）（Ｄｅｎｄｒｉｔｅｃｈ、米国）を、６００モル過剰のデンドリマーで、トリエチルアミン（ＴＥＡ）と共に、デンドリマー表面のアミン基の数に対して６０、８０、及び９０％当量の無水酢酸を添加することによってアセチル化した。反応物を激しく撹拌しながら室温で２４時間行った。Ｖｉｖａｓｐｉｎ（商標）Ｔｕｒｂｏ １５（ＭＷＣＯ １０，０００、ドイツ国ザルトリウス）を用いて４，０００ｒ．ｐ．ｍ．で１５分間過剰の試薬を除去し、ｄｄＨ２Ｏで１０回洗浄した（遠心濾過）。次いで、アセチル化デンドリマーを、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドローダミン（ＮＨＳ－ＲＨＯ）を使用して蛍光標識して、ナノ粒子をより良好に定量及び視覚化した。デンドリマーをジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解し、デンドリマーの数に対して１０当量でＤＭＳＯに溶解したＮＨＳ－ＲＨＯを滴加し、次いで、反応を室温で２４時間行った。過剰な試薬を遠心濾過によって除去した。次いで、ＮＨＳ－ＲＨＯ標識デンドリマーをペプチドとコンジュゲートさせた。デンドリマーをリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）に溶解し、次いで、ＰＢＳに溶解した１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）－カルボジイミド（ＥＤＣ）及びＮＨＳをデンドリマー溶液に添加した。次いで、溶液を室温で１時間激しく撹拌した。その後、ＰＢＳに溶解したペプチドを添加し、次いで、反応を室温で２４時間進行させた。過剰なペプチド及び試薬を遠心濾過によって除去した。
表面プラズマ共鳴（ＳＰＲ）。ＳＰＲ分析を、ＢＩＡｃｏｒｅ（商標）Ｘ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ ＡＢ、スウェーデン国ウプサラ）を使用して行った。まとめると、ＰＤ－Ｌ１タンパク質（Ｒ＆Ｄシステム）を、ＥＤＣ／ＮＨＳ化学によってセンサーチップ（ＣＭ５センサーチップ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）のカルボキシル化デキストランコーティング金膜表面に固定化した。試料溶液３０μＬを２０μＬ／分の流量で注入した。サンプル溶液を両方のチャネル（参照用のチャネル１、ＰＤ－Ｌ１を用いるチャネル２）に流し、チャネル１のシグナルからチャネル２のシグナルを差し引くことによって最終的なＳＰＲセンサーグラムを得た。
円偏光二色性（ＣＤ）分光法。ＣＤスペクトルは、Ａｖｉｖ ｍｏｄｅｌ ４２０ Ｃｉｒｃｕｌａｒ Ｄｉｃｈｒｏｉｓｍ分光計（Ａｖｉｖ、米国）を用いて得た。試料を、１ｍｍの経路長の石英キュベットを使用して２６０から１９０ｎｍまで分析した。
減衰全反射－フーリエ変換赤外（ＡＴＲ－ＦＴＩＲ）分光法。Ｈ２Ｏに溶解した試料をＺｎＳｅ ＡＴＲプリズム上で乾燥させた。ＦＴＩＲスペクトルは、Ｂｒｕｋｅｒ Ｅｑｕｉｎｏｘ ５５／Ｓ ＦＴＩＲ分光計で得た。
分子動力学（ＭＤ）シミュレーション研究。減衰定数０．０１ｐｓ－１及び時間ステップ２ｆｓのランジュバン動力学を使用して、Ｐ＝１ｂａｒ及びＴ＝３００ＫでのＮＰＴアンサンブルにおけるＮＡＭＤ及びＣＨＡＲＭＭ力場（ＣＨＡＲＭＭ一般力場及びＣＨＡＲＭＭ３６）でシステムをシミュレートした。長距離静電相互作用は、周期的境界条件の存在下でＰＭＥ法によって計算した。Ｈ結合数は、３．５Åのカットオフ距離及び６０°の角度でＶＭＤによって分析した。
蛍光偏光（ＦＰ）アッセイ。ＰＢＳにおけるＦＰアッセイを、ＰＤ－Ｌ１結合及び競合アッセイ（λｅｘ＝４８０ｎｍ；λｅｍ＝５３５ｎｍ）に使用した。蛍光異方性測定は、３８４ウェルプレート中、Ｉｎｆｉｎｉｔｅ（登録商標）Ｍ１０００ Ｐｒｏマイクロプレートリーダー（Ｔｅｃａｎ）を用いて室温で行った。ｆβＨ２＿ｍｔ／ＰＤ－Ｌ１複合体を３０分のインキュベーション時間後にＦＰ競合アッセイに使用し、競合物質で滴定した。
細胞培養。ヒト腎細胞癌（ＲＣＣ）細胞株７８６－Ｏ及び乳癌細胞株ＭＣＦ－７を、それぞれ高ＰＤ－Ｌ１発現癌細胞モデル及び低ＰＤ－Ｌ１発現癌細胞モデルとして利用した。ヒトＴリンパ球細胞株Ｊｕｒｋａｔを代表的なＰＤ－１発現免疫細胞としてこの研究で使用した。７８６－Ｏ及びＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞をＲＰＭＩ培地中で培養し、一方、ＭＣＦ－７細胞をＤＭＥＭ培地中で増殖させた。全ての細胞培養培地に１％（ｖ／ｖ）ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｐ／Ｓ）及び１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を添加した。細胞を、５％ＣＯ２を含有する加湿雰囲気下、３７℃でインキュベートした。
ウエスタンブロット。７８６－Ｏ及びＭＣＦ－７細胞からの総タンパク質溶解物を、細胞をＲＩＰＡ緩衝液（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１％ＮＰ－４０、１％デオキシコール酸ナトリウム、０．１％ＳＤＳ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．５、２ｍＭ ＥＤＴＡ、プロテアーゼ阻害剤カクテルＩＩ）とインキュベートすることによって調製した。溶解物のタンパク質含有量をＢＣＡアッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ（商標）ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ）によって定量した。２５μｇのタンパク質を４～１６％勾配アクリルアミドゲルで分離し、湿式転写条件でＰＶＤＦ膜に転写した。ブロットを、ＰＤ－Ｌ１に対する一次抗体（ポリクローナル抗ヒトＰＤ－Ｌ１、ＡＦ１５６、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）及びβ－アクチン（モノクローナル抗βアクチン、ＭＡＢ ８９２９、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて４℃で一晩プローブし、続いて適切な二次抗体と室温で１時間インキュベーションした。ブロット上のタンパク質を、化学発光試薬Ｃｌａｒｉｔｙ（商標）Ｗｅｓｔｅｒｎ ＥＣＬ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を使用して検出し、Ｓｙｎｇｅｎｅ（商標）Ｇ：Ｂｏｘ Ｆ３（Ｓｙｎｇｅｎｅ、メリーランド州フレデリック）を使用して画像化した。
Ｔ細胞サイトカイン産生の評価。ＥＬＩＳＡを用いてＴ細胞によって分泌されたインターロイキン－２（ＩＬ－２）の量を評価することによって、癌免疫細胞共培養系におけるＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞の活性を調べた。癌細胞を９６ウェルプレート（５，０００細胞／ウェル）中で４８時間インキュベートした。癌細胞及びＴ細胞を、それぞれＰＤ－Ｌ１及びＰＤ－１発現を活性化するために、インターフェロン－γ（ＩＦＮγ、１０ｎｇ／ｍＬ）及びフィトヘマグルチニン（ＰＨＡ、１μｇ／ｍＬ）／酢酸ミリスチン酸ホルボール（ＰＭＡ、５０ｎｇ／ｍＬ）で３０時間前処置した。次いで、癌細胞をＩＣＩで６時間処置し、続いてＪｕｒｋａｔ Ｔと１：４の比で共培養した。細胞培養上清を４８時間のインキュベーション後に回収し、ＩＬ－２について評価した。
化学感受性アッセイ。化学療法薬ドキソルビシンと共に、免疫チェックポイント阻害剤の相乗的細胞傷害効果を測定することによって、化学感受性アッセイを実施した。癌細胞を９６ウェルプレート（５，０００細胞／ウェル）に播種し、４８時間インキュベートした。前述のように、癌細胞及びＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞をＩＦＮγ及びＰＨＡ／ＰＭＡで前処置した。次いで、癌細胞をカルセインＡＭ（１．５μＭ）で染色し、続いてＩＣＩＳで２時間処置した。ドキソルビシン（５μＭ）処置の前に、細胞を１：４の比で更に２４時間共培養した。ドキソルビシン処置（２時間）後の癌細胞生存に対する各ＩＣＩの効果を、蛍光強度の変化に基づいて分析した。
結果：
ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１ペプチド阻害剤複合体を開発するために、ＰＤ－１表面からのβ－ヘアピンペプチドを同定し、３つの相乗的アプローチの組み合わせを通して操作した（図１）。最初に、本発明者らは、高いＰＤ－Ｌ１親和性を示すように最適化された非天然ＰＤ－１外部ドメインのアミノ酸組成物を使用した。第２に、ペプチドをデンドリマー表面に多価様式でコンジュゲートし、それにより、腫瘍細胞上の複数のＰＤ－Ｌ１タンパク質との協調的な強い相互作用を可能にした。第３に、デンドリマー表面でのコンジュゲート化は、排除された体積効果及びデンドリマーペプチド相互作用により、それらの天然の構造であるβヘアピンへのペプチドフォールディングを支援した。
したがって、これらの工学的アプローチの潜在的な相乗効果を考慮して、本発明者らは、このＤＰＣ戦略が、抗腫瘍免疫の回復のためのＰＤ－Ｌ１との競合的相互作用においてペプチドが天然ＰＤ－１を上回ることを可能にすると仮定した。
ＰＤ－Ｌ１標的化ＤＰＣを開発するために、操作されたＰＤ－１外部ドメイン配列（βＨ１＿ｍｔ及びβＨ２＿ｍｔ、図２）に基づいてβ－ヘアピンペプチドを合成し、第７世代（Ｇ７）のポリ（アミドアミン）（ＰＡＭＡＭ）デンドリマーの表面に結合させた。Ｇ７ ＰＡＭＡＭデンドリマーの表面積がＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１界面の表面積よりも約１０倍大きいと仮定して、コンジュゲート化の前に、９０％のデンドリマーアミン基をアセチル化して、結合したペプチドの数を制御した（図３）。次いで、Ｇ７－βＨ１＿ｍｔ及びＧ７－βＨ２＿ｍｔとして示される得られたＤＰＣを、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を使用して分析して、それらの結合動態を測定した。図４に示すように、Ｇ７－βＨ２＿ｍｔは、固定化ＰＤ－Ｌ１タンパク質に対してＧ７－βＨ１＿ｍｔよりも高い親和性を示したが、完全アセチル化デンドリマーは結合応答を示さなかった。さらに、Ｇ７－βＨ２＿ｍｔのＰＤ－Ｌ１親和性も野生型βＨ２－デンドリマーコンジュゲート対照（Ｇ７－βＨ２＿ｗｔ）のＰＤ－Ｌ１親和性よりも高く、操作されたＰＤ－１配列（βＨ２＿ｍｔ）がより高い親和性をもたらすことを示した。したがって、本発明者らは、ＰＤＬ１標的化リガンドとしてβＨ２＿ｍｔペプチドを選択し、それらを様々なアセチル化度でデンドリマー表面にコンジュゲートして、有効なペプチド価を決定した。多価結合相互作用の結果としての結合強度は、リガンド分子の数に比例すると予想することができる。しかしながら、より多数のβＨ２＿ｍｔペプチド（すなわち、８０％及び６０％アセチル化デンドリマーから調製されたＤＰＣ）を有するＤＰＣでは、より低いＰＤ－Ｌ１親和性が観察された（図５）。これらの予想外の結果は、おそらく、リガンド間の最適化された空間的距離が、他の場所でも観察されたリガンドの数の単なる増加ではなく、より強い結合を達成する上で重要な役割を果たすという事実に起因する。これらの結果は、全体として、９０％アセチル化デンドリマーから調製されたＧ７－βＨ２＿ｍｔが、その対応物であるＧ７－βＨ１＿ｍｔ及びＧ７－βＨ２＿ｗｔよりも効果的にＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１相互作用に拮抗する可能性が高いことを示している。
次に、本発明者らは、Ｇ７－βＨ２＿ｍｔのＰＤ－Ｌ１結合動態を、抗ＰＤ－Ｌ１（ａＰＤ－Ｌ１）抗体及び遊離βＨ２＿ｍｔペプチドのＰＤ－Ｌ１結合動態と比較した。ＳＰＲ分析により、Ｇ７－βＨ２＿ｍｔは、βＨ２＿ｍｔよりも５桁高いＰＤ－Ｌ１親和性（２．７５×１０－９対１．１９×１０－４のＫＤ）を示したことが明らかにされ、これは、図６～８に示されるように、全ａＰＤ－Ｌ１抗体のものに匹敵する（ＫＤ ２．０９×１０－９）。注目すべきことに、Ｇ７－βＨ２＿ｍｔの解離速度定数（ｋｄ）は、遊離ペプチドと比較して約１８０倍減少したが、デンドリマーあたり３０個のペプチドしかなかった（データは示さず）。この結合における非線形増強は、多価結合効果に特徴的であり、すなわち、多価物体は、その一価対応物よりも標的分子に対する再結合機会が高い（統計的再結合機構）。興味深いことに、多価結合効果における役割が小さいことが知られている会合速度定数（ｋａ）も非線形的に増加した（２．５２×１０５対１．０７×１０３）。この結果は、多価結合に加えて、他の因子が、Ｇ７－βＨ２＿ｍｔの有意に増強されたＰＤ－Ｌ１結合に寄与することを意味する。
Ｇ７－βＨ２＿ｍｔの改善された結合動態の背後にある機構を解明するために、本発明者らは、デンドリマーへのコンジュゲート化時にそれらの標的親和性及び選択性に有意に影響を及ぼすペプチドの折り畳み構造の変化を調べた［２０］。図９は、ペプチドフォールディングの程度が観察されたＧ７－βＨ２＿ｍｔ（赤色線）の円偏光二色性（ＣＤ）プロファイル（約２２０ｎｍでの負のシグナル）を示し、これは、α－らせん構造に起因する２２２ｎｍを中心とする典型的な広い負のＣＤバンドとは異なる。対照的に、遊離βＨ２＿ｍｔは、約２００ｎｍの強い負のＣＤバンドに示されるように、ほとんど折り畳まれていないランダムコイル構造（黒い線）を示した。デンドリマーのＣＤプロファイル（赤色線及び灰色線の両方）は、遠紫外線（ＵＶ）光を吸収するデンドリマー骨格中の豊富なアミド結合のために２１８ｎｍ未満のシグナルを省略したことに留意されたい。１μＭの濃度のデンドリマーを使用することにより、高分子による低波長光の吸収を最小限に抑えつつ、ペプチドの二次構造が典型的に特徴付けられる１９０～２３０ｎｍの範囲のデータ解釈のために十分に強いシグナルを得た。
次いで、本発明者らは、減衰全反射－フーリエ変換赤外（ＡＴＲ－ＦＴＩＲ）を使用して、ペプチドの折り畳み挙動を研究した。図１０に示すように、ＦＴＩＲスペクトルにより、βＨ２＿ｍｔペプチド中に、微量のβターン構造（１６７０及び１６９０ｃｍ－１付近の弱い吸収）と共に、ランダムコイル及びβシート（１６４０ｃｍ－１付近の広帯域）の存在が確認された。対照的に、Ｇ７－βＨ２＿ｍｔのＦＴＩＲスペクトルは、ストランド間振動結合については１６３４ｃｍ－１、βターン立体配座については１６６８及び１６８３ｃｍ－１で分解可能な吸収を有するβヘアピン構造のシグネチャを示した。したがって、両方の構造解析は、βＨ２＿ｍｔのヘアピン構造がデンドリマーのコンジュゲート化によって安定化されることをまとめて示している。これらの結果は、表面テザリングが排除体積効果（図１１）を介した生体分子構造の安定化を可能にすることを示唆するいくつかの理論的研究と一致しており、すなわち、基質の存在下では、折り畳まれるペプチドの立体配座自由度が制限され、折り畳みのエントロピーコストが低減される。
実験結果を支持するために、本発明者らは、単一のβＨ２＿ｍｔペプチド生成５（Ｇ５）ＰＡＭＡＭデンドリマーコンジュゲートを使用して分子動力学（ＭＤ）シミュレーションを更に行った。効率的な演算時間のため、より大きなＧ７の代わりにＧ５ ＰＡＭＡＭデンドリマーを使用したことに留意されたい。デンドリマーの表面上のペプチド挙動を、最初の（１）伸長及び（２）折り畳まれたβＨ２＿ｍｔ（図１２及び１３）から５００ｎｓの間比較した。溶液中で折り畳まれた立体配座と伸長した立体配座の両方を示す遊離βＨ２＿ｍｔとは対照的に、最初に伸長したペプチドは折り畳まれた構造に曲がり、最初に折り畳まれたβＨ２＿ｍｔはデンドリマー表面上で折り畳まれた立体配座を安定に維持した。興味深いことに、ペプチドは、ヘアピン構造を維持しながら、水素結合、静電相互作用、及びファンデルワールス相互作用を含む、デンドリマー表面との様々な分子間力を生成した（データは示さず）。一般に、表面とのそのような分子相互作用の形成は、タンパク質の構造安定性を低下させることが知られている。しかしながら、βＨ２＿ｍｔは、ＰＤ－１タンパク質構造全体内の複数の分子相互作用に元々さらされている単離されたペプチドセグメントである（データは示さず）。これらの分子相互作用は、上記のエントロピーコストの低減に加えて、デンドリマー表面上の折り畳まれた立体配座でのペプチド分子の更なる安定化に寄与するようである。β－ヘアピンを安定化する最良の方法は、ペプチド中の２本の鎖の共有結合架橋である。しかしながら、化学修飾は、典型的には、ペプチド調製プロセスを複雑にし、次いで、合成収率の著しい低下を誘導する。鎖間非共有結合の導入は、別の一般的に使用される戦略であるが、それは、ペプチドの物理化学的特性に潜在的に影響を及ぼす実質的なアミノ酸置換を必要とする。対照的に、本発明者らのＤＰＣ戦略は、ペプチド構造に対する最小限の修飾でペプチドのヘアピン構造を安定化することを可能にする。樹状ナノ粒子からもたらされる多価結合の利点と相まって、この特有のＤＰＣプラットフォームは、βシートに富むタンパク質表面を効果的に拮抗し、標的化する新規な方法を提示する。
次に、本発明者らは、Ｇ７－βＨ２＿ｍｔをＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１阻害剤として使用する可能性を検討した。蛍光偏光（ＦＰ）競合アッセイを行うため、フルオレセイン結合βＨ２＿ｍｔ（ｆβＨ２＿ｍｔ）ペプチドを合成し、ＰＤ－Ｌ１タンパク質との標的複合体を構築するために使用した（図１４）。競合実験（ｆβＨ２＿ｍｔ、１０ｎＭ；ＰＤ－Ｌ１、２μＭ）では、複合体の完全性は、βＨ２＿ｍｔペプチド及び完全アセチル化デンドリマーの添加によって影響されなかったが、Ｇ７－βＨ２＿ｍｔは、ＰＤ－Ｌ１からのｆβＨ２＿ｍｔの用量依存的置換をもたらした（図１５）。興味深いことに、ＤＰＣは、ＰＤ－Ｌ１親和性がわずかに低いにもかかわらず、ａＰＤＬ１抗体よりも効果的な競合性を示し、これは、ＤＰＣ表面上の複数の標的タンパク質の適応を可能にする多価リガンドディスプレイに起因し得る（図１６）。
それらの効率を更に精査するために、ＤＰＣをｉｎ ｖｉｔｒｏで試験した。図１７及び図１８に示すように、Ｇ７－βＨ２＿ｍｔと７８６－Ｏ細胞（ＰＤ－Ｌ１過剰発現細胞株）との強い細胞相互作用が蛍光顕微鏡を使用して観察されたが、ＤＰＣはＭＣＦ－７細胞との相互作用が有意に少なく（ＰＤ－Ｌ１発現レベルが低い）、Ｇ７－βＨ２＿ｍｔの高いＰＤ－Ｌ１選択性を実証した。次いで、ｉｎ ｖｉｔｒｏ ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１阻害効果を、他の箇所に記載されているように（図１９）、癌細胞と共培養した後にＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞によって分泌されたサイトカイン（インターロイキン－２、ＩＬ－２）の量を測定することによって評価した。ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１結合の遮断は、Ｔ細胞を活性化し、それらのサイトカイン産生を促進することが周知である。図２０は、Ｇ７－βＨ２＿ｍｔが７８６－Ｏ／Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞相互作用を効果的に阻害し、非処置癌細胞と比較してＴ細胞からのＩＬ－２分泌を１．５２倍増加させて（ｐ＜０．００１）、１．３４倍の増強（ｐ＝０．０１１）を示したにすぎないａＰＤ－Ｌ１抗体よりも更に顕著であったことを示す。これは、Ｇ７－βＨ２＿ｍｔの多価結合効果に起因する可能性がある。遊離ペプチドも完全アセチル化デンドリマーも顕著なＩＬ－２産生を誘導しなかったことに留意されたい。
ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１阻害を裏付けるために、本発明者らは、ＤＰＣ処置が癌細胞の化学療法抵抗性に影響を及ぼし得るかどうかも試験したが、これは多くの臨床研究及び前臨床研究において免疫チェックポイント遮断によって減少することが証明されている。腫瘍（７８６－Ｏ又はＭＣＦ－７）及びＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞を使用した共培養モデルを使用して、ドキソルビシン（ＤＯＸ）及びＧ７－βＨ２＿ｍｔ（図２１）の相乗的細胞傷害効果を調査した。異なるＰＤ－Ｌ１アンタゴニストで処置した癌細胞をＴ細胞と共培養した後、ＤＯＸ処置して細胞死を誘導した。図２２に示すように、Ｇ７－βＨ２＿ｍｔでＰＤ－Ｌ１分子を遮断すると、７８６－Ｏ細胞の化学療法抵抗性が有意に減少し、ドキソルビシンのみで処置した細胞と比較して、細胞生存率が８．４±３．８％減少した（ｐ＝０．０２２）。Ｇ７－βＨ２＿ｍｔは、７．２±３．７％の細胞生存率低下を誘導したａＰＤ－Ｌ１抗体よりもわずかに有効であった（ｐ＝０．０３０）。遊離ペプチドが化学療法抵抗性に対してわずかな効果しか有さず（１．８±２．０％減少；ｐ＝０．３３４）、完全アセチル化Ｇ７デンドリマーが癌細胞に対して細胞傷害性効果を有さないことを考慮すると、この結果は、多価Ｇ７－βＨ２＿ｍｔがＰＤ－１／ＰＤＬ１免疫チェックポイントを効果的に遮断するという別の証拠の層を提供する。低レベルのＰＤ－Ｌ１を発現するＭＣＦ－７細胞も同様の傾向を示したが、差は高ＰＤ－Ｌ１発現７８６－Ｏ細胞ほど有意ではなかった。
結論として、本発明者らは、ＤＰＣアプローチが、タンパク質表面から単離されたβ－ヘアピンペプチドをナノスケールのデンドリマー上で多量体化及び立体配座安定化することを可能にし、それによって有意に増強された標的親和性を示すことを実証した。増強された結合動態は、ＤＰＣが遊離ペプチドよりも劇的に強いＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１阻害効果及びａＰＤ－Ｌ１抗体に匹敵するレベルの効率を示したｉｎ ｖｉｔｒｏ効率の有意な増強に変換された。抗体を使用するＰＤ－Ｌ１阻害は、非小肺癌、膀胱癌及びメルケル細胞皮膚癌等のいくつかの癌型の処置に有効であることが既に臨床的に証明されている。しかしながら、モノクローナル抗体に基づく現在承認されているアンタゴニストは、その高いコスト及びモジュール性の欠如のために制限がある。本発明者らの戦略は、デンドリマー－ペプチド系が免疫療法だけでなく他の抗腫瘍剤にも適応できるプラットフォーム技術を提供することから、これらの問題に対処する可能性を有する。さらに、多くのタンパク質表面上の様々なβ－ヘアピンペプチドは、このＤＰＣアプローチと適合性であり得、多様な生物医学的用途に使用される可能性を高める。この研究は、癌治療のための免疫チェックポイント遮断を含む様々な疾患に取り組むためのタンパク質相互作用の効果的な調節のための新たに操作されたペプチドナノ粒子プラットフォームを提供する。
実施例２：Ｔｒｐｚｉｐ ＤＰＣ
βヘアピンがＴｒｐｚｉｐによって安定化されると、Ｔｒｐ残基は同じペプチド表面に配置される（図２５）。したがって、ペプチドが適切な方向で表面に付着すると、Ｔｒｐクラスターの露出が妨げられ、その結果、標的結合における非特異的寄与が最小限に抑えられる。Ｔｒｐｚｉｐ－ＤＰＣハイブリッド系を開発するために、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１複合体構造及びデンドリマーコンジュゲート化プロセスを考慮してｐＬ１の一次構造を改変し（配列番号４）、配列番号５（図２６）を得た。ＰＤ－１コアに埋もれているアミノ酸残基はＰＤ－Ｌ１結合とは無関係であるので、本発明者らはそれらの一部（アルギニン、アスパラギン酸及びロイシン）をＴｒｐ残基で置換してＴｒｐｚｉｐ構造を導入した。コア残基の１つであるバリンを、デンドリマーのコンジュゲート化のためにリジンで更に置換し、これにより、ＰＤ－Ｌ１結合表面を露出させ、Ｔｒｐクラスターをナノ粒子表面（ｐＬ１ＴＺ）に面させるためのペプチドの方向性を決定する。ナノ粒子足場として、本発明者らはデンドリマーを選択した。
図２７に示すように、ｐＬ１は２００ｎｍ付近に強い負のバンドを持つランダムコイル構造に存在することが分かった。一方、ｐＬ１ＴＺのＣＤスペクトルは、２００ｎｍの負のバンド、２１５ｎｍの弱いショルダー（βシート）、及び２２８ｎｍの弱い正のバンド（Ｔｒｐ残基間の相互作用を示す励起子結合バンド）からなり、Ｔｒｐｚｉｐ形成を伴う部分的に安定化されたβヘアピン構造を示している（図２８）。興味深いことに、二次構造は、デンドリマー表面に結合したときに更に一段階安定化され、これは、２００ｎｍ及び２３０ｎｍで有意に増加したＣＤシグナルで確認された（図２９）。以前の研究における知見に基づいて、本発明者らは、この表面支援ヘアピン安定化を、排除された体積効果、すなわち、表面の存在が非秩序構造の配座空間を制限し、これが、折り畳まれていない状態のエントロピーを減少させることに起因すると考えた（図３０）。表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）分析により、安定化され多量体化されたＰＤ－Ｌ１結合ペプチドは、遊離ペプチドと比較して非常に増加したＰＤ－Ｌ１結合親和性を示すことが明らかになった（図３１）。さらに、ＤＰＣはまた、顕著に向上したＰＤ－Ｌ１選択性を明らかにし、ペプチド／デンドリマー界面空間におけるＴｒｐ残基を隠した（図３２）。
実施例３：デンドリマー－ペプチドコンジュゲートはｉｎ ｖｉｔｒｏで処置効果を改善する
ペプチドｐＰＤ１は、配列ＩＹＬＣＧＡＩＳＬＨＰＫＡＫＩＥＥＳＰＧＡ（配列番号６）を有し、これはマウスＰＤ－Ｌ１に結合する。ペプチドを、そのシステイン（Ｃ）基を介してＳＭＣＣ化学によってデンドリマーにコンジュゲートさせた。
雌Ｂａｌｂ／ｃマウス（４～６週齢）をＣｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒから得た。動物の手順及び維持は、ウィスコンシン大学の施設ガイドラインに従って実施した。４Ｔ１細胞株を各マウスの背側わき腹に皮下注射によって接種し、カリパスを使用して腫瘍体積を測定した。腫瘍が約２５０ｍｍ３の体積に達したら、マウスを群に無作為化し、処置を開始した。１００μＬの試薬を尾静脈注射によって３～４回投与した。時間の関数としての腫瘍体積及び体重を図３３及び図３４に示す マウスを、ＩＶＩＳ Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を使用して腫瘍生物発光について調べた。図３５のデータにおいて、エラーバーは平均の標準誤差を表す。
「１つの（ａ）」及び「１つの（ａｎ）」及び「その（ｔｈｅ）」という用語、ならびに同様の指示対象（特に以下の特許請求の範囲の文脈における）の使用は、本明細書で特に指示されない限り、又は文脈と明らかに矛盾しない限り、単数及び複数の両方を包含すると解釈されるべきである。本明細書で使用される場合、第１、第２等の用語は、特定の順序を示すことを意味するのではなく、単に便宜上、複数の、例えば層を示すことを意味する。「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、及び「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」という用語は、特に明記しない限り、非限定的な用語（すなわち、「～を含むが、限定されない」を意味する）として解釈されるべきである。値の範囲の列挙は、本明細書に別段の指示がない限り、その範囲内に入る各別個の値を個別に参照する簡略方法として役立つことを意図しているにすぎず、各別個の値は、あたかもそれが本明細書に個別に列挙されているかのように本明細書に組み込まれる。全ての範囲の端点は、範囲内に含まれ、独立して組み合わせることができる。本明細書に記載の全ての方法は、本明細書に別段の指示がない限り、又は文脈と明らかに矛盾しない限り、適切な順序で実施することができる。任意の及び全ての例又は例示的な言語（例えば、「等」）の使用は、単に本発明をよりよく説明することを意図しており、別段の請求がない限り、本発明の範囲を限定するものではない。本明細書のいかなる言語も、本明細書で使用される本発明の実施に不可欠な特許請求されていない要素を示すと解釈されるべきではない。
例示的な実施形態を参照して本発明を説明したが、本発明の範囲から逸脱することなく、様々な変更を行うことができ、その要素を等価物で置き換えることができることが当業者には理解されよう。さらに、本発明の本質的な範囲から逸脱することなく、特定の状況又は材料を本発明の教示に適合させるために多くの修正を行うことができる。したがって、本発明は、本発明を実施するために企図される最良の形態として開示された特定の実施形態に限定されず、本発明は、添付の特許請求の範囲内に入る全ての実施形態を含むことが意図される。その全ての可能な変形における上述の要素の任意の組み合わせは、本明細書で特に指示されない限り、又は文脈と明らかに矛盾しない限り、本発明に包含される。

Claims (31)

  1. ナノ粒子系であって、
    それにコンジュゲートされた複数のβ－ヘアピンペプチドを含む多価ナノ粒子コアを含む、ナノ粒子系。
  2. 前記多価ナノ粒子コアは、超分岐ポリマー、デンドリマー、デンドロン、ハイブリッドナノ粒子、又はミセルを含む、請求項１に記載のナノ粒子系。
  3. 前記ミセルは両親媒性デンドロンコイルを含む、請求項２に記載のナノ粒子系。
  4. 前記ハイブリッドナノ粒子は、デンドリマー－エキソソームハイブリッドを含む、請求項２に記載のナノ粒子系。
  5. 前記ハイブリッドナノ粒子は、前記β－ヘアピンペプチドを共有結合で有する多価ポリマー足場ナノ粒子コアと、前記ポリマー足場ナノ粒子コアを封入する外側シェルとを含み、前記外側シェルがリポソーム又はポリマーシェルを含む、請求項２に記載のナノ粒子系。
  6. 前記デンドリマーは、ポリ（アミドアミン）（ＰＡＭＡＭ）デンドリマー、ポリエステルデンドリマー、ポリプロピレンイミン（ＰＰＩ）デンドリマー、ジアミノブタンアミンポリプロピレンイミンテトラミン（ＤＡＢ－Ａｍ４）デンドリマー、ポリプロピルアミン（ＰＯＰＡＭ）デンドリマー（ｄｅｎｄｉｍｅｒ）、ポリリジンデンドリマー、ポリエステルデンドリマー、イプチセンデンドリマー、脂肪族ポリ（エーテル）デンドリマー、芳香族ポリエーテルデンドリマー、又はそれらの組み合わせである、請求項２に記載のナノ粒子系。
  7. 前記デンドリマーはＰＡＭＡＭデンドリマーである、請求項２に記載のナノ粒子系。
  8. 前記β－ヘアピンペプチドは、腫瘍標的化ペプチド、細胞透過性ペプチド、チェックポイント阻害剤受容体に対して高い親和性を有するβ－ヘアピンペプチド、又はタンパク質折り畳み疾患の処置のためのペプチドを含む、請求項１に記載のナノ粒子系。
  9. 前記β－ヘアピンペプチドはＴｒｐｚｉｐペプチドを含む、請求項１に記載のナノ粒子系。
  10. 前記β－ヘアピンペプチドは、高い親和性でＰＤ－Ｌ１に結合するＰＤ－１の表面ペプチド等の免疫チェックポイント阻害剤β－ヘアピンペプチドである、請求項１に記載のナノ粒子系。
  11. 前記ナノ粒子系は、治療剤、予防剤又は診断剤と更に結合している、請求項１に記載のナノ粒子系。
  12. 前記治療剤は化学療法剤又は治療用核酸である、請求項１１に記載のナノ粒子系。
  13. 前記診断剤は造影剤である、請求項１１に記載のナノ粒子系。
  14. 請求項１～１３のいずれか一項に記載のナノ粒子系と、薬学的に許容され得る賦形剤とを含む、医薬組成物。
  15. 治療剤、予防剤又は診断剤を更に含む、請求項１７に記載の医薬組成物。
  16. ナノ粒子系を作製する方法であって、
    複数のβ－ヘアピンペプチドを多価ナノ粒子コアにコンジュゲートさせ、前記ナノ粒子系を提供するのに十分な条件下で、複数の反応性末端基を含む前記多価ナノ粒子コアを、１つ以上のβ－ヘアピンペプチドを含む組成物と接触させること、を含む、方法。
  17. 前記反応性末端基は、ジシクロヘキシルカルボジイミド、ジイソプロピルカルボジイミド、Ｎ－（３－ジメチルアミノプロピル）－Ｎ'－エチルカルボジイミド、１，１'－カルボニルジイミダゾール、Ｎ－スクシンイミジルＳ－アセチルチオアセテート、Ｎ－スクシンイミジル－Ｓ－アセチルチオプロピオネート、２－メルカプトエチルアミン、スルホスクシンイミジル４－（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサン－１－カルボキシレート、スクシンイミジルヨードアセテート、スクシンイミジル３－（２－ピリジルジチオ）プロピオネート、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル、Ｎ－ヒドロキシスルホスクシンイミドエステル、Ｎ－γ－マレイミドブチリル－オキシスルホスクシンイミドエステル、ニトロフェニルエステル、テトラフルオロフェニルエステル、ペンタフルオロフェニルエステル、チオピリジルエステル、チオニトロフェニルエステル、及び前述のうちの少なくとも１つを含む組み合わせを含む、請求項１６に記載の方法。
  18. 前記多価ナノ粒子コアは、２つ以上の異なる反応性末端基を含む、請求項１６に記載の方法。
  19. 複数の反応性末端基を含む前記多価ナノ粒子コアを治療剤、予防剤又は診断剤と接触させることを更に含む、請求項１６に記載の方法。
  20. 前記多価ナノ粒子コアは、超分岐ポリマー、デンドリマー、デンドロン、ハイブリッドナノ粒子、又はミセルを含む、請求項１６に記載の方法。
  21. 前記ミセルは両親媒性デンドロンコイルを含む、請求項２０に記載の方法。
  22. 前記ハイブリッドナノ粒子は、デンドリマー－エキソソームハイブリッドを含む、請求項２０に記載の方法。
  23. 前記ハイブリッドナノ粒子は、前記免疫チェックポイント阻害剤が共有結合した多価ポリマー足場ナノ粒子コアと、前記ポリマー足場ナノ粒子コアを封入する外側シェルとを含み、前記外側シェルがリポソーム又はポリマーシェルを含む、請求項２０に記載の方法。
  24. 前記デンドリマーは、ポリ（アミドアミン）（ＰＡＭＡＭ）デンドリマー、ポリエステルデンドリマー、ポリプロピレンイミン（ＰＰＩ）デンドリマー、ジアミノブタンアミンポリプロピレンイミンテトラミン（ＤＡＢ－Ａｍ４）デンドリマー、ポリプロピルアミン（ＰＯＰＡＭ）デンドリマー（ｄｅｎｄｉｍｅｒ）、ポリリジンデンドリマー、ポリエステルデンドリマー、イプチセンデンドリマー、脂肪族ポリ（エーテル）デンドリマー、芳香族ポリエーテルデンドリマー、又は前述のうちの１つ以上を含む組み合わせである、請求項２０に記載の方法。
  25. 前記デンドリマーはＰＡＭＡＭデンドリマーである、請求項２０に記載の方法。
  26. 前記β－ヘアピンペプチドは、腫瘍標的化ペプチド、細胞透過性ペプチド、チェックポイント阻害剤受容体に対して高い親和性を有するβ－ヘアピンペプチド、又はタンパク質折り畳み疾患の処置のためのペプチドを含む、請求項１６に記載の方法。
  27. 前記β－ヘアピンペプチドは、高い親和性でＰＤ－Ｌ１に結合するＰＤ－１の表面ペプチド等の免疫チェックポイント阻害剤β－ヘアピンペプチドである、請求項１６に記載の方法。
  28. 前記β－ヘアピンペプチドはＴｒｐｚｉｐペプチドを含む、請求項１６に記載の方法。
  29. 請求項１～１３のいずれか一項に記載のナノ粒子系を、それを必要とする対象に投与することを含む、免疫療法の方法。
  30. 前記対象はヒト癌患者又は免疫障害を有するヒト患者である、請求項２９に記載の免疫療法の方法。
  31. 放射線療法、化学療法、外科手術、又は前述の少なくとも１つを含む組み合わせを投与することを更に含む、請求項２９に記載の免疫療法の方法。
JP2022523422A 2019-10-29 2020-10-29 ペプチド－ナノ粒子コンジュゲート 〔関連出願の相互参照〕 本出願は、２０１９年１０月２９日に出願されたｐｃｔ／ｕｓ２０１９／０５８４６３の一部継続出願であり、２０１９年１０月２９日に出願された米国仮出願第６２／９２７，２９３号の優先権を主張し、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。 Pending JP2023500602A (ja)

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