CN103874710A

CN103874710A - 细胞渗透型抗dna抗体和其抑制dna修复的用途

Info

Publication number: CN103874710A
Application number: CN201280025431.2A
Authority: CN
Inventors: J·E·汉森; P·M·格雷泽; R·H·维斯波尔; R·N·西村; G·陈
Original assignee: Yale University; University of California; US Department of Veterans Affairs VA
Current assignee: Yale University; University of California; US Department of Veterans Affairs VA
Priority date: 2011-04-01
Filing date: 2012-04-02
Publication date: 2014-06-18
Anticipated expiration: 2032-04-02
Also published as: ES2744840T3; US20220017609A1; EP2694555B1; WO2012135831A8; WO2012135831A1; EP2694555A1; CN103874710B; US10961301B2; JP2016094479A; JP2014513069A; EP3597665A1; US20240247056A1; JP6178785B2; US9701740B2; US20170334981A1; US20140050723A1

Abstract

提供渗透细胞核并抑制DNA修复或干扰DNA代谢的抗体用于治疗癌症（直接地以及通过使癌细胞对DNA损伤型治疗敏感）或者抑制或预防病毒感染、增殖或代谢。所述方法涉及用含有细胞渗透型抗DNA抗体或其衍生物的组合物处理细胞，单独或与诱导DNA损伤的治疗（例如DNA损伤型化学疗法或放射）组合。细胞渗透型抗DNA抗体或其衍生物的影响在DNA修复不足的癌细胞中得到增强，并且细胞渗透型抗DNA抗体或其衍生物对DNA修复不足的癌细胞具有合成致死性。

Description

细胞渗透型抗DNA抗体和其抑制DNA修复的用途

相关申请案的交叉引用

本申请案要求2011年4月1日申请的美国临时申请案第61/470,918号的权利，其以全文引用的方式并入本文中。

关于联邦政府赞助研究或开发的声明

本发明是在政府支持下根据国立卫生研究院授予皮特·格雷泽（Peter Glazer）的协议P01 CA129186进行。政府拥有本发明的某些权利。

技术领域

本发明大体上是关于用于治疗癌症的抗体疗法领域，并且更特定地是关于细胞渗透型抗DNA抗体用于抑制DNA修复、使细胞对放射疗法和DNA损伤型化学疗法敏感以及选择性地杀死先前已存在DNA修复不足的癌细胞的用途。

背景技术

大部分癌症疗法因非特异性组织毒性所引起的显著副作用而严重受限，并且鉴别对癌细胞具有选择性毒性或者选择性地使肿瘤对治疗敏感的新颖药剂是癌症研究中的重要目标。大量工作集中于将单株抗体的特异性结合活性应用于肿瘤特异性疗法的开发。选择性抗体（例如曲妥珠单抗（trastuzumab）

）、利妥昔单抗（rituximab）

）和西妥昔单抗（cetuximab）（爱必妥

））已获准用于人类癌症疗法中，但其均缺乏渗透到癌细胞中的能力并且因此仅限于攻击位于肿瘤细胞外表面的标靶。

大量肿瘤特异性标靶位于细胞和细胞核内，并且多种癌症尤其易受抑制DNA修复的疗法的攻击。

因此本发明的一个目标是提供抑制DNA修复的细胞渗透型抗体，例如抗DNA抗体。

本发明的另一个目标是提供提高癌细胞对放射疗法和/或化学疗法的敏感性的组合物。

本发明的另一个目标是提供细胞渗透型抗体和其衍生物，其对先前已存在DNA修复不足的癌症或其他不合需要的细胞具有选择性毒性，这些细胞通常与家族性综合症有关，这些综合症是由DNA修复基因突变引起，但是也偶尔在DNA修复基因沉默或突变时发生。

本发明的另一个目标是提供细胞渗透型抗体和其衍生物，其通过扰乱主体DNA修复而预防或者抑制病毒感染、整合和/或复制。

发明内容

已经开发出使用抗DNA抗体渗透细胞核并抑制DNA修复的方法。在优选实施例中，细胞是赘生物，通常是癌细胞，例如癌瘤。治疗癌性或某些受感染细胞的方法涉及使所述细胞与细胞渗透型抗DNA抗体（单独或与其他药剂（例如化学治疗剂或放射）组合）接触。在一些实施例中，所述方法涉及分析受试者或肿瘤中损害DNA修复的一种或多种基因突变或正常基因表达的变化，接着如果鉴别出一种或多种突变或发生改变的表达或功能的模式那么选择抗DNA抗体用于治疗细胞。

DNA修复受损的细胞是此方法的尤其优良的标靶。在优选实施例中，细胞在与DNA修复、DNA损伤检查点、DNA合成、同源重组或非同源末端接合有关的基因的表达方面存在缺陷或所述基因发生突变。例示性基因包括XRCC1、ADPRT(PARP-1)、ADPRTL2(PARP-2)、聚合酶β、CTPS、MLH1、MSH2、FANCD2、PMS2、p53、p21、PTEN、RPA、RPA1、RPA2、RPA3、XPD、ERCC1、XPF、MMS19、RAD51、RAD51b.、RAD51C、RAD51D、DMC1、XRCCR、XRCC3、BRCA1、BRCA2、PALB2、RAD52、RAD54、RAD50、MRE11、NB51、WRN、BLM、KU70、KU80、ATM、ATR CHK1、CHK2、FANCA、FANCB、FANCC、FANCD1、FANCD2、FANCE、FANCF、FANCG、FANCC、FANCD1、FANCD2、FANCE、FANCF、FANCG、RAD1和RAD9。在一些实施例中，存在缺陷的基因是肿瘤抑制基因。举例来说，细胞可能在BRCA1或BRCA2中具有一种或多种突变。

许多癌症疗法程序（例如化学疗法和放射疗法）通过压制细胞修复DNA损伤的能力，引起细胞死亡来起作用。在一些实施例中，细胞对放射疗法和/或化学疗法具有抗性。还提供了通过向受试者投予含有细胞渗透型抗DNA抗体的组合物来增强放射疗法和/或化学疗法在受试者中的功效的方法。在一些实施例中，抗体提高细胞对放射疗法和/或化学疗法的敏感性。可以通过此方法增强的化学疗法包括损伤DNA或者抑制DNA修复的化学疗法。可以在投予放射疗法和/或化学疗法之前、同时或者之后向受试者投予抗DNA抗体。在优选实施例中，在投予放射疗法和/或化学疗法之前或之后至少两天，更优选地在投予放射疗法和/或化学疗法之前或之后至少一天，甚至更优选地与放射疗法和/或化学疗法同时向受试者投予抗DNA抗体。

披露了抑制DNA修复的细胞渗透型抗DNA抗体。这些抗体在不借助于载剂或结合物的情况下被转运到细胞的细胞核中。在一些实施例中，抗DNA抗体可以与单链DNA（ssDNA）、双链DNA（dsDNA）或其组合结合。70%全身性红斑狼疮（SLE）患者中存在对双链DNA具有特异性的抗体，相比之下，无全身性红斑狼疮的人群中仅0.5%的人具有这种抗体。因此，在一些实施例中，从患有SLE的受试者或者患有类似的自体免疫病状的动物（例如小鼠或兔）分离或者获得细胞渗透型抗DNA抗体，接着人类化或重组性表达并且以二聚物或单链抗体形式投予。

有效的细胞渗透型抗DNA抗体的实例是单株抗DNA抗体3E10或其与3E10结合相同抗原决定基的变异体或片段。在优选实施例中，抗DNA抗体是抗DNA抗体的单链可变片段或其保守性变异体。举例来说，抗DNA抗体可以是3E10的单链可变片段（3E10scFv）或其保守性变异体。3E10scFv优选地以从哺乳动物细胞中的表达载体（例如酵母，例如毕赤酵母（Pichia pastoris））表达的重组型蛋白质形式产生。

在优选实施例中，抗体与由ATCC寄存编号PTA2439融合瘤产生的单株抗体3E10具有相同的抗原决定基特异性。此可以通过产生含有单株抗体3E10的抗体结合部位的重组型抗体来实现。或者，此可以通过由从患有自体免疫疾病（例如SLE）的人类受试者或小鼠或其他实验动物分离的淋巴细胞产生融合瘤来实现。合适抗体包括全长抗体、单链抗体和抗体片段。抗体还可以是双特异性单株抗体，其特异性结合细胞的细胞核中的第二治疗标靶。举例来说，在一些实施例中，抗体特异性结合细胞的细胞核中的蛋白质，例如DNA修复蛋白、DNA复制蛋白、DNA损伤反应蛋白、细胞周期调节蛋白、DNA损伤检查点蛋白、细胞凋亡调节蛋白或应力反应蛋白。这些类别中的例示性标靶分别包括RAD52蛋白、共济失调毛细血管扩张突变蛋白（ATM）、CHK2或CHK1蛋白、BCL2蛋白、热休克蛋白70（HSP70）、Myc蛋白和Ras蛋白。

在一个优选实施例中，细胞渗透型抗DNA抗体是以单位剂量形式以有效抑制癌症中的DNA修复的量提供，其可以包括处于同一个小瓶中或分别处于试剂盒中的药学上可接受之赋形剂，其中抗体以有效抑制癌细胞中的DNA修复的量存在。在优选实施例中，抗体是以约200mg/m²到约1000mg/m²，包括约200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900或1000mg/m²的量存在。在一些实施例中，医药组合物是呈用于静脉内注射的单位剂型形式。在一些实施例中，医药组合物是呈用于瘤内注射的单位剂型形式。

医药组合物（例如剂量单元）可以更含有其它治疗剂或者与其他治疗剂一起提供在试剂盒中。举例来说，其它治疗剂可以是抗肿瘤剂、放射增敏剂或其组合。抗肿瘤剂优选地损伤DNA或抑制DNA修复。在一些实施例中，抗肿瘤剂是顺铂（cisplatin）、环磷酰胺（Cytoxan）、阿霉素（doxorubicin）、甲氨蝶呤（methotrexate）、丝裂霉素C（mitomycin c）、氮芥（nitrogen mustard）、核糖核苷酸还原酶抑制剂（例如羟基脲）、替拉扎明（tirapazamine）、替莫唑胺（temozolomide）或拓扑异构酶抑制剂（例如喜树碱（camptothecin））。

可以存在于医药组合物中的放射增敏剂的非限制性实例包括顺铂、阿霉素、吉西他滨（gemcitabine）、5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil）、PARP1抑制剂、组织蛋白脱乙酰基酶抑制剂、蛋白酶体抑制剂、表皮生长因子受体（EGFR）抑制剂、胰岛素样生长因子-1（IGF-1）受体抑制剂、CHK1抑制剂、mTOR抑制剂、激酶抑制剂、己酮可可碱（pentoxifylline）和长春瑞滨（vinorelbine）。

医药组合物（例如剂量单元）可更含有一种或多种用于治疗癌症的治疗性单株抗体。在优选实施例中，治疗性单株抗体是贝伐珠单抗（bevacizumab）、西妥昔单抗（cetuximab）、利妥昔单抗（rituximab）、曲妥珠单抗（trastuzumab）或其组合。

附图说明

图1A是3E10单链抗体可变片段（3E10scFv）的示意图，此片段由通过连接结构域（LD）接合的3E10轻链和重链的可变区组成。添加Myc和His6标签以便进行检测和纯化。3E10scFv渗入癌细胞的细胞核中（在Skov-3卵巢癌细胞用5μM3E10scFv处理30分钟接着固定并用抗Myc抗体染色的情况下证明）。图1B是柱状图，其显示当存在对照缓冲液（柱1和柱3）或10μM3E10Fv（柱2和柱4）时用0Gy（柱1-2）或4Gy（柱3-4）照射的U251人神经胶质瘤细胞的克隆源性存活（与对照物相比的存活分数）。误差条表示重复实验的标准误差。图1C-1D是显示当存在（虚线）或不存在（实线）10μM3E10scFv时U87人神经胶质瘤细胞的细胞死亡（%，通过碘化丙锭萤光测量）随阿霉素（Dox）（0-250nM）（图1E）或太平洋紫杉醇（paclitaxel）（0-2.5nM）（图1F）的变化的图形。

图2A说明3E10-DNA结合实验中使用的DNA受质的不同构造。图2B是显示在与递增浓度的3E10（0-1μM）一起培育后当存在（实线）或不存在（虚线）由3E10结合的自由单链尾端（tail）时经放射性标记的寡核苷酸的百分比（%）（通过凝胶迁移率变动分析确定）。这些结合曲线得出当存在和不存在自由单链尾端时3E10与受质结合的K_d分别是0.2μM和0.4μM。图2C-2H呈现各DNA构造的个别3E10-DNA结合曲线。图2I是柱状图，其显示当存在对照缓冲液（空心柱）或20μM3E10（实心柱）时与所需的修复酶一起培育的合成性经放射性标记的双螺旋DNA受质中的单链断裂/碱基切除修复（BER）（n+1产物%表示不完全修复中间物的比例，其中已将核苷酸添加到有间隙的双螺旋分子中，但未修复剩余单链断裂以便产生全长产物）。在所示时间点时停止修复反应，并且通过凝胶电泳和自动放射线照相对n、n+1和双螺旋反应产物进行定量。

图3A是试管内DNA链交换分析法的示意图。图3B和3C是柱状图，其显示递增剂量的3E10（0-35μM）对使用野生型hRAD51蛋白（图3B）或变异体hRAD51K133R（图3C）的RAD51介导的链交换的影响。hRAD51K133R变异体与野生型蛋白质相比对于链交换的活性甚至更高，因为其未使ATP水解。3E10抑制野生型RAD51和hRAD51K133R变异体的链交换。

免疫荧光图象说明当存在对照缓冲液或10μM3E10scFv时用2Gy照射后24小时，每个U251神经胶质瘤细胞中的DNA双链断裂（γH2AX聚集点）。图3D是柱状图，其显示当存在对照缓冲液（空心柱）或10μM3E10scFv（实心柱）时用2Gy照射后24小时，每个U251神经胶质瘤细胞中DNA双链断裂（γH2AX聚集点）的平均数目。误差条表示标准误差。

图4A-4B是柱状图，其通过处理后1-2周测量的集落形成显示用对照缓冲液（空心柱）或10μM3E10scFv（实心柱）处理的BRCA2健全型（图4A）或BRCA2不足型（图4B）人卵巢癌细胞的克隆源性存活（与对照物相比的存活分数）。图4C是显示用3E10scFv（0-2μM）处理的BRCA2不足型（PEO1）和BRCA2健全型（PEO4）人卵巢癌细胞的细胞死亡%的图形。在处理后三天通过

荧光（其报导ATP含量作为代谢活性细胞的测量值）评估3E10scFv对细胞存活的影响。误差条表示六次测量的平均值的标准误差。图4D是显示用对照缓冲液或3E10scFv处理的BRCA2不足型CAPAN1/neo细胞（人胰腺癌细胞）的克隆源性存活（通过集落形成测量的与对照物相比的存活分数）。图4E是显示用0μM、2.5μM、5μM或10μM完全3E10抗体处理的BRCA2不足型（虚线）或BRCA2健全型（实线）人卵巢癌细胞的细胞死亡（%）的图形。图4F和4G是柱状图，其显示用对照缓冲液（柱1）、10μM3E10（柱2）、3nM阿霉素（Dox）（柱3）或10μM3E10+3nM阿霉素（柱4）处理的BRCA2不足型（图4G）或BRCA2健全型（图4F）人卵巢癌的细胞死亡（%）。

图5是柱状图，其显示通过腹膜内注射对照缓冲液（柱1）、单独3E10抗体（0.8mg于0.5mL PBS中，10μM）（柱2）、单独阿霉素（Dox）（80μg/kg）（柱3）或3E10和阿霉素（柱4）进行皮下注射处理的SCID小鼠中产生的U87神经胶质瘤的肿瘤体积（增加%）。各处理组包含4只小鼠。注射后三天，通过测量肿瘤生长来评估处理的影响。

图6A是显示人神经胶质瘤异种移植小鼠中肿瘤体积（mm³）随时间（天）变化的图形，这些小鼠是在U87细胞植入后二十六天（肿瘤已经生长到约100mm³的平均尺寸）通过腹膜内注射对照性PBS缓冲液（实心菱形和三角形）或3E10（1mg于PBS中）（空心菱形和三角形）来处理，24小时后重复再次进行上述注射，接着在第二次注射后用0Gy（菱形）或8Gy（三角形）照射2小时。

图6B呈现各组中无疾病进展存活率的卡普兰-麦尔（Kaplan-Meier）曲线。无疾病进展存活率定义为肿瘤尺寸与基线尺寸相比未增加达到超过三倍的存活率。基线尺寸定义为在抗体处理前一天的肿瘤尺寸，其表示为图6A中的第25天和图6B中的第0天。用8Gy处理的肿瘤中肿瘤增至三倍的时间（肿瘤体积增加达到基线的三倍所需的时间）是9.5±0.5天，相比之下，用8Gy+3E10处理的肿瘤的肿瘤增至三倍的时间是13.7±1.8天（p=0.04）。但是，与单独对照缓冲液相比，单独3E10对U87肿瘤无影响，对照性肿瘤的肿瘤增至三倍的时间是6.8±0.7天，而相比之下，用单独3E10处理的肿瘤的肿瘤增至三倍的时间是6.5±0.3天（p=0.67）。

具体实施方式

I.定义

术语“抗体”是指选择性结合靶抗原的天然或合成抗体。所述术语包括多株和单株抗体。除完整免疫球蛋白分子之外，术语“抗体”还包括这些免疫球蛋白分子的片段或聚合物，和选择性结合靶抗原的免疫球蛋白分子的人或人类化型式。

术语“细胞渗透型抗DNA抗体”是指被转运到活哺乳动物细胞的细胞核中并且特异性结合DNA（例如单链和/或双链DNA）的抗体。在优选实施例中，抗体是在不借助于载剂或结合物的情况下被转运到细胞的细胞核中。在其它实施例中，抗体与细胞渗透型部分（例如细胞渗透型肽）结合。

术语“特异性结合”是指抗体与其同源抗原（例如DNA）结合而不与其它抗原显著结合。优选地，抗体以大于约10⁵mol^-1（例如10⁶mol^-1、10⁷mol^-1、10⁸mol^-1、10⁹mol^-1、10¹⁰mol^-1、10¹¹mol^-1和10¹²mol^-1或更大）的与该第二分子的亲和力常数（Ka）与所述抗原“特异性结合”。

术语“单株抗体”或“MAb”是指从实质上同类的抗体群获得的抗体，即除了一小群抗体分子中可能存在的天然突变外，所述群内的个别抗体是相同的。

术语“DNA修复”是指细胞用来鉴别和矫正对DNA分子的损伤的一系列过程。通过碱基切除修复（BER）、核苷酸切除修复（NER）或错配修复（MMR）来修复单链缺陷。通过非同源末端接合（NHEJ）、微同源介导的末端接合（MMEJ）或同源重组来修复双链断裂。在DNA损伤后，细胞周期检查点被活化，其暂停细胞周期以便为细胞提供时间修复损伤，随后继续分裂。检查点介体蛋白包括BRCA1、MDC1、53BP1、p53、ATM、ATR、CHK1、CHK2和p21。

术语“受损DNA修复”是指其中突变细胞或基因表达发生改变的细胞不能进行DNA修复或其中一种或多种DNA修复路径的活性降低或与野生型细胞相比修复其DNA损伤所需的时间更长的状态。

术语“化学敏感性”是指癌细胞对抗癌药作用的相对敏感性。癌细胞的化学敏感性越高，杀死这种癌细胞所需的抗癌药越少。

术语“放射敏感性”是指细胞对电离放射的不良作用的相对敏感性。细胞的放射敏感性越高，杀死这种细胞所需的放射越少。通常，已经发现细胞放射敏感性与细胞分裂速率成正比并且与细胞的DNA修复能力成反比。

术语“抗放射性”是指当暴露于临床合适剂量的放射时不会死亡的细胞。

术语“赘生性细胞”是指发生异常细胞增殖（“瘤形成”）的细胞。赘生性细胞的生长过度并且与其周围的正常组织不协调。这种生长通常即使在刺激停止后仍然持续按相同过度方式进行，并且通常引起肿瘤形成。

术语“肿瘤”或“赘生物”是指含有赘生性细胞的异常组织块。赘生物和肿瘤可以是良性的、恶化前的或恶性的。

术语“癌症”或“恶性赘生物”是指显示生长不受控、对相邻组织的侵袭并且通常转移到身体其他位置的细胞。

术语“抗肿瘤药”是指可以抑制或预防癌症发展、侵袭和/或转移的组合物，例如药物或生物制品。

术语“抗癌部分”是指可以与所披露的抗DNA抗体组合以便增强所述抗体的抗癌性质的任何药剂，例如肽、蛋白质、核酸或小分子。所述术语包括抗肿瘤药、结合并抑制癌细胞中其他治疗标靶的抗体以及对癌细胞具有亲和力以便定向靶向癌细胞的物质。

术语“病毒转型细胞”是指已经受病毒感染或者其基因组中已经并入病毒DNA或RNA的细胞。病毒可以是急性转型或慢性转型致癌病毒。在急性转型病毒中，病毒粒子载运编码活性过度的致癌基因的基因（称为病毒-致癌基因（v-onc）），并且一旦v-onc被表达，则受感染细胞发生转型。相比之下，在慢性转型病毒中，将病毒基因组插入宿主基因组中原致癌基因附近。例示性致癌病毒包括人乳头状瘤病毒（HPV）、B型肝炎（HBV）、C型肝炎（HCV）、人亲T淋巴细胞性病毒（HTLV）、与卡堡氏肉瘤（Kaposi's sarcoma）有关的疱疹病毒（HHV-8）、梅克尔细胞（Merkelcell）多瘤病毒、埃-巴二氏病毒（Epstein-Barr virus；EBV）、人免疫缺陷病毒（HIV）和人巨细胞病毒（CMV）。

病毒感染细胞是指已经暴露于病毒或受病毒感染或携带病毒遗传物质（RNA或DNA）的细胞。病毒可以是致癌病毒或裂解病毒或潜伏性病毒并且会引起癌症、免疫缺陷、肝炎、脑炎、肺炎、呼吸道疾病或其它疾病病状。早先已证实逆转录酶病毒（特别是HIV）在某种程度上依赖于碱基切除修复（BER）路径来整合到宿主DNA中。3E10抑制DNA修复的能力提供了一种机制，使3E10和其它抗DNA抗体可以改善病毒引起的疾病，特别是通过干扰DNA修复并且由此通过阻断DNA或RNA代谢（其是病毒生命周期的一部分以及细胞病毒感染的一部分）。实例证明3E10抑制BER路径，支持抑制所述反转录病毒的感染性的功效。

术语“个体”、“宿主”、“受试者”和“患者”可以互换地使用，是指作为投药或治疗对象的任何个体。受试者可以是脊椎动物，例如哺乳动物。因此，受试者可以是人或兽医学患者。

术语“治疗有效性”意指所使用的组合物量是足以改善疾病或病症的一种或多种病因或症状的量。所述改善仅需减轻或改变，而不一定是消除。用于治疗癌症的组合物的治疗有效量优选地是足以引起肿瘤消退或使肿瘤对放射或化学疗法敏感的量。

术语“药学上可接受”是指不会在生物学或其它方面不合需要的物质，即所述物质可以被投予个体而不会引起任何不合需要的生物学作用或通过有害的方式与含有它的医药组合物中的任一种其它组分相互作用。如本领域的普通技术人员所熟知，将容易地选择载剂以便使活性成分的任何降解最少以及使个体中的任何不良副作用最少。

术语“治疗”是指意图治愈、改善、稳定或预防疾病、病理学病状或病症的对患者的医学管理。此术语包括积极治疗，即治疗特别针对疾病、病理学病状或病症的改善，并且还包括病因治疗，即治疗针对去除相关疾病、病理学病状或病症的病因。此外，此术语包括姑息治疗，即治疗被设计成用于缓解症状而非治愈疾病、病理学病状或病症；预防性治疗，即治疗针对最小化或部分抑制或完全抑制相关疾病、病理学病状或病症的发展；和支持治疗，即治疗用于补充另一种针对改善相关疾病、病理学病状或病症的特定治疗。

术语“抑制”意指降低活性、反应、病状、疾病或其它生物参数。此术语可以包括（但不限于）完全消除活性、反应、病状或疾病。此术语还可以包括（例如）使活性、反应、病状或疾病与原始或对照程度相比降低10%。因此，与原始或对照程度相比，降低程度可达10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%或其间的任何降低量。

“融合蛋白”是指通过接合两个或多于两个多肽而形成的多肽，所述接合是通过一个多肽的氨基末端与另一个多肽的羧基末端之间形成的肽键进行。融合蛋白可以通过成分多肽的化学偶合而形成或者其可以表达为来自编码单一相连融合蛋白的核酸序列的单一多肽。单链融合蛋白是具有单一相连多肽主结构的融合蛋白。融合蛋白可以使用分子生物学中的常规技术通过将两个基因同框接合到单一核酸序列中接着在产生融合蛋白的条件下在合适的宿主细胞中表达核酸来制备。

II.组合物

A.抗DNA抗体

披露用于增强靶细胞对化学疗法和/或放射的敏感性的细胞渗透型抗DNA抗体。经常在全身性红斑狼疮（SLE）患者的血清中发现针对单链或双链脱氧核糖核酸（DNA）的自身抗体并且它们通常与疾病发病机理有关。因此，在一些实施例中，可以从SLE患者获得或分离抗DNA抗体。在优选实施例中，抗DNA抗体是单株抗体或者其片段或变异体。存在DNA反应性循环自身抗体（抗DNA抗体）是全身性红斑狼疮（SLE）患者中的标志性实验室发现。尽管抗DNA抗体在SLE中的确切作用尚不清楚，但已经表明所述抗体在SLE病理生理学中起积极作用。在二十世纪九十年代早期，在针对SLE的实验疫苗疗法中测试鼠类狼疮抗DNA抗体3E10。这些工作的目的在于开发抗个体基因型抗体，其将特异性结合SLE患者中的抗DNA抗体。但是，意外发现3E10可以渗透到活细胞和细胞核中而不引起任何可观测到的细胞毒性（韦斯巴特RH（Weisbart RH）等人，免疫学杂志（J Immunol.）1990144（7）：2653-2658；扎克DJ（Zack DJ）等人，免疫学杂志1996157（5）:2082-2088）。对SLE疫苗疗法中3E10的研究接着被集中于开发用于将治疗分子转运到细胞和细胞核中的分子递送工具的3E10的努力所替代。也报告了其它抗体能够渗透细胞。

3E10抗体和其单链可变片段（3E10scFv）渗透到细胞和细胞核中并且已证实其能够通过化学结合或重组型融合来转运连接到所述抗体的治疗性蛋白货物。通过3E10或3E10scFv递送到细胞的蛋白货物包括过氧化氢酶、p53和Hsp70（韦斯巴特RH等人，免疫学杂志2000164：6020-6026；汉森JE（Hansen JE）等人，癌症研究（Cancer Res.）2007年2月15日；67（4）:1769-74；汉森JE等人，脑部研究（BrainRes.）2006年5月9日；1088（1）:187-96）。3E10scFv在活体内有效地介导将Hsp70递送到神经元并且由此降低大鼠中风模型中的大脑梗塞体积和改良神经功能（詹X（Zhan X）等人，中风学（Stroke），201041（3）:538-43）。

现已发现3E10和3E10scFv在不与任何治疗性蛋白质结合的情况下可以增强癌细胞放射敏感性和化学敏感性并且此作用在DNA修复不足的细胞中得到增强。此外，3E10和3E10scFv即使在不进行放射或化学疗法的情况下仍对DNA修复不足的癌细胞有选择性致死性。美国食品和药物管理局（FDA）已经建立开发单株抗体用于人类疗法的途径，并且FDA已经批准将3E10用于I期人类临床试验，此试验被设计成测试3E10在针对SLE的实验疫苗疗法中的功效（斯佩尔蒂尼F（Spertini F）等人，风湿病学杂志（J Rheumatol）1999，26（12）：2602-8）。因此，这些类型的抗体可以用于DNA修复不足的癌症的靶向疗法以及针对癌症的新靶向疗法以便增强DNA修复健全型癌症以及DNA修复不足型癌症中的其他癌症治疗形式。

已知其它细胞渗透型抗体（均天然存在于SLE患者中）并且通过筛选抗体文库或已知细胞渗透型抗体的衍生化作用来获得。在一些实施例中，抗DNA抗体与细胞渗透型部分（例如细胞渗透型肽）结合以便有助于进入细胞中和转运到细胞核。细胞渗透型肽的实例包括（但不限于）聚精氨酸（例如R9）、触角足（Antennapedia）序列、TAT、HIV-Tat、穿膜肽（Penetratin）、Antp-3A（Antp突变体）、蟾蜍肽II（BuforinII）、细胞穿透肽（Transportan）、MAP（模型两性肽）、K-FGF、Ku70、朊病毒、pVEC、Pep-1、SynB1、Pep-7、HN-1、BGSC（双胍盐-亚精胺-胆固醇）和BGTC（双胍盐-三氨乙基胺-胆固醇）。在其它实施例中，使用TransMabs^TM技术（不列颠哥伦比亚省温哥华市的英钠克斯生物技术公司（InNexus Biotech.,Inc.,Vancouver,BC））修饰抗体。

在优选实施例中，抗DNA抗体是在不借助于载剂或结合物的情况下被转运到细胞的细胞核中。举例来说，在活体内被转运到哺乳动物细胞的细胞核中而无细胞毒素作用的单株抗体3E10和其活性片段披露于颁予理查德·韦斯巴特（Richard Weisbart）的美国专利第4,812,397号和第7,189,396号中，其描述3E10抗体以及产生和修饰3E10抗体的方法。简单地说，可以根据已知技术通过使来自抗DNA抗体的血清含量升高的宿主（例如MRL/1pr小鼠）的脾细胞与骨髓瘤细胞融合或者通过用合适的转型载体使脾细胞转型以便使细胞永生化来制备抗体。可以在选择性培养基中培养细胞并且进行筛选以便选择结合DNA的抗体。

可以使用的抗体包括任何类别的完全免疫球蛋白（即完整抗体）、其片段和至少含有抗体的抗原结合可变域的合成蛋白质。可变域在抗体间序列不同并且用于各特定抗体针对其特定抗原的结合和特异性。但是，可变性通常并不在抗体的可变域内均匀分布。其通常集中于称为互补决定区（CDR）或高变区（均位于轻链和重链可变域中）的三个区段中。可变域中保守性更高的部分被称为构架（FR）。原生重链和轻链的可变域各包含四个FR区域，其主要呈β片状构造，由三个CDR连接，其形成环连接并且在一些情况下形成β片状结构的一部分。各链中的CDR通过FR区域保持紧密靠近在一起并且与来自另一条链的CDR一起贡献抗体的抗原结合位点的形成。因此，抗体至少含有渗透细胞、保持DNA结合和/或干扰DNA修复的CDR组分。3E10的可变区含有所有三种性质。

还披露具有生物活性的抗体片段。片段（无论是否连接到其它序列）包括插入、缺失、取代或特定区域或特异性氨基酸残基的其他所选修饰，只要与未经过修饰的抗体或抗体片段相比不显著改变或损害片段的活性即可。

还可以修改技术以便用于产生对抗原性蛋白质具有特异性的单链抗体。本领域的普通技术人员熟知用于产生单链抗体的方法。可以通过使用短肽连接子使重链和轻链的可变域融合在一起，由此在单一分子上重新构成抗原结合位点来产生单链抗体。已经在不显著破坏抗原结合或结合特异性的情况下产生单链抗体可变片段（scFv），其中一个可变域的C端通过具有15个到25个氨基酸的肽或连接子系到另一个可变域的N端。选择连接子以允许重链和轻链按照其合适的构造定向结合在一起。

可以修饰抗DNA抗体以便改良其治疗潜力。举例来说，在一些实施例中，细胞渗透型抗DNA抗体与另一种抗体结合，所述另一种抗体对癌细胞的细胞核中的第二治疗标靶具有特异性。举例来说，细胞渗透型抗DNA抗体可以是融合蛋白，其含有3E10scFv和特异性结合第二治疗标靶的单株抗体的单链可变片段。在其它实施例中，细胞渗透型抗DNA抗体是双特异性抗体，其具有来自3E10的第一重链和第一轻链以及来自特异性结合第二治疗标靶的单株抗体的第二重链和第二轻链。

可以通过连接两个scFv来工程改造出二价单链可变片段（二-scFv）。此可以通过产生具有两个VH和两个VL区域的单肽链从而产生串联scFv来进行。ScFv也可以被设计成具有对于使两个可变区折叠在一起来说太短的连接肽（约五个氨基酸），从而迫使scFv发生二聚。此类型被称为双功能抗体。已经证实双功能抗体的解离常数比相应scFv低高达40倍，表明其对其标靶的亲和力高得多。更短的连接子（一个或两个氨基酸）引起形成三聚物（三功能抗体）。四功能抗体亦己被产生。其与双功能抗体相比对其标靶呈现出甚至更高的亲和力。

抗体的治疗功能可以通过使抗体或其片段与治疗剂偶合来增强。所述抗体或片段与治疗剂的偶合可以通过形成免疫结合物或形成融合蛋白，或通过使抗体或片段连接到核酸（例如siRNA）或小分子（包含抗体或抗体片段和治疗剂）来实现。

重组型融合蛋白是通过融合基因的遗传工程改造而产生的蛋白质。此通常涉及从编码第一个蛋白质的cDNA序列去除终止密码子，接着通过接合或重叠扩展PCR同框连接第二个蛋白质的cDNA序列。DNA序列接着将被细胞表达成单一蛋白质。蛋白质可以被工程改造成包括两种原始蛋白质的完全序列或任一蛋白质的一部分序列。如果两个实体是蛋白质，那么通常还添加连接子（或“间隔基”）肽，其使蛋白质更有可能独立地折叠并且按预期起作用。

本领域中熟知将非人类抗体人类化的方法。通常，人类化抗体中引入有一个或多个来自非人类来源的氨基酸残基。这些非人类氨基酸残基通常被称为“输入”残基，其通常是从“输入”可变域获得。抗体人类化技术通常涉及使用重组DNA技术操作编码抗体分子中一个或多个多肽链的DNA序列。

在一些实施例中，修饰细胞渗透型抗体以便改变其半衰期。在一些实施例中，需要延长抗体的半衰期以使其在循环中或在治疗位点处存在更长的时间。举例来说，当单独使用抗DNA抗体治疗癌症（例如DNA修复受损的癌细胞）时，可能需要长时间保持循环或治疗位置中抗体的效价。在其它实施例中，缩短抗DNA抗体的半衰期以便降低潜在副作用。举例来说，当抗体与放射疗法或化学疗法结合使用时，抗体优选地在放射或抗肿瘤药治疗期间以高剂量存在于循环中，但在其它时间则快速地从循环中去除。预期抗体片段（例如3E10scFv）的半衰期比全尺寸抗体短。其它改变半衰期的方法已知并且可用于所述方法中。举例来说，抗体可以用延长半衰期的Fc变异体工程改造，例如使用Xtend^TM抗体半衰期延长技术（加利福尼亚州蒙罗维亚的先科公司（Xencor,Monrovia,CA））。

B.癌症和病毒转型细胞

抗体可用于治疗发生生长失调、侵袭或转移的细胞。DNA修复受损的癌细胞是细胞渗透型抗DNA抗体的尤其优良的对象。在一些实施例中，细胞渗透型抗DNA抗体对DNA修复受损的细胞具有致死性。在优选实施例中，细胞在与DNA修复、DNA合成或同源重组有关的基因表达方面存在缺陷。例示性基因包括XRCC1、ADPRT（PARP-1）、ADPRTL2（PARP-2）、聚合酶β、CTPS、MLH1、MSH2、FANCD2、PMS2、p53、p21、PTEN、RPA、RPA1、RPA2、RPA3、XPD、ERCC1、XPF、MMS19、RAD51、RAD51B、RAD51C、RAD51D、DMC1、XRCCR、XRCC3、BRCA1、BRCA2、PALB2、RAD52、RAD54、RAD50、MRE11、NB51、WRN、BLM、KU70、KU80、ATM、ATR CFIK1、CHK2、FANCA、FANCB、FANCC、FANCD1、FANCD2、FANCE、FANCF、FANCG、FANCC、FANCD1、FANCD2、FANCE、FANCF、FANCG、RAD1和RAD9。在一些实施例中，存在缺陷的基因是肿瘤抑制基因。在优选实施例中，细胞的BRCA1或BRCA2中具有一个或多个突变。基因突变（例如BRCA1和BRCA2突变）可以使用标准PCR、杂交或定序技术鉴别。

因此，在一些实施例中，抗DNA抗体可以用于治疗由DNA修复不足型家族性综合症引起的癌症，例如乳癌、卵巢癌和胰腺癌。在这些实施例中，抗DNA抗体可以在无放射疗法或化学疗法的情况下有效。举例来说，抗DNA抗体可以用于治疗与BRCA1、BRCA2、PALB2或RAD51B、RAD51C、RAD51D或相关基因中的突变有关的癌症。抗DNA抗体还可以用于治疗跟与DNA错配修复有关的基因（例如MSH2、MLH1、PMS2和相关基因）中的突变有关的结肠癌、子宫内膜肿瘤或脑肿瘤。抗DNA抗体还可以用于治疗伴有DNA修复基因（例如BRCA1、MLH1或RAD51B、RAD51C或RAD51D）沉默的癌症。在这些优选实施例中，抗DNA抗体抑制DNA修复的能力与这些癌症固有的修复不足相组合便足以诱导细胞死亡。

因此，在一些实施例中，抗DNA抗体可以用于治疗病毒转型细胞，例如受致癌病毒感染的细胞。病毒转型可以迫使细胞发生表达型变化，例如高饱和密度、不依赖于锚定的生长（anchorage-independent growth）、接触抑制损失、定向生长损失、永生化和细胞骨架分裂。细胞转型需要细胞内持续存在病毒基因组的至少一部分。此可以通过从多种病毒基因（例如致癌基因）持续表达来实现。这些基因可能干扰细胞的信号传导途径，引起观测到的细胞的表型变化。在一些情况中，将病毒基因组插入宿主基因组中原致癌基因附近。最终结果是转型细胞显示细胞分裂增加，其对病毒是有利的。在一些实施例中，病毒转型、病毒感染和/或代谢依赖于DNA修复机制。在这些实施例中，使用所披露的抗DNA抗体抑制DNA修复也抑制细胞中的病毒转型、病毒感染和/或代谢。

在一些实施例中，病毒转型、病毒感染和/或代谢依赖于作为病毒生命周期的一部分的病毒编码RNA或DNA的代谢，产生容易被3E10或其它抗DNA抗体结合和/或抑制的中间物。在这些实施例中，用所披露的抗DNA抗体进行的治疗也抑制细胞中的病毒转型、病毒感染和/或代谢。

早先已发现慢病毒（例如HIV）的感染和整合依赖于宿主BER活性（约德（Yoder）等人，公共科学图书馆·综合（PLoS One），2011年3月，6（3）e17862）。此外，共济失调-微血管扩张突变型（ATM）DNA损伤反应似乎对HIV复制比较关键（刘（Lau）等人，自然细胞生物学（Nat Cell Biol），20057（5）:493-500）。在一些实施例中，反转录病毒（包括慢病毒、HIV）感染和整合依赖于宿主DNA修复机制。在这些实施例中，用所披露的抗DNA抗体进行的治疗也可以抑制病毒感染/整合和抑制病毒生命周期中的再感染。

在一些实施例中，慢病毒（HIV）复制依赖于DNA修复。在这些实施例中，用所披露的抗DNA抗体进行的治疗也可以抑制病毒复制和抑制病毒生命周期中的再感染。因此，抗DNA抗体可以用于治疗受病毒（例如致癌病毒）感染的细胞。在一些实施例中，抗体抑制病毒转型、复制、代谢或其组合。会受抗DNA抗体影响的例示性致癌病毒包括人乳头状瘤病毒（HPV）、B型肝炎（HBV）、C型肝炎（HCV）、人亲T淋巴细胞性病毒（HTLV）、卡堡氏肉瘤相关疱疹病毒（HHV-8）、梅克尔细胞多瘤病毒、埃-巴二氏病毒（EBV）、人免疫缺陷病毒（HIV）和人巨细胞病毒（CMV）。抗DNA抗体也可以用于治疗潜伏性病毒。在一些实施例中，受感染细胞设置针对病毒（例如HSV-1）的DNA损伤反应的失效有助于产生潜伏期。因此这些受病毒感染细胞的DNA修复受损并且对用抗DNA抗体进行的治疗敏感。例示性潜伏性病毒包括CMV、EBV、单纯疱疹病毒（1型和2型）以及水痘带状疱疹病毒。

抗DNA抗体也可以用于治疗由病毒引起的病毒感染，这些病毒会引起癌症、免疫缺陷、肝炎、脑炎、肺炎、呼吸道疾病或其它疾病病状，借助于抗体结合DNA和干扰DNA修复或RNA代谢（其是病毒生命周期的一部分）的能力。

生命周期或所引起的感染的症状可能受到抗体投药影响的代表性病毒包括人乳头状瘤病毒（HPV）、B型肝炎（HBV）、C型肝炎（HCV）、人亲T淋巴细胞性病毒（HTLV）、卡堡氏肉瘤相关疱疹病毒（HHV-8）、梅克尔细胞多瘤病毒、埃-巴二氏病毒（EBV）、人免疫缺陷病毒（HIV）和人巨细胞病毒（CMV）。

其它可能受到抗体投药影响的病毒包括细小病毒、痘病毒、疱疹病毒和其它DNA病毒：

可能受到抗体投药影响的RNA病毒包括：

反转录病毒也可能受影响：

α逆转录病毒属（Alpharetrovirus）；物种类型：禽白血病病毒（Avian leukosis virus）；其它包括劳斯肉瘤病毒（Rous sarcoma virus）

β逆转录病毒属（Betaretrovirus）；物种类型：小鼠乳腺肿瘤病毒

γ反转录病毒属（Gammaretrovirus）；物种类型：鼠类白血病病毒；其它包括猫白血病病毒

δ反转录病毒属（Deltaretrovirus）；物种类型：牛白血病病毒；其它包括引起癌症的人亲T淋巴细胞性病毒

ε反转录病毒属（Epsilonretrovirus）；物种类型：角膜白斑真皮肉瘤病毒

慢病毒属（Lenlivirus）；物种类型：人免疫缺陷病毒1；其它包括猿、猫免疫缺陷病毒

泡沫病毒属（Spumavirus）；物种类型：猿泡沫病毒

肝DNA病毒科-例如B型肝炎病毒

其它可能受抗体投药影响的病毒疾病包括科罗拉多蜱传热（Colorado Tick Fever）（由科罗拉多蜱传热病病毒（Coltivirus）、RNA病毒引起）、西尼罗河热（West NileFever）（脑炎，由主要存在于中东和非洲的黄病毒引起）、黄热病、狂犬病（由弹状病毒科（Rhabdoviridae）的亲神经性病毒的多种不同菌株引起）、病毒性肝炎、肠胃炎（病毒性）-急性病毒性胃肠炎（由诺沃克病毒和类诺沃克病毒、轮状病毒、杯状病毒和星状病毒引起）、脊髓灰质炎、流行性感冒（flu）（由正黏液病毒（其会发生频繁的抗原变异）引起）、风疹（麻疹）、副黏病毒科、腮腺炎、呼吸综合症（包括病毒性肺炎和急性呼吸综合症，包括由统称为急性呼吸道病毒的多种病毒引起的义膜性喉炎）和由呼吸道融合性病毒（RSV，幼儿中呼吸道感染的最危险病因）引起的呼吸道疾病。

在一些实施例中，抗DNA抗体可以与放射疗法、化学疗法或其组合结合使用以便治疗任何癌症，包括癌瘤、神经胶质瘤、肉瘤或淋巴瘤。在这些实施例中，抗DNA抗体可以使细胞对放射疗法或化学疗法的DNA损伤作用敏感。可以使用抗体治疗的癌症的代表性但非限制性清单包括血液和淋巴系统癌症（包括白血病、霍奇金氏淋巴瘤（Hodgkin's lymphoma）、非霍奇金氏淋巴瘤、孤立性浆细胞瘤、多发性骨髓瘤）、生殖泌尿系统癌症（包括前列腺癌、膀胱癌、肾癌、尿道癌、阴茎癌、睾丸癌）、神经系统癌症（包括脑膜瘤、神经胶质瘤、神经胶母细胞瘤、室管膜瘤）、头部和颈部癌症（包括口腔、鼻腔、鼻咽腔、口咽腔、喉和鼻窦的鳞状细胞癌）、肺癌（包括小细胞和非小细胞肺癌）、妇科癌症（包括子宫颈癌、子宫内膜癌、阴道癌、阴门癌、卵巢癌和输卵管癌）、胃肠道癌症（包括胃癌、小肠癌、结肠直肠癌、肝癌、肝胆癌和胰腺癌）、皮肤癌（包括黑素瘤、鳞状细胞癌和基底细胞癌）、乳癌（包括乳腺管癌和小叶癌）和儿科癌症（包括神经母细胞瘤、尤因肉瘤（Ewing's sarcoma）、威耳姆士瘤（Wilms tumor）、髓母细胞瘤）。

在一些实施例中，癌症是对放射疗法或化学疗法显示一定抗性的赘生物或肿瘤。对使用标准方法的放射疗法具有抗性的癌症包括（但不限于）肉瘤、肾细胞癌、黑素瘤、淋巴瘤、白血病、癌瘤、胚细胞瘤和生殖细胞肿瘤。

C.放射疗法

所披露的细胞渗透型抗DNA抗体可以与放射疗法组合使用。放射疗法（radiationtherapy/radiotherapy）是医学上使用电离放射作为癌症治疗的一部分以便控制恶性细胞。放射疗法也在非恶性病状中具有若干种应用，例如治疗三叉神经痛、重度甲状腺眼病、翼状胬肉、色素绒毛结节性滑膜炎、预防瘢痕瘤疤痕生长和预防异位骨化。在一些实施例中，抗DNA抗体用于提高非恶性病状的放射敏感性。

放射疗法通过损伤分裂细胞（癌细胞）的DNA来起作用。此DNA损伤是由两种类型的能量（光子或带电粒子）中的一种引起。此种损伤是直接或间接的。间接电离由于水电离而发生，形成自由基（主要是羟基自由基），其接着损伤DNA。举例来说，大部分由光子疗法引起的放射作用是通过自由基起作用。光子放射疗法的一个主要局限性是实体肿瘤细胞变得缺氧，并且低氧环境中的肿瘤细胞对放射损伤的抵抗性可能高达正常氧环境中的肿瘤细胞的2到3倍。

对癌细胞DNA的直接损伤是通过高LET（线性能量转移）带电粒子（例如质子、硼、碳或氖离子）发生。此损伤独立于肿瘤供氧，因为这些粒子主要通过直接能源转移（通常引起双链DNA断裂）起作用。由于质量相对较大，因此质子和其它带电粒子在组织中的侧向散射极小；光束不显著变宽，保持集中于肿瘤形状并且向周围组织递送小剂量副作用。光子放射疗法中使用的放射量是以戈瑞（Gray；Gy）为单位来测量，并且视所治疗的癌症的类型和阶段而变化。对于治愈情况，实体上皮瘤的典型剂量在60到80Gy范围内，而淋巴瘤用20到40Gy治疗。术后（辅助）剂量通常是约45-60Gy，按1.8-2Gy为一份进行投药（用于乳癌、头部和颈部癌症）。放射肿瘤学家在选择剂量时考虑许多其它因素，包括患者是否正接收化学疗法、患者共病、在手术前还是在手术后投予放射疗法和手术成功程度。

癌症对放射的反应由其放射敏感性描述。高放射敏感性癌细胞被中等剂量的放射快速杀死。这些细胞包括白血病、大部分淋巴瘤和生殖细胞肿瘤。大部分上皮癌仅具有中等放射敏感性并且需要显著更高剂量的放射（60-70Gy）以便实现根治。一些类型的癌症具有显著抗放射性，即需要与临床实践中的安全剂量相比显著更高的剂量以便实现根治。通常认为肾细胞癌和黑素瘤具有抗放射性。

肿瘤对放射疗法的反应还与其尺寸有关。由于复杂的原因，极大的肿瘤与较小肿瘤或微观疾病相比对放射的反应较小。已使用各种策略来克服此作用。最常用技术是在放射疗法之前进行外科切除术。此最常见于乳癌治疗中，其中在广泛局部切除或乳房切除术之后投予辅助放射疗法。另一种方法是在根治性放射疗法之前用新型新辅助化学疗法缩小肿瘤。第三种技术是通过在放射疗法过程期间提供某些药物来增强癌症的放射敏感性。所披露的细胞渗透型抗DNA抗体发挥此第三种功能。在这些实施例中，抗DNA抗体使细胞对放射疗法的敏感性提高（例如）至少10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%。此外，细胞渗透型抗DNA抗体可以与一种或多种其它放射增敏剂组合。已知的放射增敏剂的实例包括顺铂、吉西他滨、5-氟尿嘧啶、己酮可可碱、长春瑞滨、PARP抑制剂、组织蛋白脱乙酰基酶抑制剂和蛋白酶体抑制剂。

D.化学治疗剂

许多化学治疗剂（尤其抗肿瘤药）可以与抗体组合使用。大部分化学治疗药物可以划分成烷化剂、抗代谢剂、蒽环霉素、植物碱、拓扑异构酶抑制剂、单株抗体和其它抗肿瘤剂。

在优选实施例中，抗肿瘤药损伤DNA或干扰DNA修复，因为这些活性将最有效地与抗DNA抗体发生协同作用。在这些实施例中，抗体使细胞对化学疗法的敏感性提高（例如）至少10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%。损伤DNA或抑制DNA修复的抗肿瘤药的非限制性实例包括卡铂（carboplatin）、卡莫司汀（carmustine）、苯丁酸氮芥、顺铂、环磷酰胺、达卡巴嗪（dacarbazine）、道诺霉素（daunorubicin）、阿霉素、表柔比星（epirubicin）、艾达霉素（idarubicin）、异环磷酰胺（ifosfamide）、洛莫司汀（lomustine）、二氯甲基二乙胺、米托蒽醌（mitoxantrone）、奥克赛铂（oxaliplatin）、甲基苯甲肼、替莫唑胺（temozolomide）和戊柔比星（valrubicin）。在一些实施例中，抗肿瘤药是替莫唑胺，其是通常针对神经胶母细胞瘤使用的DNA损伤型烷化剂。在一些实施例中，抗肿瘤药是PARP抑制剂，其抑制DNA损伤的碱基切除修复中的步骤。在一些实施例中，抗肿瘤药是组织蛋白脱乙酰基酶抑制剂，其抑制转录水平的DNA修复并且破坏染色质结构。在一些实施例中，抗肿瘤药是蛋白酶体抑制剂，其通过破坏细胞中的泛素代谢来抑制DNA修复。泛素是调节DNA修复的信号传导分子。在一些实施例中，抗肿瘤药是激酶抑制剂，其通过改变DNA损伤反应信号传导途径来抑制DNA修复。

在其它实施例中，抗肿瘤药通过靶向癌细胞中的不同活性与抗DNA抗体互补。在这些实施例中，抗肿瘤药不抑制DNA修复或损伤DNA。

可与细胞渗透型抗DNA抗体组合的抗肿瘤药的实例包括（但不限于）烷化剂（例如替莫唑胺、顺铂、卡铂、奥克赛铂、二氯甲基二乙胺、环磷酰胺、苯丁酸氮芥、达卡巴嗪、洛莫司汀、卡莫司汀、甲基苯甲肼、苯丁酸氮芥和异环磷酰胺）、抗代谢剂（例如氟尿嘧啶、吉西他滨、甲氨蝶呤、胞嘧啶阿拉伯糖、氟达拉滨（fludarabine）和氟尿苷（floxuridine））、一些抗有丝分裂剂和长春花生物碱（例如长春新碱（vincristine）、长春碱（vinblastine）、长春瑞滨（vinorelbine）和长春地辛（vindesine））、蒽环霉素（包括阿霉素、道诺霉素、戊柔比星、艾达霉素和表柔比星）以及放线菌素（例如放线菌素D）、细胞毒性抗生素（包括丝裂霉素（mitomycin）、普卡霉素（plicamycin）和博来霉素（bleomycin））和拓扑异构酶抑制剂（包括喜树碱（camptothecin），例如伊立替康（irinotecan）和拓扑替康（topotecan），以及表鬼臼毒素衍生物，例如安吖啶（amsacrine）、依托泊苷（etoposide）、依托泊苷磷酸盐和替尼泊苷（teniposide））。

E.医药组合物

细胞渗透型抗DNA抗体可以与药学上可接受的载剂组合用于治疗用途。在一些实施例中，医药组合物是单位剂型，其含有于药学上可接受的赋形剂中的细胞渗透型抗DNA抗体或其片段，其中抗体是以有效抑制癌症或受感染细胞中的DNA修复的量存在。在优选实施例中，抗体是以约200mg/m²到约1000mg/m²，更优选地约200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900或1000mg/m²的量存在。在一些实施例中，单位剂型是用于静脉内注射的单位剂型。在一些实施例中，单位剂型是用于瘤内注射的单位剂型。

物质可以呈溶液、乳液或悬浮液（例如并入微粒、脂质体或细胞中）形式。通常，调配物中使用适量的药学上可接受的盐以使调配物等渗。药学上可接受的载剂的实例包括（但不限于）生理食盐水、林格氏溶液（Ringer's solution）和右旋糖溶液。溶液的pH值优选地是约5到约8，并且更优选地是约7到约7.5。医药组合物可以包括载剂、增稠剂、稀释剂、缓冲剂、防腐剂和表面活性剂。其它载剂包括持续释放制剂，例如含有抗体的固体疏水性聚合物的半渗透基质，所述基质是呈成形粒子形式，例如薄膜、脂质体或微粒。本领域的普通技术人员将明白视乎（例如）投药途径和所投予的组合物的浓度而定，某些载剂可能更优选。医药组合物还可以包括一种或多种活性成分，例如抗微生物剂、消炎剂和麻醉剂。

用于非经肠投药的制剂包括无菌水性或非水性溶液、悬浮液和乳液。非经肠媒剂包括氯化钠溶液、林格氏右旋糖（Ringer's dextrose）、右旋糖和氯化钠、乳酸林格氏溶液（lactated Ringer's）或不挥发性油。还可以存在防腐剂和其它添加剂，例如抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂和惰性气体。

为了帮助抗体溶解于水性环境中，可以添加表面活性剂作为湿润剂。表面活性剂可以包括阴离子洗涤剂，例如十二烷基硫酸钠、磺基丁二酸钠二辛酯和磺酸钠二辛酯。可以使用阳离子洗涤剂并且可以包括氯化苯甲烃铵或氯化苯乙铵。可以作为表面活性剂包括在调配物中的潜在非离子清洁剂的清单是聚桂醇400、聚乙二醇40硬脂酸酯、聚环氧乙烷氢化蓖麻油10、聚环氧乙烷氢化蓖麻油50和聚环氧乙烷氢化蓖麻油60、单硬脂酸甘油酯、聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯40、聚山梨醇酯60、聚山梨醇酯65和聚山梨醇酯80、蔗糖脂肪酸酯、甲基纤维素和羧甲基纤维素。这些表面活性剂可以单独或按不同比率的混合物形式存在于蛋白质或衍生物的调配物中。可能增强肽吸收的添加剂是（例如）油酸、亚麻油酸和次亚麻油酸的脂肪酸。

III.方法

A.治疗性投药

提供通过向受试者投予治疗有效量的细胞渗透型抗DNA抗体来治疗受试者的癌症或感染的方法。还提供通过向受试者投予含有细胞渗透型抗DNA抗体的医药组合物来提高受试者中细胞的放射敏感性或化学敏感性的方法。在一些实施例中，所述方法涉及首选选择诊断具有赘生物（例如癌症或肿瘤）或病原体（病毒）感染的个体。

视需要局部治疗还是全身治疗以及所治疗的区域而定，医药组合物可按多种方式投予。举例来说，可以静脉内、肌肉内、鞘内、腹膜内、皮下投予组合物。可以将组合物直接投予到肿瘤或组织中，例如立体定位。在一些实施例中，通过注射或通过手术植入导管将组合物投入脑或肝脏中。

视受试者物种、年龄、体重和一般条件、所治疗病症的严重性和投药模式而定，所需组合物的精确量将在受试者间不同。因此，不可能指定每一种组合物的精确量。但是，一般熟习此项技术者仅使用本文中的教示所提供的常规实验便可确定合适量。举例来说，可凭经验判定组合物的有效剂量和投药时程，并且作出所述判定在一般熟习此项技术者的技术范围内。组合物的投药剂量范围是大到足以损伤靶细胞中的DNA修复和/或使靶细胞对放射疗法和/或化学疗法敏感的量。剂量不应过大以免引起不良副作用，例如不良交叉反应、过敏反应等。通常，剂量将随患者年龄、状况和性别、投药途径、方案中是否包括其它药物以及所治疗的癌症的类型、阶段和位置而变。如果出现任何不良指征，那么剂量可以由个别医师调节。剂量可以变化，并且可以每天按一次或多次剂量投药来投予一天或若干天。可以在文献中发现关于既定种类的医药产品的合适剂量的指导。视上文提及的因素而定，单独使用的抗体的典型日剂量可以在每天每公斤体重约1μg直到每天每公斤体重100mg的范围或以上。在优选实施例中，抗体以约200mg/m²到约1000mg/m²，更优选地约200-900、300-800、400-700、500-600mg/m²的量存在。在一些实施例中，单位剂型是用于静脉内注射的单位剂型。在一些实施例中，单位剂型是用于经口投药的单位剂型。在一些实施例中，单位剂型是用于瘤内注射的单位剂型。

抗DNA抗体提高癌症的放射敏感性或化学敏感性。化学疗法和/或放射疗法的有效剂量可能对某些癌症具有毒性。在一些实施例中，抗DNA抗体降低治疗癌症所需的抗癌药物或放射水平的所需有效剂量，由此降低有效剂量的毒性。举例来说，阿霉素的最常用剂量是每21到28天静脉内40到60mg/m²，或每21天一次静脉内60到75mg/m²。如果患者的胆红素含量在1.2mg/dL与3mg/dL之间，那么剂量应降低50%。如果患者的胆红素含量在3.1mg/dL与5.0mg/dL之间，那么剂量应降低75%。当阿霉素总剂量达到450mg/m²时，可能发生严重的不可逆心肌毒性，其引起通常对心脏支撑疗法不起反应的充血性心脏衰竭。当与抗DNA抗体组合使用时，可以降低阿霉素剂量以便降低心肌毒性而不损失功效。

在其它实施例中，所披露的抗DNA抗体可以与正常剂量的药物或放射一起使用以便提高功效。举例来说，抗DNA抗体可以用于增强针对具有药物或放射抗性的癌症的药物或放射疗法的效力。对使用标准方法的放射疗法具有抗性的癌症包括肉瘤、淋巴瘤、白血病、癌瘤、胚细胞瘤和生殖细胞肿瘤。

B.筛选分析法

因为已证实抗DNA抗体抑制DNA修复并且提高癌细胞的放射敏感性和/或化学敏感性，因此还提供检测样品中的抗DNA抗体的方法。举例来说，样品可以是含有抗体的体液，例如来自患有或怀疑患有SLE的受试者的血液、血清或血浆。样品可以是组织或细胞样品，例如活组织检查切片。

在一些实施例中，所述方法可以用于监测患有SLE之受试者的诊断或预后。举例来说，细胞渗透型抗DNA抗体的检测可以提供将要发生SLE突然发作的患者的早期检测。

在一些实施例中，所述方法可以用于预测受试者对化学疗法或放射疗法的敏感性。在这些实施例中，样品中细胞渗透型抗DNA抗体的含量可以与对化学疗法或放射疗法的敏感性程度相对应。在优选实施例中，化学疗法是抑制DNA修复或引起DNA损伤的疗法。

所述方法可涉及使细胞与来自受试者的样品接触并且监测样品对细胞的作用。细胞优选地是已被证实通常具有抗放射性或抗化学疗法性但在用抗DNA抗体处理后变得放射敏感和/或化学敏感的细胞系，例如癌细胞系。在一些实施例中，对细胞进行照射，并且所述方法涉及评估样品对细胞放射敏感性的作用。在其他实施例中，使细胞与抗癌药接触，并且所述方法涉及评估样品对化学敏感性的影响。在其它实施例中，所述方法涉及监测样品对细胞死亡的直接影响。在所有这些实施例中，放射敏感性、化学敏感性或细胞死亡的增加表明样品含有抗DNA抗体。

在其它实施例中，所述方法涉及免疫分析法，例如设计用于检测抗DNA抗体的ELISA或流动式细胞测量术。在优选实施例中，所述方法是以细胞为基础以便检测细胞渗透。

参考以下非限制性实例将进一步理解本发明。

实例

实例1：细胞渗透型抗DNA抗体（3E10）在试管内增强细胞放射敏感性

材料和方法

细胞系：MCF-7、HeLa、U251和U87细胞系是从美国菌种保藏中心（AmericanType Culture Collection；ATCC）获得。获得PEO1和PEO1C4-2细胞（酒井W（SakaiW）等人，癌症研究69:6381（2009））。使细胞在补充有10%胎牛血清（FBS）的杜贝克改良伊格尔培养基（Dulbecco's Modification of Eagles Medium；DMEM；

）中在37℃和5%CO₂下生长并保持。

产生并纯化3E10和3E10scFv：根据韦斯巴特RH等人，免疫学杂志144:2653（1990）中所描述从融合瘤上清液纯化3E10。根据汉森JE等人，脑部研究1088:187（2006）中所描述在毕赤酵母中表达3E10scFv并且从上清液纯化。通过布莱德福分析法（Bradford assay）测定蛋白质浓度。

试管内细胞存活分析法：根据汉森JE等人，癌症研究67:1769（2007）；斯达切克GC（Stachelek GC）等人，癌症研究70:409（2010）中所描述进行克隆源性分析法和以碘化丙锭为基础的分析法。

细胞照射：根据制造商说明书使用X-RAD320生物学照射器（Precision X-Ray）用x射线按指定剂量照射在6或12孔板中生长的细胞。

表1呈现证实3E10scFv使MCF-7和HeLa细胞对IR敏感的数据。在存在含有对照缓冲液或3E10scFv的培养基的情况下照射MCF-7和Hela细胞，并且通过集落形成分析法来测定克隆源性存活。呈现每种处理与未受照射的对照细胞相比的存活分数±标准平均误差。3E10scFv的剂量是0.25μM（MCF-7）和1.0μM（HeLa细胞）。IR剂量是4Gy（MCF-7）和6Gy（HeLa细胞）。

结果

SLE是一种自体免疫疾病，其特征是对宿主DNA具有反应性的自身抗体（抗细胞核抗体；ANA）的异常产生。这些抗体中极少数可以渗透到细胞中，但几乎均具有细胞毒性并且不适于临床使用（阿拉贡-西格瓦（Alarcon-Segovia），D，狼疮（Lupus）10:315（2001））。但是，发现从SLE的小鼠模型分离的一种罕见的细胞渗透型抗DNA抗体3E10对培养物中的细胞或活体内对小鼠无毒性，并且甚至证实其在评估3E10在用于治疗SLE的疫苗中的潜在用途的I期人类临床试验中是安全的（斯佩尔蒂尼F（Spertini F）等人，风湿病学杂志26:2602（1999）；韦斯巴特RH等人，免疫学杂志144:2653（1990）；扎克DJ等人，免疫学杂志157:2082（1996））。3E10并未进一步继续作为疫苗，而是改为作为分子运载工具加以研究（汉森JE等人，脑部研究1088:187（2006）；汉森JE等人，生物化学杂志（J Biol Chem）282:20790（2007））。

除良性毒性概况之外，3E10的细胞渗透机制也与其它细胞渗透型ANA不同。与所有其它细胞渗透型ANA不同，3E10的细胞渗透与其Fc或恒定域无关；实际上，3E10单链可变片段（3E10scFv）可以单独通过由平衡核苷转运体（其普遍存在于人类细胞上）介导的机制渗透细胞并且定位于细胞核中（汉森JE等人，生物化学杂志282:20790（2007）；里斯S（Lisi S）等人，临床和试验医学（Clin Exp Med）11:1（2011））。

已在试管内和活体内证实完全3E10抗体和3E10scFv均能够将货物蛋白（例如p53和Hsp70）递送到细胞中（汉森JE等人，脑部研究1088:187（2006）；汉森JE等人，癌症研究67:1769（2007）；詹X等人，中风学41:538（2010））。意图使用3E10将具有已知放射敏化作用的连接分子转运到癌细胞中以便增强肿瘤对放射疗法的反应。但是，在初始实验中，发现3E10可以独自增强细胞放射敏感性。此展示于表1和图1B中。表1呈现证实3E10scFv使MCF-7和HeLa细胞对IR敏感的数据。在存在含有对照缓冲液或3E10scFv的培养基的情况下照射MCF-7和Hela细胞，并且通过集落形成分析法来测定克隆源性存活。呈现每一种治疗与未受照射的对照细胞相比的存活分数+标准平均误差。3E10scFv的剂量是0.25μM（MCF-7）和1.0μM（HeLa细胞）。IR剂量是4Gy（MCF-7）和6Gy（HeLa细胞）。

图1B展示克隆源性存活分析法，其测量3E10scFv对用电离放射（IR）处理的U251人神经胶质瘤细胞的存活的影响。使U251细胞与含有3E10scFv或对照缓冲液的生长培养基一起培育1小时，接着用0或4Gy IR照射细胞并且通过集落形成评估克隆源性。与早先研究一致，单独3E10scFv对未受照射的U251细胞无毒性。但是，发现在存在3E10scFv时照射的U251细胞对IR更敏感。3E10scFv还在低至0.25μM的剂量下提高MCF-7人乳癌细胞和HeLa人子宫颈癌细胞的放射敏感性（表1）。以前并未描述细胞渗透型抗DNA抗体的放射敏化作用。

实例2：细胞渗透型抗DNA抗体（3E10）在试管内增强DNA损伤型化学疗法

材料和方法

因为放射靶向DNA，因此测试3E10对癌细胞对DNA损伤型化学疗法的反应的影响。具体地说，比较3E10对细胞对阿霉素和太平洋紫杉醇（癌症疗法中常用的两种药剂）的敏感性的影响。阿霉素是蒽环霉素抗生素，其嵌入DNA中并且诱导链断裂（特威KM（Tewey KM）等人，科学（Science）226:466（1984）），而太平洋紫杉醇干扰微管功能（乔丹MA（Jordan MA）等人，美国国家科学院院刊（Proc Natl AcadSci USA）90:9552（1993））但不直接损伤DNA。

预计3E10scFv将使细胞对阿霉素而非太平洋紫杉醇敏感。在存在对照缓冲液或10μM3E10scFv下用递增剂量的阿霉素（0-250nM）或太平洋紫杉醇（0-25nM）处理U87人神经胶质瘤，接着在处理后一周通过碘化丙锭荧光测定细胞杀死百分比。

结果

如所预测，3E10scFv显著增强细胞对阿霉素而非太平洋紫杉醇的敏感性（图1C和1D）。3E10scFv使癌细胞对IR和阿霉素但非太平洋紫杉醇敏感的能力表明抗体选择性增强DNA损伤疗法的细胞杀死作用。

实例3：细胞渗透型抗DNA抗体（3E30）抑制DNA修复

在确定3E10scFv使细胞对DNA损伤剂敏感后，研究这一作用的潜在机制。IR和阿霉素均诱导DNA链断裂，因此假设3E10scFv可能对DNA修复（尤其DNA链断裂修复）具有作用。作为第一步骤，检验3E10的DNA结合性质。通过将经放射性标记的DNA受质（根据许X（Xu X）等人，欧洲分子生物学学会杂志（EMBO J）28:568（2009）所描述制备）与递增浓度的3E10（0-1μM）一起培育，接着进行电泳迁移率变动分析来测定3E10对若干种不同DNA受质（包括单链DNA、钝端双螺旋DNA、具有由异体构造引起的内部鼓泡的双螺旋DNA、具有八字形单链末端的双螺旋DNA、具有5'单链尾端的双螺旋DNA和具有3'尾端的双螺旋DNA）的结合亲和力（图2A）。

材料和方法

DNA结合研究：根据许X等人，欧洲分子生物学学会杂志28:3005（2009）所描述制备经放射性标记的DNA受质（单链DNA、钝端双螺旋DNA、具有由异体构造引起的内部鼓泡的双螺旋DNA、具有八字形单链末端的双螺旋DNA、具有5'单链尾端的双螺旋DNA和具有3'尾端的双螺旋DNA）。各受质在4℃与3E10（0-10μM）一起培育30分钟，接着根据许X等人，欧洲分子生物学学会杂志28:3005（2009）所描述进行电泳迁移率变动分析。使用ImageJ（国立卫生研究院）将结合的寡核苷酸百分比对3E10浓度作曲线来计算Kd。

DNA修复分析法：分别根据斯达切克GC等人，癌症研究70:409（2010）和德雷E（Dray E）等人，美国国家科学院院刊108:3560（2011）所描述进行单链断裂/碱基切除修复（BER）和RAD51介导的链交换分析法。

显微术：根据早先描述进行免疫组织化学和γH2AX免疫荧光分析法（汉森JE等人，生物化学杂志282:20790（2007）；斯达切克GC等人，癌症研究70:409（2010））。

结果

所观测到的单链、八字形臂和5'/3'尾端受质的结合曲线相对于双螺旋和鼓泡受质的结合曲线的左移表明3E10以更大的亲和力与具有自由单链尾端的受质结合（图2C-2H）。组合结果并且作曲线以便直接比较存在或不存在自由单链尾端时3E10与受质的结合。总体来说，3E10以0.2μM的Kd结合于具有自由单链尾端的受质并且以0.4μM的Kd结合于不具有自由单链尾端的受质（图2B）。这些结果表明在细胞渗透和细胞核局部化后，3E10可优先结合于由具有单链尾端的双螺旋DNA组成的DNA修复或复制中间物。

接着检验3E10对特定DNA修复途径的影响，从试管内单链断裂/碱基切除修复（BER）分析法（斯达切克GC等人，癌症研究70:409（2010））开始。在BER中，通过糖基化酶切除受损碱基，接着通过核酸内切酶使磷酸二酯主结构裂解以便产生具有单链断裂的受质（产物n）。DNA聚合酶β的dRP解离酶活性去除dRP基团，并且其聚合酶活性插入失去的核苷酸并且恢复正确碱基配对（产物n+1）。接着通过连接酶接合残余链断裂以便恢复磷酸二酯主结构的完整性，引起n+1产物转化成具有双螺旋构造的全长产物。因此可以通过追踪n和n+1物质随时间推移的含量（相对于总受质和产物DNA的百分比进行定量）来测定BER效率。为测量3E10对BER的影响，测试在存在对照缓冲液、对照抗微管蛋白抗体或3E10时经放射性标记的DNA受质（与尿嘧啶DNA糖基化酶、AP核酸内切酶、DNA聚合酶β和连接酶一起培育）中的U:G失配的修复。与对照缓冲液相比，3E10显著延缓n+1物质转化成最终接合产物，表明3E10损害单链断裂修复途径中的接合步骤（图2I）。与对照缓冲液相比，抗微管蛋白抗体对BER无作用。

为了进一步探测3E10对DNA修复的影响，测试3E10对同源依赖性修复（HDR）（DNA双链断裂（DSB）修复的关键途径，包括IR诱导的DSB和与停滞的复制叉有关的DSB）的影响（阿诺多C（Arnaudeau C）等人，分子生物学杂志（J Mol Biol）307:1235（2001）；李X等人，细胞研究18:99（2008））。HDR依赖于RAD51重组酶，其结合单链DNA以便形成核丝，所述核丝介导链侵入（strand invasion）（桑P（Sung）等人，科学265:1241（1994）；桑P等人，生物化学杂志278:42729（2003）；桑P等人，细胞学（Cell）82:453（1995））。因为3E10优先结合自由单链尾端，因此假设抗体可损害RAD51介导的链侵入和交换。此假设在试管内链交换分析法（德雷E等人，美国国家科学院院刊108:3560（2011））中测试，其示意图展示于图3A中。经纯化的人RAD51（hRAD51）与未经标记的150bp单链DNA受质一起培育5分钟以允许形成能够进行链侵入的hRAD51-单链DNA核蛋白。接着向反应物中添加3E10（0-35μM）或对照性抗His₆IgG抗体并且培育5分钟。接着，添加具有一个放射性标记链的呈钝端双螺旋构造的40bp DNA受质并且使其在存在或不存在抗体的情况下与hRAD51-单链DNA核蛋白丝一起培育30分钟（示意图展示于图3A中）。接着通过电泳观察链交换程度并且进行定量。3E10通过剂量依赖性方式抑制链交换（图3B），而对照性抗His₆IgG抗体对链交换无影响。3E10还能够抑制RAD51变异体hRAD51K133R（ATP水解存在缺陷）介导的链交换并且因此与野生型RAD51相比是更有效的链交换介体（迟P（Chi P）等人，DNA修复（DNA Repair）（Amst）5:381（2006））（图3C）。这些数据证明3E10通过抑制RAD51介导的链交换来抑制HDR。

因为发现3E10在试管内抑制HDR，因此假设在用3E10处理的细胞中DNA损伤型疗法诱导的DNA DSB修复将被延迟。为测试此假设，用对照缓冲液或3E10scFv（10μM）处理U251神经胶质瘤细胞并且用2Gy IR照射。二十四小时后，通过免疫荧光法观察磷酸化组织蛋白组分γH2AX的聚集点来对每个细胞中的存留DNADSB的数目进行定量。与在对照缓冲液中照射的细胞中具有6.8±1个γH2AX聚集点相比，在存在3E10scFv时照射的细胞在第24小时时每个细胞中平均具有10.5±1个γH2AX聚集点（p<0.01）。这些数据证明用3E10scFv处理的细胞中DNA DSB的解析延迟，与证明3E10抑制DNA修复的试管内结果一致。

实例4：细胞渗透型抗DNA抗体（3E10）对DNA修复不足的癌细胞具有合成致死性

材料和方法

具有由BRCA2突变引起的HDR不足（穆娜ME（Moynahan ME）等人，分子细胞学（Mol Cell）7:263（2001））的癌细胞极易于通过抑制单链断裂修复来杀死（布莱恩特HE（Bryant HE）等人，自然（Nature）434:913（2005）；冯Z（Feng Z）等人，美国国家科学院院刊108:686（2011）；凯林（Kaelin）、Jr.WG等人，自然综述癌症（Nat Rev Cancer）5:689（2005））。所述抑制可以通过用聚(ADP-核糖)聚合酶1（PARP-1）抑制剂或DNA聚合酶β抑制剂处理来实现（一种称为合成致死性的现象）（斯达切克GC等人，癌症研究70:409（2010）；布莱恩特HE等人，自然434:913（2005）；凯林，Jr.WG等人，自然综述癌症5:689（2005）；法默H（Farmer H）等人，自然434:917（2005））。此外，已经证实BRCA2不足型细胞对HDR的进一步抑制敏感，例如通过敲除BRCA2不足型癌细胞中的RAD52的合成致死作用证实（冯Z等人，美国国家科学院院刊108:686（2011））。根据3E10抑制单链断裂修复和HDR的观测结果，假设3E10将对BRCA2不足型癌细胞具有合成致死性。为测试此假设，评估用3E10scFv或完全3E10抗体进行的治疗对配对的BRCA2-不足型（PEO1）和BRCA2健全型（PEO1C4-2）人卵巢癌细胞的影响（酒井W等人，癌症研究69:6381（2009））。还测试3E10scFv对BRCA2健全型PEO4人卵巢癌细胞和BRCA2不足型CAPAN1/neo人胰腺癌细胞的影响。

结果

3E10scFv处理降低BRCA2不足型PEO1细胞的克隆源性存活（p=0.03），但不会不利地影响BRCA2健全型PEO1C4-2细胞的存活（图4A-4B）。在细胞活性分析法中，3E10scFv也对BRCA2不足型PEO1细胞有毒性，但对BRCA2健全型PEO4细胞无毒（图4C）。单独3E10scFv也仅对BRCA2不足型人胰腺癌细胞（CAPAN1/neo）有毒性（图4D）。完全3E10抗体也类似地通过剂量依赖性方式选择性地对BRCA2不足型PEO1细胞具有毒性（图4E）。这些数据提供细胞渗透型抗DNA抗体对DNA修复不足的癌细胞的合成致死作用的首要证据并且证明3E10作为具有DNA修复不足的恶性肿瘤的靶向癌症疗法的潜在效用。重要的是，3E10对BRCA2不足型癌细胞的合成致死作用与上述机械性实验一致，表明3E10影响DNA链断裂修复。

此外，已经证实缺氧癌细胞具有降低的同源性=定向修复能力（宾德拉（Bindra）等人，分子细胞生物学（Mol.Cell.Biol.）2409:8504-8518（2004）），因此预期3E10和类似的抗体对缺氧癌细胞具有合成致死性。

实例5：细胞渗透型抗DNA抗体3E10显著地并且选择性地使DNA修复不足型癌细胞对DNA损伤型疗法敏感

材料和方法

为了测定3E10在加上DNA损伤剂时是否对BRCA2不足型癌细胞具有甚至更大的影响，用对照缓冲液、10μM3E10、3nM阿霉素或10μM3E10+3nM阿霉素处理BRCA2不足型PEO1和BRCA2健全型PEO1C4-2卵巢癌细胞。接着在处理后三天通过碘化丙锭荧光评估细胞死亡百分比。选择低剂量阿霉素（3nM）以便最小化单独阿霉素对细胞的作用，并且决定在处理后3天测量细胞死亡百分比以便最小化单独3E10对BRCA2不足型细胞的合成致死性的混杂作用（其在处理后七天变得明显）。

结果

正如所料，单独的低剂量阿霉素对BRCA2健全型或BRCA2不足型细胞无显著毒性。向阿霉素中添加3E10对BRCA2健全型细胞具有最小的影响。但是，3E10与阿霉素的组合对BRCA2不足型细胞具有高细胞毒性（65%±7细胞死亡，p<0.001）（图4F-4G）。

实例6：3E10在活体内增强DNA损伤型化学疗法

接着测定3E10对肿瘤细胞对DNA损伤型疗法的敏感性的影响在活体内在小鼠肿瘤模型中是否保留。

材料和方法

因为预期完全3E10抗体与可变片段相比在循环中的半衰期长，因此使用完全3E10抗体进行活体内研究。通过皮下注射在SCID小鼠中产生U87神经胶质瘤肿瘤。当肿瘤形成并且处于一致生长期时，通过腹膜内注射对照缓冲液、单独3E10抗体（0.8mg于0.5mL PBS中，10μM）、单独阿霉素（80μg/kg）或3E10与阿霉素来处理小鼠。各处理组包含4只小鼠。接着注射后三天，通过测量肿瘤生长来评估处理的影响。此肿瘤测量时间点的选择是以试管内研究为基础，所述研究证明可以在处理后3天检测抗体对癌细胞对阿霉素的敏感性的影响。由于在肿瘤体积达到400mm³（其在对照组中快速实现）时处死动物的预定制度要求，在3天后无法获得其它肿瘤测量值。

结果

用对照缓冲液处理的小鼠中的肿瘤体积增加54%±23。用单独3E10或阿霉素处理不会显著影响肿瘤生长，其中肿瘤体积分别增加48%±13和61%±10。相比之下，用3E10与阿霉素的组合处理的小鼠中的肿瘤生长显著降低，其中肿瘤尺寸仅增加9%±7（p=0.004，其中通过用阿霉素+3E10对比单独阿霉素处理的小鼠中绝对肿瘤体积的比较来计算p）。这些数据证明3E10在活体内使肿瘤对阿霉素敏感（图5）。

实例7：细胞渗透型抗DNA抗体（3E10）在活体内使人神经胶质瘤异种移植物对电离放射敏感

材料和方法

通过将U87细胞皮下注射到裸鼠的侧腹中来产生人神经胶质瘤异种移植物。处理组是：对照组（n=8）；抗体组（n=8）；8Gy（电离放射）（n=8）和8Gy+抗体（n=7；在麻醉时损失一只动物）。在植入后二十五天，肿瘤在小鼠中生长达到约100mm³的平均尺寸。在第26天，通过腹膜内注射对照缓冲液（PBS；“对照”和“8Gy”组）或3E10（1mg于PBS中；“抗体”和“8Gy+抗体”组）来处理小鼠。接着每组在24小时后接受相同试剂的第二次注射。在第二次注射后2小时，用8Gy照射“8Gy”和“8Gy+抗体”组中的肿瘤。接着跟踪每组中的肿瘤体积并且在肿瘤体积达到1000mm³时处死小鼠。肿瘤生长测量值与肿瘤植入后天数的关系展示于图6A中。

结果

与单独对照缓冲液（实心菱形）相比，单独3E10（空心菱形）对肿瘤生长无显著影响。但是，3E10和8Gy（空心三角形）与单独8Gy（实心三角形）相比在更大程度上抑制肿瘤生长。

在图6B中，呈现各组中无疾病进展存活率的卡普兰-麦尔曲线。无疾病进展存活率定义为肿瘤尺寸与基线尺寸相比未增加达到三倍或超过三倍的存活率。基线尺寸定义为在抗体处理前一天的肿瘤尺寸，其表示为图A中的第25天和图B中的第0天。用8Gy处理的肿瘤中的肿瘤增至三倍的时间（肿瘤体积增加达到基线的三倍所需的时间）是9.5±0.5天，相比之下，用8Gy+3E10处理的肿瘤的肿瘤增至三倍的时间是13.7±1.8天（p=0.04）。但是，与单独对照缓冲液相比，单独3E10对U87肿瘤无影响，其中对照肿瘤的肿瘤增至三倍的时间是6.8±0.7天，而用单独3E10处理的肿瘤的肿瘤增至三倍的时间是6.5±0.3天（p=0.67）。这些数据证明3E10在活体内使人神经胶质瘤异种移植物对电离放射敏感。误差条表示平均值的标准误差。

Claims

1.一种抑制赘生细胞或暴露于病毒的细胞或受感染细胞中DNA修复的方法，其包含使所述细胞与包含细胞渗透型抗DNA抗体的医药组合物接触，所述细胞渗透型抗DNA抗体增强DNA损伤或干扰DNA代谢。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述赘生细胞是从由以下各项所构成的族群中选出的癌细胞：肉瘤、淋巴瘤、白血病、癌瘤和腺癌、胚细胞瘤、生殖细胞肿瘤、神经胶质瘤、神经内分泌肿瘤、黑素瘤、横纹肌样瘤、胚胎性瘤、神经外胚层肿瘤、类癌瘤、颅咽管瘤、组织细胞瘤、髓上皮瘤、间皮瘤、多发性骨髓瘤、慢性骨髓增生性疾病、原始神经外胚层肿瘤、唾液腺肿瘤、胸腺瘤、胸腺癌瘤、甲状腺癌和威耳姆士瘤。

3.根据权利要求1所述的方法，其中所述细胞具有抗放射性。

4.根据权利要求1所述的方法，其中所述细胞对化学疗法具有抗性。

5.根据权利要求1所述的方法，其中所述细胞具有固有性存在缺陷的或不足的DNA修复。

6.根据权利要求1所述的方法，其中所述细胞暴露于具有或引起DNA修复缺陷或不足的病毒或受到所述病毒感染，或所述病毒依赖于宿主DNA修复途径进行感染、整合或复制。

7.根据权利要求6所述的方法，其中所述细胞暴露于慢病毒或受慢病毒感染。

8.根据权利要求1所述的方法，其中所述细胞具有从由以下各项所构成的族群中选出的DNA修复基因的一种或多种突变或异常表达：XRCC1、ADPRT（PARP-1）、ADPRTL2（PARP-2）、聚合酶β、CTPS、MLH1、MSH2、FANCD2、PMS2、p53、p21、PTEN、RPA、RPA1、RPA2、RPA3、XPD、ERCC1、XPF、MMS19、RAD51、RAD51b.、RAD51C、RAD51D、DMC1、XRCCR、XRCC3、BRCA1、BRCA2、PALB2、RAD52、RAD54、RAD50、MRE11、NB51、WRN、BLM、KU70、KU80、ATM、ATRCHK1、CHK2、FANCA、FANCB、FANCC、FANCD1、FANCD2、FANCE、FANCF、FANCG、FANCC、FANCD1、FANCD2、FANCE、FANCF、FANCG、RAD1和RAD9。

9.根据权利要求1所述的方法，其中所述细胞具有存在缺陷的肿瘤抑制基因，例如BRCA1或BRCA2。

10.根据权利要求1所述的方法，其中所述细胞是缺氧肿瘤的一部分。

11.根据权利要求1所述的方法，其中所述抗体是与放射增敏剂组合投予。

12.根据权利要求11所述的方法，其中所述放射增敏剂是从由以下各项所构成的族群中选出：顺铂（cisplatin）、阿霉素（doxorubicin）、吉西他滨（gemcitabine）、5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil）、PARP1抑制剂、组织蛋白脱乙酰基酶抑制剂、蛋白酶体抑制剂、表皮生长因子受体（EGFR）抑制剂、胰岛素样生长因子-1（IGF-1）受体抑制剂、CHK1抑制剂、mTOR抑制剂、激酶抑制剂、己酮可可碱（pentoxifylline）和长春瑞滨（vinorelbine）。

13.根据权利要求1所述的方法，其进一步包含用放射疗法治疗受试者，其中所述细胞渗透型抗DNA抗体提高所述细胞对放射疗法的敏感性。

14.根据权利要求1所述的方法，其进一步包含用损伤DNA或抑制DNA修复的抗肿瘤药治疗所述细胞，其中所述细胞渗透型抗DNA抗体提高所述细胞对所述抗肿瘤药的敏感性。

15.根据权利要求1所述的方法，其中所述赘生细胞是位于受试者中，其进一步包含用治疗性单株抗体治疗所述受试者。

16.根据权利要求1所述的方法，其中所述细胞渗透型抗DNA抗体是来源于患有自体免疫疾病的受试者或动物。

17.根据权利要求16所述的方法，其中所述自体免疫疾病是全身性红斑狼疮或其动物模型。

18.根据权利要求1所述的方法，其中所述细胞渗透型抗DNA抗体包含单株抗体3E10、其细胞渗透片段、保守性变异体或人类化形式。

19.根据权利要求18所述的方法，其中所述细胞渗透型抗DNA抗体包含3E10的单链可变片段（3E10scFv）。

20.根据权利要求1所述的方法，其中所述细胞渗透型抗DNA抗体是在不借助于载剂或结合物的情况下被转运到所述细胞的细胞核中。

21.一种剂量单元，其包含于药学上可接受的赋形剂中的细胞渗透型抗DNA抗体或其片段，其中所述抗体是以有效抑制具有或不具有固有的DNA修复不足的癌症或受病毒感染细胞中的DNA修复的量存在。

22.根据权利要求21所述的剂量单元，其进一步包含抗肿瘤药或放射增敏剂。

23.根据权利要求22所述的剂量单元，其中所述抗肿瘤剂是从由以下各项所构成的族群中选出：顺铂、环磷酰胺（Cytoxan）、阿霉素、甲氨蝶呤（methotrexate）、丝裂霉素C（mitomycin c）、氮芥（nitrogen mustard）、羟基脲、替拉扎明（tirapazamine）、替莫唑胺（temozolomide）、喜树碱（camptothecin）、PARP抑制剂、卡铂（carboplatin）、表柔比星（epirubicin）、核糖核苷酸还原酶抑制剂、异环磷酰胺（ifosphamide）、西妥昔单抗（cetuximab）、利妥昔单抗（rituximab）、舒尼替尼（sunitinib）、链脲霉素（streptozocin）、索拉非尼（sorafenib）、放线菌素D（actinomycin D）、甲基苯甲肼（procarbazine）、DTIC、8-MOP、培美曲塞（pemetrexed）、依维莫司（everolimus）、长春新碱（vincristine）、长春碱（vinblastine）、博来霉素（bleomycin）、达卡巴嗪（dacarbazine）、依托泊苷（etoposide）、格立得（Gliadel）、烷化剂、核苷或核苷酸类似物以及它们的组合。

24.根据权利要求22所述的剂量单元，其中所述放射增敏剂是从由以下各项所构成的族群中选出：顺铂、阿霉素、吉西他滨、5-氟尿嘧啶、PARP1抑制剂、组织蛋白脱乙酰基酶抑制剂、蛋白酶体抑制剂、表皮生长因子受体（EGFR）抑制剂、胰岛素样生长因子-1（IGF-1）受体抑制剂、CHK1抑制剂、mTOR抑制剂、己酮可可碱、长春瑞滨、迷索硝唑（misonidazole）、丝裂霉素C、烷化剂、核苷类似物和核苷酸类似物。

25.一种人或人类化单株细胞渗透型抗DNA抗体，其抑制DNA修复，所述细胞渗透型抗DNA抗体是在不借助于载剂或结合物的情况下被转运到所述细胞的细胞核中，且所述抗体并非为由ATCC寄存编号PTA2439融合瘤产生的单株抗体3E10。

26.根据权利要求25所述的抗体，其与由ATCC寄存编号PTA2439融合瘤产生的单株抗体3E10具有相同或不同抗原决定基特异性。

27.根据权利要求26所述的抗体，其包含具有单株抗体3E10的抗体结合部位的重组型抗体。

28.根据权利要求25所述的抗体，其是由使用从患有自体免疫疾病的人类受试者或从自体免疫疾病的动物模型分离的淋巴细胞制备的融合瘤产生。

29.根据权利要求26至28中任一项所述的抗体，其中所述抗体是单链抗体或其片段。

30.根据权利要求26至28中任一项所述的抗体，其中所述抗体是双特异性单株抗体，其特异性结合第二标靶。

31.根据权利要求30所述的抗体，其中所述抗体特异性结合从由DNA修复蛋白、DNA复制蛋白和DNA损伤反应蛋白所构成的族群中选出的蛋白质。

32.根据权利要求31所述的抗体，其中所述抗体特异性结合热休克蛋白（HSP）、Myc蛋白或Raf/Ras蛋白。

33.一种测定受试者对DNA损伤疗法的敏感性的方法，其包含分析来自所述受试者的样品中的细胞渗透型抗DNA抗体含量，其中所述样品与对照物相比细胞渗透型抗DNA抗体增加表明所述受试者对所述DNA损伤疗法敏感。