JP2022505041A - Ｄｎａアルキル化剤及びａｔｒ阻害剤を使用する併用療法 - Google Patents

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Abstract

本発明は、ＤＮＡアルキル化ＡＤＣ及びＡＴＲ阻害剤の相乗的組合せに関する。【選択図】なし

Description

本発明は、抗体分子に付着されており、従って抗体薬物コンジュゲートを形成するＡＴＲ阻害剤及びＤＮＡアルキル化剤を使用した、がんを治療するための併用療法に関する。
世界的ながんの負担は依然として高く、毎年１０００万～２０００万人ががんと診断されており、がん関連死は毎年１０００万人にものぼるため、学術界及び産業界は、がんと闘うためのなお一層洗練された療法の開発を探し求めている。
デュオカルマイシンは、非常に強力な抗腫瘍薬物候補のクラスである。デュオカルマイシンの合成アナログとしては、アドゼレシン、ビゼレシン、及びカルゼレシンが挙げられる。シクロプロピルピロロインドールファミリーのメンバーとしてのこうした治験薬は、がん治療の臨床試験へと進んでいる。ｉｎ ｖｉｖｏで評価されたデュオカルマイシンファミリーの最初のメンバーは、ＣＣ－１０６５であり、中程度の抗腫瘍活性を示すものの、肝毒性のためその有効性が制限されていた。現時点では、デュオカルマイシンファミリーのいずれのメンバーも、臨床開発は報告されていない。
デュオカルマイシンに基づく療法薬の治療指数を向上させるための取り組みにおいて、ＢＭＳ－９３６５６１（抗ＣＤ７０）及びＳＹＤ９８５（抗ＨＥＲ２）を含む幾つかのＡＤＣが開発されている。ＢＭＳ－９３６５６１は、進行明細胞癌及びＢ細胞非ホジキンリンパ腫を有する患者において最初に分析された。しかしながら、８ｍｐｋまでの用量で耐容性であったにも関わらず、臨床治験は第Ｉ相中に中止された。より最近では、Ｓｙｎｔｈｏｎは、ａｄｏ－トラスツズマブエムタンシンの代替として、切断可能なリンカーを用いてトラスツズマブにコンジュゲートされたｓｅｃｏ－ＤＵＢＡとして知られているデュオカルマイシンプロドラッグを使用したＳＹＤ９８５（トラスツズマブデュオカルマイシン）を生成した。ＳＹＤ９８５は、現在第ＩＩＩ相臨床試験中である。
幾つかの試みにも関わらず、デュオカルマイシンファミリーのメンバーに基づく薬物は、デュオカルマイシン自体に基づくものもであっても、デュオカルマイシン担持ＡＤＣとしてであっても、ヒト療法がまだ承認されていない。
当技術分野には、有効性並びに安全性の両面におけるがん療法の向上に対する、高度に満たされていない必要性が依然として存在する。特に単独療法はほとんどの場合で治癒性でないため、ＡＤＣの併用療法の確立は、有効性を増加させ、副作用を軽減し、耐性発現を遅延させるための戦略を提起することができる。
ＤＮＡ損傷修復を阻害する幾つかのＡＴＲｉ（毛細血管拡張性運動失調症及びＲＡＤ３関連タンパク質阻害剤）は、現在、臨床開発中である。これはまだ承認されていない。
本発明に結び付く研究作業中に、本発明者らは、驚くべきことに、デュオカルマイシン担持ＡＤＣとＡＴＲ阻害剤との組合せが、組合せ有効性だけでなく、高度に相乗的な効果も示すことを見出した。
本発明者らは、ＤＮＡ損傷応答阻害剤（ＤＤＲｉ）の組合せが、デュオカルマイシン担持ＡＤＣに基づくがん療法を向上させるための追加の戦略を提起し得ると仮定した。幾つかの異なるＤＤＲｉを選択し、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏモデルにおいて試験した。ＨＣＣ－１９５４がん細胞及びＭＤＡ－ＭＢ－４６８がん細胞を、選択されたＤＤＲｉと、デュオカルマイシン単独又は抗体に付着させたデュオカルマイシンとの組合せで処置し、併用処置の抗増殖効果を、単剤単独の効果と比較した。
「ネイキッド」デュオカルマイシン並びにデュオカルマイシン担持ＡＤＣを、当技術分野で公知の幾つかのＤＤＲｉと組み合わせた。そのようなＤＤＲｉの作用様式は、例えば、Ｒａｄ５１発現の減少、ＣＨＫ１阻害、ＷＥＥ１キナーゼ阻害、Ｏ６－アルキルグアニン－ＤＮＡアルキルトランスフェラーゼ阻害、ＤＮ－ＰＫ阻害 Ｐａｒｐ阻害 ＭＴＨ１阻害、ＡＴＲ阻害、ＣＨＫ１阻害、ＮＥＫ１阻害、ＴＯＰ２阻害、及びＨｅｒ２阻害等、多岐にわたる。
本発明に結び付く実験では、驚くべきことに、キナーゼＡＴＲの阻害剤、及び複製ストレスに対する応答に中心的な役割を果たすその主要な下流エフェクターチェックポイントキナーゼ１（ＣＨＫ１）に対する阻害剤のみが、高度に相乗的な様式でデュオカルマイシン担持ＡＤＣの細胞傷害効果を増強したことが示された。
幾つかのデュオカルマイシンに基づくＡＤＣは、様々なＡＴＲ阻害剤と組み合わせると、ｉｎ ｖｉｔｒｏ並びにｉｎ ｖｉｖｏで強力な相乗効果を示した。ＨＥＲ２発現ＮＣＩ－Ｎ８７腫瘍を有するｒａｇ２マウスを、ＨＥＲ２標的指向性デュオカルマイシン－ＡＤＣ及び２つの異なるＡＴＲ阻害剤で処置した。ＡＴＲ阻害剤の単独処置は、非常に軽度の腫瘍成長阻害しか示さず、最大有効用量未満の濃度のＡＤＣによる処置は、部分的な腫瘍応答に結び付いた。しかしながら、併用処置は、非常に強力な抗腫瘍効果をもたらしつつ、耐容性も良好だった。本研究は、抗ＨＥＲ２－デュオカルマイシンＡＤＣを使用した腫瘍へのデュオカルマイシンの標的化送達とＡＴＲ阻害剤の全身適用との組合せは、単剤としての薬物による治療よりも優れていることを実証する。
デュオカルマイシンそれ自体は毒性が高いため、ヒトがん療法の有望な候補ではないと考えられるため、デュオカルマイシン担持ＡＤＣとＡＴＲｉとの組合せは、非常に有望である。そのため、そのような組合せを臨床設定にて評価する試みを正当化することができる。
本発明により治療される具体的なタイプのがんとしては、これらに限定されないが、卵巣、腹膜、卵管、肺、頭頸部、結腸、神経内分泌系、尿路上皮、前立腺、食道、膀胱、胃、間葉、乳房、膵臓、及びそれらの組織学的サブタイプのがんが挙げられる。一部の実施形態では、がんは、小細胞肺がん（ＳＣＬＣ）、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、頭頸部扁平上皮癌（ＳＣＣＨＮ）、結腸直腸がん（ＣＲＣ）、原発性神経内分泌腫瘍及び肉腫、又は卵巣がん、原発性腹膜がん、及び卵管がんから選択されるＰＡＲＰｉ耐性再発がんから選択される。
一部の態様では、ＡＴＲ阻害剤は、以下の式：
Figure 2022505041000001
 の１つにより表されるか、又はその薬学的に許容される塩である。
更なる実施形態では、ＤＮＡアルキル化剤を担持するＡＤＣ及びＡＴＲ阻害剤は、放射線療法（ＲＴ）、更なる化学療法（ＣＴ）、又は化学放射線療法（ＣＲＴ）と組み合わせて使用される。
更なる態様では、本開示は、ＤＮＡアルキル化剤を担持するＡＤＣとＡＴＲ阻害剤との組合せを宣伝するための方法であって、標的対象集団（ａｕｄｉｅｎｃｅ）に対して、がんを有する対象を治療するための本組合せの使用を促す（ｐｒｏｍｏｔｉｎｇ）ことを含む方法を提供する。
本明細書では、ＤＮＡアルキル化剤を担持するＡＤＣ、ＡＴＲ阻害剤、及び少なくとも薬学的に許容される賦形剤又はアジュバントを含む医薬組成物も提供される。
更なる態様では、本発明は、ＤＮＡアルキル化剤を担持するＡＤＣ、及びＤＮＡアルキル化剤を担持するＡＤＣをＡＴＲ阻害剤と組み合わせて使用して、対象のがんを治療するか又は進行を遅延させるための説明書を含む添付文書を含むキットに関する。また、ＡＴＲ阻害剤、及びＡＴＲ阻害剤をＤＮＡアルキル化剤を担持するＡＤＣと組み合わせて使用して、対象のがんを治療又は進行を遅延させるための説明書を含む添付文書を含むキットが提供される。
前段落のキットは、放射線療法、追加の化学療法、又は放射線化学療法の説明書を更に示してもよい。
Ａ）抗体のＬＣは、Ｃ末端がモチーフ（Ｇ4Ｓ）3ＬＰＥＴＧＳにより伸長されていること、Ｂ）抗体のＬＣは、Ｃ末端がモチーフＬＰＥＴＧＳにより伸長されていること、Ｃ）一方の鎖にｓｃＦｖ及び他方の鎖にＦａｂを保持するＳＥＥＤ抗体であって、Ｆａｂは、Ｃ末端がＬＰＥＴＧＳ配列により伸長されているＳＥＥＤ抗体、Ｄ）合計で４つのＳｒｔＡ部位を保持する抗体であって、（Ｇ4Ｓ）3ＬＰＥＴＧＳ ＳｒｔＡ認識モチーフがＬＣのＣ末端に融合されており、ＬＰＥＴＧＳ配列がＨＣのＣ末端に融合されている抗体、Ｅ）天然ｍＡｂを示す図である。 相乗作用スコアを決定するための用量マトリックスアッセイの実験設定のスキームを示す図である。左から右へと濃度を増加させたＤＵＢＡの系列希釈物、及び上から下へのＤＤＲｉの系列希釈物を、単独で又は組み合わせて細胞に添加する。細胞は、処置に対して強力に（暗色）又は弱く（明色）応答する。３つの場合を考慮しなければならない：１）相加性：化合物は相互作用せず、得られる細胞応答は、単剤の応答を超えない。２）拮抗作用：組合せの効果は、単剤の効果よりも弱い。３）併用処置に対する応答は、単剤の効果よりも強力である。 相乗作用スクリーニングの結果を示す図である。ＨＣＣ－１９５４細胞及びＭＤＡ－ＭＢ－４６８細胞に対して、デュオカルマイシン変異体ＤＵＢＡをＤＤＲｉと組み合わせ、その組合せ効果を相乗作用スコアとして報告した。相乗作用スコアのカットオフを±１と画定した。この範囲では、組合せのＳは相加的であると想定され、Ｓ＞１は相乗作用を示し、Ｓ＜１は拮抗作用を示す。独立実験の個々のデータポイント並びにバーとしての生物学的複製物の平均が図示されている。 ＡＴＲ又は非標的指向性ｓｉＲＮＡで処置した細胞に対するＤＤＭ及びＤＵＢＡの効力を示す図である。個々のデータポイント及び黒色バーとしてのＩＣ50値の平均が表示されている。 ＡＴＲｉの化学構造を示す。 ＡＤＣ形式で研究したデュオカルマイシン変異体ＤＵＢＡ（１０）、ＤＤＭ（３８）、及びＤＳＡ（１３）の化学構造を示す図である。薬物は、ｓｅｃｏ形態で表示されている。 ＨＥＲ２提示細胞株に対する、異なるリンカー－薬物を保持するαＨＥＲ２－デュオカルマイシンＡＤＣ αＨＥＲ２－１、αＨＥＲ２－２、及びαＨＥＲ２－３、カドサイラ、並びにａＨＥＬ－１の選択性指数を示す図である。選択性指数は、ＨＥＲ２陰性細胞株ＭＤＡ－ＭＢ－４６８に対する個々の分子のＩＣ50値を、表記のＨＥＲ２陽性細胞株に対するその分子のＩＣ50値で除算することにより算出した。バーは、各ＡＤＣの選択性指数の平均を表す。 ＥＧＦＲ過剰発現細胞株に対する抗ＥＧＦＲ αＥＧＦＲ－１及びαＥＧＦＲ－７ ＡＤＣの選択性指数を示す図である。選択性は、ＥＧＦＲ陰性細胞株ＭＣＦ７に対する個々の分子のＩＣ50値を、表記のＥＧＦＲ陽性細胞株に対するＩＣ50値で除算することにより算出した。様々なＥＧＦＲ陽性細胞株の選択性は、灰色の色調で示されている。バーは、ある特定のＡＤＣで処置した細胞株に対する選択性指数の平均を表す。 ＡＺＤ６７３８と組み合わせたデュオカルマイシンに基づくＡＤＣ及び小分子の、ＨＣＣ－１９５４に対する相乗作用スコアを示す図である。個々のデータポイント並びにバーで表されている個々のポイントの平均が表示されている。 ＮＣＩ－Ｎ８７細胞又はＭＤＡ－ＭＢ－４５３細胞に対する、デュオカルマイシン担持ＡＤＣ αＨＥＲ２－２及びαＨＥＲ２－６と様々なＡＴＲｉとの組合せの相乗作用スコアを示す図である。対照としての小分子ＤＵＢＡ及びゲムシタビン、並びに陰性対照としてのカドサイラが含まれていた。バーは、独立した生物学的複製物の平均を表す。 ＨＴ２９細胞における相乗作用スコアと細胞ＣＨＫ１リン酸化阻害との相関性を示す図である。ＣＨＫ１リン酸化阻害に関してＡＴＲｉがより強力であるほど、相乗作用スコアがより高くなる。この相関性は、ＨＣＣ－１９５４細胞では、小分子薬物ＤＵＢＡと幾つかのＡＴＲｉとの組合せで示された。この相関性は、ＨＣＣ－１９５４では、ＡＤＣ αＨＥＲ２－２と組み合わせた同じＡＴＲｉで再現された。ＡＴＲｉのサブセットを、ＭＤＡ－ＭＢ－４５３細胞及びＮＣＩ－Ｎ８７細胞に対して、αＨＥＲ２－２及び別のＤＵＢＡに基づくＡＤＣ αＨＥＲ２－６と組み合わせた。 ＥＧＦＲ陽性細胞株及びＥＧＦＲ陰性細胞株ＭＣＦ７に対する、セツキシマブ－デュオカルマイシンＡＤＣとＡＴＲｉ ＡＺＤ６７３８との組合せの相乗作用スコアを示す図である。対照として、セツキシマブ－ＭＭＡＥを、ＡＴＲｉ ＡＺＤ６７３８と組み合わせた。個々のデータポイント並びに実験の平均が表示されている ３工程プロセスとしての、用量低減指数を決定するためのＭＮＥＤ曲線シフトアッセイを示す図である。１）ＡＤＣ αＨＥＲ２－１の細胞傷害性を、細胞生存率実験で確認した。２）ＡＴＲｉ １の阻害剤効力を滴定して、ＭＮＥＤを特定した。３）ＭＮＥＤ曲線シフトアッセイは、ＡＤＣ αＨＥＲ２－１を系列希釈することにより実施する。αＨＥＲ２－１の系列希釈物を、単独で又は以前に決定されたＭＮＥＤのＡＴＲｉ １と共に、ＨＣＣ－１９５４細胞に添加した。これは、効力低下へと向かうＡＤＣの左方向シフトに結び付いた。ＭＮＥＤでの阻害剤を、品質管理として細胞に添加して、細胞生存率に対する効果がないことを示した。 ＨＥＲ２陽性細胞株のパネル及びＨＥＲ２陰性細胞株ＭＤＡ－ＭＢ－４６８に対する、αＨＥＲ２－１とＡＺＤ６７３８又はＶＥ－８２２との組合せの用量低減指数を示す図である。ＡＴＲｉは、それらの個々のＭＮＥＤで組合せ群に投与した（表１１）。 ＨＣＣ－１９５４細胞に対する、ＡＤＣ αＨＥＲ２－１と、ＡＴＲｉ ＡＺＤ６７３８、ＶＥ－８２２、ＡＴＲｉ １、及びＢＡＹ７３の組合せを示す図である。ＡＴＲｉは、表１１にまとめられている通りのそれらの個々のＭＮＥＤで併用処置群に投与する。Ａ）単剤群及び組合せ群のＩＣ50値は、個々のデータポイントとして図示されている。黒色バーは、各群のＩＣ50値の平均を示す。Ｂ）ＡＴＲｉと組み合わせたαＨＥＲ２－１のＤＲＩがプロットされている。ＤＲＩは、Ａ）に示されているＩＣ50値から算出した。 一定濃度のＡＴＲｉ ＡＺＤ６７３８及びＶＥ－８２２と組み合わせた場合の、αＨＥＲ２－１、αＨＥＲ２－２、αＨＥＲ２－３、及びカドサイラのＤＲＩの比較を示す図である。ＤＲＩは、表１２及び表１３のＩＣ50値を使用して算出した。ＡＴＲｉをＭＮＥＤでＡＤＣに追加した（表１１）。 ＡＴＲｉと組み合わせたデュオカルマイシン担持ＡＤＣのＤＲＩを示す図である。Ａ）ＡＴＲｉと、デュオカルマイシン担持ＡＤＣ αＨＥＲ２－１、αＨＥＲ２－２、及びαＨＥＲ２－３、並びにカドサイラとの組合せのＤＲＩを、細胞株とは無関係に概括した。個々のデータポイントが表示されており、平均は黒色バーで示されている。こうしたデータは既に提示されている。Ｂ）デュオカルマイシン担持ＡＤＣと組み合わせたＡＴＲｉのＤＲＩ。結果は、どのＡＤＣ変異体を使用したかには関わらず概括されている。個々のデータポイントが表示されており、平均は黒色バーで示されている。 強化効果の用量依存性を示す図である。ＭＤＡ－ＭＢ－４６８細胞を、ＡＤＣ αＨＥＲ２－１、及び漸増用量のＶＥ－８２２（左）又はＡＺＤ６７３８（右）で処置した。個々のデータポイントが表示されており、平均は黒色バーで示されている。 単独療法、及びＡＺＤ６３７８又はＶＥ－８２２のいずれかとそれぞれのＭＮＥＤで組み合わせたαＨＥＲ２－１の併用療法の選択性指数の比較を示す図である。ＡＤＣのみで処置された細胞の選択性指数を、数式２に従って算出した。 ＧＰ陽性細胞ＭＤＡ－ＭＢ－４６８及びＷＩＳＨに対する、単剤としての、又は一定用量のＡＴＲｉ ＡＺＤ６７３８及びＶＥ－８２２と組み合わせた場合のαＧＰ－１の効力を示す図である。阻害剤を、ＭＮＥＤで細胞に投与した。生物学的複製物実験の個々のＩＣ50値が表示されている。 ＮＣＩ－Ｎ８７異種移植片を保持するＨ２ｄ Ｒａｇ２マウスにおける、ＡＴＲ阻害剤ＡＺＤ６７３８及びＡＴＲｉ １と組み合わせたαＨＥＲ２－６の療法有効性を示す図である。Ａ）抗腫瘍活性を、ビヒクル、並びに単剤αＨＥＲ２－６、ＡＺＤ６７３８、及びＡＴＲｉ １と比較した腫瘍容積の変化として評価した。従って、マウス（１群当たりＮ＝１０）を、１．０ｍｇ ｋｇ-1のαＨＥＲ２－６を静脈内投与することにより、５０ｍｇ ｋｇ-1のＡＺＤ６７３８若しくはＡＴＲｉ １を２週間にわたって１日１回経口投与することにより、又はαＨＥＲ２－６＋ＡＺＤ６７３８若しくはαＨＥＲ２－６＋ＡＴＲｉ １の組合せにより、矢印で示されている０日目から開始して単剤と同じ用量及びスケジュールで処置した。上部の点線は腫瘍容積が７３％増加したことを示し、下部の点線は、０日目と比較して腫瘍容積が６６％減少したことを示す。点線の間の範囲は腫瘍停滞を示し、下部の線より下は腫瘍退縮を示す。Ｂ）個々の動物のレベルにおける、組合せ群αＨＥＲ２－６＋ＡＺＤ６７３８又はαＨＥＲ２－６＋ＡＴＲｉ １の腫瘍容積。αＨＥＲ２－６＋ＡＺＤ６７３８による処置は、１／１０の治癒に結び付き、αＨＥＲ２－６＋ＡＴＲｉ １による処置は、２／１０の治癒に結び付いた。 ＮＣＩ－Ｎ８７異種移植片を保持するＨ２ｄ Ｒａｇ２マウスにおける、ＡＴＲ阻害剤ＡＺＤ６７３８及びＡＴＲｉ １と組み合わせたαＨＥＲ２－６の療法耐容性を示す図である。体重を、併用処置、並びに対応する単剤αＨＥＲ２－６、ＡＺＤ６７３８、及びＡＴＲｉ １の耐容性の尺度として評価した。 ＡＤＣ形式に適用したデュオカルマイシン誘導体の化学構造を示す図である。ＤＣ１（１９）、ＤＣ４（２０）、ＤＣ４４（２１）、ＤＵ－２５７（２２）、副溝結合体（２３）、ｓｅｃｏ－ＤＵＢＡ（１０）、ＤＳＡ（１３）、ＣＢＩ－ＴＭＩ（２４）、及びこの分子の誘導体（２６）の構造が図示されている。点線の四角は、リンカーの付着点を示す。
定義
「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、状況が明白に別様であると指示しない限り、複数の参照物を含む。従って、例えば、抗体への言及は、１つ若しくは複数の抗体又は少なくとも１つの抗体を指す。従って、「ａ」（又は「ａｎ」）、「１つ又は複数」、及び「少なくとも１つ」という用語は、本明細書では同義的に使用される。
「約」は、数値で規定されるパラメーター（例えば、本明細書に記載の併用療法による化合物の用量又は治療時間の長さ）を修飾するために使用される場合、そのパラメーターについて明記されている数値よりも最大で１０％だけ上下に変動し得ることを意味する。例えば、約１０ｍｇ／ｋｇの用量は、９ｍｇ／ｋｇと１１ｍｇ／ｋｇとの間で変動してもよい。
抗体－薬物コンジュゲート又はＡＤＣは、当技術分野で周知である。薬物を抗体に連結するためには、幾つかの技法が存在する。そうした技法は、例えば、Ｂｅｃｋら、Ｎａｔｕｒｅ ｒｅｖｉｅｗｓ、１６巻、２０１７年５月に概説されている。
ＡＤＣ又は免疫コンジュゲートとしても知られている抗体－薬物コンジュゲートは、強力な細胞傷害性薬物を抗原発現腫瘍細胞へと標的化することにより抗体及び細胞傷害性薬物の両方の特性を組み合わせて、それによりそれらの抗腫瘍活性を増強させる標的化学療法分子である。所与の標的抗原に対する抗体－薬物コンジュゲートの開発が成功するか否かは、抗体選択の最適化、リンカー安定性、細胞傷害性薬物の効力、及び抗体とのリンカー－薬物コンジュゲーションの機序に依存する。より具体的には、選択的抗体－薬物コンジュゲートは、以下の少なくとも１つ又は複数により特徴付けられる：
（ｉ）抗体－薬物コンジュゲートの形成方法では、抗体が標的抗原に対する十分な特異性を保ち、薬物有効性が維持されること；（ｉｉ）抗体－薬物コンジュゲートは、血中での薬物放出及びそれに伴う非標的化細胞への損傷を制限するのに十分な程度に安定であること；（ｉｉｉ）細胞膜輸送効率（エンドサイトーシス）が、療法用の細胞内抗体－薬物コンジュゲート濃度を達成するのに十分な程度であること；（ｉｖ）抗体－薬物コンジュゲートからの細胞内薬物放出が、療法用薬物濃度を達成するのに十分な程度であること；及び（ｖ）薬物細胞傷害性が、ナノモルの量又はナノモル未満の量であること。
抗体－薬物コンジュゲートは、薬物部分の腫瘍への標的化送達、及び一部の実施形態では腫瘍における細胞内蓄積を可能にし、非コンジュゲート薬物の全身投与は、正常細胞に対して許容できないレベルの毒性をもたらす可能性がある（Ｐｏｌａｋｉｓ Ｐ．（２００５年）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ５巻：３８２～３８７頁）。
抗体－薬物コンジュゲートは、強力な細胞傷害性薬物を抗原発現腫瘍細胞へと標的化し（Ｔｅｉｃｈｅｒ，Ｂ．Ａ．（２００９年）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔｓ ９巻：９８２～１００４頁）、それにより有効性を最大化し、オフターゲット毒性を最小化して治療指数を増強する（Ｃａｒｔｅｒ，Ｐ．Ｊ．及びＳｅｎｔｅｒ Ｐ．Ｄ．（２００８年）Ｔｈｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｊｏｕｒ．１４巻（３号）：１５４～１６９頁；Ｃｈａｒｉ，ＲＶ．（２００８年）Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．４１巻：９８～１０７頁）、抗体及び細胞傷害性薬物の両方の特性を組み合わせた標的化学療法分子である。
本発明のＡＤＣは、腫瘍関連抗原又は細胞表面受容体を標的とし、一部の実施形態では、以下のタンパク質（１）～（８７）からなる群から選択される。
（１）ＢＭＰＲ１Ｂ（骨形成タンパク質受容体１Ｂ型、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＮＭ＿００１２０３）
（２）Ｅ１６（ＬＡＴ１、ＳＬＣ７Ａ５、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＮＭ＿００３４８６）
（３）ＳＴＥＡＰ１（前立腺６回膜貫通上皮抗原、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＮＭ＿Ｏｌ２４４９）
（４）０７７２Ｐ（ＣＡ１２５、ＭＵＣ１６、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＡＦ３６１４８６）
（５）ＭＰＦ（ＭＰＦ、ＭＳＬＮ、ＳＭＲ、巨核球増強因子、メソテリン、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＮＭ＿００５８２３）
（６）Ｎａｐｉ２ｂ（Ｎａｐｉ３ｂ、ＮＡＰＩ－３Ｂ、ＮＰＴＩＩｂ、ＳＬＣ３４Ａ２、溶質輸送体ファミリー３４（リン酸ナトリウム）、メンバー２、ＩＩ型ナトリウム依存性リン酸トランスポーター３ｂ、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＮＭ＿００６４２４）
（７）Ｓｅｒｎａ Ｓｂ（ＦＬＪ１０３７２、ＫＩＡＡ１４４Ｓ、Ｍｍ．４２０１Ｓ、ＳＥＭＡＳＢ、ＳＥＭＡＧ、セマフォリンＳｂ Ｈｌｏｇ、ｓｅｍａドメイン、７回トロンボスポンジンリピート（Ｉ型及びＩ型様）、膜貫通５ドメイン（ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ５ ｄｏｍａｉｎ）（ＴＭ）及び短い細胞質ドメイン、（セマフォリン）ＳＢ、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＡＢ０４０８７８）
（８）ＰＳＣＡ ｈｌｇ（２７０００ＳＯＣ１２Ｒｉｋ、ＣＳ３０００８０１６Ｒｉｋ、ＲＩＫＥＮ ｃＤＮＡ ２７０００ＳＯＣ１２、ＲＩＫＥＮ ｃＤＮＡ ２７０００ＳＯＣ１２遺伝子、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＡＹ３Ｓ８６２８）；
（９）ＥＴＢＲ（エンドセリンＢ型受容体、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＡＹ２７Ｓ４６３）；
（１０）ＭＳＧ７８３（ＲＮＦ１２４、仮想タンパク質ＦＬＪ２０３１５、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＮＭ＿Ｏｌ７７６３）；
（１１）ＳＴＥＡＰ２（ＨＧＮＣ＿８６３９、ＩＰＣＡ－１、ＰＣＡＮＡＰ１、ＳＴＡＭＰ１、ＳＴＥＡＰ２、ＳＴＭＰ、前立腺がん関連遺伝子１、前立腺がん関連タンパク質１、前立腺６回膜貫通上皮抗原２、６回膜貫通前立腺タンパク質、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＡＦ４５５１３８）
（１２）ＴｒｐＭ４（ＢＲ２２４５０、ＦＬＪ２００４１、ＴＲＰＭ４、ＴＲＰＭ４Ｂ、一過性受容体電位カチオンチャネル、サブファミリーＭ、メンバー４、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＮＭ＿０１７６３６）
（１３）ＣＲＩＰＴＯ（ＣＲ、ＣＲ１、ＣＲＧＦ、ＣＲＩＰＴＯ、ＴＤＧＦ１、奇形腫由来成長因子、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＮＰ００３２０３又はＮＭ＿００３２１２）
（１４）ＣＤ２１（ＣＲ２（補体受容体２）又はＣ３ＤＲ（Ｃ３ｄ／エプスタインバーウイルス受容体）又はＨｓ．７３７９２ Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号Ｍ２６００４）
（１５）ＣＤ７９ｂ（ＣＤ７９Ｂ、ＣＤ７９～、ＩＧｂ（免疫グロブリン関連ベータ）、Ｂ２９、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＮＭ＿０００６２６又は１１０３８６７４）
（１６）ＦｃＲＨ２（ＩＦＧＰ４、ＩＲＴＡ４、ＳＰＡＰ１Ａ（ＳＨ２ドメイン含有ホスファターゼアンカータンパク質１ａ）、ＳＰＡＰ１Ｂ、ＳＰＡＰ１Ｃ、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＮＭ＿０３０７６４、ＡＹ３５８１３０）
（１７）ＨＥＲ２（ＥｒｂＢ２、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号Ｍｌ １７３０）
（１８）ＮＣＡ（ＣＥＡＣＡＭ６、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号Ｍｌ８７２８）；
（１９）ＭＤＰ（ＤＰＥＰ１、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＢＣ０１７０２３）
（２０）ＩＬ２０Ｒａ（ＩＬ２０Ｒａ、ＺＣＹＴＯＲ７、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＡＦ１８４９７１）；
（２１）ブレビカン（ＢＣＡＮ、ＢＥＨＡＢ、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＡＦ２２９０５３）
（２２）ＥｐｈＢ２Ｒ（ＤＲＴ、ＥＲＫ、Ｈｅｋ５、ＥＰＨＴ３、Ｔｙｒｏ５、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＮＭ＿００４４４２）
（２３）ＡＳＬＧ６５９（Ｂ７ｈ、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＡＸ０９２３２８）
（２４）ＰＳＣＡ（前立腺幹細胞抗原前駆体、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＡＪ２９７４３６）
（２５）ＧＥＤＡ（Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＡＹ２６０７６３）；
（２６）ＢＡＦＦ－Ｒ（Ｂ細胞活性化因子受容体、ＢＬｙＳ受容体３、ＢＲ３、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＡＦ１１６４５６）；ＢＡＦＦ受容体／ｐｉｄ＝ＮＰ４４３１７７．１－
（２７）ＣＤ２２（Ｂ細胞受容体ＣＤ２２－Ｂアイソフォーム、ＢＬ－ＣＡＭ、Ｌｙｂ－８、Ｌｙｂ８、ＳＩＧＬＥＣ－２、ＦＬＪ２２８１４、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＡＫ０２６４６７）；
（２８）ＣＤ７９ａ（ＣＤ７９Ａ、ＣＤ７９ａ、免疫グロブリン関連アルファ、Ｉｇベータ（ＣＤ７９Ｂ）と共有結合的に相互作用し、表面でＩｇＭ分子と複合体を形成し、Ｂ細胞分化に関与するシグナルを伝達するＢ細胞特異的タンパク質）、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＮＰ＿００１７７４．１０
（２９）ＣＸＣＲ５（バーキットリンパ腫受容体１、ＣＸＣＬ１３ケモカインにより活性化されるＧタンパク質共役型受容体は、リンパ球遊走及び体液性防御において機能し、ＨＩＶ－２感染並びにおそらくはＡＩＤＳ、リンパ腫、骨髄腫、及び白血病の発症に役割を果たす）；３７２ａａ、ｐＩ：８．５４ ＭＷ：４１９５９ ＴＭ：７［Ｐ］遺伝子染色体：ｌ ｌｑ２３．３、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＮＰ＿００１７０７．ｌ）
（３０）ＨＬＡ－ＤＯＢ（ペプチドに結合し、それらをＣＤ４＋Ｔリンパ球に提示するＭＨＣクラスＩＩ分子（Ｉａ抗原）のベータサブユニット）；２７３ａａ、ｐＩ：６．５６ ＭＷ：３０８２０ ＴＭ：１［Ｐ］遺伝子染色体：６ｐ２１．３、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＮＰ ００２１１１．１）
（３１）Ｐ２Ｘ５（Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＮＰ ００２５５２．２）
（３２）ＣＤ７２（Ｂ細胞分化抗原ＣＤ７２、Ｌｙｂ－２）Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＮＰ ００１７７３．１）
（３３）ＬＹ６４（ロイシンリッチリピート（ＬＲＲ）ファミリーのＩ型膜タンパク質であるリンパ球抗原６４（ＲＰ１０５）は、Ｂ細胞の活性化及びアポトーシスを調節し、機能喪失は、全身性エリテマトーデス患者における疾患活性の増加と関連付けられる）；６６１ａａ、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＮＰ ００５５７３．１）
（３４）ＦｃＲＨ１（Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＮＰ＿４４３１７０．１）
（３５）ＦＣＲＨ５ Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号 ヒト：ＡＦ３４３６６２、ＡＦ３４３６６３、ＡＦ３４３６６４、ＡＦ３４３６６５、ＡＦ３６９７９４、ＡＦ３９７４５３、ＡＫ．０９０４２３、ＡＫ．０９０４７５、ＡＬ８３４１８７、ＡＹ３５８０８５；マウス：ＡＫ．０８９７５６、ＡＹ１５８０９０、ＡＹ５０６５５８；ＮＰ １１２５７１．１
（３６）ＴＥＮＢ２（ＴＭＥＦＦ２、トモレグリン（ｔｏｍｏｒｅｇｕｌｉｎ）、ＴＰＥＦ、ＨＰＰ１、ＴＲ、推定膜貫通プロテオグリカン、成長因子及びフォリスタチンのＥＧＦ／ヘレグリンファミリーに関連する）、ＮＣＢＩ受入：ＡＡＤ５５７７６、ＡＡＦ９１３９７、ＡＡＧ４９４５１、ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ ０５７２７６；ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ：２３６７１；ＯＭＩＭ：６０５７３４；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ Ｑ９ＵＩＫ５；Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＡＦｌ ７９２７４；ＡＹ３５８９０７、ＣＡＦ８５７２３、ＣＱ７８２４３６
（３７）ＰＭＥＬ１７（銀ホモログ；ＳＩＬ Ｖ；Ｄｌ２Ｓ５３Ｅ；ＰＭＥＬ１７；ＳＩ；ＳＩＬ）；ＭＥ２０；ｇｐ１００）ＢＣ００１４１４；ＢＴ００７２０２；Ｍ３２２９５；Ｍ７７３４８；ＮＭ＿００６９２８；
（３８）ＴＭＥＦＦｌ；Ｈ７３６５；Ｃ９ｏｒｆ２；Ｃ９０ＲＦ２；Ｕｌ９８７８；Ｘ８３９６１；ＮＭ＿０８０６５５；ＮＭ＿００３６９２；
（３９）ＧＤＮＦ－Ｒａｌ（ＧＤＮＦファミリー受容体アルファｌ；ＧＦＲＡｌ；ＧＤＮＦＲ；ＧＤＮＦＲＡ；ＲＥＴＬｌ；ＴＲＮＲｌ；ＲＥＴｌＬ；ＧＤＮＦＲ－アルファｌ；ＧＦＲ－ＡＬＰＨＡ－１）；Ｕ９５８４７；ＢＣ０１４９６２；ＮＭ＿ｌ４５７９３、ＮＭ＿００５２６４；
（４０）Ｌｙ６Ｅ（リンパ球抗原６複合体、遺伝子座Ｅ、Ｌｙ６７、ＲＩＧ－Ｅ、ＳＣＡ－２、ＴＳＡ－１）；１５ ＮＰ ００２３３７．１；ＮＭ＿００２３４６．２；
（４１）ＴＭＥＭ４６（シサホルノログ（ｓｈｉｓａ ｈｏｒｎｏｌｏｇ）２（アフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ ｌａｅｖｉｓ））；ＳＨＩＳＡ２）；ＮＰ ００１００７５３９．１；ＮＭ＿００１００７５３８；
（４２）Ｌｙ６Ｇ６Ｄ（リンパ球抗原６複合体、遺伝子座Ｇ６Ｄ；Ｌｙ６－Ｄ、ＭＥＧＴｌ）；ＮＰ ０６７０７９．２；ＮＭ＿０２１２４６．２；
（４３）ＬＧＲ５ ＮＰ ００３６５８．１；ＮＭ＿００３６６７．２；
（４４）ＲＥＴ（ｒｅｔプロトオンコジーン；ＭＥＮ２Ａ；ＨＳＣＲ１；ＭＥＮ２Ｂ；ＭＴＣｌ；ＰＴＣ；ＣＤＨＦ１２；Ｈｓ．１６８１１４；ＲＥＴ５ ｌ；ＲＥＴ－ＥＬＥｌ）；ＮＰ＿０６６１２４．１；ＮＭ＿０２０９７５．４；
（４５）ＬＹ６Ｋ（リンパ球抗原６複合体、遺伝子座Ｋ；ＬＹ６Ｋ；ＨＳＪ００１３４８；ＦＬＪ３５２２６）；ＮＰ＿０５９９９７．３；ＮＭ＿Ｏｌ７５２７．３；
（４６）ＧＰＲ１９（Ｇタンパク質共役型受容体１９；Ｍｍ．４７８７）；ＮＰ ００６１３４．１；ＮＭ＿００６１４３．２；
（４７）ＧＰＲ５４（ＫＩＳＳ１受容体；ＫＩＳＳ１Ｒ；ＧＰＲ５４；ＨＯＴ７Ｔ１７５；ＡＸＯＲ１２）；ＮＰ １１５９４０．２；１０ ＮＭ＿０３２５５１．４；
（４８）ＡＳＰＨＤｌ（アスパラギン酸ベータヒドロキシラーゼドメイン含有１；ＬＯＣ２５３９８２）；ＮＰ ８５９０６９．２；ＮＭ＿ｌ８１７１８．３；
（４９）チロシナーゼ（ＴＹＲ；ＯＣＡＩＡ；ＯＣＡｌＡ；チロシナーゼ；ＳＨＥＰ３）；ＮＰ ０００３６３．１；ＮＭ＿０００３７２．４；
（５０）ＴＭＥＭ１１８（リングフィンガータンパク質、膜貫通２；ＲＮＦＴ２；ＦＬＪ１４６２７）；
ＮＰ Ｉｓｈｉｋａｗａ，Ｎ．ら（２００７年）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６７巻（２４号）：１１６０１～１１６１１頁；ｄｅ Ｎｏｏｉｊ－ｖａｎ Ｄａｌｅｎ，Ａ．Ｇ．ら、１；ＮＭ＿００１１０９９０３．１；
（５１）ＧＰＲ１７２Ａ（Ｇタンパク質共役型受容体１７２Ａ；ＧＰＣＲ４１；ＦＬＪ１１８５６；Ｄｌ５Ｅｒｔｄ７４７ｅ）；ＮＰ ０７８８０７．１；ＮＭ＿０２４５３１．３
（５２）ＣＤ３３
（５３）ＣＬＬ－１（ＣＬＥＣ１２Ａ、ＭＩＣＬ、及びＤＣＡＬ２）、
（５４）ＣＥＡＣＡＭ－５
（５５）ＭＵＣ－１
（５６）ＥＧＦＲ
（５７）ｃ－Ｍｅｔ
（５８）ａｖｂ６
（５９）ＲＯＲ１
（６０）葉酸Ｒ１
（６１）ＨＥＲ２
（６２）５Ｔ４
（６３）Ｔｒｏｐ－２
（６４）ｇｐＮＭＢ
（６５）ＣａｎＡｇ
（６６）カドヘリン－３
（６７）カドヘリン－６
（６８）ＣＤ４４ｖ６
（６９）ＣＤ１３８
（７０）ＣＤ１７４
（７１）ＥｐＣＡＭ
（７２）ｃＫｉｔ
（７３）ＥｐｈＡ２
（７４）ＥｐｈＡ４
（７５）ＦＧＦＲ２
（７６）ＦＧＦＲ３
（７７）ＧＣＣ
（７８）ＩＧＦＲ１
（７９）メソテリン
（８０）ＮａＰｉ２Ｂ
（８１）ＰＳＭＡ
（８２）ＴＩＭ１
（８３）ＰＴＫ７
（８４）ＴＦ（組織因子）
（８５）ＩＬ１３ＲＡ２
（８６）ＧＲＰ７８
（８７）ガンマＧＴ
一実施形態では、本発明のＡＤＣは、ＤＮＡアルキル化剤としてデュオカルマイシンを保持することができる。本発明で使用可能なデュオカルマイシンの例は、表４及び表５並びに図２３に示されている。ＡＤＣに使用されている更なるクラスのＤＮＡアルキル化剤は、インドリノベンゾジアゼピンである。例えば、Ｍｉｌｌｅｒら、Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ、８月１日、２０１６年（１５巻）（８号）１８７０～１８７８頁。
本発明で使用可能な更なるデュオカルマイシンは、ＢＭＳ－９３６５６１及びＳＹＤ９８５との関連で記載されている。
ＳＹＤ９８５におけるデュオカルマイシンは、ｓｅｃｏ－ＤＵＢＡである（図６、（１０）を参照）。
一部の実施形態では、本発明で使用可能な非デュオカルマイシンＤＮＡアルキル化剤は、以下の式（ｘ）：
Figure 2022505041000002
 のもの、又はその薬学的に許容される塩である。ＮとＣとの間の二重線＝は、単結合又は二重結合のいずれかを表し、但しそれが二重結合の場合、Ｘは存在せず、Ｙは水素であり、それが単結合の場合、Ｘは水素であり、Ｙは－ＳＯ３Ｈである。「Ａ」という用語は、下記で規定される通りの抗体又は抗原結合性断片である。
患者に薬物を「投与すること」又は患者に対する薬物の「投与」（及びこの語句の文法的等価物）は、医療専門家による患者への投与であってもよく若しくは自己投与であってもよい直接投与、及び／又は薬物を処方する行為であってもよい間接投与を指す。例えば、患者に薬物を自己投与するように指示するか又は薬物の処方箋を患者に提供する医師は、患者に薬物を投与している。
「抗体」は、免疫グロブリン分子の可変領域に位置する少なくとも１つの抗原認識部位を介して、炭水化物、ポリヌクレオチド、脂質、ポリペプチド等の標的に特異的に結合することが可能な免疫グロブリン分子である。本明細書で使用される場合、「抗体」という用語は、インタクトなポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体だけでなく、別様の指定がない限り、特異的結合をインタクト抗体と競合するその任意の抗原結合性断片又は抗体断片、抗原結合性部分を含む融合タンパク質（例えば、抗体－薬物コンジュゲート）、抗原認識部位を含む免疫グロブリン分子の任意の他の修飾構成、ポリエピトープ特異性を有する抗体組成物、及び多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）も包含する。
抗体の「抗原結合性断片」又は「抗体断片」は、抗原結合が依然として可能であるインタクト抗体の部分、及び／又はインタクト抗体の可変領域を含む。抗原結合性断片としては、以下のものが挙げられる：例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、及びＦｖ断片、ドメイン抗体（ｄＡｂ、例えば、サメ及びラクダ抗体）、相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む断片、単鎖可変断片抗体（ｓｃＦｖ）、単鎖抗体分子、抗体断片から形成される多重特異性抗体、マキシボディ、ミニボディ、イントラボディ、ダイアボディ、トライアボディ、テトラボディ、ｖ－ＮＡＲ、及びｂｉｓ－ｓｃＦｖ、線状抗体（例えば、米国特許第５，６４１，８７０号明細書、実施例２；Ｚａｐａｔａら（１９９５年）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．８ＨＯ：１０５７を参照）、並びに特異的抗原結合性をポリペプチドに付与するのに十分な免疫グロブリンの少なくとも部分を含むポリペプチド。抗体のパパイン分解は、「Ｆａｂ」断片と呼ばれる２つの同一の抗原結合性断片、及び残りの「Ｆｃ」断片を産生する。この呼称は容易に結晶化する能力を反映する。Ｆａｂ断片は、Ｈ鎖の可変領域ドメイン（ＶＨ）及び１つの重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１）を伴うＬ鎖全体からなる。各Ｆａｂ断片は、抗原結合に関して一価であり、つまり単一の抗原結合部位を有する。抗体のペプシン処理は、単一の大型Ｆ（ａｂ’）２断片を産出し、これは、異なる抗原結合活性を有し、抗原を架橋することが依然として可能な２つのジスルフィドで結合されたＦａｂ断片にほぼ対応する。Ｆａｂ’断片は、抗体ヒンジ領域の１つ又は複数のシステインを含む、ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端に幾つかの追加の残基を有するという点で、Ｆａｂ断片とは異なる。Ｆａｂ’－ＳＨは、本明細書では、定常ドメインのシステイン残基が遊離チオール基を有するＦａｂ’の呼称である。Ｆ（ａｂ’）２抗体断片は、元々、それらの間にヒンジシステインを有するＦａｂ’断片の対として産生された。抗体断片の他の化学的カップリングも公知である。
「ＡＴＲ阻害剤」又は「ＡＴＲｉ」は、ＤＮＡ損傷応答を媒介するＡＴＲキナーゼ経路の阻害剤を指す。好ましくは、ＡＴＲ阻害剤は、ＡＴＲキナーゼの酵素活性を阻害する分子である。本発明の治療方法、薬剤、及び使用に有用なＡＴＲ阻害剤の例としては、化合物１～５のいずれか、又はその薬学的に許容される塩が挙げられる。更なるＡＴＲ阻害剤は、国際公開第２０１３／０４９７２６号パンフレット、国際公開第２０１３／１５２２９８号パンフレット、国際公開第２０１３／０４９８５９号パンフレット、米国特許出願公開第２０１３－００８９６２５、米国特許出願公開第２０１３－０１１５３１２、米国特許出願公開第２０１４－０１０７０９３、米国特許出願公開第２０１３－００９６１３９号明細書、国際公開第２０１１／１４３４２６号パンフレット、米国特許出願公開第２０１３－００９５１９３号明細書、国際公開第２０１４／０５５７５６号パンフレット、国際公開第２０１１／１４３４１９号パンフレット、国際公開第２０１１／１４３４２２号パンフレット、国際公開第２０１１／１４３４２５号パンフレット、米国特許出願公開第２０１３－０１１５３１１号明細書、米国特許出願公開第２０１３－０１１５３１２号明細書、米国特許出願公開第２０１３－０１１５３１３号明細書、米国特許出願公開第２０１３－０１１５３１４、国際公開第２０１１／１６３５２７号パンフレット、国際公開第２０１２／１７８１２３号パンフレット、国際公開第２０１２／１７８１２４号パンフレット、国際公開第２０１２／１７８１２５号パンフレット、米国特許出願公開第２０１４－０１１３００５号明細書、国際公開第２０１３／０４９７２６号パンフレット、国際公開第２０１３／０７１０８５号パンフレット、国際公開第２０１０／０７１８３７号パンフレット、国際公開第２０１４／０８９３７９号パンフレット、国際公開第２０１４／１４３２４２、国際公開第２０１４／１４３２４１号パンフレット、国際公開第２０１５／０８４３８４号パンフレット、国際公開第２０１４／１４３２４０号パンフレット、国際公開第２０１５／１８７４５１号パンフレット、国際公開第２０１５／０８５１３２号パンフレット、国際公開第２０１４／０６２６０４号パンフレット、国際公開第２０１４／１４３２４０号パンフレット、国際公開第２０１３／０７１０９４号パンフレット、国際公開第２０１３／０７１０９３号パンフレット、国際公開第２０１３／０７１０９０、国際公開第２０１３／０７１０８８号パンフレット、国際公開第２０１３／０４９８５９号パンフレット、国際公開第２０１３／０４９７１９号パンフレット、国際公開第２０１３／０４９７２０号パンフレット、国際公開第２０１３／０４９７２２号パンフレット、国際公開第２０１２／１３８，９３８号パンフレット、国際公開第２０１１／１６３５２７号パンフレット、国際公開第２０１１／１４３，４２３号パンフレット、国際公開第２０１１／１４３，４２６号パンフレット、国際公開第２０１１／１４３，３９９号パンフレット、及び／又は国際公開第２０１０／０５４３９８号パンフレットに記載されている。これらの文献は全て、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
「バイオマーカー」は、一般に、病状を示す生物学的分子、並びにそれらの定量的及び定性的測定値を指す。「予後バイオマーカー」は、療法に関わらず、疾患転帰と相関する。例えば、腫瘍低酸素症は、否定的な予後マーカーであり、腫瘍低酸素症がより高いほど、疾患の転帰が否定的なものになる可能性がより高くなる。「予測バイオマーカー」は、患者が特定の療法に対して肯定的に応答する可能性が高いか否かを示す。例えば、ＨＥＲ２プロファイリングは、乳がん患者が、ハーセプチン（トラスツズマブ、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）に応答する可能性が高いか否かを決定するために乳がん患者で広く使用されている。「応答バイオマーカー」は、療法に対する応答の尺度を提供し、従って、療法が効いているか否かの指標を提供する。例えば、前立腺特異的抗原レベルの減少は、一般に、前立腺がん患者に対する抗がん療法が効いていることを示す。マーカーが、本明細書に記載の治療のための患者を特定又は選択するための基盤として使用される場合、マーカーは、治療前及び／又は治療中に測定することができ、得られた値は、以下のいずれかを評価する際に臨床医により使用される：（ａ）個体が初期治療受容に好適であると考えられるか若しくはその可能性が高いこと；（ｂ）個体が初期治療受容に好適でないと考えられるか若しくはその可能性が高いこと；（ｃ）治療に対する応答性；（ｄ）個体が治療受容継続に好適であると考えられるか若しくはその可能性が高いこと；（ｅ）個体が治療受容継続に好適でないと考えられるか若しくはその可能性が高いこと；（ｆ）投薬量の調整；（ｇ）臨床的利益の可能性の予測；又は（ｈ）毒性。当業者であれば十分に理解することになるように、臨床設定でのバイオマーカーの測定は、そのパラメーターが、本明細書に記載の治療の投与を開始、継続、調整、及び／又は中止するための基盤として使用されたことを明確に示すものである。
「がん」、「がん性」、又は「悪性」は、典型的には、制御されていない細胞成長により特徴付けられる哺乳動物の生理学的状態を指すか又は記述する。がんの例としては、これらに限定されないが、癌腫、リンパ腫、白血病、芽細胞腫、及び肉腫が挙げられる。そのようながんのより具体的な例としては、以下のものが挙げられる：扁平上皮癌、骨髄腫、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、神経膠腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、急性骨髄性白血病、多発性骨髄腫、胃腸（管）がん、腎がん、卵巣がん、肝臟がん、リンパ芽球性白血病、リンパ球性白血病、結腸直腸がん、子宮内膜がん、腎臓がん、前立腺がん、甲状腺がん、黒色腫、軟骨肉腫、神経芽細胞腫、膵臓がん、多形性神経膠芽細胞腫、子宮頸部がん、脳がん、胃がん、膀胱がん、ヘパトーマ、乳がん、結腸癌、尿路上皮がん、及び頭頸部がん。
「化学療法」は、がんの治療に有用な化学化合物である化学療法剤を伴う療法である。化学療法剤の例としては、以下のものが挙げられる：チオテパ及びシクロホスファミド等のアルキル化剤；ブスルファン、インプロスルファン、及びピポスルファン等のスルホン酸アルキル；ベンゾドーパ（ｂｅｎｚｏｄｏｐａ）、カルボコン、メツレドーパ（ｍｅｔｕｒｅｄｏｐａ）、及びウレドーパ（ｕｒｅｄｏｐａ）等のアジリジン；アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホルアミド、トリエチレンチオホスホルアミド、及びトリメチロールメラミンを含むエチレンイミン及びメチロールメラミン；アセトゲニン（特に、ブラタシン及びブラタシノン）；デルタ－９－テトラヒドロカンナビノール（ドロナビノール）；ベータ－ラパコン；ラパコール；コルヒチン；ベツリン酸；ブリオスタチン；ペメトレキセド；カリスタチン；ポドフィロトキシン；ポドフィリン酸；テニポシド；クリプトフィシン（特に、クリプトフィシン１及びクリプトフィシン８）；ドラスタチン；エリュテロビン；パンクラチスタチン；ＴＬＫ－２８６；ＣＤＰ３２３、経口アルファ－４インテグリン阻害剤；サルコジクチイン；スポンギスタチン；クロラムブシル、クロルナファジン、クロロホスファミド、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシド塩酸塩、メルファラン、ノブエンビキン、フェネステリン、プレドニムスチン、トロホスファミド、及びウラシルマスタード等のナイトロジェンマスタード；カルムスチン、クロロゾトシン、ホテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、及びラニムスチン等のニトロソウレア；ジネミシンＡを含むジネミシン；エスペラミシン；並びにネオカルチノスタチン発色団及び関連色素タンパク質エンジイン抗生物質発色団、アクラシノマイシン、アクチノマイシン、アントラマイシン、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カラビシン（ｃａｒａｂｉｃｉｎ）、カルミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、６－ジアゾ－５－オキソ－Ｌ－ノルロイシン、ドキソルビシン（モルホリノ－ドキソルビシン、シアノモルホリノ－ドキソルビシン、２－ピロリノ－ドキソルビシン、ドキソルビシンＨＣｌリポゾーム注射剤、及びデオキシドキソルビシンを含む）、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、ミトマイシンＣ等のミトマイシン、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン（ｐｏｔｆｉｒｏｍｙｃｉｎ）、ピューロマイシン、クエラマイシン、ロドルビシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、及びゾルビシン；メトトレキサート、ゲムシタビン、テガフール、カペシタビン、エポチロン、及び５－フルオロウラシル（５－ＦＵ）等の抗代謝剤；デノプテリン、メトトレキサート、プテロプテリン、及びトリメトレキサート等の葉酸アナログ；フルダラビン、６－メルカプトプリン、チアミプリン、及びチオグアニン等のプリンアナログ；アンシタビン、アザシチジン、６－アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロクスウリジン、及びイマチニブ（２－フェニルアミノピリミジン誘導体）等のピリミジンアナログ、並びに他のｃ－Ｋｉｔ阻害剤；アミノグルテチミド、ミトタン、及びトリロスタン等の抗副腎剤；フォリン酸等の葉酸補給剤；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；エニルウラシル；アムサクリン；ベストラブシル；ビサントレン；エダトレキセート；デフォファミン（ｄｅｆｏｆａｍｉｎｅ）；デメコルチン；ジアジクオン；エフロルニチン；酢酸エリプチニウム；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシ尿素；レンチナン；ロニダイニン（ｌｏｎｉｄａｉｎｉｎｅ）；マイタンシン及びアンサミトシン等のマイタンシノイド；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダンモール（ｍｏｐｉｄａｎｍｏｌ）；ニトラミン；ペントスタチン；フェナメット；ピラルビシン；ロソキサントロン；２－エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫポリサッカリド複合体（ＪＨＳ Ｎａｔｕｒａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、ユージーン、オレゴン州）；ラゾキサン；リゾキシン；シゾフィラン（ｓｉｚｏｆｉｒａｎ）；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジクオン；２，２’，２’’－トリクロロトリエチルアミン；トリコテセン（特に、Ｔ－２トキシン、ベラクリンＡ、ロリジンＡ、及びアングイジン）；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン（ｇａｃｙｔｏｓｉｎｅ）；アラビノシド（「Ａｒａ－Ｃ」）；チオテパ；タキソイド、例えば、パクリタキセル、アルブミン結合型パクリタキセルナノ粒子製剤、及びドキセタキセル（ｄｏｘｅｔａｘｅｌ）；クロラムブシル；６－チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキサート；シスプラチン及びカルボプラチン等の白金アナログ；ビンブラスチン；白金；イホスファミド；ミトキサントロン；ビンクリスチン；オキサリプラチン；ロイコボリン；ビノレルビン；ノバントロン；エダトレキサート；ダウノマイシン；アミノプテリン；イバンドロネート；ジフルオロメチルオルニチン（ＤＭＦＯ）；レチノイン酸等のレチノイド；上記のもののいずれかの薬学的に許容される塩、酸、又は誘導体；並びにＣＨＯＰ（シクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン、及びプレドニゾロンの併用療法の略語）又はＦＯＬＦＯＸ（５－ＦＵ及びロイコボリンと組み合わせたオキサリプラチンによる治療レジメンの略語）等の上記のものの２つ又はそれよりも多くの組合せ。
「臨床転帰」、「臨床パラメーター」、「臨床応答」、又は「臨床エンドポイント」は、療法に対する患者の反応に関連する任意の臨床観察又は測定を指す。臨床転帰の非限定的な例としては、腫瘍応答（ＴＲ）、全生存（ＯＳ）、無進行生存期間（ＰＦＳ）、無病生存期間、腫瘍再発までの期間（ＴＴＲ）、腫瘍進行までの期間（ＴＴＰ）、相対危険度率（ＲＲ）、毒性、又は副作用が挙げられる。
「完全奏功」又は「完全寛解」は、治療に応答して、がんの全ての徴候が消失することを指す。これは、必ずしもがんが治癒したことを意味するとは限らない。
「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、本明細書で使用される場合、本組成物及び方法が、挙げられている要素を含むが、他のものを除外しないことを意味することが意図されている。「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」は、本組成物及び方法を規定するために使用される場合、本組成物又は方法にとって任意の本質的な重要性を有する他の要素を除外することを意味するものとする。「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」は、特許請求されている組成物及び実質的な方法工程について、微量要素よりも多くの他の成分を除外することを意味するものとする。こうした移行句の各々により規定される実施形態は、本発明の範囲内にある。従って、本方法及び組成物は、追加のステップ及び構成要素を含んでいてもよく（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）、又はその代わりに重要でない工程及び組成物を含んでいてもよく（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）、又はその代わりに記載の方法工程若しくは組成物のみが意図されていてもよい（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）ことが意図される。
「用量」及び「投薬量」は、投与する活性剤又は療法剤の特定量を指す。そのような量は「剤形」に含まれており、「剤形」は、ヒト対象及び他の哺乳動物のための単一投薬量として好適な物理的に別個の単位を指し、各単位は、担体等の１つ又は複数の好適な医薬賦形剤と共に、所望の作用発現、耐容性、及び療法効果を生み出すように計算された所定量の活性剤を含む。
「Ｆｃ」は、ジスルフィドにより一緒に保持されている両Ｈ鎖のカルボキシ末端部分を含む断片である。抗体のエフェクター機能は、ある特定のタイプの細胞に見出されるＦｃ受容体（ＦｃＲ）によっても認識される領域であるＦｃ領域の配列により決定される。
本発明の抗体の「機能的断片」は、一般に、インタクト抗体の抗原結合性若しくは可変領域又はＦｃＲ結合能力が保たれているか若しくは修飾されている抗体のＦｃ領域を含む、インタクト抗体の部分を含む。機能的抗体断片の例としては、線状抗体、単鎖抗体分子、及び抗体断片から形成される多重特異性抗体が挙げられる。
「Ｆｖ」は、完全な抗原認識及び抗原結合部位を含む最小抗体断片である。この断片は、堅固な非共有結合で付随されている、１つの重鎖軽鎖可変領域ドメイン及び１つの軽鎖可変領域ドメインの二量体からなる。こうした２つのドメインがフォールディングすると、抗原結合のためのアミノ酸残基に寄与し、抗体に抗原結合特異性を付与する６つの超可変ループ（Ｈ鎖及びＬ鎖から各々３つのループ）が生じる。しかしながら、単一の可変ドメイン（又は抗原に特異的な３つのＨＶＲのみを含むＦｖの半分）でさえ、結合部位全体よりも親和性はより低いものの、抗原を認識して結合する能力を有する。
「ヒト抗体」は、ヒトにより産生される抗体のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を有し、及び／又は本明細書で開示される通りのヒト抗体を製作するための技法のいずれかを使用して製作された抗体である。ヒト抗体のこの定義は、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を明確に除外する。ヒト抗体は、ファージディスプレイライブラリーを含む当技術分野で公知の種々の技法を使用して産生することができる（例えば、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ及びＷｉｎｔｅｒ（１９９１年）、ＪＭＢ ２２７巻：３８１頁；Ｍａｒｋｓら（１９９１年）ＪＭＢ ２２２巻：５８１頁を参照）。ヒトモノクローナル抗体の調製には、Ｃｏｌｅら（１９８５年）Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ、Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ、７７頁；Ｂｏｅｒｎｅｒら（１９９１年）、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ １４７巻（ｌ号）：８６頁；ｖａｎ Ｄｉｊｋ及びｖａｎ ｄｅ Ｗｉｎｋｅｌ（２００１年）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ ５巻：３６８頁に記載されている方法も利用可能である。ヒト抗体は、抗原負荷に応答してそのような抗体を産生するように修飾されているが、その内因性遺伝子座が無効化されているトランスジェニック動物、例えば、免疫ｘｅｎｏｍｏｕｓｅ（ＸＥＮＯＭＯＵＳＥ技術に関する米国特許第６，０７５，１８１号明細書及び第６，１５０，５８４号明細書を参照）に抗原を投与することにより準備することができる。また、例えば、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術を用いて生成されるヒト抗体に関する、Ｌｉら（２００６年）ＰＮＡＳ ＵＳＡ、１０３巻：３５５７頁を参照されたい。
非ヒト（例えば、マウス）抗体の「ヒト化」形態は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含むキメラ抗体である。一実施形態では、ヒト化抗体は、レシピエントのＨＶＲに由来する残基が、所望の特異性、親和性、及び／又は能力を有するマウス、ラット、ウサギ、又は非ヒト霊長類等の非ヒト種（ドナー抗体）のＨＶＲに由来する残基により置き換えられているヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。一部の場合では、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク（「ＦＲ」）残基が、対応する非ヒト残基により置き換えられている。更に、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にもドナー抗体にも見出されない残基を含んでいてもよい。こうした修飾をなして、結合親和性等の抗体性能を更に洗練させることができる。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含むことになり、超可変ループの全て又は実質的に全ては非ヒト免疫グロブリン配列の超可変ループに対応し、ＦＲ領域の全て又は実質的に全てはヒト免疫グロブリン配列のＦＲ領域であるが、ＦＲ領域は、結合親和性、異性化、免疫原性等の抗体性能を向上させる１つ又は複数の個々のＦＲ残基置換を含んでいてもよい。ＦＲにおけるこうしたアミノ酸置換の数は、典型的には、Ｈ鎖では６つ以下、Ｌ鎖では３つ以下である。また、ヒト化抗体は、任意選択で、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも部分、典型的にはヒト免疫グロブリンの少なくとも部分を含むことになる。更なる詳細は、例えば、Ｊｏｎｅｓら（１９８６年）Ｎａｔｕｒｅ ３２１巻：５２２頁；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら（１９８８年）、Ｎａｔｕｒｅ ３３２巻：３２３頁；Ｐｒｅｓｔａ（１９９２年）Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２巻：５９３頁；Ｖａｓｗａｎｉ及びＨａｍｉｌｔｏｎ（１９９８年）、Ａｎｎ．Ａｌｌｅｒｇｙ，Ａｓｔｈｍａ＆Ｉｍｍｕｎｏｌ．１巻：１０５頁；Ｈａｒｒｉｓ（１９９５年）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ ２３巻：１０３５頁；Ｈｕｒｌｅ及びＧｒｏｓｓ（１９９４年）Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．５巻：４２８頁；並びに米国特許第６，９８２，３２１号明細書及び第７，０８７，４０９号明細書を参照されたい。
「免疫グロブリン」（Ｉｇ）は、本明細書では「抗体」と同義的に使用される。基本的な４鎖抗体単位は、２つの同一軽（Ｌ）鎖及び２つの同一重（Ｈ）鎖で構成されるヘテロ四量体糖タンパク質である。ＩｇＭ抗体は、Ｊ鎖と呼ばれる追加のポリペプチドと共に５つの基本ヘテロ四量体単位からなり、１０個の抗原結合部位を含み、ＩｇＡ抗体は、重合してＪ鎖との組合せで多価集合体を形成することができる２～５つの基本４鎖単位で構成される。ＩｇＧの場合、４鎖単位は、一般に約１５０，０００ダルトンである。各Ｌ鎖は、１つの共有結合ジスルフィド結合によりＨ鎖に連結されており、２つのＨ鎖は、Ｈ鎖アイソタイプに応じて１つ又は複数のジスルフィド結合により互いに連結されている。また、Ｈ鎖及びＬ鎖は各々、規則的に離間された鎖内ジスルフィド架橋を有する。各Ｈ鎖は、Ｎ末端に、可変ドメイン（ＶＨ）、それに続いてα鎖及びγ鎖の各々では３つの定常ドメイン（ＣＨ）並びにμアイソタイプ及びεアイソタイプでは４つのＣＨドメインを有する。各Ｌ鎖は、Ｎ末端に、可変ドメイン（ＶＬ）、それに続いてその他方の末端に定常ドメインを有する。ＶＬはＶＨとアラインし、ＣＬは、重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１）とアラインする。特定のアミノ酸残基は、軽鎖可変ドメインと重鎖可変ドメインとの間の界面を形成すると考えられている。ＶＨ及びＶＬが一緒に対形成すると、単一の抗原結合部位を形成する。異なるクラスの抗体の構造及び特性については、例えば、Ｂａｓｉｃ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、第８版、Ｓｔｉｅｓら（編）、Ａｐｐｌｅｔｏｎ＆Ｌａｎｇｅ、ノーウォーク、コネティカット州、１９９４年、７１頁及び第６章を参照されたい。任意の脊椎動物種に由来するＬ鎖は、それらの定常ドメインのアミノ酸配列に基づきカッパ及びラムダと呼ばれる、２つの明白に異なるタイプの１つに帰属させることができる。免疫グロブリンは、それらの重鎖の定常ドメイン（ＣＨ）のアミノ酸配列に応じて、様々なクラス又はアイソタイプに帰属させることができる。免疫グロブリンには、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭの５つのクラスがあり、それぞれα、δ、ε、γ、及びμと指定される重鎖を有する。γクラス及びαクラスは、ＣＨ配列及び機能の比較的小さな違いに基づいて更にサブクラスに分類され、例えば、ヒトは、以下のサブクラス：ＩｇＧ１、ＩｇＧ２Ａ、ＩｇＧ２Ｂ、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、及びＩｇＫ１を発現する。
「注入」又は「注入する」は、療法目的で薬物含有溶液を静脈を介して体内に導入することを指す。一般に、これは静脈内（ＩＶ）バッグにより達成される。
「と組み合わせて」又は「と併せて」は、１つ又は複数の他の化合物に加えて１つの化合物を投与することを指す。そのため、「と組み合わせて」又は「と併せて」は、１つ又は複数の他の化合物に加えて１つの化合物を任意の順序で投与することを指す。例えば、上記１つの化合物は、上記１つ又は複数の他の化合物を個体に投与する前、投与中、又は投与後に投与することができる。本明細書で使用される場合、ＤＮＡアルキル化剤を担持するＡＤＣ及びＡＴＲ阻害剤を含む組合せの投与に関する「組み合わせて」という用語は、こうした化合物が任意の順序で患者に投与されることを意味する。例えば、化合物は、同時に又は順次投与することができる。また、追加の化学療法がある場合、２つの化合物を同時に投与し、続いて第３の化合物を順次投与することができる。また、化合物は、単一の又は別々の組成物、製剤、又は単位剤形として投与してもよい。また、２つの化合物は、単一の組成物、製剤、又は単位剤形として投与してもよく、第３の化合物は、別々の組成物、製剤、又は単位剤形として投与される。ＤＮＡアルキル化剤を担持するＡＤＣ、ＡＴＲ阻害剤、及び潜在的な追加の化学療法剤又は放射線療法又は放射線化学療法は、適切な投薬プロトコールに従って、同じ日に又は異なる日に任意の順序で投与されることが理解されるだろう。
「転移性」がんは、身体の１つの部分（例えば、肺）から身体の別の部分に広がったがんを指す。
「モノクローナル抗体」は、本明細書で使用される場合、実質的に均質な抗体の集団から得られる抗体を指し、つまり、集団を構成する個々の抗体は、少量で存在する場合がある考え得る天然に存在する突然変異及び／又は翻訳後修飾（例えば、異性化及びアミド化）を除いて同一である。モノクローナル抗体は非常に特異的であり、単一の抗原部位を標的とする。典型的には、異なる決定基（エピトープ）を標的とする異なる抗体を含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、各モノクローナル抗体は、抗原の単一の決定基を標的とする。モノクローナル抗体は、それらが特異的であることに加えて、ハイブリドーマ培養により合成され、他の免疫グロブリンにより夾雑されていないという点で有利である。「モノクローナル」という修飾語は、抗体の実質的に均一な集団から得られる抗体の特質を示し、任意の特定の方法による抗体の産生を必要とすると解釈されるべきではない。例えば、本発明により使用されるモノクローナル抗体は、以下のものを含む様々な技法により製作することができる：例えば、ハイブリドーマ法（例えば、Ｋｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５年）Ｎａｔｕｒｅ ２５６巻：４９５頁；Ｈｏｎｇｏら（１９９５年）Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ １４巻（３号）：２５３頁；Ｈａｒｌｏｗら（１９８８年）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、第２版；Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇら（１９８１年）Ｉｎ：Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｔ－ＣｅＩｌ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ ５６３巻（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ｎ．Ｙ．））、組換えＤＮＡ法（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号を参照）、ファージディスプレイ技術（例えば、Ｃｌａｃｋｓｏｎら（１９９１年）Ｎａｔｕｒｅ ３５２巻：６２４頁；Ｍａｒｋｓら（１９９２年）ＪＭＢ ２２２巻：５８１頁；Ｓｉｄｈｕら（２００４年）ＪＭＢ ３３８巻（２号）：２９９頁；Ｌｅｅら（２００４年）ＪＭＢ ３４０巻（５号）：１０７３頁；Ｆｅｌｌｏｕｓｅ（２００４年）ＰＮＡＳ ＵＳＡ １０１巻（３４号）：１２４６７頁；及びＬｅｅら（２００４年）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２８４巻（１－２号）：１１９頁を参照）、並びにヒト免疫グロブリン配列をコードするヒト免疫グロブリン遺伝子座又は遺伝子の一部又は全てを有する動物にてヒト抗体又はヒト様抗体を産生するための技術（例えば、国際公開第１９９８／２４８９３号パンフレット；国際公開第１９９６／３４０９６号パンフレット；国際公開第１９９６／３３７３５号パンフレット；国際公開第１９９１／１０７４１号パンフレット；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら（１９９３年）ＰＮＡＳ ＵＳＡ ９０巻：２５５１頁；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら（１９９３年）Ｎａｔｕｒｅ ３６２巻：２５５頁；Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎら（１９９３年）Ｙｅａｒ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．７巻：３３頁；米国特許第５，５４５，８０７号明細書；第５，５４５，８０６号明細書；第５，５６９，８２５号明細書；第５，６２５，１２６号明細書；第５，６３３，４２５号明細書；及び第５，６６１，０１６号明細書；Ｍａｒｋｓら（１９９２年）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０巻：７７９頁；Ｌｏｎｂｅｒｇら（１９９４年）Ｎａｔｕｒｅ ３６８巻：８５６頁；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ（１９９４年）Ｎａｔｕｒｅ ３６８巻：８１２頁；Ｆｉｓｈｗｉｌｄら（１９９６年）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４巻：８４５頁；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ（１９９６）、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４巻：８２６頁；並びにＬｏｎｂｅｒｇ及びＨｕｓｚａｒ（１９９５年），Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３巻：６５～９３頁を参照）。本明細書のモノクローナル抗体としては、具体的には、重鎖及び／又は軽鎖の部分が、特定の種に由来するか又は特定の抗体クラス若しくはサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一であるか又は相同性であり、鎖の残りは、別の種に由来するか又は別の抗体クラス若しくはサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一であるか又は相同性であるキメラ抗体（免疫グロブリン）、並びにそれらが所望の生物学的活性を示す限り、そのような抗体の断片が挙げられる（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号明細書；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら（１９８４年）ＰＮＡＳ ＵＳＡ、８１巻：６８５１頁を参照）。
「客観的応答」は、完全奏功（ＣＲ）又は部分奏功（ＰＲ）を含む測定可能な応答を指す。
「部分奏功」は、治療に応答した、１つ若しくは複数の腫瘍若しくは病変のサイズの減少又は身体のがんの程度の減少を指す。
「患者」及び「対象」は、本明細書では同義的に使用され、がんの治療を必要とする哺乳動物を指す。一般に、患者は、がんの１つ又は複数の症状を罹患すると診断されているか又はそのリスクのあるヒトである。ある特定の実施形態では、「患者」又は「対象」は、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、ウサギ、ブタ、マウス、若しくはラットなどの非ヒト哺乳動物、又はスクリーニング、特徴付け、並びに薬物及び療法の評価に使用される動物を指す。
「薬学的に許容される」は、物質又は組成物が、哺乳動物の治療に関して化学的に及び／又は毒物学的に好適でなければならないことを示す。
「薬学的に許容されるアジュバント」という用語は、抗原に対する身体の免疫応答を増強するありとあらゆる物質を指す。薬学的に許容されるアジュバントの非限定的な例は、ミョウバン、フロイント不完全アジュバント、ＭＦ５９、ポリ（Ｉ：Ｃ）等のｄｓＲＮＡの合成アナログ、細菌ＬＰＳ、細菌フラジェリン、イミダゾールキノリン、特定のＣｐＧモチーフを含むオリゴデオキシヌクレオチド、ムラミルジペプチド及びＱｕｉｌ－Ａ（登録商標）等の細菌細胞壁の断片である。
本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される担体」又は「薬学的に許容される希釈剤」は、医薬投与と適合性である、ありとあらゆる溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤及び抗真菌剤、等張剤、並びに吸収遅延剤を意味する。薬学的活性物質のためのそのような媒体及び作用剤の使用は、当技術分野において周知である。許容される担体、賦形剤、又は安定剤は、使用される投薬量及び濃度においてレシピエントに無毒性であり、本発明の範囲を限定はしないが、以下のものが挙げられる：追加の緩衝剤；保存剤；共溶媒；アスコルビン酸及びメチオニンを含む抗酸化剤；ＥＤＴＡ等のキレート剤；金属錯体（例えば、Ｚｎ－タンパク質錯体）；ポリエステル等の生分解性ポリマー；ナトリウム、多価糖アルコール等の塩形成対イオン；アラニン、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、リジン、オルニチン、ロイシン、２－フェニルアラニン、グルタミン酸、及びスレオニン等のアミノ酸；ラクチトール、スタキオース、マンノース、ソルボース、キシロース、リボース、リビトール、ミオイニシトース（ｍｙｏｉｎｉｓｉｔｏｓｅ）、ミオイノシトール、ガラクトース、ガラクチトール、グリセロール、シクリトール（例えば、イノシトール）、ポリエチレングリコール等の有機糖又は糖アルコール；尿素、グルタチオン、チオクト酸、チオグリコール酸ナトリウム、チオグリセロール、［アルファ］－モノチオグリセロール、及びチオ硫酸ナトリウム等の硫黄含有還元剤；ヒト血清アルブミン、ウシ血清アルブミン、ゼラチン、又は他の免疫グロブリン等の低分子量タンパク質；並びにポリビニルピロリドン等の親水性ポリマー。Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ 第１６版、Ｏｓｏｌ，Ａ．編（１９８０年）に記載のもの等の、他の薬学的に許容される担体、賦形剤、又は安定剤も、それらが医薬組成物の所望の特質に悪影響を及ぼさない限り、本明細書に記載の医薬組成物に含めることができる。
分子の「薬学的に許容される塩」は、分子の塩形態を指す。薬学的に許容される塩は、酢酸イオン、コハク酸イオン、又は他の対イオン等の別の分子の包含を伴っていてもよい。対イオンは、親化合物の電荷を安定させる任意の有機又は無機部分であってもよい。更に、薬学的に許容される塩は、その構造中に１つよりも多くの荷電原子を有してもよい。複数の荷電原子が薬学的に許容される塩の一部である場合は、複数の対イオンを有してもよい。従って、薬学的に許容される塩は、１つ若しくは複数の荷電原子及び／又は１つ若しくは複数の対イオンを有してもよい。本発明の化合物が塩基性である場合、所望の薬学的に許容される塩は、当技術分野で利用可能な任意の好適な方法により調製することができ、例えば、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、メタンスルホン酸、リン酸等の無機酸で、或いは、酢酸、マレイン酸、コハク酸、マンデル酸、フマル酸、マロン酸、ピルビン酸、シュウ酸、グリコール酸、サリチル酸、グルクロン酸若しくはガラクツロン酸等のピラノシジル酸、クエン酸若しくは酒石酸等のアルファヒドロキシ酸、アスパラギン酸若しくはグルタミン酸等のアミノ酸、安息香酸若しくは桂皮酸等の芳香族酸、又はｐ－トルエンスルホン酸若しくはエタンスルホン酸等のスルホン酸等で、遊離塩基を処理することにより調製することができる。本発明の化合物が酸である場合、所望の薬学的に許容される塩は、任意の好適な方法により、例えば、アミン（第一級、第二級、又は第三級）、アルカリ金属水酸化物、又はアルカリ土類金属水酸化物等の、無機又は有機塩基で遊離酸を処理することにより調製することができる。好適な塩の代表的な例としては、これらに限定されないが、グリシン及びアルギニン等のアミノ酸、アンモニア、第一級、第二級、及び第三級アミン、並びにピペリジン、モルホリン、及びピペラジン等の環状アミンに由来する有機酸、並びにナトリウム、カルシウム、カリウム、マグネシウム、マンガン、鉄、銅、亜鉛、アルミニウム、及びリチウムに由来する無機塩が挙げられる。
「再発性」がんは、外科手術等の初期療法に応答した後で、初期部位又は遠隔部位のいずれかで再成長したがんである。局所的な「再発性」がんは、以前に治療したがんと同じ場所で治療後に再発するがんである。
１つ又は複数の症状の「低減」（及びこの語句の文法的等価物）は、症状の重症度又は頻度を減少させること、又は症状を消失させることを指す。
「血清」は、凝固血液から分離することができる透明な液体を指す。血清は、赤血球及び白血球及び血小板を含む通常の未凝固血液の液体部分である血漿とは異なる。血清は、血球でも凝固因子でもない成分である（血清は、白血球も赤血球も含んでいない）。血清は、血栓の形成を支援するフィブリノーゲンを含まない血漿である。血清と血漿とを区別するのは血餅である。
「単鎖Ｆｖ」は、「ｓＦｖ」又は「ｓｃＦｖ」とも略され、単一のポリペプチド鎖に接続されたＶＨ及びＶＬ抗体ドメインを含む抗体断片である。好ましくは、ｓＦｖポリペプチドは、ＶＨドメインとＶＬドメインとの間にポリペプチドリンカーを更に含み、ポリペプチドリンカーは、ｓＦｖが、抗原結合のために所望の構造を形成することを可能にする。ｓＦｖの総説は、例えば、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ（１９９４年）、Ｉｎ：Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、１１３巻、Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ及びＭｏｏｒｅ（編）、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、２６９頁を参照されたい。
「持続的応答」は、療法剤による治療又は本明細書に記載の併用療法の中止後の持続的な療法効果を意味する。一部の実施形態では、持続的応答は、治療期間と少なくとも同じであるか、又は治療期間よりも少なくとも１．５、２．０、２．５、又は３倍長い期間を有する。
「全身性」治療は、薬物物質が血流を移動し、全身の細胞に到達して影響を及ぼす治療である。
ＤＮＡアルキル化剤を担持するＡＤＣ又はＡＴＲ阻害剤の「治療有効量」は、本発明の各々の例において、がんを有する患者に投与すると、意図されている療法効果、例えば、患者のがんの１つ若しくは複数の徴候の緩和、寛解、軽減、若しくは消失、又はがん患者の治療の経過における任意の他の臨床結果を示すことになる、必要とされる投薬量及び期間において有効な量を指す。療法効果は、必ずしも１用量の投与で生じる必要はなく、一連の用量の投与後でのみ生じてもよい。従って、治療有効量は、１回又は複数回の投与で投与することができる。そのような治療有効量は、個体の病状、年齢、性別、及び体重、並びに個体において所望の応答を誘発するアルキル化剤を担持するＡＤＣ又はＡＴＲ阻害剤の能力等の要因に応じて様々であり得る。また、治療有効量は、治療上有益な効果が、アルキル化剤を担持するＡＤＣ又はＡＴＲ阻害剤の任意の毒性効果又は有害効果を上回る量である。
状態若しくは患者を「治療する」又は状態若しくは患者の「治療」は、臨床結果を含む有益な又は所望の結果を得るための措置を講じることを指す。本発明の目的では、有益な又は所望の臨床結果としては、これらに限定されないが、がんの１つ若しくは複数の症状の緩和、寛解；疾患の程度の縮小；疾患進行の遅延若しくは緩徐；病状の寛解、軽減、若しくは安定化；又は他の有益な結果が挙げられる。「治療する」又は「治療」への言及は、状態の確立された症状の緩和だけでなく予防も含むことが理解されるべきである。従って、その段階、障害、若しくは状態を「治療する」又はその段階、障害、若しくは状態の「治療」は、以下を含む：（１）段階、障害、若しくは状態を罹患している可能性があるか又は素因を有する可能性があるが、段階、障害、若しくは状態の臨床的若しくは不顕性症状をまだ経験若しくは表示していない対象において発症する段階、障害、又は状態の臨床症状の出現を防止又は遅延させること；（２）段階、障害、又は状態を阻害すること、つまり、疾患若しくはその再発（維持治療の場合）又はその少なくとも１つの臨床的な若しくは不顕性の症状の発症を阻止、低減、若しくは遅延させること、或いは（３）疾患を軽減又は減衰させること、つまり、段階、障害、若しくは状態、又はその臨床的な若しくは不顕性の症状の少なくとも１つの退縮を引き起こすこと。
「腫瘍」は、がんを有すると診断されているか又はがんを有することが疑われる対象に適用される場合、任意のサイズの悪性又は潜在的に悪性の新生物又は組織塊を指し、原発腫瘍及び二次新生物を含む。固形腫瘍は、通常は嚢胞又は液体区域を含まない組織の異常な成長又は塊である。様々なタイプの固形腫瘍が、それらを形成する細胞のタイプにちなんで名付けられている。固形腫瘍の例は、肉腫、癌腫、及びリンパ腫である。白血病（血液のがん）は、一般に、固形腫瘍を形成しない。
「単位剤形」は、本明細書で使用される場合、治療しようとする対象に適切な療法用製剤の物理的に別々の単位を指す。しかしながら、本発明の組成物の総１日使用量は、健全な医学的判断の範囲内で主治医により決定されることになることが理解されるだろう。任意の特定の対象又は生物の具体的な有効用量レベルは、治療されている障害及び障害の重症度；使用される具体的な活性作用剤の活性；使用される具体的な組成物；対象の年齢、体重、全体的な健康状態、性別、及び食事；使用される具体的な活性作用剤の投与時間及び排泄速度；治療期間；使用される具体的な化合物と組み合わせて又は同時に使用される薬物及び／又は追加療法薬；並びに医学技術で周知の類似要因を含む様々な要因に依存することになるだろう。
「可変」は、可変ドメインのある特定の区画の配列が抗体間で大きく異なるという事実を指す。Ｖドメインは、抗原結合を媒介し、その特定の抗原に対する特定の抗体の特異性を規定する。しかしながら、可変性は、可変ドメインの範囲全体に均等に分散されていない。その代わり、可変性は、軽鎖可変ドメイン及び重鎖可変ドメインの両方にある超可変領域（ＨＶＲ）と呼ばれる３つの区画に集中している。可変ドメインのより高度に保存された部分は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる。天然重鎖及び軽鎖の可変ドメインは各々、主にベータシート構成をとっており、３つのＨＶＲにより接続されている４つのＦＲ領域を含み、３つのＨＶＲは、ベータシート構造を接続するループを形成し、一部の場合ではベータシート構造の一部を形成する。各鎖のＨＶＲは、ＦＲ領域により一緒に近傍に保持されており、他方の鎖のＨＶＲと共に、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する（Ｋａｂａｔら（１９９１年）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、ベテスダ、メリーランド州を参照）。定常ドメインは、抗体と抗原との結合に直接的には関与しないが、抗体依存性細胞傷害への抗体の参加等、種々のエフェクター機能を呈する。
抗体の「可変領域」又は「可変ドメイン」は、抗体の重鎖又は軽鎖のアミノ末端ドメインを指す。重鎖及び軽鎖の可変ドメインは、それぞれ「ＶＨ」及び「ＶＬ」と呼ばれる場合がある。こうしたドメインは、一般に、抗体の最も可変性の部分であり（同じクラスの他の抗体と比べて）、抗原結合部位を含む。
本明細書で使用される場合、複数の項目、構造要素、構成要素、及び／又は材料は、便宜上、共通のリストに提示されていてもよい。しかしながら、こうしたリストは、リストの各メンバーが、別々の固有なメンバーとして個々に特定されているかの如く解釈されるべきである。従って、そのようなリストの個々のメンバーは、そうではないという指示がない限り、共通の群におけるそれらの提示のみに基づいて同じリストの任意の他のメンバーと事実上等価であると解釈されるべきではない。
濃度、量、及び他の数値データは、本明細書では、範囲形式で表現又は提示されていてもよい。そのような範囲形式は、便宜上及び簡潔性のために使用されるに過ぎず、従って、範囲の限界として明示的に挙げられている数値を含むだけでなく、その範囲内に包含される全ての個々の数値又は部分範囲を、各数値及び部分範囲が明示的に挙げられているかの如く含むように柔軟に解釈されるべきであることが理解されるべきである。実例として、「約１～約５」という数値範囲は、約１～約５の明示的に挙げられている値だけでなく、示されている範囲内の個々の値及び部分範囲も含むと解釈されるべきである。従って、この数値範囲には、２、３、及び４等の個々の値、並びに１～３、２～４、及び３～５等の部分範囲、並びに１、２、３、４、及び５が個々に含まれる。この同じ原則は、最小値又は最大値としてたった１つの数値が挙げられている範囲にも該当する。更に、そのような解釈は、範囲の幅広さ又は記載されている特質に関わらず適用されるべきである。
略語
本明細書で使用されている一部の略語としては、以下のものが挙げられる。
ＡＴＲ：毛細血管拡張性運動失調症及びＲＡＤ３関連タンパク質
ＢＩＤ：１日２回
ＣＤＲ：相補性決定領域
ＣＲＣ：結腸直腸がん
ＣＲＴ：化学放射線療法
ＣＴ：化学療法
ＤＮＡ：デオキシリボ核酸
Ｉｇ：免疫グロブリン
ＩＨＣ：免疫組織化学
ＩＶ：静脈内
ｍＣＲＣ：転移性結腸直腸がん
ＭＳＩ－Ｈ：高マイクロサテライト領域遺伝子不安定性（Ｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｌｉｔｅ ｓｔａｔｕｓ ｉｎｓｔａｂｌｅ ｈｉｇｈ）
ＭＳＩ－Ｌ：低マイクロサテライト領域遺伝子不安定性（Ｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｌｉｔｅ ｓｔａｔｕｓ ｉｎｓｔａｂｌｅ ｌｏｗ）
ＭＳＳ：マイクロサテライト領域遺伝子安定性（Ｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｌｉｔｅ ｓｔａｔｕｓ ｓｔａｂｌｅ）
ＮＫ：ナチュラルキラー
ＮＳＣＬＣ：非小細胞肺がん
ＯＳ：全生存期間
ＰＦＳ：無進行生存期間
ＱＤ：１日１回
ＱＩＤ：１日４回
Ｑ２Ｗ：２週間毎
Ｑ３Ｗ：３週間毎
ＲＮＡ：リボ核酸
ＲＲ：相対リスク
ＲＴ：放射線療法
ＳＣＣＨＮ：頭頸部扁平上皮癌
ＳＣＬＣ：小細胞肺がん
ＳｏＣ：標準治療
ＴＩＤ：１日３回
ＴＲ：腫瘍応答
ＴＴＰ：腫瘍進行までの時間
ＴＴＲ：腫瘍再発までの時間
ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）種の培養ブロスから最初に単離されたデュオカルマイシンは、デュオカルマイシンＡ、デュオカルマイシンＳＡ、及びＣＣ－１０６５を含む、抗腫瘍抗生物質のファミリーのメンバーである。デュオカルマイシンは、ＤＮＡの副溝に結合し、その後ＤＮＡの不可逆的なアルキル化を引き起こす。これにより、核酸アーキテクチャが破壊され、最終的には腫瘍細胞死に結び付く。
デュオカルマイシンは、元々はストレプトマイセスから単離された天然化合物のクラスである。こうした非常に強力な分子は、デュオカルマイシン誘導体ＤＵＢＡ（１１）により例示されるように、ＤＮＡアルキル化単位及びＤＮＡ結合単位からなる共通の分子構築様式を有する。ＤＮＡ二本鎖のＡＴリッチ領域の副溝に結合した後、ＤＵＢＡの活性化シクロプロパン環にアデニンのＮ３が付加され、ＤＮＡのアルキル化に結び付く。デュオカルマイシンは、反応性シクロプロパン環を含むが、水性媒体中ではかなり安定的である。しかしながら、デュオカルマイシンは、ＤＮＡの存在下で顕著なアルキル化効率及び速度を呈する。この現象を解明するために、デュオカルマイシンＳＡ（ＤＳＡ、１３）とＤＮＡとの複合体が、核磁気共鳴（ＮＭＲ）分光法を使用して研究された。デュオカルマイシンの２つのサブユニットは、リガンドの非存在下では、同一平面上にある。ＤＮＡの副溝に結合すると、疎水性接触が最大化され、ＤＳＡの立体構造変化に結び付く。２つのサブユニットは互いに対してねじれて、アルキル化のために分子を活性化する。
ＳＹＤ９８５は、Ｄｕｔｃｈ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ｃｏｍｐａｎｙ Ｓｙｎｔｈｏｎにより現在臨床開発中のデュオカルマイシンに基づくＡＤＣである。このＡＤＣは、カテプシンＢで切断可能なジペプチドリンカーを介して抗ＨＥＲ２抗体トラスツズマブに接続されているデュオカルマイシンプロドラッグであるｓｅｃｏ－ＤＵＢＡからなる。
国際公開第２０１５／１０４３７３号パンフレットには、子宮内膜がんを治療するためのデュオカルマイシン担持ＡＤＣの使用が開示されている。
国際公開第２０１１／１３３０３９号パンフレットには、ＤＮＡアルキル化剤ＣＣ－１０６５の一連のアナログ及びそれらのＨＥＲ２標的指向性ＡＤＣが開示されている。実施例１５では、幾つかのトラスツズマブ－デュオカルマイシンコンジュゲートが、ヌードマウスのＮ８７（つまり、ＨＥＲ２ ＩＨＣ（免疫組織化学）３＋胃腫瘍）異種移植片に対して試験された。結果は、国際公開第２０１１／１３３０３９号パンフレットの図４Ａ、４Ｂ、及び４Ｃに示されている。１２ｍｇ／Ｋｇ ｉ．ｖ．の単一用量による処置後、６つ全てのＡＤＣは、体重に影響を及ぼすことなく、抗体トラスツズマブそれ自体及び対照ビヒクルと比較して、腫瘍容積を低減させ、生存率を向上させた。
国際公開第２０１５／１０４３８５号パンフレットには、ＨＥＲ２を発現するヒト固形腫瘍及び血液学的悪性腫瘍の治療に使用するためのデュオカルマイシン含有ＡＤＣが開示されている。
当技術分野に記載されているデュオカルマイシン及びその誘導体を、本発明の目的のために使用することができる。
本発明は、部分的には、ＤＮＡアルキル化ＡＤＣ及びＡＴＲ阻害剤の組合せ利益の発見から導き出された。驚くべきことに、本発明の組合せは、併用処置のみよりも優れていることが示された。本発明者らは、この組合せの強化効果が、細胞培養及びｉｎ ｖｉｖｏモデルにおいて相乗的であることを示した。
従って、一態様では、本発明は、それを必要とする対象のがんを治療するための方法であって、対象にＤＮＡアルキル化ＡＤＣ及びＡＴＲ阻害剤を投与することを含む方法で使用するためのＤＮＡアルキル化ＡＤＣ及びＡＴＲ阻害剤を提供する。同様に、本発明は、それを必要とする対象のがんを治療するための方法であって、対象にＤＮＡアルキル化ＡＤＣ及びＡＴＲ阻害剤を投与することを含む方法における本組合せの使用を提供する。同様に、本発明は、対象にＤＮＡアルキル化ＡＤＣ及びＡＴＲ阻害剤を投与することを含む、それを必要とする対象のがんを治療するための薬剤を製造するための、ＤＮＡアルキル化ＡＤＣ及びＡＴＲ阻害剤の使用を提供する。
本発明の全ての実施形態では、治療有効量のＤＮＡアルキル化ＡＤＣ及びＡＴＲ阻害剤が適用されることが理解されるべきである。
一部の態様では、ＡＴＲ阻害剤は、式Ａ－Ｉ：
Figure 2022505041000003
 により表される化合物、又はその薬学的に許容される塩であり、
式中、
Ｒ1は、窒素、酸素、及び硫黄からなる群から独立して選択される０～４つのヘテロ原子を有する５～６員単環式アリール又はヘテロアリール環であり、単環式アリール又はヘテロアリール環は、別の環と縮合して、窒素、酸素、及び硫黄からなる群から独立して選択される０～６つのヘテロ原子を有する８～１０員二環式アリール又はヘテロアリール環を形成してもよく、各Ｒ1は、１～５つのＪ1基で置換されていてもよく、
Ｒ2は、窒素、酸素、及び硫黄からなる群から独立して選択される０～３つのヘテロ原子を有する５～６員単環式アリール又はヘテロアリール環であり、単環式アリール又はヘテロアリール環は、別の環と縮合して、窒素、酸素、及び硫黄からなる群から独立して選択される０～４つのヘテロ原子を有する８～１０員二環式アリール又はヘテロアリール環を形成してもよく、各Ｒ2は、１～５つのＪ2基で置換されていてもよく、
Ｌは、－Ｃ（Ｏ）ＮＨ－又は－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｃ1-6アルキル）－であり、
ｎは、０又は１であり、
各Ｊ1及びＪ2は、独立して、ハロ、－ＣＮ、－ＮＯ2、－Ｖ1－Ｒ、又は－（Ｖ2）m－Ｑであり、
Ｖ1は、Ｃ1-10脂肪族鎖であり、０～３つのメチレン単位が、独立して、Ｏ、ＮＲ’’、Ｓ、Ｃ（Ｏ）、Ｓ（Ｏ）、又はＳ（Ｏ）2で置き換えられていてもよく、Ｖ1は、ＪV1の１～６つの出現で置換されていてもよく、
Ｖ2は、Ｃ1-10脂肪族鎖であり、０～３つのメチレン単位が、独立して、Ｏ、ＮＲ’’、Ｓ、Ｃ（Ｏ）、Ｓ（Ｏ）、又はＳ（Ｏ）2で置き換えられていてもよく、Ｖ2は、ＪV2の１～６つの出現で置換されていてもよく、
ｍは、０又は１であり、
Ｑは、窒素、酸素、及び硫黄からなる群から独立して選択される０～４つのヘテロ原子を有する３～８員の飽和若しくは不飽和単環式環であるか、又は窒素、酸素、及び硫黄からなる群から独立して選択される０～６つのヘテロ原子を有する９～１０員の飽和若しくは不飽和二環式環であり、各Ｑは、０～５つのＪQで置換されていてもよく、
各ＪV1又はＪV2は、独立して、ハロゲン、ＣＮ、ＮＨ2、ＮＯ2、Ｃ1-4脂肪族、ＮＨ（Ｃ1-4脂肪族）、Ｎ（Ｃ1-4脂肪族）2、ＯＨ、Ｏ（Ｃ1-4脂肪族）、ＣＯ2Ｈ、ＣＯ2（Ｃ1-4脂肪族）、Ｃ（Ｏ）ＮＨ2、Ｃ（Ｏ）ＮＨ（Ｃ1-4脂肪族）、Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｃ1-4脂肪族）2、ＮＨＣＯ（Ｃ1-4脂肪族）、Ｎ（Ｃ1-4脂肪族）ＣＯ（Ｃ1-4脂肪族）、ＳＯ2（Ｃ1-4脂肪族）、ＮＨＳＯ2（Ｃ1-4脂肪族）、又はＮ（Ｃ1-4脂肪族）ＳＯ2（Ｃ1-4脂肪族）であり、Ｃ1-4脂肪族は、ハロで置換されていてもよく、
Ｒは、Ｈ又はＣ1-6脂肪族であり、Ｃ1-6脂肪族は、ＮＨ2、ＮＨ（Ｃ1-4脂肪族）、Ｎ（Ｃ1-4脂肪族）2、ハロゲン、Ｃ1-4脂肪族、ＯＨ、Ｏ（Ｃ1-4脂肪族）、ＮＯ2、ＣＮ、ＣＯ2Ｈ、ＣＯ2（Ｃ1-4脂肪族）、ＣＯ（Ｃ1-4脂肪族）、Ｏ（ハロＣ1-4脂肪族）、又はハロＣ1-4脂肪族の１～４つの出現で置換されていてもよく、
各ＪQは、独立して、ハロ、オキソ、ＣＮ、ＮＯ2、Ｘ－Ｒ、又は－（Ｘ）p－Ｑ4であり、
ｐは、０又は１であり、
Ｘは、Ｃ1-10脂肪族であり、Ｃ1-6脂肪族の１～３つのメチレン単位は、－ＮＲ、－Ｏ－、－Ｓ－、Ｃ（Ｏ）、Ｓ（Ｏ）2、又はＳ（Ｏ）で置き換えられていてもよく、Ｘは、独立して、ＮＨ2、ＮＨ（Ｃ1-4脂肪族）、Ｎ（Ｃ1-4脂肪族）2、ハロゲン、Ｃ1-4脂肪族、ＯＨ、Ｏ（Ｃ1-4脂肪族）、ＮＯ2、ＣＮ、ＣＯ（Ｃ1-4脂肪族）、ＣＯ2Ｈ、ＣＯ2（Ｃ1-4脂肪族）、Ｃ（Ｏ）ＮＨ2、Ｃ（Ｏ）ＮＨ（Ｃ1-4脂肪族）、Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｃ1-4脂肪族）2、ＳＯ（Ｃ1-4脂肪族）、ＳＯ2（Ｃ1-4脂肪族）、ＳＯ2ＮＨ（Ｃ1-4脂肪族）、ＳＯ2Ｎ（Ｃ1-4脂肪族）2、ＮＨＣ（Ｏ）（Ｃ1-4脂肪族）、Ｎ（Ｃ1-4脂肪族）Ｃ（Ｏ）（Ｃ1-4脂肪族）の１～４つの出現で置換されていてもよく、Ｃ1-4脂肪族は、ハロの１～３つの出現で置換されていてもよく、
Ｑ4は、窒素、酸素、及び硫黄からなる群から独立して選択される０～４つのヘテロ原子を有する３～８員の飽和若しくは不飽和単環式環であるか、又は窒素、酸素、及び硫黄からなる群から独立して選択される０～６つのヘテロ原子を有する８～１０員の飽和若しくは不飽和二環式環であり、各Ｑ4は、１～５つのＪQ4で置換されていてもよく、
ＪQ4は、ハロ、ＣＮ、又はＣ1-4アルキルであり、最大２つのメチレン単位が、Ｏ、ＮＲ*、Ｓ、Ｃ（Ｏ）、Ｓ（Ｏ）、又はＳ（Ｏ）2で置き換えられていてもよく、
Ｒは、Ｈ又はＣ1-4アルキルであり、Ｃ1-4アルキルは、１～４つのハロで置換されていてもよく、
Ｒ’’及びＲ*は、各々独立して、Ｈであるか、Ｃ1-4アルキルであるか、又は存在せず、Ｃ1-4アルキルは、１～４つのハロで置換されていてもよい。
一部の実施形態では、Ｌは、－Ｃ（Ｏ）ＮＨ－であり、Ｒ1及びＲ2は、フェニルである。
別の実施形態では、ＡＴＲ阻害剤は、式Ａ－Ｉ－ａ：
Figure 2022505041000004
 により表される化合物、又はその薬学的に許容される塩であり、
式中、
環Ａは、
Figure 2022505041000005
 又は
Figure 2022505041000006
 であり、
Ｊ5ｏは、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｃ1-4脂肪族、Ｏ（Ｃ1-3脂肪族）、又はＯＨであり、
Ｊ5ｐは、
Figure 2022505041000007
 であり、
Ｊ5ｐ1は、Ｈ、Ｃ1-4脂肪族、オキセタニル、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロピラニルであり、Ｊ5ｐ1は、ＯＨ又はハロの１～２つの出現で置換されていてもよく、
Ｊ5ｐ2は、Ｈ、メチル、エチル、ＣＨ2Ｆ、ＣＦ3、又はＣＨ2ＯＨであり、
Ｊ2ｏは、Ｈ、ＣＮ、又はＳＯ2ＣＨ3であり、
Ｊ2ｍは、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、又はメチルであり、
Ｊ2ｐは、－ＳＯ2（Ｃ1-6アルキル）、－ＳＯ2（Ｃ3-6シクロアルキル）、－ＳＯ2（４～６員ヘテロシクリル）、－ＳＯ2（Ｃ1-4アルキル）Ｎ（Ｃ1-4アルキル）2、又は－ＳＯ2（Ｃ1-4アルキル）－（４～６員ヘテロシクリル）であり、ヘテロシクリルは、酸素、窒素、及び硫黄からなる群から選択される１つのヘテロ原子を含み、Ｊ2ｐは、ハロ、ＯＨ、又はＯ（Ｃ1-4アルキル）の１～３つの出現で置換されていてもよい。
一部の実施形態では、環Ａは、
Figure 2022505041000008
 である。
他の実施形態では、環Ａは、
Figure 2022505041000009
 である。
一部の好ましい実施形態では、ＡＴＲ阻害剤は、下記式（化合物１）：
Figure 2022505041000010
 により表される化合物、又はその薬学的に許容される塩である。化合物１は、３－［３－（４－メチルアミノメチル－フェニル）－イソオキサゾール－５－イル］－５－［４－（プロパン－２－スルホニル）－フェニル］－ピラジン－２－イルアミンとも呼ばれる。
別の態様では、ＡＴＲ阻害剤は、式Ａ－ＩＩ：
Figure 2022505041000011
 により表されるか、又はその薬学的な塩若しくは誘導体であり、
式中、
Ｒ10は、フルオロ、クロロ、又は－Ｃ（Ｊ10）2ＣＮから選択され、
Ｊ10は、独立して、Ｈ若しくはＣ1-2アルキルであるか、又は
Ｊ10の２つの出現は、それらが付着している炭素原子と一緒になって、３～４員の置換されていてもよい炭素環式環を形成し、
Ｒ20は、Ｈ；ハロ；－ＣＮ；ＮＨ2；フルオロの０～３つの出現で置換されていてもよいＣ1-2アルキル；又はＣ1-3脂肪族鎖であり、脂肪族鎖の最大で２つのメチレン単位は、－Ｏ－、－ＮＲa－、－Ｃ（Ｏ）－、又は－Ｓ（Ｏ）zで置き換えられていてもよく、
Ｒ3は、Ｈ；ハロ；ハロの１～３つの出現で置換されていてもよいＣ1-4アルキル；Ｃ3-4シクロアルキル；－ＣＮ；又はＣ1-3脂肪族鎖であり、脂肪族鎖の最大で２つのメチレン単位は、－Ｏ－、－ＮＲa－、－Ｃ（Ｏ）－、又は－Ｓ（Ｏ）zで置き換えられていてもよく、
Ｒ4は、Ｑ1若しくはＣ1-10脂肪族鎖であり、脂肪族鎖の最大で４つのメチレン単位は、－Ｏ－、－ＮＲa－、－Ｃ（Ｏ）－、若しくは－Ｓ（Ｏ）z－で置き換えられていてもよく、各Ｒ4は、ＪQ1の０～５つの出現で置換されていてもよいか、又は
Ｒ3及びＲ4は、それらが結合している原子と一緒になって、酸素、窒素、及び硫黄からなる群から選択される０～２つのヘテロ原子を有する５～６員芳香族又は非芳香族環を形成し、Ｒ3及びＲ4により形成される環は、ＪZの０～３つの出現で置換されていてもよく、
Ｑ1は、酸素、窒素、及び硫黄からなる群から選択される０～３つのヘテロ原子を有する３～７員の完全飽和、部分的不飽和、若しくは芳香族単環式環であるか、又は酸素、窒素、及び硫黄からなる群から選択される０～５つのヘテロ原子を有する７～１２員の完全飽和、部分的不飽和、若しくは芳香族二環式環であり、
ＪZは、独立して、Ｃ1-6脂肪族、＝Ｏ、ハロ、又は→Ｏであり、
ＪQ1は、独立して、－ＣＮ、ハロ、＝Ｏ、Ｑ2、若しくはＣ1-8脂肪族鎖であり、脂肪族鎖の最大で３つのメチレン単位は、－Ｏ－、－ＮＲa－、－Ｃ（Ｏ）－、若しくは－Ｓ（Ｏ）z－で置き換えられていてもよく、ＪQ1の各出現は、ＪRの０～３つの出現で置換されていてもよいか、又は
同じ原子にあるＪQ1の２つの出現は、それらが接合している原子と一緒になって、酸素、窒素、及び硫黄からなる群から選択される０～２つのヘテロ原子を有する３～６員環を形成し、ＪQ1の２つの出現により形成される環は、Ｊxの０～３つの出現で置換されていてもよいか、又は
ＪQ1の２つの出現は、Ｑ1と一緒になって、６～１０員の飽和若しくは部分的不飽和架橋環系を形成し、
Ｑ2は、酸素、窒素、若しくは硫黄から選択される０～３つのヘテロ原子を有する３～７員の完全飽和、部分的不飽和、若しくは芳香族単環式環、又は酸素、窒素、若しくは硫黄から選択される０～５つのヘテロ原子を有する７～１２員の完全飽和、部分的不飽和、若しくは芳香族二環式環から独立して選択され、
ＪRは、独立して、－ＣＮ、ハロ、＝Ｏ、→Ｏ、Ｑ3、若しくはＣ1-6脂肪族鎖であり、脂肪族鎖の最大で３つのメチレン単位は、－Ｏ－、－ＮＲa－、－Ｃ（Ｏ）－、若しくは－Ｓ（Ｏ）z－で置き換えられていてもよく、各ＪRは、ＪTの０～３つの出現で置換されていてもよいか、又は
同じ原子にあるＪRの２つの出現は、それらが接合している原子と一緒になって、酸素、窒素、若しくは硫黄から選択される０～２つのヘテロ原子を有する３～６員環を形成し、ＪRの２つの出現により形成される環は、Ｊxの０～３つの出現で置換されていてもよいか、又は
ＪRの２つの出現は、Ｑ2と一緒になって、６～１０員の飽和若しくは部分的不飽和架橋環系を形成し、
Ｑ3は、酸素、窒素、及び硫黄からなる群から選択される０～３つのヘテロ原子を有する３～７員の完全飽和、部分的不飽和、若しくは芳香族単環式環であるか、又は酸素、窒素、及び硫黄からなる群から選択される０～５つのヘテロ原子を有する７～１２員の完全飽和、部分的不飽和、若しくは芳香族二環式環であり、
ＪXは、独立して、－ＣＮ、＝Ｏ、ハロ、又はＣ1-4脂肪族鎖であり、脂肪族鎖の最大で２つのメチレン単位は、－Ｏ－、－ＮＲa－、－Ｃ（Ｏ）－、又は－Ｓ（Ｏ）z－で置き換えられていてもよく、
ＪTは、独立して、ハロ、－ＣＮ、→Ｏ；＝Ｏ、－ＯＨ、Ｃ1-6脂肪族鎖であり、脂肪族鎖の最大で２つのメチレン単位は、－Ｏ－、－ＮＲa－、－Ｃ（Ｏ）－、若しくは－Ｓ（Ｏ）z－で置き換えられていてもよいか、又は酸素、窒素、及び硫黄からなる群から選択される０～２つのヘテロ原子を有する３～６員非芳香族環であり、ＪTの各出現は、ＪMの０～３つの出現で置換されていてもよいか、或いは
同じ原子にあるＪTの２つの出現は、それらが接合している原子と一緒になって、酸素、窒素、及び硫黄からなる群から選択される０～２つのヘテロ原子を有する３～６員環を形成するか、或いは
ＪTの２つの出現は、Ｑ3と一緒になって、６～１０員の飽和若しくは部分的不飽和架橋環系を形成し、
ＪMは、独立して、ハロ又はＣ1-6脂肪族であり、
ｚは、０、１、又は２であり、
Ｒaは、独立して、Ｈ又はＣ1-4脂肪族である。
一部の実施形態では、Ｒ10及びＲ3はフルオロである。
他の実施形態では、Ｒ4はＱ1である。
更に他の実施形態では、Ｑ1は、独立して、ピペリジニル及びイミダゾリルである。
別の実施形態では、ＡＴＲ阻害剤は、式Ａ－ＩＩ－ａ：
Figure 2022505041000012
 により表されるか、又はその薬学的に許容される塩若しくはプロドラッグであり、
式中、
Ｒ10は、フルオロ、クロロ、又は－Ｃ（Ｊ10）2ＣＮであり、
Ｊ10は、独立して、Ｈ若しくはＣ1-2アルキルであるか、又は
Ｊ10の２つの出現は、それらが付着している炭素原子と一緒になって、置換されていてもよい３～４員炭素環式環を形成し、
Ｒ3は、Ｈ；クロロ；フルオロ；ハロの１～３つの出現で置換されていてもよいＣ1-4アルキル；Ｃ3-4シクロアルキル；－ＣＮ；又はＣ1-3脂肪族鎖であり、脂肪族鎖の最大で２つのメチレン単位は、－Ｏ－、－ＮＲa－、－Ｃ（Ｏ）－、又は－Ｓ（Ｏ）zで置き換えられていてもよく、
Ｌ1は、Ｈ；酸素、窒素、及び硫黄からなる群から選択される０～２つのヘテロ原子を有する３～７員芳香族若しくは非芳香族環；又はＣ1-6脂肪族鎖であり、脂肪族鎖の最大で２つのメチレン単位は、－Ｏ－、－ＮＲa－、－Ｃ（Ｏ）－、又は－Ｓ（Ｏ）zで置き換えられていてもよく、各Ｌ1は、Ｃ1-4脂肪族；－ＣＮ；ハロ；－ＯＨ；又は酸素、窒素、及び硫黄からなる群から選択される０～２つのヘテロ原子を有する３～６員非芳香族環で置換されていてもよく、
Ｌ2は、Ｈ；酸素、窒素、及び硫黄からなる群から選択される０～２つのヘテロ原子を有する３～７員芳香族若しくは非芳香族環；又はＣ1-6脂肪族鎖であり、脂肪族鎖の最大で２つのメチレン単位は、－Ｏ－、－ＮＲa－、－Ｃ（Ｏ）－、又は－Ｓ（Ｏ）zで置き換えられていてもよく、各Ｌ2は、Ｃ1-4脂肪族；－ＣＮ；ハロ；－ＯＨ；又は酸素、窒素、及び硫黄からなる群から選択される０～２つのヘテロ原子を有する３～６員非芳香族環で置換されていてもよいか、或いは
Ｌ1及びＬ2は、それらが付着している窒素と一緒になって環Ｄを形成し、環Ｄは、ＪGの０～５つの出現で置換されていてもよく、
Ｌ3は、Ｈ、Ｃ1-3脂肪族、又はＣＮであり、
環Ｄは、酸素、窒素、及び硫黄からなる群から選択される１～２つのヘテロ原子を有する３～７員ヘテロシクリル環であるか、又は酸素、窒素、及び硫黄からなる群から選択される１～５つのヘテロ原子を有する７～１２員の完全飽和若しくは部分的不飽和二環式環であり、
ＪGは、独立して、ハロ；－ＣＮ；－Ｎ（Ｒ゜）2；→Ｏ；３～６員カルボシクリル；酸素、窒素、及び硫黄からなる群から選択される１～２つのヘテロ原子を有する３～６員ヘテロシクリル；若しくはＣ1-4アルキル鎖であり、アルキル鎖の最大で２つのメチレン単位は、－Ｏ－、－ＮＲa－、－Ｃ（Ｏ）－、若しくは－Ｓ（Ｏ）zで置き換えられていてもよく、各ＪGは、ＪKの０～２つの出現で置換されていてもよいか、
同じ原子にあるＪGの２つの出現は、それらが接合している原子と一緒になって、酸素、窒素、及び硫黄からなる群から選択される０～２つのヘテロ原子を有する３～６員環を形成するか、又は
ＪGの２つの出現は、環Ｄと一緒になって、６～１０員の飽和若しくは部分的不飽和架橋環系を形成し、
ＪKは、酸素、窒素、及び硫黄からなる群から選択される０～２つのヘテロ原子を有する３～７員芳香族又は非芳香族環であり、
ｚは、０、１、又は２であり、
Ｒa及びＲ°は、独立して、Ｈ又はＣ1-4アルキルである。
別の実施形態では、Ｒ10及びＲ3は、フルオロである。
他の好ましい実施形態では、ＡＴＲ阻害剤は、下記式（化合物２）：
Figure 2022505041000013
 により表される化合物、又はその薬学的に許容される塩である。化合物２は、２－アミノ－６－フルオロ－Ｎ－（５－フルオロ－４－｛４－［４－（オキセタン－３－イル）ピペラジン－１－カルボニル］ピペリジン－１－イル｝ピリジン－３－イル）ピラゾロ［１，５－ａ］ピリミジン－３－カルボキサミドとも呼ばれる。
一部の好ましい実施形態では、ＡＴＲ阻害剤は、下記式（化合物３）：
Figure 2022505041000014
 により表される化合物、又はその薬学的に許容される塩である。化合物３は、２－アミノ－６－フルオロ－Ｎ－［５－フルオロ－４－（１－メチル－１Ｈ－イミダゾール－５－イル）ピリジン－３－イル］ピラゾロ［１，５－ａ］ピリミジン－３－カルボキサミドとも呼ばれる。
別の好ましいＡＴＲ阻害剤は、セララセルチブ（ｃｅｒａｌａｓｅｒｔｉｂ）（ＣＡＳ登録番号１３５２２２６－８８－０）としても知られているＡＺＤ６７３８、又はその薬学的に許容される塩である。これは、化学式４－｛４－［（３Ｒ）－３－メチルモルホリン－４－イル］－６－［１－（Ｓ－メチルスルホンイミドイル）シクロプロピル］ピリミジン－２－イル｝－１Ｈ－ピロロ［２，３－ｂ］ピリジンを有し、以下の式（化合物４）：
Figure 2022505041000015
 により表されるか、又はその薬学的に許容される塩である。
別の好ましいＡＴＲ阻害剤は、化学式２－［（３Ｒ）－３－メチルモルホリン－４－イル］－４－（１－メチル－１Ｈ－ピラゾール－５－イル）－８－（１Ｈ－ピラゾール－５－イル）－１，７－ナフチリジンを有し、以下の式（化合物５）：
Figure 2022505041000016
 により表されるか、又はその薬学的に許容される塩である。
一部の実施形態では、ＡＴＲ阻害剤は、以下の群：
Figure 2022505041000017
 又はそれらの薬学的に許容される塩から選択される。
本発明の併用療法で使用することができるＡＴＲ阻害剤の更なる好ましい例は、下記の式Ｉ：
Figure 2022505041000018
 の化合物であって、式中、
Ｒ1は、Ｃ（ＣＨ3）2ＳＯ2Ａ’、ＣＨ2ＯＳＯ2Ａ’、Ｃ（ＣＨ3）2ＯＨ、－［Ｃ（Ｒ3）2］nＨｅｔ1、又は１－メチルスルホニル－シクロプロパ－１－イルを示し、
Ｒ2は、Ｈｅｔ2、ＮＲ3（ＣＨ2）nＨｅｔ2、ＯＨｅｔ2、Ａｒ1、ＣＯＮＨＨｅｔ3、ＣＯＨｅｔ3、又はＣＯＮＨＡを示し、
Ｒ3は、Ｈ又はＡ’を示し、
Ｈｅｔ1は、イミダゾリル、ピラゾリル、トリアゾリル、又はピリジルを示し、これらの各々は、未置換であるか、又はＣＯＯＨ、ＣＯＯＡ’、ＣＨ2ＯＨ、ＣＨ2ＯＡ’、若しくはＡにより一置換されており、
Ｈｅｔ2は、１Ｈ－ピロロ［２，３－ｂ］ピリジニル、１Ｈ－ピロロ［２，３－ｃ］ピリジニル、インドリル、ベンズイミダゾリル、イミダゾリル、１，２，３，４－テトラヒドロイソキノリル、ピリジル、トリアゾリル、ピラゾリル、キノリル、イソキノリル、キナゾリニル、又は１，３－ジヒドロ－２ラムダ６－２，２－ジオキソ－１－ベンゾチアゾリルを示し、これらの各々は、未置換であるか、又はＨａｌ、Ａ’、－［Ｃ（Ｒ3）2］nＯＲ3、ＣＯＮＨ2、ＳＯ2フェニル、ベンジル、ＣＮ、－［Ｃ（Ｒ3）2］nＮＨ2、－［Ｃ（Ｒ3）2］nＮＨＡ、オキセタニル－ＮＨ－、及び／若しくはＮＨＣＯＡにより一置換若しくは二置換されており、
Ｈｅｔ3は、トリアゾリル、ピリダジニル、ピリミジニル、ピラゾリル、又はピロリジニルを示し、これらの各々は、未置換であるか、又は－［Ｃ（Ｒ3）2］nＯＲ3、－［Ｃ（Ｒ3）2］nＮＨ2、若しくは＝Ｏにより一置換されており、
Ａｒ1は、－［Ｃ（Ｒ3）2］nＯＲ3により一置換されているフェニル、イミダゾリル、
－［Ｃ（Ｒ3）2］nＮＨ2、ピラゾリル、アジリジニル、又はオキセタニルを指し、これらの各々は、未置換であるか、又は－［Ｃ（Ｒ3）2］nＯＲ3若しくは－［Ｃ（Ｒ3）2］nＮＨ2により一置換されており、
Ａは、１～７つのＨ原子が、ＯＨ、Ｆ、Ｃｌ、及び／若しくはＢｒで置き換えられていてもよく、並びに／又は１つ若しくは２つの非隣接ＣＨ2基が、Ｏ及び／若しくはＮＨ基により置き換えられていてもよい、１～６つのＣ原子を有する非分岐又は分岐アルキルを示し、
Ａ’は、１～４つのＣ原子を有する非分岐又は分岐アルキルを示し、
Ｈａｌは、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、又はＩを示し、
ｎは、０、１、２、又は３を示す化合物、
並びにそれらの薬学的に許容される塩、互変異性体、及び立体異性体であり、これらのあらゆる比の混合物を含む。
好ましい実施形態では、Ｒ1は、Ｃ（ＣＨ3）2ＳＯ2Ａ’又はＣ（ＣＨ3）2ＯＨを示す。
更に好ましい実施形態では、Ｒ2は、Ｈｅｔ2を示す。
更に好ましい実施形態では、Ｒ3は、Ｈを示す。
更に好ましい実施形態では、Ａは、１～５つのＨ原子がＯＨ及び／又はＦで置き換えられていてもよい、１～６つのＣ原子を有する非分岐又は分岐アルキルを示す。
更に好ましい実施形態では、Ｈｅｔ2は、１Ｈ－ピロロ［２，３－ｂ］ピリジニル、１Ｈ－ピロロ［２，３－ｃ］ピリジニル、インドリル、ベンズイミダゾリル、又はイミダゾリルを示し、これらの各々は、Ｈａｌ、－［Ｃ（Ｒ3）2］nＮＨ2、及び／又は－［Ｃ（Ｒ3）2］nＮＨＡにより一置換又は二置換されている。
更に好ましい実施形態では、Ｒ1は、Ｃ（ＣＨ3）2ＳＯ2Ａ’又はＣ（ＣＨ3）2ＯＨを示し、
Ｒ2は、Ｈｅｔ2を示し、
Ｈｅｔ2は、１Ｈ－ピロロ［２，３－ｂ］ピリジニル、１Ｈ－ピロロ［２，３－ｃ］ピリジニル、インドリル、ベンズイミダゾリル、又はイミダゾリルを示し、これらの各々は、未置換であるか、又はＨａｌ、ＯＨ、－［Ｃ（Ｒ3）2］nＮＨ2、－［Ｃ（Ｒ3）2］nＮＨＡ、オキセタニル－ＮＨ－、及び／若しくはＮＨＣＯＡにより一置換若しくは二置換されており、
Ａは、１～５つのＨ原子がＯＨ及び／又はＦで置き換えられていてもよい、１～６つのＣ原子を有する非分岐又は分岐アルキルを示し、
Ａ’は、１～４つのＣ原子を有する非分岐又は分岐アルキルを示し、
Ｈａｌは、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、又はＩを示し、
ｎは、０、１、２、又は３を示す。
更に好ましい実施形態では、Ｒ1は、Ｃ（ＣＨ3）2ＳＯ2ＣＨ3又はＣ（ＣＨ3）2ＯＨを示し、Ｒ2はＨｅｔ2を示し、Ｒ3はＨを示し、Ｈｅｔ2は、１Ｈ－ピロロ［２，３－ｂ］ピリジニル、１Ｈ－ピロロ［２，３－ｃ］ピリジニル、インドリル、ベンズイミダゾリル、又はイミダゾリルを示し、これらの各々は、Ｈａｌ、－［Ｃ（Ｒ3）2］nＮＨ2、及び／又は－［Ｃ（Ｒ3）2］nＮＨＡにより一置換又は二置換されており、Ａは、１～５つのＨ原子がＯＨ及び／又はＦで置き換えられていてもよい、１～６つのＣ原子を有する非分岐又は分岐アルキルを示し、Ａ’は、１～４つのＣ原子を有する非分岐又は分岐アルキルを示し、Ｈａｌは、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、又はＩを示し、ｎは、０、１、２、又は３を示す。
本発明のＡＴＲｉの特に好ましい実施形態は、下記に図示されているもの：
Figure 2022505041000019
Figure 2022505041000020
Figure 2022505041000021
Figure 2022505041000022
Figure 2022505041000023
Figure 2022505041000024
Figure 2022505041000025
Figure 2022505041000026
Figure 2022505041000027
Figure 2022505041000028
Figure 2022505041000029
Figure 2022505041000030
Figure 2022505041000031
Figure 2022505041000032
Figure 2022505041000033
Figure 2022505041000034
Figure 2022505041000035
 並びにそれらの薬学的に許容される溶媒和物、塩、互変異性体、及び立体異性体であり、これらのあらゆる比の混合物を含む。
本発明で使用可能なＡＴＲｉの更に好ましい実施形態は、表６に図示されている。
一実施形態では、本発明の療法組合せは、ヒト対象の治療に使用される。療法組合せによる治療で予想される主な利益は、こうしたヒト患者のリスク／ベネフィット比の増大である。
種々の実施形態では、本発明の療法組合せは、第１選択治療、第２選択治療、第３選択治療、又はそれ以降の選択治療として使用される。選択治療とは、患者が受けとる様々な薬剤又は他の療法による治療の順序の位置づけを指す。第１選択療法レジメンは、最初に行われる治療であり、第２又は第３選択療法は、それぞれ第１選択療法後に又は第２選択療法後に行われる。従って、第１選択療法は、疾患又は状態の最初の治療である。がんを有する患者では、第１選択療法は、一次療法又は一次治療と呼ばれることもあり、手術、化学療法、放射線療法、又はそうした療法の組合せであってもよい。典型的には、患者が、肯定的な臨床転帰を示さなかったか、又は第１若しくは第２選択療法に対して不顕性応答しか示さなかったか、又は肯定的な臨床応答を示したが後に再発を経験し、場合によっては疾患が、より初期の肯定的応答を誘発したより初期の療法に対して今や耐性であるかのいずれかであったため、患者には、その後の化学療法レジメン（第２又は第３選択療法）が行われる。
ＡＴＲ阻害剤とＤＮＡアルキル化ＡＤＣとでは作用様式が異なるため、免疫関連有害事象が増強される可能性は低い。非臨床知見又は公表されている臨床結果には重複する免疫特徴が存在しないため、本発明の併用療法が、単独で投与された場合にこうした作用剤で一般に観察されるものよりも大きな有害事象の増強を示すリスクは低い。ＤＮＡアルキル化ＡＤＣ及びＡＴＲ阻害剤、好ましくは本発明の化合物１又は２の、各々の場合で単剤として特定されている潜在的なリスクは、同様に併用治療の潜在的なリスクでもあるとみなされる。
本発明の療法組合せは、より後期の選択治療、特にがんの第２選択治療又はより高次の治療に適用されることが好ましい。対象が少なくとも１ラウンドの従前のがん療法を受けている限り、従前の療法の数に制限はない。従前のがん療法のラウンドとは、例えば、１つ又は複数の化学療法剤、放射線療法、又は化学放射線療法で対象を治療するための規定のスケジュール／段階であって、対象が、予定より早く終了したか又は中止されたかのいずれかで、そのような以前の治療がうまくいかなかったものを指す。１つの理由は、がんが従前の療法に耐性だったか又は耐性になったためであってもよい。がん患者を治療するための現行の標準治療（ＳｏＣ）には、毒性であり古い化学療法レジメンでの投与が伴うことが多い。ＳｏＣは、生活の質に干渉する可能性が高い強力な有害事象（二次がんなど）のリスクが高いことに関連付けられる。一実施形態では、ＡＴＲ阻害剤とＤＮＡアルキル化剤との組合せは、単剤及び／又は多剤化学療法、放射線療法、又は化学放射線療法に耐性であるがんを有する患者において、ＳＯＣ化学療法と同様に有効であり、それよりも良好に耐容性であり得る。
一部の実施形態では、ＡＴＲ阻害剤は、静脈内又は経口投与される。一部の実施形態では、ＡＴＲ阻害剤は、持続注入により投与される。化合物１又はその薬学的に許容される塩は、好ましくは静脈内投与される。化合物２又はその薬学的に許容される塩、化合物３又はその薬学的に許容される塩、及び化合物４又はその薬学的に許容される塩は、好ましくは経口投与される。一部の実施形態では、併用療法で使用されるＡＴＲ阻害剤は、約２０ｍｇ／ｍ2～約３００ｍｇ／ｍ2、約３０ｍｇ／ｍ2～約２４０ｍｇ／ｍ2、約４０ｍｇ／ｍ2～約２４０ｍｇ／ｍ2、約４０ｍｇ／ｍ2～約１８０ｍｇ／ｍ2、約６０ｍｇ／ｍ2～約１２０ｍｇ／ｍ2、約８０ｍｇ／ｍ2～約１２０ｍｇ／ｍ2、約９０ｍｇ／ｍ2～約１２０ｍｇ／ｍ2、又は約８０ｍｇ／ｍ2～約１００ｍｇ／ｍ2の用量で投与してもよい。ある特定の実施形態では、ＡＴＲ阻害剤は、約４０ｍｇ／ｍ2～約３００ｍｇ／ｍ2（例えば、約２４０ｍｇ／ｍ2）の用量で投与してもよい。一部の場合では、ＡＴＲ阻害剤は、約６０ｍｇ／ｍ2～約１８０ｍｇ／ｍ2（例えば、約１２０ｍｇ／ｍ2）の用量で投与してもよい。ある特定の場合では、ＡＴＲ阻害剤は、約８０ｍｇ／ｍ2～約１００ｍｇ／ｍ2（例えば、約９０ｍｇ／ｍ2）の用量で投与してもよい。一部の実施形態では、ＡＴＲ阻害剤は、約４０ｍｇ／ｍ2、約６０ｍｇ／ｍ2、約９０ｍｇ／ｍ2、又は約１２０ｍｇ／ｍ2の用量で投与してもよい。好ましくは、療法組合せのＡＴＲ阻害剤は、約９０ｍｇ／ｍ2の用量で投与される。
一部の実施形態では、ＡＴＲ阻害剤は、化合物１又はその薬学的に許容される塩であり、約２０ｍｇ／ｍ2～約３００ｍｇ／ｍ2、約３０ｍｇ／ｍ2～約２４０ｍｇ／ｍ2、約４０ｍｇ／ｍ2～約２４０ｍｇ／ｍ2、約４０ｍｇ／ｍ2～約１８０ｍｇ／ｍ2、約６０ｍｇ／ｍ2～約１２０ｍｇ／ｍ2、約８０ｍｇ／ｍ2～約１２０ｍｇ／ｍ2、約９０ｍｇ／ｍ2～約１２０ｍｇ／ｍ2、又は約８０ｍｇ／ｍ2～約１００ｍｇ／ｍ2の用量で投与される。一部の実施形態では、化合物１又はその薬学的に許容される塩は、約４０ｍｇ／ｍ2、約６０ｍｇ／ｍ2、約９０ｍｇ／ｍ2、又は約１２０ｍｇ／ｍ2の用量で、好ましくは約９０ｍｇ／ｍ2の用量で投与される。
本明細書に記載のような併用療法で使用するための投薬量に関して上記で参照されている範囲の全ての組合せが可能であり得ることが理解されるべきである。加えて、併用療法で使用される２つの化合物の投薬を互いに適合させて、利便性及び服薬遵守を向上させることができる。
一部の実施形態では、組合せレジメンは、リード期、任意選択でそれに続いてリード期の終了後の維持期を含む。本明細書で使用される場合、併用治療は、規定の治療期間（つまり、第１の期又はリード期）を含む。そのような期間又は期の終了後、別の規定の治療期間（つまり、第２の期又は維持期）が続いてもよい。
ＡＴＲ阻害剤及びＤＮＡアルキル化ＡＤＣは、任意の順序で投与することができる。例えば、全てを、実質的に同時に投与してもよく又は順次投与してもよい。ＡＴＲ阻害剤及びＤＮＡアルキル化ＡＤＣは、別々の組成物、製剤、若しくは単位剤形にて任意の順序で患者に投与されるか、又は化合物は、１つの組成物、製剤、若しくは単位剤形にて一緒に投与される。
ある特定の実施形態では、患者は、更に放射線療法を得る。ある特定の実施形態では、放射線療法は、約３５～７０Ｇｙ／２０～３５分割を含む。一部の実施形態では、放射線療法は、標準的な分割化（週５日で１日当たり１．８～２Ｇｙ）、１日１回で最大５０～７０Ｇｙの総線量のいずれかで行われる。一実施形態では、定位放射線療法並びにガンマナイフが使用される。軽減設定では、他の分割スケジュール、例えば、５分割で２５Ｇｙ、１０分割で３０Ｇｙも広く使用されている。放射線療法の場合、治療期間は、放射線療法が行われる時間枠になるだろう。こうした介入は、電子、光子、及び陽子、アルファ放射体、又は他のイオンにより行われる治療に、放射性ヌクレオチドによる治療に、例えば、甲状腺がんを有する患者に行われる131Ｉによる治療に、並びにホウ素捕捉中性子療法で治療される患者に適用される。
例示的なそのような薬学的に許容される組成物は、下記に及び本明細書に更に記載されている。
典型的には、ＡＴＲ阻害剤又はＤＮＡアルキル化ＡＤＣは、対象への投与に好適な医薬組成物に組み込まれており、医薬組成物は、化合物及び薬学的に許容される担体を含む。多くの場合、組成物には、等張剤、例えば、糖；マンニトール、ソルビトール等の多価アルコール；又は塩化ナトリウムが含まれていることが好ましい。薬学的に許容される担体は、化合物の保管寿命又は有効性を増強する、湿潤剤若しくは乳化剤、保存剤、又は緩衝剤等の少量の補助物質を更に含んでいてもよい。
本発明の組成物は、様々な形態であってもよい。そうした形態として、例えば、液体溶液（例えば、注射用及び注入用の溶液）、分散物又は懸濁物、錠剤、丸剤、粉末、リポソーム、及び坐剤等の、液体剤形、半固体剤形、及び固体剤形が挙げられる。好ましい形態は、意図されている投与様式及び療法応用に依存する。好ましい実施形態では、ＤＮＡアルキル化ＡＤＣは、静脈内注入又は注射により投与される。別の好ましい実施形態では、ＤＮＡアルキル化ＡＤＣは、筋肉内又は皮下注射により投与される。好ましい実施形態では、ＡＴＲ阻害剤は、静脈内注入、注射、又は経口で投与される。
療法組成物は、典型的には、製造及び保管条件下で無菌及び安定でなければならない。組成物は、溶液、マイクロエマルジョン、分散物、リポソーム、又は高薬物濃度に好適な他の秩序構造として製剤化することができる。無菌注射用溶液は、上記に列挙されている成分の１つ又は組合せと共に必要量の活性化合物を適切な溶媒に組み込み、必要に応じて続いて濾過滅菌することにより調製することができる。一般に、分散物は、基本分散媒、及び上記に列挙されているものの必要な他の成分を含む無菌ビヒクルに有効成分を組み込むことにより調製される。無菌注射用溶液を調製するための無菌粉末の場合、好ましい調製方法は、その以前に滅菌濾過された溶液から有効成分＋任意の追加の所望の成分の粉末が得られる真空乾燥及び凍結乾燥である。溶液の適正な流動性は、例えば、レシチン等のコーティングを使用することにより、分散物の場合は、必要な粒子サイズを維持することにより、及び界面活性剤を使用することにより維持することができる。注射用組成物の長期吸収は、吸収を遅延させる作用剤、例えばモノステアリン酸塩及びゼラチンを組成物に含めることによりもたらすことができる。
更なる態様では、ＤＮＡアルキル化ＡＤＣ及びＡＴＲ阻害剤を含むキットが提供される。
更なる態様では、ＤＮＡアルキル化ＡＤＣ、及びＤＮＡアルキル化ＡＤＣをＡＴＲ阻害剤と組み合わせて使用して、対象のがんを治療又は進行を遅延させるための説明書を含む添付文書を含むキットが提供される。また、ＡＴＲ阻害剤、及びＡＴＲ阻害剤をＤＮＡアルキル化ＡＤＣと組み合わせて使用して、対象のがんを治療又は進行を遅延させるための説明書を含む添付文書を含むキットが提供される。キットは、第１の容器及び第２の容器及び添付文書を含んでいてもよく、第１の容器は、ＤＮＡアルキル化ＡＤＣを含む少なくとも１用量の薬剤を含み、第２の容器は、ＡＴＲ阻害剤を含む少なくとも１用量の薬剤を含み、添付文書は、薬剤を使用して対象のがんを治療するための説明書を含む。また、ＡＴＲ阻害剤及びＤＮＡアルキル化ＡＤＣは、単一の容器に含まれていてもよい。容器は、同じ又は異なる形状（例えば、バイアル、注射器、及びボトル）及び／又は材料（例えば、プラスチック又はガラス）で構成されていてもよい。キットは、希釈剤、フィルター、ＩＶバッグ及びライン、針、並びに注射器等の、薬剤を投与するのに有用であり得る他の材料を更に含んでいてもよい。
図２３は、デュオカルマイシンの幾つかの例を示す。
以下の配列を有する、ＣＨＫ１（ＣＨＥＫ１）、ＡＴＲ、ＰＬＫ１に対するｓｉＲＮＡ及び非標的指向性ｓｉＲＮＡのプールは、Ｄｈａｒｍａｃｏｎから購入した。
ｓｉゲノムヒトＣＨＥＫ１（１１１１）ＳＭＡＲＴプールｓｉＲＮＡ：
ＧＣＡＡＣＡＧＵＡＵＵＵＣＧＧＵＡＵＡ
ＧＧＡＣＵＵＣＵＣＵＣＣＡＧＵＡＡＡＣ
ＡＡＡＧＡＵＡＧＡＵＧＧＵＡＣＡＡＣＡ
ＡＧＡＵＡＵＧＡＡＧＣＧＵＧＣＣＧＵＡ
オンターゲット＋ヒトＡＴＲ（５４５）ＳＭＡＲＴプールｓｉＲＮＡ：
ＧＡＧＡＡＡＧＧＡＵＵＧＵＡＧＡＣＵＡ
ＧＣＡＡＣＵＣＧＣＣＵＡＡＣＡＧＡＵＡ
ＣＣＡＣＧＡＡＵＧＵＵＡＡＣＵＣＵＡＵ
ＣＣＧＣＵＡＡＵＣＵＵＣＵＡＡＣＡＵＵ
オンターゲット＋ヒトＰＬＫ１（５３４７）ＳＭＡＲＴプールｓｉＲＮＡ：
ＧＣＡＣＡＵＡＣＣＧＣＣＵＧＡＧＵＣＵ
ＣＣＡＣＣＡＡＧＧＵＵＵＵＣＧＡＵＵＧ
ＧＣＵＣＵＵＣＡＡＵＧＡＣＵＣＡＡＣＡ
ＵＣＵＣＡＡＧＧＣＣＵＣＣＵＡＡＵＡＧ
ｓｉＧｅｎｏｍｅ非標的指向性ｓｉＲＮＡプール＃１：
ＵＡＧＣＧＡＣＵＡＡＡＣＡＣＡＵＣＡＡ
ＵＡＡＧＧＣＵＡＵＧＡＡＧＡＧＡＵＡＣ
ＡＵＧＵＡＵＵＧＧＣＣＵＧＵＡＵＵＡＧ
ＡＵＧＡＡＣＧＵＧＡＡＵＵＧＣＵＣＡＡ
本発明で使用される抗体は、以下のアミノ酸配列を有する。
ａ）２００９年に薬物バンク受入エントリー（ｄｒｕｇ ｂａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｅｎｔｒｙ）ＤＢ０００７２により公表されているαＨＥＲ２抗体のアミノ酸配列。遺伝子改変は下線で表記されている。
重鎖：
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＮＩＫＤＴＹＩＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＲＩＹＰＴＮＧＹＴＲＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＡＤＴＳＫＮＴＡＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＳＲＷＧＧＤＧＦＹＡＭＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
ＳｒｔＡ認識モチーフを有する軽鎖：
ＭＫＬＰＶＲＬＬＶＬＭＦＷＩＰＡＳＬＳＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＤＶＮＴＡＶＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＳＡＳＦＬＹＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＲＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＨＹＴＴＰＰＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＬＰＥＴＧＳ
ｂ）αＥＧＦＲ抗体セツキシマブのアミノ酸配列。遺伝子改変は下線で表記されている。
天然重鎖：
ＱＶＱＬＫＱＳＧＰＧＬＶＱＰＳＱＳＬＳＩＴＣＴＶＳＧＦＳＬＴＮＹＧＶＨＷＶＲＱＳＰＧＫＧＬＥＷＬＧＶＩＷＳＧＧＮＴＤＹＮＴＰＦＴＳＲＬＳＩＮＫＤＮＳＫＳＱＶＦＦＫＭＮＳＬＱＳＮＤＴＡＩＹＹＣＡＲＡＬＴＹＹＤＹＥＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＡＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
ＳｒｔＡ認識モチーフを有する重鎖：
ＱＶＱＬＫＱＳＧＰＧＬＶＱＰＳＱＳＬＳＩＴＣＴＶＳＧＦＳＬＴＮＹＧＶＨＷＶＲＱＳＰＧＫＧＬＥＷＬＧＶＩＷＳＧＧＮＴＤＹＮＴＰＦＴＳＲＬＳＩＮＫＤＮＳＫＳＱＶＦＦＫＭＮＳＬＱＳＮＤＴＡＩＹＹＣＡＲＡＬＴＹＹＤＹＥＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＡＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫＬＰＥＴＧＳ
スペーサー及びＳｒｔＡ認識モチーフを有する軽鎖：
ＤＩＬＬＴＱＳＰＶＩＬＳＶＳＰＧＥＲＶＳＦＳＣＲＡＳＱＳＩＧＴＮＩＨＷＹＱＱＲＴＮＧＳＰＲＬＬＩＫＹＡＳＥＳＩＳＧＩＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＳＩＮＳＶＥＳＥＤＩＡＤＹＹＣＱＱＮＮＮＷＰＴＴＦＧＡＧＴＫＬＥＬＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＬＰＥＴＧＳ
ＳｒｔＡ認識モチーフを有する軽鎖：
ＤＩＬＬＴＱＳＰＶＩＬＳＶＳＰＧＥＲＶＳＦＳＣＲＡＳＱＳＩＧＴＮＩＨＷＹＱＱＲＴＮＧＳＰＲＬＬＩＫＹＡＳＥＳＩＳＧＩＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＳＩＮＳＶＥＳＥＤＩＡＤＹＹＣＱＱＮＮＮＷＰＴＴＦＧＡＧＴＫＬＥＬＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣＬＰＥＴＧＳ
ｃ）αＨＥＬ抗体のアミノ酸配列。遺伝子改変は下線で表記されている。
スペーサー及びＳｒｔＡ認識モチーフを有する軽鎖：
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＧＮＩＨＮＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＹＴＴＴＬＡＤＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＹＴＦＴＩＳＳＬＱＰＥＤＩＡＴＹＹＣＱＨＦＷＳＴＰＲＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＬＰＥＴＧＳ
天然重鎖：
ＱＶＱＬＱＥＳＧＰＧＬＶＲＰＳＱＴＬＳＬＴＣＴＶＳＧＦＳＬＴＧＹＧＶＮＷＶＲＱＰＰＧＲＧＬＥＷＩＧＭＩＷＧＤＧＮＴＤＹＮＳＡＬＫＳＲＶＴＭＬＫＤＴＳＫＮＱＦＳＬＲＬＳＳＶＴＡＡＤＴＡＶＹＹＣＡＲＥＲＤＹＲＬＤＹＷＧＱＧＳＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
ｄ）αＭＥＴ×ＥＧＦＲ抗体のアミノ酸配列。遺伝子改変は下線で表記されている。
ｓｃＦｖを有するＳＥＥＤ ＧＡ重鎖：
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＳＩＧＴＮＩＨＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＫＹＡＳＥＳＩＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＹＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＶＡＴＹＹＣＱＱＮＹＮＷＰＴＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＥＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＦＳＬＴＮＹＧＶＨＷＭＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＩＧＶＩＷＳＧＧＮＴＤＹＮＴＰＦＴＳＲＶＴＩＴＳＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＡＬＴＹＹＤＹＥＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
ＳＥＥＤ ＡＧ重鎖：
ＭＥＴＤＴＬＬＬＷＶＬＬＬＷＶＰＧＳＴＧＥＶＱＬＶＱＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＡＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＡＩＳＧＳＧＧＳＴＹＹ
ＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＤＲＲＩＴＨＴＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＦＲＰＥＶＨＬＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＡＲＧＦＹＰＫＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＳＲＱＥＰＳＱＧＴＴＴＦＡＶＴＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＴＩＳＬＳＰＧＫ
ＳｒｔＡ認識モチーフを有する軽鎖：
ＭＥＴＤＴＬＬＬＷＶＬＬＬＷＶＰＧＳＴＧＥＰＶＬＴＱＰＰＳＶＳＶＡＰＧＥＴＡＴＩＰＣＧＧＤＳＬＧＳＫＩＶＨＷＹＱＱＲＰＧＱＡＰＬＬＶＶＹＤＤＡＡＲＰＳＧＩＰＥＲＦＳＧＳＫＳＧＴＴＡＴＬＴＩＳＳＶＥＡＧＤＥＡＤＹＦＣＱＶＹＤＹＨＳＤＶＥＶＦＧＧＧＴＫＬＴＶＬＧＱＰＫＡＡＰＳＶＴＬＦＰＰＳＳＥＥＬＱＡＮＫＡＴＬＶＣＬＩＳＤＦＹＰＧＡＶＴＶＡＷＫＡＤＳＳＰＶＫＡＧＶＥＴＴＴＰＳＫＱＳＮＮＫＹＡＡＳＳＹＬＳＬＴＰＥＱＷＫＳＨＫＳＹＳＣＱＶＴＨＥＧＳＴＶＥＫＴＶＡＰＴＥＣＳＬＰＥＴＧＳ
ｅ）αＭＥＴ抗体のアミノ酸配列。遺伝子改変は下線で表記されている。
ＳｒｔＡ認識モチーフを有する軽鎖：
ＭＥＴＤＴＬＬＬＷＶＬＬＬＷＶＰＧＳＴＧＥＰＶＬＴＱＰＰＳＶＳＶＡＰＧＥＴＡＴＩＰＣＧＧＤＳＬＧＳＫＩＶＨＷＹＱＱＲＰＧＱＡＰＬＬＶＶＹＤＤＡＡＲＰＳＧＩＰＥＲＦＳＧＳＫＳＧＴＴＡＴＬＴＩＳＳＶＥＡＧＤＥＡＤＹＦＣＱＶＹＤＹＨＳＤＶＥＶＦＧＧＧＴＫＬＴＶＬＧＱＰＫＡＡＰＳＶＴＬＦＰＰＳＳＥＥＬＱＡＮＫＡＴＬＶＣＬＩＳＤＦＹＰＧＡＶＴＶＡＷＫＡＤＳＳＰＶＫＡＧＶＥＴＴＴＰＳＫＱＳＮＮＫＹＡＡＳＳＹＬＳＬＴＰＥＱＷＫＳＨＫＳＹＳＣＱＶＴＨＥＧＳＴＶＥＫＴＶＡＰＴＥＣＳＬＰＥＴＧＳ
重鎖：
ＥＶＱＬＶＱＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＡＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＡＩＳＧＳＧＧＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＤＲＲＩＴＨＴＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
Figure 2022505041000036
Figure 2022505041000037
Figure 2022505041000038
Figure 2022505041000039
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Figure 2022505041000043
Figure 2022505041000044
以下には、本発明に結び付いた研究の状況で使用された方法が記載されている。概して、こうした方法は、当技術分野で周知であり、完全性を期すために本明細書に提示されている。
ａ）抗体発現
抗体の発現は、ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２９３トランスフェクションキット（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に提供されているプロトコ－ルに基づく。１２５０μＬのＯｐｔｉ－ＭＥＭを、８０μＬのＥｘｐｉｆｅｃｔａｍｉｎｅと混合し、最長で５分間インキュベートする。その後、１２．５μｇの重鎖及び軽鎖プラスミドを、１２５０μＬのＯｐｔｉ－ＭＥＭで希釈する。ＳＥＥＤ抗体は、２つの異なる重鎖を有する。ＧＡ鎖及びＡＧ鎖の重鎖プラスミド並びに軽鎖を、質量比１：１：１で混合する。両溶液を一緒にして反応混合物を形成し、３０分間インキュベートする。一方で、Ｅｘｐｉ２９３（商標）細胞の細胞密度を、ＶｉＣｅｌｌ細胞計数器（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を使用して決定する。生存率が９５％よりも大きな場合、細胞を使用した。細胞を、Ｅｘｐｉ２９３（商標）発現培地で３．０×１０6細胞ｍＬ-1に希釈して総容積を２１ｍＬにする。それを３７℃に調節した。反応混合物を、振とうしながら細胞懸濁物に添加する。細胞を、３７℃及び５％ＣＯ２で振とうする。１６～１８時間後、１５０μＬのエンハンサー１及び１．５ｍＬのエンハンサー２を添加する。発現は、３７℃及び５％ＣＯ２で４日間振とうしながら行った。遠心分離（６０００ｇ／１０分間／４℃）後に上清を収集することにより抗体を単離する。上清を、Ｓｔｅｒｉｔｏｐ ０．２２μｍフィルター又はＳｔｅｒｉｆｌｉｐ ０．２２μｍフィルター（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｍｅｒｃｋ ＫＧａＡ）を使用して滅菌濾過する。抗体を、プロテインＡクロマトグラフィーで処理することにより精製する。この手順は、試薬の比を等しく維持することによりスケールアップすることができる。
ｂ）形質転換
氷上で解凍し、その後５０ｎｇのプラスミド溶液と混合した５０μＬの化学コンピテント細胞を使用して形質転換を実施した。氷上で３０分間インキュベートした後、細胞を３０秒間４２℃に調節した。その後、２５０μＬのＳＯＣ培地を添加し、３７℃で４５分間振とうしながらインキュベートした。細胞懸濁物を、１６ｋｒｃｆで１分間遠心分離した。上清を廃棄し、細胞を、残りの溶液に再懸濁した。懸濁物を、抗生物質を含む寒天プレートにプレーティングした。プレートを３７℃で一晩インキュベートした。
ｃ）プラスミド増幅
プラスミドを、Ｏｎｅ Ｓｈｏｔ ＴＯＰ１０化学コンピテント大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の形質転換により増幅した。タンパク質発現のために高プラスミド収量が必要な場合は、ＪｅｔＳｔａｒ（商標）２．０プラスミド精製キットを使用して精製を実施した。一晩培養物を回収することから精製手順を開始した。細胞を溶解し、続いて沈殿及び遠心分離を行った。上清を、プレパック陰イオン交換カラムにアプライする。デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）骨格は負に荷電されているため、ＤＮＡは、正荷電カラムマトリックスに結合する。低塩洗浄ステップは、リボ核酸（ＲＮＡ）、炭水化物、及びタンパク質を除去する。次いで、ＤＮＡを高塩濃度条件下で溶出した。アルコールを使用してＤＮＡを沈殿させることにより、ＤＮＡを脱塩した。配列決定目的のプラスミド増幅には、ＱＩＡＰｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐキットを使用した。精製手順は、ＪｅｔＳｔａｒ（商標）２．０プラスミド精製キット手順と同様であるが、ＤＮＡを、高塩濃度でＱｉａＰｒｅｐカラムのシリカ膜に吸着させ、低塩濃度で溶出させる。
ｄ）ＡＤＣ生成及び精製
リンカー－薬物のコンジュゲーションは、幾つかの技法を使用して達成することができる。こうした技法の一部は、抗体の事前修飾を必要とする。使用した抗体形式は、図１に図示されている。形式Ａ、Ｂ、及びＣは、ソルターゼＡを使用して酵素修飾するために設計されている。形式Ａ及びＢの場合、従来のＩｇＧ分子は、Ｃ末端が（Ｇ４Ｓ）３スペーサー及びソルターゼＡ認識配列ＬＰＥＴＧＳで又はソルターゼＡ認識配列ＬＰＥＴＧＳのみで伸長されている。形式Ｃは、鎖交換遺伝子操作ドメイン（ＳＥＥＤ、ｓｔｒａｎｄ－ｅｘｃｈａｎｇｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｄｏｍａｉｎ）技術を使用して生成された二重特異性抗体形式である。これにより、異なる抗原に結合するｓｃＦｖ部分及びＦａｂ部分を組み合わせることが可能になる。更に、Ｆａｂは、Ｃ末端がソルターゼＡ認識モチーフＬＰＥＴＧＳで伸長されている。形式Ｄは、１ｍＡｂ当たり最大で４つの薬物を有するＡＤＣの産生を可能にする。従って、ＬＣは、（Ｇ４Ｓ）３スペーサー及びソルターゼＡ認識配列ＬＰＥＴＧＳを含み、ＨＣは、ＳｒｔＡ認識モチーフＬＰＥＴＧＳによりＣ末端が伸長されている。リンカー－薬物を含むマレイミドのコンジュゲーションには、天然ｍＡｂ（形式Ｅ）を使用することができる。
幾つかの精製方法を使用した。チオールカップリング又はＳｒｔＡによる酵素コンジュゲーションのいずれかを使用してｍＡｂとのコンジュゲーションを行った後、粗ＡＤＣ混合物を精製して、過剰なリンカー－薬物、コンジュゲーション試薬、又は酵素を枯渇させる必要がある。便利な戦略は、分取ＳＥＣによる精製であり、これにより精製ＡＤＣが直接得られる。プロテインＡクロマトグラフィーを使用する場合、適切な緩衝液中でのＡＤＣ保管を保証するために緩衝液を交換する追加の精製工程を行うことが常に示唆される。従って、プロテインＡクロマトグラフィーの後には脱塩が行われる。しかしながら、この方法では試料が更に希釈されるため、濃縮工程が必要となる場合がある。別の経路では、プロテインＡクロマトグラフィーを使用し、続いて脱塩を行う。凝集体が存在する場合、分取ＳＥＣを使用して高分子種を枯渇させることができる。試料が希釈されるため、濃縮により精製ＡＤＣを得る。
ｅ）ソルターゼＡ媒介性コンジュゲーション反応
抗体のＳｒｔＡ認識モチーフ１つ当たり１０当量のオリゴグリシン細胞傷害性基質を使用して反応を実施する。抗体と比較して０．３７当量のソルターゼＡを適用する。ソルターゼＡは、カルシウムイオンの結合部位を有する。カルシウムイオンの結合はソルターゼＡの動きを緩徐化し、それにより基質とソルターゼＡとの結合を可能にする。これは、活性の８倍増加に結び付く。
１３．５μＭ（１当量）抗体構築物
５ｍＭ（３７５当量）のＣａＣｌ２
ＳｒｔＡ認識モチーフ１つ当たり１３３μＭ（１０当量）のオリゴグリシン基質
５μＭ（０．３７当量）のｅＳｒｔＡ
試薬及び緩衝液を、記載のように混合する。反応混合物を反応緩衝液で希釈して、所定の濃度に調整する。反応は、混合物を２２℃で３０分間インキュベートすることにより実施する。ＳｒｔＡを添加することにより、反応が開始される。７５０当量のＥＤＴＡを添加することにより反応を停止させる。ＥＤＴＡは、錯体を形成することにより遊離カルシウムイオンを溶液から除去する。溶液中の抗体の最終濃度を、十分な量の緩衝液を添加することにより１３．５μＭに調整する。
ｆ）プロテインＡクロマトグラフィー
ＩｇＧ抗体精製の基盤は、ＩｇＧ型抗体のＦｃ領域に対するスタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）プロテインＡの高い結合親和性である。プロテインＡとＩｇＧ抗体との結合は、生理学的なｐＨ及びイオン強度で生じるが、結合は、低ｐＨで破壊され、抗体の溶出がもたらされる。ＩｇＧ分子は、通常ｐＨ３．０で溶出することが示された。
抗体精製：分取プロテインＡ親和性クロマトグラフィーは、ＡＫＴＡＸｐｒｅｓｓ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）クロマトグラフィーシステムで、５ｍＬプロテインＡ ＨＰカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）のＨｉＴｒａｐ（商標）１ｍＬを使用して実施した。抗体がカラムに結合したら、カラムを結合緩衝液で洗浄した。その後、カラムを１００％溶出緩衝液で洗浄することにより、１工程で溶出を実施した。抗体を１．５ｍＬの画分で、９６ディープウェルプレートの１００μＬ中和緩衝液へと溶出した。ＳＤＳ－ＰＡＧＥを使用して画分の純度を分析し、それに応じてプールした。
ＡＤＣ精製：ＡＤＣを上記に記載の通りに精製したが、５ｍＬプロテインＡ ＨＰカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）のＨｉＴｒａｐ（商標）１ｍＬを使用してＡＫＴＡ Ｐｕｒｉｆｉｅｒ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）クロマトグラフィーシステムで精製した。試料を、ＳｕｎＣｈｒｏｍのオートサンプラーを使用してカラムにアプライした。１ｍＬの画分を、１００μＬ中和緩衝液を含む１．５ｍＬチューブへと溶出した。ＡＤＣ含有画分をプールした。
ｇ）分取ＳＥＣ
ＳＥＣの分離原理は、サイズの違いにより引き起こされる分析対象物の溶出時間の差異に基づく。ＳＥＣカラムの固定相は、細孔を有する球状粒子で構成されている。小分子は細孔内へと拡散することができるが、より大きな分子は、細孔に進入することができず、マトリックスを直接的に通過する。そのため、まず最も大きな分子が溶出し、続いてより小さい分子がそれらのサイズ順に溶出する。本作業の過程では、凝集体を抗体調製物から除去するために、並びに酵素ソルターゼＡ及び過剰トキシン等のコンジュゲーション試薬からＡＤＣを分離するためにＳＥＣを使用した。ＳＥＣ精製は、Ａｇｉｌｅｎｔ １２６０ ＨＰＬＣシステム（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で実施した。流速は０．５ｍＬ／分だった。Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００ １０／３０ ｉｎｃｒｅａｓｅカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して試料を分離した。試料を０．５ｍＬ画分で溶出し、プールして最終産物を得た。経路Ｄを介して精製したαＨＥＲ２－１を調製するための分取ＳＥＣは、ＨｉＬｏａｄ（商標）１６／６００ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ（商標）２００ｐｇカラムを使用してＡＫＴＡＸｐｒｅｓｓ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）クロマトグラフィーシステムで実施した。そのために、カラムを水で洗浄し、その後移動相で平衡化した。注入後、試料を１ｍＬ分-1の流速にて均一濃度で溶出した。ピークは分画収集される。
ｈ）分析的ＨＩＣ
ＡＤＣの薬物対抗体比（ＤＡＲ）は、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）を使用して決定することができる。そのために、タンパク質を、高濃度のカオトロピック塩を含む水性移動相にアプライする。個々のタンパク質は、それらの疎水性に基づいて固定相に結合し、塩含有量を徐々に低減することにより、疎水性が最も低いものから最も高いものの順に溶出する123。異なるＡＤＣ種及び未反応ｍＡｂは、負荷薬物に基づいて分離される。クロマトグラムの加重曲線下面積を使用して、ＡＤＣのＤＡＲを算出することができる。
全ての試料は、硫酸アンモニウムの最終濃度が１．５Ｍになるように試料調製緩衝液を使用して希釈することにより調製した。ソルターゼＡで生成されたＡＤＣの分析的ＨＩＣは、ＭＡＢ ＰＡＫブチル、４．６×５０ｍｍカラム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を備えたＨＰＬＣシステム（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して実施した。ＵＶ－ＶＩＳ検出器では、２２０ｎｍ及び２８０ｎｍの波長を使用した。測定は、２０分間で０から１００％緩衝液Ｂへの勾配を１ｍＬ分-1の流速で適用して実施した。ＨＰＬＣ分析は３０℃で実施した。その後、カラムを１００％緩衝液Ｂで洗浄した。ＬＣ ３ＤシステムのＣｈｅｍＳｔａｔｉｏｎ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用してデータを処理した。
ｉ）分析的ＳＥＣ
ｍＡｂ試料及びＡＤＣ試料のモノマー含有量を、分析的ＳＥＣにより決定した。分析的ＳＥＣは、ＴＳＫ－ＧＥＬ Ｓｕｐｅｒ ＳＷ３０００ＳＥＣ４．６×３００ｍｍカラムを備えたＡｇｉｌｅｎｔＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓのＩｎｆｉｎｉｔｙ１２６０ＨＰＬＣシステムで実施した。溶出は、０．３５ｍＬ分-1の流速にて均一濃度で実施した。
ｊ）緩衝液交換
緩衝液の交換は、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－２５媒体を含むＰＤ－１０脱塩カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して実施する。根底にあるクロマトグラフィー法は、サイズ排除クロマトグラフィーであり、試料は、分子のサイズに基づいて分離される122。タンパク質の溶出には、タンパク質試料の品質低下に結び付く可能性のある過酷な緩衝液条件が使用されることが多い。結果として、保管のために緩衝液を交換する必要がある。脱塩のため、３カラム容積の保管用緩衝液をアプライすることによりカラムを平衡化した。次いで、２．５ｍＬのタンパク質溶液をカラムにアプライし、続いて３．５ｍＬの保管用緩衝液を使用して新しいファルコンへと溶出した。
ｋ）哺乳動物がん細胞の解凍
クライオバイアルとして－８０℃で提供された細胞を、氷が溶解するまで３７℃の水浴で解凍した。細胞を再懸濁し、５０ｍＬファルコンチューブに移した。細胞懸濁物を遠心分離した（５分間／５００ｒｐｍ／ＲＴ）。上清を減圧除去し、ペレットを５ｍＬ細胞培養培地に再懸濁した。この時点で、細胞を細胞傷害性アッセイに直接使用したか、又は１０ｍＬ細胞培養培地を含むＴ７５フラスコに投入したかのいずれかだった。
ｌ）哺乳動物がん細胞の培養
通常は、Ｔ７５細胞培養フラスコ中の細胞を、５％ＣＯ２加湿雰囲気のインキュベーター内で３７℃にて培養し、３～４日毎に継代した。継代のため、培地を減圧除去し、細胞をＰＢＳで洗浄し（３×）、１ｍＬの０．０５％トリプシン－ＥＤＴＡを添加した。剥離反応の完了を目視で調べた。全ての細胞が剥離したら、９ｍＬの培地を細胞に添加して剥離反応を停止させた。細胞の成長速度に応じて、細胞を、１：２～１：４に分割し、１０ｍＬの培地を含む新しいＴ７５フラスコに再播種した。その後、細胞を、５％ＣＯ２加湿雰囲気のインキュベーター内で３７℃にてインキュベートした。
ｍ）曲線シフトアッセイ
相乗効果を更に解明するために、ＡＴＲｉによるデュオカルマイシン担持ＡＤＣの強化効果を研究した。そのために、曲線シフトアッセイ系を確立した。最初の工程では、ある特定の細胞株を阻害剤で処置することにより用量反応曲線（ＤＲＣ）を得る。このＤＲＣから最大非有効用量（ＭＮＥＤ）を導き出すことができる。ＭＮＥＤは、生存率に影響を及ぼすことなくある特定の細胞株に添加することができる最も高い用量である。ＡＤＣの活性を、別々の実験で確認する。最後に、組合せ実験を実施することができる。そのために、ＡＤＣ及びＡＤＣ＋ＭＮＥＤの阻害剤を細胞に添加する。対照として、阻害剤を並行してＭＮＥＤで試験する。阻害剤はＭＮＥＤで適用されるため、阻害剤により引き起こされる細胞生存率の低減は予想されない。３つの結果が考えられる：１）ＡＤＣ＋阻害剤の組合せは、ＡＤＣのみと効力が同等である。これは相加効果しかないことを示唆するだろう。２）ＡＤＣ＋阻害剤の組合せは、ＡＤＣ単独よりも強力でない。そのような結果は、脱強化作用として解釈される。３）ＡＤＣ＋阻害剤の組合せは、ＡＤＣ単独よりも強力である。この場合、ＡＤＣの効力は強化されている。
Figure 2022505041000045
強化効果は、用量低減指数（ＤＲＩ）として表し、これは、数式（１）に従って、ＡＤＣのＩＣ50値をＡＤＣ＋阻害剤のＩＣ50値で除算することにより算出することができる。
Figure 2022505041000046
曲線シフトアッセイを以下の通りに実施した：ＶｉＣｅｌｌ（商標）－ＸＲ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を使用して細胞数及び生存率を決定し、不透明（ｏｐａｇｕｅ）９６ウェルプレートに播種した（１０ｋ生存細胞／ウェル）。播種後、プレートを加湿チャンバー内で一晩インキュベートした（３７℃、５％ＣＯ２）。化合物を適切な媒体で希釈し、細胞に添加し、プレートを加湿チャンバー内でインキュベートした（３７℃、５％ＣＯ２、６日間）。室温で３０分間平衡化した後、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）を添加した。プレートを振とうした後（３分間、５５０ｒｐｍ、ｒｔ）、それをインキュベートし（１０分間、ｒｔ）、Ｓｙｎｅｒｇｙ４プレートリーダー（ＢｉｏＴｅｋ）で発光を読み取った。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍバージョン６．０５を使用して評価を実施した。そのために、発光値を、未処置細胞の発光値に対して正規化し、用量反応を、４点ロジスティックフィッティングでフィッティングした。
ｎ）用量マトリックスアッセイ
用量マトリックス組合せアッセイを上記の通り実施したが、不透明３８４ウェルプレート（２ｋ生存細胞／ウェル）で実施した。ＴｅｃａｎＤ３００ｅ液体を使用して化合物を添加した。タンパク質溶液を０．３％Ｔｗｅｅｎ－２０（最終）で補完し、１μＭに希釈した。全てのウェルを、添加した最大量のＤＭＳＯ（最大０．４％）又はＴｗｅｅｎ－２０に対して正規化した。Ｅｎｖｉｓｉｏｎ２１０４マルチラベルリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）で発光の読取りを実施し、Ｇｅｎｅｄａｔａ Ｓｃｒｅｅｎｅｒ（登録商標）バージョン１４．０．６－スタンダード（Ｇｅｎｅｄａｔａ ＡＧ）を使用してデータを評価した。発光値を未処置細胞の発光に対して正規化し、Ｓｍａｒｔ Ｆｉｔを使用して用量反応をフィッティングした。相乗作用スコアを、ＬＯＥＷＥ相乗作用モデルを使用して算出した。
ｏ）ノックダウン実験
０．７*１０6個の生存細胞をＴ２５フラスコに播種し、５ｍＬの培地を添加し、細胞を３７℃及び５％ＣＯ２で一晩インキュベートした。トランスフェクションを以下の通り実施した：２．５μＬのリポフェクタミンＲＮＡｉＭＡＸを２４７．５μＬのＯｐｔｉＭＥＭで希釈し、０．３μＭのｓｉＲＮＡ（ＡＴＲ、ＣＨＫ１、又は非標的指向性ｓｉＲＮＡ）溶液をＯｐｔｉＭＥＭで調製して、２５０μＬの最終容積を得た。溶液を混合し、室温で２０分間インキュベートした後、５００μＬの細胞培養培地を添加した。細胞培養培地を細胞から除去し、ＰＢＳで洗浄し（３×）、トランスフェクションミックスを細胞に添加した。３７℃及び５％ＣＯ2で４時間インキュベートした後、トランスフェクションミックスを減圧除去した。細胞を培地で洗浄し（３×）、５ｍＬの培地を添加し、細胞を３７℃及び５％ＣＯ2で６０時間インキュベートした。次いで、細胞を剥離し、３８４ウェルプレートに播種した。次いで、細胞傷害性アッセイを、上記に記載のように実施したが、１つの化合物のみを用いた。
ｐ）統計分析
統計分析は、不等分散を想定し、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌで両側Ｔ．検定式を使用して実施した。曲線シフトアッセイの帰無仮説は、２つの化合物の組合せが、単剤単独と等しく細胞傷害性であることだった。相乗作用実験の帰無仮説は、２つの組合せが、等しく相乗的であることだった。グラフ注釈：*：Ｐ＜．０５、**：Ｐ＜．０１、***：Ｐ＜．００１、****：Ｐ＜．０００１。
ｑ）異種移植実験
６～８週齢の雌Ｈ２ｄ Ｒａｇ２マウスを、Ｔａｃｏｎｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＬＬＣから入手した。細胞培養からＮＣＩ－Ｎ８７細胞を回収し、細胞をマトリゲルと１：１で混合し、２．５×１０6個の細胞をマウスの脇腹に皮下注射することにより、異種移植片を確立した。カリパスを使用した二次元での長さ測定により、腫瘍容積を週２回評価した。容積は、数式３に従って算出した。この数式において、長さＬは、最も長い腫瘍長であり、Ｗは、最も短い腫瘍長である。
Ｖ＿腫瘍＝（Ｌ*Ｗ＾２）／２ 数式３
初期腫瘍成長期の後、マウスを無作為化し、１０匹の動物を含む処置群に割り当てた。処置開始時の初期腫瘍容積はおよそ１００ｍｍ3だった。ビヒクル処置マウスは、０．５％メトセル、０．２５％Ｔｗｅｅｎ－２０の水溶液を受け取った。１０ｍＭヒスチジン、８％トレハロース、０．０５％Ｔｗｅｅｎ－２０、ｐＨ６．０緩衝液に溶解した１．０ｍｇ／ｋｇのＡＤＣ αＨＥＲ２－６の単一用量を尾静脈へと静脈内投与した。０．５％メトセル、０．２５％Ｔｗｅｅｎ－２０の水溶液に溶解した５０ｍｇ／ｋｇのＡＺＤ６７３８及びＡＴＲｉ １を、２週間にわたって１日１回経口投与した。マウスの体重を週２回測定して、処置期間中の体重を評価した。単一動物の試験を中止する基準は、皮膚潰瘍、腫瘍長が１５ｍｍを超えること、又は腫瘍が体重の１０％を超えることだった。加えて、体重喪失が２０％を超え、憔悴した外観が伴っていた場合、体重喪失が３日連続で２０％を超えた場合、又は体重減少が調整した体重の２５％を超えた場合、体重喪失は、中止の基準だった。残った動物が８匹未満／群の場合、処置群を全体を中止したため、統計分析は実施できなかった。腫瘍応答基準は以下の通りだった：１）腫瘍容積の変化が、観察段階の終了時に処置開始時と比較して＞７３％であった場合、治療結果を腫瘍進行と称した。２）腫瘍容積の変化が、処置終了時に初期腫瘍サイズの－６６％～７３％であった場合、腫瘍停滞が得られた。３）腫瘍が処置終了時に６６％よりも大きく低減した場合を退縮と称した。４）腫瘍が処置終了時に触知不能又は＜２０ｍｍ3であった場合、処置結果を完全退縮と称した。この研究は、Ｌｏｕｉｓａ Ｈｕｅｔｔｅｌ氏が実施し、Ａｎａ Ｈｅｃｈｔ氏が監督した。
ｒ）細胞ＣＨＫ１リン酸化阻害
１ウェル当たり３５００個のＨＴ２９細胞（培地は付録１を参照）を、３０μＬで黒色３８４ウェルプレートに播種した。細胞を２２℃で１時間インキュベートした後、３７℃、１０％ＣＯ２、及び９０％相対湿度で一晩インキュベートした。ＡＴＲｉの系列希釈物を、ヒドロキシ尿素と同時に最終濃度３ｍＭで細胞に添加した。５μＬの７×ＰＢＳ／ＨＥＰＥＳを添加し、ＤＭＳＯを最終的に０．５％にした。プレートを、３７℃、１０％ＣＯ２、及び９０％相対湿度で４時間インキュベートした。Ｔｅｃａｎ－Ｐｏｗｅｒｗａｓｈｅｒを使用して上清を除去した。３０μＬ／ウェルのＰＢＳ中４％ポリ－ホルムアルデヒドを添加し、その後２２℃で１５分間インキュベートすることにより、細胞を固定した。細胞を８０μＬのＰＢＳで１回洗浄し、Ｔｅｃａｎ Ｐｏｗｅｒｗａｓｈｅｒを使用して上清を除去した。１ウェル当たり４０μＬの－２０℃冷却メタノールを添加し、２２℃で１０分間インキュベートした。細胞を８０μＬのＰＢＳで１回洗浄し、Ｔｅｃａｎ Ｐｏｗｅｒｗａｓｈｅｒを使用して上清を除去した。１ウェル当たり３０μＬのＰＢＳ中０．２％Ｔｒｉｔｏｎ溶液を細胞に添加し、２２℃で１０分間インキュベートした。細胞を８０μＬのＰＢＳで１回洗浄し、Ｔｅｃａｎ Ｐｏｗｅｒｗａｓｈｅｒを使用して上清を除去した。２５μＬの１０％ヤギ血清、１％ＢＳＡ、０．１％Ｔｗｅｅｎ－２０、０．１％アジ化ナトリウムを含むＰＢＳを添加し、３７℃で６０分間インキュベートした。上清を除去し、２５μＬの１°抗体（ホスホ－ＣＨＫ１（Ｓｅｒ３４５、１３３Ｄ３）ウサギｍＡｂ）、１％ＢＳＡ、０．１％アジ化ナトリウムを含むＰＢＳを用いて４～８℃にて一晩染色した。８０μＬのＰＢＳで洗浄し、上清を除去した。２５μＬの２°抗体（ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）４８８ヤギ抗ウサギＦ（ａｂ’）２断片）及び０．２μｇ／ｍＬヨウ化プロピジウム、１％ＢＳＡ、０．１％アジ化ナトリウムを含むＰＢＳを添加した。プレートを３７℃で６０～９０分間インキュベートした。それを８０μＬのＰＢＳで洗浄し、０．１％アジ化ナトリウムで補完された８０μＬのＰＢＳを添加した。プレートを透明粘着シールで密封した。ＩＭＸ Ｕｌｔｒａで画像を取得し、Ｍｅｔａｅｘｐｒｅｓｓ５．３を使用して分析した。
実施例１：デュオカルマイシンの相乗的薬物組合せパートナーのスクリーニング
相乗的薬物組合せのスクリーニングは、用量マトリックスアッセイを実施することにより達成することができる。そのために、２つの薬物を系列希釈し、各用量レベルで混合し、用量マトリックスを得る。組合せの効果が、単剤の相加効果と同一である場合、その薬物組合せは相加的であり得る。しかしながら、組合せの効果は、単剤の活性よりも強力であり得る。このシナリオを相乗作用と称し、単剤と比較してより弱い組合せ効果を、拮抗作用と称する。用量マトリックスアッセイは、図２に模式的に図示されている。この図には、用量マトリックスアッセイの結果：相加作用、拮抗作用、相乗作用が例示されている。
スクリーニングは、デュオカルマイシン誘導体ＤＵＢＡ（１０）及びＤＤＲ阻害剤を系列希釈することにより実施した。その後、系列希釈物を単独又は組合せのいずれかで、ＨＣＣ－１９５４細胞又はＭＤＡ－ＭＢ－４６８細胞に添加した。用量マトリックスアッセイでは、ＤＵＢＡをヒカントンと組み合わせた。処置の６日後にＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏアッセイキットを使用して細胞生存率を測定した。細胞生存率アッセイのシグナルを、未処置細胞に対して正規化し、フィッティングした。続いて、Ｌｏｅｗｅ相加性モデルによる相加効果の予測を、単剤活性に基づいてＤＵＢＡ及びＤＤＲｉの各用量対について算出した。モデルデータをフィッティングデータから減算することにより、過剰マトリックスを生成した。過剰マトリックスは、モデルと実際のデータとの間の差異を視覚化したものとみなすことができ、また、高い相乗作用又は拮抗作用のいずれかのスポットを強調する。しかしながら、組合せ効果の定量化は、相乗作用スコアを算出することにより実施した。そのために、モデルとフィッティングした実際のデータとの間の加重容積を、ＧｅｎｅＤａｔａ Ｓｃｒｅｅｎｅｒソフトウェアを使用して算出した。これは、Ｋｒｕｅｇｅｒら22による相乗作用スコアの規定に従って相乗作用スコア（Ｓ）として表されている。ＤＵＢＡ及びヒカントンの組合せの場合、相乗作用スコアは０．１であり、これは相加性を示す。ＤＵＢＡ及びＡＺＤ６７３８の組合せについても同じ手順を繰り返した。過剰マトリックスにより、１６０～６３０ｎＭのＡＺＤ６７３８及び０．１６～０．０３９ｎＭのＤＵＢＡの濃度において追加の細胞傷害性のホットスポットが特定された。この範囲では、この組合せの活性は、この組合せが相加性である場合に死滅させることになるものよりも最大で６９％より多くのがん細胞を死滅させた。この組合せの追加細胞傷害性は７．６の相乗作用スコアに相当した。相乗作用スコアに加えて、単独療法における薬物の効力をこうした実験から得た。薬物ＤＵＢＡ及びＡＺＤ６７３８の活性データを、対応する濃度に対してプロットすると、ロジスティック関数を使用してフィッティングされた用量反応が得られる。この用量反応曲線から効力を得た。
組合せを真に相乗的又は拮抗的であると分類するためのカットオフを画定するために、Ｓの散乱を偽対照実験で決定した。そのために、４つの異なる細胞株に対して、７つの異なる化合物をそれ自体と組み合わせて、測定値の平均付近の３σの信頼区間を算出した。こうした実験によると、０．６～－０．７の範囲のＳでの組合せでは、相加的である確率は９９．７％だった。便宜上、カットオフを±１の値に設定した。
モデル及び実際の応答が等しい場合に相加性であるとした（－１＞Ｓ＜＋１）組合せ実験から、相乗作用スコア（Ｓ）を得た。実際の応答がモデルを超えていた場合、組合せは相乗的（Ｓ＞１）であり、その組合せで処置した細胞が、その組合せ処置に対して、単剤と比較してより弱い応答を示した場合、その組合せは拮抗的（Ｓ＜１）だった。組合せ効果の程度は、スコアの大きさにより決定した。
デュオカルマイシンの相乗的組合せパートナーを特定するために、低スループットスクリーニングを実施した。そのために、ＤＮＡ損傷修復、細胞周期調節、ＤＮＡリモデリングに干渉したか、又はデュオカルマイシン誘導性病変の修復に潜在的な役割を示す文献データに基づきＤＮＡ損傷を誘導したかのいずれかである１７個の小分子ＤＮＡ損傷応答阻害剤（ＤＤＲｉ）を選択した。阻害剤は、対応する標的及び作用機序と共に表２に要約されている。
まず、ＤＮＡ修復に直接関与する阻害剤を選択した。デュオカルマイシン誘導性複製フォーク停止の結果としてのフォーク崩壊は、二本鎖切断に結び付く場合がある。従って、二本鎖切断の修復に関与する修復経路の阻害剤は、デュオカルマイシンと相乗作用し得るという仮説を立てた。従って、相同組換え修復の下方制御因子であるアムバチニブ又はＤＮＡ ＰＫ阻害剤であるＮＵ７４４１を、デュオカルマイシンと組み合わせた。ＫＵ－５５９３３＋ＤＵＢＡの相乗作用スコアは、ＨＣＣ－１９５４細胞に対して相乗作用のカットオフをわずかに超えた（Ｓ＝２．１±１．２）。これは、オフターゲット阻害又はデュオカルマイシン処置の結果としての二本鎖切断の形成のいずれかを示す。デュオカルマイシン変異体ＤＵＢＡとＤＮＡ－ＰＫｉ ＮＵ７４４１又はアムバチニブとの組合せでは、カットオフを超える相乗作用スコアは得られなかった。
二本鎖修復の阻害の他に、ブレオマイシンＡ５及びトポイソメラーゼＩＩ阻害剤エトポシドをＤＵＢＡと組み合わせて、修復能力を過負荷にした。ＨＣＣ－１９５４細胞では、ＤＵＢＡと組み合わせたブレオマイシンＡ５は、カットオフをわずかに超えたが（Ｓ＝１．６±１．０）、ＭＤＡ－ＭＢ－４６８細胞では、この組合せは相加性の範囲内だった（Ｓ＝０．４±１．０）。エトポシドとＤＵＢＡとの組合せは、ＨＣＣ－１９５４（Ｓ＝０．７±０．５）及びＭＤＡ－ＭＢ－４６８細胞（Ｓ＝－０．３±０．２）の両方に対して、相加効果に結び付いた。
選択したＤＮＡ修復阻害剤の第２の群は、損傷塩基の修復に関与するものであった。嵩高いＤＮＡ病変を直接除去するためには、塩基切除修復が必要である。バチルス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ）の塩基切除修復酵素であるＤＮＡグリコシラーゼＡｌｋＤは、デュオカルマイシンアナログであるヤタケマイシンにより引き起こされる病変の除去を媒介することが示された。従って、Ｏ６－アルキルグアニン－ＤＮＡ－アルキルトランスフェラーゼ阻害剤であるロメグアトリブを使用して、ヒトグリコシラーゼの阻害効果を研究した。細胞株ＭＤＡ－ＭＢ－４６８に対してロメグアトリブをデュオカルマイシンと組み合わせた場合、分散が高度であり弱い相乗効果しか観察されなかったが（Ｓ＝２．８±２．３）、ＨＣＣ－１９５４細胞に対しては相加性が観察された（Ｓ＝０．１±１．３）。ロメグアトリブに加えて、別のＢＥＲ阻害剤であるＴＨ５８８を、ＤＵＢＡと組み合わせた。ＴＨ５８８は、酸化的に損傷した塩基の摘除に関与するＭＴＨ１を阻害する。しかしながら、ＨＣＣ－１９５４細胞（Ｓ＝－０．２±０．３）及びＭＤＡ－ＭＢ－４６８細胞（Ｓ＝－０．４±０．３）では、相加効果が観察された。
損傷したヌクレオチドを除去するための修復経路は、ヌクレオチド切除修復（ＮＥＲ）である。これは、デュオカルマイシンアルキル化病変の修復に役割を果たす。ヘリカーゼＩＩ及びＤＮＡポリメラーゼＩの存在下で、ＣＣ－１０６５（１５）病変は、ＡＢＣエキシヌクレアーゼにより切除された。しかしながら、ＮＥＲ能力の高いＨｅＬａ細胞の細胞抽出物のＮＥＲは、動員されなかった。ごく少数のＮＥＲ阻害剤しか市販されていないかったため、組合せ実験では、ＨＳＰ９０阻害剤であるタネスピマイシンを研究した。この阻害剤は、ＮＥＲにおける重要な酵素であるＥＲＣＣ１の発現を下方制御した。ＨＣＣ－１９５４では、ＤＵＢＡとタネスピマイシンとの組合せ（Ｓ＝１．４±０．４）は、カットオフを超えた。
ＤＮＡ損傷修復を妨害するより一般的な手法は、ＤＮＡ損傷応答タンパク質を核へと移入させる細胞の能力を減少させることだった。ビンクリスチンのような微小管標的指向性作用剤は、ＤＮＡ修復酵素の核移行を阻害し、細胞質におけるタンパク質の蓄積に結び付いた。デュオカルマイシンで処置すると、ダイネイン阻害剤であるシリオブレビンＤがＤＮＡ損傷応答酵素の核への輸送を妨げ、それによりＤＮＡ損傷の蓄積を増加させる可能性があるという仮説を立てた。しかしながら、シリオブレビンＤとデュオカルマイシン誘導体ＤＵＢＡとの組合せは、細胞株ＨＣＣ－１９５４（Ｓ＝１．２±０．６）ではカットオフをわずかに超えたが、ＭＤＡ－ＭＢ－４６８細胞では相加効果が観察された（Ｓ＝０．２±０．５）。こうした結果は、微小管阻害性ＡＤＣカドサイラ＋ＡＺＤ６７３８の組合せ実験と一致していた。ＡＺＤ６７３８と組み合わせたカドサイラの相乗作用スコアは、ＭＤＡ－ＭＢ－４５３ではＳ＝１．１±０．３であり、ＮＣＩ－Ｎ８７細胞ではＳ＝０．３±０．２だった。これは相加性を示すに過ぎない。
研究した阻害剤の第３の群には、チェックポイント調節を抑止する薬物が含まれていた。ＷＥＥ１キナーゼは、チェックポイント調節に関与する。ＷＥＥ１の活性は、Ｇ２期を延長して、Ｓ期で蓄積されたＤＮＡ損傷を修復するための時間を稼ぐ。ＷＥＥ１がＡＺＤ１７７５により阻害されると、Ｇ２／Ｍチェックポイントが無効になり、細胞が有糸分裂へと進行することに結び付く。ＷＥＥ１阻害は、マウスにおける患者由来異種移植モデルにおいてＣＨＫ１／２阻害と相乗作用し、一般に、ＤＮＡ損傷剤による処置に対して細胞を感作する。本発明者らの研究では、ＤＵＢＡ及びＡＺＤ１７７５の組合せは、ＨＣＣ－１９５４細胞（Ｓ＝０．８±０．１）及びＭＤＡ－ＭＢ－４６８（Ｓ＝０．１±０．４）細胞では相加性だった。酵素ＰＡＲＰ１は、相同組換え修復、非相同末端結合、及び更に塩基切除修復のような幾つかの修復経路において重要な役割を果たす。更に、停止した複製フォーク（ＳＲＦ）に結合し、ＳＲＦの存在により活性化される。ＰＡＲＰ１を欠如する細胞は、ヒドロキシ尿素及び過剰チミジンによる処置に感受性であり、それぞれ複製フォークの崩壊又は停止を引き起こす。デュオカルマイシンによる処置は、停止した複製フォークの形成に結び付くため、これは、デュオカルマイシン誘導性ＤＮＡ病変の感知に潜在的な役割を果たすことを示唆している。この研究では、ＤＵＢＡと組み合わせたオラパリブは、ＨＣＣ－１９５４（Ｓ＝０．６±０．４）に対して相加効果を示し、ＭＤＡ－ＭＢ－４６８細胞に対してわずかな相乗効果（Ｓ＝１．１±０．１）を示した。
ＡＴＲ及びＣＨＫ１キナーゼは、細胞周期だけでなく、ＤＮＡ損傷応答調節にも重要な酵素である。ＡＴＲｉ ＡＺＤ６７３８及びＣＨＫ１ｉ ＬＹ２６０３６１８並びにＡＺＤ７７６２を、ＤＵＢＡの相乗的組合せパートナーとして特定した。ＡＴＲｉ ＡＺＤ６７３８は、ＨＣＣ－１９５４細胞（Ｓ＝６．９±０．７）及びＭＤＡ－ＭＢ－４６８細胞（Ｓ＝５．７±１．０）に対して、ＤＵＢＡと強力に相乗作用した。相乗作用は、ＨＣＣ－１９５４（Ｓ＝４．１±０．３、Ｐ＝．００００２）及びＭＤＡ－ＭＢ－４６８細胞（Ｓ＝４．４±１．７、Ｐ＝．３）では、ＬＹ２６０３６１８＋ＤＵＢＡよりもＡＴＲｉ ＡＺＤ６７３８＋ＤＵＢＡの方がより強力だった。この場合もまた、ＡＺＤ６７３８とＤＵＢＡとの組合せは、ＨＣＣ－１９５４（Ｓ＝３．６±０．４、Ｐ＝．０００２）及びＭＤＡ－ＭＢ－４６８細胞（Ｓ＝２．６±０．２、Ｐ＝．０１）では、ＤＵＢＡと組み合わせたＡＺＤ７７６２で観察された相乗作用を超えていた。
機能的ＨＥＲ２は、ＭＣＦ７細胞の照射後のＧ２／Ｍチェックポイントの活性化に不可欠であると記載されている。ＨＥＲ２阻害は、ＭＣＦ７の照射処置後、ＡＴＲ及びＣＨＫ１シグナル伝達の無効化に結び付いた。ＡＴＲ及びＣＨＫ１がＤＵＢＡと相乗作用することが示され、二重の上皮成長因子受容体及びＨＥＲ２阻害剤であるラパチニブ又はＨＥＲ２阻害剤ＣＰ７２４７１４が、ＤＵＢＡと相乗作用するか否かを研究した。両阻害剤とＤＵＢＡとの組合せは、ＨＣＣ－１９５４細胞及びＭＤＡ－ＭＢ－４６８細胞に対して相加効果をもたらした。
ＮＥＫ１は、こうした２つのキナーゼ間の相互作用を調節する、ＡＴＲ及びＡＴＲＩＰに関連するキナーゼである。ｃｍｐｄ３１は、もともとＮＥＫ２を阻害するために設計されたものであるが、０．１７μＭの効力でＮＥＫ１を阻害する。従って、ｃｍｐｄ３１を、ＤＵＢＡと組み合わせた。ＨＣＣ－１９５４細胞（Ｓ＝０．３±０．１）及びＭＤＡ－ＭＢ－４６８細胞（Ｓ＝０．４±０．２）では、相加性のみが観察された。用量マトリックスアッセイの結果、図３に図示されている。
Figure 2022505041000047
キナーゼ阻害剤はオフターゲット効果を示すことが多いため、こうした酵素が、デュオカルマイシンで処置された細胞の生存に不可欠な役割を果たすことを証明するために、ｓｉＲＮＡノックダウンを使用してＡＴＲ及びＣＨＫ１レベルを減少させた。そのために、ＨＣＣ－１９５４細胞をＴ２５フラスコに播種し、一晩接着させた。次いで、細胞をＰＢＳで洗浄し、その後、ＡＴＲ、ＣＨＫ１、及び非標的指向性ｓｉＲＮＡを添加した。細胞を４時間インキュベートし、培地で洗浄し、３日間インキュベートした。細胞を剥離させ、３８４ウェルプレートに播種した。それらを、デュオカルマイシンで６日間にわたって処置した。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏアッセイキットにより細胞生存率を決定し、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍを使用してデータを評価した。定量ＰＣＲを使用して、ノックダウン効率を評価した。
Figure 2022505041000048
結果は図４に示されている。ＤＵＢＡは、非標的指向性ｓｉＲＮＡで処置した細胞と比較して（ＩＣ５０＝１．５ｎＭ）、ＡＴＲノックダウン細胞（ＩＣ５０＝０．２５ｎＭ）及びＣＨＫ１ノックダウン細胞（ＩＣ５０＝１．１ｎＭ）に対してより強力だった。同様の結果がＤＤＭでも得られた。ＤＤＭは、この場合も、ＡＴＲノックダウン細胞（ＩＣ５０＝０．０１４ｎＭ）及びＣＨＫ１（ＩＣ５０＝０．１３３ｎＭ）ノックダウン細胞に対して、対照細胞（ＩＣ５０＝０．２３ｎＭ）よりも強力だった。ＣＨＫ１細胞と非標的指向性ｓｉＲＮＡ処置細胞との差異は小さかったが、ＤＵＢＡは、ＡＴＲノックダウン細胞に対して対照細胞よりも５．８倍、ＤＤＭは１７．３倍強力だった。
全体として、ＤＵＢＡとＡＴＲｉ ＡＺＤ６７３８との組合せは、ＤＵＢＡ＋ＣＨＫ１ｉ ＬＹ２６０３６１８又はＡＺＤ７７６２と比較して優れた相乗効果をもたらした。加えて、デュオカルマイシンの強化作用は、ＣＨＫ１ノックダウン細胞よりもＡＴＲノックダウン細胞に対してより強力だった。まとめると、相乗効果が一貫してより強力であるため、デュオカルマイシンとＡＴＲ阻害剤との薬物組合せを用いて研究を進めた。
実施例２：デュオカルマイシンライブラリーとＡＴＲ阻害剤ＡＺＤ６７３８との相乗的薬物組合せ
相乗的薬物組合せであるＤＵＢＡ＋ＡＺＤ６７３８を特定した後で、一連のデュオカルマイシン変異体を研究した。これにより、観察された相乗作用がＤＵＢＡにより引き起こされた効果ではなく、概してデュオカルマイシンによるものであることが検証されるはずである。そのために、デュオカルマイシン変異体を、それらの構造的特徴に従って２つの群にクラスター化した。トリメトキシインドール（ＴＭＩ）系統では、デュオカルマイシンの結合単位は一定に保たれるが、アルキル化単位は様々である。デュオカルマイシンＳＡ（１３）及びＣＢＩ－ＴＭＩ（２４）のアルキル化単位は、三環からなり、立体電子特性が異なる。後者のアルキル化単位はキラル中心を有する。これとは対照的に、３つのアキラルなデュオカルマイシン変異体を調査した。これらのうち、２つの変異体デュオカルマイシン３５及び３６は、二環式アルキル化単位を有し、３７は単環式アルキル化単位を有していた。ＴＭＩ系統の構造は、表４にまとめられている。
Figure 2022505041000049
ＴＭＩ系統は、デュオカルマイシンとＡＴＲ阻害剤との相乗作用に対するアルキル化単位の影響を解明することができる。シクロプロパベンゾインドール（ＣＢＩ）系統（表５）を使用して、デュオカルマイシン変異体とＡＴＲｉとの相乗効果に対する結合単位の影響を研究した。ＣＢＩ系統では、アルキル化単位は一定に保たれており、Ｒ１のメチル又は水素のようなわずかな修飾しかなく、結合単位は様々である。
Figure 2022505041000050
ＡＴＲｉ ＡＺＤ６７３８と組み合わせたデュオカルマイシン変異体の相乗効果を研究するために、ＨＣＣ－１９５４細胞を、単剤又は２つの対応する薬物の組合せのいずれかで処置した。６日間の処置後、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ発光アッセイを実施し、Ｅｎｖｉｓｉｏｎ Ｒｅａｄｅｒで発光を読み取った。上記に記載のようにＧｅｎｅＤａｔａ Ｓｃｒｅｅｎｅｒを使用して結果を分析した。アッセイの結果は、デュオカルマイシン変異体の効力、及びＡＺＤ６７３８と組み合わせた各変異体の相乗作用スコアだった。
ＨＣＣ－１９５４細胞に対するＴＭＩ系統の効力は、非常に分散していた（表４）。ＤＳＡ（１３）のＩＣ５０値はナノモル未満であり、０．３±０．１ｎＭだったが、単環式アルキル化単位３７を有するデュオカルマイシン変異体のＩＣ５０値はマイクロモルであり、１．２±０．５μＭだった。ＴＭＩ系列の残りのデュオカルマイシン変異体の効力は、その中間である。デュオカルマイシン３６は、３．０±０．５ｎＭという１桁台のナノモル範囲の効力を有していた。２４及び３５は、それぞれ２４±３２ｎＭ及び４３．５ｎＭのＩＣ５０値を有する。ＣＢＩ系列のデュオカルマイシンの効力は、より均一に分布していた（表５）。デュオカルマイシンＤＭ（３８）は、０．１２±０．０３ｎＭのＩＣ５０値を有し、ＤＵＢＡ（１０）は、０．２±０．１ｎＭのＩＣ５０値を有していた。化合物３９は、０．１６ｎＭの効力を有し、デュオカルマイシン４０は、１．６ｎＭの効力を有していた。
試験した全ての化合物で、以前に決定された相乗作用スコアのカットオフである１を超えていた。しかしながら、相乗作用スコアは、ＴＭＩ系列では大きく異なっていた。二環式アキラルアルキル化単位３６を有するデュオカルマイシンは、ＡＺＤ６７３８と組み合わせると６．７±０．８の相乗作用スコアに達し、その次が三環式キラルアルキル化単位ＣＢＩ－ＴＭＩ（２４）（Ｓ＝６．１±１．２）及びＤＳＡ（１３）（Ｓ＝４．１±０．４）を有するデュオカルマイシンだった。二環式アキラルアルキル化単位を有する薬物３５は、ＡＺＤ６７３８と一緒に投与すると、５．２±０．２のスコアを示した。最も弱い相乗効果は、単環式アキラルアルキル化ユニットを含むデュオカルマイシン３７で得られた（Ｓ＝２．８±０．５）。ＣＢＩ系統では、差異はそれほど顕著ではなかった。デュオカルマイシンＤＤＭ（３８）及び３９は、互いに近接した相乗作用スコアを示した（それぞれ、Ｓ＝５．６±１．７及びＳ＝５．１）。アルキル化単位としてメチルＣＢＩ単位を有するデュオカルマイシンも、同等の相乗作用スコアを示した。ＤＵＢＡ（１０）は、ＡＺＤ６７３８と組み合わせると、Ｓ＝６．９±０．７の相乗作用スコアを示し、ＤＵＢＡ前駆体４０とＡＺＤ６７３８との組合せは、Ｓ＝６．７だった。
薬物ＤＤＭ（３８）及びＤＵＢＡ（１０）を、更なる実験のために選択した。デュオカルマイシンは、その構造的特徴に関わらず、ＡＴＲｉ ＡＺＤ６７３８と相乗作用した。デュオカルマイシン変異体ＤＵＢＡが、他のＡＴＲ阻害剤とも相乗作用するか否かを調査した。
実施例３：ＡＴＲ阻害剤の生物学的活性
ＡＺＤ６７３８との組合せ実験では、デュオカルマイシン変異体は、相乗効果の程度に役割を果たすことが確認された。この研究では、組合せ効果に対するＡＴＲｉの影響を解明するために、幾つかの異なるＡＴＲ阻害剤を調査した。この報告で研究されたＡＴＲｉの化学構造の概要は図５に示されている。ＡＴＲｉを、４つの群にクラスター化した。Ａｓｔｒａ ＺｅｎｅｃａのＡＺ２０及びＡＺＤ６３７８に由来するＡＴＲｉは、同一のコア単位と密接に関係している。ＢａｙｅｒのＡＴＲ阻害剤も、同じコア単位を有していた。３つのＢａｙｅｒのＡＴＲｉは、Ｒ１が異なるに過ぎなかった。第Ｉ相ＡＴＲｉ ＢＡＹ１８９５３４４は、ピラゾール残基を保持し、ＡＴＲｉ ＢＡＹ７３は、Ｒ１にメタンスルホンピリジン残基を保持していた。ＢａｙｅｒのＡＴＲｉ ＢＡＹ２８６は、Ｒ１にメタンスルホン部分を保持していた。ＶＥ－８２２は、残りのクラスターとは構造的に無関係だった。
表６には、ＡＴＲｉの特徴的な特性及び化学構造がまとめられている。Ａｓｔｒａ Ｚｅｎｅｃａが開発した２つの化合物、即ちＡＺ２０（ＡＴＲｉ２）及び第Ｉ相ＡＴＲｉ ＡＺＤ６７３８（ＡＴＲｉ３）を研究した。更に、Ｂａｙｅｒの化合物が含まれていた。第Ｉ相ＡＴＲｉ ＢＡＹ１８９５３４４（ＡＴＲｉ １）、並びにそれぞれＢＡＹ７３（６）及びＢＡＹ２８６（ＡＴＲｉ５）と称される、ＢａｙｅｒＡＧ１４９による特許の実施例７３又は実施例２８６として公表されている２つのＡＴＲｉを研究した。更に、ＡＴＲｉ １及びＭｅｒｃｋの第Ｉ相ＡＴＲｉ ＶＥ－８２２（ＡＴＲｉ７）を調査した。細胞傷害性は、ＨＣＣ－１９５４細胞に対する抗増殖効力により表した。
ＡＺＤ６７３８は、このパネルでは最も効力が低いＡＴＲｉであり（２．２±０．７μＭ）、その次が、１．６±０．５μＭのＩＣ５０値を有するＡＺ２０であった。ＶＥ－８２２は、マイクロモル未満の範囲で効力があり、０．９±０．４μＭの効力を有していた。効力は、ＡＴＲｉ １（０．４±０．２μＭ）、及びＢａｙｅｒのＢＡＹ１８９５３４４（０．０５±０．０２μＭ）、ＢＡＹ７３（０．１２±０．０３μＭ）、ＢＡＹ２８６（０．０８±０．０２μＭ）の薬物で増加した。加えて、細胞傷害性を、ＮＣＩ－Ｎ８７細胞及びＭＤＡ－ＭＢ－４５３細胞で決定した。ＡＴＲｉ １は、ＮＣＩ－Ｎ８７細胞（０．３６±０．０７ｎＭ）及びＭＤＡ－ＭＢ－４５３（０．３２±０．５ｎＭ）細胞に対して、ＨＣＣ－１９５４と同じ範囲で効力があったが、ＢＡＹ１８９５３４４の効力は、細胞株間でより大きく異なっていた。ＢＡＹ１８９５３４４は、ＨＣＣ－１９５４細胞と比較すると、ＮＣＩ－Ｎ８７（０．３±０．３ｎＭ）及びＭＤＡ－ＭＢ－４５３（０．２±０．２ｎＭ）では著しく効力が低かった。その一方で、ＡＺＤ６７３８は、ＨＣＣ－１９５４細胞に対する効力と比較して、ＮＣＩ－Ｎ８７細胞（０．９８±０．０９ｎＭ）及びＭＤＡ－ＭＢ－４５３（１．１±０．３ｎＭ）細胞に対してはおよそ２倍の効力があった。
Figure 2022505041000051
Figure 2022505041000052
実施例４ ＡＤＣ生成
デュオカルマイシン担持ＡＤＣの生成
この研究では、幾つかのデュオカルマイシン担持ＡＤＣを、がん関連受容体チロシンキナーゼ ＨＥＲ２、ＥＧＦＲ、及び間葉上皮移行（ＭＥＴ）を標的とする抗体に基づいて生成した。こうした抗体にカップリングされたリンカー－薬物は、タグＬＤ Ｘで指定した。この場合、Ｘは、特定の構造のインデックス番号を指す。得られるＡＤＣの名称は、標的又は抗体の名称及びリンカー－薬物インデックス番号で構成されていた。例えば、リンカー－薬物１（ＬＤ－１）及び抗ＥＧＦＲ（αＥＧＦＲ）抗体又は抗ＨＥＲ２（αＨＥＲ２）で構成されるＡＤＣは、それぞれαＥＧＦＲ－１又はαＨＥＲ２－１という名称を保持していた。
デュオカルマイシン担持ＡＤＣを生成するためのリンカー－薬物は、表７にまとめられている。リンカー－薬物の基本構造には、カテプシンＢで切断することができるジペプチドバリン－シトルリンリンカーが使用されている。ジペプチドは、自己犠牲型モジュールの後にあり、それにより切断時の効率的な薬物放出が保証される。自己犠牲型モジュールは、Ｒ２位にメチル基又はジエチルグリコール部分のいずれかを保持する。この基本構造は、Ｒ１のＮ末端が伸長される。リンカー－薬物ＬＤ－１～ＬＤ－５は、ソルターゼＡ（ＳｒｔＡ）媒介性コンジュゲーションを可能にするために、Ｎ末端三重グリシン配列を含む。リンカー－薬物の溶解度を増加させるために、幾つかの修飾を導入した。ＬＤ－２及びＬＤ－５は、エチレングリコールで修飾されている。溶解度は電荷によっても媒介される場合があるため、ＬＤ－３は、生理学的ｐＨで正に荷電されるリジンを含む。ＬＤ－６は、化学的コンジュゲーション技法によりコンジュゲートした。ＬＤ－７は、チオールとのコンジュゲーションのために、マレイミドモチーフによりＮ末端が修飾されている。両リンカーには、溶解度を増加させるためにエチレングリコール単位が組み込まれている。デュオカルマイシン変異体ＤＤＭ（ＬＤ－１）、ＤＵＢＡ（ＬＤ－２～ＬＤ－６）、及びＤＳＡ（ＬＤ－７）を、Ｒ３における薬物として使用した（図６を参照）。
Figure 2022505041000053
Figure 2022505041000054
ＳｒｔＡコンジュゲーションを使用して、ＬＤ－１とαＨＥＲ２ ｍＡｂとのコンジュゲーションを実施した。そのために、（Ｇ4Ｓ）3－ＬＰＥＴＧＳでＣ末端を修飾した抗体を、ＬＤ－１、ＣａＣｌ2溶液、及び緩衝液と混合した。次いで、ＳｒｔＡを添加して反応を開始させた。２２℃で３０分間振とうした後、過剰量のＥＤＴＡを添加して反応を停止させた。次いで、試料をプロテインＡクロマトグラフィーに供した。通過画分を廃棄し、洗浄工程の後で、酸性ｐＨシフトを使用してＡＤＣを溶出した。緩衝液交換及び濃縮後、得られた精製ＡＤＣを、分析的ＨＩＣ及びＳＥＣにより分析した。
ＡＤＣの生産性に対するデュオカルマイシンリンカー－薬物の影響を研究するために、この研究の過程では、αＨＥＲ２ ｍＡｂをツール抗体として使用した。そのために、ＬＤ－１～ＬＤ－５を、まずは分析規模反応で、ＳｒｔＡ媒介性コンジュゲーションによりαＨＥＲ２ ｍＡｂとコンジュゲーションした。ＬＤ－４は、得られた産物が沈殿したため、αＨＥＲ２ ｍＡｂにコンジュゲーションすることができなかった。ＬＤ－５は、分析規模反応でαＨＥＲ２ ｍＡｂとコンジュゲーションすることに成功した。しかしながら、コンジュゲーション反応は不完全であり、ＤＡＲがおよそ１であるＡＤＣに結び付いた。リンカー－薬物ＬＤ－１、ＬＤ－２、及びＬＤ－３は、分取規模にて、抗体形式Ａを使用したαＨＥＲ２ ｍＡｂとのカップリングに成功した。この設定では、ＤＡＲが＞１．８５である均質なＡＤＣが調製された。ＡＤＣの単量体含有量は少なくとも９５％だった。ＤＵＢＡに基づくリンカー－薬物ＬＤ２及びＬＤ－３は、それぞれ優れた収率又は非常に良好な収率でαＨＥＲ２ ｍＡｂにコンジュゲートされたが、αＨＥＲ２－１の調製は、不良な収率～良好な収率で実施された。
それに加えて、ＬＤ－１を、αＥＧＦＲ ｍＡｂセツキシマブ、並びにｍＡｂ αＭＥＴ、αＭＥＴ×ＥＧＦＲ、及びαＨＥＬ（鶏卵リゾチーム、アイソタイプ対照）にコンジュゲートした。得られたＡＤＣを、許容可能な収率で調製した。αＨＥＬ－１の調製では１．９０のＤＡＲが達成され、αＥＧＦＲ－１及びαＭＥＴ－１の調製では、それぞれ１．７０及び１．６８のＤＡＲを有するＡＤＣが得られた。αＭＥＴ×ＥＧＦＲ－１ ＡＤＣの場合、それぞれ０．８９及び０．９５のＤＡＲが達成された。こうしたＡＤＣの単量体含有量は、単量体含有量が９３．６％と最も低かったαＭＥＴ－１を除いて、許容可能だった。
Figure 2022505041000055
ＡＤＣ αＨＥＲ２－６は、化学コンジュゲーション技法を使用して生成し、１．９０のＤＡＲを有するＡＤＣがもたらされた。αＥＧＦＲ－７は、ＬＤ－７を鎖間システインとコンジュゲーションすることにより産生した。１．５４のＤＡＲが達成された。両ＡＤＣは、ごく少量の凝集体しか含んでいなかった。
実施例５：デュオカルマイシンに基づくＡＤＣの細胞傷害性
この章には、デュオカルマイシンに基づくＡＤＣの抗増殖効果が記載されている。ＡＤＣ αＨＥＲ２－１の細胞傷害性を、ＨＥＲ２陽性細胞で研究した。細胞パネルには、乳がん細胞株ＢＴ－４７４、ＨＣＣ－１９５４、ＪＩＭＴ－１、ＭＤＡ－ＭＢ－３６１、ＭＤＡ－ＭＢ－４５３、及びＳＫ－ＢＲ－３、並びに肺腺癌細胞株Ｃａｌｕ－３が包含されていた。更に、ＡＤＣを、ＨＥＲ２陰性乳がん細胞株ＭＤＡ－ＭＢ－４６８で試験した。αＨＥＲ２－１は、ＨＥＲ２陽性細胞株では、２桁台のピコモル～１桁台のナノモル範囲で活性であり、ＨＥＲ２陰性細胞株ＭＤＡ－ＭＢ－４６８では、より低い３桁台のナノモル範囲で弱い細胞傷害性しか示さなかった。ＡＤＣ αＨＥＲ２－２及びαＨＥＲ２－３は、Ｃａｌｕ－３細胞、ＨＣＣ－１９５４細胞、及びＳＫ－ＢＲ－３細胞に対して、αＨＥＲ２－１と同様に細胞傷害性だった。しかしながら、カドサイラは、Ｃａｌｕ－３に対して、デュオカルマイシンに基づくＡＤＣと比較して５分の１～４５分の１の効力しか示さなかった。カドサイラ並びにαＨＥＲ２－２及びαＨＥＲ２－３は、抗原陰性細胞に対して、２桁台のナノモル範囲で効力を示した。非標的指向性ＡＤＣ αＨＥＬ－１は、ＨＥＲ２陽性細胞に対して、２桁台～３桁台のナノモル範囲の弱い抗増殖効果を呈した。ＡＤＣ αＨＥＲ２－６は、ＮＣＩ－Ｎ８７及びＭＤＡ－ＭＢ－４５３に対してナノモル未満のＩＣ５０値を示し、これはカドサイラの効果と同等だった。αＨＥＲ２－６は、ＮＣＩ－Ｎ８７細胞に対して、αＨＥＲ２－２と同等の効力を示した。
Figure 2022505041000056
ｉｎ ｖｉｔｒｏデータのみが利用可能である初期薬物開発段階では、治療指数は、オンターゲット及びオフターゲット選択性に基づいて評価することができる。標的選択性は、必ずしもｉｎ ｖｉｖｏでの治療指数の増加と相関するわけではないが、より高い標的選択性が、治療濃度域の向上にも結び付いた例が多数存在する。従って、抗原発現細胞に対するＡＤＣの選択性指数（ＳＩ）を、数式（４）に従って算出して、ＡＤＣを順位付けた。個々のＡＤＣの選択性指数を、標的陰性細胞のＩＣ５０を標的陽性細胞のＩＣ５０で除算することにより決定した。
Figure 2022505041000057
個々のＡＤＣの選択性指数は、図７に図示されている。ＡＤＣ αＨＥＲ２－１は、試験した中で最も選択性のＡＤＣであり、平均選択性指数は６３９だった。平均選択性指数が６７及び４３であるＡＤＣ αＨＥＲ２－２及びαＨＥＲ２－３は、平均選択性指数が１１０であるカドサイラよりも弱く選択性が低い。非標的指向性ＡＤＣ αＨＥＬ－１の平均選択性指数はおよそ１であり、これは、αＨＥＬ－１が標的非依存的な細胞死滅特性を発揮することを示す。小分子薬物ＤＤＭ及びＤＵＢＡは、研究した他の細胞株よりも低い用量でＭＤＡ－ＭＢ－４６８細胞を死滅させ、それぞれ０．１５及び０．１４の選択性指数に結び付いた。
αＨＥＲ２ ｍＡｂ及びαＥＧＦＲ ｍＡｂに加えて、αＭＥＴ ｍＡｂ及び二重特異性αＭＥＴ×ＥＧＦＲ ｍＡｂを、ＡＤＣ生成のために使用した。得られたＡＤＣの抗増殖特性を研究した（表１０）。受容体ＥＧＦＲ及びＭＥＴの表面発現は、１細胞当たり１０，０００～１００，０００コピーの場合は陽性、１００～１０００コピーの場合は二重陽性、＞１０００コピーの場合は三重陽性と分類した。ＡＤＣ αＥＧＦＲ－１及びαＭＥＴ－１は、ＡＤＣのＩＣ50値が４５ｎＭだったＭＫＮ－４５に対するαＥＧＦＲ－１を除いて、ＥＧＦＲ陽性細胞及びＭＥＴ陽性細胞に対してナノモル未満の範囲で効力を示した。αＭＥＴ×ＥＧＦＲ－１は、研究した細胞株に対しては効力がより低く、ＩＣ50値は１桁台のナノモル範囲だった。ＡＤＣ αＥＧＦＲ－７は、ナノモル未満の範囲でＡ４３１細胞及びＭＤＡ－ＭＢ－４６８細胞を死滅させた。ＥＧＦＲ陰性ＭＣＦ７細胞では、デュオカルマイシンＤＭ担持ＡＤＣ αＥＧＦＲ－１及びＤＳＡ保持αＥＧＦＲ－７は、１桁台～２桁台のナノモル範囲で効力がかなり低かった。遊離薬物ＤＤＭ及びＤＳＡは、表面受容体ステータスに関わりなく、ナノモル未満の範囲で全ての細胞株に対して効力を示した。
Figure 2022505041000058
個々のセツキシマブ－デュオカルマイシンＡＤＣ間の差異を更に解明するために、選択性指数を、ＡＤＣ αＥＧＦＲ－１及びＡＤＣ αＥＧＦＲ－７のＩＣ50値並びにＥＧＦＲ陽性細胞株及びＥＧＦＲ陰性細胞株ＭＣＦ７に対するそれぞれの小分子対応物を使用して、数式２に従って算出した。結果は、図８に図示されている。ＡＤＣ αＥＧＦＲ－１は、ＡＤＣ αＥＧＦＲ－７と比較して（Ａ４３１に対してはＳＩ＝４０、及びＭＤＡ－ＭＢ－４６８に対して１４８）、細胞株Ａ４３１（ＳＩ＝１６２）及びＭＤＡ－ＭＢ－４６８（ＳＩ＝２２２）に対してより選択的だった。αＥＧＦＲ－１は、ＮＣＩ－Ｈ１９７５細胞（ＳＩ＝２５７）に対して選択的だったが、ＭＫＮ－４５細胞（ＳＩ＝０．６）に対しては選択性を示さなかった。αＥＧＦＲ－１の平均選択性指数は１６１であり、αＥＧＦＲ－７は９４だった。小分子デュオカルマイシンＤＤＭ及びＤＳＡは、ＥＧＦＲ過剰発現細胞株に対して選択性を示さなかった（それぞれ、ＳＩ平均＝０．５及び０．３）。
実施例６：デュオカルマイシン－ＡＤＣとＡＴＲｉとの相乗作用
αＨＥＲ２－デュオカルマイシンＡＤＣ及びＡＴＲｉの組合せの相乗作用
ＨＣＣ－１９５４を、ＡＺＤ６７３８と組み合わせたＤＤＭ、ＤＵＢＡ、及び対応するＤＤＭ担持αＨＥＲ２－１、及びＤＵＢＡ保持ＡＤＣ αＨＥＲ２－２（図９）で６日間処置した。次いで、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏキットを使用して細胞傷害性を決定した。Ｅｎｖｉｓｉｏｎリーダーで発光を読み取り、ＧｅｎｅＤａｔａ Ｓｃｒｅｅｎｅｒを使用してデータを評価した。ＤＤＭとＡＺＤ６７３８との組合せ（Ｓ＝５．６±１．７）は、対応するＡＤＣ αＨＥＲ２－１（Ｓ＝５．１±２．０）と同等に相乗的だった。ＤＵＢＡとＡＺＤ６７３８との組合せ（６．９±０．７）及びαＨＥＲ２－２＋ＡＺＤ６７３８の組合せ（７．２±１．０）についても同じ結論を導き出すことができる。
陽性対照として、ＨＣＣ－１９５４細胞に対して、ＳＮ－３８及びゲムシタビンをＡＺＤ６７３８と組み合わせた。ＳＮ－３８並びにゲムシタビンは、ＡＺＤ６７３８と相乗作用した（Ｓ＝７．２±０．８及びＳ＝６．９±０．３）。しかしながら、微小管阻害剤ＭＭＡＥは、ＨＣＣ－１９５４細胞に対する、ＡＴＲｉ ＡＺＤ６７３８（Ｓ＝２．２±０．１）並びにＡＺＤ６７３８と組み合わせた微小管阻害性ＡＤＣ カドサイラ（Ｓ＝１．３±０．７）との相乗作用は弱かった。この場合、６．４の相乗作用スコアが得られた１つの測定値を除外した。従って、相乗効果に対する２つの分子部分の影響を解明するために、αＨＥＲ２ ｍＡｂトラスツズマブ及びＤＭ１をＡＺＤ６７３８と組み合わせた。トラスツズマブは、ＨＣＣ－１９５４細胞に対して、ＡＺＤ６７３８と相乗作用しなかったが（Ｓ＝－０．２±０．２）、ＤＭ１及びＡＺＤ６７３８は、相乗的な細胞死滅に結び付いた（Ｓ＝２．８±０．５）。
更に、ＡＤＣ αＨＥＲ２－２又は対応する小分子ＤＵＢＡとの組合せの相乗効果に対する異なるＡＴＲｉの影響を、ＨＣＣ－１９５４細胞で研究した。ＨＣＣ－１９５４細胞に対して、αＨＥＲ２－２とＡＴＲｉ １との組合せは、αＨＥＲ２－２とＡＺＤ６７３８との組合せよりも有意に強力であり（Ｐ＝．０３）、スコアは１２．５±１．７だった。ＡＤＣ αＨＥＲ２－２をＢＡＹ１８９５３４４と組み合わせると、ＡＺＤ６７３８と組み合わせたαＨＥＲ２－２よりも有意に強力であり（Ｐ＝．００３）、相乗作用スコアは１３．１±１．０だった。ＡＴＲｉ ＶＥ－８２２及びＡＺ２０は、αＨＥＲ２－２との相乗作用がＡＺＤ６７３８と同等であり、相乗作用スコアは、それぞれ５．７±０．３及び５．８±０．４だった。αＨＥＲ２－２と組み合わせたＢＡＹ７３は、１４．４±１．１という最も高い相乗作用スコアを示した。ＢＡＹ２８６＋αＨＥＲ２－２は、１０．４±０．２という中間範囲の相乗作用スコアを示した。ＨＣＣ－１９５４細胞に対する、ＡＴＲｉ ＡＺ２０（Ｓ＝５．１±０．５）、ＡＴＲｉ １（Ｓ＝１２．０±０．６）、ＢＡＹ１８９５３４４（Ｓ＝１２．８±０．５）、ＢＡＹ７３（Ｓ＝１２．４±０．８）、ＢＡＹ２８６（Ｓ＝９．５±０．８）、及びＶＥ－８２２（Ｓ＝５．３±０．６）と組み合わせたＤＵＢＡの相乗作用スコアは、対応する同じＡＴＲｉと組み合わせたＡＤＣ αＨＥＲ２－２と同様だった。
次の実験では、ＮＣＩ－Ｎ８７細胞及びＭＤＡ－ＭＢ－４５３細胞に対して、ＡＤＣ αＨＥＲ２－２及びαＨＥＲ２－６を、３つのＡＴＲ阻害剤ＡＺＤ６７３８、ＡＴＲｉ １、及びＢＡＹ１８９５３４４と組み合わせた。対照として、小分子ＤＵＢＡ及びゲムシタビン並びにＡＤＣ対照としてのカドサイラを、ＡＴＲｉ ＡＺＤ６７３８と組み合わせた（図１０）。αＨＥＲ２－２は、ＮＣＩ－Ｎ８７細胞に対して、昇順でＡＴＲｉ ＡＺＤ６７３８（Ｓ＝３．７±０．７）、ＡＴＲｉ １（Ｓ＝７．１±０．８）、及びＢＡＹ１８９５３４４（Ｓ＝７．６±０．４）と相乗作用した。αＨＥＲ２－２＋ＡＴＲｉ １（Ｐ＝．００８）及びＢＡＹ１８９５３４４（Ｐ＝．０００７）との組合せは、ＡＤＣ＋ＡＴＲｉ ＡＺＤ６７３８の組合せよりも有意に相乗的だった。別のＤＵＢＡ－ＡＤＣ αＨＥＲ２－６の組合せでも同じ傾向が観察された。この場合も、ＡＺＤ６７３８（Ｓ＝３．０±０．０５）との組合せは、最も低いスコアを示し、ＡＴＲｉ １との組合せ（Ｓ＝６．１±０．４）は中間範囲を示し、ＢＡＹ１８９５３４４との組合せ（Ｓ＝７．０±０．２）は最も高いスコアを示した。直接的に比較すると、αＨＥＲ２－６とＡＺＤ６３７８の組合せのＳは、αＨＥＲ２－６とＡＴＲｉ １（Ｐ＝．００９）及びＢＡＹ１８９５３４４（Ｐ＝．０００２）との組合せよりも有意に低かった。陽性対照として、ＤＵＢＡを、ＡＴＲｉ ＡＺＤ６７３８と組み合わせた。Ｓ＝３．１±０．６の相乗作用スコアは、デュオカルマイシン誘導体とＡＴＲｉとの相乗作用を証明する。αＨＥＲ２－６とＡＺＤ６７３８との組合せは、その小分子対応物であるＤＵＢＡとＡＺＤ６７３８との組合せと比較して同等に相乗的だった（Ｐ＝．３）。陰性対照であるカドサイラは、ＡＺＤ６７３８と組み合わせた場合、相加効果しか示さなかったが（Ｓ＝０．３±０．２）、ベンチマークであるゲムシタビンは、ＡＴＲｉ ＡＺＤ６３７８と組み合わせた場合、カットオフスコアをわずかに超えた（Ｓ＝１．１±０．５）。デュオカルマイシン－ＡＤＣ αＨＥＲ２－６は、陰性対照であるカドサイラ（Ｐ＝．００３）及び陽性対照であるゲムシタビン（Ｐ＝．００１）と比較して、ＡＴＲｉ ＡＺＤ６７３８と有意により強力に相乗作用した。
ＭＤＡ－ＭＢ－４５３細胞に対しても同様の結果が得られた。この場合、αＨＥＲ２－２は、昇順でＡＴＲｉ ＡＺＤ６７３８（Ｓ＝９．１±２．１）、ＡＴＲｉ １（Ｓ＝１３．３±０．３）、及びＢＡＹ１８９５３４４（Ｓ＝１４．７±２．３）と相乗作用した。同じ傾向が、αＨＥＲ２－６＋ＡＺＤ６７３８（Ｓ＝９．５±０．９）、ＡＴＲｉ １（Ｓ＝１１．４±１．４）、及びＢＡＹ１８９５３４４（Ｓ＝１５．８±０．５）とでも観察された。ゲムシタビンは、ＮＣＩ－Ｎ８７に対してよりもＭＤＡ－ＭＢ－４５３に対して（Ｓ＝１．６±１．２）、ＡＺＤ６７３８とわずかにより強力に相乗作用した。カドサイラとＡＺＤ６７３８との陰性対照組合せは、１．１±０．３の相乗効果スコアに達した。これは、非常に弱い相乗作用を示すカットオフスコアをわずかに上回る。陽性対照ＤＵＢＡは、ＭＤＡ－ＭＢ－４５３細胞に対してでも、ＡＺＤ６７３８と相乗作用を示したが（Ｓ＝５．０±０．５）、αＨＥＲ２－６と対応するＡＴＲｉとの組合せよりも有意により弱かった（Ｐ＝．０１）。
この研究では、ＨＣＣ－１９５４細胞、ＭＤＡ－ＭＢ－４５３細胞、及びＮＣＩ－Ｎ８７細胞に対するデュオカルマイシン及びデュオカルマイシンに基づくＡＤＣとの組合せ効果に対するＡＴＲｉの効果を解明するために、合計で７つのＡＴＲｉを調査した。デュオカルマイシンＤＵＢＡ又はＤＵＢＡに基づくＡＤＣと組み合わせた個々のＡＴＲｉ（図９及び図１０に提示されている）の相乗作用スコアを、リン酸化を阻害するそれらの効力に対してプロットした。そのために、ＨＴ２９後のＣＨＫ１の活性化に、ヒドロキシ尿素で処置することによりストレスを与えた。このプロットは、図１１に図示されている。小分子ＤＵＢＡをＡＴＲｉと共に用いると、ＨＣＣ－１９５４に対するＡＴＲｉの効力と相乗作用スコアとの間に相関性が観察された。この知見は、ＨＣＣ－１９５４に対してＡＴＲｉライブラリと組み合わせたＡＤＣ αＨＥＲ２－２でも確認された。ＭＤＡ－ＭＢ－４５３細胞及びＮＣＩ－Ｎ８７細胞に対して、ＡＴＲｉのサブセットと組み合わせたαＨＥＲ２－２及びαＨＥＲ２－６でも同じ相関性が観察された。
αＥＧＦＲ－デュオカルマイシンＡＤＣ及びＡＴＲｉの組合せの相乗作用
デュオカルマイシン修飾ＡＤＣをＡＴＲｉと組み合わせるという概念を、追加の抗体に当てはめることができることを検証するため、セツキシマブに基づくデュオカルマイシン－ＡＤＣを調査した。そのために、ＥＧＦＲ陽性細胞株Ａ５４９、Ａ４３１、及びＭＤＡ－ＭＢ－４６８、並びにＥＧＦＲ陰性ＭＣＦ７細胞を、ＡＺＤ６７３８と組み合わせたＤＤＭに基づくαＥＧＦＲ－１、ＤＳＡに基づくαＥＧＦＲ－７で処置した。対照として、細胞を、ＭＭＡＥ－ＡＤＣ αＥＧＦＲ並びに小分子デュオカルマイシンＤＤＭ及びＤＳＡでも処置した。６日間の処置後、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ試薬を使用して細胞生存率を決定した。Ｅｎｖｉｓｉｏｎリーダーで発光を読み取り、ＧｅｎｅＤａｔａ Ｓｃｒｅｅｎｅｒを使用して評価を行った。データは、図１２に示されている。陰性対照であるＡＤＣ αＥＧＦＲの相乗作用スコアは、相加性の範囲内だった。陽性対照であるＤＤＭは、Ａ５４９に対しての２．０±１．１からＭＤＡ－ＭＢ－４６８細胞に対しての６．０±１．０までの範囲の相乗作用スコアを示した。Ａ４３１、ＭＤＡ－ＭＢ－４６８、及びＭＣＦ７に対する小分子ＤＳＡの相乗作用スコアは同等だった。しかしながら、ＤＳＡは、Ａ５４９細胞に対してＡＺＤ６７３８と相乗作用しなかったが、相加効果を示した。αＥＧＦＲ－１＋ＡＺＤ６７３８の組合せの相乗作用は、Ａ５４９（Ｓ＝３．９±１．０）細胞、Ａ４３１（Ｓ＝３．９±０．３）細胞、及びＭＤＡ－ＭＢ－４６８（Ｓ＝４．２±０．３）細胞に対しては非常に類似していたが、ＭＣＦ７に対する相乗作用スコア（Ｓ＝２．２±０．１）は、ＭＤＡ－ＭＢ－４６８（Ｐ＝．００６）又はＡ４３１（Ｐ＝．０１）に対してＡＺＤ６７３８と組み合わせたαＥＧＦＲ－１と比較して有意に低かった。しかしながら、ＤＳＡ－ＡＤＣ αＥＧＦＲ－７とＡＴＲｉとの組合せでは、効果はそれほど明確ではなかった。Ｃ－７＋ＡＺＤ６７３８の相乗作用スコアは、Ａ４３１に対しては４．４±０．６、Ａ５４９に対しては２．９±１．１、ＭＤＡ－ＭＢ－４６８細胞に対しては３．２±０．４だった。この組合せでは、ＥＧＦＲ陰性細胞株ＭＣＦ７に対する相乗作用スコアは、２．３±０．１に達した。これは、Ａ４３１細胞に対してこの組合せで得られたものよりも有意に低い（Ｐ＝．０３）。
ＡＴＲｉとのαＨＥＲ２－デュオカルマイシン組合せの用量低減
併用療法の安全性を向上させるための戦略は、投与用量の低減である。前章では、ＡＴＲｉと組み合わせたデュオカルマイシン担持ＡＤＣは、がん細胞に対して相乗的な毒性効果を見せたことが実証された。しかしながら、相乗効果を相乗作用スコアとして表しても、同じ細胞効果を維持しつつ、組み合わせた薬物の用量をどのくらい低下させることができるかについて推定することは可能ではなかった。従って、ＡＴＲｉを有効用量未満で添加した場合に、デュオカルマイシン担持ＡＤＣの効力がどのくらい強力に増加するのかを研究した。
最大非有効用量（ＭＮＥＤ）曲線シフトアッセイでの用量低減指数（ＤＲＩ）の決定は、図１３に例示的に図示されるように、３工程プロセスである。最初の工程では、ＡＤＣの細胞傷害性を細胞生存率アッセイで確認する。ここでは、ＨＣＣ－１９５４細胞を、αＨＥＲ２－１、αＨＥＲ２ ｍＡｂトラスツズマブ（Ｔ）、及び対照ＡＤＣ αＨＥＬ－１で６日間処置し、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏキットを使用して細胞生存率を測定した。αＨＥＲ２－１のＩＣ50値は１．１ｎＭだったが、ネイキッドｍＡｂは、いかなる抗増殖効果も示さなかった。アイソタイプ対照ＡＤＣ αＨＥＬ－１は、２５０ｎＭで細胞生存率を７５％へと低減させたが、細胞傷害性はαＨＥＲ２－１よりもかなり低かった。２番目の工程では、ＡＴＲｉに対するＭＮＥＤを決定した。そのために、細胞をＡＴＲｉ １で処置し、用量反応曲線（ＤＲＣ）をプロットしてＭＮＥＤを特定した。この場合、ＭＮＥＤは４０ｎＭだった。こうしたデータを得た上で、最終工程であるＭＮＥＤ曲線シフトアッセイへと進んだ。そのために、ＨＣＣ－１９５４細胞を、αＨＥＲ２－１の系列希釈物又は４０ｎＭのＡＴＲｉ １で補完されたαＨＥＲ２－１の系列希釈物で処置した。組合せの完全なＤＲＣを得るために、ＡＤＣの開始濃度を、工程１の実験よりも低くした。αＨＥＲ２－１のＩＣ50値は２．５ｎＭだった。αＨＥＲ２－１と４０ｎＭのＡＴＲｉ １との組合せは、０．０５９ｎＭの効力を示した。ＡＤＣ単独と比較した組合せのこの強化作用は、４２のＤＲＩとして表すことができる。ＡＴＲｉ １は、４０ｎＭでは細胞生存率を低減させなかった。
細胞株は、αＨＥＲ２－１及びＡＴＲｉの併用処置に対して異なる応答を示す可能性があるため、ＡＺＤ６７３８及びＶＥ－８２２のＭＮＥＤを、ＨＥＲ２陽性細胞株のパネルに対して及びＨＥＲ２陰性細胞株ＭＤＡ－ＭＢ－４６８に対して決定した。加えて、ＢＡＹ７３及びＡＴＲｉ１のＭＮＥＤを、ＨＣＣ－１９５４細胞に対して測定した。ＨＥＲ２陽性細胞株及びＨＥＲ２陰性細胞株ＭＤＡ－ＭＢ－４６８のＭＮＥＤは、表１１にまとめられている。
Figure 2022505041000059
次いで、細胞を、ＡＤＣ単独で、又はαＨＥＲ２－１と対応するＭＮＥＤのＡＺＤ６７３８又はＶＥ－８２２との組合せのいずれかで処置した。単独処置及び併用処置のＩＣ50値は、表１２にまとめている。全ての場合で、組合せのＩＣ50値は、ＡＤＣ単独のＩＣ50値よりも低かったものの、有意差があったのはごく少数だった。ＡＤＣ単独の効力は、ＨＣＣ－１９５４細胞では１±１ｎＭだった。２５０ｎＭのＡＺＤ６７３８又は２５０ｎＭのＶＥ－８２２と組み合わせると、組合せの効力は、それぞれ０．３±０．３ｎＭ又は０．３±０．２ｎＭへと低下した。強化効果は、両方の場合で有意だった（それぞれ、Ｐ＝．０３及びＰ＝．０３）。ＪＩＭＴ－１に対するαＨＥＲ２－１のＩＣ50値は、０．４１±０．０７ｎＭだった。αＨＥＲ２－１と８０ｎＭのＡＴＲｉ ＡＺＤ６７３８との組合せは、有意により高い効力に結び付き（Ｐ＝．０３）、ＩＣ50値は０．１９±０．０３ｎＭだった。また、ＭＤＡ－ＭＢ－３６１に対する、αＨＥＲ２－１と１１１ｎＭのＡＺＤ６７３８との組合せの効力（ＩＣ50＝０．０３±０．０１）は、αＨＥＲ２１による単独処置よりも有意に強力だった（ＩＣ50＝０．１０±０．０２）。強化効果を、ＨＥＲ２陰性細胞株ＭＤＡ－ＭＢ－４６８でも研究した。ＡＤＣ単独の効力は１４０±４７ｎＭだった。３００ｎＭのＡＺＤ６７３８又は３００ｎＭのＶＥ－８２２を添加した場合、効力は、１９±４ｎＭ又は４４±１７ｎＭだった。αＨＥＲ２－１とＡＺＤ６７３８又はＶＥ－８２２との組合せは、αＨＥＲ２－１単独による単独療法よりも有意に強力だった（それぞれ、Ｐ＝．００００９又はＰ＝．０００４）。
Figure 2022505041000060
単独処置に対する併用処置の強化効果は、数式１を使用して用量低減指数を算出することにより、より詳細な様式で解明することができる。組合せの効力は、ＤＲＩの増加と共に単独療法と比較して増強される。この計算の結果は、図１４に表示されている。αＨＥＲ２－１＋ＶＥ－８２２の組合せのＤＲＩは、Ｃａｌｕ－３、ＪＩＭＴ－１、及びＳＫ－ＢＲ－３では２未満だった。ほとんどの場合、ＤＲＩは２～５に達した。αＨＥＲ２－１とＡＺＤ６７３８との組合せのＤＲＩは、ＨＣＣ－１９５４（ＤＲＩ＝５．４）、ＭＤＡ－ＭＢ－４５３（ＤＲＩ＝６．４）、及びＭＤＡ－ＭＢ－４６８（ＤＲＩ＝７．４）では５を超えた。αＨＥＲ２－１とＡＺＤ６７３８（ＤＲＩ＝１１．１）及びＶＥ－８２２（ＤＲＩ＝１２．０）との組合せは、ＢＴ－４７４細胞では、１０よりも大きなＤＲＩに達した。
更に、ＨＣＣ－１９５４細胞を、ＡＤＣ αＨＥＲ２－１並びにＡＴＲｉ ＡＺＤ６７３８、ＶＥ－８２２、ＡＴＲｉ １、及びＢＡＹ７３で同時処置して、ＤＲＩに対するＡＴＲｉの効果を研究した（図１５）。ＡＤＣ単独のＩＣ50値は１．４±１．２ｎＭだったが、ＡＤＣと２５０ｎＭのＡＺＤ６７３８との組合せは、５．４倍強力であり（Ｐ＝．０３）、ＩＣ50＝０．２６±０．３３ｎＭだった。αＨＥＲ２－１とＶＥ－８２２との組合せも同様に強力であり（ＩＣ50＝０．３３±０．１７ｎＭ）、この場合も、αＨＥＲ２－１による単独処置よりも有意に強力だった（Ｐ＝．０３）。ＶＥ－８２２と組み合わせたαＨＥＲ２－１では、４．３のＤＲＩが得られた。ＡＤＣと、４０ｎＭのＡＴＲｉ １又は１４ｎＭのＢＡＹ７３との組合せは、ＡＤＣ効力を強力に強化した（それぞれ、ＩＣ50＝０．０７４±０．０２２ｎＭ及びＩＣ50＝０．０３０±０．００８ｎＭ）。αＨＥＲ２－１及びＡＴＲｉ １の組合せでは、２７．１のＤＲＩが達成され、ＡＤＣとＢＡＹ７３との組合せは、４７．１倍の強化作用に結び付いた。こうしたデータに基づくと、αＨＥＲ２１＋ＢＡＹ７３又はＡＴＲｉ １は、αＨＥＲ２－１単独よりも有意に強力である（それぞれ、Ｐ＝．０１及びＰ＝．０１）。明瞭性のため、αＨＥＲ２－１と、４つの異なるＡＴＲｉ ＡＺＤ６７３８、ＶＥ－８２２、ＡＴＲｉ １、及びＢＡＹ７３との組合せのＤＲＩを、図１５Ｂに図示する。
小分子デュオカルマイシンとＡＺＤ６７３８とを組み合わせると、相乗作用スコアに大きな差異があることが観察された。従って、ＤＵＢＡに基づくＡＤＣの強化効果を、異なるＡＴＲｉと組み合わせた場合のＤＤＭ保持ＡＤＣの強化効果と比較しなければならない。ＤＤＭに基づくＡＤＣ αＨＥＲ２－１単独の、又はＡＺＤ６７３８及びＶＥ－８２２と組み合わせた場合の効力は、既に表１２にまとめられている。こうした実験に加えて、ＤＵＢＡに基づくＡＤＣ αＨＥＲ２－２及びαＨＥＲ２－３単独の、又はＡＺＤ６７３８及びＶＥ－８２２と組み合わせた場合の効力を、ＨＥＲ２陽性細胞株ＨＣＣ－１９５４、Ｃａｌｕ－３、及びＳＫ－ＢＲ－３、並びにＨＥＲ２陰性細胞株ＭＤＡ－ＭＢ－４６８で研究した。αＨＥＲ２－２及びαＨＥＲ２－３は、ＨＣＣ－１９５４細胞及びＣａｌｕ－３細胞に対して、１桁台のナノモル範囲のＩＣ50値を示したが、ＡＤＣは、ＳＫ－ＢＲ－３細胞に対してナノモル未満の範囲で効力を示した。ＭＤＡ－ＭＢ－４６８細胞では、ＤＵＢＡに基づくＡＤＣは、ＨＥＲ２陽性細胞株に対してほど強力ではなく、ＩＣ50値は２桁台のナノモル範囲だった。ＡＺＤ６７３８又はＶＥ－８２２を各細胞株のそれぞれ対応するＭＮＥＤでＡＤＣに追加すると、ＡＤＣの効果が強化された。この傾向は、αＨＥＲ２－２及びαＨＥＲ２－３と、ＡＺＤ６７３８及びＶＥ－８２２との全ての組合せで観察されたが、効果が有意だったのは、αＨＥＲ２－２＋ＡＺＤ６７３８（Ｐ＝．０４）及びＶＥ－８２２（Ｐ＝．０４）の強化効果の場合のみだった。
Figure 2022505041000061
対照ＡＤＣカドサイラは、ＨＣＣ－１９５４、ＳＫ－ＢＲ－３、及びＭＤＡ－ＭＢ－４６８に対して同等の効力を示した。Ｃａｌｕ－３に対しては、カドサイラは、デュオカルマイシン保持ＡＤＣ αＨＥＲ２－２及びαＨＥＲ２－３よりもかなり効力が低かった。しかしながら、この効果は有意ではなかった。
一定用量のＡＺＤ６７３８及びＶＥ－８２２と組み合わせたＤＤＭ担持ＡＤＣ αＨＥＲ２－１、ＤＵＢＡ保持αＨＥＲ２－２及びαＨＥＲ２－３、並びに対照ＡＤＣカドサイラの、ＨＣＣ－１９５４、Ｃａｌｕ－３、ＳＫ－ＢＲ－３、及びＭＤＡ－ＭＢ－４６８に対するＤＲＩの要約は、図１６に表示されている。ＨＣＣ－１９５４細胞に対しては、ＤＵＢＡ－ＡＤＣが最も高いＤＲＩに達した。αＨＥＲ２－２の効力は、ＡＺＤ６７３８（２１．５倍）又はＶＥ－８２２（２２．９倍）を追加することにより強力に増強された。αＨＥＲ２－３をＭＮＥＤのＡＺＤ６７３８（１８．５倍）又はＶＥ－８２２（１１．７倍）と組み合わせることにより、より弱い強化効果が達成された。ＤＤＭ担持ＡＤＣ αＨＥＲ２－１とＡＺＤ６７３８との組合せでは、ＡＺＤ６３７８又はＶＥ－８２２を追加した場合、到達したＤＲＩは、それぞれ５．４又は４．３とかなり低かった。陰性対照ＡＤＣカドサイラは、ＡＺＤ６７３８又はＶＥ－８２２と組み合わせると、それぞれ１．４及び１．５のＤＲＩを示した。ＡＴＲｉと組み合わせたＤＵＢＡ担持ＡＤＣは、ＤＤＭ担持ＡＤＣ αＨＥＲ２－１＋ＡＴＲｉよりも優れているという傾向は、程度はあまり顕著ではないが、Ｃａｌｕ－３、ＳＫ－ＢＲ－３、及びＭＤＡ－ＭＢ－４６８でも再現された。ＡＴＲｉとのカドサイラ組合せは、一貫して＜２のＤＲＩを示した。
ＤＤＭ担持ＡＤＣの強化効果を、ＤＵＢＡ保持ＡＤＣ及び陰性対照カドサイラと比較するために、ＤＲＩを概括し、図１７Ａに図示した。ＡＴＲｉと組み合わせた場合の、ＤＵＢＡに基づくＡＤＣ αＨＥＲ２－２及びαＨＥＲ２－３の強化効果は、ＤＤＭに基づくαＨＥＲ２－１とＡＴＲｉとの組合せの強化作用（ＤＲＩ＝３．６）よりも強力だった（それぞれ、ＤＲＩ＝９．８及び７．２）。カドサイラ＋ＡＴＲｉの平均ＤＲＩは、１．３だった。更に、デュオカルマイシン担持ＡＤＣに追加した場合のＡＴＲｉ ＡＺＤ６７３８及びＶＥ－８２２の、様々な細胞株に対する強化効果を比較した（図１７Ｂ）。全ての場合で、ＡＺＤ６７３８とデュオカルマイシンＡＤＣと組合せのＤＲＩの平均は、ＶＥ－８２２とデュオカルマイシンに基づくＡＤＣとの組合せと比較してより高かった。
ここで研究した細胞株は、ＡＴＲ阻害剤に対して異なる耐容性を示した。それは異なるＭＮＥＤにより反映されている。選択性指数を導入し、それにより異なるＡＤＣの比較を可能にした。しかしながら、併用処置の場合、様々な一定濃度のＡＴＲｉを、デュオカルマイシン－ＡＤＣと一緒に細胞へと添加した。これにより、薬物組合せの選択性指数の算出が妨害された。その結果、一定濃度のＡＴＲｉと組み合わせたＡＤＣの効力をＭＤＡ－ＭＢ－４６８で決定することが必要だった。以下の実験では、ＡＤＣに追加された一定用量のＡＴＲｉに対するＤＲＩの依存性を、組合せ実験で調査した。図１８は、ＡＤＣ単独のＩＣ50値が、ＶＥ－８２２又はＡＺＤ６７３８のいずれかを追加することにより用量依存的な様式で減少したことを示す。
図１８に提示されているデータは、数式２による選択性指数の算出を可能にした。つまり、ＭＤＡ－ＭＢ－４６８に対する、一定濃度の１１１ｎＭのＡＺＤ６３７８と組み合わせたαＨＥＲ２－１のＩＣ50値（５３±１６ｎＭ）を、ＭＤＡ－ＭＢ－４５３に対する、１１１ｎＭのＡＺＤ６７３８と組み合わせたαＨＥＲ２－１のＩＣ50値（０．０５±０．０１ｎＭ）で除算した。これは、その特定の用量のＡＴＲｉでの併用処置について１０１０の選択性指数をもたらした。それと比較して、αＨＥＲ２－１を使用した単独療法の選択性指数は４１４だった。単独療法、αＨＥＲ２－１とＡＺＤ６７３８又はＶＥ－８２２との併用処置の選択性指数は、図１９に図示されている。ＢＴ－４７４に対するＡＴＲｉのＭＮＥＤ、及びＣａｌｕ－３に対するＡＺＤ６７３８のＭＮＥＤは、ＨＥＲ２陰性細胞株ＭＤＡ－ＭＢ－４６８のＭＮＥＤを超えていたため、こうした場合では選択性指数を算出しなかった。更に、ＭＤＡ－ＭＢ－４６８細胞は、４０ｎＭのＶＥ－８２２で処置しなかったため、その場合はＳＩを算出しなかった。
αＨＥＲ２－１の選択性は、Ｃａｌｕ－３細胞に対しては１５３、ＨＣＣ－１９５４細胞に対しては１３８、及びＪＩＭＴ－１細胞に対しては３３７だった。αＨＥＲ２－１の場合、ＭＤＡ－ＭＢ－４５３（ＳＩ＝４６０）及びＳＫ－ＯＶ－３（ＳＩ＝６９０）に対してより高い選択性指数が得られた。ＭＤＡ－ＭＢ－３６１細胞又はＳＫ－ＢＲ－３細胞をαＨＥＲ２－１で処置した場合、３桁台の指数が得られた（それぞれ、ＳＩ＝１３８０又は１７２５）。ＨＣＣ－１９５４細胞、ＳＫ－ＢＲ－３細胞、及びＳＫ－ＯＶ－３細胞を、αＨＥＲ２－１及びＡＺＤ６７３８で同時に処置した場合、ＳＩは、単独療法と比較して減少した。組合せで処置すると、ＨＣＣ－１９５４に対するＳＩは１００であり、ＳＫ－ＢＲ－３に対するＳＩは１１０５であり、ＳＫ－ＯＶ－３細胞に対するＳＩは５７１である。αＨＥＲ２－１及びＡＺＤ６７３８を、ＪＩＭＴ－１（ＳＩ＝３７９）、ＭＤＡ－ＭＢ－３６１（ＳＩ＝１７４９）、又はＭＤＡ－ＭＢ－４５３細胞（ＳＩ＝１０６０）に同時投与した場合、選択性は増加した。ＶＥ－８２２及びαＨＥＲ２－１によるＣａｌｕ－３細胞の併用処置は、単独療法と比較して、Ｃａｌｕ－３に対する選択性をわずかに増加させた（ＳＩ＝１７２）。ＨＣＣ－１９５４細胞では、単独療法（ＳＩ＝１３８）及び併用療法（ＳＩ＝１４０）の選択性は等しかった。ＪＩＭＴ－１細胞では、αＨＥＲ２－１とＶＥ－８２２の組合せは、αＨＥＲ２－１単独による処置よりも抗原陽性細胞（ＳＩ＝４２９）に対してより選択的だったが、ＳＫ－ＢＲ－３細胞では、単独療法と比較して１６４０というより低いＳＩが、この組合せで得られた。ＶＥ－８２２と組み合わせたαＨＥＲ２－１は、ＡＤＣ単独よりもＳＫ－ＯＶ－３細胞に対して比較的より選択的だった（ＳＩ＝１６４０）。
ＡＴＲｉと組み合わせた場合の糖タンパク質結合－デュオカルマイシンＤＭ ＡＤＣの強化効果。
更に、ＨＥＲ２陽性細胞に対してαＨＥＲ２に基づくＡＤＣで観察された強化効果を、他の標的抗原にも当てはめることができるか否かを研究し、２つの糖タンパク質（ＧＰ）発現細胞株を、ＧＰ結合ＡＤＣ αＧＰ－１単独で、又はＡＴＲｉ ＡＺＤ６７３８及びＶＥ－８２２をそれらのそれぞれのＭＮＥＤで組み合わせたＡＤＣで６日間処置した。その後、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏアッセイを使用して細胞生存率を決定した。細胞生存率アッセイの効力は図２０にまとめられている。単剤としてのＡＤＣのＩＣ50値は、ＧＰ発現細胞株１では５±２ｎＭであり、ＧＰ発現細胞株２では１．４±０．６ｎＭだった。ＡＤＣ αＧＰ－１の効力は、３００ｎＭのＡＺＤ６７３８を追加することにより、ＧＰ発現細胞株１細胞では７．５倍に増強され、０．７±０．３ｎＭのＩＣ50値がもたらされた。３００ｎＭのＶＥ－８２２を追加すると、組合せの効力が１．１±０．５ｎＭに減少した。これは、単剤よりも４．７倍強力である。ＧＰ発現細胞株２でも同様の結果が得られた。３００ｎＭのＡＺＤ６７３８と組み合わせたαＧＰ－１のＩＣ50値は０．３±０．２ｎＭだった。これは、４．２分の１の用量低減に相当する。３００ｎＭのＶＥ－８２２をＡＤＣに追加すると、効力が４．５分の１に減少し、０．３±０．２ｎＭの効力に結び付いた。
実施例８：ＡＴＲ阻害剤ＡＺＤ６７３８及びＡＴＲｉ １とのαＨＥＲ２－６組合せのｉｎ ｖｉｖｏ効力及び耐容性
デュオカルマイシンは、抗体とコンジュゲートさせるとＡＴＲｉとも相乗作用することの確認に成功した後、この組合せをｉｎ ｖｉｖｏで調査して、併用処置の効力及び耐容性を研究した。ＮＣＩ－Ｎ８７細胞をＨ２ｄ Ｒａｇ２マウスに皮下注射した１０日後に、動物を無作為化し、ビヒクル、１．０ｍｇ ｋｇ-1のαＨＥＲ２－６の単一静脈内投与、又は経口で１４日間にわたって１日１回投与した５０ｍｇ ｋｇ-1のＡＴＲｉ ＡＺＤ６７３８若しくはＡＴＲｉ １のいずれか処置した。ＡＺＤ６７３８と組み合わせたαＨＥＲ２－６又はαＨＥＲ２－６＋ＡＴＲｉ １を、単剤と同じ投薬量及びスケジュールで投与することにより、組合せ効果を研究した。
腫瘍容積が中止の基準を満たしたため、ビヒクル群は２４日目に中止した。ＡＺＤ６７３８による処置は、ビヒクル処置群と統計的に差異はなかった（Ｐ＝．２）。ＡＴＲ阻害剤ＡＴＲｉ １の場合、８日目までは一過性の腫瘍停滞が誘導されたが、腫瘍は急速に進行してエンドポイントに達した。しかしながら、腫瘍成長阻害は、ビヒクル群と比較して統計的に有意に強力だった（Ｐ＝．００３）。単剤αＨＥＲ２－６の投与は、腫瘍が進行した９日目まで、一過性の腫瘍停滞に結び付いた。ＡＤＣ処置は、ビヒクル受容群（Ｐ＝．０００２）並びにＡＺＤ６７３８（Ｐ＝９×１０-9）及びＡＴＲｉ １（Ｐ＝．００６）で処置したＡＴＲｉ単独療法群と比較して、腫瘍容積の統計的に有意な低減をもたらした。
しかしながら、併用療法群αＨＥＲ－６＋ＡＺＤ６７３８又はＡＴＲｉ １は、ビヒクル処置群よりも統計的に有意により強力な抗腫瘍効果を誘導した（それぞれ、Ｐ＝．００００３又はＰ＝．００００２）。αＨＥＲ－６＋ＡＺＤ６７３８の組合せは、３匹の動物が腫瘍に皮膚病変を示したためこの群を中止した６６日目まで腫瘍停滞を誘導した。αＨＥＲ－６＋ＡＴＲｉ １の組合せによるマウスの処置は、腫瘍が再び進行し始めた６３日目まで、腫瘍退縮に結び付いた。注目すべきことに、αＨＥＲ－６＋ＡＺＤ６７３８を受け取った併用処置群では、１匹のマウスが完全奏功（Ｖ腫瘍＜２０ｍｍ3）を示し、これは群が中止される（６６日目）まで継続した。αＨＥＲ６＋ＡＴＲｉ１で処置した群では、合計３匹で完全奏功が観察された。１匹のマウスでは、この効果は腫瘍が進行するまでおよそ９０日間にわたって一過性に継続し、他の２匹のマウスの場合、動物は、観察期間の終わり（１５週間）まで無腫瘍生存を示した。データは、処置群のレベルのもの（図２１Ａ）及び組合せ群の個々の動物のレベルのもの（図２１Ｂ）が、図２１に表示されている。
動物の全体的な状態並びにマウスの体重変化を考慮して抗がん処置の耐容性を評価した（図２２）。ＡＤＣ αＨＥＲ２－６で処置したマウスの体重は減少せず、全ての時点でビヒクル処置群の体重と同等だった。しかしながら、ＡＴＲｉ ＡＺＤ６７３８及びＡＴＲｉ １で処置したマウスは、ビヒクル群と比較して体重が減少したが、体重喪失は依然として５％未満だった。αＨＥＲ２－６とＡＺＤ６７３８又はＡＴＲｉ １との併用処置を受けたマウスは、単剤としてのＡＴＲｉ ＡＺＤ６７３８又はＡＴＲｉ １で処置したマウスと同等の体重プロファイルを示した。
ＡＤＣ αＨＥＲ２－６、ＡＴＲｉ ＡＺＤ６７３８、及びＡＴＲｉ １、並びに併用処置は良好に耐容されたと結論付けることができる。

Claims (20)

  1. それを必要とする対象のがんを治療するための方法であって、ＡＴＲ阻害剤及びＤＮＡアルキル化ＡＤＣを任意の順序で前記対象に投与することを含む方法。
  2. ＤＮＡアルキル化ＡＤＣは、デュオカルマイシン担持ＡＤＣである、請求項１に記載の方法。
  3. 前記ＡＤＣは、ＥＧＦＲ、Ｈｅｒ２、ｃＭｅｔ－ＥＧＦＲ、又はｃＭｅｔを標的とする、請求項２に記載の方法。
  4. 前記ＡＴＲ阻害剤は、化合物１若しくはその薬学的に許容される塩、化合物２若しくはその薬学的に許容される塩、化合物３若しくはその薬学的に許容される塩、化合物４若しくはその薬学的に許容される塩、化合物５若しくはその薬学的に許容される塩、化合物６若しくはその薬学的に許容される塩、化合物７若しくはその薬学的に許容される塩、又は化合物８若しくはその薬学的に許容される塩からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
  5. 前記ＡＴＲ阻害剤は、化合物１又はその薬学的に許容される塩である、請求項４に記載の方法。
  6. 前記対象は、少なくとも１ラウンドの従前のがん療法を受けており、任意に、前記がんは、従前の療法に対して耐性であったか又は耐性となったものである、請求項１に記載の方法。
  7. 化学療法（ＣＴ）、放射線療法（ＲＴ）、又は化学療法及び放射線療法（ＣＲＴ）を前記対象に施すことを更に含む、請求項１に記載の方法。
  8. 前記ＡＴＲ阻害剤及び前記ＤＮＡアルキル化ＡＤＣは、リード期中に投与され、維持期中には、前記ＡＴＲ阻害剤は投与されるが、前記ＤＮＡアルキル化ＡＤＣは投与されない、請求項７に記載の方法。
  9. 前記ＡＴＲ阻害剤及び前記ＤＮＡアルキル化ＡＤＣは、前記リード期中に投与され、前記維持期中には、前記ＤＮＡアルキル化ＡＤＣは投与されるが、前記ＡＴＲ阻害剤は投与されない、請求項８に記載の方法。
  10. ＡＴＲ阻害剤並びにＤＮＡアルキル化ＡＤＣ並びに少なくとも薬学的に許容される担体、希釈剤、賦形剤、及び／又はアジュバントを含む医薬組成物。
  11. ＡＴＲ阻害剤及びＤＮＡアルキル化剤を含む組合せ。
  12. がんを治療するための薬剤を製造するための、請求項１１に記載の医薬組成物又は請求項１２に記載の組合せの使用。
  13. 薬剤として使用するための、請求項１１に記載の組合せ又は請求項１２に記載の医薬組成物。
  14. ＡＴＲ阻害剤及びＤＮＡアルキル化ＡＤＣを含むキット。
  15. ＡＴＲ阻害剤、及び前記ＡＴＲ阻害剤をＤＮＡアルキル化ＡＤＣと組み合わせて使用して対象のがんを治療又は進行を遅延させるための説明書を含む添付文書を含むキット。
  16. ＤＮＡアルキル化ＡＤＣ、及び前記ＤＮＡアルキル化ＡＤＣをＡＴＲ阻害剤と組み合わせて使用して対象のがんを治療又は進行を遅延させるための説明書を含む添付文書を含むキット。
  17. 前記ＡＴＲ阻害剤及び前記ＤＮＡアルキル化ＡＤＣを使用して対象のがんを治療又は進行を遅延させるための説明書を含む添付文書を更に含む、請求項１７に記載のキット。
  18. 第１の容器及び第２の容器及び添付文書を含み、前記第１の容器は、前記ＡＴＲ阻害剤を含む少なくとも１用量の薬剤を含み、前記第２の容器は、前記ＤＮＡアルキル化ＡＤＣを含む少なくとも１用量の薬剤を含み、前記添付文書は、前記薬剤を使用して対象のがんを治療するための説明書を含む、請求項１８に記載のキット。
  19. ＤＮＡアルキル化ＡＤＣとＡＴＲ阻害剤との組合せを宣伝するための方法であって、標的対象集団に対して、がんを有する対象を治療するための前記組合せの使用を促すことを含む方法。
  20. 前記ＤＮＡアルキル化ＡＤＣは、ＤＵＢＡ、ＤＤＭ、及び／又はＤＳＡからなる群から選択されるデュオカルマイシン担持ＡＤＣである、請求項２に記載の方法。
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