CN109803687A - 纳米载体向肿瘤的抗体介导的自催化靶向递送 - Google Patents

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Abstract

提供用于封装活性剂并将它递送到细胞外DNA的靶向DNA的纳米载体。纳米载体，例如聚合物颗粒、脂质体以及多层囊泡，具有与其缀合的靶向DNA的靶向部分。靶向DNA的该靶向部分通常是结合于DNA或核小体的抗体或由其衍生的变异体、片段或融合蛋白。该靶向部分可以是结合DNA的循环自身抗体，如通常在患有SLE的患者中所发现的那些。在一些实施例中，该靶向部分是抗体3E10或由其衍生的变异体、片段或融合蛋白。还提供了药物组合物、使用方法以及给药方案。

Description

纳米载体向肿瘤的抗体介导的自催化靶向递送
相关申请的交叉引用
本申请要求2016年6月15日提交的U.S.S.N.62/350,423的权益和优先权，其以全文引用的方式并入本文中。
序列表的参考
序列表以名为“YU_7013_PCT_ST25.txt”的文本文件形式提交，该文本文件创建于2017年6月15日并且具有23,726个字节的大小，该序列表依据37 C.F.R§1.52(e)(5)以引用的方式并入本文中。
技术领域
本发明的领域大体上是靶向药物递送领域，特别是将药物递送到细胞外DNA的位点，例如在肿瘤中和肿瘤附近发现的那些位点、受伤和损伤部位、缺血组织以及感染部位。
背景技术
第一种纳米药物是脂质体纳米载体中的阿霉素(doxorubicin，DOX)制剂，于1995年被FDA批准用于治疗患有艾滋病相关卡波西肉瘤(AIDS-related Kaposi'ssarcoma)的人类患者(Barenholz等人,《控制释放杂志：控制释放协会官方杂志》(Journalof Controlled Release:Official Journal of the Controlled Release Society),160(2):117-134(2012))。从那时起，用于递送化疗药的纳米载体的开发已成为癌症药物开发的有前景的方法。与游离药物相比，纳米载体的使用具有许多优点。例如，纳米载体允许递送原本不能直接施用的疏水性或毒性药物。纳米载体还能为本身会被循环中的ATP结合盒(ATP-binding cassette，ABC)转运蛋白降解或消除的药物提供保护。此外，肿瘤(40-80nm)与健康组织(<8nm)中的内皮间连接(interendothelial junction)之间的大小差异以及肿瘤中的淋巴引流功能缺陷会产生高渗透长滞留(enhanced permeability and retention，EPR)效应(Jain,《癌转移评论》(Cancer Metastasis Rev),6(4):559-593(1987))，因为该EPR效应，所以纳米载体的使用改变了化疗药的生物分布并导致药物优先在肿瘤中积累。然而，这种基于EPR效应的被动靶向方法可能不足以在癌症治疗中产生有意义的收益(Chauhan等人,《自然·材料》(Nat Mater),12(11):958-962(2013))。
为了进一步提高靶向效率，可以通过与对癌细胞或肿瘤新血管系统或肿瘤微环境中过表达的分子具有高亲和力的配体缀合来改造纳米载体。例如，S,S-2-[3-[5-氨基-1-羧基戊基]-脲基]-戊二酸(ACUPA)靶向前列腺特异性膜抗原(prostate-specific membraneantigen，PSMA)(Hrkach等人,《科学·转化医学》(Sci Transl Med),4(128):128ra139(2012))；iRGD靶向肿瘤新血管系统中的αυ整联蛋白(Sugahara等人,《癌细胞》(CancerCell),16(6):510-520(2009)；Zhou等人,《生物材料》(Biomaterials),33(2):583-591(2012))；并且氯毒素(chlorotoxin，CTX)靶向基质金属蛋白酶-2(matrixmetalloproteinase-2，MMP2)(Han等人,《美国化学学会·纳米》(ACS Nano),10(4):4209-4218(2016))。ACUPA缀合的纳米医学和iRGD缀合的纳米医学已经成功地进入临床试验并且证明了改善的功效(Chow等人,《科学·转化医学》,5(216):216rv214(2013)；Service等人,《科学》(Science),330(6002):314-315(2010))。尽管如此，这些传统的靶向方法还是会受到显著的限制：随着杀死肿瘤细胞和新血管系统的化疗剂的递送，可用于靶向递送的分子的量随时间减少；因此，肿瘤中纳米颗粒积累的效率下降。在过去几年中，已经进行了许多尝试来克服这种限制，包括努力采用单独的纳米颗粒制剂，通过诱导凝血级联而在体内进行通信(von Maltzahn等人,《自然·材料》,10(7):545-552(2011))。然而，这种系统的复杂性可能限制在临床中应用该技术的能力。需要将纳米载体靶向肿瘤的替代策略，以帮助将纳米医学方法转化为临床上有意义的疗法。
本发明的目的是提供鉴定、诊断和治疗疾病与病症的组合物、试剂盒和方法。
发明内容
提供用于封装活性剂并将它递送到细胞外DNA的靶向DNA的纳米载体。纳米载体，例如聚合物颗粒、脂质体和多层囊泡，具有靶向与其缀合的DNA的靶向部分。靶向DNA的靶向部分通常是抗体或由其衍生的变异体、片段或融合蛋白，其结合于DNA或核小体或其组分或DNA的前体，如核苷酸、核苷、核碱基。例如，靶向DNA的靶向部分可以是可变片段(Fv)。在一个实例中，Fv是scFv、di-scFv或tri-scFv。例如，Fv是scFv。在一个实例中，Fv是di-scFv。在一个实例中，Fv是tri-scFv。
该靶向部分可以是结合DNA的循环自身抗体，如通常在患有SLE的患者中所发现的那些。在一些实施例中，该靶向部分是抗体3E10或5C6，或由其衍生的变异体、片段或融合蛋白。例如，该靶向部分是具有包括如SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列的VH和包括SEQ IDNO:3中所示的氨基酸序列的VL的抗体(3E10)或具有包括如SEQ ID NO:14中所示的氨基酸序列的VH和包括SEQ ID NO:18中所示的氨基酸序列的VL的抗体(5C6)，或其变异体、片段、融合蛋白。例如，该靶向部分是具有包括如SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列的VH和包括SEQ ID NO:3中所示的氨基酸序列的VL的抗体，或其变异体、片段、融合蛋白。该靶向部分是具有包括如SEQ ID NO:14中所示的氨基酸序列的VH和包括SEQ ID NO:18中所示的氨基酸序列的VL的抗体，或其变异体、片段、融合蛋白。在另一个实例中，该靶向部分是3E10或5C6的人源化形式或嵌合形式。
该靶向部分可以是Fab、(Fab')2、微型抗体(minibody)、VL、VH、scFv-Fc、双功能抗体(diabody)、三功能抗体(triabody)、四功能抗体(tetrabody)，或抗体3E10或5C6或其变异体的其它组分或衍生物。该靶向部分可以是可变片段。例如，该靶向部分可以是抗体3E10或5C6或其变异体的单价、二价或三价单链可变片段(scFV)。在一些实施例中，scFV包括具有选自SEQ ID NO:1或2或18的氨基酸序列的重链和具有SEQ ID NO:3或14的氨基酸序列的轻链。在特定实施例中，该靶向部分包括SEQ ID NO:11、12或13的氨基酸序列。
在一些实施例中，该靶向部分能够被释放在靶位点并用作活性剂。例如，该靶向部分可以用能够在谷胱甘肽存在下裂解的二硫键连接到纳米载体上，谷胱甘肽例如可以在肿瘤微环境中发现。在特定实施例中，所释放的活性剂是抗体3E10或5C6，或由其衍生的片段、变异体或融合蛋白。
在一些实施例中，纳米载体是聚合物纳米颗粒。聚合物纳米颗粒可以由一种或多种生物可降解的聚酯或聚酸酐形成，例如聚(乳酸)、聚(乙醇酸)或聚(乳酸-共-乙醇酸)。在一个特定实施例中，聚合物纳米颗粒由PLGA-聚(ε-苄氧羰基-L-赖氨酸)(PLL)形成。
纳米载体通常具有封装在其中的一种或多种活性剂。例如，活性剂可以是抗血管生成剂、抗增殖剂、化疗剂、细胞毒性剂、抗体或其片段或变异体、放射增敏剂、放射性同位素、治疗蛋白、治疗基因、siRNA、适体(aptamer)、寡核苷酸、反义寡核苷酸、基因修饰剂、基因表达修饰剂或其组合。在另一个实例中，活性剂是PARP抑制剂。例如，PARP抑制剂可以是奥拉帕尼(Olaparib)(C24H23FN4O3)。
还提供了药物组合物，其包括有效量的纳米载体和药学上可接受的载体，用于向有此需要的受试者施用。还公开了通过向有此需要的受试者施用有效量的纳米载体来治疗该受试者的方法，通常是以药物组合物的形式施用。在一些实施例中，该受试者具有癌症、缺血或受伤或感染或遗传病或自身免疫病。活性剂可以基于预期的治疗、诊断或预防用途来加以选择。例如，当治疗癌症时，活性剂可以是抗血管生成剂、抗增殖剂、化疗剂、细胞毒性剂、放射增敏剂或其组合。为了治疗缺血，活性剂可以增加血流，减少凝血，诱导动脉扩张，诱导或增加血栓溶解，保护并延长缺血区域的细胞存活，或其组合。为了治疗受伤，活性剂可以是止痛剂、麻醉剂、消炎剂、抗感染剂、细胞因子、趋化因子、免疫调节剂、促进伤口愈合的试剂、保护并延长受伤区域的细胞存活的试剂或其组合。为了治疗感染，活性剂可以是抗微生物剂、抗病毒剂、抗细菌剂、抗生素、抗体或其片段或变异体、止痛剂、麻醉剂、消炎剂、抗感染剂、细胞因子、趋化因子、免疫调节剂、促进伤口愈合的试剂、保护并延长感染区域的细胞存活的试剂或其组合。
还提供给药方案。在一些实施例中，按几小时、几天或几周的时间间隔向受试者施用组合物两次或更多次。以下实例证明，当活性剂是在癌症背景下递送的化疗剂时，随着活性剂诱导更多细胞死亡并因此在靶位点处诱导更多细胞外DNA，治疗的有效性随后续施用而改善。在一个特定实施例中，给药方案包括相隔至少一天的二、三、四、五次或更多次施用包括纳米载体的药物组合物。
还提供了检测癌症、组织损伤、受伤或缺血的部位的方法。方法通常包括向有此需要的受试者施用有效量的在药学上可接受的载体中的靶向纳米载体。纳米载体通常加载有可使用诊断成像或核医疗学技术检测的试剂，例如通过PET-CT、骨扫描、MRI、CT、超声波心动描记术(echocardiography)、超声波或x射线来检测。
附图说明
图1A是显示如通过动态光散射(dynamic light scattering，DLS)所测定的纳米颗粒(裸纳米颗粒、DOX-NP、3E10EN-NP、3E10EN/DOX-NP)的流体力学直径(hydrodynamicdiameter)的条形图。图1B是显示DOX-NP和3E10EN/DOX-NP的控制DOX释放曲线的线图。图1C是显示纳米颗粒对4T1鼠乳腺癌细胞活力的影响的线图。将细胞用单独的DOX、DOX-NP、3E10EN-NP或3E10EN/DOX-NP处理三天，然后通过MTT分析评估存活率。显示细胞活力百分比。
图2是显示与A载玻片结合的纳米颗粒的定量分析(荧光强度)的条形图，该载玻片涂有线性化质粒DNA，与含或不含表面3E10EN的纳米颗粒一起孵育。出于检测的目的，用IR780封装纳米颗粒。在与纳米颗粒一起孵育60分钟后，漂洗载玻片，并通过成像系统观测与纳米颗粒的量相关的IR780的信号。***：P<0.001
图3是显示如通过Picogreen染色所测定的正常组织以及有和没有用3E10EN/DOX-NP处理的4T1肿瘤中的exDNA的相对量(荧光强度)的条形图。未处理过的肿瘤中的exDNA的量是肝脏、心脏和肌肉中的exDNA的量的7.5倍、11.7倍和2.5倍。与未处理过的小鼠中的肿瘤相比，用3E10EN/DOX-NP处理小鼠使肿瘤中的exDNA的量增加5.1倍。存在于指定组织(n＝5)中的exDNA以平均值+/-SD表示。**：P<0.01。***：P<0.001。
图4是显示从静脉内施用有或没有3E10EN缀合的加载有IR780的纳米颗粒后24小时从4T1荷瘤小鼠切除并使用IVIS成像系统成像的肿瘤的荧光强度的条形图。来自接受预激处理(priming treatment)的小鼠的肿瘤中的纳米颗粒的平均量是来自没有预激的小鼠的肿瘤中的量的1.8倍。通过预激，纳米颗粒在肿瘤中的积累达到了肝脏中的积累的4.1倍，是接受裸NP处理的小鼠的0.5倍。指定纳米颗粒在肿瘤中的积累的定量分析(n＝4)，其中*和#分别表示NP w/3E10组与NP w/o 3E10组之间以及NP w/3E10与预激组和NP w/3E10组之间的统计分析。*和#：P<0.05，**和##：P<0.01。
图5是显示纳米颗粒对4T1肿瘤生长的影响的肿瘤体积生长曲线(肿瘤体积(mm3))。通过静脉内注射对照PBS、游离DOX、DOX-NP、3E10EN-NP或3E10EN/DOX-NP，每周处理携带约100mm3大小的4T1肿瘤的小鼠三次(每组n＝7只小鼠)，并且每周测量三次肿瘤体积并将肿瘤体积绘制成如图所示。
图6是来自具有转移性黑素瘤脑肿瘤的小鼠的一对脑部图像，其通过IVIS成像来检测纳米颗粒中的IR780信号。对照小鼠图像来自用对照纳米颗粒处理的小鼠，对照纳米颗粒加载有IR780，但缺少表面3E10EN。3E10EN图像来自用加载有IR780并具有表面缀合的3E10EN的纳米颗粒处理的小鼠。
图7是来自具有U87成胶质细胞瘤脑肿瘤的小鼠的一对脑部图像，其通过IVIS成像来检测纳米颗粒中的IR780信号。对照小鼠图像来自用对照纳米颗粒处理的小鼠，对照纳米颗粒加载有IR780，但缺少表面3E10EN。3E10EN图像来自用加载有IR780并具有表面缀合的3E10EN的纳米颗粒处理的小鼠。
图8是来自具有由大脑中动脉阻塞(middle cerebral artery occlusion)诱发的中风的小鼠的一对脑部图像。对照小鼠图像来自用对照纳米颗粒处理的小鼠，对照纳米颗粒加载有IR780，但缺少表面3E10EN。3E10EN图像来自用加载有IR780并具有表面缀合的3E10EN的纳米颗粒处理的小鼠。
图9是显示有和没有3E10EN的缀合的DOX-NP的血液浓度随时间变化的线图。
具体实施方式
I.定义
如本文中所使用的术语“3E10”是指由ATCC登录号PTA 2439杂交瘤所产生的单克隆抗体。
如本文中所使用的术语“5C6”是指具有溶核活性(nucleolytic activity)的单克隆抗DNA抗体，其由来自MRL/lpr狼疮小鼠模型的杂交瘤产生，如Noble等人,2014,《科学报告》(Sci Rep)4:5958 doi:10.1038/srep05958中所述。
如本文中所使用，如本文中所使用的术语“单链Fv”或“scFv”意指单链可变片段，其在单一多肽链中包括通过连接子(linker)连接的轻链可变区(VL)和重链可变区(VH)，该连接子使得scFv能够形成抗原结合所期望的结构(即，单一多肽链的VH和VL相互缔合形成Fv)。VL和VH区域可以衍生自亲本抗体或可以化学方式或以重组方式合成。
如本文中所使用的术语“可变区”旨在将免疫球蛋白的这种结构域与由抗体所广泛共用的结构域(如抗体Fc结构域)区分开来。可变区包括“高变区”，其残基负责抗原结合。高变区包括来自“互补决定区”或“CDR”的氨基酸残基(即，通常大致在轻链可变结构域中的残基24-34(L1)、50-56(L2)和89-97(L3)处和大致在重链可变结构域中的残基27-35(H1)、50-65(H2)和95-102(H3)处；Kabat等人,《免疫学感兴趣的蛋白质的序列》(Sequences ofProteins of Immunological Interest),第5版.马里兰州贝塞斯达的美国国立卫生研究院的公共卫生服务部(Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD.)(1991))和/或来自“高变环”的那些残基(即，轻链可变结构域中的残基26-32(L1)、50-52(L2)和91-96(L3)和重链可变结构域中的残基26-32(H1)、53-55(H2)和96-101(H3)；Chothia和Lesk,1987,《分子生物学杂志》(J.Mol.Biol.)196:901-917)。
如本文中所使用的术语“构架区(Framework Region)”或“FR”残基是除了如本文中所定义的高变区残基外的那些可变结构域残基。
如本文中所使用的术语“抗体”是指结合靶抗原的天然或合成抗体。该术语包括多克隆抗体和单克隆抗体。除了完整免疫球蛋白分子之外，术语“抗体”还包括结合靶抗原的那些免疫球蛋白分子和人类或人源化形式的免疫球蛋白分子的片段或聚合物。
如本文中所使用的术语“细胞渗透性抗DNA抗体”是指被转运到活的哺乳动物细胞的细胞核中并结合DNA(例如，单股和/或双股DNA)的抗体或其抗原结合片段或分子。在一个实施例中，细胞渗透性抗DNA抗体在没有载体或缀合物的帮助下被转运到细胞的细胞核中。在另一个实施例中，细胞渗透性抗DNA抗体与细胞渗透部分缀合，细胞渗透部分例如细胞渗透肽。所属领域的技术人员应了解，术语“细胞渗透”在本公开的上下文中可以用于指具有靶向DNA的靶向部分的其它颗粒，如scFv。例如，该术语可以用于指在没有载体或缀合物的帮助下被转运到细胞的细胞核中并结合DNA(例如，单股和/或双股DNA)的scFv。
如本文中所使用的术语“特异性结合”是指抗体与其同源抗原(cognate antigen)(例如DNA)结合而不与其它抗原显著结合。抗体优选以大于约105mol-1(例如，106mol-1、107mol-1、108mol-1、109mol-1、1010mol-1、1011mol-1和1012mol-1或更大)的对抗原的亲和力常数(Ka)而与该第二分子“特异性结合”。
如本文中所使用的术语“单克隆抗体”或“MAb”是指从基本上同质的抗体群体获得的抗体，即，在除了可能存在于抗体分子的一小个子组中的可能天然存在的突变之外都相同的群体内的个别抗体。
如本文中所使用的术语“DNA修复”是指细胞鉴别和校正DNA分子损伤的过程的集合。单股缺陷通过碱基切除修复(base excision repair，BER)、核苷酸切除修复(nucleotide excision repair，NER)或错配修复(mismatch repair，MMR)来修复。双股断裂通过非同源末端连接(non-homologous end joining，NHEJ)、微同源介导的末端连接(microhomology-mediated end joining，MMEJ)或同源重组来修复。DNA损伤后，细胞周期检查点被激活，它们暂停细胞周期，使细胞有时间修复损伤，然后继续分裂。检查点介体蛋白质包括BRCA1、MDC1、53BP1、p53、ATM、ATR、CHK1、CHK2以及p21。
如本文中所使用的术语“受损的DNA修复”是指这样一种状态，其中与野生型细胞相比，突变细胞或具有改变的基因表达的细胞不能修复DNA或具有降低的一种或多种DNA修复途径的活性或效率或需要更长的时间来修复其DNA损伤。
如本文中所使用的术语“化学敏感性”是指癌细胞对抗癌药物的作用的相对易感性。癌细胞的化学敏感性越高，杀死该细胞所需的抗癌药物就越少。
如本文中所使用的术语“辐射敏感性”是指细胞对电离辐射的有害作用的相对易感性。细胞的辐射敏感性越高，杀死该细胞所需的辐射就越少。一般来说，已发现细胞辐射敏感性与细胞分裂速率成正比，并且与细胞的DNA修复能力成反比。
如本文中所使用的术语“抗辐射”是指当暴露于临床合适的辐射剂量时不会死亡的细胞。
如本文中所使用的术语“赘生性细胞(neoplastic cell)”是指经历异常细胞增殖(“瘤形成”)的细胞。赘生性细胞的生长超过其周围的正常组织的生长并且与其周围的正常组织的生长不协调。即使在刺激停止后，该生长通常仍以相同的过度方式持续，并且通常导致肿瘤的形成。
如本文中所使用的术语“肿瘤”或“赘生物”是指含有赘生性细胞的异常组织块。赘生物和肿瘤可能是良性的、恶化前的或恶性的。
如本文中所使用的术语“癌症”或“恶性赘生物”是指显示出不受控制的生长和分裂、侵入相邻组织并且经常转移到身体的其它位置的细胞。
如本文中所使用的术语“抗赘生性”是指组合物，如药物或生物制剂，能够抑制或预防癌症生长、侵入和/或转移。
如本文中所使用的术语“抗癌部分”是指任何能够与所公开的抗DNA抗体组合来增强抗体的抗癌特性的试剂，如肽、蛋白质、核酸或小分子。该术语包括抗赘生性药物、结合和抑制癌细胞中的其它治疗靶标的抗体以及对癌细胞具有亲和力以定向靶向癌细胞的物质。
如本文中所使用的术语“病毒转化的细胞”是指已用病毒感染或已将病毒的DNA或RNA并入其基因组中的细胞。该病毒可以是急性转化或缓慢转化的致癌病毒。在急性转化的病毒中，病毒颗粒携带编码过度活跃的癌基因的基因，该过度活跃的癌基因称为病毒癌基因(viral-oncogene，v-onc)，并且一旦表达v-onc，就会转化感染的细胞。相反，在缓慢转化的病毒中，病毒基因组被插入宿主基因组中的原癌基因附近。示范性肿瘤病毒(oncovirus)包括人类乳头瘤病毒(Human papillomavirus，HPV)、乙型肝炎(Hepatitis B，HBV)、丙型肝炎(Hepatitis C，HCV)、人类嗜T淋巴细胞病毒(Human T-lymphotropic virus，HTLV)、卡波西肉瘤相关疱疹病毒(HHV-8)、梅克尔细胞多瘤病毒(Merkel cell polyomavirus)、埃-巴二氏病毒(Epstein-Barr virus，EBV)、人类免疫缺陷病毒(Human immunodeficiencyvirus，HIV)以及人类巨细胞病毒(Human cytomegalovirus，CMV)。
如本文中所使用的“病毒感染的细胞”是指已暴露于病毒或用病毒感染或携带病毒遗传物质RNA或DNA的细胞。该病毒可以是致癌病毒或裂解病毒(lytic virus)或潜伏病毒，并且可以导致癌症、免疫缺陷、肝炎、脑炎、肺炎、呼吸道疾病或其它疾病病状。先前已经表明，逆转录病毒，特别是HIV，部分依赖于碱基切除修复(BER)途径来整合到宿主DNA中。3E10抑制DNA修复的能力提供了一种机制，这种机制使得3E10和其它抗DNA抗体能够改善由病毒引起的疾病，特别是通过干扰DNA修复，从而阻断作为病毒生命周期的一部分以及作为细胞的病毒感染的一部分的DNA或RNA代谢。
如本文中所使用的术语“抑制”意指降低活性、反应、病状、疾病或其它生物学参数。这可以包括但不限于活性、反应、病状或疾病的完全消除。这还可以包括：例如，与天然或对照水平相比，活性、反应、病状或疾病降低10％。因此，该降低可以是与天然或对照水平相比，降低10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或其间的任何降低量。
如本文中所使用的术语“融合蛋白”是指通过两个或更多个多肽的连接而形成的多肽，这两个或更多个多肽的连接是通过在一个多肽的氨基端与另一个多肽的羧基端之间形成的肽键，或通过将一个多肽与另一个多肽通过氨基酸侧链之间的反应(例如每个多肽上的半胱氨酸残基之间的二硫键)而连接。融合蛋白可以通过组成性多肽的化学偶合形成，或者可以从编码单一连续融合蛋白的核酸序列表达为单一多肽。可以使用分子生物学中的常规技术来制备融合蛋白，将两个基因框内连接成单一核酸序列，然后在产生融合蛋白的条件下在合适的宿主细胞中表达核酸。
如本文中所使用的术语“变异体”是指与参考多肽或多核苷酸不同但保留基本特性的多肽或多核苷酸。多肽的典型变异体与另一个参考多肽在氨基酸序列上是不同的。一般来说，差异是有限的，因此参考多肽的序列与变异体的序列总体上非常相似并且在许多区域中是相同的。变异体和参考多肽可以通过一个或多个修饰(例如，取代、添加和/或缺失)而在氨基酸序列上不同。所取代或插入的氨基酸残基可以是或可以不是由遗传密码编码的氨基酸残基。多肽的变异体可以是天然存在的，如等位基因变异体，或其可以是已知非天然存在的变异体。
可以在本公开的多肽的结构中进行修饰和改变，并且仍然获得具有与多肽相似的特征的分子(例如，保守氨基酸取代)。举例来说，某些氨基酸可以取代序列中的其它氨基酸，而无明显的活性损失。因为是多肽的相互作用能力和性质限定了多肽的生物功能活性，所以可以在多肽序列中进行某些氨基酸序列取代，尽管如此，还是获得了具有类似特性的多肽。
在进行此类改变时，可以考虑氨基酸的亲水指数。氨基酸的亲水指数在赋予多肽相互作用生物功能方面的重要性是所属领域中通常所理解的。已知某些氨基酸可以取代具有相似亲水指数或分数的其它氨基酸并且仍然产生具有相似生物活性的多肽。每种氨基酸都基于其疏水性和电荷特征而被分配一个亲水指数。那些指数是：异亮氨酸(+4.5)；缬氨酸(+4.2)；亮氨酸(+3.8)；苯丙氨酸(+2.8)；半胱氨酸/胱氨酸(+2.5)；蛋氨酸(+1.9)；丙氨酸(+1.8)；甘氨酸(-0.4)；苏氨酸(-0.7)；丝氨酸(-0.8)；色氨酸(-0.9)；酪氨酸(-1.3)；脯氨酸(-1.6)；组氨酸(-3.2)；谷氨酸(-3.5)；谷氨酰胺(-3.5)；天冬氨酸(-3.5)；天冬酰胺(-3.5)；赖氨酸(-3.9)；以及精氨酸(-4.5)。
公认氨基酸的相对亲水特征决定了所得多肽的二级结构，所得多肽的二级结构又限定了该多肽与其它分子的相互作用，其它分子例如酶、底物、受体、抗体、抗原以及辅因子。所属领域中已知，氨基酸可以被具有相似亲水指数的另一个氨基酸取代并且仍然获得在功能上等同的多肽。在这些变化中，亲水指数在±2之内的氨基酸取代是优选的，亲水指数在±1之内的氨基酸取代是特别优选的，并且亲水指数在±0.5之内的氨基酸取代是甚至更特别优选的。
类似氨基酸的取代也可以基于亲水性进行，特别是在由此产生的生物功能等同多肽或肽打算用于免疫学实施例的情况下。给氨基酸残基分配以下亲水性值：精氨酸(+3.0)；赖氨酸(+3.0)；天冬氨酸(+3.0±1)；谷氨酸(+3.0±1)；丝氨酸(+0.3)；天冬酰胺(+0.2)；谷氨酰胺(+0.2)；甘氨酸(0)；脯氨酸(-0.5±1)；苏氨酸(-0.4)；丙氨酸(-0.5)；组氨酸(-0.5)；半胱氨酸(-1.0)；蛋氨酸(-1.3)；缬氨酸(-1.5)；亮氨酸(-1.8)；异亮氨酸(-1.8)；酪氨酸(-2.3)；苯丙氨酸(-2.5)；色氨酸(-3.4)。应理解，氨基酸可以取代具有相似亲水性值的另一种氨基酸，并且仍然获得生物学上等同的，特别是免疫学上等同的多肽。在这些变化中，亲水性值在±2之内的氨基酸取代是优选的，亲水性值在±1之内的氨基酸取代是特别优选的，并且亲水性值在±0.5之内的氨基酸取代是甚至更特别优选的。
如上文所概述，氨基酸取代一般是基于氨基酸侧链取代基的相对相似性，例如其疏水性、亲水性、电荷、大小等。考虑了各种前述特征的示范性取代是所属领域的技术人员众所周知的并且包括(原始残基：示范性取代)：(Ala：Gly、Ser)、(Arg：Lys)、(Asn：Gln、His)、(Asp：Glu、Cys、Ser)、(Gln：Asn)、(Glu：Asp)、(Gly：Ala)、(His：Asn、Gln)、(Ile：Leu、Val)、(Leu：Ile、Val)、(Lys：Arg)、(Met：Leu、Tyr)、(Ser：Thr)、(Thr：Ser)、(Tip：Tyr)、(Tyr：Trp、Phe)以及(Val：Ile、Leu)。此公开的实施例因此涵盖如上文所阐述的多肽的功能或生物等同物。具体来说，多肽的实施例可以包括与感兴趣的多肽具有约50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更大的序列同一性的变异体。
如本文中所使用的术语“序列同一性百分比(％)”被定义为是在比对序列并且在必要时引入空隙以实现最大的序列同一性百分比之后，候选序列中与参考核酸序列中的核苷酸或氨基酸相同的核苷酸或氨基酸的百分比。出于测定序列同一性百分比的目的而进行的比对可以按所属领域的技术范围内的各种方式实现，例如使用公开可用的计算机软件，如BLAST、BLAST-2、ALIGN、ALIGN-2或Megalign(DNASTAR)软件。用于测量比对的适当参数，包括在所比较的序列的全长上实现最大比对所需的任何算法，可以通过已知方法确定。
出于本文的目的，给定核苷酸或氨基酸序列C相对于、与或针对给定核酸序列D的序列同一性％(其或者可以表达为相对于、与或针对给定序列D具有或包括一定的序列同一性％的给定序列C)计算如下：
100乘以分数W/Z，
其中W是通过序列比对程序在该程序的C和D比对中被评定为相同匹配的核苷酸或氨基酸的数量，并且其中Z是D中的核苷酸或氨基酸的总数。应了解，在序列C的长度不等于序列D的长度的情况下，C相对于D的序列同一性％将不等于D相对于C的序列同一性％。
如本文中所使用，如本文中所使用的术语“生物相容性”是指本身对宿主(例如动物或人类)无毒，也不会在宿主中以产生有毒浓度的单体亚基或寡聚亚基或其它副产物的速率降解(如果材料降解的话)的一种或多种材料。
如本文中所使用的术语“生物可降解”意指材料降解或分解成其组成亚基，或例如通过生化过程将材料消化成较小的(例如非聚合)亚基。
如本文中所使用的术语“持续释放(sustained release)”是指物质在一段延长的时间内释放，与大丸剂(bolus)类施用形成对比，在大丸剂类施用中，将全部的量的物质同时变成生物学上可用的。
如本文中所使用的术语“颗粒”是指任何由治疗剂、诊断剂或预防剂形成的颗粒；上面连接着该治疗剂、诊断剂或预防剂或与该治疗剂、诊断剂或预防剂连接的颗粒；或并入了该治疗剂、诊断剂或预防剂的颗粒。在一个实例中，颗粒是结合蛋白。举例来说，颗粒可以是抗体。在另一个实例中，颗粒是Fv，如scFv。
如本文中所使用的术语“纳米颗粒”一般是指直径从约10nm一直到(但不包括)约1微米或从100nm到约1微米的颗粒。颗粒可以具有任何形状。具有球形形状的纳米颗粒一般被称为“纳米球”。
如本文中所使用的术语“微球”是本领域公认的，并且包括由大小在从约1微米或大于1微米一直到约1000微米的范围内的生物相容性聚合物形成的大体上球形胶体结构。一般来说，“微胶囊”也是本领域公认的术语，其与微球的区别在于其由核和壳形成。术语“微粒”也是本领域公认的，并且包括微球和微胶囊，以及可能不容易放入以上两个类别中的任一个中的结构，平均尺寸全部小于约1000微米。如果结构的直径小于约1微米，那么可以使用相应的本领域公认的术语“纳米球”、“纳米胶囊”以及“纳米颗粒”。在某些实施例中，纳米球、纳米胶囊以及纳米颗粒的平均直径是约500nm、200nm、100nm、50nm、10nm或1nm。
含有微粒或纳米颗粒的组合物可以包括一系列粒度的颗粒。在某些实施例中，粒度分布可以是均一的，例如，在平均体积直径的小于约20％标准偏差之内，并且在其它实施例中，还要更均一，例如，在中值体积直径的约10％之内。
如本文中所使用的短语“平均粒度”一般是指颗粒群体中的颗粒的统计平均粒度(直径)。基本上球形的颗粒的直径可以指物理直径或流体力学直径。非球形颗粒的直径可以指流体力学直径。如本文中所使用的非球形颗粒的直径可以指颗粒表面上的两点之间的最大直线距离。平均粒度可以使用所属领域中已知的方法，如动态光散射来测量。
如本文中所使用的短语“单分散”和“均匀大小分布”可互换使用并且描述的是所有颗粒的大小都相同或几乎相同的纳米颗粒或微粒群体。如本文中所使用的单分散分布是指这样的颗粒分布，其中该分布的90％处于中值粒度的15％以内，或处于中值粒度的10％以内，或处于中值粒度的5％以内。
除非另外规定，否则如本文中所使用的“分子量”一般是指本体聚合物的相对平均链长。在实践中，分子量可以使用各种方法，包括凝胶渗透色谱法(gel permeationchromatography，GPC)或毛细管粘度测定法来估计或表征。GPC分子量报告为与数均分子量(Mn)相对的重均分子量(Mw)。毛细管粘度测定法按使用一组特定的浓度、温度和溶剂条件从聚合物稀溶液测定的固有粘度来提供分子量的估计值。
如本文中所使用的术语“靶向部分”是指定位到特定区域或远离特定区域的部分。该部分可以是例如蛋白质、核酸、核酸类似物、碳水化合物或小分子。该实体可以是例如治疗化合物，如小分子；或诊断实体，如可检测标记。该区域可以是组织、特定细胞类型或亚细胞区室。在一个实施例中，靶向部分指导活性实体的定位。该活性实体可以是小分子、蛋白质、聚合物或金属。该活性实体可用于治疗、预防或诊断目的。
如本文中所使用的短语“药物学上可接受的”是指在合理的医学判断范围内，适用于与人类和动物的组织接触而没有过多毒性、刺激、过敏反应或其它问题或并发症，与合理的效益/风险比相称的组合物、聚合物以及其它材料和/或剂型。
如本文中所使用的短语“药学上可接受的载体”是指在将任何主题组合物从一个器官或身体部分携带或转运到另一个器官或身体部分的过程中所涉及的药学上可接受的材料、组合物或媒剂，如液体或固体填料、稀释剂、溶剂或封装材料。在与主题组合物的其它成分相容并且对患者无害的意义上，每种载体必须是“可接受的”。
如本文中所使用的短语“药学上可接受的盐”是本领域公认的，并且包括化合物的相对无毒的无机酸和有机酸加成盐。药学上可接受的盐的实例包括衍生自无机酸的盐和衍生自有机酸的盐，无机酸例如盐酸和硫酸，有机酸例如乙磺酸、苯磺酸、对甲苯磺酸。用于形成盐的合适的无机碱的实例包括氨、钠、锂、钾、钙、镁、铝以及锌的氢氧化物、碳酸盐以及碳酸氢盐。盐还可以用合适的有机碱形成，合适的有机碱包括无毒并且强度足以形成这种盐的有机碱。
如本文中所使用的术语“个体”、“宿主”、“受试者”以及“患者”可互换使用，是指任何作为施用或治疗靶标的个体。受试者可以是脊椎动物，例如哺乳动物。因此，受试者可以是人类或家畜患者。
如本文中所使用的术语“治疗”是指患者的医学管理，其旨在治愈、改善、稳定或预防疾病、病理性病状或病症。这一术语包括积极治疗，即专门针对疾病、病理性病状或病症的改善而进行的治疗，并且还包括病因治疗，即针对相关疾病、病理性病状或病症的原因的去除而进行的治疗。另外，这一术语包括缓解性治疗，即为了缓解症状而非治愈疾病、病理性病状或病症而设计的治疗；预防性治疗，即为了最小化或部分或完全抑制相关疾病、病理性病状或病症的发展而进行的治疗；以及支持性治疗，即为了补充针对相关疾病、病理性病状或病症的改善的另一种特定疗法而采用的治疗。
如本文中所使用的术语“治疗有效量”是指当并入本文中所描述的颗粒中和/或颗粒上时，以适用于任何医药治疗的合理效益/风险比产生一定的所期望的作用的治疗剂的量。有效量可以取决于例如以下因素而变化：待治疗的疾病或病状、待施用的特定靶向构建体、受试者的体型、或疾病或病状的严重程度。所属领域的普通技术人员可凭经验确定特定化合物的有效量，不需要进行过多实验。在一些实施例中，术语“有效量”是指用于减少或减轻一种或多种脑部疾病或病症的症状的治疗剂或预防剂的量，例如用于减小肿瘤大小(例如，肿瘤体积)或减少或减轻神经病症的一种或多种症状，如记忆或学习能力缺失、震颤或摇晃等。在其它实施例中，“有效量”是指修复受损神经元和/或诱导神经元再生所必需的治疗剂的量。
如本文中所使用的术语“并入”和“封装”是指将活性剂并入、配制或以其它方式包括到能够在所期望的应用中释放、例如持续释放该试剂的组合物中和/或该组合物上。该术语考虑了将治疗剂或其它材料并入聚合物基质中的任何方式，包括例如：与这种聚合物的单体连接(通过共价、离子或其它结合相互作用)；物理混合；在聚合物涂层中包封该试剂；以及使这种单体成为聚合的一部分以得到聚合物制剂；分布在整个聚合物基质中；附着在聚合物基质的表面上(通过共价或其它结合相互作用)；封装在聚合物基质内等。术语“共并入”或“共封装”是指在主题组合物中并入治疗剂或其它材料以及至少一种其它治疗剂或其它材料。例如，可以封装至少两种活性剂。在另一个实例中，可以封装至少三种、至少四种、至少五种或更多种活性剂。
更具体来说，在聚合物中封装有任何治疗剂或其它材料的物理形式可以随特定实施例而不同。例如，可以首先将治疗剂或其它材料封装在微球中，然后以保持微球结构的至少一部分的方式与聚合物组合。或者，治疗剂或其它材料在聚合物中完全不能混溶，使其作为小液滴分散而不是溶解在聚合物中。
如本文中所使用的“活性剂”是指在体内局部地和/或全身性地起作用的生理学或药理学活性物质。活性剂是向患者施用以治疗(例如治疗剂)、预防(例如预防剂)或诊断(例如诊断剂)疾病或病症的物质。
II.组合物
具有抗DNA抗体的纳米颗粒可用于将治疗剂递送的体内外源性DNA的位点，包括例如肿瘤；缺血区域，如缺血性脑或心肌梗塞中的梗塞区域；以及受伤，如受到收缩伤害的骨骼肌。当通过纳米颗粒递送细胞毒性剂作为活性剂时，该策略不仅能够有效地靶向细胞外DNA，而且由于死细胞和垂死细胞的DNA释放增加，所以随着时间的推移和后续处理，还能产生改善的递送效率。因此，所公开的组合物通常包括具有抗DNA或抗核小体抗体的纳米载体，或由其衍生的与纳米载体缀合的功能片段、变异体或融合蛋白。
提供了包括一种或多种活性剂的纳米载体组合物，这一种或多种活性剂各自加载到递送媒剂中、与递送媒剂表面连接和/或被封入递送媒剂内。
纳米载体递送媒剂可以是例如聚合物颗粒、无机颗粒、二氧化硅颗粒、脂质体、胶束、多层囊泡或微泡。
在一个实施例中，递送媒剂是纳米级组合物，例如10nm一直到(但不包括)约1微米。但是，应了解，在一些实施例中并且对一些用途来说，颗粒可以更小或更大(例如微粒等)。虽然本文中所公开的许多组合物都被称为纳米颗粒或纳米载体组合物，但是应了解，在一些实施例中并且对一些用途来说，载体可以比纳米颗粒略大一些。例如，载体组合物可以在约1微米到约1000微米之间。这种组合物可被称为微粒组合物。例如，根据本公开的纳米载体可以是微粒。微粒是直径大小在0.1μm与100μm之间的颗粒。在另一个实例中，纳米载体可以是超颗粒(supraparticle)。超颗粒是直径大小超过约100μm的颗粒。例如，超颗粒可以具有大小为约100μm到约1,000μm的直径。
微泡是直径小于1毫米但大于1微米的气泡，广泛应用在工业、生命科学以及医学上。泡壳和填充材料的组成决定了所赋予的特征，如浮力、压碎强度、导热性以及声学特性。在医学中，它们被应用于诊断中，如成像和治疗，如药物递送。
在用于治疗癌症的一些实施例中，期望颗粒具有适合进入肿瘤微环境的大小。在特定实施例中，颗粒具有通过高渗透长滞留(EPR)效应而适合进入肿瘤微环境和/或肿瘤细胞的大小。EPR是指使特定大小的分子倾向于在肿瘤组织中的积累远远超过它们在正常组织中的积累的特性。因此，在用于治疗癌症的示范性组合物中，递送媒剂可以在约25nm到约500nm的范围内。在另一个实例中，递送媒剂可以在约50nm到约300nm的范围内，包括端值。在另一个实例中，递送媒剂可以在约80nm到约120nm的范围内，包括端值。在另一个实例中，递送媒剂可以在约85nm到约110nm的范围内，包括端值。
聚合物纳米颗粒通常使用单一或双重乳液法，使用水性和非水性溶剂形成。通常，在去除溶剂之后，纳米颗粒含有最少量的非水性溶剂。纳米颗粒的示范性制备方法描述于实例中。
在一些实施例中，使用乳液溶剂蒸发法制备纳米颗粒。将聚合物材料溶解在不能与水混溶的有机溶剂中并与药物溶液或药物溶液的组合混合。不能与水混溶的有机溶剂可以是GRAS成分，如氯仿、二氯甲烷以及酰基乙酸酯。药物可以溶解在(但不限于)以下一种或多种中：丙酮、乙醇、甲醇、异丙醇、乙腈以及二甲亚砜(Dimethyl sulfoxide，DMSO)。然后向所得混合物溶液中加入水溶液以通过乳化产生乳液溶液。乳化技术可以是(但不限于)探针超声处理或通过均质机均质化。
在一些实施例中，使用纳米沉淀法或微流体装置制备纳米颗粒。将聚合物材料与药物或药物组合在能与水混溶的有机溶剂中混合。能与水混溶的有机溶剂可以是以下一种或多种：丙酮、乙醇、甲醇、异丙醇、乙腈以及二甲亚砜(DMSO)。然后向水溶液中加入所得混合物溶液以产生纳米颗粒溶液。试剂可以与颗粒的聚合物基质的表面缔合、被封装在该聚合物基质内、被该聚合物基质包围和/或分布在整个聚合物基质中。
在一些实施例中，通过两亲性聚合物的自组装，任选地包括亲水性和/或疏水性聚合物，使用乳液溶剂蒸发、单步纳米沉淀法或微流体装置来制备纳米颗粒。
本公开所涵盖的纳米颗粒的其它示范性产生方法描述于Zhou等人,《生物材料》,33(2):583-591(2012)和Han等人,《纳米医学》(Nanomedicine)(2016)中。
将靶向部分并入到纳米颗粒中的两种方法包括：i)在纳米颗粒制备前，将靶向配体与聚合物的亲水性区域(例如，PEG)缀合；和ii)将靶向分子并入到纳米颗粒上，其中纳米颗粒表面上的PEG层在感兴趣的组织处在化学药品或酶存在下会发生裂解以暴露出靶向分子。
在一个实例中，颗粒可以是微粒或纳米颗粒。纳米颗粒常被用于组织间应用、细胞渗透以及某些施用途径。在一个实例中，纳米颗粒可以具有从10nm一直到约1,000nm的任何直径。纳米颗粒可以具有以下直径：10nm到900nm、10nm到800nm、10nm到700nm、10nm到600nm、10nm到500nm、20nm到500nm、30nm到500nm、40nm到500nm、50nm到500nm、50nm到400nm、50nm到350nm、50nm到300nm或50nm到200nm。在一些实施例中，纳米颗粒可以具有小于400nm、小于300nm或小于200nm的直径。例如，纳米颗粒可以具有在50nm与300nm之间的直径。
在一个实例中，纳米颗粒的平均直径介于约50nm与约500nm之间或介于约50nm与约350nm之间。在一些实施例中，纳米颗粒的平均直径是约100nm。
纳米颗粒的ζ电位通常介于约-50mV与约+50mV之间，或介于约-25mV与+25mV之间，或介于约-10mV与约+10mv之间。
在一些实施例中，颗粒是脑渗透性聚合物纳米颗粒，其可以加载药物并针对颅内对流增强递送(convection-enhanced delivery，CED)加以优化，如WO 2013/166487和美国公开申请第2015/0118311号中所讨论的那些。例如，颗粒可以通过以下形成：对聚合物-药物溶液进行乳化，然后去除溶剂并在第一力下离心以去除较大的颗粒，然后使用第二较高的力收集较小的颗粒以沉积较小的颗粒，这些较小的颗粒具有小于100nm的直径或在25-75纳米范围内的平均直径，能够渗透脑间隙空间。
能与水部分混溶的有机溶剂，如苄醇、乳酸丁酯以及乙酸乙酯(ethyl acetate，EA)，允许纳米颗粒制剂通过乳液扩散机制，并且能够产生比不能与水混溶的溶剂小的纳米颗粒，不能与水混溶的溶剂例如二氯甲烷(dicloromethane，DCM)。使用能与水部分混溶的有机溶剂可提高脑渗透性纳米颗粒的产量。可以使用的代表性溶剂包括DCM、苄醇、乳酸丁酯和乙酸乙酯(EA)、丙酮。EA因其低毒性而特别具有吸引力。
为了减少聚集，可以向组合物中加入糖，如FDA批准的二糖海藻糖。其它糖包括葡萄糖、蔗糖和乳糖。糖与纳米颗粒的重量比通常是在10-50％之间。
在一个实例中，纳米载体和具有纳米载体的组合物可以用于制造供治疗病状用的药剂。在另一个实例中，本公开涉及用于治疗病状的纳米载体或具有该纳米载体的组合物。待治疗病状的实例在下文中进行讨论。
下面是制造聚合物NP的示范性材料和方法。
A.示范性纳米载体
在一些实施例中，术语“纳米载体”在本公开的上下文中用于指包括孔隙网络的附聚颗粒。孔隙网络为纳米载体提供大孔隙体积和表面积以便携带有效负载(payload)，例如下文所讨论的示范性活性剂中的一种或多种。大孔隙体积和表面积是有利的，因为它可以提高纳米载体所能够携带的有效负载的量。
在一些实施例中，纳米载体不是包括孔隙网络的附聚颗粒。
1.聚合物
纳米载体可以是含有一种或多种亲水性聚合物的颗粒。示范性亲水性聚合物包括纤维素聚合物，如淀粉和多糖；亲水性多肽；聚(氨基酸)，如聚-L-谷氨酸(PGS)、γ-聚谷氨酸、聚-L-天冬氨酸、聚-L-丝氨酸或聚-L-赖氨酸；聚亚烷基二醇和聚环氧烷，如聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇(PPG)和聚(环氧乙烷)(PEO)；聚(乙氧基化多元醇)；聚(烯醇)；聚乙烯吡咯烷酮；聚(羟烷基甲基丙烯酰胺)；聚(甲基丙烯酸羟烷基酯)；聚(糖)；聚(羟基酸)；聚(乙烯醇)以及其共聚物。
纳米颗粒可以含有一种或多种疏水性聚合物。合适的疏水性聚合物的实例包括聚羟基酸，如聚(乳酸)、聚(乙醇酸)和聚(乳酸-共-乙醇酸)；聚羟基烷酸酯，如聚3-羟基丁酸酯或聚4-羟基丁酸酯；聚己内酯；聚(原酸酯)；聚酸酐；聚(磷腈)(poly(phosphazene))；聚(丙交酯-共-己内酯)；聚碳酸酯，如酪氨酸聚碳酸酯；聚酰胺(包括合成和天然聚酰胺)、多肽和聚(氨基酸)；聚酯酰胺；聚酯；聚(二氧杂环己酮)；聚(亚烷基烷基化物)；疏水性聚醚；聚氨基甲酸酯；聚醚酯；聚缩醛；聚氰基丙烯酸酯；聚丙烯酸酯；聚甲基丙烯酸甲酯；聚硅氧烷；聚(氧乙烯)/聚(氧丙烯)共聚物；聚缩酮；聚磷酸盐；聚羟基戊酸酯；聚亚烷基草酸酯；聚亚烷基琥珀酸酯；聚(马来酸)以及其共聚物。
疏水性聚合物可以是脂肪族聚酯。在一些实施例中，疏水性聚合物是聚(乳酸)、聚(乙醇酸)或聚(乳酸-共-乙醇酸)。
纳米颗粒可以含有一种或多种生物可降解的聚合物。示范性生物可降解的聚合物可以包括不溶于水或微溶于水的聚合物，其在体内被化学转化或酶促转化为水溶性材料。生物可降解的聚合物可以包括通过可水解的交联基团交联以使交联的聚合物不溶于水或微溶于水的可溶性聚合物。
纳米颗粒中的生物可降解的聚合物可以包括聚酰胺、聚碳酸酯、聚亚烷基、聚亚烷基二醇、聚环氧烷、聚对苯二甲酸亚烷基酯、聚乙烯醇、聚乙烯醚、聚乙烯基酯、聚乙烯基卤化物、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙交酯、聚硅氧烷、聚氨基甲酸酯和其共聚物、烷基纤维素、羟烷基纤维素、纤维素醚、纤维素酯、硝基纤维素、丙烯酸酯和甲基丙烯酸酯的聚合物、甲基纤维素、乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羟丁基甲基纤维素、乙酸纤维素、丙酸纤维素、乙酸丁酸纤维素、邻苯二甲酸乙酸纤维素、羧乙基纤维素、三乙酸纤维素、纤维素硫酸钠盐、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(甲基丙烯酸乙酯)、聚(甲基丙烯酸丁酯)、聚(甲基丙烯酸异丁酯)、聚(甲基丙烯酸己酯)、聚(甲基丙烯酸异癸酯)、聚(甲基丙烯酸月桂酯)、聚(甲基丙烯酸苯酯)、聚(丙烯酸甲酯)、聚(丙烯酸异丙酯)、聚(丙烯酸异丁酯)、聚(丙烯酸十八烷基酯)、聚乙烯、聚丙烯聚(乙二醇)、聚(环氧乙烷)、聚(对苯二甲酸乙二酯)、聚(乙烯醇)、聚(乙酸乙烯酯)、聚氯乙烯聚苯乙烯和聚乙烯吡咯烷酮、其衍生物、其线性和支化共聚物和嵌段共聚物以及其共混物。示范性生物可降解的聚合物包括聚酯、聚(原酸酯)、聚(乙烯亚胺)、聚(己内酯)、聚(羟基丁酸酯)、聚(羟基戊酸酯)、聚酸酐、聚(丙烯酸)、聚乙交酯、聚(氨基甲酸酯)、聚碳酸酯、聚磷酸酯、聚磷腈、其衍生物、其线性和支化共聚物和嵌段共聚物以及其共混物。
纳米颗粒可以含有一种或多种两亲性聚合物。两亲性聚合物可以是含有疏水性聚合物嵌段和亲水性聚合物嵌段的聚合物。疏水性聚合物嵌段可以含有以上疏水性聚合物或其衍生物或共聚物中的一种或多种。亲水性聚合物嵌段可以含有以上亲水性聚合物或其衍生物或共聚物中的一种或多种。在一些实施例中，两亲性聚合物是含有由疏水性聚合物形成的疏水端和由亲水性聚合物形成的亲水端的二嵌段聚合物。在一些实施例中，可以将一个部分与疏水端、亲水端或这两端连接。
在一些实施例中，纳米颗粒含有第一两亲性聚合物和第二两亲性聚合物，第一两亲性聚合物具有疏水性聚合物嵌段、亲水性聚合物嵌段以及与亲水性聚合物嵌段缀合的靶向部分，第二两亲性聚合物具有疏水性聚合物嵌段和亲水性聚合物嵌段，但没有靶向部分。第一两亲性聚合物的疏水性聚合物嵌段和第二两亲性聚合物的疏水性聚合物嵌段可相同或不同。同样，第一两亲性聚合物的亲水性聚合物嵌段和第二两亲性聚合物的亲水性聚合物嵌段可相同或不同。
在一些实施例中，纳米颗粒含有生物可降解的聚酯或聚酸酐，如聚(乳酸)、聚(乙醇酸)以及聚(乳酸-共-乙醇酸)。例如，根据本公开的纳米颗粒可以从所产生的聚(乳酸-共-乙醇酸)产生。例如，纳米颗粒可以含有以下聚酯中的一种以上：包括乙醇酸单元的均聚物，在本文中称为“PGA”，和包括乳酸单元的均聚物，如聚-L-乳酸、聚-D-乳酸、聚-D,L-乳酸、聚-L-丙交酯、聚-D-丙交酯和聚-D,L-丙交酯，在本文中统称为“PLA”，以及包括己内酯单元的均聚物，如聚(ε-己内酯)，在本文中统称为“PCL”；以及包括乳酸和乙醇酸单元的共聚物，如其特征在于乳酸:乙醇酸的比率的各种形式的聚(乳酸-共-乙醇酸)和聚(丙交酯-共-乙交酯)，在本文中统称为“PLGA”；以及聚丙烯酸酯，以及其衍生物。示范性聚合物还包括聚乙二醇(PEG)和上述聚酯的共聚物，如各种形式的PLGA-PEG或PLA-PEG共聚物，在本文中统称为“聚乙二醇化聚合物”。在某些实施例中，PEG区域可通过可裂解连接子与聚合物共价缔合以产生“聚乙二醇化聚合物”。其它聚合物包括PLGA-聚(ε-苄氧羰基-L-赖氨酸)(PLL)(即，PLGA-PLL)。
例如，纳米颗粒还可以含有一种或多种聚合物缀合物，其在聚合物与靶向部分或可检测标记之间含有端对端键。例如，改性聚合物可以是PLGA-PEG-肽嵌段聚合物。
例如，纳米颗粒可以含有一种聚合物或两种或更多种聚合物的混合物。纳米颗粒可含有其它实体，如稳定剂、表面活性剂或脂质。纳米颗粒可含有具有靶向部分的第一聚合物和没有靶向部分的第二聚合物。通过调整靶向聚合物和非靶向聚合物的比率，可以调整颗粒外的靶向部分的密度。
纳米颗粒可以含有两亲性聚合物，其具有疏水端、亲水端以及与亲水端连接的靶向部分。在一些实施例中，两亲性大分子是嵌段共聚物，其具有疏水性聚合物嵌段、与疏水性聚合物嵌段共价偶合的亲水性聚合物嵌段以及与亲水性聚合物嵌段共价偶合的靶向部分。例如，两亲性聚合物可以具有缀合物，该缀合物具有结构A-B-X，其中A是疏水性分子或疏水性聚合物，B是亲水性分子或亲水性聚合物，并且X是靶向部分。示范性两亲性聚合物包括这样的两亲性聚合物，其中A是疏水性生物可降解聚合物，B是PEG，并且X是靶向、结合的靶向部分。
在一些实施例中，纳米颗粒含有具有如上所述的结构A-B-X的第一两亲性聚合物和具有结构A-B的第二两亲性聚合物，其中第二两亲性大分子中的A和B独立地选自第一两亲性大分子中的A和B，虽然它们可能是相同的。
2.脂质体和胶束
纳米载体可以是脂质体或胶束。脂质体是由同心磷脂双层构成的球形囊泡，其由水性区室隔开。脂质体可以粘附到细胞表面上并形成分子膜。在结构上，脂质体是由同心磷脂双层构成的脂质囊泡，其包围水性内部(Gregoriadis等人,《国际制药学杂志》(Int.J.Pharm.),300,125-302005；Gregoriadis和Ryman,《生物化学杂志》(Biochem.J.),124,58P(1971))。疏水性化合物与脂质相缔合，而亲水性化合物与水相缔合。
脂质体具有在细胞和组织表面上形成分子膜的能力。临床研究已经证明了脂质体作为局部愈合剂的功效(Dausch等人,《眼科临床月刊》(Klin Monatsbl Augenheilkd)223,974-83(2006)；Lee等人,《眼科临床月刊》221,825-36(2004))。脂质体也被用于眼科学中改善角膜炎、角膜移植排斥、葡萄膜炎、眼内炎以及增殖性玻璃体视网膜病变(Ebrahim等人，2005；Li等人，2007)。
已广泛研究过脂质体作为多种化疗剂的药物载体(已经发表了约25,000篇关于该主题的科学论文)(Gregoriadis,《新英格兰医学杂志》(N Engl J Med)295,765-70(1976)；Gregoriadis等人,《国际制药学杂志》300,125-30(2005))。水溶性抗癌物质如阿霉素可以被保护在由磷脂双层界定的脂质体的水性区室内，而脂溶性物质如两性霉素(amphotericin)和辣椒素(capsaicin)可以被整合到磷脂双层中(Aboul-Fadl,《当今医药化学》(Curr Med Chem)12,2193-214(2005)；Tyagi等人,《泌尿学杂志》(J Urol)171,483-9(2004))。脂质体显著改善了环孢霉素(cyclosporine)的局部和玻璃体递送(Lallemand等人,《欧洲制药学与生物制药学杂志》(Eur J Pharm Biopharm)56,307-182003)。化疗剂的递送能够改善药代动力学并降低毒性特征(Gregoriadis,《生物技术趋势》(TrendsBiotechnol)13,527-37(1995)；Gregoriadis和Allison,《欧洲生物化学学会联合会快报》(FEBS Lett)45,71-4 1974；Sapra等人,《当代药物递送》(CurrDrug Deliv)2,369-81(2005))。已有超过十种以脂质体和脂质为基础的制剂得到了监管机构的批准，并且许多脂质体药物正处于临床前开发或临床试验中(Barnes,《药物疗法专家意见》(Expert OpinPharmacother)7,607-15(2006)；Minko等人,《医药化学中的抗癌剂》(Anticancer AgentsMed Chem)6,537-52(2006))。关于脂质体的急性、亚慢性和慢性毒性的安全性数据已经从数千名患者在临床中使用脂质体的广泛临床经验中得到了同化。
例如脂质体和胶束这样的纳米载体可以由一种或多种脂质形成，这一种或多种脂质在生理pH下可以是中性的、呈阴离子或呈阳离子。合适的中性脂质和阴离子脂质包括但不限于甾醇和脂质，如胆固醇、磷脂、溶血性脂质(lysolipid)、溶血磷脂、鞘脂或聚乙二醇化脂质。中性脂质和阴离子脂质包括但不限于磷脂酰胆碱(phosphatidylcholine，PC)(如卵PC、大豆PC)，包括但不限于1,2-二酰基-甘油-3-磷酸胆碱；磷脂酰丝氨酸(phosphatidylserine，PS)、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇(phosphatidylinositol，PI)；糖脂；鞘磷脂(sphingophospholipid)，如鞘磷脂(sphingomyelin)和神经鞘糖脂(也称为1-神经酰胺葡糖苷)，如神经酰胺吡喃半乳糖苷、神经节苷脂和脑苷脂；含有羧酸基的脂肪酸、甾醇，例如胆固醇；1,2-二酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺，包括但不限于1,2-二油烯基磷酸乙醇胺(DOPE)、1,2-双十六烷基磷酸乙醇胺(DHPE)、1,2-二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、1,2-二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)以及1,2-二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(DMPC)。脂质还可以包括脂质的各种天然的(例如，组织衍生的L-α-磷脂酰：蛋黄、心脏、脑、肝、大豆)和/或合成的(例如，饱和和不饱和的1,2-二酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1-酰基-2-酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1,2-二庚酰基-SN-甘油-3-磷酸胆碱)衍生物。在一些实施例中，脂质体含有磷脂酰胆碱(PC)头部基团和任选的鞘磷脂。在一些实施例中，脂质体含有DPPC。在另一个实施例中，脂质体含有中性脂质，如1,2-二油酰磷脂酰胆碱(DOPC)。
在某些实施例中，脂质体由单一类型的磷脂产生。在一些实施例中，磷脂具有磷脂酰胆碱头部基团，并且可以是例如鞘磷脂。脂质体可以包括鞘磷脂代谢物。用于配制脂质体的鞘磷脂代谢物包括但不限于神经酰胺、鞘氨醇或1-磷酸鞘氨醇。用于配制脂质体的脂质中所包括的鞘磷脂代谢物的浓度可以在约0.1mol％到约10mol％或约2.0mol％到约5.0mol％的范围内，或者可以是约1.0mol％的浓度。
脂质体中合适的阳离子脂质包括但不限于N-[1-(2,3-二油酰氧基)丙基]-N,N,N-三甲基铵盐，也称为TAP脂质，例如甲基硫酸盐。合适的TAP脂质包括但不限于DOTAP(二油酰基-)、DMTAP(二肉豆蔻酰基-)、DPTAP(二棕榈酰基-)以及DSTAP(二硬脂酰基-)。脂质体中合适的阳离子脂质包括但不限于二甲基双十八烷基溴化铵(DDAB)、1,2-二酰氧基-3-三甲基铵丙烷、N-[1-(2,3-二醇酰氧基)丙基]-N,N-二甲胺(DODAP)、1,2-二酰氧基-3-二甲基铵丙烷、N-[1-(2,3-二油烯基氧基)丙基]-N,N,N-三甲基氯化铵(DOTMA)、1,2-二烷氧基-3-二甲基铵丙烷、双十八烷基酰胺基甘氨酰精胺(DOGS)、3-[N-(N',N'-二甲氨基-乙烷)氨基甲酰基]胆固醇(DC-Chol)；2,3-二油酰氧基-N-(2-(精胺甲酰胺基)-乙基)-N,N-二甲基-1-丙烷三氟乙酸铵(DOSPA)、β-丙氨酰胆固醇、鲸蜡基三甲基溴化铵(CTAB)、二C14-脒、N-叔丁基-N'-十四烷基-3-十四烷氨基-丙脒、N-(α-三甲氨基乙酰基)双十二烷基-D-谷氨酸氯化物(TMAG)、双十四酰基-N-(三甲铵基-乙酰基)二乙醇胺氯化物、1,3-二油酰氧基-2-(6-羧基-精氨基)-丙酰胺(DOSPER)以及N,N,N',N'-四甲基-,N'-双(2-羟乙基)-2,3-二油酰氧基-1,4-丁二铵碘化物。在一个实施例中，阳离子脂质可以是1-[2-(酰氧基)乙基]-2-烷基(烯基)-3-(2-羟乙基)-咪唑啉氯化物衍生物，例如1-[2-(9(Z))-十八烯酰氧基)乙基]-2-(8(Z)-十七烯基-3-(2-羟乙基)咪唑啉氯化物(DOTIM)以及1-[2-(十六酰氧基)乙基]-2-十五烷基-3-(2-羟乙基)咪唑啉氯化物(DPTIM)。在一个实施例中，阳离子脂质可以是在季胺上含有羟烷基部分的2,3-二烷氧基丙基季铵化合物衍生物，例如1,2-二油酰基-3-二甲基-羟乙基溴化铵(DORI)、1,2-二油烯基氧基丙基-3-二甲基-羟乙基溴化铵(DORIE)、1,2-二油烯基氧基丙基-3-二甲基-羟丙基溴化铵(DORIE-HP)、1,2-二油烯基-氧基-丙基-3-二甲基-羟丁基溴化铵(DORIE-HB)、1,2-二油烯基氧基丙基-3-二甲基-羟戊基溴化铵(DORIE-Hpe)、1,2-二肉豆蔻基氧基丙基-3-二甲基-羟乙基溴化铵(DMRIE)、1,2-二棕榈基氧基丙基-3-二甲基-羟乙基溴化铵(DPRIE)以及1,2-二硬脂基氧基丙基-3-二甲基-羟乙基溴化铵(DSRIE)。
脂质可以由多于一种脂质的组合形成，例如，带电脂质可以与在生理pH下非离子或不带电的脂质组合。非离子脂质包括但不限于胆固醇和DOPE(1,2-二油酰基甘油基磷脂酰乙醇胺)。第一磷脂(如鞘磷脂)与第二脂质的摩尔比可以在约5:1到约1:1或3:1到约1:1或约1.5:1到约1:1的范围内，或者该摩尔比是约1:1。
在一些实施例中，脂质体或胶束包括磷脂、胆固醇以及含氮脂质。实例包括磷脂，包括天然磷脂，如磷脂酰胆碱、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇、磷脂酰乙醇胺、磷脂酸、心磷脂、鞘磷脂、蛋黄卵磷脂、大豆卵磷脂以及溶血卵磷脂，以及以标准方式获得的其氢化产物。还有可能使用合成磷脂，如磷酸二鲸蜡基酯、二硬脂酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺、二棕榈酰磷脂酰丝氨酸、桐酰磷脂酰胆碱(eleostearoylphosphatidylcholine)、桐酰磷脂酰乙醇胺(eleostearoylphosphatidylethanolamine)以及均聚{N'--[N-(2-氨乙基)-2-氨乙基]天冬酰胺}P[Asp(DET)]和嵌段阳离子聚合物(block-catiomer)聚(乙二醇)(PEG)-b-P[Asp(DET)]。
在一些实施例中，脂质体是长循环脂质体或隐形脂质体，如Immordino等人,《国际纳米医学杂志》(Int J Nanomedicine),1(3):297-315(2006)中所综述的那些，此参考文献专门以全文引用的方式并入本文中。例如，已开发出这样的脂质体，其表面经过各种分子修饰，这些分子包括糖脂和唾液酸。长循环脂质体可以包括例如脂质体组合物中的合成聚合物聚(乙二醇)(PEG)。脂质体载体表面上的PEG可以延长血液循环时间，同时减少单核吞噬细胞系统摄取(隐形脂质体)并用作靶向部分的锚。
抗体和抗体片段由于对其靶抗原的高度特异性，所以被广泛用于脂质体的靶向部分。提到免疫脂质体，通过将抗体偶合到脂质体表面来产生靶向脂质体的方法是所属领域已知的。这类技术包括但不限于常规偶合和基于马来酰亚胺的技术。此外参见Paszko和Senge,《当今医药化学》,19(31):5239-77(2012)；Kelly等人,《药物递送杂志》(Journal ofDrug Delivery),第2011卷(2011),文章编号727241,11页。
胶束可以是聚合物胶束，例如由两亲性二嵌段或三嵌段共聚物构成的聚合物胶束，这些二嵌段或三嵌段共聚物由亲溶剂性和疏溶剂性嵌段制成(参见例如Croy和Kwon,《当代药物设计》(Curr Pharm Des.),12(36):4669-84(2006))。
3.微泡
在一些实施例中，纳米载体是微泡。
在一些实施例中，微泡与活性剂一起分散在溶液中或者与封装有活性剂的脂质体或颗粒一起分散在悬浮液中。在超声波暴露期间，微泡响应于声波的振荡而改变大小并最终破裂产生冲击波，瞬时打开附近生物组织中的紧密连接。同时，溶液中或从脂质体或颗粒释放的活性剂快速扩散穿过瞬时打开的连接点并渗透原本难以渗透的组织。
在一些实施例中，微泡包被或填充有活性剂，其中超声波冲击波激活包衣并引起微型爆炸以释放出医药。
在一些实施例中，微泡具有通过由蛋白质、脂质或聚合物构成的壳稳定的气体核。它们填充有不溶的全氟化碳气体，如全氟甲烷、全氟乙烷、全氟丙烷、全氟丁烷或全氟戊烷。在一个实施例中，微泡的直径是约1到约15微米。
微泡可以具有由白蛋白、溶菌酶和其它具有高表面活性的两亲性蛋白质形成的蛋白质壳。白蛋白包被的微泡可以通过在空气存在下对经过加热的人类血清白蛋白溶液(例如，5％(w/v))进行超声处理来形成。在超声处理期间，形成空气微泡，其被封装在聚集的白蛋白的纳米级厚的壳内。需要加热以在超声处理之前使白蛋白变性并促进封装，并且通过在气蚀(cavitation)期间形成的半胱氨酸残基之间的二硫键将白蛋白壳保持在一起。
微泡可以具有由合成的表面活性剂的混合物形成的表面活性剂壳，合成的表面活性剂如和在空气存在下对混合溶液进行超声处理，形成稳定的微泡。
在优选实施例中，微泡具有脂质壳。本文可使用市售的脂质包被的微泡制剂，包括(Lantheus Medical Imaging)和(Bracco Diagnostics)。磷脂在空气-水界面处自发地自组装成高度取向的单层，使得其疏水酰基链面向气体并且其亲水性头部基团面向水。脂质分子通过‘弱’物理力保持在一起，没有链缠结，这使得壳在超声波声透射期间能顺应区域膨胀和压缩。适合形成微泡的示范性脂质分子上文在脂质体的产生中有过描述。
在其它实施例中，微泡具有由交联的或缠结的聚合物物种形成的聚合物壳，或聚电解质多层壳。Sirsi S和Borden M在《气泡科学、工程与技术》(Bubble Sci EngTechnol),1(1-2):3-17(2009)中描述了示范性的带聚合物壳的微泡。
B.靶向DNA的部分
所公开的纳米载体通常包括与其连接、连结或缀合的靶向DNA或其组分的部分，DNA组分例如核苷酸或核苷或核碱基或核小体或其组分。该部分可以与形成纳米载体的聚合物缀合。在一个实例中，在纳米载体的外壳上展示结合部分。
靶向部分可以是可以与细胞外DNA或其组分、核苷酸、核碱基或核小体结合的抗体或变异体或功能片段或融合蛋白。所属领域中已知各种示范性抗DNA/抗核小体抗体(参见例如Shuster A.M.等人,《科学》,第256卷,1992,第665-667页；Isenberg等人,《风湿病学》(Rheumatology),46(7):1052-1056(2007))。例如，经常在患有全身性红斑狼疮(systemiclupus erythematosus，SLE)的患者的血清中鉴定出针对单股或双股脱氧核糖核酸(DNA)的自身抗体，并且这些自身抗体在疾病发病机制中常常有所涉及。存在对DNA具有反应性的循环自身抗体(抗DNA抗体)是全身性红斑狼疮(SLE)患者的标志性实验室发现。尽管抗DNA抗体在SLE中的确切作用尚不清楚，但已有人提出抗体在SLE病理生理学中起着积极作用。精选的狼疮抗DNA自身抗体能够渗透活细胞核并抑制DNA修复或直接损伤DNA，并且正在努力使用这些抗体来对抗对DNA损伤敏感的肿瘤(Hansen等人,《科学·转化医学》,4(157):157ra142(2012)；Noble等人,《癌症研究》(Cancer Research),2015；75(11):2285-2291；Noble等人,《英国科学报告》(Sci Rep-Uk),4(2014)；Noble等人,《自然·风湿病学综述》(Nat Rev Rheumatol)(2016))。因此，在一些实施例中，抗DNA抗体可以从SLE患者衍生或分离。在一些实施例中，抗DNA抗体是单克隆抗体或其片段或变异体。
抗体可以例如天然存在于SLE患者中，或通过筛选抗体库获得。可以通过根据已知技术将来自具有升高的血清水平的抗DNA抗体的宿主(例如，MRL/1pr小鼠)的脾细胞与骨髓瘤细胞融合或通过用合适的转化载体转化脾细胞以使细胞永生化来制备抗体。可以在选择性培养基中培养细胞并筛选细胞以选出结合DNA的抗体。
在一些实施例中，本公开所涵盖的抗体、变异体、功能片段或融合蛋白能够水解DNA。在其它实施例中，本公开所涵盖的抗体、变异体、功能片段或融合蛋白不水解DNA。
在一些实施例中，本公开所涵盖的抗体、变异体、功能片段或融合蛋白是细胞渗透性的、核膜渗透性的或两种都是。因此，在一些实施例中，本公开所涵盖的抗体、变异体、功能片段或融合蛋白当与纳米载体缀合时(1)是细胞渗透性的；(2)是细胞渗透性的，但不渗透核膜；(3)是细胞渗透性和核渗透性的；或(4)不是细胞渗透性的并且不是核膜渗透性的。因此，在一些实施例中，纳米载体主要留在细胞外空间中，例如，在肿瘤微环境中。在一些实施例中，靶向部分有助于将纳米载体跨细胞膜递送到细胞中。换言之，在一个实例中，靶向部分是细胞渗透性的。因此，在一些实施例中，与相同特征的非靶向颗粒相比，靶向颗粒更有效地或以更高的频率被递送到细胞中。在一些实施例中，靶向部分还促进纳米载体的跨核膜递送。在另一个实例中，靶向部分不是细胞渗透性的。
可以使用的示范性抗体包括任何类别的全免疫球蛋白(即，完整抗体)、其片段以及至少含有抗体的抗原结合可变结构域的合成蛋白质。各抗体之间的可变结构域序列不同并且可变结构域被用于每种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性。然而，变异性通常不是均匀分布在抗体的可变结构域中的。它通常集中在轻链和重链可变结构域中称为互补决定区(complementarity determining region，CDR)或高变区的三个区段中。可变结构域的更高度保守部分称为构架(FR)。天然重链和轻链的可变结构域各自包括四个FR区，主要采用β-折叠构型，通过三个CDR连接，其形成连接β-折叠结构的环，并且在一些情况下形成β-折叠结构的一部分。每条链中的CDR通过FR区紧密靠近地保持在一起，并且与来自另一条链的CDR一起有助于形成抗体的抗原结合位点。因此，抗体可含有渗透细胞、维持DNA结合和/或干扰DNA修复所必需的CDR组分。
还公开了具有生物活性的抗体变异体和片段。片段无论是否与其它序列连接，都可以包括特定区域或特定氨基酸残基的插入、缺失、取代或所选择的其它修饰，其条件是与未修饰的抗体或抗体片段相比，该片段的活性没被显著改变或受损。
技术也可以用以产生对抗原蛋白具有特异性的单链抗体。单链抗体的产生方法是所属领域的技术人员众所周知的。可以通过使用短肽连接子使重链和轻链的可变结构域融合在一起来产生单链抗体，从而在单个分子上重构抗原结合位点。已经开发出单链抗体可变片段(scFv)，其中一个可变结构域的C端通过15到25个氨基酸的肽或连接子与另一个可变结构域的N端连接，并没有显著破坏抗原结合或结合的特异性。连接子经过选择以使重链和轻链能以其适当的构象取向结合在一起。
可以修饰抗DNA靶向部分以改善其治疗潜力。例如，在一些实施例中，抗DNA靶向部分与对第二治疗靶标具有特异性的另一种抗体缀合，例如，在癌细胞上或癌细胞附近或肿瘤微环境中。例如，抗DNA抗体可以是含有结合DNA或核小体的单链可变片段的融合蛋白和特异性结合第二治疗靶标的单克隆抗体的单链可变片段。在其它实施例中，抗DNA抗体是双特异性抗体，其具有来自抗DNA或抗核小体抗体的第一重链和第一轻链以及来自特异性结合第二治疗靶标的单克隆抗体的第二重链和第二轻链。
二价单链可变片段(di-scFv)可通过连接两个scFv来改造。这可以通过产生具有两个VH和两个VL区的单肽链，产生串联scFv来进行。scFv还可以被设计成具有连接子肽，其对于两个可变区而言太短以致于不能折叠在一起(约五个氨基酸)，迫使scFv二聚。这种类型被称为双功能抗体。已证明双功能抗体具有比相应的scFv低至多40倍的解离常数，这意味着它们对其靶标具有高得多的亲和力。即使较短的连接子(一个或两个氨基酸)也能引起三聚体(三功能抗体或三体(tribody))的形成。四功能抗体也已经产生了。其呈现甚至比双功能抗体更高的对其靶标的亲和力。
抗体可以是人源化抗体或嵌合抗体，或其片段、变异体或融合蛋白。用于人源化非人类抗体的方法在所属领域中是众所周知的。通常，人源化抗体具有从非人源引入其中的一个或多个氨基酸残基。这些非人类氨基酸残基常常被称为“输入(import)”残基，其通常取自“输入”可变结构域。抗体人源化技术通常涉及使用重组DNA技术来操纵编码抗体分子的一条或多条多肽链的DNA序列。
在一些实施例中，修饰抗体以改变其半衰期。在一些实施例中，期望增加抗体的半衰期，使其在循环中或在治疗部位存在更长的时间。在其它实施例中，降低抗DNA抗体的半衰期以减少潜在的副作用。预期抗体片段具有比全尺寸抗体短的半衰期。其它改变半衰期的方法是已知的并且可以用于所述方法中。例如，可以用延长半衰期的Fc变异体改造抗体，例如使用XtendTM抗体半衰期延长技术(加利福尼亚州蒙罗维亚(Monrovia,CA)的Xencor)。
在一些实施例中，靶向部分或纳米载体本身与例如细胞渗透肽的细胞渗透部分缀合，以帮助进入细胞并转运到细胞核。细胞渗透肽的实例包括但不限于聚精氨酸(例如，R9)、触角足序列(Antennapedia sequence)、TAT、HIV-Tat、穿膜肽(Penetratin)、Antp-3A(Antp突变型)、蟾蜍素(Buforin)II、运输蛋白(Transportan)、模型两亲性肽(modelamphipathic peptide，MAP)、K-FGF、Ku70、朊病毒(Prion)、pVEC、Pep-1、SynB1、Pep-7、HN-1、双胍盐-亚精胺-胆固醇(Bis-Guanidinium-Spermidine-Cholesterol，BGSC)以及双胍盐-三氨乙基胺-胆固醇(Bis-Guanidinium-Tren-Cholesterol，BGTC)。在其它实施例中，使用TransMabsTM技术(不列颠哥伦比亚省温哥华市(Vancouver,BC)的InNexus Biotech公司)修饰抗体。
在一些实施例中，抗DNA抗体是3E10、5C6，或由其衍生的变异体、功能片段或融合蛋白。例如，抗DNA抗体可以包含具有如SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列的VH和具有如SEQID NO:3中所示的氨基酸序列的VL(3E10)。示范性变异体包括这样的抗体，其具有VH和VL，VH包括与SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列至少90％相同的氨基酸序列，VL包括与如SEQ IDNO:3中所示的序列至少90％相同的氨基酸序列。其它示范性变异体包括这样的抗体，其具有VH和VL，VH包括与SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列至少95％、至少98％、至少99％相同的氨基酸序列，VL包括与如SEQ ID NO:3中所示的序列至少95％、至少98％、至少99％相同的氨基酸序列。其它示范性变异体包括3E10的人源化形式，如WO 2015/106290和WO 2016/033324中所描述的那些。
在另一个实例中，抗DNA抗体可以包含具有如SEQ ID NO:14中所示的氨基酸序列的VH和具有如SEQ ID NO:18中所示的氨基酸序列的VL(5C6)。示范性变异体包括这样的抗体，其具有VH和VL，VH具有与SEQ ID NO:14中所示的氨基酸序列至少90％相同的氨基酸序列，VL具有与如SEQ ID NO:18中所示的序列至少90％相同的氨基酸序列。其它示范性变异体包括这样的抗体，其具有VH和VL，VH具有与SEQ ID NO:14中所示的氨基酸序列至少95％、至少98％、至少99％相同的氨基酸序列，VL具有与如SEQ ID NO:18中所示的序列至少95％、至少98％、至少99％相同的氨基酸序列。
以下实例说明，与每个纳米颗粒的表面缀合的平均五个3E10EN分子对于将颗粒靶向细胞外DNA是有效的。靶向分子的数量一般是在约1到约10,000或约5到约1,000的范围内。
1.示范性抗体
预先从MRLmpj/lpr狼疮小鼠模型产生一组杂交瘤，包括3E10和5C6杂交瘤，并评估DNA结合活性(Zack等人,《免疫学杂志》(J.Immunol.)154:1987-1994(1995)；Gu等人,《免疫学杂志》,161:6999-7006(1998))。因此，在一些实施例中，靶向部分是3E10或5C6抗体或其变异体、片段和融合蛋白。各自可以单独或组合地与封装有活性剂的纳米载体的表面连接并将纳米载体靶向细胞外DNA的位点，包括但不限于凋亡和坏死的细胞和组织的微环境。
3E10(D31N)di-scFv(“3E10EN”)具有核渗透活性并且自身抑制DNA修复，当与纳米载体不可逆地缀合时，可能不会渗透到细胞核中以发挥其生物功能。因此，当抗DNA抗体与纳米载体的表面共价缀合时，活性剂通常也被加载或封装在纳米载体内。然而，在一些实施例中，靶向部分通过可裂解的连接子或键与纳米载体的表面缀合，在被递送至靶位点时释放出靶向部分。在特定实施例中，连接子或键是二硫键。通过这种方法，一旦由于谷胱甘肽水平升高而遇到还原性肿瘤微环境，靶向部分就可以从纳米载体释放(Shao等人,《治疗剂递送》(Ther Deliv),3(12):1409-1427(2012))。所释放的抗体或由其衍生的片段或融合蛋白然后变成可以如上所述渗透细胞的活性剂。其它可裂解的连接子可以是作为肿瘤微环境中酶的底物的肽，如PLGLAG(SEQ ID NO:29)(参见例如Aguilera等人,《综合生物学》(Integr Biol)(Camb),1(5-6):371-381(2009))和RLQLKL(SEQ ID NO:30)(参见例如Whitney等人,《生物化学杂志》(J.Biol.Chem.),285(29):22532-41(2010))。
作为使抗体与纳米载体的表面缀合的替代方案或补充，可以将抗体(如3E10或5C6)或由其衍生的变异体或片段或融合蛋白或其任何组合单独地或与一种或多种额外活性剂组合着封装到纳米载体中。一旦通过二硫键的断裂或通过被封装的抗体的释放而从纳米载体释放，游离抗体将能够渗透靶细胞核并抑制DNA修复，从而使肿瘤对DNA损伤敏感或选择性地杀死DNA修复缺陷型癌细胞。在一些实施例中，被封装抗体中的一些或全部具有与其缀合的活性剂，以促进向细胞或其核递送活性剂。
因此，在一些实施例中，所加载或封装的活性剂不包括3E10或5C6或由其衍生的片段、变异体、人源化形式或融合蛋白。在其它实施例中，所加载或封装的活性剂包括3E10或5C6或由其衍生的片段或融合蛋白，呈游离抗体、与第二活性剂缀合的抗体或其组合的形式。任一个实施例都可以包括一种或多种额外活性剂。
a.3E10
在1990年代早期，在针对SLE的实验性疫苗疗法中测试了鼠狼疮抗DNA抗体3E10。这些努力旨在开发抗独特型抗体，其将特异性结合SLE患者中的抗DNA抗体。然而，偶然发现3E10渗透到活细胞和细胞核中而没有引起任何能被观察到的细胞毒性(Weisbart RH等人,《免疫学杂志》(J Immunol.)1990 144(7):2653-2658；Zack DJ等人,《免疫学杂志》1996157(5):2082-2088)。然后通过集中于开发3E10作为用于将治疗性分子转运到细胞和细胞核中的分子递送载体的努力来取代对SLE疫苗疗法中的3E10的研究。3E10优先结合DNA单股尾部，抑制DNA单股和双股断裂修复中的关键步骤(Hansen等人,《科学·转化医学》(Science Translational Medicine),4:157ra142(2012))。因此，所属领域的技术人员应了解，3E10可以包含具有如SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列的VH和具有如SEQ ID NO:3中所示的氨基酸序列的VL。3E10抗体和其包括VH的CDR1中的D31N突变的单链可变片段(3E10(D31N)scFv)以及其二价和三价融合物渗透到细胞和细胞核中，并且已证明能够转运通过化学缀合或重组融合而连接到抗体上的治疗蛋白货物。通过3E10或3E10(D31N)scFv递送到细胞的蛋白质货物包括过氧化氢酶、p53和Hsp70(Weisbart RH等人,《免疫学杂志》2000164:6020-6026；Hansen JE等人,《癌症研究》(Cancer Res.)2007年2月15日；67(4):1769-74；Hansen JE等人,《脑研究》(Brain Res.)2006年5月9日；1088(1):187-96)。3E10(D31N)scFv可有效地介导将Hsp70体内递送到神经元并且这促使大鼠中风模型中脑梗塞体积减小和神经功能改善(Zhan X等人,《中风》(Stroke).201041(3):538-43)。
3E10和3E10(D31N)scFv以及其二价和三价融合物不与任何治疗蛋白缀合，能增强癌细胞辐射敏感性和化学敏感性，并且这种效应在DNA修复缺陷型细胞中被加强。此外，即使在没有辐射或化疗的情况下，3E10和3E10 scFv以及其二价和三价融合物对DNA修复缺陷型癌细胞也是选择性致死的。美国食品和药物管理局(Food and Drug Administration，FDA)已经建立了将单克隆抗体开发成人类疗法的途径，并且3E10已被FDA批准用于I期人类临床试验，该试验旨在测试3E10在针对SLE的实验性疫苗疗法中的功效(Spertini F等人,《风湿病学杂志》(JRheumatol.)1999 26(12):2602-8)。
实验表明，3E10(D31N)scFv首先与细胞外DNA或其降解产物结合，然后通过ENT2核苷补救途径进入细胞核，从而渗透细胞核(Weisbart,《科学报告》(Scientific Reports),5:论文编号：12022(2015)doi:10.1038/srep12022)。当给小鼠和大鼠施用时，3E10优先被吸引到细胞外DNA富集的组织，包括肿瘤、中风模型中的缺血性脑区域以及受到收缩伤害的骨骼肌(Weisbart等人,《科学报告》,5:12022(2015)；Hansen等人,《生物化学杂志》(J BiolChem),282(29):20790-20793(2007)；Weisbart等人,《分子免疫学》(Mol Immunol),39(13):783-789(2003)；Zhan等人,《中风：脑循环杂志》(Stroke:A Journal of CerebralCirculation),41(3):538-543(2010))。因此，细胞外DNA的存在增强了3E10(D31N)scFv的细胞核摄取。此外，3E10(D31N)scFv优先在体内定位于肿瘤细胞核中，可能是由于局部环境中从肿瘤缺血区域和坏死区域释放的DNA增加。
b.5C6
5C6在BRCA2(-)细胞而不是BRCA2(+)细胞中诱导γH2AX并选择性遏制BRCA2(-)细胞的生长。从机理上讲，5C6似乎在BRCA2(-)细胞中诱导衰老。衰老是众所周知的对DNA损伤的反应，并且DNA损伤剂，包括许多化疗剂，在长时间暴露后会诱导衰老(Sliwinska等人,《衰老与发育机理》(Mech.Ageing Dev.),130:24-32(2009)；te Poele等人,《癌症研究》62:1876-1883(2002)；Achuthan等人,《生物化学杂志》,286:37813-37829(2011))。这些观察结果表明，5C6渗透细胞核并损伤DNA，并且相比于具有完整DNA修复的细胞，由于BRCA2缺乏而导致预先存在DNA修复缺陷的细胞对这种损伤更为敏感。参见美国公开申请第2015/0376279号。此外，所属领域的技术人员应了解，5C6可以包含具有如SEQ ID NO:14中所示的氨基酸序列的VH和具有如SEQ ID NO:18中所示的氨基酸序列的VL。
2.片段和融合蛋白
在一些实施例中，靶向部分和/或活性剂由抗体3E10或5C6或其变异体的一个或多个抗原结合抗体片段和/或抗原结合融合蛋白构成。抗原结合分子通常与3E10或5C6的表位结合，并且可以例如维持完整抗体的功能或活性。
示范性片段和融合物包括但不限于单链抗体、单链可变片段(scFv)、di-scFv、tri-scFv、双功能抗体、三功能抗体、四功能抗体、二硫键连接的Fv(sdFv)、Fab'、F(ab')2、Fv以及单结构域抗体片段(sdAb)。
在一些实施例中，靶向部分包括两个或更多个scFv。例如，靶向部分可以是scFv或di-scFv。在一些实施例中，每个scFv可以包括3E10或5C6或其变异体的重链可变区(VL)的一个、两个或所有三个互补决定区(CDR)。scFv可以包括3E10或5C6或其变异体的轻链可变区(VL)的一个、两个或所有三个CDR。分子可以包括3E10或5C6或其变异体的重链可变区和/或轻链可变区。
可以通过使用短肽连接子使重链和轻链的可变结构域融合在一起来产生单链可变片段，从而在单个分子上重构抗原结合位点。已经开发出单链抗体可变片段(scFv)，其中一个可变结构域的C端通过连接子与另一个可变结构域的N端连接，并没有显著破坏抗原结合或结合的特异性。连接子经过选择以使重链和轻链能以其适当的构象取向结合在一起。连接子通常富含甘氨酸以获得柔韧性，并且通常还包括丝氨酸或苏氨酸以获得溶解性。连接子可以例如将VH的N端与VL的C端相连接，或反之亦然。scFv还可以直接从衍生自杂交瘤的亚克隆重链和轻链产生。在一些实施例中，scFv保留或改善或增加原始免疫球蛋白的特异性，同时去除恒定区并引入连接子。
抗体3E10或5C6的包括两个或更多个单链可变片段(scFv)的示范性分子包括但不限于二价-scFv(di-scFv)、三价-scFv(tri-scFv)、多价-scFv(multi-scFv)、scFv的双功能抗体、三功能抗体、四功能抗体等，这两个或更多个scFv包括3E10或5C6或其变异体的轻链可变区(VL)和3E10或5C6或其变异体的重链可变区(VH)。
二价单链可变片段可通过连接两个scFv来改造。这可以通过产生具有两个VH和两个VL区的单肽链，产生被称为串联di-scFv的di-scFv来进行。scFv还可以被设计成具有连接子肽，其对于两个可变区而言太短以致于不能折叠在一起(约五个氨基酸)，迫使scFv二聚并形成被称为双功能抗体的二价单链可变片段。已证明双功能抗体具有比相应的scFv低至多40倍的解离常数，表明它们对其靶标具有高得多的亲和力。即使较短的连接子(一个或两个氨基酸)也能引起三聚体(三功能抗体或三体)的形成。四功能抗体也已经产生了并且已证明其呈现甚至比双功能抗体更高的对其靶标的亲和力。
所公开的靶向部分包括3E10或5C6和其变异体的抗原结合抗体片段和融合蛋白，其通常与亲本抗体3E10或5C6结合相同的表位。在一些实施例中，抗原结合分子是二价、三价或多价scFv。尽管抗原结合分子的抗原结合抗体片段或融合蛋白可以包括额外的抗体结构域(例如，恒定结构域、铰链结构域等)，但在一些实施例中，它不包括额外的抗体结构域。例如，3E10结合DNA并抑制DNA修复，这对DNA修复缺陷型细胞是合成致死的。此功能独立于任何3E10恒定区。相比之下，靶向细胞外受体的非渗透性抗体，如西妥昔单抗(cetuximab)，部分地依赖于Fc介导的ADCC和补体的激活来对肿瘤发挥作用。因此，从非渗透性抗体中消除Fc可以减小它们对肿瘤的作用程度，但是3E10不需要Fc来对癌细胞起作用。因此，缺乏Fc区的3E10片段或融合物应该不能激活ADCC和补体，因此具有较低的非特异性副作用风险。
a.单链可变片段
本文中所公开的单链可变片段可以包括3E10或5C6或其变异体的抗原结合片段。在美国专利第4,812,397号和第7,189,396号以及美国公开申请第2014/0050723号中讨论了单克隆抗体3E10和其活性片段和示范性变异体，其在体内转运至哺乳动物细胞核而没有细胞毒性作用。在例如WO 2012/135831、WO 2016/033321、WO 2015/106290以及WO 2016/033324中讨论了其它适合与所公开的纳米载体一起使用的3E10抗体组合物，包括其片段和融合物。在美国公开申请第2015/0376279号中描述了5C6。
scFv包括通过连接子连接的轻链可变区(VL)和重链可变区(VH)。在一个实例中，连接子包括超过12个氨基酸残基，其中(Gly4Ser)3(SEQ ID NO:10)是scFv较为偏好的连接子之一。在一个实例中，scFv是通过二硫键稳定的Fv(或diFv或dsFv)，其中将单个半胱氨酸残基引入VH的FR和VL的FR以及通过二硫键连接的半胱氨酸残基以产生稳定的Fv。在一个实例中，scFv是二聚scFv(di-scFV)，即包括通过非共价键或共价键、例如通过亮氨酸拉链结构域(例如，衍生自Fos或Jun)连接的两个scFv分子的蛋白质，或三聚scFV(tri-scFv)。在另一个实例中，两个scFv通过长度足够的肽连接子连接以允许scFv形成和结合抗原，例如，如美国公开申请第2006/0263367号中所述。在下文和本文其它地方讨论和示范了其它细节。
各抗体之间的可变结构域序列不同并且可变结构域被用于每种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性。然而，变异性通常不是均匀分布在抗体的可变结构域中的。它通常集中在轻链和重链可变结构域中称为互补决定区(CDR)或高变区的三个区段中。可变结构域的更高度保守部分称为构架(FR)。天然重链和轻链的可变结构域各自包括四个FR区，主要采用β-折叠构型，通过三个CDR连接，其形成连接β-折叠结构的环，并且在一些情况下形成β-折叠结构的一部分。每条链中的CDR通过FR区紧密靠近地保持在一起，并且与来自另一条链的CDR一起有助于形成抗体的抗原结合位点。
本文中所公开的抗体的片段和融合物可以具有生物活性。例如，片段和融合物无论是否与其它序列连接，都可以包括特定区域或特定氨基酸残基的插入、缺失、取代或所选择的其它修饰。在一些实施例中，与非修饰抗体或抗体片段相比，片段或融合物的活性没有显著降低或受损。
b.抗体序列
i.3E10轻链可变区
3E10的轻链可变区的氨基酸序列是：
DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASKSVSTSSYSYMHWYQQKPGQPPKLLIKYASYLESGVPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCQHSREFPWTFGGGTKLEIK(SEQ ID NO:3)。互补决定区(CDR)用下划线表示。其它3E10轻链序列是所属领域中已知的。参见例如Zack等人,《免疫学杂志》,15；154(4):1987-94(1995)；GenBank：L16981.1-小鼠Ig重排的L-链基因(Mouse Igrearranged L-chain gene),部分编码序列(partial cds)；GenBank：AAA65681.1-免疫球蛋白轻链(immunoglobulin light chain),部分(partial)[小家鼠(Mus musculus)])。
互补决定区(CDR)用下划线表示，包括CDR L1：RASKSVSTSSYSYMH(SEQ ID NO:26)；CDR L2：YASYLES(SEQ ID NO:27)；CDR L3：QHSREFPWT(SEQ ID NO:28)。
ii.3E10重链可变区
3E10的重链可变区的氨基酸序列是：
(SEQ ID NO:1；Zack等人,《免疫学与细胞生物学》(Immunology and CellBiology),72:513-520(1994)；GenBank：L16981.1-小鼠Ig重排的L-链基因,部分编码序列；和GenBank：AAA65679.1-免疫球蛋白重链,部分[小家鼠])。互补决定区(CDR)用下划线表示。
3E10的重链可变区的优选变异体的氨基酸序列是：
(SEQ ID NO:2)。互补决定区(CDR)用下划线表示。
已经确定3E10的重链可变区的氨基酸位置31对抗体和其片段渗透细胞核并与DNA结合的能力有影响。例如，CDR1中的D31N突变(在SEQ ID NO:1和2中用粗体和斜体表示)渗透细胞核并以比原始抗体大得多的效率结合DNA(Zack等人,《免疫学与细胞生物学》,72:513-520(1994)；Weisbart等人,《自身免疫杂志》(J.Autoimmun.),11,539-546(1998)；Weisbart,《国际肿瘤学杂志》(Int.J.Oncol.),25,1867-1873(2004))。
互补决定区(CDR)用下划线表示，包括CDR H1.1(原始序列)：DYGMH(SEQ ID NO:22)；CDR H1.2(含D31N突变)：NYGMH(SEQ ID NO:23)；CDR H2：YISSGSSTIYYADTVKG(SEQ IDNO:24)；CDR H3：RGLLLDY(SEQ ID NO:25)。
除了上述3E10和其片段之外，还可以使用额外的抗DNA抗体以将纳米载体靶向DNA并将纳米载体递送到肿瘤或损伤或感染部位并递送到细胞中。这些抗体包括如下文所指定的细胞核渗透性抗DNA抗体5C6。
iii.5C6轻链可变区
mAb 5C6的κ轻链可变区(VL)的氨基酸序列是：
DIVLTQSPASLAAVSLGERATISYRASKSVSTSGYSYMHWNQQKPGQAPRLLIYLVSNLESGVPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCQHIRELDTFFGGGTKLEIK(SEQ ID NO:14)。
互补决定区(CDR)用下划线表示，包括CDR L1：RASKSVSTSGYSYMH(SEQ ID NO:15)；CDR L2：LVSNLES(SEQ ID NO:16)；CDR L3：QHIRELDTF(SEQ ID NO:17)。
iv.5C6重链可变区
mAb 5C6的重链可变区(VH)的氨基酸序列是：
QLKLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSSYTMSWVRQTPAKRLEWVATISSGGGSTYYPDSVKGRFTISRDNARNTLYLQMSSLRSEDTAMYYCARRAYSKRGAMDYWGQGTSVTVSS(SEQ ID NO:18)。
互补决定区(CDR)用下划线表示，包括CDR H1：SYTMS(SEQ ID NO:19)；CDR H2：TISSGGGSTYYPDSVKG(SEQ ID NO:20)；CDR H3：RAYSKRGAMDY(SEQ ID NO:21)。
c.连接子
如本文中所使用的术语“连接子”包括但不限于肽连接子。肽连接子可以是任何大小的，只要它不干扰可变区对表位的结合即可。在一些实施例中，连接子包括一个或多个甘氨酸和/或丝氨酸氨基酸残基。单价单链抗体可变片段(scFv)，其中一个可变结构域的C端通常通过15到25个氨基酸的肽或连接子与另一个可变结构域的N端连接。连接子经过选择以使重链和轻链能以其适当的构象取向结合在一起。双功能抗体、三功能抗体等中的连接子通常包括相比于如上文所讨论的单价scFv的连接子来说更短的连接子。二价、三价和其它多价scFv通常包括三个或更多个连接子。连接子的长度和/或氨基酸组成可以相同或不同。因此，连接子的数量、连接子的组成以及连接子的长度可以基于如所属领域中已知的scFv的所期望的价数来确定。连接子可以允许或驱动二价、三价和其它多价scFv的形成。
例如，连接子可以包括4-8个氨基酸。在一个特定实施例中，连接子包括氨基酸序列GQSSRSS(SEQ ID NO:4)。在另一个实施例中，连接子包括15-20个氨基酸，例如18个氨基酸。在一个特定实施例中，连接子包括氨基酸序列GQSSRSSSGGGSSGGGGS(SEQ ID NO:5)。其它柔性连接子包括但不限于氨基酸序列Gly-Ser、Gly-Ser-Gly-Ser(SEQ ID NO:6)、Ala-Ser、Gly-Gly-Gly-Ser(SEQ ID NO:7)、(Gly4-Ser)2(SEQ ID NO:8)和(Gly4-Ser)4(SEQ IDNO:9)以及(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)3(SEQ ID NO:10)。
d.变异体
scFv可以由抗体片段或融合蛋白构成，该抗体片段或融合蛋白包括与3E10或5C6的可变重链和/或轻链的氨基酸序列(例如，分别是SEQ ID NO:1、2、3、14和/或18)至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％相同的可变重链和/或可变轻链的氨基酸序列，并且其结合于3E10或5C6的表位，对DNA修复缺陷型细胞是选择性致死的或选择性增加这些细胞的辐射敏感性和/或化学敏感性，或其组合。scFv可以由抗体片段或融合蛋白构成，该抗体片段或融合蛋白包括与3E10或5C6的可变重链和/或轻链的CDR的氨基酸序列(例如，分别是SEQ IDNO:22-25和26-28或19-21和15-17)至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％相同的CDR，并且其结合于3E10或5C6的表位，对DNA修复缺陷型细胞是选择性致死的或选择性增加这些细胞的辐射敏感性和/或化学敏感性，或其组合。可以通过BLAST蛋白质比较确定两个氨基酸序列的同一性百分比。在一些实施例中，scFv包括上述优选可变结构域的CDR中的一个、两个、三个、四个、五个或所有六个并且其结合于3E10或5C6的表位，对DNA修复缺陷型细胞是选择性致死的或选择性增加这些细胞的辐射敏感性和/或化学敏感性，或其组合。
以上提供了3E10或5C6的轻链可变序列的预测互补决定区(CDR)。同样参见GenBank：AAA65681.1-免疫球蛋白轻链,部分[小家鼠]。以上提供了3E10和5C6的重链可变序列的预测互补决定区(CDR)。参见例如Zack等人,《免疫学与细胞生物学》,72:513-520(1994)和GenBank登录号AAA65679.1。
e.示范性scFv
示范性3E10 scFV包括mono-scFv 3E10(D31N)、di-scFv 3E10(D31N)以及tri-scFv 3E10(D31N)。
scFv 3E10(D31N)的氨基酸序列是：
(SEQ ID NO:11)。
关于SEQ ID NO:11的scFv蛋白质结构域的注释
·AGIH序列增加溶解性(SEQ ID NO:11的氨基酸1-4)
·Vk可变区(SEQ ID NO:11的氨基酸5-115)
·轻链CH1的起始(6aa)(SEQ ID NO:11的氨基酸116-121)
·(GGGGS)3连接子(SEQ ID NO:11的氨基酸122-136)
·VH可变区(SEQ ID NO:11的氨基酸137-252)
·Myc标签(SEQ ID NO:11的氨基酸253-268)
·His 6标签(SEQ ID NO:11的氨基酸269-274)
3E10 di-scFv(D31N)的氨基酸序列
di-scFv 3E10(D31N)是二价单链可变片段，包括3E10的2×重链和轻链可变区并且其中在重链的位置31处的天冬氨酸突变为天冬酰胺。di-scFv 3E10(D31N)的氨基酸序列是：
(SEQ ID NO:12)。
关于SEQ ID NO:12的di-scFv蛋白质结构域的注释
·AGIH序列增加溶解性(SEQ ID NO:12的氨基酸1-4)
·Vk可变区(氨基酸5-115)
·轻链CH1的起始(6aa)(SEQ ID NO:12的氨基酸116-121)
·(GGGGS)3连接子(SEQ ID NO:12的氨基酸122-136)
·VH可变区(SEQ ID NO:12的氨基酸137-252)
·由人类IgG CH1起始13个氨基酸(SEQ ID NO:12的氨基酸253-265)组成的Fv片段之间的连接子
·Swivel序列(SEQ ID NO:12的氨基酸266-271)
·Vk可变区(SEQ ID NO:12的氨基酸272-382)
·轻链CH1的起始(6aa)(SEQ ID NO:12的氨基酸383-388)
·(GGGGS)3连接子(SEQ ID NO:12的氨基酸389-403)
·VH可变区(SEQ ID NO:12的氨基酸404-519)
·Myc标签(SEQ ID NO:12的氨基酸520-535)
·His 6标签(SEQ ID NO:12的氨基酸536-541)
tri-scFv的氨基酸序列
tri-scFv 3E10(D31N)是三价单链可变片段，包括310E的3×重链和轻链可变区并且其中在重链的位置31处的天冬氨酸突变为天冬酰胺。tri-scFv 3E10(D31N)的氨基酸序列是：
(SEQ ID NO:13)。
关于SEQ ID NO:13的tri-scFv蛋白质结构域的注释
·AGIH序列增加溶解性(SEQ ID NO:13的氨基酸1-4)
·Vk可变区(SEQ ID NO:13的氨基酸5-115)
·轻链CH1的起始(6aa)(SEQ ID NO:13的氨基酸116-121)
·(GGGGS)3连接子(SEQ ID NO:13的氨基酸122-136)
·VH可变区(SEQ ID NO:13的氨基酸137-252)
·由人类IgG CH1起始13个氨基酸(SEQ ID NO:13的氨基酸253-265)组成的Fv片段之间的连接子
·Swivel序列(SEQ ID NO:13的氨基酸266-271)
·Vk可变区(SEQ ID NO:13的氨基酸272-382)
·轻链CH1的起始(6aa)(SEQ ID NO:13的氨基酸383-388)
·(GGGGS)3连接子(SEQ ID NO:13的氨基酸389-403)
·VH可变区(SEQ ID NO:13的氨基酸404-519)
·由人类IgG CH1起始13个氨基酸(SEQ ID NO:13的氨基酸520-532)组成的Fv片段之间的连接子
·Swivel序列(SEQ ID NO:13的氨基酸533-538)
·Vk可变区(SEQ ID NO:13的氨基酸539-649)
·轻链CH1的起始(6aa)(SEQ ID NO:13的氨基酸650-655)
·(GGGGS)3连接子(SEQ ID NO:13的氨基酸656-670)
·VH可变区(SEQ ID NO:13的氨基酸671-786)
·Myc标签(SEQ ID NO:13的氨基酸787-802)
·His 6标签(SEQ ID NO:13的氨基酸803-808)
WO 2016/033321和Noble等人,《癌症研究》,75(11):2285-2291(2015)指出，di-scFv和tri-scFv与其单价对应物相比具有改善的和额外的活性。下面还提供了对应于每种示范性融合蛋白的不同结构域的子序列。所属领域的技术人员应了解，示范性融合蛋白或其结构域可以用以构建上文更详细讨论的融合蛋白。例如，在一些实施例中，di-scFv包括第一scFv，该第一scFv包括连接到VH可变结构域(例如，SEQ ID NO:12的氨基酸137-252，或其功能变异体或片段)的Vk可变区(例如，SEQ ID NO:12的氨基酸5-115，或其功能变异体或片段)，连接到第二scFv，该第二scFv包括连接到VH可变结构域(例如，SEQ ID NO:12的氨基酸404-519，或其功能变异体或片段)的Vk可变区(例如，SEQ ID NO:12的氨基酸272-382，或其功能变异体或片段)。在一些实施例中，tri-scFv包括连接到第三scFv结构域的di-scFv，第三scFv结构域包括连接到VH可变结构域(例如，SEQ ID NO:13的氨基酸671-786，或其功能变异体或片段)的Vk可变区(例如，SEQ ID NO:13的氨基酸539-649，或其功能变异体或片段)。
Vk可变区可以通过例如连接子(例如，(GGGGS)3(SEQ ID NO:10)，单独地或与轻链CH1的(6aa)(SEQ ID NO:12的氨基酸116-121)组合，连接到VH可变结构域。其它合适的连接子在上文中讨论并且是所属领域中已知的。可以通过连接子(例如，SEQ ID NO:12的人类IgG CH1起始13个氨基酸(253-265))，单独地或与swivel序列(例如，SEQ ID NO:12的氨基酸266-271)组合来连接scFv。其它合适的连接子在上文中讨论并且是所属领域中已知的。
因此，di-scFv可以包括SEQ ID NO:12的氨基酸5-519。tri-scFv可以包括SEQ IDNO:13的氨基酸5-786。在一些实施例中，融合蛋白包括额外的结构域。例如，在一些实施例中，融合蛋白包括增强溶解性的序列(例如，SEQ ID NO:12的氨基酸1-4)。因此，在一些实施例中，di-scFv可以包括SEQ ID NO:12的氨基酸1-519。tri-scFv可以包括SEQ ID NO:13的氨基酸1-786。在一些实施例中，融合蛋白包括一个或多个能增强融合蛋白的纯化、分离、捕获、鉴定、分离等的结构域。示范性结构域包括例如Myc标签(例如，SEQ ID NO:12的氨基酸520-535)和/或His标签(例如，SEQ ID NO:12的氨基酸536-541)。因此，在一些实施例中，di-scFv可以包括SEQ ID NO:12的氨基酸序列。tri-scFv可以包括SEQ ID NO:13的氨基酸序列。其它可取代的结构域和额外的结构域在上文中更详细地讨论。
C.额外部分
1.额外靶向部分
纳米载体可以包括一个或多个额外的与感兴趣的靶标特异性结合的结合部分或靶向部分。代表性靶向部分包括但不限于抗体和其抗原结合片段、适体、肽以及小分子。结合部分可以与形成纳米载体的聚合物缀合。通常，在纳米载体的外壳上展示结合部分。外壳可以充当屏障，防止纳米载体被受试者的免疫系统识别，从而增加纳米载体在受试者中的半衰期。纳米颗粒可以含有疏水核。在脂质体纳米颗粒的情况下，该核也可以是亲水性的。在一些实施例中，疏水核由生物可降解的聚合物材料制成。内核携带治疗性有效负载，并在全身性、腹膜内、口服、经肺或局部施用后以持续的速率释放治疗性有效负载。纳米载体还任选地包括可检测标记，例如允许纳米载体可视化的荧光团或NMR造影剂。
纳米载体的靶向部分可以是抗体或其抗原结合片段。靶向部分应该对靶细胞上的细胞表面受体或细胞表面抗原具有亲和力。靶向部分可以引起靶细胞内纳米载体的内化。
靶向部分能够特异性地识别并结合对细胞类型、组织类型或器官具有特异性的靶分子。靶分子可以是细胞表面多肽、脂质或糖脂。靶分子可以是在特定的细胞表面、组织或器官上选择性表达的受体。细胞特异性标志物可用于特定类型的细胞，包括但不限于干细胞、皮肤细胞、血细胞、免疫细胞、肌细胞、神经细胞、癌细胞、病毒感染细胞、细菌细胞、真菌细胞以及器官特异性细胞。细胞标志物可以对内皮细胞、外胚层细胞或间充质细胞具有特异性。代表性细胞特异性标志物包括但不限于癌症特异性标志物。
靶向部分可以是肽。靶向肽可以与聚合物共价缔合，并且共价缔合可以通过连接子介导。
靶向部分可以是抗体或其抗原结合片段。抗体可以是所属领域中已知的任何类型的免疫球蛋白。举例来说，抗体可以是任何同种型，例如IgA、IgD、IgE、IgG、IgM等。抗体可以是单克隆的或多克隆的。抗体可以是天然存在的抗体，例如从哺乳动物分离和/或纯化的抗体，哺乳动物例如小鼠、兔、山羊、马、鸡、仓鼠、人类等。或者，抗体可以是经过基因改造的抗体，例如人源化抗体或嵌合抗体或其片段、变异体或融合蛋白。抗体可以采用单体形式或聚合物形式。抗体的抗原结合部分可以是任何具有至少一个抗原结合位点的部分，如Fab、F(ab')2、dsFv、sFv、双功能抗体以及三功能抗体。在某些实施例中，抗体是单链抗体。
适体是有能力以高亲和力和特异性识别几乎任何类别的靶分子的寡核苷酸或肽序列。适体与例如小有机物、肽、蛋白质、细胞以及组织的靶标结合。与抗体不同，一些适体表现出立体选择性。适体可以设计成与细胞、组织或器官上表达的特定靶标结合。
2.额外部分
纳米载体可以含有一种或多种聚合物缀合物，其在聚合物与部分之间含有端对端键。该部分可以是靶向部分、可检测标记、或治疗剂、预防剂或诊断剂。例如，聚合物缀合物可以是PLGA-PEG-膦酸酯。额外的靶向元件可以指结合纳米载体或以其它方式将纳米载体定位于特定区域的元件。该区域可以是组织、特定细胞类型或亚细胞区室。纳米载体的靶向元件可以是抗体或其抗原结合片段、适体或小分子(小于500道尔顿)。额外的靶向元件可以对靶细胞上的细胞表面受体或细胞表面抗原具有亲和力，并引起靶细胞内纳米载体的内化。
D.活性剂
待递送的试剂包括治疗、营养、诊断以及预防性化合物。可以递送蛋白质、肽、碳水化合物、多糖、核酸分子和有机分子以及诊断剂。待并入的示范性材料是药物和成像剂。治疗剂包括抗生素、抗病毒剂、抗寄生虫(蠕虫、原生动物)、抗癌剂(本文中称为“化疗剂”，包括细胞毒性药物，如阿霉素、环孢菌素、丝裂霉素C(mitomycin C)、顺铂(cisplatin)和卡铂(carboplatin)、BCNU、5FU、甲氨蝶呤(methotrexate)、亚德里亚霉素(adriamycin)、喜树碱(camptothecin)、埃博霉素(epothilone)A-F以及紫杉醇(taxol))、抗体和其生物活性片段(包括人源化抗体、单链抗体和嵌合抗体)、抗原和疫苗制剂、肽类药物、消炎剂、例如维生素的营养食品以及寡核苷酸药物(包括DNA、RNA，包括mRNA、反义、siRNA、miRNA、抗miRNA、piRNA、适体、核酶、核糖核酸酶P的外部指导序列，以及三链形成剂，如tcPNA)。在一些实施例中，该活性剂是编码寡核苷酸的载体、质粒或其它多核苷酸，如上文所讨论的那些。
待递送的示范性药物包括抗血管生成剂、抗增殖剂以及化疗剂，如雷帕霉素(rampamycin)。
代表性类别的诊断材料包括顺磁分子、荧光化合物、磁分子以及放射性核素。示范性材料包括但不限于金属氧化物，如氧化铁；金属颗粒，如金颗粒等。生物标志物也可以与表面缀合以用于诊断应用。
一种或多种活性剂可以单独配制或与赋形剂一起配制，或封装在纳米载体上、纳米载体中，或并入到纳米载体中。活性剂包括治疗剂、预防剂、营养食品以及诊断剂。可以使用任何合适的试剂。这些试剂包括有机化合物、无机化合物、蛋白质、多糖、核酸或其它可以使用标准技术并入的材料。
活性剂包括合成蛋白质和天然蛋白质(包括酶、肽-激素、受体、生长因子、抗体、信号分子)，以及合成核酸和天然核酸(包括RNA、DNA、反义RNA、三链DNA、抑制性RNA(RNAi)以及寡核苷酸)，以及其生物活性部分。对于小肽和多肽，合适的活性剂的大小是大于约1,000Da，对于蛋白质，合适的活性剂的大小更通常是至少约5,000Da并且常常是10,000Da或更大。核酸更通常以碱基对或碱基(统称为“bp”)列出。本发明的方法中通常使用长度超过约10bp的核酸。对于基因和载体来说，用于探测或治疗用途的核酸的有效长度更通常是在约20bp(探针；抑制性RNA等)到数万bp的范围内。活性剂也可以是亲水性分子，并且任选地具有低分子量。
或者，生物可降解的聚合物可以封装细胞材料，例如，待递送到如下所述的抗原呈递细胞以诱导免疫反应的细胞材料。
预防剂可以包括缓解肿胀、减少辐射损伤的化合物以及消炎剂。
对于成像，可以使用例如锝99(99mTc)的放射性材料或例如Fe2O3的磁性材料。其它材料的实例包括气体或发射气体的化合物，它们是不透射线的。最常见的脑肿瘤成像剂包括氧化铁和钆。诊断剂可以是放射性的、磁性的或x射线或超声波可检测的。其它可检测标记包括例如放射性同位素、荧光团(例如，异硫氰酸荧光素(FITC)、藻红蛋白(PE))、酶(例如，碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶)、元素颗粒(例如，金颗粒)或造影剂。这些标记可被封装在聚合物内，分散在聚合物内，或与聚合物缀合。
例如，荧光标记可以与纳米载体的聚合物化学缀合，产生荧光标记的聚合物。在其它实施例中，该标记是造影剂。造影剂是指用于增强医学成像中结构或流体在体内的对比度的物质。造影剂是所属领域中已知的并且包括但不限于基于X射线衰减和磁共振信号增强而起作用的试剂。合适的造影剂包括碘和钡。
可根据所用治疗的类型来选择活性剂。在下文中更详细地讨论用于治疗癌症、缺血以及受伤的示范性活性剂。
以下实例显示，6.0重量％的DOX被封装在纳米颗粒中。活性剂加载取决于包括活性剂的化学性质和纳米载体的组成在内的因素，然而，一般来说，按重量计约1％到约50％的活性剂被加载到纳米载体中。加载量可以是5％到25％。
III.制造方法
A.缀合物
例如在Braun等人(2005)《聚合物合成理论与实践》(Polymer Synthesis:Theoryand Practice).纽约州纽约(New York,NY)：斯普林格出版社(Springer)中描述了聚合物的合成方法。聚合物可以通过逐步增长聚合、链增长聚合或等离子体聚合来合成。
在一些实施例中，从以第一反应性偶合基团封端的疏水性聚合物和以第二反应性偶合基团封端的亲水性聚合物开始合成两亲性聚合物，第二反应性偶合基团能够与第一反应性偶合基团反应形成共价键。第一反应性偶合基团或第二反应性偶合基团中的一个可以是伯胺，其中另一个反应性偶合基团可以是胺反应性连接基团，如异硫氰酸酯、异氰酸酯、酰基叠氮化物、NHS酯、磺酰氯、醛、乙二醛、环氧化物、环氧乙烷、碳酸酯、芳基卤化物、亚氨酸酯、碳化二亚胺、酸酐以及氟苯酯。第一反应性偶合基团或第二反应性偶合基团中的一个可以是醛，其中另一个反应性偶合基团可以是醛反应性连接基团，如酰肼、烷氧基胺以及伯胺。第一反应性偶合基团或第二反应性偶合基团中的一个可以是硫醇，其中另一个反应性偶合基团可以是巯基反应性基团，如马来酰亚胺、卤代乙酰基以及吡啶基二硫化物。
在一些实施例中，以胺或胺反应性连接基团封端的疏水性聚合物与以互补反应性连接基团封端的亲水性聚合物偶合。例如，可以通过使PLGA-CO(OH)与NHS和偶合试剂反应来形成NHS酯激活的PLGA，偶合试剂例如二环己基碳二亚胺(DCC)或乙基(二甲氨基丙基)碳化二亚胺(EDC)。NHS酯激活的PLGA可以与以伯胺封端的亲水性聚合物、如PEG-NH2反应，形成两亲性PLGA-b-PEG嵌段共聚物。
在一些实施例中，使用相同或类似的偶合反应形成两亲性聚合物与靶向部分的缀合物。在一些实施例中，该缀合物从一端以第一反应性偶合基团封端并且另一端以保护基封端的亲水性聚合物开始制造。该亲水性聚合物与具有与第一反应性基团互补的反应性基团的靶向部分反应，在亲水性聚合物与靶向部分之间形成共价键。然后可以去除保护基，得到第二反应性偶合基团，例如允许疏水性聚合物嵌段与含有靶向部分的亲水性聚合物的缀合物偶合。以与第二反应性偶合基团互补的反应性偶合基团封端的疏水性聚合物然后可以共价偶合，形成缀合物。当然，这些步骤也可以按相反的顺序进行，即，可以先形成疏水性聚合物和亲水性聚合物的缀合物，然后才是去除保护基和靶向部分与亲水性聚合物嵌段的偶合。
在一些实施例中，形成具有与两亲性聚合物的两端都缀合的部分的缀合物。例如，具有疏水性聚合物嵌段和亲水性聚合物嵌段的两亲性聚合物可以具有与亲水性聚合物嵌段缀合的靶向部分以及与疏水性聚合物嵌段缀合的额外部分。在一些实施例中，该额外部分可以是可检测标记。在一些实施例中，该额外部分是治疗剂、预防剂或诊断剂。例如，该额外部分可以是用于放疗的部分。该缀合物可以从一端具有第一反应性偶合基团并且另一端具有第一保护基的疏水性聚合物和一端具有第二反应性偶合基团并且另一端具有第二保护基的亲水性聚合物开始制备。疏水性聚合物可以与具有与第一反应性偶合基团互补的反应性偶合基团的额外部分反应，从而形成疏水性聚合物与额外部分的缀合物。亲水性聚合物可以与具有与第二反应性偶合基团互补的反应性偶合基团的靶向部分反应，从而形成亲水性聚合物与靶向部分的缀合物。可以去除第一保护基和第二保护基，产生一对互补的反应性偶合基团，这对基团可以发生反应，从而将疏水性聚合物嵌段共价连接到亲水性聚合物嵌段。
B.纳米载体形成
1.乳液法
在一些实施例中，使用乳液溶剂蒸发法制备纳米颗粒。例如，将聚合物材料溶解在不能与水混溶的有机溶剂中并与药物溶液或药物溶液的组合混合。在一些实施例中，将待封装的治疗剂、预防剂或诊断剂的溶液与聚合物溶液混合。聚合物可以是(但不限于)以下一种或多种：PLA、PGA、PCL、其共聚物、聚丙烯酸酯、前述聚乙二醇化聚合物、前述聚合物-药物缀合物、前述聚合物-肽缀合物或前述荧光标记的聚合物，或其各种形式的组合。药物分子可以是(但不限于)以下一种或多种：PPARγ激活剂(例如，罗格列酮(Rosiglitazone)，(RS)-5-[4-(2-[甲基(吡啶-2-基)氨基]乙氧基)苄基]噻唑烷-2,4-二酮；吡格列酮(Pioglitazone)，(RS)-5-(4-[2-(5-乙基吡啶-2-基)乙氧基]苄基)噻唑烷-2,4-二酮；曲格列酮(Troglitazone)，(RS)-5-(4-[(6-羟基-2,5,7,8-四甲基苯并二氢吡喃-2-基)甲氧基]苄基)噻唑烷-2,4-二酮等)、前列腺素E2类似物(PGE2，(5Z,11α,13E,15S)-7-[3-羟基-2-(3-羟基辛-1-烯基)-5-氧代-环戊基]庚-5-烯酸等)、β3肾上腺素能受体激动剂(CL316243，5-[(2R)-2-[[(2R)-2-(3-氯苯基)-2-羟乙基]氨基]丙基]-1,3-苯并间二氧杂环戊烯-2,2-二甲酸二钠水合物等)、成纤维细胞生长因子21(FGF-21)、鸢尾素(Irisin)、RNA、DNA、化疗化合物、核磁共振(NMR)造影剂或其组合。不能与水混溶的有机溶剂可以是(但不限于)以下一种或多种：氯仿、二氯甲烷以及酰基乙酸酯。药物可以溶解于(但不限于)以下一种或多种：丙酮、乙醇、甲醇、异丙醇、乙腈以及二甲基亚砜(DMSO)。
在一些实施例中，聚合物溶液含有一种或多种如上所述的聚合物缀合物。聚合物溶液可以含有第一两亲性聚合物缀合物，其具有疏水性聚合物嵌段、亲水性聚合物嵌段以及与亲水端缀合的靶向部分。在一些实施例中，聚合物溶液含有一种或多种额外聚合物或两亲性聚合物缀合物。例如，除了第一两亲性聚合物缀合物之外，聚合物溶液还可以含有一种或多种疏水性聚合物、亲水性聚合物、脂质、两亲性聚合物、聚合物-药物缀合物或含有其它靶向部分的缀合物。通过控制第一两亲性聚合物与额外聚合物或两亲性聚合物缀合物的比率，可以控制靶向部分的密度。以聚合物的重量计，聚合物溶液中可以存在1％到100％的第一两亲性聚合物。例如，以聚合物的重量计，聚合物溶液中可以存在10％、20％、30％、40％、50％或60％的第一两亲性聚合物。
然后向所得混合物溶液中加入水溶液以通过乳化产生乳液溶液。乳化技术可以是(但不限于)探针超声处理或通过均质机均质化。靶向斑块的肽或荧光团或药物可以与本发明颗粒的聚合物基质的表面缔合、被封装在该聚合物基质内、被该聚合物基质包围和/或分布在整个聚合物基质中。
2.纳米沉淀法
在另一个实施例中，使用纳米沉淀法或微流体装置制备多峰纳米颗粒。将聚合物材料与药物或药物组合在能与水混溶的有机溶剂中混合。聚合物可以是(但不限于)以下一种或多种：PLA、PGA、PCL、其共聚物、聚丙烯酸酯、前述聚乙二醇化聚合物、前述聚合物-药物缀合物、前述聚合物-肽缀合物或前述荧光标记的聚合物，或其各种形式的组合。药物分子可以是(但不限于)以下一种或多种：PPARγ激活剂(例如，罗格列酮，(RS)-5-[4-(2-[甲基(吡啶-2-基)氨基]乙氧基)苄基]噻唑烷-2,4-二酮；吡格列酮，(RS)-5-(4-[2-(5-乙基吡啶-2-基)乙氧基]苄基)噻唑烷-2,4-二酮；曲格列酮，(RS)-5-(4-[(6-羟基-2,5,7,8-四甲基苯并二氢吡喃-2-基)甲氧基]苄基)噻唑烷-2,4-二酮等)、前列腺素E2类似物(PGE2，(5Z,11α,13E,15S)-7-[3-羟基-2-(3-羟基辛-1-烯基)-5-氧代-环戊基]庚-5-烯酸等)、β3肾上腺素能受体激动剂(CL 316243，5-[(2R)-2-[[(2R)-2-(3-氯苯基)-2-羟乙基]氨基]丙基]-1,3-苯并间二氧杂环戊烯-2,2-二甲酸二钠水合物等)、RNA、DNA、化疗化合物、核磁共振(NMR)造影剂或其组合。能与水混溶的有机溶剂可以是(但不限于)以下一种或多种：丙酮、乙醇、甲醇、异丙醇、乙腈以及二甲基亚砜(DMSO)。然后将所得混合物溶液加入聚合物非溶剂、如水溶液中，产生纳米颗粒溶液。靶向斑块的肽或荧光团或药物可以与本发明颗粒的聚合物基质的表面缔合、被封装在该聚合物基质内、被该聚合物基质包围和/或分布在整个聚合物基质中。
3.微流体
使用微流体制造纳米颗粒的方法是所属领域中已知的。合适的方法包括Karnik等人在美国专利申请公开第2010/0022680 A1号中所描述的方法。一般来说，微流体装置包括至少两个通道，这两个通道汇聚到混合设备中。通道通常是通过对聚合物表面进行光刻、蚀刻、压花或模塑而形成的。流体源连接到每个通道，并且向流体源施加压力以引起流体在通道中流动。压力可以通过注射器、泵和/或重力施加。具有聚合物、靶向部分、脂质、药物、有效负载等的溶液的入口流汇聚并混合，并且将所得混合物与聚合物非溶剂溶液组合，形成表面上具有所期望的部分大小和密度的纳米颗粒。通过改变入口通道中的压力和流速以及流体源的性质和组成，可以生产具有可再现大小和结构的纳米颗粒。
4.其它方法
溶剂蒸发.在此方法中，将聚合物溶解在例如二氯甲烷的挥发性有机溶剂中。向溶液中加入药物(可溶的或以细颗粒分散的)，并且使混合物悬浮于含有表面活性剂的水溶液中，表面活性剂例如聚(乙烯醇)。搅拌所得乳液直到大部分有机溶剂都蒸发，留下固体微粒。将所得微粒用水洗涤并在冻干器中干燥过夜。通过这种方法可以获得具有不同大小(0.5-1,000微米)和形态的微粒。此方法适用于相对稳定的聚合物，如聚酯和聚苯乙烯。
但是，不稳定的聚合物，如聚酸酐，在制造工艺期间会由于水的存在而发生降解。对于这些聚合物，以下两种在完全无水的有机溶剂中进行的方法更适用。
热熔微封装.在此方法中，首先熔化聚合物，然后将其与固体颗粒混合。将混合物悬浮于不能混溶的溶剂(如硅油)中，并且在连续搅拌下加热到超过聚合物的熔点5℃。一旦乳液稳定，就冷却乳液，直到聚合物颗粒固化。通过用石油醚倾析来洗涤所得微粒，得到自由流动的粉末。通过此方法获得大小在0.5到1000微米之间的微粒。通过此技术制备的球体的外表面通常光滑且致密。此程序用于制备由聚酯和聚酸酐制成的微粒。不过，此方法局限于分子量在1,000-50,000Da之间的聚合物。
溶剂去除.此技术主要是为了聚酸酐设计的。在此方法中，将药物分散或溶解在选定聚合物于例如二氯甲烷的挥发性有机溶剂中的溶液中。此混合物通过搅拌而悬浮于有机油(如硅油)中以形成乳液。与溶剂蒸发不同，此方法可用于从具有高熔点和不同分子量的聚合物制造微粒。通过此程序可以获得在1-300微米之间的范围内的微粒。通过此技术产生的球体的外部形态高度取决于所用聚合物的类型。
喷雾干燥 在此方法中，将聚合物溶解于有机溶剂中。将已知量的活性药物悬浮(不溶性药物)或共溶解(可溶性药物)于聚合物溶液中。然后对溶液或分散液进行喷雾干燥。微型喷雾干燥器(Buchi)的典型工艺参数如下：聚合物浓度＝0.04g/mL，入口温度＝-24℃，出口温度＝13-15℃，抽吸器设定值＝15，泵设定值＝10毫升/分钟，喷雾流量＝600Nl/h，并且喷嘴直径＝0.5mm。获得1-10微米范围内的微粒，其形态取决于所用聚合物的类型。
水凝胶微粒.由凝胶型聚合物如海藻酸盐制成的微粒通过传统的离子胶凝技术产生。首先将聚合物溶解在水溶液中，与硫酸钡或一些生物活性剂混合，然后通过微滴形成装置挤出，该装置在一些情况下采用氮气流来破坏微滴。将缓慢搅拌(大约100-170RPM)的离子硬化浴定位在挤出装置的下方以抓取所形成的微滴。将微粒在浴中保温20到30分钟，以便留出足够的时间来发生胶凝。通过使用各种大小的挤出机或改变氮气或聚合物溶液的流速来控制微粒的粒度。壳聚糖微粒可以通过将聚合物溶解在酸性溶液中并使其与三聚磷酸盐交联来制备。羧甲基纤维素(carboxymethyl cellulose，CMC)微粒可以通过将聚合物溶解在酸溶液中并用铅离子沉淀出微粒来制备。在带负电聚合物(例如海藻酸盐、CMC)的情况下，不同分子量的带正电配体(例如聚赖氨酸、聚乙烯亚胺)可以离子方式连接。
5.脂质体和胶束形成
脂质体通常具有水性核。水性核可以含有水或水和醇的混合物。合适的醇包括但不限于甲醇、乙醇、丙醇(如异丙醇)、丁醇(如正丁醇、异丁烯、仲丁醇、叔丁醇)、戊烷(如戊醇、异丁基甲醇)、己醇(如1-己醇、2-己醇、3-己醇)、庚醇(如1-庚醇、2-庚醇、3-庚醇和4-庚醇)或辛醇(如1-辛醇)或其组合。
脂质体包括例如由单个脂质双层形成的小单层囊泡(small unilamellarvesicle，SUV)；大单层囊泡(large unilamellar vesicleLAN)，这些是由单个脂质双层形成的具有相对较大的颗粒的囊泡；以及由多个膜层形成的多层囊泡(multi-lamellarvesicle，MLV)。因此，脂质体可以具有由一个(单层)或几个(多层)磷脂双层描绘的一个或几个水性区室(Sapra等人,《当代药物递送》(Curr.Drug Deliv.),2,369-81(2005))。多层脂质体具有更多脂质双层，用于与疏水性治疗剂缔合。因此，在脂质体内可能有较大量的治疗剂能够到达靶细胞。
脂质体可以具有任何粒度，例如平均颗粒直径可以是约10到约2000nm。在本发明的一个实施例中，平均颗粒直径是约10、20、25、30、40、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1,000、1,250、1,500、1,750、2,000nm(或在约10与约2,000nm之间的任何范围)或更大。在本发明的一个实施例中，平均颗粒直径是约2,000、1,750、1,500、1,250、1,000、900、800、700、600、500、400、300、200、100、50、40、30、25、20、10nm(或在约2,000与10nm之间的任何范围)或更小。平均颗粒直径可以是约20到约1,000nm、约100到约1,500nm、约100到约1,000nm、约100到约700nm、约200到约2,000nm、约1,000到约2,000nm或约750到约1,500nm。颗粒直径是指通过动态光散射测量的颗粒直径。
脂质体制剂可以含有大脂质体，大脂质体的范围是在制剂中的脂质体群体的1％到100％之间。在一些实施例中，大脂质体占制剂中的脂质体群体的大于约50％。
脂质体的制造方法是所属领域中已知的，并且可以包括例如从有机溶剂中干燥脂质，将脂质分散在水性介质中，纯化所得脂质体，以及分析最终产物。一些脂质体制造方法包括例如挤出法、Mozafari法、多元醇稀释法、气泡法以及加热法。
胶束可以按常规方式制备，例如，通过反相蒸发、乙醚注入、基于表面活性剂的技术等。已经公开了使用具有亲水区段和疏水区段的嵌段共聚物的聚合物胶束制剂，例如，在美国申请第20160114058号、WO 2009/142326 A1以及WO 2010/013836 A1中所公开。
C.将分子封装或连接到颗粒表面的方法
原则上有两组分子需要直接地或通过偶合分子被封装或连接到聚合物上：靶向分子、连接分子以及治疗剂、营养剂、诊断剂或预防剂。这些分子可以使用标准技术偶合。待递送的靶向分子或治疗性分子可以直接偶合到聚合物或偶合到被并入聚合物中的材料，如脂肪酸。
官能性是指配体通过存在于颗粒表面上和存在于待连接的配体上的化学官能团(羧酸、醛、胺、巯基以及羟基)而与颗粒表面缀合。官能性可以通过两种方式引入颗粒中。
第一种是在颗粒的制备期间，例如在颗粒的乳液制备期间，通过并入具有化学官能团的稳定剂。
第二种是在颗粒制备后，通过用同双官能性或异双官能性交联剂直接交联颗粒和配体。这第二种程序可以使用合适的化学和一类交联剂(CDI、EDAC、戊二醛等，如下文更详细地讨论)或任何其它能在制备后通过颗粒表面的化学改性使配体偶合到颗粒表面的交联剂。这第二类还包括一种方法，其中两亲性分子，如脂肪酸、脂质或功能稳定剂，可以被动地吸附并粘附到颗粒表面，从而引入与配体连接的官能性端基。
封装有活性剂的纳米载体的其它各种制造方法是所属领域中已知的。例如，在Wang等人(2009)《材料化学杂志》(J.Mater.Chem.)19,6451中综述了加载纳米多孔结构的方法。在一个实例中，可以通过使纳米载体与活性物质的水溶液接触，然后孵育一段时间来加载纳米载体。活性物质溶液可以含有过量的待加载到超颗粒上的活性物质并且孵育可以在室温下发生。可以使用含有超颗粒和有效负载的溶液的搅拌来增强有效负载的加载。
IV.药物组合物
可以将颗粒与适当的药学上可接受的载体一起配制成药物组合物，用于向有此需要的受试者施用。制剂可以肠内(例如口服)或胃肠外(例如通过注射或输注)施用。
颗粒可以被配制成用于肠胃外施用。如本文中所使用的“肠胃外施用”意指通过除了通过消化道或非侵入性局部或区域途径之外的任何方法施用。例如，肠胃外施用可以包括静脉内、皮内、动脉内、腹膜内、病灶内、颅内、关节内、前列腺内、胸膜内、气管内、玻璃体内、瘤内、肌肉内、皮下、结膜下、囊内、心包内、脐内、通过注射以及通过输注而向患者施用。
在一些实施例中，通过例如注射或输注来全身性施用纳米载体。在一些实施例中，通过注射或输注来局部施用纳米载体。在更特定实施例中，通过对流增强递送(CED)，向中枢神经系统，特别是脑施用纳米载体。
肠胃外制剂可以使用所属领域中已知的技术以水性组合物形式制备。通常，可以将此类组合物制备为可注射制剂，例如溶液或悬浮液；适用于在注射前在加入重构介质后制备出溶液或悬浮液的固体形式；乳液，如油包水型(w/o)乳液、水包油型(o/w)乳液以及其微乳液、脂质体或乳脂体。
载体可以是溶剂或分散介质，其含有例如水、乙醇、一种或多种多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇)、油，如植物油(例如花生油、玉米油、芝麻油等)以及其组合。例如，通过使用例如卵磷脂的包衣，通过在分散的情况下维持所需的纳米载体大小和/或通过使用表面活性剂，可以维持适当的流动性。在许多情况下，包括等渗剂，例如糖或氯化钠。
活性化合物呈游离酸或游离碱或其药学上可接受的盐形式的溶液和分散液可以在水或另一种溶剂或分散介质中制备，适当地与一种或多种药学上可接受的赋形剂混合，所述赋形剂包括但不限于表面活性剂、分散剂、乳化剂、pH调节剂、粘度调节剂以及其组合。
合适的表面活性剂可以是阴离子型、阳离子型、两性或非离子型表面活性剂。合适的阴离子型表面活性剂包括但不限于含有羧酸根、磺酸根以及硫酸根离子的表面活性剂。阴离子型表面活性剂的实例包括长链烷基磺酸和烷基芳基磺酸的钠盐、钾盐、铵盐，如十二烷基苯磺酸钠；二烷基磺基琥珀酸钠，如十二烷基苯磺酸钠；二烷基磺基琥珀酸钠，如双-(2-乙基硫氧基)-磺基琥珀酸钠；以及烷基硫酸盐，如月桂基硫酸钠。阳离子型表面活性剂包括但不限于季铵化合物，如苯扎氯铵(benzalkonium chloride)、苄索氯铵(benzethonium chloride)、西曲溴铵(cetrimonium bromide)、硬脂基二甲基苄基氯化铵、聚氧乙烯以及椰子胺。非离子型表面活性剂的实例包括乙二醇单硬脂酸酯、丙二醇肉豆蔻酸酯、单硬脂酸甘油酯、硬脂酸甘油酯、聚甘油基-4-油酸酯、脱水山梨糖醇酰化物、蔗糖酰化物、PEG-150月桂酸酯、PEG-400单月桂酸酯、聚氧乙烯单月桂酸酯、聚山梨醇酯、聚氧乙烯辛基苯基醚、PEG-1000鲸蜡基醚、聚氧乙烯十三烷基醚、聚丙二醇丁基醚、401、硬脂酰基单异丙醇酰胺以及聚氧乙烯氢化动物脂酰胺。两性表面活性剂的实例包括N-十二烷基-β-丙氨酸钠、N-月桂基-β-亚氨基二丙酸钠、肉豆蔻酰两性乙酸盐、月桂基甜菜碱以及月桂基磺基甜菜碱。
制剂可以含有防腐剂以防止微生物生长。合适的防腐剂包括但不限于对羟苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸以及硫柳汞。制剂还可以含有抗氧化剂以防止活性剂降解。
通常将制剂在重构后缓冲到pH 3-8以进行肠胃外施用。合适的缓冲液包括但不限于磷酸盐缓冲液、乙酸盐缓冲液以及柠檬酸盐缓冲液。
用于肠胃外施用的制剂中常常使用水溶性聚合物。合适的水溶性聚合物包括但不限于聚乙烯吡咯烷酮、葡聚糖、羧甲基纤维素以及聚乙二醇。
无菌可注射溶液可以通过将所需量的活性化合物并入含有上面所列举的赋形剂中的一种或多种(根据需要)的适当的溶剂或分散介质中，然后过滤灭菌来制备。一般来说，分散液通过将各种已灭菌的活性成分并入无菌媒剂中来制备，该无菌媒剂含有基础分散介质和来自上面所列举的那些的其它所需成分。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，示范性制备方法包括真空干燥和冷冻干燥技术，其从预先无菌过滤的溶液中产生活性成分加所期望的任何额外成分的粉末。可以按纳米载体本质上是多孔的方式来制备粉末，这可以增加纳米载体的溶解。多孔纳米载体的制造方法是所属领域中众所周知的。
肠内制剂使用药学上可接受的载体制备。如本文中通常所使用的“载体”包括但不限于稀释剂、防腐剂、粘合剂、润滑剂、崩解剂、溶胀剂、填料、稳定剂以及其组合。剂型中所用的聚合物包括疏水性或亲水性聚合物和pH依赖性或独立的聚合物。疏水性和亲水性聚合物包括但不限于羟丙基甲基纤维素、羟丙基纤维素、羟乙基纤维素、羧甲基纤维素、聚乙二醇、乙基纤维素、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、聚乙酸乙烯酯以及离子交换树脂。
载体还包括包衣组合物中的所有组分，其可包括增塑剂、颜料、着色剂、稳定剂以及助流剂。可以使用一种或多种药学上可接受的赋形剂制备制剂，所述赋形剂包括稀释剂、防腐剂、粘合剂、润滑剂、崩解剂、溶胀剂、填料、稳定剂以及其组合。
控制释放给药制剂可以如标准参考文献中所述制备，如《医药剂型片剂》(Pharmaceutical dosage form tablets)，Liberman等人编(纽约(New York)，马塞尔德克公司(Marcel Dekker,Inc.)，1989)；《雷明顿-药学的科学与实践》(Remington-Thescience and practice of pharmacy)，第20版，马里兰州巴尔的摩的利平科特·威廉斯·威尔金斯出版公司(Lippincott Williams&Wilkins,Baltimore,MD)，2000；以及《医药剂型和药物递送系统》(Pharmaceutical dosage forms and drug delivery systems)，第6版，Ansel等人，(宾夕法尼亚州米迪亚(Media,PA)：威廉斯·威尔金斯出版公司(Williams andWilkins)，1995)。这些参考文献提供关于用于制备片剂和胶囊以及片剂、胶囊和颗粒剂的延迟释放剂型的赋形剂、材料、设备以及方法的信息。这些参考文献提供关于用于制备片剂和胶囊以及片剂、胶囊和颗粒剂的延迟释放剂型的载体、材料、设备以及方法的信息。
稳定剂用于抑制或延迟药物分解反应，药物分解反应包括例如氧化反应。合适的稳定剂包括但不限于抗氧化剂丁基化羟基甲苯(BHT)；抗坏血酸、其盐和酯；维生素E、生育酚以及其盐；亚硫酸盐，如焦亚硫酸钠；半胱氨酸和其衍生物；柠檬酸；没食子酸丙酯以及丁基化羟基苯甲醚(BHA)。
V.使用方法
A.治疗方法
所公开的纳米载体可用于将活性剂递送到体内细胞外DNA位点。通常，有效量的具有抗DNA或抗核小体靶向部分的加载有活性剂的纳米载体向有此需要的受试者施用，该靶向部分例如3E10或由其衍生的片段或融合蛋白。如本文中所使用的术语“有效量”或“治疗有效量”意指足以治疗、抑制或缓解待治疗病症的一种或多种症状或以其它方式提供所期望的药理学和/或生理学作用的剂量。精确剂量将根据所选择的活性剂和多种因素而变化，例如受试者因变量(例如年龄、免疫系统健康等)、疾病以及正在进行的治疗。如下文更详细讨论的，在一些实施例中，受试者有癌症、缺血或受伤。当与对照相比时，组合物更有效、毒性更小或其组合。在一些实施例中，对照是用游离活性剂或被封装在非靶向纳米载体中的活性剂处理的细胞、组织或受试者。
还提供了检测癌症、组织损伤、受伤或缺血的部位的方法。方法通常包括向有此需要的受试者施用有效量的在药学上可接受的载体中的靶向纳米载体。纳米载体通常加载有可使用诊断成像或核医疗学技术检测的试剂，例如通过PET-CT、骨扫描、MRI、CT、超声波心动描记术、超声波或x射线来检测。
B.给药方案
区分肿瘤内微环境与健康组织微环境的关键特征是相对较大量的细胞外DNA(exDNA)的存在(Weisbart等人,《科学报告》,5:12022(2015)；Stroun等人,《临床化学学报》(Clin Chim Acta),313(1-2):139-142(2001)；Sueoka-Aragane等人,《公共科学图书馆·综合》(PloS One),9(12)(2014)；Wen等人,《癌症研究》,73(14):4256-4266(2013))，其源自活跃分裂、凋亡或坏死的肿瘤细胞和中性粒细胞细胞外陷阱(Wen等人,《癌症研究》,73(14):4256-4266(2013)；Hawes等人,《癌症研究》,75(20):4260-4264(2015)；Demers等人,《美国国家科学院院刊》(Proc Natl Acad Sci USA),109(32):13076-13081(2012))。重要的是，在用细胞毒性剂如DOX治疗期间，肿瘤区域中exDNA的量进一步增加，这导致肿瘤细胞死亡和DNA释放(Swystun等人,《血栓和止血杂志》(J Thromb Haemost),9(11):2313-2321(2011)；Hansen等人,《科学·转化医学》,4(157):157ra142(2012))。与正常组织相比，肿瘤环境中较大浓度的exDNA提供了使用与DNA具有高亲和力的试剂开发新的肿瘤靶向方法的机会。
以下实例说明，当纳米载体加载有诱导靶位点细胞死亡的活性剂时，随着时间的推移，抗DNA抗体-纳米载体的定位变得越来越有效地靶向细胞外DNA，并且递送更多的治疗，因为当发生这种情况时，死细胞或垂死细胞释放越来越多的DNA并将越来越多的靶向纳米载体吸引到细胞外DNA位点。此方法可以称为“自催化的”，意味着它产生其自身的正反馈回路(positive feedback loop)来刺激纳米载体越来越好地定位到靶位点。尽管此方法对于治疗癌症以及其它期望增加细胞死亡的疾病、病症和病状特别有效，但是给药方案包括两次或更多次施用，可用于任何治疗方法。
一般来说，仅举例而言，适用于所公开的方法中的剂型可以包括在以下范围内的剂量的纳米载体：1mg到1,000mg、10mg到750mg、15mg到500mg、或20mg到250mg、或25mg到200mg、或30mg到150mg、或35mg到125mg、或40mg到100mg、或45mg到90mg、或50mg到80mg。
剂量范围取决于待递送的药物、递送媒剂以及递送方法。在以下实例中，给小鼠施用1mg/小鼠的纳米颗粒。
在一些实施例中，每1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或31天向有此需要的受试者施用组合物一次。在一些实施例中，每周向受试者施用组合物一次、两次或三次。在一些实施例中，每月向受试者施用组合物一次、两次或三次。
在特定实施例中，以一次或多次施用方式施用时，每周施用的剂量是约1mg/kg到约1,500mg/kg。例如，在特定实施例中，每周向受试者施用约10mg/kg、20mg/kg、30mg/kg、40mg/kg、50mg/kg、60mg/kg、70mg/kg、80mg/kg、90mg/kg或100mg/kg一次、两次或三次。在一些实施例中，单剂量足以改善疾病的一种或多种症状。在一些实施例中，第二剂量后的改善大于第一剂量。
C.待治疗疾病
1.癌症
a.待治疗癌症
所公开的组合物和方法可用于治疗有此需要的受试者的癌症。在成熟的动物中，在大多数器官和组织中，细胞更新和细胞死亡之间通常保持平衡。体内各种类型的成熟细胞具有给定的寿命；当这些细胞死亡时，通过各种类型干细胞的增殖和分化产生新细胞。在正常情况下，新细胞的产生受到如此调节，使得任何特定类型细胞的数量保持恒定。然而，偶尔会出现不再对正常生长控制机制产生反应的细胞。这些细胞产生细胞克隆，其可以扩展到相当大的尺寸，产生肿瘤或赘生物。不能无限生长并且不会广泛侵入健康周围组织的肿瘤是良性的。继续生长并逐渐侵入的肿瘤是恶性的。术语癌症特指恶性肿瘤。除了不受控制的生长，恶性肿瘤还表现出转移。在这个过程中，小的癌细胞簇从肿瘤中移出，侵入血液或淋巴管，并被带到其它组织，在那里它们继续增殖。以这种方式，一个部位的原发性肿瘤可以在另一个部位产生继发性肿瘤。
本文中所描述的组合物和方法适用于通过延迟或抑制受试者中肿瘤的生长、减少肿瘤的生长或大小、抑制或减少肿瘤的转移和/或抑制或减少与肿瘤发展或生长相关的症状来治疗患有良性或恶性肿瘤的受试者。以下实例表明本文中所公开的颗粒和方法适用于体内治疗癌症。
可以治疗的恶性肿瘤在本文中根据肿瘤来源组织的胚胎起源进行分类。癌瘤是由内胚层或外胚层组织产生的肿瘤，这些组织例如皮肤或内脏器官和腺体的上皮衬里。所公开的组合物对于治疗癌瘤特别有效。较少出现的肉瘤衍生自中胚层结缔组织，如骨、脂肪和软骨。白血病和淋巴瘤是骨髓造血细胞的恶性肿瘤。白血病以单细胞形式增殖，而淋巴瘤倾向于以肿瘤块形式生长。恶性肿瘤可能出现在身体的许多器官或组织中，形成癌症。
可以用所提供的组合物和方法治疗的癌症类型包括但不限于癌症，如血管癌，如多发性骨髓瘤；腺癌和骨肉瘤、膀胱癌、脑癌、乳腺癌、宫颈癌、结肠直肠癌、食管癌、肾癌、肝癌、肺癌、鼻咽癌、胰腺癌、前列腺癌、皮肤癌、胃癌以及子宫癌。在一些实施例中，所公开的组合物用于同时治疗多种癌症类型。组合物也可用于治疗多个位置的转移瘤或肿瘤。
所公开的组合物可用于治疗经历不受调节的生长、侵袭或转移的细胞。
肿瘤细胞缺氧现在被认为是癌症治疗中的一个问题，因为它使癌细胞对辐射和一些化疗剂的治疗具有抗性。还已知缺氧会导致癌细胞中DNA修复受损。因此，在一些实施例中，所公开的组合物用作缺氧肿瘤细胞的靶向剂。
如上文所讨论的，在一些实施例中，3E10抗体或由其衍生的片段或融合蛋白除了用作靶向部分外，还是活性剂。如WO 2012/135831和WO 2016/033321中所讨论的，3E10抗体和片段和融合蛋白活性剂特别适用于治疗DNA修复受损的细胞，并且可以单独使用或与DNA损伤剂和放疗组合使用。
在一些实施例中，组合物对DNA修复受损的细胞是致死的。细胞在基因表达方面或在参与DNA修复、DNA合成或同源重组的蛋白质的功能方面可能是有缺陷的。示范性基因和相关产物包括XRCC1、ADPRT(PARP-1)、ADPRTL2(PARP-2)、聚合酶β、CTPS、MLH1、MSH2、FANCD2、PMS2、p53、p21、PTEN、RPA、RPA1、RPA2、RPA3、XPD、ERCC1、XPF、MMS19、RAD51、RAD51B、RAD51C、RAD51D、DMC1、XRCCR、XRCC3、BRCA1、BRCA2、PALB2、RAD52、RAD54、RAD50、MRE11、NB51、WRN、BLM、KU70、KU80、ATM、ATR CHK1、CHK2、FANC基因家族、FANCA、FANCB、FANCC、FANCD1、FANCD2、FANCE、FANCF、FANCG、FANCL、FANCM、RAD1以及RAD9。
在一些实施例中，缺陷基因是肿瘤遏制基因。在一些实施例中，该基因与维持染色体完整性和/或保护免受遗传毒性应激有关。在一些实施例中，这些细胞在单股和/或双股断裂修复方面有缺陷。
在一些实施例中，细胞在BRCA1、BRCA2和/或PTEN中具有一个或多个突变。基因突变，如BRCA1、BRCA2、PTEN突变，可以使用标准PCR、杂交或测序技术鉴定。
在特定实施例中，癌细胞由于缺氧而导致在DNA损伤修复方面有缺陷。
因此，在一些实施例中，组合物可用于治疗由DNA修复缺陷型家族性综合征引起的癌症，如乳腺癌、卵巢癌和胰腺癌。在这些实施例中，抗DNA抗体是有效的，不需要放疗或化疗。例如，组合物可用于治疗与BRCA1、BRCA2、PALB2或RAD51B、RAD51C、RAD51D或相关基因中的突变相关的癌症。组合物还可用于治疗与跟DNA错配修复相关的基因中的突变相关的结肠癌、子宫内膜肿瘤或脑肿瘤，这些基因例如MSH2、MLH1、PMS2以及相关基因。抗原结合分子也可用于治疗具有沉默的DNA修复基因的癌症，这些基因例如BRCA1、MLH1或RAD51B、RAD51C或RAD51D。抗原结合分子还可用于治疗与染色体维持或遗传毒性应激相关的癌症，例如PTEN突变或沉默的癌症。PTEN经常在许多癌症中失活，这些癌症包括乳腺癌、前列腺癌、神经胶质瘤、黑素瘤以及肺癌。在这些实施例中，抗原结合分子抑制DNA修复的能力与这些癌症的固有修复缺陷或其它易感性相结合可足以诱导细胞死亡。
可以使用所公开的组合物治疗的代表性但非限制性的癌症列表包括血液和淋巴系统的癌症(包括白血病、霍奇金氏淋巴瘤(Hodgkin's lymphomas)、非霍奇金氏淋巴瘤、孤立性浆细胞瘤、多发性骨髓瘤)、泌尿生殖系统的癌症(包括前列腺癌、膀胱癌、肾癌、尿道癌、阴茎癌、睾丸癌)、神经系统的癌症(包括脑膜瘤、神经胶质瘤、胶质母细胞瘤、室管膜瘤)、头颈部癌症(包括口腔、鼻腔、鼻咽腔、口咽腔、喉以及鼻旁窦的鳞状细胞癌)、肺癌(包括小细胞肺癌和非小细胞肺癌)、妇科癌症(包括宫颈癌、子宫内膜癌、阴道癌、卵巢外阴癌以及输卵管癌)、胃肠癌(包括胃癌、小肠癌、结肠直肠癌、肝癌、肝胆癌以及胰腺癌)、皮肤癌(包括黑素瘤、鳞状细胞癌以及基底细胞癌)、乳腺癌(包括导管癌和小叶癌以及三阴性乳腺癌)以及儿科癌症(包括成神经细胞瘤、尤文氏肉瘤(Ewing's sarcoma)、韦尔姆斯氏肿瘤(Wilms tumor)、成神经管细胞瘤)。
在一些实施例中，癌症是对放疗或化疗表现出一些抗性的赘生物或肿瘤。在特定实施例中，癌细胞由于缺氧而对辐射或化疗具有抗性。
对于使用标准方法进行放疗具有抗性的癌症包括但不限于肉瘤、肾细胞癌、黑素瘤、淋巴瘤、白血病、癌瘤、胚细胞瘤以及生殖细胞肿瘤。
b.癌症的示范性活性剂
治疗
作为3E10抗体或由其衍生的片段或融合蛋白的补充或替代，可以给纳米载体加载用于治疗或诊断癌症的蛋白质、肽、碳水化合物、多糖、核酸分子、有机分子、诊断活性剂或其组合。
在一些实施例中，活性剂是治疗性药物。大多数化疗药可分为烷化剂、抗代谢物、蒽环霉素(anthracycline)、植物生物碱，拓扑异构酶抑制剂(topoisomerase inhibitor)、单克隆抗体以及其它抗肿瘤剂。
损伤DNA或抑制DNA修复的抗赘生性药物的非限制性实例包括卡铂、卡莫司汀(carmustine)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、顺铂、环磷酰胺(cyclophosphamide)、达卡巴嗪(dacarbazine)、柔红霉素(daunorubicin)、阿霉素、表柔比星(epirubicin)、伊达比星(idarubicin)、异环磷酰胺(ifosfamide)、洛莫司汀(lomustine)、氮芥(mechlorethamine)、米托蒽醌(mitoxantrone)、奥沙利铂(oxaliplatin)、丙卡巴肼(procarbazine)、替莫唑胺(temozolomide)以及戊柔比星(valrubicin)。在一些实施例中，抗赘生性药物是替莫唑胺，这是通常用于抗胶质母细胞瘤的DNA损伤性烷化剂。在一些实施例中，抗赘生性药物是PARP抑制剂，其抑制DNA损伤的碱基切除修复步骤。例如，PARP抑制剂可以是奥拉帕尼(C24H23FN4O3)。
在一些实施例中，抗赘生性药物是组蛋白脱乙酰基酶抑制剂，其遏制转录水平的DNA修复并破坏染色质结构。在一些实施例中，抗赘生性药物是蛋白酶体抑制剂，其通过破坏细胞中的遍在代谢来遏制DNA修复。泛素是一种调节DNA修复的信号传导分子。在一些实施例中，抗赘生性药物是激酶抑制剂，其通过改变DNA损伤反应信号传导途径来遏制DNA修复。
额外的抗赘生性药物包括但不限于烷化剂(如替莫唑胺、顺铂、卡铂、奥沙利铂、氮芥、环磷酰胺、苯丁酸氮芥、达卡巴嗪、洛莫司汀、卡莫司汀、丙卡巴肼、苯丁酸氮芥以及异环磷酰胺)、抗代谢物(如氟尿嘧啶(fluorouracil)、吉西他滨(gemcitabine)、甲氨蝶呤、阿糖胞苷(cytosine arabinoside)、氟达拉滨(fludarabine)以及氟尿苷(floxuridine))、一些抗有丝分裂剂和长春花生物碱(vinca alkaloids)(如长春新碱(vincristine)、长春碱(vinblastine)、长春瑞滨(vinorelbine)以及长春地辛(vindesine))、蒽环霉素(包括阿霉素、柔红霉素、戊柔比星、伊达比星和表柔比星，以及放线菌素(actinomycin)，如放线菌素D)、细胞毒性抗生素(包括丝裂霉素、普鲁卡霉素(plicamycin)和博来霉素(bleomycin))以及拓扑异构酶抑制剂(包括喜树碱，如伊立替康(irinotecan)和拓扑替康(topotecan)，和表鬼臼毒素(epipodophyllotoxin)的衍生物，如安吖啶(amsacrine)、依托泊苷(etoposide)、磷酸依托泊苷以及替尼泊苷(teniposide))以及细胞骨架靶向药物，如太平洋紫杉醇(paclitaxel)。
在一些实施例中，活性剂是放射增敏剂。已知的放射增敏剂的实例包括顺铂、吉西他滨、5-氟尿嘧啶、己酮可可碱(pentoxifylline)、长春瑞滨、PARP抑制剂、组蛋白脱乙酰基酶抑制剂以及蛋白酶体抑制剂。
在一些实施例中，活性剂是太平洋紫杉醇、喜树碱和或衍生物。
在一些实施例中，相对于游离药物，当在所公开的纳米载体中施用时，活性剂的剂量可减少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、70、80％或更多。
c.组合疗法
所公开的组合物可以与标准的化疗、放射疗法以及其它抗癌治疗组合使用。放射疗法(又名放疗)是电离辐射作为用于控制恶性细胞的癌症治疗的一部分的医学用途。放疗在非恶性病状中也有一些应用，例如治疗三叉神经痛、严重的甲状腺眼病、翼状胬肉、色素沉着绒毛结节性滑膜炎，预防瘢痕疙瘩疤痕生长和预防异位骨化。在一些实施例中，所公开的抗原结合分子用于增加对非恶性病状的辐射敏感性。
放射疗法通过破坏分裂细胞、例如癌细胞的DNA来起作用。这种DNA损伤是由两种能量中的一种，即光子或带电颗粒引起的。这种损伤是直接的或间接的。间接电离是由于水电离，形成自由基，特别是羟基自由基，然后自由基损伤DNA而发生的。例如，由光子疗法引起的大部分辐射效应是通过自由基。光子放疗的主要局限之一是实体肿瘤细胞变得缺氧，并且缺氧环境中的肿瘤细胞对辐射损伤的抵抗力可能比正常氧气环境中的肿瘤细胞的这种抵抗力高2到3倍。
癌细胞DNA的直接损伤通过高线性能量转移(linear energy transfer，LET)带电颗粒发生，这些带电颗粒例如质子、硼、碳或氖离子。这种损伤与肿瘤供氧无关，因为这些颗粒主要通过直接能量转移起作用，通常导致双股DNA断裂。由于质量相对较大，所以质子和其它带电颗粒在组织中几乎没有侧向散射；光束不会变宽太多，保持聚焦在肿瘤形状上，并向周围组织递送小剂量的副作用。光子放射疗法中所用的辐射量以戈瑞(Gy)为单位测量，并且根据所治疗的癌症的类型和阶段而变化。对于治愈性病例，实体上皮肿瘤的典型剂量范围是60到70Gy，而淋巴瘤用较低剂量治疗。术后(辅助)剂量通常是约45-60Gy，分成1.8-2Gy的部分(对于乳腺癌、头颈癌来说)。放射肿瘤学家在选择剂量时考虑了许多其它因素，包括患者是否正在接受化疗、患者共病(patient co-morbidities)、放射疗法是在手术前还是手术后施用以及手术的成功程度。
癌症对辐射的反应由其辐射敏感性来描述。通过适度剂量的辐射迅速杀死高度辐射敏感的癌细胞。这些包括白血病、大多数淋巴瘤以及生殖细胞肿瘤。大多数上皮癌仅具有中等辐射敏感性，并且需要显著更高剂量的辐射(60-70Gy)才能实现根治性治愈。某些类型的癌症特别抗辐射，即，产生根治性治愈所需的剂量远高于临床实践中可能安全的剂量。肾细胞癌和黑素瘤通常被认为是抗辐射的。
肿瘤对放疗的反应也与其大小有关。由于复杂的原因，非常大的肿瘤对辐射的反应不如较小的肿瘤或微观疾病。使用各种策略来克服这种影响。最常见的技术是放疗前的手术切除。这在乳腺癌的治疗中最常见，先进行广泛局部切除或乳房切除术，然后辅助放疗。另一种方法是在根治性放疗前用新辅助化疗缩小肿瘤。第三种技术是通过在放疗进程期间给予某些药物来增强癌症的辐射敏感性。在一些实施例中，所公开的组合物可以实现第二种技术、第三种技术或其组合。
2.缺血
在一些实施例中，组合物用于将治疗剂靶向缺血部位。缺血是一种血管病状，涉及组织、器官或四肢的动脉供血中断，如果不治疗，可能导致组织死亡。因此，缺血可以诱导坏死，导致细胞外DNA的积累。它可能由栓塞、动脉粥样硬化动脉血栓形成或创伤引起。例如静脉流出阻塞和低流量状态的静脉问题会引起急性动脉缺血。动脉瘤是急性动脉缺血的最常见病因之一。其它病因是心脏病状，包括心肌梗塞、二尖瓣病、慢性心房颤动、心肌病以及假体，所有这些都易于发生血栓形成。常见类型的缺血包括例如大肠和小肠缺血，其可包括缺血性结肠炎；急性和慢性脑缺血，其可包括短暂性缺血发作或中风；肢体缺血，包括急性肢体缺血；以及皮肤缺血。
在用于治疗缺血的一些实施例中，给所公开的纳米载体加载活性剂，该活性剂增加血流、减少凝血(例如，采用抗凝血剂，如肝素)、诱导动脉扩张或诱导或增加血栓溶解(例如，采用重组组织型纤溶酶原激活剂(recombinant tissue plasminogen activator，rtPA)、链激酶、尿激酶等)；或加载保护和/或促进缺血区域细胞存活的试剂(如细胞保护性蛋白质，包括热休克蛋白)。在一些实施例中，相对于游离药物，当在所公开的纳米载体中施用时，活性剂的剂量可减少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、70、80％或更多。
在一些实施例中，增强脑细胞、如神经元的存活的一种组合物。
在一些实施例中，纳米载体是微泡。例如，微泡可以是用于将氧气通过媒剂输送(vehiculating)到缺氧组织的治疗装置。它们可以显示出适当的渗透性和扩散性，并且可以是无毒的。参见例如Bisazza等人,工程医学和生物学学会(Engineering in MedicineandBiology Society),2008.EMBS 2008.IEEE第30界年度国际会议(2008年8月20-25日),10.1109/IEMBS.2008.4649599，其描述了壳聚糖包被的平均直径为2.5μm的氧气微泡，其在‘体外’和‘体内’制剂中均能有效地递送氧气，并且可以方便地代谢，逆转细胞缺氧反应。还参见美国专利第9,107,950号和WO 2009/043031。使用所公开的靶向抗体，可以将包括载氧微泡在内的微泡靶向感兴趣的组织，如缺氧组织。用于修饰微泡以包括靶向部分的组合物和方法是所属领域中已知的，参见例如Yeh等人,《用于超声波分子成像的靶向微泡》(ATargeting Microbubble for Ultrasound Molecular Imaging),《公共科学图书馆·综合》,10(7):e0129681.doi:10.1371/journal.pone.0129681(2015)。
3.受伤
所公开的组合物可用于治疗受伤。受伤通常可以定义为身体损伤，其可以由例如事故、跌倒、击打、武器等引起。受伤包括伤口、脑受伤、神经受伤以及软组织受伤。受伤可以是身体任何部位的受伤，例如头部、颈部、喉咙、背部、眼睛、鼻子、喉咙、胸部、脚、脚趾、手、手指、膝盖、肘部等。受伤可以是身体的任何器官或组织的受伤，例如肾脏、肝脏、脊髓、肌肉、骨骼等。器官受伤的实例是心脏缺血性受伤。
在一些实施例中，组合物用于递送用于治疗急性伤口、慢性伤口或已感染伤口的活性剂。伤口愈合涉及表皮和真皮细胞、细胞外基质、受控制的血管生成以及血浆衍生蛋白之间的复杂相互作用，所有这些都由一系列细胞因子和生长因子来协调。这个动态过程被经典地分为几个重叠阶段：炎症、增殖、迁移以及重塑。
可被治疗的代表性慢性不愈合伤口包括但不限于糖尿病性溃疡、动脉溃疡、静脉溃疡、压力(褥疮)溃疡以及烧伤。急性伤口包括伴随受伤或手术的伤口。细菌生物膜会损害皮肤伤口愈合并降低愈合或治疗被感染的皮肤伤口的过程中的局部抗菌效率。生物膜细菌对我们的免疫防御系统不太敏感，因此，生物膜相关感染可以持续很长一段时间(即，从急性感染进展到慢性感染)。
在一些实施例中，受试者患有炎性疾病。例如，炎性疾病可能是有害刺激的结果，有害刺激例如病原体、受损细胞或刺激物。炎性疾病也可能是超敏反应或自身免疫的结果。
免疫系统经常与炎性病症有关，在过敏反应和一些肌病中均有显示，其中许多免疫系统病症导致异常炎症。在炎症过程中具有病因起源的非免疫疾病包括癌症、动脉粥样硬化以及缺血性心脏病。与炎症相关的病症的实例包括：寻常痤疮、哮喘、动脉粥样硬化、自身免疫疾病、慢性前列腺炎、肾小球肾炎、超敏反应、炎性肠病、盆腔炎性疾病、再灌注受伤、类风湿性关节炎、结节病、移植排斥、血管炎以及间质性膀胱炎。
用于治疗受伤的活性剂可根据受伤来选择，但可以包括止痛剂、麻醉剂、消炎剂、抗感染剂、细胞因子、趋化因子、免疫调节剂、其它促进愈合的试剂以及保护和/或促进受伤区域细胞存活的试剂(如细胞保护性蛋白质，包括热休克蛋白)。在一些实施例中，相对于游离药物，当在所公开的纳米载体中施用时，活性剂的剂量可减少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、70、80％或更多。
4.感染
a.待治疗的感染
细胞外DNA也可以在感染区域中找到。因此，所公开的组合物和方法可用于治疗有此需要的受试者的感染。在成熟的动物中，免疫系统通常预防或消除感染，但在某些情况下，入侵的生物体，如细菌、病毒、真菌、寄生虫，本身可以在生物体中形成并引起可能导致显著症状并且危及生命的感染。由于来自细胞裂解、中性粒细胞裂解以及中性粒细胞细胞外陷阱(NET)的释放，所以感染部位与细胞外DNA的量增加有关(Okshevsky等人,《生物技术新见》(Curr Opin Biotech),2015,33:73-80)(Whitchurch等人,《科学》,2002,295:1487)(Allesen-Holm等人,《分子生物学》(Mol Biol)2006,59:1114-1128)，并且因此可以使用本文中所公开的组合物和方法靶向感染部位。
本文中所描述的组合物和方法适用于通过延迟或抑制受试者中感染的进展、减少和/或根除感染、和/或抑制或减轻与感染相关的症状和/或减小根除感染所需的其它抗感染剂的剂量来治疗具有感染的受试者。
可用所提供的组合物和方法治疗的感染类型包括但不限于细菌感染、病毒感染、真菌感染以及寄生虫感染。
b.用于感染的示范性活性剂
治疗
作为3E10抗体或由其衍生的片段或融合蛋白的补充或替代，可以给纳米载体加载用于治疗或诊断感染的蛋白质、肽、碳水化合物、多糖、核酸分子、有机分子、诊断活性剂或其组合。
在一些实施例中，活性剂是治疗性药物。抗感染药的非限制性实例包括抗生素、抗病毒剂、抗寄生虫药。
在一些实施例中，相对于游离药物，当在所公开的纳米载体中施用时，活性剂的剂量可减少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、70、80％或更多。
5.自身免疫病和/或遗传病
a.待治疗疾病
一些自身免疫病和/或遗传病的特征在于释放DNA的受损组织的发展。所公开的组合物和方法可用于将纳米材料的递送靶向自身免疫病和/或遗传病中的组织损伤部位。
本文中所描述的组合物和方法适用于通过延迟或抑制受试者中组织损伤的进展、降低疾病严重程度和/或根除疾病、和/或抑制或减轻与疾病相关的症状和/或减小治疗疾病所需的其它试剂的剂量来治疗具有自身免疫病和/或遗传病的受试者。
可以用所提供的组合物和方法治疗的自身免疫病或遗传病的类型包括但不限于：肌营养不良(包括杜氏肌营养不良(Duchenne muscular dystrophy)和肌强直性营养不良)、全身性红斑狼疮、硬皮病、血管炎综合征、类风湿性关节炎、溶酶体贮积病(包括泰-萨二氏病(Tay-Sachs disease)和戈谢病(Gaucher disease))、糖原贮积病(包括庞贝病(Pompe disease)和麦卡德尔病(McArdle disease))。
b.用于自身免疫病和/或遗传病治疗的示范性活性剂
作为3E10抗体或由其衍生的片段或融合蛋白的补充或替代，可以给纳米载体加载用于治疗或诊断自身免疫病或遗传病的蛋白质、肽、抗体、碳水化合物、多糖、核酸分子、有机分子、诊断活性剂或其组合。
在一些实施例中，活性剂是治疗性药物。用于治疗自身免疫病和/或遗传病的试剂的非限制性实例包括免疫抑制剂、蛋白质替代物(例如抗肌萎缩蛋白(dystrophin)、抗肌萎缩蛋白相关蛋白(utrophin)、酶)、止痛剂、麻醉剂、消炎剂、抗感染剂、细胞因子、趋化因子、免疫调节剂以及其它促进愈合的试剂或保护和/或促进损伤区域细胞存活的试剂(如细胞保护性蛋白质，包括热休克蛋白)。
在一些实施例中，相对于游离药物，当在所公开的纳米载体中施用时，活性剂的剂量可减少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、70、80％或更多。
实例
实例1：合成并表征含有和不含表面抗DNA自身抗体的纳米颗粒
材料和方法
材料和细胞培养
除非另外说明，否则所有化学药品都是从西格玛-奥德里奇公司(Sigma-Aldrich)购买的。小鼠乳腺肿瘤细胞系4T1从美国典型培养物保藏中心(American Type CultureCollection，ATCC)获得，并在含有5％CO2的37℃孵育器中在补充有10％胎牛血清(英杰公司(Invitrogen))、100单位/毫升青霉素和100μg/ml链霉素(英杰公司)的DMEM培养基(英杰公司)中培养。
合成PLGA-PLL
PLGA-PLL根据先前所报道的程序(Zhou等人,《生物材料》,33(2):583-591(2012)；Han等人,《纳米医学》(2016))合成。简单来说，在氩气下，将PLGA(3g，50:50PLGA酸端基；i.v.约0.67dL/g；阿拉巴马州可吸收聚合物公司(Absorbable Polymers,AL))和200mg聚(ε-苄氧羰基-L-赖氨酸)(PLL)(MW 1000-4000Da，西格玛)溶解在干燥的圆底烧瓶中的6mL二甲基甲酰胺中。将2mL二甲基甲酰胺中的二环己基碳化二亚胺(58mg)和0.31mg二甲氨基吡啶加入聚合物溶液中并搅拌48小时。通过加入氯仿来稀释反应溶液并使反应溶液在甲醇中沉淀。然后将干燥的聚合物重新溶解在氯仿中，在乙醚中沉淀，并在真空下干燥24小时。为了去除保护，将经过干燥的被保护产物溶解在10mL于乙酸中的30％wt溴化氢中并搅拌90分钟以进行脱保护。将聚合物在乙醚中沉淀并洗涤，直到产物从黄色变为灰白色外观。然后将产物溶解在氯仿中并在乙醚中沉淀。将聚合物真空干燥24小时以去除所有痕量的乙醚。收集脱保护前和脱保护后的样品以确认聚合物的改性和苄氧羰基保护基的后续去除。将样品溶解在三氟乙醇中并使用光谱法(Cary 50Bio紫外可见分光光度计，加利福尼亚州帕罗奥图市的瓦里安(Varian,Palo Alto,CA))从200到350nm评估样品。
3E10EN产生和硫醇化(thiolation)
3E10(D31N)di-scFv(在本研究中称为3E10EN)在如先前所描述和下文所说明的巴斯德毕赤酵母(P.pastoris)中产生并纯化(SEQ ID NO:12)(Noble等人,《癌症研究》,2015；75(11):2285-2291)。在与纳米颗粒缀合之前，通过SDS-PAGE和抗Myc蛋白质印迹(Westernblot)确认从巴斯德毕赤酵母上清液中分离的3E10EN的纯度和属性(identity)。3E10EN抗体的硫醇化使用特劳特试剂(Traut's agent)进行。简单来说，向1ml PBS(pH 8.0，含5mMEDTA)中加入54μL 3E10溶液(5mg/ml)和18μL特劳特试剂溶液(10mg/ml)。通过在室温下在水平振荡器上旋转混合溶液，硫醇化过程耗时1小时。
(SEQ ID NO:12).
纳米颗粒合成
为了产生用于纳米颗粒合成的DOX，通过使用三乙胺在二氯甲烷中的滴定来去除商业DOX盐酸盐(西格玛)中的盐酸盐基团，导致DOX可溶于有机溶剂中。根据标准单乳液程序合成加载有DOX的纳米颗粒。关于DOX-NP的合成，将50mg PLGA-PLL和6.7mg阿霉素溶解在2mL乙酸乙酯中。然后将该溶液逐滴加入2ml 2.5％聚乙烯醇(polyvinyl alcohol，PVA)溶液中。将所得乳液在冰上进行3次超声处理，每次10秒。然后将乳液倒入含有0.3％(v/v)PVA水溶液的烧杯中并在室温下搅拌过夜以使EA蒸发并使颗粒硬化。通过在18000rpm下离心30分钟收集颗粒，将其用水洗涤两次，冷冻并冻干。关于3E10/DOX-NP的合成，使用相同的乳液程序。在蒸发过夜之后，收集纳米颗粒并将其重新悬浮于含有NHS-PEG5000-Mal(8mg，键凯科技(JenKem Technology))的PBS中。反应30分钟后，通过离心机(18000rpm，30分钟)去除额外的NHS-PEG5000-Mal。然后将聚乙二醇化的纳米颗粒重新悬浮于含有硫醇化3E10(270μg)的PBS中。60分钟后，通过在18000rpm下离心30分钟收集纳米颗粒，将其用水洗涤两次，冷冻并冻干。裸NP和3E10-NP根据相同的程序合成，但是分别不采用DOX/3E10和DOX。
纳米颗粒大小和形态的表征
通过扫描电子显微术(Scanning electron microscopy，SEM)表征纳米颗粒的形态和大小。简单来说，将干的纳米颗粒安装在碳带上，并使用40mA的溅射电流(美国Dynavac的Dynavac微型涂布机)在氩气氛中用金溅射涂布。使用Philips XL30 SEM使用LaB电子枪以3kV的加速电压进行SEM分析。使用动态光散射(DLS)测量纳米颗粒的流体力学直径。在HPLC级水中用0.25mg mL-1纳米颗粒填充透明比色皿。将加盖的比色皿放置在Zetasizer(马尔文(Malvern))中并读取动态光散射数据。还使用Zetasizer测量ζ电位。
缀合效率的表征
将10mg 3E10纳米颗粒溶解在100μL DMSO中，并加入到900μL ddH2O中，使最终浓度为10mg/ml。通过标准BCA分析(赛默科技(Thermo Scientific))测定溶液中3E10的量。使用相同程序处理的没有3E10的纳米颗粒用作对照。
药物封装的表征
为了确定药物封装效率(encapsulation efficiency，EE)和加载效率(loadingefficiency，LE)，将1mg加载了DOX的纳米颗粒溶解在100μL DMSO中并加入到900μL ddH2O中，使最终浓度为1mg/ml。然后将纳米颗粒溶液在13,000rpm下短暂旋转，并将100μL上清液转移到微量培养板(伯腾(BioTek))。在470nm/590nm(Ex/Em)下测量荧光强度，并根据游离DOX的标准曲线计算DOX的浓度。
DOX的控制释放
将加载了DOX的纳米颗粒在埃彭道夫管(Eppendorf tube)中重新悬浮于含有1mg/ml 0.02％叠氮化钠的PBS中，并在室温下在低速振荡器中旋转。在14天内以几个时间间隔监测DOX的释放。在每个取样时间，将纳米颗粒悬浮液在13,000rpm下离心10分钟。去除上清液以定量DOX，并更换等体积的PBS以继续监测释放。使用与上述相同的方法进行DOX的检测。
细胞毒性评估
将4T1细胞以每孔2×103个的浓度接种在96孔细胞培养板中，并与浓度在1.25到500μg/mL范围内的纳米颗粒一起孵育。向平行孔中加入相同量的游离DOX作为对照。处理后三天，使用标准MTT分析测定处理对细胞增殖的影响。
结果
开发了一种通过3E10EN进行纳米颗粒的自催化肿瘤靶向递送的策略。开发了具有3E10EN表面缀合的PLGA纳米颗粒用于exDNA靶向并且开发了内部封装有DOX的PLGA纳米颗粒用于化疗和exDNA释放。3E10EN具有使纳米颗粒归巢到肿瘤的能力，其含有比健康组织更大量的exDNA。肿瘤环境中exDNA的浓度可以随着时间的推移和细胞毒性疗法的递送而增加。因此，肿瘤中纳米颗粒积累的效率自催化地随时间的推移和后续处理而增加。
为了避免继发于Fc介导的补体激活或抗体依赖性细胞介导的细胞毒性的潜在非特异性毒性，最近已经产生并测试了缺乏Fc区的3E10片段。这些片段中最有前景的变异体之一是3E10的增强的二价单链可变片段，其已发生突变以改善其对DNA的结合亲和力(Noble等人,《癌症研究》,2015；75(11):2285-2291)。选择3E10(D31N)di-scFv用于本研究中的测试，并且其在下文中称为3E10EN(EN＝增强的)。为了测试3E10EN自催化递送纳米颗粒到肿瘤的能力，合成了具有表面缀合的3E10EN的加载了DOX的PLGA纳米颗粒(3E10EN/DOX-NP)。PLGA首先与聚(L-赖氨酸)(PLL)缀合，并且所得PLGA-PLL含有用于表面官能化的赖氨酸基团，用作起始材料。为了实现有效的封装，通过使用三乙胺在二氯甲烷中的滴定去除商业DOX盐酸盐中的盐酸盐基团。通过标准单乳液程序合成纳米颗粒，并进一步用NHS-PEG-Mal对纳米颗粒改性以显示出马来酰亚胺基团，用于硫醇化3E10EN的缀合。对照包括没有表面缀合的3E10EN的纳米颗粒(DOX-NP)、有3E10EN但没有DOX的纳米颗粒(3E10EN-NP)以及没有3E10EN或DOX的纳米颗粒(裸NP)，并且使用相同的程序合成对照，但是没有3E10EN缀合、DOX封装或这两项。扫描电子显微术(SEM)显示所有纳米颗粒都是球形并且大小是86-107nm(表1)。不同配方的纳米颗粒的流体力学直径在180-210nm的范围内(图1A)。3E10EN的缀合略微增加纳米颗粒大小。平均5个3E10EN分子与每个纳米颗粒的表面缀合。封装6.0重量％的DOX(表1)。还测量了不同NP的ζ电位。发现具有PLL的PLGA NP具有中性表面电荷，而3E10EN的缀合将表面电荷降低至-8(表1)。
比较3E10EN/DOX-NP和DOX-NP的DOX释放，以确定3E10EN是否以任何方式干扰药物释放。如图1B中所示，DOX在12天内从3E10EN/DOX-NP和DOX-NP以等同控制的方式释放，表明3E10EN不干扰药物释放。接下来，测试纳米颗粒对4T1鼠乳腺癌细胞活力的影响。将细胞用单独的DOX、DOX-NP、3E10EN-NP或3E10EN/DOX-NP处理三天，然后通过MTT分析评估存活率。游离DOX、DOX-NP和3E10EN/DOX-NP全部产生相当的细胞抑制作用，而没有DOX的3E10EN-NP对细胞没有显著毒性(图1C)。表1总结了本研究中所用的纳米颗粒的特征。
表1：纳米颗粒的特征
这些结果特别令人感兴趣，因为尽管在处理期间从NP释放的DOX的量约为接受游离DOX处理的组中的细胞所暴露的药物量的40％，但DOX-NP和游离DOX对细胞活力具有类似的作用。类似的讨论在(Park等人,《纳米医学-纳米技术》(Nanomed-Nanotechnol).2009,5:410-418；Lei等人,《国际医疗和生物工程联合会会议记录》(Ifmbe Proc).2010,32:224-227；Zhou等人,《美国国家科学院院刊》(Proc Natl Acad Sci U S A).,2013,110:11751-11756；Liu等人,《生物材料》.2009；30:5707-5719；以及Han等人,《美国化学学会·纳米》(ACS nano).2016,10:4209-4218)中并且这种作用可能是由于管理纳米颗粒和游离药物的细胞摄取和输出的机制之间的差异。例如，游离DOX，而不是加载了DOX的纳米颗粒，是在肿瘤细胞中高度表达的ATP结合盒(ABC)转运蛋白的底物。
实例2：3E10EN缀合增强纳米颗粒与exDNA的相互作用
材料和方法
3E10缀合的纳米颗粒的DNA结合能力
使用BamHI将质粒DNApGL4.74(20μg，普洛麦格(Promega))线性化以暴露出磷酸酯基，其接着被N-(3-二甲氨基丙基)-N'-乙基碳化二亚胺盐酸盐(EDC，0.20mg，1.0μmol)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS，0.17mg，1.5μmol)激活并与NH2-PEG50-NH2(0.41mg，3.0μmol)反应。以胺基封端的DNA然后用特劳特试剂(0.68mg，5.0μmol)硫醇化并被涂布到用马来酰亚胺基(MicroSurfaes公司)官能化的玻璃板表面。为了确定纳米颗粒的结合能力，将含有和不含3E10EN的加载了IR780的纳米颗粒以1mg/ml重新悬浮于PBS中并加入到玻璃板表面。在室温下孵育1小时后，用水漂洗玻璃板。使用体内成像系统(IVIS)系统(Xenogen)在745nm/800nm(Ex/Em)下检测附着在玻璃板上的纳米颗粒。
统计分析
数据一式三份地取得，并报告为平均值和标准偏差。通过配对的学生t-检验(paired Student's t-test)评估两种病状之间纳米颗粒的DNA结合能力、组织中exDNA的量以及纳米颗粒递送效率的比较。进行单向ANOVA分析以确定处理相关的肿瘤体积变化的统计显著性。p≤0.05被认为表示统计学上显著的差异。
结果
3E10与DNA具有高亲和力(Service等人,《科学》,330(6002):314-315(2010)；Swystun等人,《血栓和止血杂志》,9(11):2313-2321(2011))。设计实验以确定表面缀合的3E10EN是否会增强纳米颗粒与DNA的相互作用。为了测试这一点，用线性化的质粒DNA包被载玻片，并将载玻片与含有和不含表面3E10EN的纳米颗粒一起孵育。出于检测的目的，用近红外荧光染料IR780封装纳米颗粒。在与纳米颗粒一起孵育60分钟后，漂洗载玻片并通过IVIS观测与纳米颗粒的量相关的IR780的信号。信号在图2中定量。3E10EN的缀合使纳米颗粒与DNA包被的玻璃表面的缔合增加5.6倍，证实3E10EN-NP如预期的那样被DNA吸引。
实例3：exDNA富集在4T1肿瘤中并随着3E10EN/DOX-NP处理而增加
材料和方法
测量肿瘤和健康组织中的exDNA
从存在或不存在3E10/DOX-NP处理的小鼠切除肿瘤。从没有肿瘤的健康小鼠收获的肝脏、心脏和肌肉用作对照。将肿瘤和对照健康组织切成相似大小的薄片，安装到载玻片上，并用Picogreen(赛默飞世尔科技(ThermoFisher Scientific))染色。五分钟后，用水漂洗载玻片。通过IVIS在465nm/520nm(Ex/Em)下检测荧光强度。
结果
使用同源4T1鼠乳腺癌小鼠模型测试3E10EN将纳米颗粒靶向肿瘤的能力。在此模型中，通过在BALB/c小鼠中皮下注射产生4T1乳腺癌异种移植物。在开始功效研究之前，在存在和不存在3E10EN/DOX-NP处理的情况下，通过Picogreen染色评估正常组织和4T1肿瘤中exDNA的相对量。与先前的发现(Weisbart等人,《科学报告》,5:12022(2015)；Stroun等人,《临床化学学报》,313(1-2):139-142(2001)；Sueoka-Aragane等人,《公共科学图书馆·综合》,9(12)(2014)；Wen等人,《癌症研究》,73(14):4256-4266(2013))一致，未处理肿瘤中exDNA的量是肝脏、心脏和肌肉中的exDNA的量的7.5倍、11.7倍和2.5倍(图3)，表明在此模型中，exDNA是作为优先药物递送到肿瘤的可行靶点。测试了3E10EN/DOX-NP处理对exDNA的量的影响。携带4T1肿瘤的小鼠连续两天通过静脉内注射3E10EN/DOX-NP进行处理，然后在第3天处死小鼠并评估肿瘤exDNA含量。如图3中所示，与未处理小鼠中的肿瘤相比，用3E10EN/DOX-NP处理小鼠使肿瘤中的exDNA量增加了5.1倍。总之，这些结果证实此小鼠模型适合于使用3E10EN靶向exDNA来测试所提出的纳米颗粒向肿瘤的自催化递送。
实例4：3E10EN介导纳米颗粒的自催化肿瘤靶向递送
材料和方法
纳米颗粒的体内肿瘤归巢
将雌性BALB/c小鼠(查尔斯河实验室(Charles River Laboratories))用于此研究并保持在无菌环境中。此项目得到了耶鲁大学机构动物护理和利用委员会(Institutional Animal Care and Utilization Committee，IACUC)的批准。为了建立肿瘤，小鼠接受皮下胁腹注射1×106个4T1肿瘤细胞。每周使用可追踪的数字游标卡尺(飞世尔)测量肿瘤大小。通过测量长度(l)和宽度(w)，然后使用下式计算体积(V)来确定肿瘤体积：V＝lw2/2。当体积达到约200mm3(第1天)时，将小鼠随机分成3组。第一组在第1天和第2天用不含IR780的3E10EN缀合的纳米颗粒处理，并在第3天接受3E10EN缀合的、加载了IR780的纳米颗粒的最终注射。第二组和第三组在第3天接受加载了IR780的纳米颗粒和3E10EN缀合的、加载了IR780的纳米颗粒的静脉内施用。每只小鼠施用1mg纳米颗粒。在加载了IR780的纳米颗粒和3E10缀合的、加载了IR780的纳米颗粒中，IR780的加载是类似的。在第5天，使小鼠安乐死并收获肿瘤，使用IVIS进行成像。成像后，将肿瘤冻干并在DMSO中均质化。提取肿瘤中的染料量并使用微量培养板(伯腾)定量。
DOX-NP的血液浓度
记录随时间而变的有和没有3E10EN缀合的DOX-NP的血液浓度。为了能够检测NP，将NP与1％香豆素6共同加载。将六只BALB/c小鼠随机分成两组，分别接受有和没有3E10EN缀合的1mg DOX-NP的静脉内施用。在注射后5分钟、15分钟、30分钟、1小时、2小时、4小时、6小时、24小时、36小时以及48小时，将来自每只小鼠的20μL血液样品收集到1.5mL埃彭道夫管中并冻干。然后，向每个管中加入100μL DMSO和1mL乙腈。在水浴超声波仪中超声处理15分钟后，将样品在4000rpm下离心20分钟以去除细胞碎片和血液白蛋白。然后，从每个样品收集0.8ml上清液并加入到埃彭道夫管中。蒸发乙腈，并使用读板器(伯腾ELx800)在Ex/Em 444/505nm下定量DMSO中的染料。
结果
设计实验以确定3E10EN是否可以介导纳米颗粒向肿瘤的优先递送。将有或没有3E10EN缀合的加载了IR780的纳米颗粒静脉内施用于4T1荷瘤小鼠。二十四小时后，切除肿瘤并使用IVIS成像系统成像。观察到裸NP定位于一系列组织中，有一些肿瘤摄取，但在肝脏中看到最大量的摄取。相比之下，与裸NP相比，3E10EN缀合的NP显示出优先摄入肿瘤而不是肝脏并且肿瘤定位增加2.3倍的模式(图4)。这些结果表明3E10EN优先将纳米颗粒靶向未处理肿瘤。3E10EN不改变NP的循环寿命(图9)，因此3E10EN介导的增强的摄取被认为是由于与肿瘤中的exDNA的相互作用。这些结果表明3E10EN优先将纳米颗粒靶向未处理肿瘤。
根据所提出的策略，3E10EN介导的递送的效率将随时间的推移和处理的递送而自催化增加，这些处理诱导肿瘤DNA释放并导致exDNA在肿瘤环境中进一步积累。为了测试该策略，将4T1荷瘤小鼠连续两天每天用不含IR780的3E10EN/DOX-NP处理(这里称为预激处理)。在第三天，小鼠接受加载了IR780的3E10EN-NP的最终注射。二十四小时后，切除肿瘤并成像。如图4中所示，3E10EN/DOX-NP预激处理显著增强了纳米颗粒的肿瘤递送。来自接受预激处理的小鼠的肿瘤中的纳米颗粒的平均量是来自没有预激的小鼠的肿瘤中的量的1.8倍。值得注意的是，通过预激，纳米颗粒在肿瘤中的积累达到了肝脏中的积累的4.1倍，是接受裸NP处理的小鼠的0.5倍。
实例5：3E10EN/DOX-NP对肿瘤的作用显著大于DOX-NP或单独的DOX
材料和方法
小鼠肿瘤异种移植物中的抗肿瘤评估
如上所述建立携带4T1肿瘤的小鼠。当肿瘤体积达到约100mm3时，将小鼠随机分成5组，每组七只小鼠，如下：第1组接受PBS处理；第2组接受PBS中的游离DOX的处理；第3组接受3E10EN-NP处理；第4组接受DOX-NP处理；并且第5组接受3E10EN/DOX-NP处理。每周进行3次处理。每只小鼠施用1mg纳米颗粒，等于80μg DOX。一周测量三次肿瘤大小。当肿瘤体积达到约1000mm3时，使小鼠安乐死，此时切除肿瘤并将其固定在福尔马林(formalin)中用于免疫组织化学。获得连续切片并用苏木精和曙红(H&E)和末端脱氧核苷酸转移酶(TUNEL)对切片染色以分析治疗效果。在每个时间点，使用每个处理组的肿瘤体积的平均值绘制生长曲线。
结果
最后，设计实验以确定基于3E10EN的靶向exDNA以进行自催化肿瘤靶向的药物递送的方法是否能引起肿瘤对体内治疗的反应的改善。携带约100mm3大小的4T1肿瘤的小鼠一周处理三次，所述处理是静脉内注射对照PBS、游离DOX、DOX-NP、3E10EN-NP或3E10EN/DOX-NP。一周测量三次肿瘤体积，并且所得生长曲线显示于图5中。在所有处理组中，仅观察到3E10EN/DOX-NP极大地抑制肿瘤生长(与游离DOX和DOX-NP相比，p<0.01)。到研究结束时，与用PBS处理的对照组相比，游离DOX或DOX-NP处理分别使肿瘤体积减少了26％和19％。这两组之间未发现显著差异。相比之下，3E10EN/DOX-NP处理使肿瘤体积减少72％。在组织学上，来自对照处理的肿瘤显示出具有突出细胞核的高度细胞团；相比之下，来自用3E10EN/DOX-NP处理的动物的肿瘤表现出低得多的细胞团，更低的细胞核-细胞质比率，并且通过TUNEL染色测量到的凋亡细胞数量显著增加。
实例6：3E10EN-NP定位到黑素瘤脑肿瘤中。
材料和方法
转移性黑素瘤脑肿瘤定位研究
来自黑素瘤癌细胞系的具有颅内肿瘤的小鼠通过尾静脉注射加载了IR780的未缀合的NP(对照)或加载了IR780的3E10EN缀合的NP来进行处理。24小时后，通过IVIS观测到脑肿瘤中NP的积累。
结果
如图6中所示，在用对照处理的小鼠的脑中未检测到显著信号，但用3E10EN-NP处理的小鼠在脑肿瘤中显示显著的IR780信号，证明3E10EN将NP有效递送到了脑肿瘤。
实例7：3E10EN-NP定位到成胶质细胞瘤脑肿瘤中。
材料和方法
成胶质细胞瘤脑肿瘤定位研究
通过尾静脉注射对照NP或3E10EN-NP来处理携带原位颅内U87成胶质细胞瘤肿瘤的免疫缺陷小鼠。给NP加载IR780以便检测。在注射后24小时，通过IVIS观测到成胶质细胞瘤脑肿瘤中NP的积累。
结果
如图7中所示，在用对照处理的小鼠的脑中未检测到显著信号，但用3E10EN-NP处理的小鼠在脑肿瘤中显示显著的IR780信号。这些数据表明3E10EN将NP有效递送到了脑肿瘤。
实例8：3E10EN-NP定位到中风的缺血性脑中。
材料和方法
中风体积定位研究
通过大脑中动脉阻塞在小鼠中诱导中风。在中风指征后，通过尾静脉注射对照NP或3E10EN-NP来处理小鼠。给NP加载IR780以便检测。在注射后24小时，通过IVIS分析小鼠中风区域中的NP摄取。
结果
如图8中所示，在用对照NP处理的小鼠的脑中风体积中未检测到显著信号，但用3E10EN-NP处理的小鼠在脑中风区域中显示出显著的IR780信号。这些数据表明3E10EN将NP有效递送到了缺血性脑。
上述实例证明了利用肿瘤环境中的exDNA将纳米颗粒全身递送到肿瘤的自催化肿瘤靶向机制。3E10EN用作exDNA的靶向配体且DOX用作模型药物，并且结果显示3E10EN介导纳米颗粒向肿瘤的有效递送，并且此效率随着后续处理，随着更多的exDNA被垂死的肿瘤释放而增加。与随着时间的推移随着相关靶标随治疗退化而导致效率降低的其它靶向方法相比，所公开的组合物和方法具有随着时间的推移和治疗所带来的效率提高的关键优势，这是由于靶环境中的exDNA释放增加。
除了上述对纳米医学中递送策略的影响之外，本研究还揭示了一个新的维度：可能可以在分子治疗技术中使用狼疮抗DNA自身抗体3E10。3E10具有渗透到活细胞核中的不寻常能力，并且抗体和其优化片段先前已被用于在体外和体内将治疗性货物蛋白如p53和Hsp70递送到活细胞中(Hansen等人,《癌症研究》,67(4):1769-1774(2007)；Hansen等人,《脑研究》(Brain Res),1088(1):187-196(2006))。最近，3E10抑制DNA修复中的关键步骤的能力已被利用并通过使肿瘤对DNA损伤剂敏感并通过选择性杀死特别容易受到DNA损伤的影响的癌症如BRCA2和PTEN缺陷型恶性疾病来测试其在癌症治疗中的潜在用途(Hansen等人,《科学·转化医学》,4(157):157ra142(2012)；Noble等人,《癌症研究》,2015；75(11):2285-2291；Noble等人,《自然·风湿病学综述》(2016))。然而，3E10渗透细胞核并抑制DNA修复的能力对于本文中所提供的实验来说并不重要。相反，本研究通过使用3E10以自催化方式将纳米颗粒引导到肿瘤位点而利用其在体内归巢到exDNA位点的能力。本研究为以狼疮抗DNA自身抗体为基础将包括纳米颗粒在内的货物分子靶向exDNA位点的方法建立了概念验证，其与癌症以及如中风、梗塞或受伤等缺血性或创伤性病状的治疗有关，其中在损伤部位释放DNA。
先前的研究已经发现3E10使癌细胞变得对DNA损伤剂如DOX敏感，但是在本文中所讨论的实验中，在图1C中所报告的细胞活力分析中，表面缀合的3E10EN不与DOX协同作用。这是因为3E10EN与纳米颗粒的表面共价缀合，因此不能渗透到细胞核中以发挥其生物功能。为了实现这种敏化活性，可以通过形成二硫键来将3E10EN缀合到纳米颗粒的表面。通过这种方法，一旦由于谷胱甘肽水平升高而遇到还原性肿瘤微环境，3E10EN就可以从纳米颗粒释放(Shao等人,《治疗剂递送》,3(12):1409-1427(2012))。或者，除了使3E10EN与纳米颗粒表面缀合之外，还可以将一定量的游离3E10EN与DOX一起共同封装到纳米颗粒中，以促进药物和抗体片段向癌细胞的同时递送。一旦通过二硫键的断裂或通过所封装的3E10EN的释放从纳米颗粒释放，游离的3E10EN然后将能够渗透肿瘤细胞核并抑制DNA修复，从而使肿瘤对DNA损伤敏感或选择性杀死DNA修复缺陷型癌细胞。
总之，纳米医学有可能为临床癌症护理做出重大贡献。同时，精选的狼疮抗DNA自身抗体已成为可能用于癌症治疗的新试剂，部分原因在于它们对DNA的亲和力。
实例9：3E10(D31N)di-scFv将纳米颗粒递送到活细胞中。
材料和方法
用以下各物处理Cal12T肺癌细胞20分钟：对照缓冲液、游离di-scFv(SEQ ID NO:12)、封装有IR780染料的游离PLGA纳米颗粒、封装有IR780染料的游离di-scFv+游离PLGA纳米颗粒或封装有IR780染料的di-scFv缀合的PLGA纳米颗粒。然后在荧光显微镜下观测细胞以检测IR780信号。
结果
仅在用di-scFv缀合的纳米颗粒处理的细胞的细胞质中检测到显著的IR780信号，而在用游离纳米颗粒处理的细胞中没有检测到该信号。这些数据表明di-scFv可以将缀合的纳米颗粒递送到活细胞的细胞内区室中。
值得注意的是，IR780信号仅限于细胞质，并且在预计di-scFv定位的细胞核中未检测到。为了确定缀合的纳米颗粒是否将di-scFv保持在细胞质中，在观测活细胞之后，然后将细胞固定并通过抗myc免疫染色针对di-scFv的存在进行免疫染色(di-scFv在其C端具有myc标签)。即使是在存在游离纳米颗粒时，游离di-cFv也会渗透到细胞核中。然而，与纳米颗粒缀合的di-scFv不会进入细胞核，而是被隔离在细胞质中。还使用另一种细胞系DLD1结肠癌细胞进行了这个实验，并观察到相同的模式。这些数据证实di-scFv可以介导缀合的纳米颗粒向细胞中的递送，并且显然纳米颗粒的大小似乎将di-scFv限制在细胞质定位而不是其通常的细胞核定位。
除非另外定义，否则本文中所使用的所有技术和科技术语都具有与本发明所属领域的技术人员通常所理解的相同的含义。本文中所引用的出版物和其所引用的材料专门以引用的方式并入。
所属领域的技术人员将认识到或顶多使用常规实验就能够确定本文中所描述的本发明特定实施例的许多等同物。这些等同物打算由以下权利要求书涵盖。
序列表
<110> 耶鲁大学（YALE UNIVERSITY）
<120> 纳米载体向肿瘤的抗体介导的自催化靶向递送
<130> YU 7013 PCT
<150> U.S.S.N. 62/350,423
<151> 2016-06-15
<160> 30
<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
<211> 116
<212> PRT
<213> 小家鼠（Mus musculus）
<400> 1
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Arg Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Tyr Ile Ser Ser Gly Ser Ser Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Thr Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Phe
65 70 75 80
Leu Gln Met Thr Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Gly Leu Leu Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 2
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成多肽
<400> 2
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Arg Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Tyr Ile Ser Ser Gly Ser Ser Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Thr Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Phe
65 70 75 80
Leu Gln Met Thr Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Gly Leu Leu Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 3
<211> 111
<212> PRT
<213> 小家鼠（Mus musculus）
<400> 3
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser
20 25 30
Ser Tyr Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Tyr Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His
65 70 75 80
Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ser Arg
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Glu Phe Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
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<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成多肽
<400> 4
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1 5
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<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成多肽
<400> 5
Gly Gln Ser Ser Arg Ser Ser Ser Gly Gly Gly Ser Ser Gly Gly Gly
1 5 10 15
Gly Ser
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<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成多肽
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<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成多肽
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1
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<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成多肽
<400> 8
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<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成多肽
<400> 9
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser
20
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<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成多肽
<400> 10
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
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<211> 274
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成多肽
<400> 11
Ala Gly Ile His Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala
1 5 10 15
Val Ser Leu Gly Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Lys Ser
20 25 30
Val Ser Thr Ser Ser Tyr Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro
35 40 45
Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Tyr Leu Glu Ser
50 55 60
Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
65 70 75 80
Leu Asn Ile His Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys
85 90 95
Gln His Ser Arg Glu Phe Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu
100 105 110
Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
115 120 125
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly
130 135 140
Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly Ser Arg Lys Leu Ser Cys Ala Ala
145 150 155 160
Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala
165 170 175
Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Tyr Ile Ser Ser Gly Ser Ser
180 185 190
Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Thr Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg
195 200 205
Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Phe Leu Gln Met Thr Ser Leu Arg Ser
210 215 220
Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Arg Arg Gly Leu Leu Leu Asp
225 230 235 240
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Leu Glu Gln Lys
245 250 255
Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn Ser Ala Val Asp His His His His
260 265 270
His His
<210> 12
<211> 541
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成多肽
<400> 12
Ala Gly Ile His Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala
1 5 10 15
Val Ser Leu Gly Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Lys Ser
20 25 30
Val Ser Thr Ser Ser Tyr Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro
35 40 45
Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Tyr Leu Glu Ser
50 55 60
Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
65 70 75 80
Leu Asn Ile His Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys
85 90 95
Gln His Ser Arg Glu Phe Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu
100 105 110
Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
115 120 125
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly
130 135 140
Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly Ser Arg Lys Leu Ser Cys Ala Ala
145 150 155 160
Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala
165 170 175
Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Tyr Ile Ser Ser Gly Ser Ser
180 185 190
Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Thr Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg
195 200 205
Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Phe Leu Gln Met Thr Ser Leu Arg Ser
210 215 220
Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Arg Arg Gly Leu Leu Leu Asp
225 230 235 240
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys
245 250 255
Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Leu Glu Ser Ser Gly Ser Asp
260 265 270
Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly Gln
275 280 285
Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser Ser
290 295 300
Tyr Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys
305 310 315 320
Leu Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Tyr Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala Arg
325 330 335
Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His Pro
340 345 350
Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ser Arg Glu
355 360 365
Phe Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala
370 375 380
Asp Ala Ala Pro Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
385 390 395 400
Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys
405 410 415
Pro Gly Gly Ser Arg Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe
420 425 430
Ser Asn Tyr Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Glu Lys Gly Leu
435 440 445
Glu Trp Val Ala Tyr Ile Ser Ser Gly Ser Ser Thr Ile Tyr Tyr Ala
450 455 460
Asp Thr Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn
465 470 475 480
Thr Leu Phe Leu Gln Met Thr Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met
485 490 495
Tyr Tyr Cys Ala Arg Arg Gly Leu Leu Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
500 505 510
Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Leu Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu
515 520 525
Asp Leu Asn Ser Ala Val Asp His His His His His His
530 535 540
<210> 13
<211> 808
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成多肽
<400> 13
Ala Gly Ile His Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala
1 5 10 15
Val Ser Leu Gly Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Lys Ser
20 25 30
Val Ser Thr Ser Ser Tyr Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro
35 40 45
Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Tyr Leu Glu Ser
50 55 60
Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
65 70 75 80
Leu Asn Ile His Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys
85 90 95
Gln His Ser Arg Glu Phe Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu
100 105 110
Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
115 120 125
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly
130 135 140
Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly Ser Arg Lys Leu Ser Cys Ala Ala
145 150 155 160
Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala
165 170 175
Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Tyr Ile Ser Ser Gly Ser Ser
180 185 190
Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Thr Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg
195 200 205
Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Phe Leu Gln Met Thr Ser Leu Arg Ser
210 215 220
Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Arg Arg Gly Leu Leu Leu Asp
225 230 235 240
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys
245 250 255
Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Leu Glu Ser Ser Gly Ser Asp
260 265 270
Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly Gln
275 280 285
Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser Ser
290 295 300
Tyr Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys
305 310 315 320
Leu Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Tyr Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala Arg
325 330 335
Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His Pro
340 345 350
Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ser Arg Glu
355 360 365
Phe Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala
370 375 380
Asp Ala Ala Pro Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
385 390 395 400
Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys
405 410 415
Pro Gly Gly Ser Arg Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe
420 425 430
Ser Asn Tyr Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Glu Lys Gly Leu
435 440 445
Glu Trp Val Ala Tyr Ile Ser Ser Gly Ser Ser Thr Ile Tyr Tyr Ala
450 455 460
Asp Thr Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn
465 470 475 480
Thr Leu Phe Leu Gln Met Thr Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met
485 490 495
Tyr Tyr Cys Ala Arg Arg Gly Leu Leu Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
500 505 510
Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
515 520 525
Pro Leu Ala Pro Leu Glu Ser Ser Gly Ser Asp Ile Val Leu Thr Gln
530 535 540
Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly Gln Arg Ala Thr Ile Ser
545 550 555 560
Cys Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser Ser Tyr Ser Tyr Met His
565 570 575
Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Lys Tyr
580 585 590
Ala Ser Tyr Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly
595 600 605
Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His Pro Val Glu Glu Glu Asp
610 615 620
Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ser Arg Glu Phe Pro Trp Thr Phe
625 630 635 640
Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro Gly
645 650 655
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val
660 665 670
Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly Ser Arg
675 680 685
Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr Gly Met
690 695 700
His Trp Val Arg Gln Ala Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Tyr
705 710 715 720
Ile Ser Ser Gly Ser Ser Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Thr Val Lys Gly
725 730 735
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Phe Leu Gln
740 745 750
Met Thr Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Arg
755 760 765
Arg Gly Leu Leu Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val
770 775 780
Ser Ser Leu Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn Ser Ala
785 790 795 800
Val Asp His His His His His His
805
<210> 14
<211> 112
<212> PRT
<213> 小家鼠（Mus musculus）
<400> 14
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Ala Val Ser Leu
1 5 10 15
Gly Glu Arg Ala Thr Ile Ser Tyr Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr
20 25 30
Ser Gly Tyr Ser Tyr Met His Trp Asn Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala
35 40 45
Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Leu Val Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro
50 55 60
Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile
65 70 75 80
His Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ile
85 90 95
Arg Glu Leu Asp Thr Phe Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 15
<211> 15
<212> PRT
<213> 小家鼠（Mus musculus）
<400> 15
Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser Gly Tyr Ser Tyr Met His
1 5 10 15
<210> 16
<211> 7
<212> PRT
<213> 小家鼠（Mus musculus）
<400> 16
Leu Val Ser Asn Leu Glu Ser
1 5
<210> 17
<211> 9
<212> PRT
<213> 小家鼠（Mus musculus）
<400> 17
Gln His Ile Arg Glu Leu Asp Thr Phe
1 5
<210> 18
<211> 120
<212> PRT
<213> 小家鼠（Mus musculus）
<400> 18
Gln Leu Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Thr Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Ala Lys Arg Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Thr Ile Ser Ser Gly Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Arg Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Ala Tyr Ser Lys Arg Gly Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 19
<211> 5
<212> PRT
<213> 小家鼠（Mus musculus）
<400> 19
Ser Tyr Thr Met Ser
1 5
<210> 20
<211> 17
<212> PRT
<213> 小家鼠（Mus musculus）
<400> 20
Thr Ile Ser Ser Gly Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 21
<211> 11
<212> PRT
<213> 小家鼠（Mus musculus）
<400> 21
Arg Ala Tyr Ser Lys Arg Gly Ala Met Asp Tyr
1 5 10
<210> 22
<211> 5
<212> PRT
<213> 小家鼠（Mus musculus）
<400> 22
Asp Tyr Gly Met His
1 5
<210> 23
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成多肽
<400> 23
Asn Tyr Gly Met His
1 5
<210> 24
<211> 17
<212> PRT
<213> 小家鼠（Mus musculus）
<400> 24
Tyr Ile Ser Ser Gly Ser Ser Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Thr Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 25
<211> 7
<212> PRT
<213> 小家鼠（Mus musculus）
<400> 25
Arg Gly Leu Leu Leu Asp Tyr
1 5
<210> 26
<211> 15
<212> PRT
<213> 小家鼠（Mus musculus）
<400> 26
Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser Ser Tyr Ser Tyr Met His
1 5 10 15
<210> 27
<211> 7
<212> PRT
<213> 小家鼠（Mus musculus）
<400> 27
Tyr Ala Ser Tyr Leu Glu Ser
1 5
<210> 28
<211> 9
<212> PRT
<213> 小家鼠（Mus musculus）
<400> 28
Gln His Ser Arg Glu Phe Pro Trp Thr
1 5
<210> 29
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成多肽
<400> 29
Pro Leu Gly Leu Ala Gly
1 5
<210> 30
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成多肽
<400> 30
Arg Leu Gln Leu Lys Leu
1 5

Claims (39)

1.一种用于封装活性剂的纳米载体，其包含具有与其缀合的靶向DNA的靶向部分的颗粒。
2.根据权利要求1所述的纳米载体，其中所述靶向部分是结合于DNA、核苷酸、核苷、核碱基或核小体的抗体或由其衍生的变异体、片段或融合蛋白。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的纳米载体，其中靶向DNA的所述靶向部分是可变片段(Fv)。
4.根据权利要求3所述的纳米载体，其中所述Fv是scFv、di-scFv或tri-scFv。
5.根据权利要求1到4中任一项所述的纳米载体，其中所述靶向部分是具有包含如SEQID NO:2中所示的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:3中所示的氨基酸序列的VL的抗体(3E10)或具有包含如SEQ ID NO:14中所示的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:18中所示的氨基酸序列的VL的抗体(5C6)，或其变异体、片段、融合蛋白。
6.根据权利要求5所述的纳米载体，其中所述靶向部分是3E10或5C6的人源化形式或嵌合形式。
7.根据权利要求5或权利要求6所述的纳米载体，其中所述靶向部分是抗体3E10或5C6的单价、二价或三价或多价单链可变片段(scFv)。
8.根据权利要求5或权利要求6所述的纳米载体，其中所述靶向部分是抗体3E10或5C6的双功能抗体、三功能抗体、四功能抗体或其它多聚体。
9.根据权利要求5或权利要求6所述的纳米载体，其中所述靶向部分是抗体3E10或5C6或其变异体的Fab、(Fab')2、微型抗体、VL、VH、scFv-Fc、双功能抗体、三功能抗体、四功能抗体或其它组分或衍生物。
10.根据权利要求4、7或9中任一项所述的纳米载体，其中所述scFv包括包含选自SEQID NO:1和2的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的轻链。
11.根据权利要求4所述的纳米载体，其中所述靶向部分包含SEQ ID NO:11、12或13的氨基酸序列。
12.根据权利要求1到11中任一项所述的纳米载体，其中所述纳米载体选自由聚合物颗粒、脂质体、多层囊泡以及微泡组成的群组。
13.根据权利要求12所述的纳米载体，其中所述聚合物颗粒是聚合物纳米颗粒。
14.根据权利要求13所述的纳米载体，其中所述聚合物纳米颗粒由一种或多种生物可降解的聚酯或聚酸酐形成。
15.根据权利要求14所述的纳米载体，其中所述生物可降解的聚酯或聚酸酐选自由聚(乳酸)、聚(乙醇酸)以及聚(乳酸-共-乙醇酸)组成的群组。
16.根据权利要求13所述的纳米载体，其中所述聚合物纳米颗粒由PLGA-聚(ε-苄氧羰基-L-赖氨酸)(PLL)形成。
17.根据权利要求1到16中任一项所述的纳米载体，其中所述靶向部分是细胞渗透性的。
18.根据权利要求1到16中任一项所述的纳米载体，其中所述靶向部分不是细胞渗透性的。
19.根据权利要求1到18中任一项所述的纳米载体，其中所述靶向部分能够被释放在靶位点并用作活性剂。
20.根据权利要求19所述的纳米载体，其中所述靶向部分以能够在肿瘤微环境中在谷胱甘肽存在下裂解的二硫键连接到所述纳米载体上。
21.根据权利要求1到20中任一项所述的纳米载体，其进一步包含被封装在其中的一种或多种活性剂。
22.根据权利要求21所述的纳米载体，其中所述活性剂是抗血管生成剂、抗增殖剂、化疗剂、细胞毒性剂、抗体或其片段或变异体、放射增敏剂、放射性同位素、治疗蛋白、治疗基因、siRNA、适体、寡核苷酸、反义寡核苷酸、基因修饰剂、基因表达修饰剂或其组合。
23.根据权利要求22所述的纳米载体，其中所述活性剂是PARP抑制剂。
24.根据权利要求23所述的纳米载体，其中所述PARP抑制剂是奥拉帕尼(C24H23FN4O3)。
25.一种药物组合物，其包含有效量的根据权利要求1到24中任一项所述的纳米载体。
26.一种治疗癌症的方法，其包含向有此需要的受试者施用有效量的根据权利要求25所述的药物组合物。
27.根据权利要求26所述的方法，其中所述一种或多种活性剂是抗血管生成剂、抗增殖剂、化疗剂、细胞毒性剂、抗体或其片段或变异体、放射增敏剂、放射性同位素、治疗蛋白、治疗基因、siRNA、适体、寡核苷酸、反义寡核苷酸、基因修饰剂、基因表达修饰剂或其组合。
28.根据权利要求26或27所述的方法，其中所述癌症位于脑中。
29.一种治疗包括但不限于中风和心肌梗塞的缺血的方法，其包含向有此需要的受试者施用有效量的根据权利要求25所述的药物组合物，其中所述一种或多种活性剂是治疗蛋白、治疗基因、抗体或其片段或变异体、siRNA、适体、寡核苷酸、反义寡核苷酸、基因修饰剂、基因表达修饰剂，增加血流、减少凝血、诱导动脉扩张、诱导或增加血栓溶解、遏制细胞凋亡或以其它方式促进缺血性细胞存活的试剂，或其组合。
30.一种治疗受伤的方法，其包含向有此需要的受试者施用有效量的根据权利要求25所述的药物组合物，其中所述一种或多种活性剂是治疗蛋白、治疗基因、抗体或其片段或变异体、siRNA、适体、寡核苷酸、反义寡核苷酸、基因修饰剂、基因表达修饰剂、止痛剂、麻醉剂、消炎剂、抗感染剂、细胞因子、趋化因子、免疫调节剂，促进伤口愈合、遏制细胞凋亡或以其它方式促进受伤细胞存活的试剂，或其组合。
31.一种治疗感染的方法，其包含向有此需要的受试者施用有效量的根据权利要求25所述的药物组合物，其中所述一种或多种活性剂是治疗蛋白、治疗基因、抗体或其片段或变异体、siRNA、适体、寡核苷酸、反义寡核苷酸、基因修饰剂、基因表达修饰剂、抗生素、抗病毒剂、抗真菌剂、抗寄生虫剂、止痛剂、麻醉剂、消炎剂、抗感染剂、细胞因子、趋化因子、免疫调节剂、促进伤口愈合的试剂或其组合。
32.一种治疗自身免疫病或遗传病的方法，其包含向有此需要的受试者施用有效量的根据权利要求25所述的药物组合物，其中所述一种或多种活性剂是治疗蛋白、治疗基因、抗体或其片段或变异体、siRNA、适体、寡核苷酸、反义寡核苷酸、基因修饰剂、基因表达修饰剂、免疫抑制剂、替代蛋白质、替代基因、止痛剂、麻醉剂、消炎剂、抗感染剂、细胞因子、趋化因子、免疫调节剂、促进伤口愈合的试剂或其组合。
33.一种治疗肌营养不良的方法，其包含向有此需要的受试者施用有效量的根据权利要求25所述的药物组合物，其中所述一种或多种活性剂是治疗蛋白、治疗基因、抗体或其片段或变异体、siRNA、适体、寡核苷酸、反义寡核苷酸、基因修饰剂、基因表达修饰剂、包括抗肌萎缩蛋白或抗肌萎缩蛋白相关蛋白或肌微管素在内的替代肌肉蛋白、止痛剂、麻醉剂、消炎剂、抗感染剂、细胞因子、趋化因子、免疫调节剂、促进伤口愈合的试剂或其组合。
34.一种治疗溶酶体贮积病或糖原贮积病的方法，其包含向有此需要的受试者施用有效量的根据权利要求25所述的药物组合物，其中所述一种或多种活性剂是治疗蛋白、治疗基因、抗体或其片段或变异体、siRNA、适体、寡核苷酸、反义寡核苷酸、基因修饰剂、基因表达修饰剂、替代酶、止痛剂、麻醉剂、消炎剂、抗感染剂、细胞因子、趋化因子、免疫调节剂、促进伤口愈合的试剂或其组合。
35.根据权利要求26到34中任一项所述的方法，其中所述组合物全身性施用。
36.根据权利要求25到35中任一项所述的方法，其包含所述药物组合物的相隔至少一天的两次或更多次施用。
37.根据权利要求26到28中任一项所述的方法，其包含在用旨在增加肿瘤的DNA释放的放射疗法或化疗治疗肿瘤之后施用所述药物组合物。
38.一种检测癌症、组织损伤、受伤或缺血的部位的方法，其包含向有此需要的受试者施用有效量的根据权利要求25所述的药物组合物，其中所述一种或多种活性剂是可使用诊断成像或核医疗学技术检测的试剂。
39.根据权利要求38所述的方法，其中所述诊断成像或核医疗学技术选自由PET-CT、骨扫描、MRI、CT、超声波心动描记术、超声波以及x射线组成的群组。
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