JP2022505041A - Dnaアルキル化剤及びatr阻害剤を使用する併用療法 - Google Patents
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Abstract
Description
デュオカルマイシンは、非常に強力な抗腫瘍薬物候補のクラスである。デュオカルマイシンの合成アナログとしては、アドゼレシン、ビゼレシン、及びカルゼレシンが挙げられる。シクロプロピルピロロインドールファミリーのメンバーとしてのこうした治験薬は、がん治療の臨床試験へと進んでいる。in vivoで評価されたデュオカルマイシンファミリーの最初のメンバーは、CC-1065であり、中程度の抗腫瘍活性を示すものの、肝毒性のためその有効性が制限されていた。現時点では、デュオカルマイシンファミリーのいずれのメンバーも、臨床開発は報告されていない。
デュオカルマイシンに基づく療法薬の治療指数を向上させるための取り組みにおいて、BMS-936561(抗CD70)及びSYD985(抗HER2)を含む幾つかのADCが開発されている。BMS-936561は、進行明細胞癌及びB細胞非ホジキンリンパ腫を有する患者において最初に分析された。しかしながら、8mpkまでの用量で耐容性であったにも関わらず、臨床治験は第I相中に中止された。より最近では、Synthonは、ado-トラスツズマブエムタンシンの代替として、切断可能なリンカーを用いてトラスツズマブにコンジュゲートされたseco-DUBAとして知られているデュオカルマイシンプロドラッグを使用したSYD985(トラスツズマブデュオカルマイシン)を生成した。SYD985は、現在第III相臨床試験中である。
幾つかの試みにも関わらず、デュオカルマイシンファミリーのメンバーに基づく薬物は、デュオカルマイシン自体に基づくものもであっても、デュオカルマイシン担持ADCとしてであっても、ヒト療法がまだ承認されていない。
当技術分野には、有効性並びに安全性の両面におけるがん療法の向上に対する、高度に満たされていない必要性が依然として存在する。特に単独療法はほとんどの場合で治癒性でないため、ADCの併用療法の確立は、有効性を増加させ、副作用を軽減し、耐性発現を遅延させるための戦略を提起することができる。
本発明に結び付く研究作業中に、本発明者らは、驚くべきことに、デュオカルマイシン担持ADCとATR阻害剤との組合せが、組合せ有効性だけでなく、高度に相乗的な効果も示すことを見出した。
本発明者らは、DNA損傷応答阻害剤(DDRi)の組合せが、デュオカルマイシン担持ADCに基づくがん療法を向上させるための追加の戦略を提起し得ると仮定した。幾つかの異なるDDRiを選択し、in vitro及びin vivoモデルにおいて試験した。HCC-1954がん細胞及びMDA-MB-468がん細胞を、選択されたDDRiと、デュオカルマイシン単独又は抗体に付着させたデュオカルマイシンとの組合せで処置し、併用処置の抗増殖効果を、単剤単独の効果と比較した。
「ネイキッド」デュオカルマイシン並びにデュオカルマイシン担持ADCを、当技術分野で公知の幾つかのDDRiと組み合わせた。そのようなDDRiの作用様式は、例えば、Rad51発現の減少、CHK1阻害、WEE1キナーゼ阻害、O6-アルキルグアニン-DNAアルキルトランスフェラーゼ阻害、DN-PK阻害 Parp阻害 MTH1阻害、ATR阻害、CHK1阻害、NEK1阻害、TOP2阻害、及びHer2阻害等、多岐にわたる。
幾つかのデュオカルマイシンに基づくADCは、様々なATR阻害剤と組み合わせると、in vitro並びにin vivoで強力な相乗効果を示した。HER2発現NCI-N87腫瘍を有するrag2マウスを、HER2標的指向性デュオカルマイシン-ADC及び2つの異なるATR阻害剤で処置した。ATR阻害剤の単独処置は、非常に軽度の腫瘍成長阻害しか示さず、最大有効用量未満の濃度のADCによる処置は、部分的な腫瘍応答に結び付いた。しかしながら、併用処置は、非常に強力な抗腫瘍効果をもたらしつつ、耐容性も良好だった。本研究は、抗HER2-デュオカルマイシンADCを使用した腫瘍へのデュオカルマイシンの標的化送達とATR阻害剤の全身適用との組合せは、単剤としての薬物による治療よりも優れていることを実証する。
デュオカルマイシンそれ自体は毒性が高いため、ヒトがん療法の有望な候補ではないと考えられるため、デュオカルマイシン担持ADCとATRiとの組合せは、非常に有望である。そのため、そのような組合せを臨床設定にて評価する試みを正当化することができる。
更なる態様では、本開示は、DNAアルキル化剤を担持するADCとATR阻害剤との組合せを宣伝するための方法であって、標的対象集団(audience)に対して、がんを有する対象を治療するための本組合せの使用を促す(promoting)ことを含む方法を提供する。
本明細書では、DNAアルキル化剤を担持するADC、ATR阻害剤、及び少なくとも薬学的に許容される賦形剤又はアジュバントを含む医薬組成物も提供される。
前段落のキットは、放射線療法、追加の化学療法、又は放射線化学療法の説明書を更に示してもよい。
「a」、「an」、及び「the」は、状況が明白に別様であると指示しない限り、複数の参照物を含む。従って、例えば、抗体への言及は、1つ若しくは複数の抗体又は少なくとも1つの抗体を指す。従って、「a」(又は「an」)、「1つ又は複数」、及び「少なくとも1つ」という用語は、本明細書では同義的に使用される。
「約」は、数値で規定されるパラメーター(例えば、本明細書に記載の併用療法による化合物の用量又は治療時間の長さ)を修飾するために使用される場合、そのパラメーターについて明記されている数値よりも最大で10%だけ上下に変動し得ることを意味する。例えば、約10mg/kgの用量は、9mg/kgと11mg/kgとの間で変動してもよい。
ADC又は免疫コンジュゲートとしても知られている抗体-薬物コンジュゲートは、強力な細胞傷害性薬物を抗原発現腫瘍細胞へと標的化することにより抗体及び細胞傷害性薬物の両方の特性を組み合わせて、それによりそれらの抗腫瘍活性を増強させる標的化学療法分子である。所与の標的抗原に対する抗体-薬物コンジュゲートの開発が成功するか否かは、抗体選択の最適化、リンカー安定性、細胞傷害性薬物の効力、及び抗体とのリンカー-薬物コンジュゲーションの機序に依存する。より具体的には、選択的抗体-薬物コンジュゲートは、以下の少なくとも1つ又は複数により特徴付けられる:
(i)抗体-薬物コンジュゲートの形成方法では、抗体が標的抗原に対する十分な特異性を保ち、薬物有効性が維持されること;(ii)抗体-薬物コンジュゲートは、血中での薬物放出及びそれに伴う非標的化細胞への損傷を制限するのに十分な程度に安定であること;(iii)細胞膜輸送効率(エンドサイトーシス)が、療法用の細胞内抗体-薬物コンジュゲート濃度を達成するのに十分な程度であること;(iv)抗体-薬物コンジュゲートからの細胞内薬物放出が、療法用薬物濃度を達成するのに十分な程度であること;及び(v)薬物細胞傷害性が、ナノモルの量又はナノモル未満の量であること。
抗体-薬物コンジュゲートは、強力な細胞傷害性薬物を抗原発現腫瘍細胞へと標的化し(Teicher,B.A.(2009年)Current Cancer Drug Targets 9巻:982~1004頁)、それにより有効性を最大化し、オフターゲット毒性を最小化して治療指数を増強する(Carter,P.J.及びSenter P.D.(2008年)The Cancer Jour.14巻(3号):154~169頁;Chari,RV.(2008年)Acc.Chem.Res.41巻:98~107頁)、抗体及び細胞傷害性薬物の両方の特性を組み合わせた標的化学療法分子である。
(1)BMPR1B(骨形成タンパク質受容体1B型、Genbank受入番号NM_001203)
(2)E16(LAT1、SLC7A5、Genbank受入番号NM_003486)
(3)STEAP1(前立腺6回膜貫通上皮抗原、Genbank受入番号NM_Ol2449)
(4)0772P(CA125、MUC16、Genbank受入番号AF361486)
(5)MPF(MPF、MSLN、SMR、巨核球増強因子、メソテリン、Genbank受入番号NM_005823)
(6)Napi2b(Napi3b、NAPI-3B、NPTIIb、SLC34A2、溶質輸送体ファミリー34(リン酸ナトリウム)、メンバー2、II型ナトリウム依存性リン酸トランスポーター3b、Genbank受入番号NM_006424)
(7)Serna Sb(FLJ10372、KIAA144S、Mm.4201S、SEMASB、SEMAG、セマフォリンSb Hlog、semaドメイン、7回トロンボスポンジンリピート(I型及びI型様)、膜貫通5ドメイン(transmembrane 5 domain)(TM)及び短い細胞質ドメイン、(セマフォリン)SB、Genbank受入番号AB040878)
(8)PSCA hlg(27000SOC12Rik、CS30008016Rik、RIKEN cDNA 27000SOC12、RIKEN cDNA 27000SOC12遺伝子、Genbank受入番号AY3S8628);
(9)ETBR(エンドセリンB型受容体、Genbank受入番号AY27S463);
(10)MSG783(RNF124、仮想タンパク質FLJ20315、Genbank受入番号NM_Ol7763);
(11)STEAP2(HGNC_8639、IPCA-1、PCANAP1、STAMP1、STEAP2、STMP、前立腺がん関連遺伝子1、前立腺がん関連タンパク質1、前立腺6回膜貫通上皮抗原2、6回膜貫通前立腺タンパク質、Genbank受入番号AF455138)
(12)TrpM4(BR22450、FLJ20041、TRPM4、TRPM4B、一過性受容体電位カチオンチャネル、サブファミリーM、メンバー4、Genbank受入番号NM_017636)
(13)CRIPTO(CR、CR1、CRGF、CRIPTO、TDGF1、奇形腫由来成長因子、Genbank受入番号NP003203又はNM_003212)
(14)CD21(CR2(補体受容体2)又はC3DR(C3d/エプスタインバーウイルス受容体)又はHs.73792 Genbank受入番号M26004)
(15)CD79b(CD79B、CD79~、IGb(免疫グロブリン関連ベータ)、B29、Genbank受入番号NM_000626又は11038674)
(16)FcRH2(IFGP4、IRTA4、SPAP1A(SH2ドメイン含有ホスファターゼアンカータンパク質1a)、SPAP1B、SPAP1C、Genbank受入番号NM_030764、AY358130)
(17)HER2(ErbB2、Genbank受入番号Ml 1730)
(18)NCA(CEACAM6、Genbank受入番号Ml8728);
(19)MDP(DPEP1、Genbank受入番号BC017023)
(20)IL20Ra(IL20Ra、ZCYTOR7、Genbank受入番号AF184971);
(21)ブレビカン(BCAN、BEHAB、Genbank受入番号AF229053)
(22)EphB2R(DRT、ERK、Hek5、EPHT3、Tyro5、Genbank受入番号NM_004442)
(23)ASLG659(B7h、Genbank受入番号AX092328)
(24)PSCA(前立腺幹細胞抗原前駆体、Genbank受入番号AJ297436)
(25)GEDA(Genbank受入番号AY260763);
(26)BAFF-R(B細胞活性化因子受容体、BLyS受容体3、BR3、Genbank受入番号AF116456);BAFF受容体/pid=NP443177.1-
(27)CD22(B細胞受容体CD22-Bアイソフォーム、BL-CAM、Lyb-8、Lyb8、SIGLEC-2、FLJ22814、Genbank受入番号AK026467);
(28)CD79a(CD79A、CD79a、免疫グロブリン関連アルファ、Igベータ(CD79B)と共有結合的に相互作用し、表面でIgM分子と複合体を形成し、B細胞分化に関与するシグナルを伝達するB細胞特異的タンパク質)、Genbank受入番号NP_001774.10
(29)CXCR5(バーキットリンパ腫受容体1、CXCL13ケモカインにより活性化されるGタンパク質共役型受容体は、リンパ球遊走及び体液性防御において機能し、HIV-2感染並びにおそらくはAIDS、リンパ腫、骨髄腫、及び白血病の発症に役割を果たす);372aa、pI:8.54 MW:41959 TM:7[P]遺伝子染色体:l lq23.3、Genbank受入番号NP_001707.l)
(30)HLA-DOB(ペプチドに結合し、それらをCD4+Tリンパ球に提示するMHCクラスII分子(Ia抗原)のベータサブユニット);273aa、pI:6.56 MW:30820 TM:1[P]遺伝子染色体:6p21.3、Genbank受入番号NP 002111.1)
(31)P2X5(Genbank受入番号NP 002552.2)
(32)CD72(B細胞分化抗原CD72、Lyb-2)Genbank受入番号NP 001773.1)
(33)LY64(ロイシンリッチリピート(LRR)ファミリーのI型膜タンパク質であるリンパ球抗原64(RP105)は、B細胞の活性化及びアポトーシスを調節し、機能喪失は、全身性エリテマトーデス患者における疾患活性の増加と関連付けられる);661aa、Genbank受入番号NP 005573.1)
(34)FcRH1(Genbank受入番号NP_443170.1)
(35)FCRH5 Genbank受入番号 ヒト:AF343662、AF343663、AF343664、AF343665、AF369794、AF397453、AK.090423、AK.090475、AL834187、AY358085;マウス:AK.089756、AY158090、AY506558;NP 112571.1
(36)TENB2(TMEFF2、トモレグリン(tomoregulin)、TPEF、HPP1、TR、推定膜貫通プロテオグリカン、成長因子及びフォリスタチンのEGF/ヘレグリンファミリーに関連する)、NCBI受入:AAD55776、AAF91397、AAG49451、NCBI RefSeq:NP 057276;NCBI Gene:23671;OMIM:605734;SwissProt Q9UIK5;Genbank受入番号AFl 79274;AY358907、CAF85723、CQ782436
(37)PMEL17(銀ホモログ;SIL V;Dl2S53E;PMEL17;SI;SIL);ME20;gp100)BC001414;BT007202;M32295;M77348;NM_006928;
(38)TMEFFl;H7365;C9orf2;C90RF2;Ul9878;X83961;NM_080655;NM_003692;
(39)GDNF-Ral(GDNFファミリー受容体アルファl;GFRAl;GDNFR;GDNFRA;RETLl;TRNRl;RETlL;GDNFR-アルファl;GFR-ALPHA-1);U95847;BC014962;NM_l45793、NM_005264;
(40)Ly6E(リンパ球抗原6複合体、遺伝子座E、Ly67、RIG-E、SCA-2、TSA-1);15 NP 002337.1;NM_002346.2;
(41)TMEM46(シサホルノログ(shisa hornolog)2(アフリカツメガエル(Xenopus laevis));SHISA2);NP 001007539.1;NM_001007538;
(42)Ly6G6D(リンパ球抗原6複合体、遺伝子座G6D;Ly6-D、MEGTl);NP 067079.2;NM_021246.2;
(43)LGR5 NP 003658.1;NM_003667.2;
(44)RET(retプロトオンコジーン;MEN2A;HSCR1;MEN2B;MTCl;PTC;CDHF12;Hs.168114;RET5 l;RET-ELEl);NP_066124.1;NM_020975.4;
(45)LY6K(リンパ球抗原6複合体、遺伝子座K;LY6K;HSJ001348;FLJ35226);NP_059997.3;NM_Ol7527.3;
(46)GPR19(Gタンパク質共役型受容体19;Mm.4787);NP 006134.1;NM_006143.2;
(47)GPR54(KISS1受容体;KISS1R;GPR54;HOT7T175;AXOR12);NP 115940.2;10 NM_032551.4;
(48)ASPHDl(アスパラギン酸ベータヒドロキシラーゼドメイン含有1;LOC253982);NP 859069.2;NM_l81718.3;
(49)チロシナーゼ(TYR;OCAIA;OCAlA;チロシナーゼ;SHEP3);NP 000363.1;NM_000372.4;
(50)TMEM118(リングフィンガータンパク質、膜貫通2;RNFT2;FLJ14627);
NP Ishikawa,N.ら(2007年)Cancer Res.67巻(24号):11601~11611頁;de Nooij-van Dalen,A.G.ら、1;NM_001109903.1;
(51)GPR172A(Gタンパク質共役型受容体172A;GPCR41;FLJ11856;Dl5Ertd747e);NP 078807.1;NM_024531.3
(52)CD33
(53)CLL-1(CLEC12A、MICL、及びDCAL2)、
(54)CEACAM-5
(55)MUC-1
(56)EGFR
(57)c-Met
(58)avb6
(59)ROR1
(60)葉酸R1
(61)HER2
(62)5T4
(63)Trop-2
(64)gpNMB
(65)CanAg
(66)カドヘリン-3
(67)カドヘリン-6
(68)CD44v6
(69)CD138
(70)CD174
(71)EpCAM
(72)cKit
(73)EphA2
(74)EphA4
(75)FGFR2
(76)FGFR3
(77)GCC
(78)IGFR1
(79)メソテリン
(80)NaPi2B
(81)PSMA
(82)TIM1
(83)PTK7
(84)TF(組織因子)
(85)IL13RA2
(86)GRP78
(87)ガンマGT
本発明で使用可能な更なるデュオカルマイシンは、BMS-936561及びSYD985との関連で記載されている。
SYD985におけるデュオカルマイシンは、seco-DUBAである(図6、(10)を参照)。
「完全奏功」又は「完全寛解」は、治療に応答して、がんの全ての徴候が消失することを指す。これは、必ずしもがんが治癒したことを意味するとは限らない。
「用量」及び「投薬量」は、投与する活性剤又は療法剤の特定量を指す。そのような量は「剤形」に含まれており、「剤形」は、ヒト対象及び他の哺乳動物のための単一投薬量として好適な物理的に別個の単位を指し、各単位は、担体等の1つ又は複数の好適な医薬賦形剤と共に、所望の作用発現、耐容性、及び療法効果を生み出すように計算された所定量の活性剤を含む。
本発明の抗体の「機能的断片」は、一般に、インタクト抗体の抗原結合性若しくは可変領域又はFcR結合能力が保たれているか若しくは修飾されている抗体のFc領域を含む、インタクト抗体の部分を含む。機能的抗体断片の例としては、線状抗体、単鎖抗体分子、及び抗体断片から形成される多重特異性抗体が挙げられる。
「Fv」は、完全な抗原認識及び抗原結合部位を含む最小抗体断片である。この断片は、堅固な非共有結合で付随されている、1つの重鎖軽鎖可変領域ドメイン及び1つの軽鎖可変領域ドメインの二量体からなる。こうした2つのドメインがフォールディングすると、抗原結合のためのアミノ酸残基に寄与し、抗体に抗原結合特異性を付与する6つの超可変ループ(H鎖及びL鎖から各々3つのループ)が生じる。しかしながら、単一の可変ドメイン(又は抗原に特異的な3つのHVRのみを含むFvの半分)でさえ、結合部位全体よりも親和性はより低いものの、抗原を認識して結合する能力を有する。
「と組み合わせて」又は「と併せて」は、1つ又は複数の他の化合物に加えて1つの化合物を投与することを指す。そのため、「と組み合わせて」又は「と併せて」は、1つ又は複数の他の化合物に加えて1つの化合物を任意の順序で投与することを指す。例えば、上記1つの化合物は、上記1つ又は複数の他の化合物を個体に投与する前、投与中、又は投与後に投与することができる。本明細書で使用される場合、DNAアルキル化剤を担持するADC及びATR阻害剤を含む組合せの投与に関する「組み合わせて」という用語は、こうした化合物が任意の順序で患者に投与されることを意味する。例えば、化合物は、同時に又は順次投与することができる。また、追加の化学療法がある場合、2つの化合物を同時に投与し、続いて第3の化合物を順次投与することができる。また、化合物は、単一の又は別々の組成物、製剤、又は単位剤形として投与してもよい。また、2つの化合物は、単一の組成物、製剤、又は単位剤形として投与してもよく、第3の化合物は、別々の組成物、製剤、又は単位剤形として投与される。DNAアルキル化剤を担持するADC、ATR阻害剤、及び潜在的な追加の化学療法剤又は放射線療法又は放射線化学療法は、適切な投薬プロトコールに従って、同じ日に又は異なる日に任意の順序で投与されることが理解されるだろう。
「転移性」がんは、身体の1つの部分(例えば、肺)から身体の別の部分に広がったがんを指す。
「部分奏功」は、治療に応答した、1つ若しくは複数の腫瘍若しくは病変のサイズの減少又は身体のがんの程度の減少を指す。
「患者」及び「対象」は、本明細書では同義的に使用され、がんの治療を必要とする哺乳動物を指す。一般に、患者は、がんの1つ又は複数の症状を罹患すると診断されているか又はそのリスクのあるヒトである。ある特定の実施形態では、「患者」又は「対象」は、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、ウサギ、ブタ、マウス、若しくはラットなどの非ヒト哺乳動物、又はスクリーニング、特徴付け、並びに薬物及び療法の評価に使用される動物を指す。
「薬学的に許容されるアジュバント」という用語は、抗原に対する身体の免疫応答を増強するありとあらゆる物質を指す。薬学的に許容されるアジュバントの非限定的な例は、ミョウバン、フロイント不完全アジュバント、MF59、ポリ(I:C)等のdsRNAの合成アナログ、細菌LPS、細菌フラジェリン、イミダゾールキノリン、特定のCpGモチーフを含むオリゴデオキシヌクレオチド、ムラミルジペプチド及びQuil-A(登録商標)等の細菌細胞壁の断片である。
1つ又は複数の症状の「低減」(及びこの語句の文法的等価物)は、症状の重症度又は頻度を減少させること、又は症状を消失させることを指す。
「全身性」治療は、薬物物質が血流を移動し、全身の細胞に到達して影響を及ぼす治療である。
DNAアルキル化剤を担持するADC又はATR阻害剤の「治療有効量」は、本発明の各々の例において、がんを有する患者に投与すると、意図されている療法効果、例えば、患者のがんの1つ若しくは複数の徴候の緩和、寛解、軽減、若しくは消失、又はがん患者の治療の経過における任意の他の臨床結果を示すことになる、必要とされる投薬量及び期間において有効な量を指す。療法効果は、必ずしも1用量の投与で生じる必要はなく、一連の用量の投与後でのみ生じてもよい。従って、治療有効量は、1回又は複数回の投与で投与することができる。そのような治療有効量は、個体の病状、年齢、性別、及び体重、並びに個体において所望の応答を誘発するアルキル化剤を担持するADC又はATR阻害剤の能力等の要因に応じて様々であり得る。また、治療有効量は、治療上有益な効果が、アルキル化剤を担持するADC又はATR阻害剤の任意の毒性効果又は有害効果を上回る量である。
抗体の「可変領域」又は「可変ドメイン」は、抗体の重鎖又は軽鎖のアミノ末端ドメインを指す。重鎖及び軽鎖の可変ドメインは、それぞれ「VH」及び「VL」と呼ばれる場合がある。こうしたドメインは、一般に、抗体の最も可変性の部分であり(同じクラスの他の抗体と比べて)、抗原結合部位を含む。
濃度、量、及び他の数値データは、本明細書では、範囲形式で表現又は提示されていてもよい。そのような範囲形式は、便宜上及び簡潔性のために使用されるに過ぎず、従って、範囲の限界として明示的に挙げられている数値を含むだけでなく、その範囲内に包含される全ての個々の数値又は部分範囲を、各数値及び部分範囲が明示的に挙げられているかの如く含むように柔軟に解釈されるべきであることが理解されるべきである。実例として、「約1~約5」という数値範囲は、約1~約5の明示的に挙げられている値だけでなく、示されている範囲内の個々の値及び部分範囲も含むと解釈されるべきである。従って、この数値範囲には、2、3、及び4等の個々の値、並びに1~3、2~4、及び3~5等の部分範囲、並びに1、2、3、4、及び5が個々に含まれる。この同じ原則は、最小値又は最大値としてたった1つの数値が挙げられている範囲にも該当する。更に、そのような解釈は、範囲の幅広さ又は記載されている特質に関わらず適用されるべきである。
本明細書で使用されている一部の略語としては、以下のものが挙げられる。
ATR:毛細血管拡張性運動失調症及びRAD3関連タンパク質
BID:1日2回
CDR:相補性決定領域
CRC:結腸直腸がん
CRT:化学放射線療法
CT:化学療法
DNA:デオキシリボ核酸
Ig:免疫グロブリン
IHC:免疫組織化学
IV:静脈内
mCRC:転移性結腸直腸がん
MSI-H:高マイクロサテライト領域遺伝子不安定性(Microsatellite status instable high)
MSI-L:低マイクロサテライト領域遺伝子不安定性(Microsatellite status instable low)
MSS:マイクロサテライト領域遺伝子安定性(Microsatellite status stable)
NK:ナチュラルキラー
NSCLC:非小細胞肺がん
OS:全生存期間
PFS:無進行生存期間
QD:1日1回
QID:1日4回
Q2W:2週間毎
Q3W:3週間毎
RNA:リボ核酸
RR:相対リスク
RT:放射線療法
SCCHN:頭頸部扁平上皮癌
SCLC:小細胞肺がん
SoC:標準治療
TID:1日3回
TR:腫瘍応答
TTP:腫瘍進行までの時間
TTR:腫瘍再発までの時間
国際公開第2011/133039号パンフレットには、DNAアルキル化剤CC-1065の一連のアナログ及びそれらのHER2標的指向性ADCが開示されている。実施例15では、幾つかのトラスツズマブ-デュオカルマイシンコンジュゲートが、ヌードマウスのN87(つまり、HER2 IHC(免疫組織化学)3+胃腫瘍)異種移植片に対して試験された。結果は、国際公開第2011/133039号パンフレットの図4A、4B、及び4Cに示されている。12mg/Kg i.v.の単一用量による処置後、6つ全てのADCは、体重に影響を及ぼすことなく、抗体トラスツズマブそれ自体及び対照ビヒクルと比較して、腫瘍容積を低減させ、生存率を向上させた。
国際公開第2015/104385号パンフレットには、HER2を発現するヒト固形腫瘍及び血液学的悪性腫瘍の治療に使用するためのデュオカルマイシン含有ADCが開示されている。
当技術分野に記載されているデュオカルマイシン及びその誘導体を、本発明の目的のために使用することができる。
従って、一態様では、本発明は、それを必要とする対象のがんを治療するための方法であって、対象にDNAアルキル化ADC及びATR阻害剤を投与することを含む方法で使用するためのDNAアルキル化ADC及びATR阻害剤を提供する。同様に、本発明は、それを必要とする対象のがんを治療するための方法であって、対象にDNAアルキル化ADC及びATR阻害剤を投与することを含む方法における本組合せの使用を提供する。同様に、本発明は、対象にDNAアルキル化ADC及びATR阻害剤を投与することを含む、それを必要とする対象のがんを治療するための薬剤を製造するための、DNAアルキル化ADC及びATR阻害剤の使用を提供する。
本発明の全ての実施形態では、治療有効量のDNAアルキル化ADC及びATR阻害剤が適用されることが理解されるべきである。
式中、
R1は、窒素、酸素、及び硫黄からなる群から独立して選択される0~4つのヘテロ原子を有する5~6員単環式アリール又はヘテロアリール環であり、単環式アリール又はヘテロアリール環は、別の環と縮合して、窒素、酸素、及び硫黄からなる群から独立して選択される0~6つのヘテロ原子を有する8~10員二環式アリール又はヘテロアリール環を形成してもよく、各R1は、1~5つのJ1基で置換されていてもよく、
R2は、窒素、酸素、及び硫黄からなる群から独立して選択される0~3つのヘテロ原子を有する5~6員単環式アリール又はヘテロアリール環であり、単環式アリール又はヘテロアリール環は、別の環と縮合して、窒素、酸素、及び硫黄からなる群から独立して選択される0~4つのヘテロ原子を有する8~10員二環式アリール又はヘテロアリール環を形成してもよく、各R2は、1~5つのJ2基で置換されていてもよく、
Lは、-C(O)NH-又は-C(O)N(C1-6アルキル)-であり、
nは、0又は1であり、
各J1及びJ2は、独立して、ハロ、-CN、-NO2、-V1-R、又は-(V2)m-Qであり、
V1は、C1-10脂肪族鎖であり、0~3つのメチレン単位が、独立して、O、NR’’、S、C(O)、S(O)、又はS(O)2で置き換えられていてもよく、V1は、JV1の1~6つの出現で置換されていてもよく、
V2は、C1-10脂肪族鎖であり、0~3つのメチレン単位が、独立して、O、NR’’、S、C(O)、S(O)、又はS(O)2で置き換えられていてもよく、V2は、JV2の1~6つの出現で置換されていてもよく、
mは、0又は1であり、
Qは、窒素、酸素、及び硫黄からなる群から独立して選択される0~4つのヘテロ原子を有する3~8員の飽和若しくは不飽和単環式環であるか、又は窒素、酸素、及び硫黄からなる群から独立して選択される0~6つのヘテロ原子を有する9~10員の飽和若しくは不飽和二環式環であり、各Qは、0~5つのJQで置換されていてもよく、
各JV1又はJV2は、独立して、ハロゲン、CN、NH2、NO2、C1-4脂肪族、NH(C1-4脂肪族)、N(C1-4脂肪族)2、OH、O(C1-4脂肪族)、CO2H、CO2(C1-4脂肪族)、C(O)NH2、C(O)NH(C1-4脂肪族)、C(O)N(C1-4脂肪族)2、NHCO(C1-4脂肪族)、N(C1-4脂肪族)CO(C1-4脂肪族)、SO2(C1-4脂肪族)、NHSO2(C1-4脂肪族)、又はN(C1-4脂肪族)SO2(C1-4脂肪族)であり、C1-4脂肪族は、ハロで置換されていてもよく、
Rは、H又はC1-6脂肪族であり、C1-6脂肪族は、NH2、NH(C1-4脂肪族)、N(C1-4脂肪族)2、ハロゲン、C1-4脂肪族、OH、O(C1-4脂肪族)、NO2、CN、CO2H、CO2(C1-4脂肪族)、CO(C1-4脂肪族)、O(ハロC1-4脂肪族)、又はハロC1-4脂肪族の1~4つの出現で置換されていてもよく、
各JQは、独立して、ハロ、オキソ、CN、NO2、X-R、又は-(X)p-Q4であり、
pは、0又は1であり、
Xは、C1-10脂肪族であり、C1-6脂肪族の1~3つのメチレン単位は、-NR、-O-、-S-、C(O)、S(O)2、又はS(O)で置き換えられていてもよく、Xは、独立して、NH2、NH(C1-4脂肪族)、N(C1-4脂肪族)2、ハロゲン、C1-4脂肪族、OH、O(C1-4脂肪族)、NO2、CN、CO(C1-4脂肪族)、CO2H、CO2(C1-4脂肪族)、C(O)NH2、C(O)NH(C1-4脂肪族)、C(O)N(C1-4脂肪族)2、SO(C1-4脂肪族)、SO2(C1-4脂肪族)、SO2NH(C1-4脂肪族)、SO2N(C1-4脂肪族)2、NHC(O)(C1-4脂肪族)、N(C1-4脂肪族)C(O)(C1-4脂肪族)の1~4つの出現で置換されていてもよく、C1-4脂肪族は、ハロの1~3つの出現で置換されていてもよく、
Q4は、窒素、酸素、及び硫黄からなる群から独立して選択される0~4つのヘテロ原子を有する3~8員の飽和若しくは不飽和単環式環であるか、又は窒素、酸素、及び硫黄からなる群から独立して選択される0~6つのヘテロ原子を有する8~10員の飽和若しくは不飽和二環式環であり、各Q4は、1~5つのJQ4で置換されていてもよく、
JQ4は、ハロ、CN、又はC1-4アルキルであり、最大2つのメチレン単位が、O、NR*、S、C(O)、S(O)、又はS(O)2で置き換えられていてもよく、
Rは、H又はC1-4アルキルであり、C1-4アルキルは、1~4つのハロで置換されていてもよく、
R’’及びR*は、各々独立して、Hであるか、C1-4アルキルであるか、又は存在せず、C1-4アルキルは、1~4つのハロで置換されていてもよい。
式中、
環Aは、
J5oは、H、F、Cl、C1-4脂肪族、O(C1-3脂肪族)、又はOHであり、
J5pは、
J5p1は、H、C1-4脂肪族、オキセタニル、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロピラニルであり、J5p1は、OH又はハロの1~2つの出現で置換されていてもよく、
J5p2は、H、メチル、エチル、CH2F、CF3、又はCH2OHであり、
J2oは、H、CN、又はSO2CH3であり、
J2mは、H、F、Cl、又はメチルであり、
J2pは、-SO2(C1-6アルキル)、-SO2(C3-6シクロアルキル)、-SO2(4~6員ヘテロシクリル)、-SO2(C1-4アルキル)N(C1-4アルキル)2、又は-SO2(C1-4アルキル)-(4~6員ヘテロシクリル)であり、ヘテロシクリルは、酸素、窒素、及び硫黄からなる群から選択される1つのヘテロ原子を含み、J2pは、ハロ、OH、又はO(C1-4アルキル)の1~3つの出現で置換されていてもよい。
式中、
R10は、フルオロ、クロロ、又は-C(J10)2CNから選択され、
J10は、独立して、H若しくはC1-2アルキルであるか、又は
J10の2つの出現は、それらが付着している炭素原子と一緒になって、3~4員の置換されていてもよい炭素環式環を形成し、
R20は、H;ハロ;-CN;NH2;フルオロの0~3つの出現で置換されていてもよいC1-2アルキル;又はC1-3脂肪族鎖であり、脂肪族鎖の最大で2つのメチレン単位は、-O-、-NRa-、-C(O)-、又は-S(O)zで置き換えられていてもよく、
R3は、H;ハロ;ハロの1~3つの出現で置換されていてもよいC1-4アルキル;C3-4シクロアルキル;-CN;又はC1-3脂肪族鎖であり、脂肪族鎖の最大で2つのメチレン単位は、-O-、-NRa-、-C(O)-、又は-S(O)zで置き換えられていてもよく、
R4は、Q1若しくはC1-10脂肪族鎖であり、脂肪族鎖の最大で4つのメチレン単位は、-O-、-NRa-、-C(O)-、若しくは-S(O)z-で置き換えられていてもよく、各R4は、JQ1の0~5つの出現で置換されていてもよいか、又は
R3及びR4は、それらが結合している原子と一緒になって、酸素、窒素、及び硫黄からなる群から選択される0~2つのヘテロ原子を有する5~6員芳香族又は非芳香族環を形成し、R3及びR4により形成される環は、JZの0~3つの出現で置換されていてもよく、
Q1は、酸素、窒素、及び硫黄からなる群から選択される0~3つのヘテロ原子を有する3~7員の完全飽和、部分的不飽和、若しくは芳香族単環式環であるか、又は酸素、窒素、及び硫黄からなる群から選択される0~5つのヘテロ原子を有する7~12員の完全飽和、部分的不飽和、若しくは芳香族二環式環であり、
JZは、独立して、C1-6脂肪族、=O、ハロ、又は→Oであり、
JQ1は、独立して、-CN、ハロ、=O、Q2、若しくはC1-8脂肪族鎖であり、脂肪族鎖の最大で3つのメチレン単位は、-O-、-NRa-、-C(O)-、若しくは-S(O)z-で置き換えられていてもよく、JQ1の各出現は、JRの0~3つの出現で置換されていてもよいか、又は
同じ原子にあるJQ1の2つの出現は、それらが接合している原子と一緒になって、酸素、窒素、及び硫黄からなる群から選択される0~2つのヘテロ原子を有する3~6員環を形成し、JQ1の2つの出現により形成される環は、Jxの0~3つの出現で置換されていてもよいか、又は
JQ1の2つの出現は、Q1と一緒になって、6~10員の飽和若しくは部分的不飽和架橋環系を形成し、
Q2は、酸素、窒素、若しくは硫黄から選択される0~3つのヘテロ原子を有する3~7員の完全飽和、部分的不飽和、若しくは芳香族単環式環、又は酸素、窒素、若しくは硫黄から選択される0~5つのヘテロ原子を有する7~12員の完全飽和、部分的不飽和、若しくは芳香族二環式環から独立して選択され、
JRは、独立して、-CN、ハロ、=O、→O、Q3、若しくはC1-6脂肪族鎖であり、脂肪族鎖の最大で3つのメチレン単位は、-O-、-NRa-、-C(O)-、若しくは-S(O)z-で置き換えられていてもよく、各JRは、JTの0~3つの出現で置換されていてもよいか、又は
同じ原子にあるJRの2つの出現は、それらが接合している原子と一緒になって、酸素、窒素、若しくは硫黄から選択される0~2つのヘテロ原子を有する3~6員環を形成し、JRの2つの出現により形成される環は、Jxの0~3つの出現で置換されていてもよいか、又は
JRの2つの出現は、Q2と一緒になって、6~10員の飽和若しくは部分的不飽和架橋環系を形成し、
Q3は、酸素、窒素、及び硫黄からなる群から選択される0~3つのヘテロ原子を有する3~7員の完全飽和、部分的不飽和、若しくは芳香族単環式環であるか、又は酸素、窒素、及び硫黄からなる群から選択される0~5つのヘテロ原子を有する7~12員の完全飽和、部分的不飽和、若しくは芳香族二環式環であり、
JXは、独立して、-CN、=O、ハロ、又はC1-4脂肪族鎖であり、脂肪族鎖の最大で2つのメチレン単位は、-O-、-NRa-、-C(O)-、又は-S(O)z-で置き換えられていてもよく、
JTは、独立して、ハロ、-CN、→O;=O、-OH、C1-6脂肪族鎖であり、脂肪族鎖の最大で2つのメチレン単位は、-O-、-NRa-、-C(O)-、若しくは-S(O)z-で置き換えられていてもよいか、又は酸素、窒素、及び硫黄からなる群から選択される0~2つのヘテロ原子を有する3~6員非芳香族環であり、JTの各出現は、JMの0~3つの出現で置換されていてもよいか、或いは
同じ原子にあるJTの2つの出現は、それらが接合している原子と一緒になって、酸素、窒素、及び硫黄からなる群から選択される0~2つのヘテロ原子を有する3~6員環を形成するか、或いは
JTの2つの出現は、Q3と一緒になって、6~10員の飽和若しくは部分的不飽和架橋環系を形成し、
JMは、独立して、ハロ又はC1-6脂肪族であり、
zは、0、1、又は2であり、
Raは、独立して、H又はC1-4脂肪族である。
式中、
R10は、フルオロ、クロロ、又は-C(J10)2CNであり、
J10は、独立して、H若しくはC1-2アルキルであるか、又は
J10の2つの出現は、それらが付着している炭素原子と一緒になって、置換されていてもよい3~4員炭素環式環を形成し、
R3は、H;クロロ;フルオロ;ハロの1~3つの出現で置換されていてもよいC1-4アルキル;C3-4シクロアルキル;-CN;又はC1-3脂肪族鎖であり、脂肪族鎖の最大で2つのメチレン単位は、-O-、-NRa-、-C(O)-、又は-S(O)zで置き換えられていてもよく、
L1は、H;酸素、窒素、及び硫黄からなる群から選択される0~2つのヘテロ原子を有する3~7員芳香族若しくは非芳香族環;又はC1-6脂肪族鎖であり、脂肪族鎖の最大で2つのメチレン単位は、-O-、-NRa-、-C(O)-、又は-S(O)zで置き換えられていてもよく、各L1は、C1-4脂肪族;-CN;ハロ;-OH;又は酸素、窒素、及び硫黄からなる群から選択される0~2つのヘテロ原子を有する3~6員非芳香族環で置換されていてもよく、
L2は、H;酸素、窒素、及び硫黄からなる群から選択される0~2つのヘテロ原子を有する3~7員芳香族若しくは非芳香族環;又はC1-6脂肪族鎖であり、脂肪族鎖の最大で2つのメチレン単位は、-O-、-NRa-、-C(O)-、又は-S(O)zで置き換えられていてもよく、各L2は、C1-4脂肪族;-CN;ハロ;-OH;又は酸素、窒素、及び硫黄からなる群から選択される0~2つのヘテロ原子を有する3~6員非芳香族環で置換されていてもよいか、或いは
L1及びL2は、それらが付着している窒素と一緒になって環Dを形成し、環Dは、JGの0~5つの出現で置換されていてもよく、
L3は、H、C1-3脂肪族、又はCNであり、
環Dは、酸素、窒素、及び硫黄からなる群から選択される1~2つのヘテロ原子を有する3~7員ヘテロシクリル環であるか、又は酸素、窒素、及び硫黄からなる群から選択される1~5つのヘテロ原子を有する7~12員の完全飽和若しくは部分的不飽和二環式環であり、
JGは、独立して、ハロ;-CN;-N(R゜)2;→O;3~6員カルボシクリル;酸素、窒素、及び硫黄からなる群から選択される1~2つのヘテロ原子を有する3~6員ヘテロシクリル;若しくはC1-4アルキル鎖であり、アルキル鎖の最大で2つのメチレン単位は、-O-、-NRa-、-C(O)-、若しくは-S(O)zで置き換えられていてもよく、各JGは、JKの0~2つの出現で置換されていてもよいか、
同じ原子にあるJGの2つの出現は、それらが接合している原子と一緒になって、酸素、窒素、及び硫黄からなる群から選択される0~2つのヘテロ原子を有する3~6員環を形成するか、又は
JGの2つの出現は、環Dと一緒になって、6~10員の飽和若しくは部分的不飽和架橋環系を形成し、
JKは、酸素、窒素、及び硫黄からなる群から選択される0~2つのヘテロ原子を有する3~7員芳香族又は非芳香族環であり、
zは、0、1、又は2であり、
Ra及びR°は、独立して、H又はC1-4アルキルである。
R1は、C(CH3)2SO2A’、CH2OSO2A’、C(CH3)2OH、-[C(R3)2]nHet1、又は1-メチルスルホニル-シクロプロパ-1-イルを示し、
R2は、Het2、NR3(CH2)nHet2、OHet2、Ar1、CONHHet3、COHet3、又はCONHAを示し、
R3は、H又はA’を示し、
Het1は、イミダゾリル、ピラゾリル、トリアゾリル、又はピリジルを示し、これらの各々は、未置換であるか、又はCOOH、COOA’、CH2OH、CH2OA’、若しくはAにより一置換されており、
Het2は、1H-ピロロ[2,3-b]ピリジニル、1H-ピロロ[2,3-c]ピリジニル、インドリル、ベンズイミダゾリル、イミダゾリル、1,2,3,4-テトラヒドロイソキノリル、ピリジル、トリアゾリル、ピラゾリル、キノリル、イソキノリル、キナゾリニル、又は1,3-ジヒドロ-2ラムダ6-2,2-ジオキソ-1-ベンゾチアゾリルを示し、これらの各々は、未置換であるか、又はHal、A’、-[C(R3)2]nOR3、CONH2、SO2フェニル、ベンジル、CN、-[C(R3)2]nNH2、-[C(R3)2]nNHA、オキセタニル-NH-、及び/若しくはNHCOAにより一置換若しくは二置換されており、
Het3は、トリアゾリル、ピリダジニル、ピリミジニル、ピラゾリル、又はピロリジニルを示し、これらの各々は、未置換であるか、又は-[C(R3)2]nOR3、-[C(R3)2]nNH2、若しくは=Oにより一置換されており、
Ar1は、-[C(R3)2]nOR3により一置換されているフェニル、イミダゾリル、
-[C(R3)2]nNH2、ピラゾリル、アジリジニル、又はオキセタニルを指し、これらの各々は、未置換であるか、又は-[C(R3)2]nOR3若しくは-[C(R3)2]nNH2により一置換されており、
Aは、1~7つのH原子が、OH、F、Cl、及び/若しくはBrで置き換えられていてもよく、並びに/又は1つ若しくは2つの非隣接CH2基が、O及び/若しくはNH基により置き換えられていてもよい、1~6つのC原子を有する非分岐又は分岐アルキルを示し、
A’は、1~4つのC原子を有する非分岐又は分岐アルキルを示し、
Halは、F、Cl、Br、又はIを示し、
nは、0、1、2、又は3を示す化合物、
並びにそれらの薬学的に許容される塩、互変異性体、及び立体異性体であり、これらのあらゆる比の混合物を含む。
更に好ましい実施形態では、R2は、Het2を示す。
更に好ましい実施形態では、R3は、Hを示す。
更に好ましい実施形態では、Aは、1~5つのH原子がOH及び/又はFで置き換えられていてもよい、1~6つのC原子を有する非分岐又は分岐アルキルを示す。
R2は、Het2を示し、
Het2は、1H-ピロロ[2,3-b]ピリジニル、1H-ピロロ[2,3-c]ピリジニル、インドリル、ベンズイミダゾリル、又はイミダゾリルを示し、これらの各々は、未置換であるか、又はHal、OH、-[C(R3)2]nNH2、-[C(R3)2]nNHA、オキセタニル-NH-、及び/若しくはNHCOAにより一置換若しくは二置換されており、
Aは、1~5つのH原子がOH及び/又はFで置き換えられていてもよい、1~6つのC原子を有する非分岐又は分岐アルキルを示し、
A’は、1~4つのC原子を有する非分岐又は分岐アルキルを示し、
Halは、F、Cl、Br、又はIを示し、
nは、0、1、2、又は3を示す。
本明細書に記載のような併用療法で使用するための投薬量に関して上記で参照されている範囲の全ての組合せが可能であり得ることが理解されるべきである。加えて、併用療法で使用される2つの化合物の投薬を互いに適合させて、利便性及び服薬遵守を向上させることができる。
ATR阻害剤及びDNAアルキル化ADCは、任意の順序で投与することができる。例えば、全てを、実質的に同時に投与してもよく又は順次投与してもよい。ATR阻害剤及びDNAアルキル化ADCは、別々の組成物、製剤、若しくは単位剤形にて任意の順序で患者に投与されるか、又は化合物は、1つの組成物、製剤、若しくは単位剤形にて一緒に投与される。
例示的なそのような薬学的に許容される組成物は、下記に及び本明細書に更に記載されている。
療法組成物は、典型的には、製造及び保管条件下で無菌及び安定でなければならない。組成物は、溶液、マイクロエマルジョン、分散物、リポソーム、又は高薬物濃度に好適な他の秩序構造として製剤化することができる。無菌注射用溶液は、上記に列挙されている成分の1つ又は組合せと共に必要量の活性化合物を適切な溶媒に組み込み、必要に応じて続いて濾過滅菌することにより調製することができる。一般に、分散物は、基本分散媒、及び上記に列挙されているものの必要な他の成分を含む無菌ビヒクルに有効成分を組み込むことにより調製される。無菌注射用溶液を調製するための無菌粉末の場合、好ましい調製方法は、その以前に滅菌濾過された溶液から有効成分+任意の追加の所望の成分の粉末が得られる真空乾燥及び凍結乾燥である。溶液の適正な流動性は、例えば、レシチン等のコーティングを使用することにより、分散物の場合は、必要な粒子サイズを維持することにより、及び界面活性剤を使用することにより維持することができる。注射用組成物の長期吸収は、吸収を遅延させる作用剤、例えばモノステアリン酸塩及びゼラチンを組成物に含めることによりもたらすことができる。
更なる態様では、DNAアルキル化ADC、及びDNAアルキル化ADCをATR阻害剤と組み合わせて使用して、対象のがんを治療又は進行を遅延させるための説明書を含む添付文書を含むキットが提供される。また、ATR阻害剤、及びATR阻害剤をDNAアルキル化ADCと組み合わせて使用して、対象のがんを治療又は進行を遅延させるための説明書を含む添付文書を含むキットが提供される。キットは、第1の容器及び第2の容器及び添付文書を含んでいてもよく、第1の容器は、DNAアルキル化ADCを含む少なくとも1用量の薬剤を含み、第2の容器は、ATR阻害剤を含む少なくとも1用量の薬剤を含み、添付文書は、薬剤を使用して対象のがんを治療するための説明書を含む。また、ATR阻害剤及びDNAアルキル化ADCは、単一の容器に含まれていてもよい。容器は、同じ又は異なる形状(例えば、バイアル、注射器、及びボトル)及び/又は材料(例えば、プラスチック又はガラス)で構成されていてもよい。キットは、希釈剤、フィルター、IVバッグ及びライン、針、並びに注射器等の、薬剤を投与するのに有用であり得る他の材料を更に含んでいてもよい。
siゲノムヒトCHEK1(1111)SMARTプールsiRNA:
GCAACAGUAUUUCGGUAUA
GGACUUCUCUCCAGUAAAC
AAAGAUAGAUGGUACAACA
AGAUAUGAAGCGUGCCGUA
オンターゲット+ヒトATR(545)SMARTプールsiRNA:
GAGAAAGGAUUGUAGACUA
GCAACUCGCCUAACAGAUA
CCACGAAUGUUAACUCUAU
CCGCUAAUCUUCUAACAUU
オンターゲット+ヒトPLK1(5347)SMARTプールsiRNA:
GCACAUACCGCCUGAGUCU
CCACCAAGGUUUUCGAUUG
GCUCUUCAAUGACUCAACA
UCUCAAGGCCUCCUAAUAG
siGenome非標的指向性siRNAプール#1:
UAGCGACUAAACACAUCAA
UAAGGCUAUGAAGAGAUAC
AUGUAUUGGCCUGUAUUAG
AUGAACGUGAAUUGCUCAA
a)2009年に薬物バンク受入エントリー(drug bank accession entry)DB00072により公表されているαHER2抗体のアミノ酸配列。遺伝子改変は下線で表記されている。
重鎖:
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SrtA認識モチーフを有する軽鎖:
MKLPVRLLVLMFWIPASLSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECGGGGSGGGGSGGGGSLPETGS
b)αEGFR抗体セツキシマブのアミノ酸配列。遺伝子改変は下線で表記されている。
天然重鎖:
QVQLKQSGPGLVQPSQSLSITCTVSGFSLTNYGVHWVRQSPGKGLEWLGVIWSGGNTDYNTPFTSRLSINKDNSKSQVFFKMNSLQSNDTAIYYCARALTYYDYEFAYWGQGTLVTVSAASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SrtA認識モチーフを有する重鎖:
QVQLKQSGPGLVQPSQSLSITCTVSGFSLTNYGVHWVRQSPGKGLEWLGVIWSGGNTDYNTPFTSRLSINKDNSKSQVFFKMNSLQSNDTAIYYCARALTYYDYEFAYWGQGTLVTVSAASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKLPETGS
スペーサー及びSrtA認識モチーフを有する軽鎖:
DILLTQSPVILSVSPGERVSFSCRASQSIGTNIHWYQQRTNGSPRLLIKYASESISGIPSRFSGSGSGTDFTLSINSVESEDIADYYCQQNNNWPTTFGAGTKLELKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECGGGGSGGGGSGGGGSLPETGS
SrtA認識モチーフを有する軽鎖:
DILLTQSPVILSVSPGERVSFSCRASQSIGTNIHWYQQRTNGSPRLLIKYASESISGIPSRFSGSGSGTDFTLSINSVESEDIADYYCQQNNNWPTTFGAGTKLELKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECLPETGS
c)αHEL抗体のアミノ酸配列。遺伝子改変は下線で表記されている。
スペーサー及びSrtA認識モチーフを有する軽鎖:
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASGNIHNYLAWYQQKPGKAPKLLIYYTTTLADGVPSRFSGSGSGTDYTFTISSLQPEDIATYYCQHFWSTPRTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECGGGGSGGGGSGGGGSLPETGS
天然重鎖:
QVQLQESGPGLVRPSQTLSLTCTVSGFSLTGYGVNWVRQPPGRGLEWIGMIWGDGNTDYNSALKSRVTMLKDTSKNQFSLRLSSVTAADTAVYYCARERDYRLDYWGQGSLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
d)αMET×EGFR抗体のアミノ酸配列。遺伝子改変は下線で表記されている。
scFvを有するSEED GA重鎖:
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIGTNIHWYQQKPGKAPKLLIKYASESISGVPSRFSGSGYGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQQNYNWPTTFGQGTKVEIKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGFSLTNYGVHWMRQAPGQGLEWIGVIWSGGNTDYNTPFTSRVTITSDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARALTYYDYEFAYWGQGTLVTVSS
SEED AG重鎖:
METDTLLLWVLLLWVPGSTGEVQLVQSGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYY
ADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDRRITHTYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPFRPEVHLLPPSREEMTKNQVSLTCLARGFYPKDIAVEWESNGQPENNYKTTPSRQEPSQGTTTFAVTSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKTISLSPGK
SrtA認識モチーフを有する軽鎖:
METDTLLLWVLLLWVPGSTGEPVLTQPPSVSVAPGETATIPCGGDSLGSKIVHWYQQRPGQAPLLVVYDDAARPSGIPERFSGSKSGTTATLTISSVEAGDEADYFCQVYDYHSDVEVFGGGTKLTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHKSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECSLPETGS
e)αMET抗体のアミノ酸配列。遺伝子改変は下線で表記されている。
SrtA認識モチーフを有する軽鎖:
METDTLLLWVLLLWVPGSTGEPVLTQPPSVSVAPGETATIPCGGDSLGSKIVHWYQQRPGQAPLLVVYDDAARPSGIPERFSGSKSGTTATLTISSVEAGDEADYFCQVYDYHSDVEVFGGGTKLTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHKSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECSLPETGS
重鎖:
EVQLVQSGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDRRITHTYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
抗体の発現は、ExpiFectamine(商標)293トランスフェクションキット(Life Technologies)に提供されているプロトコ-ルに基づく。1250μLのOpti-MEMを、80μLのExpifectamineと混合し、最長で5分間インキュベートする。その後、12.5μgの重鎖及び軽鎖プラスミドを、1250μLのOpti-MEMで希釈する。SEED抗体は、2つの異なる重鎖を有する。GA鎖及びAG鎖の重鎖プラスミド並びに軽鎖を、質量比1:1:1で混合する。両溶液を一緒にして反応混合物を形成し、30分間インキュベートする。一方で、Expi293(商標)細胞の細胞密度を、ViCell細胞計数器(Beckman Coulter)を使用して決定する。生存率が95%よりも大きな場合、細胞を使用した。細胞を、Expi293(商標)発現培地で3.0×106細胞mL-1に希釈して総容積を21mLにする。それを37℃に調節した。反応混合物を、振とうしながら細胞懸濁物に添加する。細胞を、37℃及び5%CO2で振とうする。16~18時間後、150μLのエンハンサー1及び1.5mLのエンハンサー2を添加する。発現は、37℃及び5%CO2で4日間振とうしながら行った。遠心分離(6000g/10分間/4℃)後に上清を収集することにより抗体を単離する。上清を、Steritop 0.22μmフィルター又はSteriflip 0.22μmフィルター(Merck Millipore、Merck KGaA)を使用して滅菌濾過する。抗体を、プロテインAクロマトグラフィーで処理することにより精製する。この手順は、試薬の比を等しく維持することによりスケールアップすることができる。
氷上で解凍し、その後50ngのプラスミド溶液と混合した50μLの化学コンピテント細胞を使用して形質転換を実施した。氷上で30分間インキュベートした後、細胞を30秒間42℃に調節した。その後、250μLのSOC培地を添加し、37℃で45分間振とうしながらインキュベートした。細胞懸濁物を、16krcfで1分間遠心分離した。上清を廃棄し、細胞を、残りの溶液に再懸濁した。懸濁物を、抗生物質を含む寒天プレートにプレーティングした。プレートを37℃で一晩インキュベートした。
プラスミドを、One Shot TOP10化学コンピテント大腸菌(E.coli)の形質転換により増幅した。タンパク質発現のために高プラスミド収量が必要な場合は、JetStar(商標)2.0プラスミド精製キットを使用して精製を実施した。一晩培養物を回収することから精製手順を開始した。細胞を溶解し、続いて沈殿及び遠心分離を行った。上清を、プレパック陰イオン交換カラムにアプライする。デオキシリボ核酸(DNA)骨格は負に荷電されているため、DNAは、正荷電カラムマトリックスに結合する。低塩洗浄ステップは、リボ核酸(RNA)、炭水化物、及びタンパク質を除去する。次いで、DNAを高塩濃度条件下で溶出した。アルコールを使用してDNAを沈殿させることにより、DNAを脱塩した。配列決定目的のプラスミド増幅には、QIAPrep Spin Miniprepキットを使用した。精製手順は、JetStar(商標)2.0プラスミド精製キット手順と同様であるが、DNAを、高塩濃度でQiaPrepカラムのシリカ膜に吸着させ、低塩濃度で溶出させる。
リンカー-薬物のコンジュゲーションは、幾つかの技法を使用して達成することができる。こうした技法の一部は、抗体の事前修飾を必要とする。使用した抗体形式は、図1に図示されている。形式A、B、及びCは、ソルターゼAを使用して酵素修飾するために設計されている。形式A及びBの場合、従来のIgG分子は、C末端が(G4S)3スペーサー及びソルターゼA認識配列LPETGSで又はソルターゼA認識配列LPETGSのみで伸長されている。形式Cは、鎖交換遺伝子操作ドメイン(SEED、strand-exchange engineered domain)技術を使用して生成された二重特異性抗体形式である。これにより、異なる抗原に結合するscFv部分及びFab部分を組み合わせることが可能になる。更に、Fabは、C末端がソルターゼA認識モチーフLPETGSで伸長されている。形式Dは、1mAb当たり最大で4つの薬物を有するADCの産生を可能にする。従って、LCは、(G4S)3スペーサー及びソルターゼA認識配列LPETGSを含み、HCは、SrtA認識モチーフLPETGSによりC末端が伸長されている。リンカー-薬物を含むマレイミドのコンジュゲーションには、天然mAb(形式E)を使用することができる。
抗体のSrtA認識モチーフ1つ当たり10当量のオリゴグリシン細胞傷害性基質を使用して反応を実施する。抗体と比較して0.37当量のソルターゼAを適用する。ソルターゼAは、カルシウムイオンの結合部位を有する。カルシウムイオンの結合はソルターゼAの動きを緩徐化し、それにより基質とソルターゼAとの結合を可能にする。これは、活性の8倍増加に結び付く。
13.5μM(1当量)抗体構築物
5mM(375当量)のCaCl2
SrtA認識モチーフ1つ当たり133μM(10当量)のオリゴグリシン基質
5μM(0.37当量)のeSrtA
IgG抗体精製の基盤は、IgG型抗体のFc領域に対するスタフィロコッカス・アウレウス(Staphylococcus aureus)プロテインAの高い結合親和性である。プロテインAとIgG抗体との結合は、生理学的なpH及びイオン強度で生じるが、結合は、低pHで破壊され、抗体の溶出がもたらされる。IgG分子は、通常pH3.0で溶出することが示された。
抗体精製:分取プロテインA親和性クロマトグラフィーは、AKTAXpress(GE Healthcare)クロマトグラフィーシステムで、5mLプロテインA HPカラム(GE Healthcare)のHiTrap(商標)1mLを使用して実施した。抗体がカラムに結合したら、カラムを結合緩衝液で洗浄した。その後、カラムを100%溶出緩衝液で洗浄することにより、1工程で溶出を実施した。抗体を1.5mLの画分で、96ディープウェルプレートの100μL中和緩衝液へと溶出した。SDS-PAGEを使用して画分の純度を分析し、それに応じてプールした。
ADC精製:ADCを上記に記載の通りに精製したが、5mLプロテインA HPカラム(GE Healthcare)のHiTrap(商標)1mLを使用してAKTA Purifier(GE Healthcare)クロマトグラフィーシステムで精製した。試料を、SunChromのオートサンプラーを使用してカラムにアプライした。1mLの画分を、100μL中和緩衝液を含む1.5mLチューブへと溶出した。ADC含有画分をプールした。
SECの分離原理は、サイズの違いにより引き起こされる分析対象物の溶出時間の差異に基づく。SECカラムの固定相は、細孔を有する球状粒子で構成されている。小分子は細孔内へと拡散することができるが、より大きな分子は、細孔に進入することができず、マトリックスを直接的に通過する。そのため、まず最も大きな分子が溶出し、続いてより小さい分子がそれらのサイズ順に溶出する。本作業の過程では、凝集体を抗体調製物から除去するために、並びに酵素ソルターゼA及び過剰トキシン等のコンジュゲーション試薬からADCを分離するためにSECを使用した。SEC精製は、Agilent 1260 HPLCシステム(Agilent Technologies)で実施した。流速は0.5mL/分だった。Superdex200 10/30 increaseカラム(GE Healthcare)を使用して試料を分離した。試料を0.5mL画分で溶出し、プールして最終産物を得た。経路Dを介して精製したαHER2-1を調製するための分取SECは、HiLoad(商標)16/600 Superdex(商標)200pgカラムを使用してAKTAXpress(GE Healthcare)クロマトグラフィーシステムで実施した。そのために、カラムを水で洗浄し、その後移動相で平衡化した。注入後、試料を1mL分-1の流速にて均一濃度で溶出した。ピークは分画収集される。
ADCの薬物対抗体比(DAR)は、疎水性相互作用クロマトグラフィー(HIC)を使用して決定することができる。そのために、タンパク質を、高濃度のカオトロピック塩を含む水性移動相にアプライする。個々のタンパク質は、それらの疎水性に基づいて固定相に結合し、塩含有量を徐々に低減することにより、疎水性が最も低いものから最も高いものの順に溶出する123。異なるADC種及び未反応mAbは、負荷薬物に基づいて分離される。クロマトグラムの加重曲線下面積を使用して、ADCのDARを算出することができる。
全ての試料は、硫酸アンモニウムの最終濃度が1.5Mになるように試料調製緩衝液を使用して希釈することにより調製した。ソルターゼAで生成されたADCの分析的HICは、MAB PAKブチル、4.6×50mmカラム(Thermo Scientific)を備えたHPLCシステム(Agilent Technologies)を使用して実施した。UV-VIS検出器では、220nm及び280nmの波長を使用した。測定は、20分間で0から100%緩衝液Bへの勾配を1mL分-1の流速で適用して実施した。HPLC分析は30℃で実施した。その後、カラムを100%緩衝液Bで洗浄した。LC 3DシステムのChemStation(Agilent Technologies)を使用してデータを処理した。
mAb試料及びADC試料のモノマー含有量を、分析的SECにより決定した。分析的SECは、TSK-GEL Super SW3000SEC4.6×300mmカラムを備えたAgilentTechnologiesのInfinity1260HPLCシステムで実施した。溶出は、0.35mL分-1の流速にて均一濃度で実施した。
緩衝液の交換は、Sephadex G-25媒体を含むPD-10脱塩カラム(GE Healthcare)を使用して実施する。根底にあるクロマトグラフィー法は、サイズ排除クロマトグラフィーであり、試料は、分子のサイズに基づいて分離される122。タンパク質の溶出には、タンパク質試料の品質低下に結び付く可能性のある過酷な緩衝液条件が使用されることが多い。結果として、保管のために緩衝液を交換する必要がある。脱塩のため、3カラム容積の保管用緩衝液をアプライすることによりカラムを平衡化した。次いで、2.5mLのタンパク質溶液をカラムにアプライし、続いて3.5mLの保管用緩衝液を使用して新しいファルコンへと溶出した。
クライオバイアルとして-80℃で提供された細胞を、氷が溶解するまで37℃の水浴で解凍した。細胞を再懸濁し、50mLファルコンチューブに移した。細胞懸濁物を遠心分離した(5分間/500rpm/RT)。上清を減圧除去し、ペレットを5mL細胞培養培地に再懸濁した。この時点で、細胞を細胞傷害性アッセイに直接使用したか、又は10mL細胞培養培地を含むT75フラスコに投入したかのいずれかだった。
通常は、T75細胞培養フラスコ中の細胞を、5%CO2加湿雰囲気のインキュベーター内で37℃にて培養し、3~4日毎に継代した。継代のため、培地を減圧除去し、細胞をPBSで洗浄し(3×)、1mLの0.05%トリプシン-EDTAを添加した。剥離反応の完了を目視で調べた。全ての細胞が剥離したら、9mLの培地を細胞に添加して剥離反応を停止させた。細胞の成長速度に応じて、細胞を、1:2~1:4に分割し、10mLの培地を含む新しいT75フラスコに再播種した。その後、細胞を、5%CO2加湿雰囲気のインキュベーター内で37℃にてインキュベートした。
相乗効果を更に解明するために、ATRiによるデュオカルマイシン担持ADCの強化効果を研究した。そのために、曲線シフトアッセイ系を確立した。最初の工程では、ある特定の細胞株を阻害剤で処置することにより用量反応曲線(DRC)を得る。このDRCから最大非有効用量(MNED)を導き出すことができる。MNEDは、生存率に影響を及ぼすことなくある特定の細胞株に添加することができる最も高い用量である。ADCの活性を、別々の実験で確認する。最後に、組合せ実験を実施することができる。そのために、ADC及びADC+MNEDの阻害剤を細胞に添加する。対照として、阻害剤を並行してMNEDで試験する。阻害剤はMNEDで適用されるため、阻害剤により引き起こされる細胞生存率の低減は予想されない。3つの結果が考えられる:1)ADC+阻害剤の組合せは、ADCのみと効力が同等である。これは相加効果しかないことを示唆するだろう。2)ADC+阻害剤の組合せは、ADC単独よりも強力でない。そのような結果は、脱強化作用として解釈される。3)ADC+阻害剤の組合せは、ADC単独よりも強力である。この場合、ADCの効力は強化されている。
強化効果は、用量低減指数(DRI)として表し、これは、数式(1)に従って、ADCのIC50値をADC+阻害剤のIC50値で除算することにより算出することができる。
用量マトリックス組合せアッセイを上記の通り実施したが、不透明384ウェルプレート(2k生存細胞/ウェル)で実施した。TecanD300e液体を使用して化合物を添加した。タンパク質溶液を0.3%Tween-20(最終)で補完し、1μMに希釈した。全てのウェルを、添加した最大量のDMSO(最大0.4%)又はTween-20に対して正規化した。Envision2104マルチラベルリーダー(Perkin Elmer)で発光の読取りを実施し、Genedata Screener(登録商標)バージョン14.0.6-スタンダード(Genedata AG)を使用してデータを評価した。発光値を未処置細胞の発光に対して正規化し、Smart Fitを使用して用量反応をフィッティングした。相乗作用スコアを、LOEWE相乗作用モデルを使用して算出した。
0.7*106個の生存細胞をT25フラスコに播種し、5mLの培地を添加し、細胞を37℃及び5%CO2で一晩インキュベートした。トランスフェクションを以下の通り実施した:2.5μLのリポフェクタミンRNAiMAXを247.5μLのOptiMEMで希釈し、0.3μMのsiRNA(ATR、CHK1、又は非標的指向性siRNA)溶液をOptiMEMで調製して、250μLの最終容積を得た。溶液を混合し、室温で20分間インキュベートした後、500μLの細胞培養培地を添加した。細胞培養培地を細胞から除去し、PBSで洗浄し(3×)、トランスフェクションミックスを細胞に添加した。37℃及び5%CO2で4時間インキュベートした後、トランスフェクションミックスを減圧除去した。細胞を培地で洗浄し(3×)、5mLの培地を添加し、細胞を37℃及び5%CO2で60時間インキュベートした。次いで、細胞を剥離し、384ウェルプレートに播種した。次いで、細胞傷害性アッセイを、上記に記載のように実施したが、1つの化合物のみを用いた。
統計分析は、不等分散を想定し、Microsoft Excelで両側T.検定式を使用して実施した。曲線シフトアッセイの帰無仮説は、2つの化合物の組合せが、単剤単独と等しく細胞傷害性であることだった。相乗作用実験の帰無仮説は、2つの組合せが、等しく相乗的であることだった。グラフ注釈:*:P<.05、**:P<.01、***:P<.001、****:P<.0001。
6~8週齢の雌H2d Rag2マウスを、Taconic Biosciences,LLCから入手した。細胞培養からNCI-N87細胞を回収し、細胞をマトリゲルと1:1で混合し、2.5×106個の細胞をマウスの脇腹に皮下注射することにより、異種移植片を確立した。カリパスを使用した二次元での長さ測定により、腫瘍容積を週2回評価した。容積は、数式3に従って算出した。この数式において、長さLは、最も長い腫瘍長であり、Wは、最も短い腫瘍長である。
V_腫瘍=(L*W^2)/2 数式3
1ウェル当たり3500個のHT29細胞(培地は付録1を参照)を、30μLで黒色384ウェルプレートに播種した。細胞を22℃で1時間インキュベートした後、37℃、10%CO2、及び90%相対湿度で一晩インキュベートした。ATRiの系列希釈物を、ヒドロキシ尿素と同時に最終濃度3mMで細胞に添加した。5μLの7×PBS/HEPESを添加し、DMSOを最終的に0.5%にした。プレートを、37℃、10%CO2、及び90%相対湿度で4時間インキュベートした。Tecan-Powerwasherを使用して上清を除去した。30μL/ウェルのPBS中4%ポリ-ホルムアルデヒドを添加し、その後22℃で15分間インキュベートすることにより、細胞を固定した。細胞を80μLのPBSで1回洗浄し、Tecan Powerwasherを使用して上清を除去した。1ウェル当たり40μLの-20℃冷却メタノールを添加し、22℃で10分間インキュベートした。細胞を80μLのPBSで1回洗浄し、Tecan Powerwasherを使用して上清を除去した。1ウェル当たり30μLのPBS中0.2%Triton溶液を細胞に添加し、22℃で10分間インキュベートした。細胞を80μLのPBSで1回洗浄し、Tecan Powerwasherを使用して上清を除去した。25μLの10%ヤギ血清、1%BSA、0.1%Tween-20、0.1%アジ化ナトリウムを含むPBSを添加し、37℃で60分間インキュベートした。上清を除去し、25μLの1°抗体(ホスホ-CHK1(Ser345、133D3)ウサギmAb)、1%BSA、0.1%アジ化ナトリウムを含むPBSを用いて4~8℃にて一晩染色した。80μLのPBSで洗浄し、上清を除去した。25μLの2°抗体(AlexaFluor(登録商標)488ヤギ抗ウサギF(ab’)2断片)及び0.2μg/mLヨウ化プロピジウム、1%BSA、0.1%アジ化ナトリウムを含むPBSを添加した。プレートを37℃で60~90分間インキュベートした。それを80μLのPBSで洗浄し、0.1%アジ化ナトリウムで補完された80μLのPBSを添加した。プレートを透明粘着シールで密封した。IMX Ultraで画像を取得し、Metaexpress5.3を使用して分析した。
相乗的薬物組合せのスクリーニングは、用量マトリックスアッセイを実施することにより達成することができる。そのために、2つの薬物を系列希釈し、各用量レベルで混合し、用量マトリックスを得る。組合せの効果が、単剤の相加効果と同一である場合、その薬物組合せは相加的であり得る。しかしながら、組合せの効果は、単剤の活性よりも強力であり得る。このシナリオを相乗作用と称し、単剤と比較してより弱い組合せ効果を、拮抗作用と称する。用量マトリックスアッセイは、図2に模式的に図示されている。この図には、用量マトリックスアッセイの結果:相加作用、拮抗作用、相乗作用が例示されている。
モデル及び実際の応答が等しい場合に相加性であるとした(-1>S<+1)組合せ実験から、相乗作用スコア(S)を得た。実際の応答がモデルを超えていた場合、組合せは相乗的(S>1)であり、その組合せで処置した細胞が、その組合せ処置に対して、単剤と比較してより弱い応答を示した場合、その組合せは拮抗的(S<1)だった。組合せ効果の程度は、スコアの大きさにより決定した。
デュオカルマイシンの相乗的組合せパートナーを特定するために、低スループットスクリーニングを実施した。そのために、DNA損傷修復、細胞周期調節、DNAリモデリングに干渉したか、又はデュオカルマイシン誘導性病変の修復に潜在的な役割を示す文献データに基づきDNA損傷を誘導したかのいずれかである17個の小分子DNA損傷応答阻害剤(DDRi)を選択した。阻害剤は、対応する標的及び作用機序と共に表2に要約されている。
相乗的薬物組合せであるDUBA+AZD6738を特定した後で、一連のデュオカルマイシン変異体を研究した。これにより、観察された相乗作用がDUBAにより引き起こされた効果ではなく、概してデュオカルマイシンによるものであることが検証されるはずである。そのために、デュオカルマイシン変異体を、それらの構造的特徴に従って2つの群にクラスター化した。トリメトキシインドール(TMI)系統では、デュオカルマイシンの結合単位は一定に保たれるが、アルキル化単位は様々である。デュオカルマイシンSA(13)及びCBI-TMI(24)のアルキル化単位は、三環からなり、立体電子特性が異なる。後者のアルキル化単位はキラル中心を有する。これとは対照的に、3つのアキラルなデュオカルマイシン変異体を調査した。これらのうち、2つの変異体デュオカルマイシン35及び36は、二環式アルキル化単位を有し、37は単環式アルキル化単位を有していた。TMI系統の構造は、表4にまとめられている。
薬物DDM(38)及びDUBA(10)を、更なる実験のために選択した。デュオカルマイシンは、その構造的特徴に関わらず、ATRi AZD6738と相乗作用した。デュオカルマイシン変異体DUBAが、他のATR阻害剤とも相乗作用するか否かを調査した。
AZD6738との組合せ実験では、デュオカルマイシン変異体は、相乗効果の程度に役割を果たすことが確認された。この研究では、組合せ効果に対するATRiの影響を解明するために、幾つかの異なるATR阻害剤を調査した。この報告で研究されたATRiの化学構造の概要は図5に示されている。ATRiを、4つの群にクラスター化した。Astra ZenecaのAZ20及びAZD6378に由来するATRiは、同一のコア単位と密接に関係している。BayerのATR阻害剤も、同じコア単位を有していた。3つのBayerのATRiは、R1が異なるに過ぎなかった。第I相ATRi BAY1895344は、ピラゾール残基を保持し、ATRi BAY73は、R1にメタンスルホンピリジン残基を保持していた。BayerのATRi BAY286は、R1にメタンスルホン部分を保持していた。VE-822は、残りのクラスターとは構造的に無関係だった。
デュオカルマイシン担持ADCの生成
この研究では、幾つかのデュオカルマイシン担持ADCを、がん関連受容体チロシンキナーゼ HER2、EGFR、及び間葉上皮移行(MET)を標的とする抗体に基づいて生成した。こうした抗体にカップリングされたリンカー-薬物は、タグLD Xで指定した。この場合、Xは、特定の構造のインデックス番号を指す。得られるADCの名称は、標的又は抗体の名称及びリンカー-薬物インデックス番号で構成されていた。例えば、リンカー-薬物1(LD-1)及び抗EGFR(αEGFR)抗体又は抗HER2(αHER2)で構成されるADCは、それぞれαEGFR-1又はαHER2-1という名称を保持していた。
この章には、デュオカルマイシンに基づくADCの抗増殖効果が記載されている。ADC αHER2-1の細胞傷害性を、HER2陽性細胞で研究した。細胞パネルには、乳がん細胞株BT-474、HCC-1954、JIMT-1、MDA-MB-361、MDA-MB-453、及びSK-BR-3、並びに肺腺癌細胞株Calu-3が包含されていた。更に、ADCを、HER2陰性乳がん細胞株MDA-MB-468で試験した。αHER2-1は、HER2陽性細胞株では、2桁台のピコモル~1桁台のナノモル範囲で活性であり、HER2陰性細胞株MDA-MB-468では、より低い3桁台のナノモル範囲で弱い細胞傷害性しか示さなかった。ADC αHER2-2及びαHER2-3は、Calu-3細胞、HCC-1954細胞、及びSK-BR-3細胞に対して、αHER2-1と同様に細胞傷害性だった。しかしながら、カドサイラは、Calu-3に対して、デュオカルマイシンに基づくADCと比較して5分の1~45分の1の効力しか示さなかった。カドサイラ並びにαHER2-2及びαHER2-3は、抗原陰性細胞に対して、2桁台のナノモル範囲で効力を示した。非標的指向性ADC αHEL-1は、HER2陽性細胞に対して、2桁台~3桁台のナノモル範囲の弱い抗増殖効果を呈した。ADC αHER2-6は、NCI-N87及びMDA-MB-453に対してナノモル未満のIC50値を示し、これはカドサイラの効果と同等だった。αHER2-6は、NCI-N87細胞に対して、αHER2-2と同等の効力を示した。
αHER2-デュオカルマイシンADC及びATRiの組合せの相乗作用
HCC-1954を、AZD6738と組み合わせたDDM、DUBA、及び対応するDDM担持αHER2-1、及びDUBA保持ADC αHER2-2(図9)で6日間処置した。次いで、CellTiter-Gloキットを使用して細胞傷害性を決定した。Envisionリーダーで発光を読み取り、GeneData Screenerを使用してデータを評価した。DDMとAZD6738との組合せ(S=5.6±1.7)は、対応するADC αHER2-1(S=5.1±2.0)と同等に相乗的だった。DUBAとAZD6738との組合せ(6.9±0.7)及びαHER2-2+AZD6738の組合せ(7.2±1.0)についても同じ結論を導き出すことができる。
デュオカルマイシン修飾ADCをATRiと組み合わせるという概念を、追加の抗体に当てはめることができることを検証するため、セツキシマブに基づくデュオカルマイシン-ADCを調査した。そのために、EGFR陽性細胞株A549、A431、及びMDA-MB-468、並びにEGFR陰性MCF7細胞を、AZD6738と組み合わせたDDMに基づくαEGFR-1、DSAに基づくαEGFR-7で処置した。対照として、細胞を、MMAE-ADC αEGFR並びに小分子デュオカルマイシンDDM及びDSAでも処置した。6日間の処置後、CellTiter-Glo試薬を使用して細胞生存率を決定した。Envisionリーダーで発光を読み取り、GeneData Screenerを使用して評価を行った。データは、図12に示されている。陰性対照であるADC αEGFRの相乗作用スコアは、相加性の範囲内だった。陽性対照であるDDMは、A549に対しての2.0±1.1からMDA-MB-468細胞に対しての6.0±1.0までの範囲の相乗作用スコアを示した。A431、MDA-MB-468、及びMCF7に対する小分子DSAの相乗作用スコアは同等だった。しかしながら、DSAは、A549細胞に対してAZD6738と相乗作用しなかったが、相加効果を示した。αEGFR-1+AZD6738の組合せの相乗作用は、A549(S=3.9±1.0)細胞、A431(S=3.9±0.3)細胞、及びMDA-MB-468(S=4.2±0.3)細胞に対しては非常に類似していたが、MCF7に対する相乗作用スコア(S=2.2±0.1)は、MDA-MB-468(P=.006)又はA431(P=.01)に対してAZD6738と組み合わせたαEGFR-1と比較して有意に低かった。しかしながら、DSA-ADC αEGFR-7とATRiとの組合せでは、効果はそれほど明確ではなかった。C-7+AZD6738の相乗作用スコアは、A431に対しては4.4±0.6、A549に対しては2.9±1.1、MDA-MB-468細胞に対しては3.2±0.4だった。この組合せでは、EGFR陰性細胞株MCF7に対する相乗作用スコアは、2.3±0.1に達した。これは、A431細胞に対してこの組合せで得られたものよりも有意に低い(P=.03)。
併用療法の安全性を向上させるための戦略は、投与用量の低減である。前章では、ATRiと組み合わせたデュオカルマイシン担持ADCは、がん細胞に対して相乗的な毒性効果を見せたことが実証された。しかしながら、相乗効果を相乗作用スコアとして表しても、同じ細胞効果を維持しつつ、組み合わせた薬物の用量をどのくらい低下させることができるかについて推定することは可能ではなかった。従って、ATRiを有効用量未満で添加した場合に、デュオカルマイシン担持ADCの効力がどのくらい強力に増加するのかを研究した。
更に、HER2陽性細胞に対してαHER2に基づくADCで観察された強化効果を、他の標的抗原にも当てはめることができるか否かを研究し、2つの糖タンパク質(GP)発現細胞株を、GP結合ADC αGP-1単独で、又はATRi AZD6738及びVE-822をそれらのそれぞれのMNEDで組み合わせたADCで6日間処置した。その後、CellTiter-Gloアッセイを使用して細胞生存率を決定した。細胞生存率アッセイの効力は図20にまとめられている。単剤としてのADCのIC50値は、GP発現細胞株1では5±2nMであり、GP発現細胞株2では1.4±0.6nMだった。ADC αGP-1の効力は、300nMのAZD6738を追加することにより、GP発現細胞株1細胞では7.5倍に増強され、0.7±0.3nMのIC50値がもたらされた。300nMのVE-822を追加すると、組合せの効力が1.1±0.5nMに減少した。これは、単剤よりも4.7倍強力である。GP発現細胞株2でも同様の結果が得られた。300nMのAZD6738と組み合わせたαGP-1のIC50値は0.3±0.2nMだった。これは、4.2分の1の用量低減に相当する。300nMのVE-822をADCに追加すると、効力が4.5分の1に減少し、0.3±0.2nMの効力に結び付いた。
デュオカルマイシンは、抗体とコンジュゲートさせるとATRiとも相乗作用することの確認に成功した後、この組合せをin vivoで調査して、併用処置の効力及び耐容性を研究した。NCI-N87細胞をH2d Rag2マウスに皮下注射した10日後に、動物を無作為化し、ビヒクル、1.0mg kg-1のαHER2-6の単一静脈内投与、又は経口で14日間にわたって1日1回投与した50mg kg-1のATRi AZD6738若しくはATRi 1のいずれか処置した。AZD6738と組み合わせたαHER2-6又はαHER2-6+ATRi 1を、単剤と同じ投薬量及びスケジュールで投与することにより、組合せ効果を研究した。
Claims (20)
- それを必要とする対象のがんを治療するための方法であって、ATR阻害剤及びDNAアルキル化ADCを任意の順序で前記対象に投与することを含む方法。
- DNAアルキル化ADCは、デュオカルマイシン担持ADCである、請求項1に記載の方法。
- 前記ADCは、EGFR、Her2、cMet-EGFR、又はcMetを標的とする、請求項2に記載の方法。
- 前記ATR阻害剤は、化合物1若しくはその薬学的に許容される塩、化合物2若しくはその薬学的に許容される塩、化合物3若しくはその薬学的に許容される塩、化合物4若しくはその薬学的に許容される塩、化合物5若しくはその薬学的に許容される塩、化合物6若しくはその薬学的に許容される塩、化合物7若しくはその薬学的に許容される塩、又は化合物8若しくはその薬学的に許容される塩からなる群から選択される、請求項1に記載の方法。
- 前記ATR阻害剤は、化合物1又はその薬学的に許容される塩である、請求項4に記載の方法。
- 前記対象は、少なくとも1ラウンドの従前のがん療法を受けており、任意に、前記がんは、従前の療法に対して耐性であったか又は耐性となったものである、請求項1に記載の方法。
- 化学療法(CT)、放射線療法(RT)、又は化学療法及び放射線療法(CRT)を前記対象に施すことを更に含む、請求項1に記載の方法。
- 前記ATR阻害剤及び前記DNAアルキル化ADCは、リード期中に投与され、維持期中には、前記ATR阻害剤は投与されるが、前記DNAアルキル化ADCは投与されない、請求項7に記載の方法。
- 前記ATR阻害剤及び前記DNAアルキル化ADCは、前記リード期中に投与され、前記維持期中には、前記DNAアルキル化ADCは投与されるが、前記ATR阻害剤は投与されない、請求項8に記載の方法。
- ATR阻害剤並びにDNAアルキル化ADC並びに少なくとも薬学的に許容される担体、希釈剤、賦形剤、及び/又はアジュバントを含む医薬組成物。
- ATR阻害剤及びDNAアルキル化剤を含む組合せ。
- がんを治療するための薬剤を製造するための、請求項11に記載の医薬組成物又は請求項12に記載の組合せの使用。
- 薬剤として使用するための、請求項11に記載の組合せ又は請求項12に記載の医薬組成物。
- ATR阻害剤及びDNAアルキル化ADCを含むキット。
- ATR阻害剤、及び前記ATR阻害剤をDNAアルキル化ADCと組み合わせて使用して対象のがんを治療又は進行を遅延させるための説明書を含む添付文書を含むキット。
- DNAアルキル化ADC、及び前記DNAアルキル化ADCをATR阻害剤と組み合わせて使用して対象のがんを治療又は進行を遅延させるための説明書を含む添付文書を含むキット。
- 前記ATR阻害剤及び前記DNAアルキル化ADCを使用して対象のがんを治療又は進行を遅延させるための説明書を含む添付文書を更に含む、請求項17に記載のキット。
- 第1の容器及び第2の容器及び添付文書を含み、前記第1の容器は、前記ATR阻害剤を含む少なくとも1用量の薬剤を含み、前記第2の容器は、前記DNAアルキル化ADCを含む少なくとも1用量の薬剤を含み、前記添付文書は、前記薬剤を使用して対象のがんを治療するための説明書を含む、請求項18に記載のキット。
- DNAアルキル化ADCとATR阻害剤との組合せを宣伝するための方法であって、標的対象集団に対して、がんを有する対象を治療するための前記組合せの使用を促すことを含む方法。
- 前記DNAアルキル化ADCは、DUBA、DDM、及び/又はDSAからなる群から選択されるデュオカルマイシン担持ADCである、請求項2に記載の方法。
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