KR20210123433A - 세포침투 콘주게이트 및 이의 사용 방법 - Google Patents

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KR20210123433A
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cell penetrating
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conjugate
antibody
cell
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린 리
존 어니스트 샤이블리
피오트르 마렉 스위더스키
안드레아 허먼
후아 유
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시티 오브 호프
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Abstract

세포침투 콘주게이트가 본원에 제공된다. 콘주게이트는 포스포로티오에이트 핵산 또는 포스포로티오에이트 폴리머 골격에 부착된 비-세포침투 단백질을 포함하며, 여기서 상기 포스포로티오에이트 핵산 또는 포스포로티오에이트 폴리머 골격은 비-세포침투 단백질의 세포내 전달을 향상시킨다. 콘주게이트를 포함하는 조성물 및 키트가 제공된다.

Description

세포침투 콘주게이트 및 이의 사용 방법{CELL PENETRATING CONJUGATES AND METHODS OF USE THEREOF}
관련 출원에 대한 교차참조
본원은, 그것의 전체가 참고로 편입된, 2013년 8월 29일자로 출원된 미국 가출원 번호 61/871,729, 및 2014년 2월 14일자로 출원된 미국 가출원 번호 61/939,993의 우선권을 청구한다.
연방 지원된 연구 및 개발하에 이루어진 발명에 대한 권리의 서술
본 발명은 미국 국립 보건원에 의해 수여된 과제 번호 CA122976 하에서의 보조로 이루어졌다. 정부는 본 발명에 대해 특정 권리를 갖는다.
발명의 배경
항체는 약물의 다른 유형, 예컨대 소분자 약물과 비교하여 이의 용이한 발생, 특이성 및 바이오-내구성으로 인하여 유효한 약물 양식임이 입증되어 왔다. 현재의 항체 요법는 유일한 표적 세포외 분자일 수 있다. 그러나, 질환 치료 및 질환 진단을 위한 수많은 중요한 표적은 세포내(intracellular)이다. 예를 들면, 수많은 전사 인자, 예컨대 STAT3은 암 요법에 대해 가장 결정적인 것 중에서 여전히 도전적인 표적이다. 당해 기술에서 이들 및 다른 요구들에 대한 해결책이 본원에 제공된다.
본 발명의 간단한 개요
세포내 분자를 표적화하기 위해 펩타이드 및 단백질(예를 들면 항체)를 사용하는 것이 요구되고 있다. 그러나, 세포내 분자를 효과적인 방식으로 표적화하는 펩타이드 및 단백질(예를 들면 항체)의 능력은 어려운 것으로 입증되어 왔다. 하기 실시예 전체에 설명되고 입증된 것으로서, 특히 펩타이드 및 단백질(예를 들면 항체)을 개질시켜 심지어 전신계 투여로도 이들이 세포를 침투하여, 표적 세포내 분자를 효과적으로 표적화하도록 하는 방법이 본원에 제공된다. 게다가, 복합체로서의 2개의 상이한 단백질은 제공된 개질된 항체를 사용하여 표적화될 수 있는 것으로 나타난다. 제공된 세포-침투 펩타이드(단백질) 기술은 다양한 세포내 단백질(예를 들면, 종양발생 단백질, 세포내에 잔류하는 바이러스 단백질, 및 기타의 것들)을 표적화하는데 광범위하게 사용된다.
특히, 세포침투 콘주게이트가 본원에 제공된다. 일 측면에서, 콘주게이트는 포스포로티오에이트 핵산 또는 포스포로티오에이트 폴리머 골격에 부착된 비-세포침투 단백질을 포함하며, 여기서 상기 포스포로티오에이트 핵산 또는 포스포로티오에이트 폴리머 골격은 비-세포침투 단백질의 세포내 전달을 향상시킨다. 다른 측면에서, 콘주게이트를 포함하는 조성물 및 키트가 제공된다.
또 하나의 측면에서, 비-세포침투 단백질을 세포내로 전달하는 방법이 제공된다. 이 방법은 세포를 포스포로티오에이트 핵산 또는 포스포로티오에이트 폴리머 골격에 부착된 비-세포침투 단백질을 포함하는 세포침투 콘주게이트와 접촉시킴을 포함하며, 여기서 상기 포스포로티오에이트 핵산 또는 포스포로티오에이트 폴리머 골격은 비-세포침투 단백질의 세포내 전달을 향상시킨다.
또 하나의 측면에서, 시험대상자에서 질환을 치료하는 방법이 제공된다. 이 방법은 상기 시험대상자에게 포스포로티오에이트 핵산 또는 포스포로티오에이트 폴리머 골격에 부착된 비-세포침투 단백질을 포함하는 세포침투 콘주게이트 유효량을 투여함을 포함하며, 여기서 상기 포스포로티오에이트 핵산 또는 포스포로티오에이트 폴리머 골격은 비-세포침투 단백질의 세포내 전달을 향상시키고, 여기서 콘주게이트의 투여는 상기 시험대상자에서 질병을 치료한다.
도 1a, 1b, 1c, 1d 및 1e는, 항체에 의한 STAT3 융합 단백질 또는 STAT3/엑스포틴 7 복합체의 2개의 별개의 부분을 표적화하는 것이 세포질내에서 STAT3을 보유함을 나타낸다. 도 1a는, STAT3-GFP가 마우스 3T3/v-Src 세포내에서 STAT3 및 GFP 항체의 STAT3-GFP로의 세포내 전달에 의해 세포질내에 국한됨을 나타내는 이미지이다. Hoechst 33342가 부가되어 핵산을 염색시켰다. 바아 규모(scale bar)는 10μm이다. 도 1b는, STAT3이 엑스포틴 7과 상호작용함을 나타내는 웨스턴 블랏 분석(Western blot analysis)에 이어 종양 용해물의 STAT3 또는 엑스포틴 7 면역침강의 이미지이다. PIS: 예비-면역혈청. 도 1c는 Duolink®(제조원: 스웨덴 소재의 Uppsala) 기술을 사용한 U251 세포내 상호작용하는 STAT3 및 엑스포틴 7의 원위치 국재화의 이미지이다. 상호작용 현상은 점-유사 구조(dot-like structure)로 나타낸다. 검출 항체에 의해 STAT3 인식을 방지하는 STAT3 차단 펩타이드가 대조군으로서 사용되어 왔다. 선택된 영역(파선)은 우하측 코너에 확대하여 나타낸다. 바아 규모는 10μm이다(좌측 패널). 도 1d는 엑스포틴 7과 STAT3 상호작용의 정량적 분석의 그래프이다, n = 4(총 신호, 좌측); 핵 대 세포질 신호 현상, n = 26(우측). 스튜던트 T-시험(student's T-test) ***, P < 0.001; **, P < 0.01; *P < 0.05. 도 1e는 세포질내에서 STAT3 및 엑스포틴 7 항체 트랩(trap) STAT3의 세포내 전달을 나타내는 이미지이다. 생존 세포 공초점 영상화는 STAT3 세포 재분포에 있어서 듀오(duo)-항체 접근법의 효과를 입증한다. 바아 규모 10μm.
도 2a, 2b, 2c, 2d, 2e, 2f, 및 2g는, STAT3의 라이신 아세틸화가 STAT3 핵세포질 셔틀링(shuttling) 및 엑스포틴 7의 세포하 국재화를 결정함을 나타낸다. 도 2a는, 라이신 685가 STAT3 핵세포질 셔틀링에 중요함을 나타내는 iFLAP 생존 세포 공초점 영상화의 이미지이다. CFP 및 YFP에 융합된 STAT3 또는 STAT3K685R의 세포내 이동도는 세포질 YFP 표백 라운드에 의한 시간의 함수로 추적되었다. 바아 규모, 10μm. 도 2b는, STAT3K685R이 핵 체류를 겪으며 STAT3 및 GFP 항체에 의해 세포 세포질내에 보유되지 않음을 나타내는 이미지이다. 바아 규모, 10μm. 도 2c는, 티로신 인산화가 아닌 STAT3 라이신 아세틸화가 엑스포틴 7과의 상호작용에 중요함을 나타내는 웨스턴 블랏의 이미지이다. 도 2d는, 항시적으로-활성인 STAT3에서 K685를 돌연변이시키는 것이 STAT3과 엑스포틴 7 사이의 상호작용을 폐지함을 나타내는 이미지이다. STAT3 및 STAT3K685R은 U251 인간 종양 세포에서 과발현되었으며 공동침전 실험이 전체의 세포 용해물로부터 수행되었다. 도 2e는, K685를 돌연변이시키는 것이 생체내에서 엑스포틴 7, 핵 배출 체크-포인트(export check-point) 뉴클레오포린 50 및 뉴클레오포린 153과의 STAT3 상호작용을 감소시킴을 나타내는 이미지이다. 무흉선 누드 마우스에서 STAT3wt-YFP 또는 STAT3K685R-YFP로 재구성된 STAT3 결핍된 MEF 세포를 이식(engrafting)함으로써 성장시킨 종양으로부터 제조된 용해물의 면역침강 후의 웨스턴 블랏 분석이 나타나 있다. 도 2f는, 아세틸화 결핍된 STAT3K685R이 생체내에서 엑스포틴 7의 핵 배출을 제한함을 나타내는 이미지이다. 공초점 현미경사진이 나타나 있다. 핵산은 Hoechst 33342로 염색되었다. 바아의 규모, 50μm. 도 2g는 핵 엑스포틴 7의 정량화를 나타내는 그래프이다, STAT3wt 및 STAT3K685R 종양에서 n = 6 (좌측 패널) 및 핵 직경, n = 6 (우측 패널). ***, P < 0.001; **, P < 0.01.
도 3a, 3b, 3c, 3d, 3e, 3f, 3g, 3h, 및 3i는, 생체내에서 STAT3 및 엑스포틴 7 복합체의 표적화가 암 요법에 효과적임을 나타낸다. 도 3a는 명시된 항체 치료시 C57BL/6 마우스에서 마우스 B16 흑색종의 종양 성장 동력학을 나타내는 그래프이다. 각각의 점은 치료를 나타낸다. 스튜던트 T-시험 ***, P < 0.001; **, P < 0.01; *P < 0.05. 도 3b는, 웨스턴 블랏 분석에 이은 종양의 STAT3 및 뉴클레오포린 50 또는 153의 동시-면역침강에 의해 나타난 것으로서, 종양에서 STAT3 셔틀링을 파괴하는 듀오-항체 치료의 이미지이다. 도 3c는 생체내에서 종양, 종양 맥관구조 및 증식성 활성에 있어 듀오-항체 치료의 효과를 나타내기 위한 헤마톡실린 및 에오신(H&E) 염색에 대한 이미지 및 종양 미세단면의 공초점 이미지이다. 바아 규모, 100μm. 도 3d는 CD31+ 종양 맥관구조(n = 4) 및 Ki67+ 증식성 활성(n = 3)의 정량화를 나타내는 막대 그래프이다. 스튜던트 T-시험 ***, P < 0.001; **, P < 0.01; *P < 0.05. 도 3e는 명시된 항체로 처리된 종양에서, STAT3 표적 유전자, Bcl-2 및 사이클린 D1의 단백질 발현을 나타내는 웨스턴 블랏의 이미지이다. 도 3f는 명시된 항체로 국소 치료한 무흉선 nu/nu 마우스에서 이식된 인간 U87 뇌종양의 종양 성장 동력학의 그래프이다. 스튜던트 T-시험 ***, P < 0.001; **, P < 0.01; *P < 0.05. 도 3g는 듀오-항체 접근법으로 치료한 종양에서 줄어든 STAT3 DNA-결합 활성을 나타내는 시스(Sis)-유도성 성분(SIE) 올리고뉴클레오타이드에 이어 웨스턴 블랏 분석을 사용한 올리고-풀-다운(oligo-pull-down) 분석의 이미지이다. 침전물은 SDS-PAGE에 의해 처음 분리되었다. 도 3h는 생체내에서 종양 세포 세포자멸사 및 종양 혈액 맥관구조 붕괴를 효과적으로 유도하는 듀오-항체 트랩핑 접근법(duo-antibody trapping approach)의 이미지이다. 상부 패널: 아넥신 V 신호를 검출하기 위한 생체내-다광자 영상화. 아넥신 V는 종양 영상화 직전에 전신계적으로 주사되었다. CD31+ 종양 맥관구조의 공초점 이미지는 하부 패널에 나타낸다. 바아 규모, 100μm. 도 3i는 명시된 항체로 처리한 종양에서 아넥신 V+ 종양 세포 세포자멸사(n = 4) 및 CD31+ 종양 맥관구조(n = 7)의 정량화를 나타내는 막대 그래프이다. 스튜던트 T-시험 ***, P < 0.001; **, P < 0.01; *P < 0.05.
도 4a, 4b, 4c, 4d, 4e, 4f, 4g, 4h 및 4i는 포스포로티오에이트화된 핵산으로 개질된 세포침투 STAT3 및 엑스포틴 7 항체에 의한 강력한 항종양 효능을 나타낸다. 도 4a는 형광성으로 표지된 개질된 항체를 사용한 명시된 시간 및 용량에서 세포성 내재화의 혈구계산 분석의 그래프이다. 도 4b는 포스포로티오에이트화된 핵산 개질된 항체의 세포하 국재화의 공초점 현미경적 분석의 이미지이다. 항체(항-Stat3-올리고-FAM 및 항-엑스포틴 7-올리고-TAMRA)은 10μg/ml에서 2시간 동안 인큐베이트되었다. 바아 규모, 20μm. 도 4c는 명시된 바와 같은 10μg 총 용량의 포스포로티오에이트화된 핵산-개질된 항체를 사용하여 격일로 국소 치료된 B16 흑색종 종양을 지닌 마우스의 종양 부피를 나타내는 그래프이다. 표준 편차(SD)가 나타나 있다. 스튜던트 T-시험 ***, P < 0.001; **, P < 0.01; *P < 0.05. 도 4d는 10μg 총용량의 올리고-개질된 항체를 격일로 국소 또는 전신 치료되거나 치료되지 않은 채 둔 B16 흑색종 종양을 지닌 마우스의 종양 부피를 나타내는 그래프이다. SD가 나타나 있다. 스튜던트 T-시험 ***, P < 0.001; **, P < 0.01; *P < 0.05. 도 4e는 명시된 바와 같은 감소하는 용량의 항체-조합으로 격일에 3회 전신 치료(화살표)하거나 치료하지 않은 채로 둔 B16 흑색종 종양을 지닌 마우스의 종양 부피를 나타내는 그래프이다. SD가 나타나 있다. 스튜던트 T-시험 ***, P < 0.001; **, P < 0.01; *P < 0.05. 도 4f는 Stat3 활성의 유세포측정 분석의 그래프이다. 도 4g는 세포 세포자멸사의 유세포측정 분석의 그래프이다. 도 4f 및 4g는 개질된 항체에 의해 국소 치료된 종양으로부터 제조된 단일-세포 현탁액을 사용하였다. 도 4h는 뉴클레오포린 50 (상부 패널) 또는 뉴클레오포린 153 (하부 패널)의 면역침강에 이어, 단백질 상호작용을 평가하기 위한 STAT3 웨스턴 블랏에 적용된 도 4e에 대해 위에서 기재된 실험으로부터 제조된 종양 균질물을 나타내는 이미지이다. 도 4i는, 포스포로티오에이트화된 핵산 개질된 듀오 항체에 의한 효과적인 STAT3 활성 봉쇄를 나타내는 전기영동 이동도 이동 분석(electrophoretic mobility shift assay: EMSA)의 이미지이다. 핵 추출물은 도 4e에서와 같이 동일한 종양으로부터 단리되었다.
도 5a 및 5b는, STAT3이 엑스포틴 7과 상호작용함을 나타낸다. 도 5a는 웨스턴 블랏팅에 이어 U251 인간 뇌 종양 세포로부터의 전체의 세포 용해물을 사용한 동시-면역침강에 의해 나타낸 바와 같은 STAT3과 엑스포틴 7 사이의 상호작용의 이미지이다. STAT3 단백질 침전물은 SDS-PAGE에 의해 단리되고 명시된 바와 같이 다양한 엑스포틴과 이의 상호작용을 확인하기 위한 웨스턴 블랏팅 분석에 의해 분석되었다. 전체의 세포 용해물은 대조군(우측 레인)으로서 포함되었다. 도 5b는 MEF 세포내에서 발현되고 명시된 농도 및 시점에서 엑스포틴 1/Crm1-특이적인 억제제, 렙토마이신 B로 치료된 STAT3-GFP 융합 단백질(상부 패널) 또는 NFkB 서브유닛 p65-GFP(하부 패널)의 공초점 현미경검사의 이미지이다. LMB 치료시 단백질 국재화는 공초점 현미경검사를 사용하여 평가되었다. 바아 규모 10mm.
도 6a 및 6b는 각각 iFLAP 또는 FLIP에 의한 STAT3 핵세포질 셔틀링 분석을 나타낸다. v-Src로 형질전환된 섬유아세포를 사용하여 인트라카테나(intracatenar) 표백 실험(FLAP, 광표백 후 형광 손실)을 수행함으로써 STAT3의 구획 턴오버를 측정하였다. iFLAP 기술의 도식적 실험 디자인은 대안적으로, FLIP 분석 셋팅에서 세포질 표백 절차의 반복될 라운드시 활성화된 STAT3 또는 핵 YFP 유인의 시공간적 분포를 측정하는데 사용된 모든 목적한 영역(ROI)를 나타낸다. 도 6a는 STAT3-YFP를 발현하는 3T3/v-Src의 커플을 묘사하는 이미지이며, 이중 하나는 대조군으로서 공급되는 반면 iFLAP는 이의 인접 세포에서 공초점 현미경검사를 사용하여 수행된다. 규모 10μm. 도 6b는 계속되는 세포질 표백 및 핵 YFP 방출 기록시 측정된 3T3/v-Src 세포에서 발현된 핵 STAT3-YFP 또는 STAT3-K685R-YFP의 방출 신호 유인을 나타내는 그래프이다. 획득된 YFP 세기는 FLIP 파라미터를 사용하여 수정되고 정규화되었다.
도 7a, 7b, 및 7c는 핵 체류를 겪는 STAT3-K685R을 나타낸다. 도 7a는 Stat3-WT-YFP 및 Stat3-K685R-YFP로 일시적으로 형질감염되고 명시된 시점에서 10 ng/ml 온코스타틴 M으로 자극된 Stat3-결핍된 MEF의 공초점 현미경검사의 이미지이다. STAT3-WT-YFP 및 STAT3-K685RYFP의 핵 체류는 공초점 현미경검사를 사용하여 평가하였다. 바아 규모 10μm. 도 7b는 도식에 나타낸 바와 같이 설계된 디기토닌-기반 형광 프로테아제 보호 (FPP) 분석에 의해 분석된 STAT3-WT-YFP 및 STAT3-K685R-YFP의 핵 출구 동력학을 나타내는 도식이다. 도 7c는 3T3/v-Src 형질전환된 섬유아세포에서 발현된 STAT3-WT-YFP(상부 패널) 또는 STAT3-K685R-YFP(하부 패널)을 나타내는 이미지이다. 생존 세포의 이미지는 명시된 시점에서 디기토닌 투여시 획득되었다. 핵 YFP 방출의 유인은 강도 코드된 잘못된 색상 모드로 나타낸다(검정색, 높은 강도; 흰색, 낮은 강도). 바아 규모 10μm.
도 8a, 8b, 8c, 및 8d는, 라이신 K685에서 STAT3를 돌연변이시키는 것이 생체내에서 내부 핵공 복합체(NPC)와 이의 상호작용을 제거하였음을 나타낸다. STAT3 결핍된 MEF 세포는 각각 STAT3wt 또는 STAT3K685R으로 안정되게 재구성되었다. 도 8a는 무흉선 nu/nu 마우스에서 이식된 STAT3-WT 또는 STAT3-K685R을 안정하게 발현하는 MEF 세포주의 종양 부피의 그래프이다. 도 8b는 명시된 바와 같은 핵 바스켓(basket)에서 뉴클레오포린 50 (Nup50) 및 153 (Nup153)의 위치를 강조하는 NPC의 도식적 묘사이다. 엑스포틴 7은 내부 바스켓의 뉴클레오포린(우측 패널)과의 물리적 상호작용을 중재함으로써 카고(cargo)로 인식되면 STAT3의 핵 배출을 촉진한다. 도 8c는 간접적인 면역형광 STAT3 및 뉴클레오포린을 통해 평가된 생체내에서 STAT3-WT 및 STAT3-K685R과 Nup50(상부 패널) 및 Nup153(하부 패널)의 상호작용의 공초점 현미경검사의 이미지이다. STAT3 및 뉴클레오포린 이중-양성 픽셀은 이중-양성 픽셀의 이미지 마스크를 제공하는 십자선 기능을 사용하여 생성하였다. 바아 규모 10μm. 도 8d는 Nup50을 사용한 국재화시 STAT3-WT(검정색) 및 STAT3-K685R(회색)을 비교하는 이중-양성 픽셀의 정량화의 그래프이다, n = 3 (좌측 패널) 및 Nup153, n = 3 (우측 패널).
도 9는 정상 조직에서 세포질에 국한된 엑스포틴 7 국재화를 나타내는 이미지이다. 명시된 조직으로부터의 미세단면(microsection)의 공초점 현미경적 이미지는 간접적인 면역형광에 의해 엑스포틴 7, CD31, 및 핵산을 염색하였다. 엑스포틴 7+ 영역(파선)의 보다 높은 배율이 우상측 또는 우하측 코너 각각에 나타난다. 바아 규모 50μm.
도 10a, 10b, 및 10c는, 듀오-항체에 의해 STAT3를 표적화하고 7개의 복합체를 배출하는 것이 생체내에서 STAT3 셔틀링 및 기능을 차단함을 나타낸다. 도 10a는 비-표적화 IgG 대조군 항체와 비교된 표적화 항체의 효율적인 세포질 전달을 나타내는 공초점 이미지이다. 공초점 이미지는 항체 부하 및 국재화를 나타내는 STAT3-GFP 과발현 MEF 종양의 미세단면이다. 표적화 항체의 세포질 국재화는 선택된 영역(파선)으로부터 확대되어(우하측 코너) 나타난다. 바아 규모, 100μm. 조직 미세단면의 공초점 현미경적 이미지는 국소로 전달된 항체의 신장 청소능 및 전신 분포를 나타낸다. 바아 규모, 100μm. 도 10b는 생체내에서 표적화 항체의 세포내 전달시 방해된 STAT3 핵세포질 셔틀링을 나타내는 STAT3 및 뉴클레오포린 50 용해물의 웨스턴 블랏 분석에 이은 동시-면역침강의 이미지이다. 도 10c는, 생체내 전달된 표적화 항체가 투여 후 적어도 24 시간 동안 안정함을 나타내는 이미지이다. 웨스턴 블랏팅에 이어서 비-환원 조건하에서 SDSPAGE에서의 단백질 분리는 토끼 면역글로불린인, 주사된 항체를 나타낸다.
도 11a, 11b, 11c, 및 11d는 인공 종양 모델에서 듀오-항체 요법의 생체내 효과를 나타낸다. 종양은 STAT3wt로 안정되게 재구성되고 명시된 바와 같이 치료된 STAT3-결핍된 MEF 세포를 이식함으로써 성장시켰다. 도 11a는 종양 성장 동력학을 나타내는 그래프이다. 도 11b는 대조군 및 항-STAT3 및 항-엑스포틴 7 항체로 치료된 종양에서 혈관신생 인자의 단백질 발현 수준을 나타내는 웨스턴 블랏팅의 이미지이다. 도 11c는 명시된 바와 같은 항체 치료의 결과로서 종양 맥관구조의 공초점 이미지이다. CD31+ 세포가 나타나 있고(좌측 패널) 및 정량화되어 있다(우측 패널); n = 6. 스튜던트 T-시험 ***, P < 0.001; **, P < 0.01; *P < 0.05. 바아 규모 10μm. 도 11d는, 웨스턴 블랏팅이 듀오-항체 치료로 인한 전-세포자멸유도 유전자 발현에서 증가를 나타냄을 나타내는 이미지이다. 웨스턴 블랏에 대한 용해물은 명시된 바와 같이 처리한 종양으로부터 제조하였다. 이들 실험은 유사한 결과와 함께 적어도 2회 반복되었다.
도 12a, 12b, 및 12c는, 듀오-항체가 생체내에서 종양내 세포 세포질에서 효율적으로 내재화됨을 나타낸다. 도 12a는, 생체내 투여된 항체의 국재화가 토끼 면역글로불린에 대해 염색된 B16 종양 미세단면으로부터 평가되었음을 나타내는 공초점 현미경검사 이미지이다. 바아 규모 100μm(좌측 패널). 도 12b는 종양 미세단면에서 시계(field of view)당 평균 형광 강도에 의한 종양 조직내에서 보유된 항체의 정량화를 나타내는 그래프이다; 비-표적화 면역글로불린(IgG, 검정색), 표적화 STAT3/엑스포틴 7 항체 조합(회색); n = 3. 도 12c는, 흑색종 B16 종양이 C57BL/6 마우스 속에서 성장되고 명시된 바와 같이 항-STAT3/항엑스포틴 7 면역글로불린, 비-표적화 IgG 대조군으로 격일로 처치료되거나, 치료되지 않고 남아있음을 나타내는 그래프이며, 종양 성장 동력학이 모니터링되었다. 스튜던트 T-시험 ***, P < 0.001; **, P < 0.01; *P < 0.05.
도 13a 및 13b는 자가-전달 항체에 의한 세포내 표적의 인식을 나타낸다. 인간 신경아교종 U251 세포는 명시된 시간 동안 포스포로티오에이트화된 올리고뉴클레오타이드로 개질된 10μg의 αStat3(도 13a) 또는 α엑스포틴 7(도 13b) 항체로 각각 치료되었다. 전체의 세포 용해물을 제조하고 아가로즈 비드(bead)를 부가하여 4℃에서 밤새 면역침강을 유도하기 전에 세포 잔해물로부터 청소하였다. 침전물을 주의 깊게 세정하고 웨스턴 블랏 분석에 적용하여 항체 표적 인식 동력학을 측정하였다.
도 14는 세포-침투 항체의 생체내 종양내 흡수를 나타내는 그래프이다. 생체내에서 종양에 의한 형광성 올리고뉴클레오타이드(올리고FAM)에 콘주게이트된 포스포로티오에이트화된 핵산-개질된 항체의 세포내 흡수를 국소 투여 후 2 시간째에 평가하였다. 마우스 흑색종 B16 종양을 해부하고 단일-세포 현탁액을 유세포측정 분석을 위해 제조하여 FAM(FITC)+ 세포 집단을 측정하였다. 종양을 지닌 마우스를 명시된 개질된 항체/항체로 치료하고, 10μg의 총 용량의 올리고-개질된 항체를 단일 치료로 제공하였다.
도 15a 및 15b는 생체내에서 종양 조직에 대한 세포-침투 항체의 귀소(homing) 및 바이오안정성을 나타낸다. 도 15a는 각각 국소(피하, 상부 중간 및 우측 패널) 또는 전신(정맥내, 하부 패널) 주사시 형광성으로 표지된, 포스포로티오에이트화된 핵산-개질된 항체의 종양내 분포를 평가하기 위해 수행된 생명내 보유와 관련된 다광자 현미경검사의 이미지이다. 축적된 올리고-개질된 항체의 점-유사 유전자자리(dot-like loci)는 시험관내 연구에서 관찰된 것과 유사하다(도 1b). 안와후 경로(정맥내)를 통한 전신계 전달 시 종양 조직에 대한 포스포로티오에이트화된 핵산-개질된 항체 귀소를 투여 후 2 시간째에 평가하였다. 종양내에서 축적된 올리고개질된 항체의 점-유사 초점의 검출(하부 패널). 흰색 점으로 된 원은 세포 핵을 나타낸다. 바아 규모, 50μm. 도 15b는 최종 전신 투여 후 8일째에 측정된 포스포로티오에이트화된 핵산-개질된 항체의 종양 귀소 수용력 및 바이오안정성의 웨스턴 블랏 분석을 나타내는 이미지이다. 상이한 용량의 포스포로티오에이트화된 핵산-개질된 항체를 명시된 바와 같이, 격일로 3회 주사하였다. 종양을 최종 치료 후 8일째에 분석을 위해 수거하였다. 종양 균질물을 비-환원 SDS-PAGE에 이어, 웨스턴 블랏 검출에 적용하여 종양 IgG 부하를 평가하였다.
도 16a 및 16b는 포스포로티오에이트화된 핵산-개질된 세포-침투 항체의 면역 세포 집단내로의 세포성 내재화를 나타낸다. 도 16a는 명시된 바와 같이 다양한 농도의 형광성으로 표지된 올리고-개질된 αStat3 항체(αStat3oligoFITC)에서 2시간 동안 치료된 비장세포의 유세포측정 분석의 그래프이고, 면역 세포 집단, CD3+, CD11b+, 및 B220+에 의한 용량-의존적 내재화가 측정되었다. 도 16b는 10μg/ml 올리고-개질된 항체(그린)의 명시된 비장 면역 세포 집단내로의 세포성 내재화의 공초점 레이저 스캐닝 현미경검사 이미지이다. 핵산은 Hoechst 33342으로 염색되었다. 차동 간섭 콘트라스트(DIC)가 나타나 있다. 바아 규모, 10μm.
도 17a 및 17b는, 올리고뉴클레오타이드 골격 포스포로티오에이트화가 세포내 항체 전달 및 항원 인식에 중요함을 나타낸다. 인간 신경아교종 U251 세포는 명시된 시간 동안 10μg/ml의 형광성으로 표지된 포스포로티오에이트화된 핵산-개질된 αStat3 항체로 치료하였다. 단일 세포 현탁액은 개질된 항체의 흡수에 대해 유세포측정으로 분석하였다. 도 17a는 골격의 올리고뉴클레오타이드 결실 티오화(하부 패널) 콘주게이트된 항체로 처리된 세포와 비교하여 포스포로티오에이트화된 올리고뉴클레오타이드 골격과 콘주게이트된 항체로 치료한 신경아교종 세포를 나타내는 그래프이다. 콘주게이트된 올리고뉴클레오타이드의 다양한 서열은 항체의 세포성 내재화에 있어서 무시해도 좋은 효과를 갖는다. 2개의 무작위의 올리고뉴클레오타이드 서열을 시험하였다. 도 17b는, 다양한 포스포로티오에이트화된 올리고뉴클레오타이드 서열이 개질된 항체에 의한 항원 인식을 변경시키지 않음을 나타내는 이미지이다. U251 세포를 명시된 바와 같이 개질된 10μg의 αStat3 항체로 치료하였다. 전체의 세포 용해물을 제조하고 아가로스 비드를 부가하여 면역침강을 유도하였다. 침전물을 웨스턴 블랏 분석에 적용시켜 항체 표적 인식을 측정하였다.
도 18은 이종이식 인간 신경아교종 모델에서 개질된 STAT3/엑스포틴 7 항체에 의한 강력한 항종양 효과를 나타내는 그래프이다. 인간 신경아교종 U251 세포(2 x 106)를 면역저하된 NSG/NOD 마우스내로 피하 주사하였다. 종양이 평균 5mm의 직경에 도달하면, 마우스를 10μg의 명시된, 개질된 항체로 매 격일 국소 치료하였다. 종양 부피를 매 격일로 평가하였다. SD가 나타나 있다. 스튜던트 T-시험 ***, P < 0.001; **, P < 0.01; *P < 0.05.
도 19는 식 -S-S-R을 갖는 모이어티를 갖는 예시적인 포스포로티오에이트 핵산의 구조의 도식이다. 상기 모이어티에 연결된 하나의 포스포로티오에이트 핵산 염기는 포스포로티오에이트 핵산 서열에 대한 부착점을 설명하기 위한 목적으로 나타낸다. 이 경우에, R은 헥사놀이고 링커 모이어티(포스포디에스테르 프로필 반복 모노머 단위를 가짐)는 -SSR을 포스포로티오에이트 핵산의 나머지에 연결한다.
도 20은 비닐 설폰(VS) 반응성 모이어티 및 포스포로티오에이트 핵산의 나머지에 VS를 연결하는 링커 모이어티(포스포디에스테르 프로필 반복 모노머 단위를 가짐)를 지닌 예시적인 포스포로티오에이트 핵산의 구조를 나타낸다. 상기 모이어티에 연결된 하나의 포스포로티오에이트 핵산 염기는 포스포로티오에이트 핵산 서열에 대한 부착점을 설명하기 위한 목적으로 나타낸다.
도 21은 식 -S-S-R의 모이어티를 지닌 포스포로티오에이트 핵산으로부터의 비닐 설폰을 사용한 포스포로티오에이트 핵산의 합성을 위한 예시적인 방법을 나타내는 도식이다.
도 22는 말단 포스페이트(PS)를 지닌 핵산으로부터 비닐 설폰 반응성 모이어티를 갖는 핵산의 합성을 위한 예시적인 방법의 도식이다.
도 23a, 23b, 23c, 23d, 23e, 23f, 및 23g는, 포스포로티오에이트화된-올리고-개질된 항체가 내재화하여 세포내 표적을 인식함을 나타낸다. 도 23a는 대안적인 면역침강에 의해 입증된 개질된 항체에 의한 세포-침투 및 표적 인식을 나타내는 웨스턴 블랏의 이미지이다. 개질된 STAT3 항체와 함께 인큐베이트된 생존 세포로부터 제조된 전체의 세포 용해물을 STAT3에 대한 웨스턴 블랏팅 탐침검사에 의해 분석하였다. 도 23b는, 올리고(PS)의 포스포로티오에이트화가 핵산 서열(제2 패널) 또는 IgG 종(제3 패널) 또는 세포형(하부 패널)과는 독립적으로 개질된 STAT3 항체 (최상부 패널)의 세포성 흡수를 촉진함을 나타내는 유세포측정 분석의 그래프이다. 도 23c는 대안적인 IP에 이어 웨스턴 블랏팅이 도 23b에서 유세포측정 데이타를 입증함을 나타내는 웨스턴 블랏의 이미지이다. STAT3 항체는 포스포로티오에이트화된 친계(parental) 올리고(레인 2), 비-포스포로티오에이트화된 올리고(레인 3), 및 친계 올리고의 포스포로티오에이트화된 서열-스크램블드 버전(레인 4-6)으로 개질되었다. 도 23d는 형광성으로 표지된 포스포로티오에이트화된-올리고-개질된 항체의 세포내 분포의 공초점 현미경적 이미지이다. 바아 규모, 각각 20μm 및 10μm. 도 23e는 쥣과 3T3/vSrc 세포에 의한 개질된 및 개질되지 않은 p-Src 항체의 세포내 흡수를 나타내는 유세포측정 그래프이다. 도 23f는 개질된 p-Src 항체가 이의 세포내 표적 단백질 p-Src와 함께 동시국재화(colocalize)됨을 나타내는 공초점 현미경검사 이미지이다. 하부 패널은 명시된 영역(파선 박스)의 배율을 나타낸다. 세포막을 따른 개질된 p-Src 항체의 세포내 분포는 강도-암호화된 잘못된 색상 모드로 나타낸다. 바아 규모, 10μm. 도 23g는 p-Src 항체 또는 개질된 IgG 항체와 함께 인큐베이트된 3T3/vSrc 세포내에서 개질된 항체-p-Src 복합체를 검출하기 위한 대안적인 면역침강에 이어 웨스턴 블랏팅을 나타내는 웨스턴 블랏의 이미지이다. 올리고 및 비닐설폰을 통해 올리고에 부착된 항체를 이들 도들을 위한 실험에서 사용하였다.
도 24는 개질된 항체 세포내 활성을 나타내는 유세포측정 분석의 그래프이다. 유세포측정 분석은 개질된 항체의 세포내 체류를 위한 표적 항체의 요건을 나타낸다. 쥣과 3T3/vSrc 세포는 개질된 p-Src 항체 또는 개질된 IgG 항체(상부 패널)와 함께 인큐베이트하였다. 개질된 Stat3 항체(1μg/ml)를 Stat3+ 또는 Stat3- 쥣과 MEF 세포와 함게 유동 세포 분석(하부 패널) 전에 2시간 동안 인큐베이트하였다. 올리고 및 비닐설폰을 통해 올리고에 부착된 항체를 이들 도들을 위한 실험에서 사용하였다.
도 25a, 25b, 25c, 25d, 25e, 및 25f는 세포-침투 p-Src 항체에 의한 항종양 효과를 나타낸다. 도 25a는 명시된 개질된 항체로 매 격일에 국소 치료된 형질전환된 쥣과 3T3/vSrc 세포에 의해 형성된 종양의 성장 동력학을 나타내는 그래프이다. SD가 나타남, 유의성 **) P = 0.01, P = 0.001. 도 25b는 명시된 바와 같이 치료된 3T3/vSrc 종양의 균질물 속에서 p-Src 및 그것의 다운스트림 단백질의 손실을 웨스턴 블랏팅에 적용시켜 활성화된 pY416-Src, 활성화된 pY705-Stat3 뿐만 아니라 명시된 바와 같이 몇개의 Src 다운스트림 유전자의 발현에 대해 프로브화하였음을 나타내는 웨스턴 블랏의 이미지이다. 튜불린은 단백질 로딩 대조군으로서 프로브되었다. 도 25c는, 개질된 p-Src 항체가 무흉선 누드 마우스에서 인간 A2058 흑색종 성장을 효과적으로 억제함을 나타내는 그래프이다. 종양 성장 동력학을 평가하고 종양을 매 격일마다 국소 치료하였다. SD가 나타남, 유의성 ***) P = 0.001. 도 25d는 명시된 바와 같이 치료된 A2058 흑색종 종양의 균질물을 비-환원 조건하에 웨스턴 블랏팅에 적용시키고 토끼 IgG에 대해 프로브화시켰음을 나타내는 웨스턴 블랏의 이미지이다. 튜불린은 단백질 로딩 대조군으로 포함시켰다. 도 25e는, 개질된 p-Src 항체 치료가 공초점 현미경검사와 조합된 면역조직화학에 의해 입증된 바와 같이 생체내에서 종양 혈관형성 파괴 및 종양 세포 세포자멸사를 유발함을 나타내는 공초점 현미경검사 이미지이다. 명시된 바와 같이 치료된 A2058 흑색종 종양의 종양 조직 단면은 플루오레신 (FITC), CD31+ 종양 맥관구조(상부 패널) 및 절단된 카스파제 3(하부 패널)으로 염색되었다. 바아 규모, 100μm. 도 25f는 형광성 신호의 정량화를 나타내는 그래프이다. SD가 나타남, 유의성 ***) P = 0.001. S-S-헥사놀 그룹을 함유하는 올리고와 복합된/부착된 항체의 혼합물을 이들 도에서 실험을 위해 사용하였다.
도 26a, 26b, 26c, 26d, 26e, 26f, 및 26g는 자궁경부암에서 E6 종양단백질을 표적화하는 개질된 항체의 항종양 효능을 나타낸다. 도 26a 및 26b는 인간 자궁경부암 성장 동력학을 나타내는 그래프이다. 인간 CaSki 암 세포를 무흉선 누드 마우스에 이식하고 매 격일마다 아무것으로도 치료하지 않거나, 명시된 바와 같이 개질된 IgG 대조군 또는 HPV16/18 E6 항체로 국소(도 26a) 및 전신에(도 26b) 치료하였다. SD가 나타남, 유의성 *) P = 0.05, **) P = 0.01, ***) P = 0.001. 도 26c는 개질된 E6 항체에 의한 CaSki 종양의 파괴를 나타내는 현미경적 이미지이다. H&E에 의해 염색되고 브라이트필드(brightfield) 현미경검사에 의해 염색된 이미지가 나타나 있다. 바아 규모, 100μm. 도 26d는 개질된 E6 항체로 치료된 CaSki 자궁경부 종양의 균질물 속에서 FADD 단백질 수준의 증가를 나타내는 웨스턴 블랏의 이미지이다. 액틴은 단백질 로딩 대조군으로서 프로브되었다. 도 26e는 개질된 E6 항체로 치료된 CaSki 종양에서 카스파제 8 mRNA의 상승된 발현을 나타내는 RT-PCR을 나타내는 그래프이다. SD가 나타남, 유의성 **) P = 0.01. 도 26f는, 대조군 IgG 항체가 아닌 개질된 E6 항체의 생체내 체류가 종양 맥관구조의 손실 및 절단된 카스파제 3에 있어서의 증가를 생성함을 나타내는, 면역염색에 이어서 공초점 현미경검사를 나타내는 이미지이다. 명시된 바와 같이 치료된 CaSki 자궁경부 종양의 종양 조직 단면을 플루오레신(FITC), CD31+ 종양 맥관구조 및 절단된 카스파제 3에 대해 염색하였다. 바아 규모, 100μm. 도 26g는 형광성 신호의 정량화를 나타내는 그래프이다. SD가 나타남, 유의성 **) P ≤ 0.01, ***) P ≤ 0.001. S-S-헥사놀 그룹을 함유하는 부착된 올리고와 항체의 혼합물을 이들 도에서 실험을 위해 사용하였다.
도 27a, 27b, 27c, 27d, 27e, 27f, 및 27g는 개질된 항체를 사용하여 STAT3를 표적화함을 나타낸다. 도 27a는 시험관내에서 핵 축적된 Stat3의 세포질성 재위치를 유도하기 위한 개질된 항체를 나타내는 이미지이다. Stat3-mCherry 융합 단백질을 발현하는 쥣과 3T3/vSrc 세포를 명시된 항체로 치료하였다. Stat3 구획성 국재화를 살아 있는 세포내에서 공초점 현미경검사로 분석하였다. 바아 규모, 10μm. 도 27b는, 개질된 STAT3 및 엑스포틴 7 항체 치료가 강력한 항종양 효과를 유도함을 나타내는 그래프이다. 명시된 항체 치료를 사용한 마우스에서 B16 흑색종 종양 성장 동력학. 좌측 패널: 국소 주사; 중간 패널: 국소 대 전신 치료, 우측 패널: 감소하는 용량의 3회의 전신 치료(화살표). SD가 나타남, 유의성 **) P ≤ 0.01, ***) P ≤ 0.001. 도 27c는, 도 27b의 우측 패널에서의 종양 균질물로부터의 핵 추출물을 사용한 EMSA에 의해 평가된 것으로서, 개질된 STAT3/엑스포틴 7 항체를 사용한 전신계 치료가 종양내에서 Stat3 DNA-결합을 제거함을 나타내는 웨스턴 블롯의 이미지이다. 도 27d는 전신 투여된 표적화 항체의 장기적인 생체내 안정성을 나타내는 웨스턴 블랏의 이미지이다. 도 27c의 우측 패널로부터의 종양 균질물을 비-환원 조건하에서 웨스턴 블랏팅에 적용하여 토끼 면역글로불린에 대해 프로브화하였다. 도 27e는 명시된 항체로 국소 치료된 무흉선 누드 마우스에서 인간 U87 신경아교종의 종양 성장 동력학을 나타내는 그래프이다. 도 27f는 명시된 항체로 전신 치료된 무흉선 누드 마우스에서 인간 U87 신경아교종의 종양 성장 동력학을 나타낸다. SD가 나타남, 유의성 *) P ≤ 0.05, **) P ≤ 0.01, ***) P ≤ 0.001. 도 27g는 종양내에 축적된 개질된 항체를 나타내는 이미지이며, 여기서 표적은 잔류하여 항종양 효과를 발휘한다. 인간 U251 신경아교종 세포가 이식된 무흉선 누드 마우스를 명시된 바와 같이, 매 격일로 3회 국소 또는 전신계 치료하거나 치료하지 않은채 둔다. 명시된 기관(종양)으로부터의 조직 단면을 플루오레신(FITC)으로 염색하여 종양 맥관구조에 대한 개질된 항체, CD31+ 및 종양 세포 세포자멸사에 대한 절단된 카스파제 3을 검출한다. 인레이(inlay)는 명시된 영역(파선 박스)의 배율을 나타낸다. 바아 규모, 100μm. 비닐설폰을 통한 올리고 및 올리고에 부착된 항체를 도 27a, 27b, 27c, 27d, 27e, 및 27g에 대한 실험에서 사용하였다. 도 27f의 경우, STAT3/Exp7은 비닐설폰을 통해 올리고 및 올리고와 함께 부착된 항체인 반면 STAT3Rb/STAT3Ms 및 STAT3Rb/Rb의 경우 S-S-헥사놀 그룹을 함유하는 부착된 올리고와 항체의 혼합물을 사용하였다.
도 28은 생체내에서 포스포로티오에이트화된 올리고(FAM-양성) 및 전달된 항체의 동시-국재화를 나타내는 이미지이다. 인간 U251 신경아교종은, 종양을 해부하기 전에 매 격일마다 3회 국소 치료하였다. 종양 단면을 IgG 토끼 종에 대해 표지된 항체로 염색하였다. 염색된 단면은 공초점 현미경검사로 분석하였다. 인세트(inset)는 명시된 영역의 배율을 나타낸다(흰색 박스, 파선으로 됨). 바아 규모, 50μm.
도 29는 10μg/ml에서 명시된 바와 같이 24시간 동안 항체로 개질시킨 마우스 3T3/vSrc 세포를 나타내는 이미지이다. 고정된 세포를 β-튜불린 및 β-액틴으로 염색하고 공초점 현미경검사로 분석하였다. 각각의 채널에 대한 방출을 우측에 별도로 나타낸다. 바아 규모, 50μm.
도 30a 및 30b는, 격일로 전신 치료된 인간 U87 신경아교종을 나타낸다. 종양 단면을 플루오레신으로 염색하였다. 염색된 단면은 공초점 현미경검사로 분석하였다. 바아 규모, 50μm(도 30a). 플루오레신 방출 신호를 정량화하였다. SD가 나타나 있다(도 30b).
도 31a 및 31b는 매 격일로 전신 치료된 인간 U87 신경아교종을 나타낸다. 종양 단면은 절단된 카스파제 3(우측 패널)에 의해 명시된 CD31+ 종양 맥관구조(좌측 패널), c-Myc 발현(중간 패널), 및 종양 세포 세포자멸사를 위해 염색하였다. 염색된 단면을 공초점 현미경검사로 분석하였다. 바아 규모, 각각 100μm 및 50μm(도 31a). 방출 신호를 정량화하였다. SD가 나타남; 유의성: *) P<0.05, **) P<0.01, ***) P<0.001, (도 31b).
도 32는 포스포로티오에이트화된 DNA-20량체(meric)-올리고 또는 정제되지 않은 SSR-올리고-항체 콘주게이트/복합체의 비닐설폰 (VS) 매개된 부착을 통해 개질된 10 mg/ml의 정제된 (P) 또는 정제되지 않은 (UP) 항-STAT3 토끼-항체와 함께 인큐베이트된 인간 Karpas299 림프종 세포의 유동 전지 분석의 그래프이다.
도 33a 및 33b는, 포스포로티오에이트화된-올리고 개질된 항체가 세포로 도입되어 세포내 표적, 예컨대 STAT3을 인지함을 나타내는 웨스턴 블랏의 이미지이다. 도 33a는 VS(레인 4; 레인 2 비어있음)를 통해 부착된 바와 동일하게, 포스포로티오에이트화된 DNA-20량체(meric)-올리고(레인 1)의 비닐설폰(VS) 개질된 부착을 통해 개질되거나 개질되지 않은 aSTAT3 단독(레인 3) 또는 aSTAT3 및 500 pmol/ml 포스포로티오에이트화된 GpC1668의 10mg/ml의 정제된 (P)aSTAT3 항체와 함께 인큐베이트된 인간 U251 신경아교종 세포를 나타내는 웨스턴 블랏의 이미지이다. 도 33b는, 인간 U251 세포를 SSR을 통해 개질된 10mg/ml의 정제되지 않은(UP) aSTAT3 항체(레인 2), 포스포로티오에이트화된 올리고의 비닐설폰(VS) 매개된 부착을 통해 개질된 정제되지 않은(UP) aSTAT3 항체(레인 3) 또는 포스포로티오에이트화된 비닐설폰(VS) 매개된 부착을 통해 개질된 정제된(P) aSTAT3 항체(레인 4)와 함께 인큐베이트하였음을 나타내는 웨스턴 블랏의 이미지이다; 부가된 항체 IgG 없음(레인 1).
용어, "시험대상자", "환자", "개인" 등은 제한되는 것으로 의도되지 않으며 일반적으로 상호교환될 수 있다. 즉, "환자"로서 기재된 개인은 필수적으로 주어진 질환을 가지지 않지만, 의학적 조언을 단지 추구할 수 있다.
"대조군" 또는 "표준 대조군"은 시험 샘플, 측정, 또는 값과 비교하여 참조, 일반적으로 공지된 참조로서 제공되는 샘플, 측정, 또는 값을 말한다. 예를 들면, 시험 샘플은 주어진 질환(예를 들면, 자가면역 질환, 염증성 자가면역 질환, 암, 감염성 질환, 면역 질환, 또는 기타 질환)을 가진 것으로 의심되는 환자로부터 취하여 공지된 정상의(병들지 않은) 개인(예를 들면, 표준 대조군 시험대상자)와 비교할 수 있다. 표준 대조군은 또한 주어진 질환을 가지지 않은 유사한 개인(즉, 표준 대조군 집단), 예를 들면, 유사한 의료 배경, 동일한 연령, 체중 등을 지닌 건강한 개인의 집단으로부터 수집한 평균 측정 또는 값을 나타낸다. 표준 대조군 값은 또한 동일한 개인, 예를 들면, 질환 개시 전 환자로부터 조기-수득된 샘플로부터 수득될 수 있다. 숙련가는, 표준 대조군을 어떠한 수의 파라미터(예를 들면, RNA 수준, 단백질 수준, 특이적인 세포형, 특이적인 체액, 특이적인 조직, 활막세포, 활막 유체, 활막 조직, 섬유아세포-유사 활막세포, 대식세포 유사 활막세포 등)의 측정을 위해 설계할 수 있음을 이해할 것이다.
당해분야의 숙련가는, 어떠한 표준 대조군이 주어진 상황에서 가장 작절한지 및 표준 대조군 값과의 비교를 기준으로 한 데이타를 분석할 수 있는지를 이해할 것이다. 표준 대조군은 또한 데이타의 유의성(예를 들면, 통계적 유의도)를 측정하는데 가치가 있다. 예를 들면, 주어진 파라미터에 대한 값이 표준 대조군에서 광범위하게 다양한 경우, 시험 샘플내에서의 변화는 유의미한 것으로 고려되지 않을 것이다.
용어 "용량" 및 "투여량"은 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 용량은 각각의 투여에서 개인에게 주어진 활성 성분의 양을 말한다. 용량은 주어진 치료요법에 대한 정상적인 용량의 범위, 투여 빈도; 개인의 체격 및 내성; 상태의 중증도; 부작용의 위험; 및 투여 경로를 포한하는 다수의 인자에 따라 변할 것이다. 숙련가는, 용량이 상기 인자에 의존하여 또는 치료적 과정을 기반으로 개질될 수 있음을 이해할 것이다. 용어 "투여형"은 약제 또는 약제학적 조성물의 특수한 양식을 말하며, 투여 경로에 의존한다. 예를 들면, 복용 형태는 분무화, 예를 들면, 흡입제용의 액체 형태, 예를 들면, 경구 전달을 위한 정제 또는 액제, 또는 예를 들면, 주사를 위한 염수 용액일 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "치료하다" 및 "예방하다"는 발병에 있어서의 지연, 증상의 빈도 또는 중증도에 있어서의 감소, 환자 안락 또는 기능(예를 들면, 관절 기능)에 있어서의 개선, 질환 상태의 중증도에 있어서의 감소 등을 말할 수 있다. 치료 효과는 주어진 치료를 제공받지 않은 개인 또는 개인의 풀(pool), 또는 치료의 중지 전, 또는 중지 후 동일한 환자와 비교될 수 있다. 용어 "예방하다"는 일반적으로 환자에서 주어진 질환(예를 들면, 자가면역, 염증성, 암, 감염성, 대사성, 발달성, 심혈관, 간, 창자, 내분비, 신경적, 또는 기타 질환) 또는 질환 증상의 발생에 있어서의 감소를 말한다. 상기에서 명시된 바와 같이, 예방은 완전(검출가능한 증상이 없음)하거나 부분적이므로, 치료 부재하에 발생되는 경향이 있는 것보다 더 적은 증상이 관측될 수 있다.
본원에 사용된 것으로서 "치료학적 유효 용량 또는 양"은, 이것이 투여된 것에 대해 효과를 생산하는(예를 들면, 질환을 치료하거나 예방하는) 용량을 의미한다. 정확한 용량 및 제형은 치료 목적에 의존할 것이며, 공지된 기술(참고: 예를 들면, Lieberman, Pharmaceutical Dosage Forms(vols. 1-3, 1992); Lloyd, The Art, Science and Technology of Pharmaceutical Compounding (1999); Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th Edition, Gennaro, Editor (2003), 및 Pickar, Dosage Calculations(1999))을 사용하여 당해 분야의 숙련가에 의해 확인될 수 있을 것이다. 예를 들면, 주어진 파라미터의 경우, 치료적으로 효과적인 양은 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 40%, 50%, 60%, 75%, 80%, 90%, 또는 적어도 100%의 증가 또는 감소를 나타낼 것이다. 치료적 효능은 또한 "-배" 증가 또는 감소로서 표현될 수 있다. 예를 들면, 치료적으로 효과적인 양은 표준 대조군보다 적어도 1.2-배, 1.5-배, 2-배, 5-배 이상의 효과를 가질 수 있다. 치료적으로 효과적인 용량 또는 양은 질환의 하나 이상의 증상을 개선할 수 있다. 치료적으로 효과적인 용량 또는 양은, 이것이 투여되는 것에 대한 효과가 질환으로 진행될 위험이 있는 사람을 치료하는 것인 경우 질환의 발병 또는 질환의 하나 이상의 증상을 예방하거나 지연시킬 수 있다.
용어 "진단"은 질환(예를 들면, 자가면역, 염증성 자가면역, 암, 감염성, 면역, 또는 기타 질환)이 상기 시험대상자에 존재하는 상대적인 개연성을 말한다. 유사하게, 용어 "예후"는 질환 상태와 관련하여 특정의 미래의 결과가 상기 시험대상자에서 발생할 수 있는 상대적인 개연성을 말한다. 예를 들면, 본 발명의 맥락에서, 예후는 질환(예를 들면, 자가면역, 염증성 자가면역, 암, 감염성, 면역, 또는 기타 질환)으로 진행할 경향성, 또는 질환의 가능한 중증도(예를 들면, 질환의 지속시간)를 말할 수 있다. 상기 용어들은 의료 진단 분야에서 임의의 숙련가에 의해 인정될 것으로서 절대적인 것으로 의도되지 않는다.
본원에서 사용된 "핵산" 또는 "올리고뉴클레오타이드" 또는 "폴리뉴클레오타이드" 또는 문법적 등가물은 함께 공유부착으로 연결된 적어도 2개의 뉴클레오타이드를 의미한다. 용어 "핵산"은 단일-, 이중-, 다중-가닥 또는 분지형 DNA, RNA 및 이의 유사체(유도체)를 포함한다. 용어 "포스포로티오에이트 핵산"은, 하나 이상의 뉴클레오타이드간 연결기가 포스포로티오에이트 모이어티(티오포스페이트) 모이어티를 통해 존재하는 핵산을 말한다. 포스포로티오에이트 모이어티는 모노티오포스페이트(-P(O)3(S)3--) 또는 디티오포스페이트(-P(O)2(S)2 3--)일 수 있다. 본원에 제공된 모든 측면의 구현예에서, 포스포로티오에이트 모이어티는 모노티오포스페이트 (-P(O)3(S)3--)이다. 즉, 본원에 제공된 모든 측면의 구현예에서, 포스포로티오에이트 핵산은 모노티오포스페이트 핵산이다. 구현예에서, 포스포로티오에이트 핵산의 뉴클레오사이드 중 하나 이상은 포스포로티오에이트 모이어티(예를 들면 모노티오포스페이트) 모이어티를 통해 연결되며, 잔여 뉴클레오사이드는 포스포디에스테르 모이어티(-P(O)4 3--)를 통해 연결된다. 구현예에서, 포스포로티오에이트 핵산의 뉴클레오사이드중 하나 이상은 포스포로티오에이트 모이어티(예를 들면 모노티오포스페이트) 모이어티를 통해 연결되며, 잔여 뉴클레오사이드는 메틸포스포네이트 연결부를 통해 연결된다. 구현예에서, 포스포로티오에이트 핵산의 모든 뉴클레오사이드는 포스포로티오에이트 모이어티(예를 들면, 모노티오포스페이트) 모이어티를 통해 연결된다.
포스포로티오에이트 올리고뉴클레오타이드(포스포로티오에이트 핵산)는, 길이가 전형적으로 약 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15, 25, 30, 40, 50개 이상인 뉴클레오타이드, 길이가 약 100개 이하인 뉴클레오타이드이다. 포스포로티오에이트 핵산은, 길이가 예를 들면, 200, 300, 500, 1000, 2000, 3000, 5000, 7000, 10,000 등으로 더 길 수 있다. 상기에서 기재된 바와 같이, 특정의 구현예에서, 본원의 포스포로티오에이트 핵산은 하나 이상의 포스포디에스테르 결합을 함유한다. 다른 구현예에서, 포스포로티오에이트 핵산은 대안의 골격(예를 들면, 당해기술에서 공지된 바와 같은 포스포디에스테르의 모사체 또는 유사체, 예컨대, 보라노포스페이트, 메틸포스포네이트, 포스포르아미데이트, 또는 O-메틸포스포로아미다이트 연결기(참고: Eckstein, Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, Oxford University Press))을 포함한다. 포스포로티오에이트 핵산은 또한 당해기술에 공지된 하나 이상의 핵산 유사체 모노머, 예컨대, 펩타이드 핵산 모노머 또는 폴리머, 잠겨진(locked) 핵산 모노머 또는 폴리머, 모폴리노 모노머 또는 폴리머, 글리콜 핵산 모노머 또는 폴리머, 또는 트레오스 핵산 모노머 또는 폴리머를 포함한다. 다른 유사체 핵산은 미국 특허 번호 5,235,033 및 5,034,506, 및 Chapters 6 및 7, ASC Symposium Series 580, Carbohydrate Modifications in Antisense Research, Sanghui & Cook, eds.에 기술된 것들을 포함하는, 양성 골격; 비-이온성 골격, 및 논리보오스(nonribose) 골격을 지닌 것들을 포함한다. 하나 이상의 카보사이클릭 당류를 함유하는 핵산이 또한 핵산의 하나의 정의내에 포함된다. 리보오스-포스페이트 골격의 개질은 다양한 이유, 예를 들면, 생리적 환경에서 이러한 분자의 안정성 및 반감기를 증가시키기 위해 또는 바이오칩에서 프로브로서 수행될 수 있다. 천연 발생 핵산 및 유사체의 혼합물이 제조될 수 있으며; 대안적으로, 상이한 핵산 유사체의 혼합물, 및 천연 발생 핵산 및 유사체의 혼합물이 제조될 수 있다. 포스포로티오에이트 핵산 및 포스포로티오에이트 폴리머 골격은 선형 또는 분지형일 수 있다. 예를 들면, 분지형 핵산은 반복적으로 분지되어 보다 고차원 구조, 예컨대 덴드리머 등을 형성한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "포스포로티오에이트 폴리머 골격"은 적어도 2개의 포스포로티오에이트 연결기(예를 들면 모노티오포스페이트)(예를 들면, 당 서브유닛, 사이클릭 서브유닛 또는 알킬 서브유닛을 함께 연결시킴)를 지닌 화학적 폴리머이다. 포스포로티오에이트 폴리머 골격은 포스포로티오에이트 당 폴리머일 수 있으며, 이는, 펜토스 당류의 사슬 중 하나 이상(또는 모두)이 핵산에 일반적으로 존재하는 염기 (핵염기)가 없는, 포스포로티오에이트 핵산이다. 포스포로티오에이트 폴리머 골격은 2개 이상의 포스포로티오에이트 연결기를 포함할 수 있다. 포스포로티오에이트 폴리머 골격은 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15, 25, 30, 40, 50개 이상의 연결기를 포함할 수 있으며 약 100개 이하의 포스포로티오에이트 연결기를 함유할 수 있다. 포스포로티오에이트 폴리머 골격은 또한 다수의 연결기, 예를 들면, 200, 300, 500, 1000, 2000, 3000, 5000, 7000, 10,000 등의 연결기를 함유할 수 있다.
포스포로티오에이트 핵산 및 포스포로티오에이트 폴리머 골격은 부분적으로 또는 완전히 포스포로티오에이트화될 수 있다. 예를 들면, 포스포로티오에이트 핵산의 뉴클레오티드간 연결기의 50% 이상은 포스포로티오에이트 연결기일 수 있다. 임의로, 포스포로티오에이트 핵산의 뉴클레오타이드간 연결기의 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 99%는 포스포로티오에이트 연결기이다. 임의로, 포스포로티오에이트 핵산의 뉴클레오타이드간 연결기의 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 99%는 포스포로티오에이트 연결기이다. 임의로, 포스포로티오에이트 핵산의 뉴클레오타이드간 연결기의 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 99%는 포스포로티오에이트 연결기이다. 임의로, 포스포로티오에이트 핵산의 뉴클레오타이드간 연결기의 90%, 95%, 또는 99%는 포스포로티오에이트 연결기이다. 구현예에서, 잔여 뉴클레오타이드간 연결기는포스포디에스테르 연결기이다. 구현예에서, 잔여 뉴클레오타이드간 연결기는 메틸포스포네이트 연결기이다. 임의로, 포스포로티오에이트 핵산의 뉴클레오타이드간 연결기의 100%는 포스포로티오에이트 연결기이다. 유사하게, 포스포로티오에이트 폴리머 골격 내의 당간 연결기의 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 99%는 포스포로티오에이트 연결기일 수 있다. 임의로, 포스포로티오에이트 폴리머 골격 내의 당간 연결기의 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 99%는 포스포로티오에이트 연결기일 수 있다. 임의로, 포스포로티오에이트 폴리머 골격 내의 당간 연결기의 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 99%는 포스포로티오에이트 연결기일 수 있다. 임의로, 포스포로티오에이트 폴리머 골격 내의 당간 연결기의 90%, 95%, 또는 99%는 포스포로티오에이트 연결기일 수 있다. . 구현예에서, 잔여 뉴클레오타이드간 연결기는포스포디에스테르 연결기이다. 구현예에서, 잔여 뉴클레오타이드간 연결기는 메틸포스포네이트 연결기이다. 임의로, 포스포로티오에이트 폴리머 골격 내의 당간 연결기의 100%는 포스포로티오에이트 연결기일 수 있다.
핵산 비특이적 서열을 포함할 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "비특이적 서열"은 임의의 다른 핵산 서열에 대해 상보적 또는 부분적으로 상보적인 것으로 설계된 일련의 잔기를 함유하는 핵산 서열을 지칭한다. 예로써, 비특이적 핵산 서열은, 세포 또는 유기체와 접촉할 시, 억제 핵산으로서 기능하지 않는 핵산 잔기의 서열이다. "억제 핵산"은 표적 핵산(예를 들어, 단백질로 해독될 수 있는 mRNA)에 부착할 수 있고 표적 핵산 (예를 들어, DNA로부터 mRNA)의 전사를 감소시킬 수 있거나 표적 핵산(예를 들어, mRNA)의 해독을 감소시킬 수 있거나 전사체 스플라이싱(예를 들어, 단일 가닥의 모르폴리노 올리고)를 변화시킬 수 있는 핵산(예를 들어, DNA, RNA, 뉴클레오타이드 유사체의 중합체)이다.
본원에 제공된 포스포로티오에이트 핵산 및 포스포로티오에이트 폴리머 골격은 하나 이상의 반응성 모이어티, 예를 들면, 공유 반응성 모이어티를 포함할 수 있다. 반응성 모이어티는 임의의 적절한 링커, 예컨대 당해기술에 공지된 폴리머 링커 (도 19 및 도 20에 나타난 바와 같이, 또는 대안적으로 폴리에틸렌 글리콜 링커 또는 동등체)를 사용하여 포스포로티오에이트 핵산 및 포스포로티오에이트 폴리머 골격의 잔여 부분에 부착될 수 있다. 구현예에서, 링커는 본원에서 기재된 검출가능한 표지를 포함 (즉, 이에 부착될) 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "공유 반응성 모이어티"는 비-세포침투 단백질의 아미노산과 화학적으로 반응하여, 본원에 기재된 바와 같이, 공유 부착, 따라서 본원에서 제공된 바와 같은 콘주게이트를 형성할 수 있는 화학적 모이어티를 지칭한다.
"표지된 핵산 또는 올리고뉴클레오타이드"는 공유적으로, 링커 또는 화학 결합을 통하여, 비공유적으로, 반데르발스, 정전 또는 수소 결합을 통하여 표지에 결합하여, 이로써 핵산의 존재가 상기 핵산에 결합된 검출가능한 표지의 존재를 검출함으로써 검출되는 것이다. 대안적으로, 고 친화성 상호작용을 사용한 방법은, 결합 파트너의 쌍 중 하나가 다른 하나, 예를 들어, 결합 바이오틴, 스트렙타비딘에 결합하는 상동한 결과를 달성시킬 수 있다. 구현예에서, 포스포로티오에이트 핵산 또는 포스포로티오에이트 폴리머 골격은 검출가능한 표지를 본원에 개시된 바와 같이 포함하고, 이는 본 분야에 일반적으로 알려져 있다.
"생물학적 샘플" 또는 "샘플"은 대상체 또는 환자로부터 수득되거나 유도된 물질을 지칭한다. 생물학적 샘플은 조직학적 목적을 위하여 취해진, 예컨대 생검 및 부검 샘플과 같은 조직의 섹션, 및 냉동 섹션을 포함한다. 그와 같은 샘플은, 체액 예컨대 혈액 및 혈액 분획 또는 생성물 (예를 들면, 혈청, 혈장, 혈소판, 적혈구, 등), 가래, 조직, 배양 세포 (예를 들면, 일차 배양물, 외식편, 및 형질전환된 세포) 대변, 소변, 활막 유체, 관절 조직, 활막 조직, 활막세포, 섬유아세포-유사 활막세포, 대식세포-유사 활막세포, 면역 세포, 조혈 세포, 섬유아세포, 대식세포, T 세포 등을 포함한다. 생물학적 샘플은 전형적으로 진핵 유기체, 예컨대 포유동물 예컨대 영장류 예를 들면, 침팬지 또는 인간; 소; 개; 고양이; 설치류, 예를 들면, 기니아 피그, 랫트, 마우스; 토끼; 또는 조류; 파충류; 또는 어류로부터 수득된다.
상기 용어 "폴리펩타이드", "펩타이드" 및 "단백질"은 본원에서 아미노산 잔기의 중합체를 지칭하기 위해 상호교환적으로 사용된다. 상기 용어는 하나 이상의 아미노산 잔기가 상응하는 천연 아미노산의 인공 화학적 모사체인 아미노산 중합체, 및 천연 아미노산 중합체 및 비-천연 아미노산 중합체에 적용된다.
상기 용어 "아미노산"은 천연 아미노산과 유사한 방식으로 기능하는 아미노산 유사체 및 아미노산 모사체 뿐만 아니라 천연 및 합성 아미노산을 지칭한다. 천연 아미노산은 이후 변형된 아미노산들, 예를 들어, 하이드록시프롤린, γ-카복시글루타메이트, 및 O-포스포세린 뿐만 아니라 유전자 코드에 의해 암호화된 것들이다. 아미노산 유사체는 천연 아미노산과 동일한 기본 화학적 구조, 즉, 수소, 카복실 그룹, 아미노 그룹 및 R 그룹에 결합된 α 탄소를 갖는 화합물, 예를 들어, 호모세린, 노르류신, 메티오닌 설폭사이드, 메티오닌 메틸 설포늄을 지칭한다. 상기 유사체는 변형된 R 그룹(예를 들어, 노르류신) 또는 변형된 펩타이드 골격을 갖지만 천연 아미노산과 동일한 기본 화학적 구조를 보유한다. 아미노산 모사체는 아미노산의 일반 화학적 구조와는 상이하지만 천연 아미노산과 유사한 방식으로 기능하는 구조를 갖는 화학적 화합물을 지칭한다.
아미노산은 본원에서 기관[IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commission]에 의해 추천되는 이들의 통상적으로 공지된 3문자 심볼 또는 1문자 심볼에 의해 지칭될 수 있다. 마찬가지로 뉴클레오타이드는 이들의 통상적으로 수용되는 1문자 코드에 의해 지칭될 수 있다.
"표지" 또는 "검출가능한 모이어티"는 분광, 광화학적, 생화학적, 면역화학적, 화학적, 또는 기타 물리적 수단에 의하여 검출가능한 조성물이다. 예를 들면, 유용한 표지는, 예를 들면, 방사선표지를 표적 펩타이드와 특이적으로 반응성인 펩타이드 또는 항체에 편입시킴으로써 검출가능하게 제조될 수 있는, 32P, 형광성 염료, 전자 치밀 시약, 효소 (예를 들면, ELISA 통상적으로 사용된 바와 같은), 바이오틴, 디곡시제닌, 또는 합텐 및 단백질 또는 기타 독립체를 포함한다. 당해기술에 공지된 항체를 표지에 콘주게이트하기 위한 임의의 적절한 방법이 예를 들어, Hermanson, Bioconjugate Techniques 1996, Academic Press, Inc., San Diego에 기재된 방법을 사용하여 이용될 수 있다.
용어 "재조합"은, 예를 들면, 세포, 또는 핵산, 단백질, 또는 벡터에 대해 참조와 함께 사용될 때, 상기 세포, 핵산, 단백질, 또는 벡터가 실험실 방법의 결과이거나, 이에 의하여 변형되었다는 것을 나타낸다. 따라서, 예를 들면, 재조합 단백질은 실험실 방법에 의하여 생성된 단백질을 포함한다. 재조합 단백질은 단백질의 원산 (비-재조합) 형태 내에 발견되지 않은 아미노산 잔기를 포함할 수 있거나, 개질되었던, 예를 들면, 표지되었던 아미노산 잔기를 포함할 수 있다.
용어 "이종성"은, 핵산의 일부에 대한 참조로 사용될 때, 상기 핵산이 자연 상태에서 서로 동일한 관계 내에서 발견되지 않은 2 이상의 하위 서열을 포함한다. 예를 들면, 핵산은 전형적으로 재조합으로 생성되며, 새로운 기능적 핵산을 제조하기 위하여 마련된, 비관련 유전자로부터의 2이상의 서열, 예컨대 일 공급원으로부터의 프로모터 및 또 다른 공급원으로부터의 암호화 영역을 갖는다. 유사하게, 이종성 단백질은, 상기 단백질이 자연 상태에서 서로 동일한 관계에서 발견되지 않는 2 이상의 하위 서열을 포함한다는 것을 나타낸다(예를 들면, 융합 단백질).
"항체"는 항원에 특이적으로 결합하고 이를 인식하는 면역글로불린 유전자 또는 이의 단편으로부터의 프레임워트 영역을 포함하는 폴리펩타이드를 지칭한다. 인식된 면역글로불린 유전자는 카파, 람다, 알파, 감마, 델타, 엡실론, 및 mu 불변 영역 유전자, 뿐만 아니라 무수한 면역글로불린 가변 영역 유전자를 포함한다. 경쇄는 카파 또는 람다로 분류된다. 중쇄는 감마, 뮤, 알파, 델타, 또는 엡실론으로 분류되며, 이는 각각 면역글로불린 클래스, IgG, IgM, IgA, IgD 및 IgE를 차례로 정의한다. 전형적으로, 항체의 항원-부착 영역은 부착의 특이성 및 친화성에 있어서 가장 중요할 것이다. 일부 구현예에서, 항체의 항체 또는 단편은 인간, 마우스, 랫트, 햄스터, 낙타 등을 포함하는 상이한 유기체로부터 유래할 수 있다. 본 발명의 항체는 하나 이상의 아미노산 위치에서 개질되었거나 돌연변이되어 항체의 원하는 기능 (예를 들면 당화, 발현, 항원 인식, 효과기 기능, 항원 부착, 특이성, 등)을 개선 또는 조절하는 항체를 포함할 수 있다.
예시적인 면역글로불린 (항체) 구조 단위는 사량체를 포함한다. 각각의 사량체는 폴리펩타이드 사슬의 2개의 동일한 쌍으로 구성되며, 각각의 쌍은 하나의 "가벼운" (약 25 kD) 및 하나의 "무거운" 사슬 (약 50-70 kD)을 포함한다. 각 사슬의 N-말단은, 주로 항원 인식을 책임지는, 약 100개 내지 110개 이상의 아미노산의 가변 영역을 정의한다. 용어 가변 경쇄 (VL) 및 가변 중쇄 (VH)는 이들 경쇄 및 중쇄 각각을 지칭한다.
항체는, 예를 들면, 다양한 펩티다아제로의 소화에 의해 생성된 수많은 잘-특성화된 단편으로서, 또는 온전한 면역글로불린으로서, 존재한다. 따라서, 예를 들면, 펩신은 힌지 영역 내의 디설파이드 연결기 아래에서 항체를 소화시켜 F(ab)'2, 그 자체가 디설파이드 부착에 의하여 VH-CH1 부착된 경쇄인 Fab의 이량체를 생성한다. F(ab)'2는 온화한 조건 하에서 감소되어 힌지 영역 내의 디설파이드 연결부를 파괴하여, 이로써 F(ab)'2 이량체를 Fab' 모노머로 전환할 수 있다. Fab' 모노머는 본질적으로 힌지 영역의 부분을 갖는 Fab이다 (참고: Fundamental Immunology (Paul ed., 3d ed. 1993)). 다양한 항체 단편은 온전한 항체의 소화 관점에서 정의될 수 있으며, 당업자는 그와 같은 단편이 재조합 DNA 방법론을 사용함에 의하여 드노보 또는 화학적으로 합성될 수 있다는 것을 알 것이다. 따라서, 용어 항체는, 본원에서 사용된 바와 같이, 항체 단편은 전체 항체의 변형에 의하여 생성되거나, 재조합 DNA 방법론을 사용하여 드노보 합성되거나 (예를 들어 , 단일 사슬 Fv), 또는 파아지 디스클레이 라이브러리를 사용하여 식별된 항체 단편을 또한 포함한다 (참고, 예를 들면, McCafferty 등, Nature 348:552-554 (1990)).
본 발명의 적합한 항체, 예를 들면, 재조합, 단클론성, 또는 다클론성 항체의 제조 및 본 발명에 따른 용도를 위해서, 당해 기술에 공지된 많은 기술이 사용될 수 있다(참고, 예를 들면, Kohler & Milstein, Nature 256:495-497 (1975); Kozbor et al., Immunology Today 4: 72 (1983); Cole et al., pp. 77-96 in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc. (1985); Coligan, Current Protocols in Immunology (1991); Harlow & Lane, Antibodies, A Laboratory Manual (1988); and Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice (2d ed. 1986)). 목적한 항체의 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 유전자는 세포로부터 클로닝될 수 있는데, 예를 들어, 단클론성 항체를 암호화하는 유전자는 하이브리도마로부터 클로닝되어 재조합 단클론성 항체를 생산하는데 사용될 수 있다. 단클론성 항체의 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 유전자 라이브러리는 또한 하이브리도마 또는 형질 세포로부터 제조될 수 있다. 중쇄 및 경쇄 유전자 생성물의 랜덤 조합은 상이한 항원 특이성을 지닌 항체의 거대한 풀(pool)을 생성한다(참고: 예를 들면, Kuby, Immunology (3rd ed. 1997)). 단일 사슬 항체 또는 재조합 항체의 생산을 위한 기술(참고: 미국 특허 4,946,778, 미국 특허 번호 4,816,567)은 본 발명의 폴리펩타이드에 대한 항체를 생산하기 위해 적응될 수 있다. 또한, 트랜스제닉 마우스, 또는 다른 유기체, 예컨대, 기타 포유동물은 인간화된 또는 인간 항체를 발현하는데 사용될 수 있다(참고: 예를 들면, 미국 특허 번호 5,545,807; 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; 5,661,016, Marks et al., Bio/Technology 10:779-783 (1992); Lonberg et al., Nature 368:856-859 (1994); Morrison, Nature 368:812-13 (1994); Fishwild et al., Nature Biotechnology 14:845-51 (1996); Neuberger, Nature Biotechnology 14:826 (1996); 및 Lonberg & Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13:65-93 (1995)). 대안적으로, 파아지 디스플레이 기술을 사용하여 선택된 항원에 특이적으로 결합하는 항체 및 헤테로머 Fab 단편을 확인할 수 있다(참고: 예를 들면, McCafferty et al., Nature 348:552-554 (1990); Marks et al., Biotechnology 10:779-783 (1992)). 항체는 또한 이중특이적으로 제조될 수 있는데, 즉, 2개의 상이한 항원을 인식할 수 있다(참고, 예를 들면, WO 93/08829, Traunecker et al., EMBO J. 10:3655-3659 (1991); and Suresh et al., Methods in Enzymology 121:210 (1986)). 항체는 또한 헤테로콘주게이트, 예를 들면, 2개의 공유적으로 연결된 항체, 또는 면역독소일 수 있다(참고, 예를 들면, 미국 특허 번호 4,676,980 , WO 91/00360; WO 92/200373; 및 EP 03089).
비-인간 항체를 인간화하거나 영장류화하는 방법은 당해기술에 잘 알려져 있다(예를 들면, U.S. 특허 번호 4,816,567; 5,530,101; 5,859,205; 5,585,089; 5,693,761; 5,693,762; 5,777,085; 6,180,370; 6,210,671; 및 6,329,511; WO 87/02671; EP 특허 출원 0173494; Jones et al. (1986) Nature 321:522; 및 Verhoyen et al. (1988) Science 239:1534). 인간화된 항체는 예를 들면, 문헌(참고: Winter 및 Milstein (1991) Nature 349:293)에 또한 기술되어 있다. 일반적으로, 인간화된 항체는 비-인간인 공급원으로부터 이것내로 도입된 하나 이상의 아미노산 잔기를 갖는다. 이들 비-인간 아미노산 잔기는 흔히 도입 가변 도메인으로부터 전형적으로 취해지는 도입 잔기로 언급된다. 인간화는 설치류 CDRs 또는 CDR 서열을 인간 항체의 상응하는 서열로 치환함으로써, 윈터(Winter) 및 공동-작업자의 방법에 따라 본질적으로 수행될 수 있다(참고, 예를 들면, Morrison et al., PNAS USA, 81:6851-6855 (1984), Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-327 (1988); Morrison and Oi, Adv. Immunol., 44:65-92 (1988), Verhoeyen et al., Science 239:1534-1536 (1988) 및 Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992), Padlan, Molec. Immun., 28:489-498 (1991); Padlan, Molec. Immun., 31(3):169-217 (1994)). 따라서, 그와 같은 인간화된 항체는 키메라성 항체(미국 특허 번호 4,816,567)이며, 여기서 실질적으로 한개 미만의 온전한 인간 가변 도메인은 비-사람 종으로부터의 상응하는 서열에 의해 치환된다. 실제로, 인간화된 항체는 전형적으로 인간 항체이며, 여기서 일부 CDR 잔기 및 가능하게는 일부 FR 잔기는 설치류 항체에서 비슷한 부위로부터의 잔기로 치환된다. 예를 들면, 인간화된 면역글로불린 프레임워크 영역을 암호화하는 제1 서열 및 원하는 면역글로불린 상보성 결정 영역을 암호화하는 제2 서열 세트를 포함하는 폴리뉴클레오타이드는 적절한 cDNA 및 게놈 DNA 세그먼트를 조합함으로써 또는 합성적으로 생산될 수 있다. 인간 불변 영역 DNA 서열은 다양한 인간 세포로부터 잘 알려진 절차에 따라 단리될 수 있다.
"키메라 항체"는, (a) 불변 영역(constant region), 또는 이의 일부가 변경되거나, 대체되거나 교환됨으로써 항원 결합 부위(가변 영역)가 상이한 또는 변경된 부류, 효과기 기능 및/또는 종, 또는 키메라성 항체에 새로운 특성을 부여하는 전적으로 상이한 분자, 예를 들면, 효소, 독소, 호르몬, 성장 인자, 약물 등의 불변 영역에 연결되거나; (b) 가변 영역, 또는 이의 일부가 상이한 또는 변경된 항원 특이성을 가진 가변 영역으로 변경되거나, 대체되거나 교환된 항체 분자이다. 본 발명에 따른 바람직한 항체, 및 이의 용도는 인간화된 및/또는 키메라성 단클론성 항체를 포함한다.
치료제를 항체에 콘주게이트하기 위한 기술은 잘 알려져 있다(참고: 예를 들면, Arnon et al., "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et al.(eds.), pp. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom et al., "Antibodies For Drug Delivery" in Controlled Drug Delivery (2nd Ed.), Robinson et al. (eds.), pp. 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987); Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review" in Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al. (eds.), pp. 475-506 (1985); 및 Thorpe et al., "The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates", Immunol. Rev., 62:119-58 (1982)).
어구 항체에 "특이적으로(또는 선택적으로) 결합하다" 또는 "와 특이적으로(또는 선택적으로) 면역반응성인"은, 단백질 또는 펩타이드를 언급하는 경우, 흔히 단백질 또는 다른 생물제제의 이종성 집단에서, 단백질의 존재의 졀정적인 결합 반응을 말한다. 따라서, 지정된 면역분석 조건 하에서, 명시된 항체는 특정한 단백질에 배경의 적어도 2배 및 더욱 전형적으로 배경의 10 내지 100배 이상으로 결합한다. 이러한 조건하에서 항체에 대한 특이적 결합은 특정한 단백질에 대한 이의 특이성에 대해 선택된 항체를 요구한다. 예를 들면, 다클론성 항체는 선택된 항원과 특이적으로 면역반응성이고 다른 단백질과는 면역반응성이 아닌 다클론성 항체 만을 수득하기 위해 선택될 수 있다. 이러한 선택은 다른 분자와 교차-반응하는 항체를 감함으로써 달성될 수 있다. 다양한 면역분석 포맷을 사용하여 특정한 단백질과 특이적으로 면역반응성인 항체를 선택할 수 있다. 예를 들면, 고체상 ELISA 면역분석을 일반적으로 사용하여 단백질과 특이적으로 면역반응성인 항체를 선택한다(참고: 예를 들면, Harlow & Lane, Using Antibodies, A Laboratory Manual (1998) for a description of immunoassay format and conditions that can be used to determine specific immunoreactivity).
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "약제학적으로 허용되는"은 "생리학적으로 허용되는" 및 "약리학적으로 허용되는"과 동의어로 사용된다. 약제학적 조성물은 일반적으로 버퍼링(buffering) 및 저장 시 보존을 위한 제제를 포함할 것이며, 투여 경로에 따라, 적절한 전달을 위한 버퍼(buffer) 및 캐리어(carrier)를 포함할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "암"은 포유동물에서 발견되는 모든 유형의 암, 신생물 또는 악성 종양을 지칭하고, 이는 백혈병, 암종 및 육종을 포함한다. 예시적인 암은 뇌암, 유방암, 경부암, 결장암, 두경부암, 간암, 신장암, 폐암, 비-소 세포 폐암, 흑색종, 중피종, 난소암, 육종, 위암, 자궁암 및 수모세포종을 포함한다. 추가의 예는 호지킨 질환, 비-호지킨 림프종, 다발성 골수종, 신경아세포종, 난소암, 횡문근육종, 원발성 혈소판 증가증, 원발성 고분자글로불린혈증, 원발성 뇌 종양, 암, 악성 췌장 인슐린종, 악성 카르시노이드, 뇨 방광암, 전암성 피부 병소, 고환암, 림프종, 갑상선암, 신경아세포종, 식도암, 비뇨 생식관암, 악성 고칼슘혈증, 자궁내막암, 부신피질암, 내분비 및 외분비 췌장의 신생물 및 전립선암을 포함한다.
상기 용어 "백혈병"은 광범위하게 혈액 형성 기관의 진행성 악성 질환을 지칭하고 일반적으로 혈액 및 골수에서 백혈구 및 이의 전구체의 기형 증식 및 발육을 특징으로 한다. 백혈병은 일반적으로 (1) 질환-급성 또는 만성의 지속성 및 특성; (2) 관여하는 세포의 유형; 골수(골수성), 림프구(림프구성), 또는 단핵구; 및 (3) 혈액 백혈병 또는 비백혈병(준백혈병)에서 다수의 비정상 세포에서의 증가 또는 비증가를 기초로 하여 임상적으로 분류된다. 상기 P388 백혈병 모델은 광범위하게 생체내 항-백혈병 활성을 예측하는 것으로서 받아들여진다. P388 검정에서 양성인 시험은 일반적으로 치료될 백혈병 유형과는 상관 없이 일부 생체내 항-백혈병 활성 수준을 나타내는 것으로 사료된다. 따라서, 본원은 백혈병을 치료하는 방법, 및 바람직하게는 급성 림프구성 백혈병, 만성 림프구성 백혈병, 급성 과립구성 백혈병, 만성 과립구성 백혈병, 급성 전골수성 백혈병, 성인 T-세포 백혈병, 비백혈병성 백혈병, 류코사이테믹 백혈병(leukocythemic leukemia), 호염기성 백혈병, 아세포 백혈병, 소 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 피부 백혈병, 배아 백혈병, 호산성 백혈병, 그로스 백혈병, 모발 세포 백혈병, 조혈세포 백혈병, 혈구모세포 백혈병, 조직구 백혈병, 줄기 세포 백혈병, 급성 단핵구 백혈병, 백혈구감소성 백혈병, 림프성 백혈병, 림프아구 백혈병, 림프구성 백혈병, 림프형성 백혈병, 림프구성 백혈병, 림프육종 세포 백혈병, 비만 세포 백혈병, 거핵구성 백혈병, 소골수아구 백혈병, 단핵구성 백혈병, 골수아구성 백혈병, 골수성 백혈병, 골수 과립구성 백혈병, 골수단핵구성 백혈병, 나에렐리 백혈병, 혈장 세포 백혈병, 다발성 골수종, 형질세포성 백혈병, 전골수구성 백혈병, 리에더 세포 백혈병(Rieder cell leukemia), 쉴링 백혈병, 줄기 세포 백혈병, 아백혈성 백혈병, 및 미분화된 세포 백혈병을 포함한다.
상기 용어 "육종"은 일반적으로 배아 연결 조직과 같이 물질로 구성되고 일반적으로 미소 섬유 또는 동질성 물질내 매립된 세밀하게 팩킹된 세포로 구성되는 종양을 지칭한다. 항신생물 티올-결합 미토콘드리아 산화제와 항암제의 병용물로 치료될 수 있는 육종은 연골육종, 섬유육종, 림프육종, 흑색육종, 점액육종, 골육종, 아베메티육종(Abemethy's sarcoma), 지방 육종, 지질육종, 포상 연조직 육종, 에나멜 아세포 육종, 포도송이 모양의 육종, 녹색종 육종, 융모막 암종, 배 육종, 빌름스 종양 육종(Wilms' tumor sarcoma), 자궁내막 육종, 간질성 육종, 어윙 육종(Ewing's sarcoma), 파시알 육종(fascial sarcoma), 섬유모세포 육종, 거대 세포 육종, 과립구 육종, 호지킨 육종, 특발성 다발성 유색 출혈 육종, B 세포의 면역아세포 육종, 림프종, T 세포의 면역아세포 육종, 얀센 육종, 카포시 육종(Kaposi's sarcoma), 쿠퍼 세포 육종(Kupffer cell sarcoma), 혈관육종, 백혈육종, 악성 간엽종 육종, 골막주위육종, 망상적혈구 육종, 라우스 육종(Rous sarcoma), 장액낭종 육종, 윤활액 육종 및 텔란기엑탈틱 육종(telangiectaltic sarcoma)을 포함한다.
상기 용어 "흑색종"은 피부 및 다른 기관의 멜라닌 세포 시스템으로부터 발생된 종양을 의미하는 것으로 한다. 항신생물 티올-결합 미토콘드리아 산화제와 항산화제의 병용물로 치료될 수 있는 흑색종은 예를 들어, 말단흑색흑색종(acral-lentiginous melanoma), 무흑색소성 흑색종(amelanotic melanoma), 양성소아흑색종, 클라우드만 육종(Cloudman's melanoma), S91 흑색종, 하딩-파세이 흑색종(Harding-Passey melanoma), 소아성 흑새종, 악성흑색점 흑색종, 악성 흑색종(malignant melanoma), 결절성 흑색종, 조갑하 흑색종 및 표재 확장성 흑색종(superficial spreading melanoma)을 포함한다.
상기 용어 "암종"은 주변 조직을 침투하는 경향이 있어 전이를 유발하는 상피 세포로 구성된 악성의 새로운 성장을 지칭한다. 항신생물 티올 부착 미토콘드리아 산화제와 항암제의 병용물로 치료될 수 있는 예시적인 암종은 예를 들어, 소핵 암종, 소핵과 암종(acinous carcinoma), 선양낭포 암종, 아데노이드 낭종 암종, 선암종, 부신피질의 암종, 폐포 암종, 폐포 세포 암종, 기저 세포 암종, 기저세포성 암종(carcinoma basocellulare), 기저양 암종, 기저편평 세포 암종, 기관지폐포 암종, 세기관지 암종, 기관지원성암종, 대뇌양 암종, 담관세포 암종, 융모막 암종, 콜로이드 암종, 코메도 암종(comedo carcinoma), 코퍼스 암종(corpus carcinoma), 소공질 암종, 잔류갑상선암종(carcinoma en cuirasse), 피각 암종, 원주 암종, 실린더형 세포 암종, 관 암종, 듀럼 암종, 배아 암종, 대뇌양 암종(encephaloid carcinoma), 상피양 암종(epiermoid carcinoma), 상피 아데노이드 암종(carcinoma epitheliale adenoides), 외장성 암종(exophytic carcinoma), 궤양 생성 암종(carcinoma ex ulcere), 섬유층 암종, 젤라티니포르니 암종(gelatiniforni carcinoma), 젤라틴성 암종(gelatinous carcinoma), 거대 세포 암종, 거대세포성 암종(carcinoma gigantocellulare), 선천적 암종, 과립막 세포 암종, 모발-매트릭스 암종, 헤마토이드 암종(hematoid carcinoma), 간세포 암종(hepatocellular carcinoma), 허틀 세포 암종(Hurthle cell carcinoma), 하이알린 암종(hyaline carcinoma), 하이페머프로이드 암종(hypemephroid carcinoma), 유아성 배아 암종, 원위치 암종, 표피내 암종, 상피내 암종, 크롬페처 암종(Krompecher's carcinoma), 쿨키트즈키 세포 암종(Kulchitzky-cell carcinoma), 거대-세포 암종(large-cell carcinoma), 수정체 암종, 수정체성 암종, 지방종성 암종, 림프상피성 암종, 수질 암종, 수질성 암종, 흑색증성 암종, 몰레(molle) 암종, 점액 암종, 뮤시파룸 암종(carcinoma muciparum), 점액세포 암종(carcinoma mucocellulare), 점액상피양 암종(mucoepidermoid carcinoma), 추벽 암종(carcinoma mucosum), 점액성 암종, 믹소마토드 암종(carcinoma myxomatodes), 비인두 암종, 귀리 세포 암종, 골화성 암종, 유골 암종, 젖꼭지모양의 암종, 문맥주위 암종, 조직침투전 암종, 프리클 세포 암종(prickle cell carcinoma), 풀모양의 암종, 콩팥의 신장 세포 암종, 저장 세포 암종, 육종성 암종, 상악동막 암종, 딱딱한 섬유질의 암종, 음낭암종, 시그네트-환 세포 암종(signet-ring cell carcinoma), 심플렉스 암종(carcinoma simplex), 소세포 암종, 솔라노이드 암종, 회전 타원체 세포 암종, 스핀들 세포 암종, 해면체 암종, 비늘모양의 암종, 비늘모양 세포 암종, 스트링 암종, 텔란기엑타티쿰 암종(carcinoma telangiectaticum), 텔란기엑토데스 암종(carcinoma telangiectodes), 전이 세포 암종, 튜버섬 암종(carcinoma tuberosum), 결절성 암종, 사마귀모양의 암종, 및 빌로섬 암종(carcinoma villosum)을 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "전이," "전이성," 및 "전이암"은, 상호교환적으로 사용될 수 있으며, 증식성 질환 또는 장애, 예를 들면, 하나의 장기로부터의, 또는 또 다른 비-인접 장기 또는 신체 부분으로부터의 암의 확산을 지칭한다. 암은, 유래 부위, 예를 들면, 유방에서 발생하고, 이러한 부위는 원발성 종양, 예를 들면, 일차 유방암으로 지칭된다. 원발성 종양 또는 유래 부위 내의 일부 암 세포는 국지 부위 내의 주위 정상 조직에 침투 및 침윤하는 능력, 및/또는 체내 다른 부위 및 조직 체계를 통하여 순환하는 림프계 또는 혈관계의 벽을 침투하는 능력을 획득한다. 원발성 종양의 암 세포로부터 형성된 제2 임상적으로 검출가능한 종양은 전이성 또는 2차 종양으로 지칭된다. 암 세포가 전이할 때, 전이성 종양 및 이의 세포는 원래 종양의 그것과 유사한 것으로 추정된다. 따라서, 만약 폐암이 유방으로 전이되면, 유방 부위의 2차 종양은 비정상 폐 세포 및 비 비정상 유방 세포로 구성된다. 유방 내 2차 종양은 전이성 폐암으로 지칭된다. 따라서, 어구 전이성 암은 대상체가 원발성 종양을 갖고 있거나 가졌고, 하나 이상의 2차 종양을 갖는 질환으로 지칭된다. 어구 비-전이암 또는 비전이성 암을 갖는 대상체는, 대상체가 원발성 종양을 갖지만 하나 이상의 2차 종양을 갖지 않는 질환을 지칭한다. 예를 들면, 전이성 폐암은, 1차 폐 종양을 갖거나 이의 이력이 있고, 2차 위치 또는 다중 위치, 예컨대 유방 내에 하나 이상의 2차 종양을 갖는 대상체 내의 질환을 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "자가면역 질환"은 예컨대 대상체의 체내에 정상적으로 존재하는 물질 조직 및/또는 세포에 대하여 면역계에 의한 변화된 면역반응으로부터 야기된 질환 또는 장애를 지칭한다. 자가면역 질환 비제한적으로, 관절염, 류마티스성 관절염, 건선성 관절염, 유년성 특발성 관절염, 경피증, 전신 경피증, 다발성 경화증, 전신 홍반성 낭창 (SLE), 중증 근무력증, 유년 발병형 당뇨병, 진성 당뇨병 유형 1, 길랑-바레 증후군, 하시모토 뇌염, 하시모토 갑상선염, 강직 척추염, 건선, 쇼그렌 증후군,혈관염, 사구체신염, 자가면역 갑상선염, 베체트병, 크론병, 궤양성 대장염, 수포성 유천포창, 유육종증, 건선, 어린선(ichthyosis), 그레이브스 안증, 염증성 장 질환, 애디슨병, 백반증, 천식, 및 알러지성 천식을 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "염증성 질환"은 비정상 또는 변화된 염증과 관련된 질환 또는 장애를 지칭한다. 염증은, 병원체, 손상된 세포 또는 조직 또는 자극체에 반응하여 치유 과정의 일부로서, 면역계에 의하여 개시된 생물학적 반응이다. 만성적 염증은 다양한 질환을 야기할 수 있다. 염증성 질환은 비제한적으로, 죽상경화증, 알러지, 천식, 류마티스성 관절염, 이식 거부, 소아지방변증, 만성적 전립선염, 염증성 장 질환, 골반 염증성 질환, 및 염증성 근병증을 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "대사성 장애"는 탄수화물(carobydrates), 아미노산, 유기산을 포함하는 다양한 분자 및 물질의 비정상 대사를 포함하는 질환 또는 장애를 지칭한다. 대사성 장애는 비제한적으로, 탄수화물 대사 장애, 예를 들면, 글리코겐 축적 질환, 아미노산 대사 장애, 예를 들면, 페닐케톤뇨증, 단풍나무 시럽 소변 질환, 글루타르산 혈증 유형 1, 요소 대사 장애 또는 요소 대사 결함, 예를 들면, 카바모일 포스페이트 합성효소 I 결핍, 유기산 대사 장애 (유기 산성뇨), 예를 들면, 알캅톤뇨증, 지방산 산화 및 미토콘드리아 대사 장애, 예를 들면, 중간-사슬 아실-조효소 A 탈수소효소 결핍, 포르피린 대사 장애, 예를 들면, 급성 간헐적 포르피린증, 퓨린 또는 피리미딘 대사 장애 , 예를 들면, Lesch-Nyhan 증후군, 스테로이드 대사 장애, 예를 들면, 유지질 선천성 부신 과다형성, 선천성 부신 과다형성, 미토콘드리아 기능 장애, 예를 들면, 컨스 세르(Kearns-Sayre) 증후군, 페록시솜 기능 장애, 예를 들면, 젤웨거(Zellweger) 증후군, 및 용해소체 축적 장애, 예를 들면, 고슈아 질환, 및 니만 피크병을 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "발달 장애"는 종종 언어 장애, 학습 장애, 운동 장애 및 신경발달 장애와 연관된 소아기에서 유래된 질환 또는 장애를 지칭한다. 그 예는 비제한적으로, 자폐증 스펙트럼 장애 및 주의력 결핍 장애를 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "심혈관 질환"은 심장, 혈관 또는 둘 모두와 연관된 질환을 지칭한다. 심혈관 질환은 비제한적으로, 관상동맥 심장병, 심근병증, 고혈압 심장병, 심부전, 심장 율동부정, 염증성 심장병, 말초 동맥 질환, 뇌혈관 질환 및 염증성 심장병을 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "간 질환"은 간 및/또는 간 기능 이상과 연관된 질환을 지칭한다. 간 질환 비제한적으로, 간염, 알코올성 간 질환, 지방간 질환, 경변증, 버드-키아리 증후군, 길버트 증후군 및 암을 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "창자 질환"은 창자 (소장 또는 대장) 내의 이상와 연관된 질환 또는 장애를 지칭한다. 창자 질환 include, 비제한적으로, 위장염, 대장염, 회장염, 충수염, 만성적 소화장애증, Chron's 질환, 에테로바이러스, 과민성 장 증후군, 및 게실r 질환.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "내분비 질환"은 내분비샘 분비 저하, 내분비샘 분비 과다 및 종양을 포함하는 내분비계의 질환 또는 장애를 지칭한다. 내분비 질환은, 비제한적으로, 애디슨병, 당뇨병, 콘(Conn) 증후군, 쿠싱 증후군, 글루코코르티코이드 치료가능 알도스테론증, 저혈당증, 갑상선기능항진증, 갑상선기능저하증, 갑상선염, 뇌하수체저하증, 생식샘기능저하증 및 부갑상선 장애를 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "신경적 장애"은 구조적, 생화학적 또는 전기적 장애를 포함하는 신체 신경계의 질환 또는 장애를 지칭한다. 신경적 장애는 비제한적으로, 뇌 손상, 뇌 기능이상, 척수 장애, 말초 신경병증, 뇌신경 장애, 자율신경계 장애, 발작 장애, 운동 장애, 예를 들면, 파킨슨병 및 다발성 경화증, 및 중심 신경병증을 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "감염성 질환"은 숙주 대상체에서의 병원성 제제의 감염, 존재 및/또는 성장과 연관된 질환 또는 장애를 지칭한다. 감염성 병원성 제제는, 비제한적으로, 바이러스, 박테리아, 진균, 원생동물, 다중세포 기생충 및 비정상적인 단백질, 예를 들면, 프리온을 포함한다. 감염성 질환과 관련된 바이러스는 비제한적으로, 단순 포진 바이러스, 사이토메갈로바이러스, 엡슈타인-바르 바이러스, 수두-대상포진 바이러스, 헤르페스바이러스, 소포성 구내염 바이러스, 간염 바이러스, 리노바이러스, 코로나바이러스, 인플루엔자 바이러스, 홍역 바이러스, 폴리오마바이러스, 인간 파필로마바이러스, 호흡기 세포융합 바이러스, 아데노바이러스, 콕사키(Coxsackie) 바이러스, 뎅기열 바이러스, 볼거리 바이러스, 폴리오바이러스, 광견병 바이러스, 루(Rous) 육종 바이러스, 황열병 바이러스, 에볼라 바이러스, 유인원 면역결핍 바이러스, 인간 면역결핍 바이러스를 포함한다. 감염성 질환과 관련된 박테리아는, 비제한적으로, M. 결핵, 살모넬라 종, E. 콜라이, 클라미디아 종, 스타필로코쿠스 종, 바실러스 종, 및 슈도모나스(Psudomonas) 종을 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 병태, 질환 또는 장애와 관련된 병태, 질환 또는 장애 또는 증상의 "치료" 또는 "~의 치료"는 임상 결과를 포함하는 유익한 또는 원하는 결과를 수득하기 위한 접근법을 지칭한다. 유익한 또는 원하는 임상 결과는, 비제한적으로, 부분 또는 전체로, 하나 이상의 증상 또는 병태의 완화 또는 개선, 병태 정도의 약화, 장애 또는 질환, 병태, 장애 또는 질환의 상태의 안정화, 병태 발병의 예방, 장애 또는 질환, 병태 확산의 예방, 장애 또는 질환, 병태의 지연 또는 완화, 장애 또는 질환 진행, 병태의 지연 또는 완화, 장애 또는 질환 개시, 병태, 장애 또는 질환 상태의 개선 또는 일시적 처방, 및 차도를 포함할 수 있다. "치료"는 또한 치료를 받지 않을 경우 기대되는 생존률과 비교하여 연장되는 대상체 생존률을 의미할 수 있다. "치료"는 병태, 장애 또는 질환의 억제, 병태, 장애 또는 질환의 일시적인 진행 완화를 또한 의미할 수 있으나, 이는 일부 예에서, 병태, 장애 또는 질환의 영구적인 진행 정지를 포함한다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어, 치료, 치료하다 또는 치료하는은 프로테아제의 발현을 특징으로 하는 질환 또는 병태의 하나 이상의 증상 또는 프로테아제의 발현을 특징으로 하는 질환 또는 병태의 증상의 효과를 감소시키는 방법을 지칭한다. 따라서, 상기된 방법에서, 치료는 질환 또는 병태의 확립된 질환, 병태 또는 증상의 중증도에서 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 100% 감소를 지칭할 수 있다. 예를 들어, 질환을 치료하기 위한 방법은 대조군에 비하여 대상체에서 질환의 하나 이상의 증상을 10% 감소시키는 경우 치료인 것으로 간주된다. 따라서, 상기 감소는 본래의 수준 또는 대조군 수준과 비교하여 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 100%, 또는 10% 내지 100%에서 임의의 % 감소일 수 있다. 치료가 반드시 질환, 병태 또는 질환 또는 병태의 증상의 치유 또는 완전한 제거를 지칭하는 것이 아닌 것으로 이해된다. 추가로, 본원에 사용된 바와 같이, 저하시기키거나, 감소시키거나 억제한다는 지칭은 대조군 수준과 비교하여 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 이상의 변화를 포함하고 상기 용어는 완전한 제거를 포함하지만 반드시 포함하는 것은 아니다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "세포-침투" 또는 "세포-침투"은 유의미한 또는 효과적인 양으로 세포외 환경으로부터 세포로 분자 (예를 들면, 단백질)를 전달하는 능력을 지칭한다. 따라서, 세포-침투 콘주게이트는 세포외 환경으로부터 막을 통하여 세포로 전달되는 분자이다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "비-세포침투" 또는 "비-세포침투"는 유의미한 또는 효과적인 양으로 세포외 환경으로부터 세포로 분자가 전달되지 않는 불능을 지칭한다. 따라서, 비-세포침투 펩타이드 또는 단백질은 일반적으로, 세포, 기관 또는 유기체의 집단 상에서 유의미한 생물학적 효과를 달성하기 위하여 세포외 환경으로부터 세포막을 통하여 세포로 전달되지 못한다. 상기 용어는, 하나 이상의 소수의 펩타이드 또는 단백질이 상기 세포로 진입할 수 있다는 가능성을 배제하지 않는다. 그러나, 상기 용어는, 일반적으로 유의미한 정도로 세포외 환경으로부터 세포에 진입할 수 없는 분자를 지칭한다. 비-세포침투 분자 및 물질의 예는, 비제한적으로, 대분자 예컨대, 예를 들면, 고분자량 단백질을 포함한다. 펩타이드 또는 단백질은 당해분야의 숙련가에게 공지된 방법을 사용하여 비-세포침투성인 것으로 측정될 수 있다. 예로써, 펩티드 또는 단백질은 형광적으로 표지될 수 있고, 세포외 환경으로부터 세포로 전달되는 펩타이드 또는 단백질은 유세포측정 분석 또는 공초점 현미경검사에 의하여 시험관내 측정될 수 있다. 일부 구현예에서, "비-세포침투 단백질"은 포스포로티오에이트 핵산 또는 포스포로티오에이트 폴리머 골격에 부착된 동일한 단백질에 대해 적어도 약 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 10,000 또는 100,000 배 미만으로 세포침투하는 단백질을 지칭한다. 일부 구현예에서, "비-세포침투 단백질"은 측정가능하게 세포에 침투하지 않는 단백질을 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "분자량" (M.W.) 또는 "분자량"은 분자내 모든 원자의 분자량의 합을 지칭한다. 분자에 대하여, 고분자량을 갖는 분자는 전형적으로 25 kDa 이상의 분자량을 갖는다. 예로써, 고분자량 단백질은 약 25 kDa 내지 1000 kDa 또는 그 이상의 M.W.(분자량)을 가질 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "세포내"는 세포 안쪽을 의미한다. 본원에서 사용된 바와 같이, "세포내 표적"은 세포 내에 위치하고, 본원에 제공된 비-세포침투 단백질에 부착하는 표적인, 표적, 예를 들면, 핵산, 폴리펩타이드 또는 기타 분자 (예를 들면, 탄수화물)이다. 결합은 직접적 또는 간접적일 수 있다. 임의로, 비-세포침투 단백질 선택적으로 세포내 표적에 결합한다. 선택적으로 결합한다, 선택적으로 결합, 또는 특이적으로 결합은 하나의 제제 (예를 들면, 세포내 표적)가 다른 제제의 부분 또는 전체의 배제 부분에 결합하는 제제 (예를 들면, 비-세포침투 단백질)을 지칭한다. 결합은 검정 방법의 배경에 적어도 약 1.5배인, 검출가능한 결합을 의미한다. 선택적 또는 특이적 결합을 위하여, 그와 같은 검출가능한 결합은 소정의 제제에 대해 검출될 수 있으나, 조절 제제에 대해서는 검출될 수 없다. 대안적으로, 또는 추가로, 결합의 검출은 다운-스트림 분자 또는 사전의 존재를 분석함으로써 측정될 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "콘주게이트"는 원자 또는 분자 사이의 회합을 지칭한다. 회합은 직접적 또는 간접적일 수 있다. 예를 들면, 핵산 및 단백질 사이의 콘주게이트는 직접적으로 예를 들면, 공유 결합에 의하여, 또는 간접적으로, 예를 들면, 비-공유 결합 (예를 들면 정전 상호작용 (예를 들면 이온 결합, 수소 결합, 할로겐 결합), 반데르발스 상호작용 (예를 들면 쌍극자-쌍극자, 쌍극자-유도된 쌍극자, 런던 분산), 환 스태킹(ring stacking) (pi 효과), 소수성 상호작용 등)에 의할 수 있다. 임의로, 콘주게이트는 비제한적으로 친핵성 치환 (예를 들면, 아민 및 알코올과 아실 할라이드, 활성 에스테르의 반응), 친전자성 치환 (예를 들면, 엔아민 반응) 및 탄소-탄소 및 탄소-헤테로원자 다중 결합에 대한 부가 (예를 들면, 마이클 반응, 딜스-알더 부가)를 포함하는 콘주게이트 화학을 사용하여 형성된다. 이들 및 다른 유용한 반응은 예를 들면, 하기에 논의된다: March, ADVANCED ORGANIC CHEMISTRY, 3rd Ed., John Wiley & Sons, New York, 1985; Hermanson, BIOCONJUGATE TECHNIQUES, Academic Press, San Diego, 1996; and Feeney et al., MODIFICATION OF PROTEINS; Advances in Chemistry Series, Vol. 198, American Chemical Society, Washington, D.C., 1982. 구현예에서, 포스포로티오에이트 핵산 및 포스포로티오에이트 골격 폴리머는 포스포로티오에이트 핵산 및 포스포로티오에이트 골격 폴리머 (예를 들면 모노티오포스페이트)의 성분 및 단백질의 성문 사이에서 비-공유 화학적 반응을 통하여 단백질에 비-공유부착된다. 다른 구현예에서, 포스포로티오에이트 핵산 또는 포스포로티오에이트 골격 폴리머는 하나 이상의 반응성 모이어티, 예를 들면, 공유 반응성 모이어티, 본원에 기재된 바와 같이 (예를 들면, 아미노산 반응성 모이어티 예컨대 비닐 설폰 모이어티 (-S(O)2CH=CH2)를 포함한다.
본원에 사용된 콘주게이트 화학을 위하여 사용된, 공유 반응성 모이어티 또는 작용기를 포함하는 유용한 반응성 모이어티는 예를 들면 하기를 포함한다:
(a) 비제한적으로, N-하이드록시석신이미드 에스테르, N-하이드록시벤즈트리아졸 에스테르, 산 할로겐화물, acyl 이미다졸, 티오에스테르, p-니트로페닐 에스테르, 알킬, 알케닐, 알키닐 및 방향족 에스테르를 포함하는 카복실 그룹 및 다양한 그것의 유도체;
(b)에스테르, 에테르, 알데하이드, 등으로 전환될 수 있는 하이드록실 그룹;
(c) 할로알킬 그룹, 여기서 상기 할라이드는 이후 친핵성 그룹 예컨대, 예를 들면, 아민, 카복실레이트 음이온, 티올 음이온, 탄소음이온, 또는 알콕사이드 이온으로 대체될 수 있으며, 이로써 할로겐 원자 부위에 새로운 그룹의 공유부착을 초래할 수 있다.;
(d) 딜스-알더 반응 예컨대, 예를 들면, 말레이미도 그룹에 참여할 수 있는 디에노필 그룹;
(e) 알데하이드 또는 케톤 그룹, 이로써 차후의 유도가 카보닐 유도체 예컨대, 예를 들면, 이민, 하이드라존, 세미카바존 또는 옥심의 형성을 통하여, 또는 그리냐드 부가 또는 알킬리튬 부가와 같은 그러한 기전을 통하여 가능하다;
(f) 예를 들면, 설폰아미드를 형성하는 아민과의 차후의 반응을 위한 설포닐 할라이드 그룹;
(g) 디설파이드로 전환되거나, 아실 할라이드와 반응하거나, 또는 금속 예컨대 금에 결합할 수 있는 티올 그룹;
(h) 예를 들면, 아실화된, 알킬화된 또는 산화될 수 있는 아민 또는 설프하이드릴 그룹;
(i) 예를 들면, 고리화부가, 아실화, 마이클 부가, 등을 겪을 수 있는 알켄;
(j) 예를 들면, 아민 및 하이드록실 화합물과 반응할 수 있는에폭사이드;
(k) 핵산 합성에 유용한 포스포르아미다이트 및 다른 표준 작용기;
(l) 금속 산화규소 결합;
(m) 예를 들면, 포스페이트 디에스테르 결합을 형성시키는 반응성 인 그룹 (예를 들면 포스핀) 에 대한 금속 결합 ; 및
(n) 설폰, 예를 들면, 비닐 설폰.
반응성 작용기들은, 그들이 본원에 기재된 단백질의 화학적 안정성에 참여 또는 간섭하지 않도록 선택될 수 있다. 예로써, 상기 핵산은 비닐 설폰 또는 기타 반응성 모이어티를 포함한다. 도 21은 식 -S-S-R의 모이어티를 지닌 핵산으로부터의 비닐 설폰 반응성 모이어티를 사용한 핵산의 합성을 나타내며, 여기서 R은 -(CH2)6-OH이다. 도 22는 말단 포스페이트(PS)를 지닌 핵산으로부터 비닐 설폰을 갖는 핵산의 합성의 도식이다.
세포침투 콘주게이트가 본원에 제공된다. 세포침투 콘주게이트는 포스포로티오에이트 핵산에 부착된 비-세포침투 단백질을 포함하고, 상기 포스포로티오에이트 핵산은 비-세포침투 단백질의 세포내 전달을 향상시킨다. 임의로, 포스포로티오에이트 핵산은 비특이적 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 비-세포침투 단백질은 포스포로티오에이트 폴리머 골격에 부착된다. 따라서, 포스포로티오에이트 폴리머 골격에 부착된 비-세포침투 단백질을 포함하는 세포침투 콘주게이트가 제공되고, 상기 포스포로티오에이트 폴리머 골격은 비-세포침투 단백질의 세포내 전달을 향상시키는, 세포침투 콘주게이트. 상기에서 논의된 바와 같이, 폴리머 골격은 핵산 서열로서 동일한 구조를 함유한다 (즉, 함께 연결된 2이상의 당 잔기의 사슬을 함유한다), 단, 폴리머 골격은 핵산 서열 내에 정상적으로 존재하는 염기가 없다. 세포침투 콘주게이트가 본원에 제공된다.
포스포로티오에이트 핵산 또는 포스포로티오에이트 폴리머 골격은 임의의 적절한 길이일 수 있다. 임의로, 각각의 포스포로티오에이트 핵산 또는 포스포로티오에이트 폴리머 골격은 독립적으로 길이가 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100개 또는 그 초과 핵산 잔기 또는 당 잔기이다. 임의로, 각각의 포스포로티오에이트 핵산 또는 포스포로티오에이트 폴리머 골격은 독립적으로 길이가 10개 내지 30개 잔기이다. 따라서, 각각의 핵산 또는 폴리머 골격의 길이는 적어도 약 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100개 또는 그 초과의 핵산 잔기 또는 당 잔기일 수 있다. 임의로, 각각의 포스포로티오에이트 핵산 또는 포스포로티오에이트 폴리머 골격은 독립적으로 5 내지 50, 10 내지 50, 15 내지 50, 20 내지 50, 25 내지 50, 30 내지 50, 35 내지 50, 40 내지 50, 45 내지 50, 5 내지 75, 10 내지 75, 15 내지 75, 20 내지 75, 25 내지 75, 30 내지 75, 35 내지 75, 40 내지 75, 45 내지 75, 50 내지 75, 55 내지 75, 60 내지 75, 65 내지 75, 70 내지 75, 5 내지 100, 10 내지 100, 15 내지 100, 20 내지 100, 25 내지 100, 30 내지 100, 35 내지 100, 40 내지 100, 45 내지 100, 50 내지 100, 55 내지 100, 60 내지 100, 65 내지 100, 70 내지 100, 75 내지 100, 80 내지 100, 85 내지 100, 90 내지 100, 95 내지 100개, 또는 그 이상이다. 임의로, 각각의 포스포로티오에이트 핵산 또는 포스포로티오에이트 폴리머 골격은 독립적으로 길이가 10 내지 15, 10 내지 20, 10 내지 30, 10 내지 40, 또는 10 내지 50개 잔기이다.
임의로, 하나의 포스포로티오에이트 핵산 또는 포스포로티오에이트 폴리머 골격의 길이는 또 하나의 포스포로티오에이트 핵산 또는 포스포로티오에이트 폴리머 골격과 상이하다. 예로써, 2개의 포스포로티오에이트 핵산 또는 포스포로티오에이트 폴리머 골격이 비-세포침투 단백질에 부착된 경우, 제1 포스포로티오에이트 핵산 또는 포스포로티오에이트 폴리머 골격은 하나의 길이(예를 들면, 22개 잔기)일 수 있으며 제2 포스포로티오에이트 핵산 또는 포스포로티오에이트 폴리머 골격은 상이한 길이(예를 들면, 25개 잔기)일 수 있다. 따라서, 복수의 포스포로티오에이트 핵산 및 포스포로티오에이트 폴리머 골격이 비-세포침투 단백질에 부착된 경우, 포스포로티오에이트 핵산 및 포스포로티오에이트 폴리머 골격은 수많은 상이한 길이를 가질 수 있고, 예를 들면, 길이가 10 내지 30개 잔기일 수 있다.
임의로, 복수의 포스포로티오에이트 핵산 또는 포스포로티오에이트 폴리머 골격은 비-세포침투 단백질에 부착된다. 임의로, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25개 이상의 포스포로티오에이트 핵산 또는 포스포로티오에이트 폴리머 골격이 단백질에 부착된다. 구현예에서, 상기 부착은 공유부착이다. 상기 부착은 비-공유부착일 수 있다. 포스포로티오에이트 핵산 또는 포스포로티오에이트 폴리머 골격은 비-세포침투 단백질의 라이신, 아르기닌, 시스테인, 또는 히스티딘에 독립적으로 부착될 수 있다. 임의로, 각각의 포스포로티오에이트 핵산 또는 포스포로티오에이트 폴리머 골격은 단백질의 시스테인에 부착된다. 임의로, 단백질은 단백질의 라이신, 아르기닌, 시스테인, 히스티딘, 또는 이들의 조합 중 10%, 25%, 50%, 75%, 90%, 95%, 또는 100%에 부착된 포스포로티오에이트 핵산 또는 포스포로티오에이트 폴리머 골격을 포함한다.
상기에서 논의된 바와 같이, 핵산, 예를 들면, 포스포로티오에이트 핵산 또는 포스포로티에이트 폴리머 골격은 다양한 기전을 통해 비-세포침투 단백질에 부착될 수 있다. 포스포로티오에이트 핵산 또는 포스포로티오에이트 폴리머 골격은 비-세포침투 단백질에 공유부착적으로 또는 비-공유부착적으로 부착될 수 있다. 임의로, 복수의 포스포로티오에이트 핵산 또는 포스포로티오에이트 폴리머 골격이 단백질에 부착된 경우, 다수 중 각각은 단백질에 공유부착적으로 또는 비-공유부착적으로 부착될 수 있다. 임의로, 단백질은 공유부착적으로 및 비-공유부착적으로 부착된 포스포로티오에이트 핵산 또는 포스포로티오에이트 폴리머 골격을 포함한다. 임의로, 단백질은 공유부착적으로 부착된 포스포로티오에이트 핵산 또는 포스포로티오에이트 폴리머 골격을 포함하며, 비-공유부착적으로 부착된 포스포로티오에이트 핵산 또는 포스포로티오에이트 폴리머 골격을 포함하지 않는다. 임의로, 단백질은 비-공유부착적으로 부착된 포스포로티오에이트 핵산 또는 포스포로티오에이트 폴리머 골격을 포함하며 공유부착적으로 부착된 포스포로티오에이트 핵산 또는 포스포로티오에이트 폴리머 골격을 포함하지 않는다. 각각의 포스포로티오에이트 핵산 또는 포스포로티오에이트 폴리머 골격은 반응성 모이어티, 예를 들면, 포스포로티오에이트 핵산 또는 포스포로티오에이트 폴리머 골격의 비-세포침투 단백질로의 부착을 촉진하는, 아미노산 반응성 모이어티 또는 공유 반응성 모이어티를 함유할 수 있다. 따라서, 포스포로티오에이트 핵산 또는 포스포로티오에이트 폴리머 골격은 반응성 모이어티를 통해 단백질에 부착될 수 있다.
본원에 제공된 세포침투 콘주게이트는 부착되지 않은 비-세포침투 단백질을 부착되지 않은 포스포로티오에이트 핵산 또는 부착되지 않은 포스포로티오에이트 폴리머 골격과 접촉시켜 부착되지 않은 포스포로티오에이트 핵산 또는 부착되지 않은 포스포로티오에이트 폴리머 골격이 부착되지 않은 비-세포침투 단백질의 아미노산에 공유적으로 결합하여 상기 세포침투 콘주게이트를 형성하도록함으로써 제조될 수 있다. 세포침투 콘주게이트를 제조하는 맥락내에서 사용된 것으로서 용어 "부착되지 않은"의 사용은 콘주케이트의 부착 및 형성 전에 비-세포침투 단백질, 포스포로티오에이트 핵산 또는 포스포로티오에이트 폴리머 골격의 상태를 나타내기 위해 의도된다. 즉, 용어 "부착되지 않은"은, 비-세포침투 단백질, 포스포로티오에이트 핵산 또는 포스포로티오에이트 폴리머 골격이 유리되어 있고 세포침투 콘주게이트내에서 이들의 관련 형태와 비교하여 이들의 결합되지 않은 상태임을 나타낸다.
구현예에서, 포스포로티오에이트 핵산 또는 포스포로티오에이트 폴리머 골격은 공유 반응성 모이어티를 포함한다. 상기에서 기재된 바와 같이, 공유 반응성 모이어티는 단백질의 라이신, 아르기닌, 시스테인 또는 히스티딘(예를 들면, 아미노산 측쇄와)과 반응성일 수 있다. 구현예에서, 공유 반응성 모이어티는 시스테인과 반응성이다. 공유 반응성 모이어티는 비닐 설폰일 수 있다.
구현예에서, 본원에 제공된 세포침투 콘주게이트는 부착되지 않은 비-세포침투 단백질을 부착되지 않은 포스포로티오에이트 핵산 또는 부착되지 않은 포스포로티오에이트 폴리머 골격과 접촉시켜 부착되지 않은 포스포로티오에이트 핵산 또는 부착되지 않은 포스포로티오에이트 폴리머 골격이 부착되지 않은 비-세포침투 단백질에 결합하도록 하여 세포침투 콘주게이트를 접촉하고 형성함으로써 제조할 수 있다.
본원에 제공된 이러한 또는 다른 구현예에서, 포스포로티오에이트 핵산, 포스포로티오에이트 폴리머 골격, 부착되지 않은 포스포로티오에이트 핵산 또는 부착되지 않은 포스포로티오에이트 폴리머 골격은 식 -S-S-(CH2)z-OH(여기서, z는 1 내지 50, 1 내지 40, 1 내지 30, 1 내지 20, 1 내지 10 또는 1 내지 5의 정수이다)를 갖는 치환체를 포함할 수 있다. 변수 z는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10일 수 있다. 변수 z는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 또는 9일 수 있다. 변수 z는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8일 수 있다. 변수 z는 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7일 수 있다. 변수 z는 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6일 수 있다.
구현예에서, 부착되지 않은 포스포로티오에이트 핵산 또는 부착되지 않은 포스포로티오에이트 폴리머 골격이 비-세포침투 단백질과 접촉하는 경우, 당해 접촉은 환원 조건하에서 수행된다. 접촉은 또한 약 9.0, 8.5, 8.0, 7.9, 7.8, 7.7, 7.6, 7.5, 7.4, 7.3, 7.2, 7.1 또는 7.0 미만의 pH에서 수행될 수 있다. 구현예에서, pH는 8.0 미만이다. 구현예에서, pH는 7.9 미만이다. 구현예에서, pH는 7.8 미만이다. 구현예에서, pH는 7.7 미만이다. 구현예에서, pH는 7.6 미만이다. 구현예에서, pH는 7.5 미만이다. 구현예에서, pH는 7.4 미만이다. 구현예에서, pH는 7.3 미만이다. 구현예에서, pH는 7.2 미만이다. 구현예에서, pH는 7.1 미만이다. 구현예에서, pH는 7.0 미만이다. 구현예에서, 접촉은 환원 조건 및 약 8.0 미만(예를 들면, 약 7.9, 7.8, 7.7, 7.6, 7.5, 7.4, 7.3, 7.2, 7.1 또는 7.0)의 pH에서 수행된다.
구현예에서, 부착되지 않은 포스포로티오에이트 핵산 또는 부착되지 않은 포스포로티오에이트 폴리머 골격은 몰 과잉의 부착되지 않은 비-세포침투 단백질 속에(예를 들면, 접촉 시기에) 존재한다. 몰 과잉은 약 2 내지 100 배, 예컨대 약 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 1,6 17 ,18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 또는 100의 과잉일 수 있다. 구현예에서, 몰 과잉은 약 2 내지 90, 3 내지 80, 4 내지 70, 5 내지 60, 6 내지 50, 7 내지 40, 8 내지 30, 9 내지 30, 10 내지 30, 15 내지 25 또는 약 20이다. 구현예에서, 몰 과잉은 약 10, 20 또는 30이다. 구현예에서, 몰 과잉은 약 20이다. 구현예에서, 몰 과잉은 적어도 약 5이다. 구현예에서, 몰 과잉은 적어도 약 10이다. 구현예에서, 몰 과잉은 적어도 약 15이다. 구현예에서, 몰 과잉은 적어도 약 20이다.
본원에 제공된 어떠한 측면의 구현예에서, 포스포로티오에이트 핵산 또는 포스포로티오에이트 폴리머 골격은 식 S-S-R(여기서, R은 보호 그룹이다)을 갖는 반응성 모이어티를 포함한다. 임의로, R은 헥사놀(1가 치환체)이다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 헥사놀은 식 C6H13OH를 갖는 화합물을 포함하고 1-헥사놀, 2-헥사놀, 3-헥사놀, 2-메틸-1-펜타놀, 3-메틸-1-펜타놀, 4-메틸-1-펜타놀, 2-메틸-2-펜타놀, 3-메틸-2-펜타놀, 4-메틸-2-펜타놀, 2-메틸-3-펜타놀, 3-메틸-3-펜타놀, 2,2-디메틸-1-부탄올, 2,3-디메틸-1-부탄올, 3,3-디메틸-1-부탄올, 2,3-디메틸-2-부탄올, 3,3-디메틸-2-부탄올, 및 2-에틸-1-부탄올을 포함한다. 임의로, R은 1-헥사놀이다.
제공된 세포침투 콘주게이트는 비-세포침투 단백질을 포스포로티오에이트 핵산과 접촉시키고 포스포로티오에이트 핵산을 단백질에 결합하도록 함으로써 제조할 수 있다. 예로써, 제공된 세포침투 콘주게이트는 비-세포침투 단백질을 포스포로티오에이트 핵산과 접촉시키고 포스포로티오에이트 핵산이 단백질의 아미노산에 공유적으로 결합하도록 함으로써 제조할 수 있다. 임의로, 포스포로티오에이트 핵산은 반응성 모이어티를 포함한다. 예로써, 반응성 모이어티는 상기에서 기재된 바와 같이, 비닐 설폰 또는 식 S-S-R을 갖는 반응성 모이어티일 수 있다. 임의로, R은 헥사놀, 예를 들면, 1-헥사놀이다. 식 S-S-R의 반응성 모이어티를 갖는 예시적인 포스포로티오에이트 핵산은 도 19에 나타나 있으며 비닐 설폰 반응성 모이어티를 갖는 예시적인 포스포로티오에이트 핵산은 도 20에 나타나 있다. 접촉은 임의로, 환원 조건하에서 수행되지만 당해 분야의 숙련가에게 공지된 다른 조건하에서 수행될 수 있다. 임의로, 포스포로티오에이트 핵산은 몰 과잉의 비-세포침투 단백질 속에 존재한다.
임의로, 비-세포침투 단백질은 고분자량 단백질이다. 비-세포침투 단백질은 임의로 약 25 kD 초과의 분자량을 갖는다. 일부 구현예에서, 비-세포침투 단백질은 적어도 약 25 내지 적어도 약 750 kD의 분자량을 갖는다. 따라서, 비-세포침투 단백질은 적어도 약 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 205, 210, 215, 220, 225, 230, 235, 240, 245, 250, 255, 260, 265, 270, 275, 280, 285, 290, 295, 300, 305, 310, 315, 320, 325, 330, 335, 340, 345, 350, 355, 360, 365, 370, 375, 380, 385, 390, 395, 400, 405, 410, 415, 420, 425, 430, 435, 440, 445, 450, 455, 460, 465, 470, 475, 480, 485, 490, 495, 500, 505, 510, 515, 520, 525, 530, 535, 540, 545, 550, 555, 560, 565, 570, 575, 580, 585, 590, 595, 600, 605, 610, 615, 620, 625, 630, 635, 640, 645, 650, 655, 660, 665, 670, 675, 680, 685, 690, 695, 700, 705, 710, 715, 720, 725, 730, 735, 740, 745, 750, 또는 그 이상의 킬로달톤 (kD)의 분자량을 가질 수 있다. 임의로, 비-세포침투 단백질은 적어도 약 25 내지 100 kD, 적어도 약 25 내지 150 kD, 적어도 약 25 내지 200 kD, 적어도 약 25 내지 250 kD, 적어도 약 25 내지 300 kD, 적어도 약 25 내지 350 kD, 적어도 약 25 내지 400 kD, 적어도 약 25 내지 450 kD, 적어도 약 25 내지 500 kD, 적어도 약 25 내지 550 kD, 적어도 약 25 내지 600 kD, 적어도 약 25 내지 650 kD, 적어도 약 25 내지 700 kD 또는 적어도 약 25 내지 750 kD의 분자량을 갖는다.
임의로, 비-세포침투 단백질은 항체이다. 위에서 더 상세히 논의된 바와 같이, 항체는 전장 항체, 예컨대 IgG, IgA, IgM, IgD 또는 IgE 항체 또는 그것의 단편일 수 있다. 임의로, 항체는 IgG 항체 또는 그것의 단편일 수 있다. 임의로, 항체는 Fv 단편 또는 인간화된 항체일 수 있다. 따라서, 포스포로티오에이트 핵산 또는 폴리머 골격에 부착된 항체가 제공되며, 여기서 상기 포스포로티오에이트 핵산 또는 폴리머 골격은 세포내로 항체의 전달을 향상시킨다. 임의로, 항체는 치료적 항체, 즉, 질환의 치료시 사용된 항체이다. 따라서, 하나 이상의 포스포로티오에이트 핵산 또는 폴리머 골격에 부착된 치료적 항체가 또한 제공되며, 여기서 상기 항체는 세포내 표적에 결합한다.
임의로, 비-세포침투 단백질은 세포내 표적에 결합한다. 세포내 표적은 세포내 위치한 치료적 표적, 또는 진단 표적, 또는 기타 관심 표적, 예컨대 표적 또는 구조, 예를 들면 공초점 현미경검사로 영상화되는 예를 들면, 히스톤일 수 있다. 따라서, 세포내 표적에 결합된 세포침투 콘주게이트가 제공된다. 임의로, 세포내 표적은 자가면역 질환, 염증성 질환, 대사성 장애, 발달 장애, 심혈관 질환, 간 질환, 창자 질환, 감염성 질환, 내분비 질환, 신경적 장애, 및 암으로 구성된 군으로부터 선택된 질환의 표적이다. 질환의 표적은 질환과 연관된 진단성 표적 또는 치료적 표적 또는 기타 관신 표적일 수 있다. 예시적인 암의 세포내 표적은, 비제한적으로, STAT (예를 들면, STAT3), NFκB, PKB/Akt, Myc 패밀리 멤버, 스테로이드 호르몬 수용체 (예를 들면, 에스트로겐 수용체), 스테로이드 호르몬 수용체 리간드 (예를 들면, 사이클린 D1), 수용체 티로신 키나제 (RTKs), HER2, EGFR, VEGFR, PDGFR, Src 패밀리 멤버, Ras, Abl, BCR-Abl, NPM-Alk, 야누스 키나제 (JAKs), 부루튼(Brutun) 티로신 키나제 (BTK), 및 바이러스 종양단백질 (예를 들면, EBV 단백질, 또는 HPV 단백질, 예를 들면, E6 및 E7)를 포함한다. 임의로, 감염성 질환의 세포내 표적은 바이러스 단백질 또는 바이러스 전사체이다. 따라서, 세포내 표적은 인간 면역결핍 바이러스 (HIV), 인플루엔자 바이러스, 단순 포진 바이러스(cirus), 엡슈타인 바르 바이러스, 사이토메갈로바이러스, 인간 유두종 바이러스, 또는 간염 바이러스의 바이러스 단백질 또는 바이러스 전사체일 수 있다. 임의로, 세포내 표적은 비제한적으로, 전사 인자, 전사 인핸서, 전사 억제인자, 히스톤 또는 번역후 개질된 히스톤을 포함하는 DNA 부착 단백질이다. 임의로, 세포내 표적은 후생유전적으로 개질된 DNA, 예를 들면, 메틸화된 또는 하이드록시메틸화된 시토신 (5mC 또는 5hmC), 5-포르밀시토신 (5fC) 및 5-카복실시토신 (5caC)이다. 임의로, 세포내 표적은 핵산, 예를 들면, RNA 전사체 또는 핵산이다. 예를 들면, 세포내 표적은 감염성 병원체, 예를 들면, 기생충, 바이러스 또는 박테리아의 핵산이다. 임의로, 세포내 표적은 신호전달 분자 또는 전사 인자이다. 임의로, 신호전달 분자는 포스파타제 또는 키나아제이다. 임의로, 세포내 표적은 암 세포 내에 위치한 암 표적이다. 임의로, 세포내 표적은 STAT, 예를 들면, STAT3 또는 엑스포틴 7이다. 임의로, 비-세포침투 단백질은 추가로, 상기 단백질에 부착된 표지, 소분자 또는 기능적 핵산을 포함할 수 있다.
포스포포스포로티오에이트 핵산 또는 포스포로티오에이트 폴리머 골격에 부착된 비-세포침투 단백질을 포함하는 복수의 세포침투 콘주게이트가 제공되며, 여기서 상기 포스포로티오에이트 핵산 또는 포스포로티오에이트 폴리머 골격은 비-세포침투 단백질의 세포내 전달을 향상시킨다. 포스포로티오에이트 핵산 또는 포스포로티오에이트 폴리머 골격은 비-세포침투 단백질에 공유부착적으로 또는 비-공유부착적으로 부착된다. 임의로, 상기 복수는 공유부착적으로 부착된 포스포로티오에이트 핵산 또는 포스포로티오에이트 폴리머 골격을 포함하며, 비-공유부착적으로 부착된 포스포로티오에이트 핵산 또는 포스포로티오에이트 폴리머 골격을 포함하지 않는다. 임의로, 포스포로티오에이트 핵산 또는 포스포로티오에이트 폴리머 골격은 성가 바-세포침투 단백질에 공유부착적으로 부착되며, 상기 복수는 비-공유부착적으로 부착된 포스포로티오에이트 핵산 또는 포스포로티오에이트 폴리머 골격을 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, 상기 복수는 비-공유부착된 포스포로티오에이트 핵산 또는 포스포로티오에이트 폴리머 골격을 포함하는 하나 이상의 상기 단백질 및 공유부착된 포스포로티오에이트 핵산 또는 포스포로티오에이트 폴리머 골격을 포함하는 하나 이상의 상기 단백질을 포함한다. 따라서, 상기 복수는 비-공유적으로 및 공유적으로 부착된 포스포로티오에이트 핵산 또는 포스포로티오에이트 폴리머 골격을 포함하는 단백질을 포함할 수 있다. 게다가, 각각의 콘주게이트는 비-공유적으로 및/또는 공유적으로 부착된 포스포로티오에이트 핵산 또는 포스포로티오에이트 폴리머 골격을 포함하는 단백질을 포함할 수 있다.
제공된 세포침투 콘주게이트 중 하나 이상을 포함하는 세포가 제공되고, 예를 들면, 상기 세포는 복수의 세포침투 콘주게이트를 포함한다. 임의로, 상기 콘주게이트는 세포 내에서 세포내 표적에 결합된다. 예로써, 상기 세포는 하나 이상의 포스포로티오에이트 핵산 또는 폴리머 골격에 부착된 제1 비-세포침투 단백질 및 제2 비-세포침투 단백질을 포함할 수 있다. 상기 제1 및 제2 비-세포침투 단백질은 세포 내에서 세포내 표적에 결합될 수 있다. 임의로, 제2 비-세포침투 단백질은 상기 제1 비-세포침투 단백질과 비교하여 세포내 표적 상에 상이한 에피토프에 결합한다. 임의로, 제2 비-세포침투 단백질은 제2 세포내 표적에 결합한다. 임의로, 제1 및/또는 제2 비-세포침투 단백질은 항체이다. 따라서, 상기 제1 및 제2 비-세포침투 단백질은 동일한 단백질 또는 상이한 단백질일 수 있다.
세포침투 콘주게이트 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약제학적 조성물이 본원에 제공된다. 상기 제공된 조성물은 임의로 시험관내 또는 생체내 제형 및 투여를 위해 적합하다. 적합한 담체 및 이들의 제형은 문헌[참조: Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21st Edition, David B. Troy, ed., Lippicott Williams & Wilkins (2005). 약제학적으로 허용되는 담체란 생물학적으로 또는 다른 목적하지 않는 것이 아닌 물질을 의미하고, 즉, 상기 물질은 목적하지 않은 생물학적 효과를 유발하지 않거나 이것이 함유된 약제학적 조성물의 다른 성분과 해로운 방식으로 상호작용하는 것 없이 대상체에게 투여된다. 대상체에 투여되는 경우, 상기 담체는 임의로 활성 성분의 분해를 최소화하고 대상체내 부작용을 최소화하기 위해 선택된다.
제공된 조성물은 단일 제제 또는 1 초과의 제제를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 조성물은 하나 이상의 포스포로티오에이트 핵산 또는 폴리머 골격에 부착된 제2 비-세포침투 단백질을 추가로 포함한다. 따라서, 상기 세포는 하나 이상의 포스포로티오에이트 핵산 또는 폴리머 골격에 부착된 제1 비-세포침투 단백질 및 제2 비-세포침투 단백질을 포함하는 제1 세포-침투 콘주게이트를 포함하는 조성물이 본원에 제공된다. 임의로, 제2 비-세포침투 단백질은 세포내 표적에 결합한다. 임의로, 제2 비-세포침투 단백질은 상기 제1 비-세포침투 단백질과 비교하여 세포내 표적 상에 상이한 에피토프에 결합한다. 임의로, 제2 비-세포침투 단백질은 제2 세포내 표적에 결합한다. 임의로, 제1 및/또는 제2 비-세포침투 단백질은 항체이다. 상기 제1 및 제2 비-세포침투 단백질은 동일한 단백질 또는 상이한 단백질일 수 있다.
투여용 조성물은 통상적으로 약제학적으로 허용되는 담체, 바람직하게는 수성 담체 중에 용해된 본원에 기재된 바와 같은 제제를 포함한다. 다양한 수성 담체, 예를 들어, 완충 식염 수 등이 사용될 수 있다. 이들 용액은 멸균성이고 일반적으로 목적하지 않는 문제점이 없다. 이들 조성물은 통상의 널리 공지된 멸균 기술에 의해 멸균될 수 있다. 상기 조성물은 pH 조정 및 완충제, 독성 조정제 등과 같이 대략적인 생리학적 조건에 요구되는 바와 같은 약제학적으로 허용되는 보조 물질, 예를 들어, 나트륨 아세테이트, 염화나트륨, 염화칼륨, 염화칼슘, 나트륨 락테이트 등을 함유할 수 있다. 이들 제형 중에 활성제의 농도는 광범위하게 다양할 수 있고 선택된 특정 투여 방식 및 대상체의 필요성에 따라 주로 유체 용적, 점도, 체중 등을 기준으로 선택된다.
유리 염기 또는 약제학적으로 허용되는 염으로서 활성 화합물의 용액은 하이드록시프로필셀룰로스와 같은 계면활성제와 적합하게 혼합된 물 중에서 제조될 수 있다. 분산제는 또한 글리세릴, 액체 폴리에틸렌 글리콜 및 이의 혼합물 중에서 및 오일 중에서 제조될 수 있다. 통상적인 보관 및 사용 조건하에서, 이들 제제는 미생물의 성장을 예방하기 위한 보존제를 함유할 수 있다.
약제학적 조성물은 비강내 또는 흡입성 용액 또는 스프레이, 에어로졸 또는 흡입제를 통하여 전달될 수 있다. 점비액은 액적 또는 스프레이로 비강으로 투여되도록 설계된 수용액일 수 있다. 점비액은 그들이 코 분비에 대한 많은 측면에서 유사하도록 제조될 수 있다. 따라서, 수성 점비액은 보통 pH 5.5 내지 6.5를 유지하도록 등장성이고 경도로 완충된다. 또한, 필요하다면, 안과 제조물 및 적절한 약물 안정제에 사용된 것들과 유사한 항미생물 보존제가 제형에 포함될 수 있다. 다양한 상업적 코 제조물이 공지되어 있으며, 예를 들면, 항생제 및 항히스타민제를 포함한다.
경구 제제는 예를 들어, 약제학적 등급의 만니톨, 락토스, 전분, 마그네슘 스테아레이트, 나트륨 사카린, 셀룰로스, 탄산마그네슘 등과 같은 부형제를 포함할 수 있다. 이들 조성물은 용제, 현탁제, 정제, 환제, 캅셀제, 지연 방출 제형 또는 산제 형태를 취한다. 일부 양태에서, 경구 약제학적 조성물은 불활성 희석제 또는 동화성 식용 담체를 포함하거나 이들은 경질 또는 연질 쉘 겔라틴 캅셀에 내포될 수 있거나 이들은 정제로 타정되거나 이들은 직접 식이 음식물에 혼입될 수 있다. 경구 치료학적 투여를 위해, 상기 활성 화합물은 부형제와 함께 혼입될 수 있고 섭취가능한 정제, 협측 정제, 트로키제, 캡슐, 엘릭시르, 현탁제, 시럽, 웨이퍼제 등의 형태로 사용될 수 있다. 상기 조성물 및 제제는 적어도 0.1%의 활성 화합물을 함유해야 한다. 조성물 및 제제의 %는 물론 다양할 수 있고 간편하게 유니트 중량의 약 2 내지 약 75%, 또는 바람직하게 25 내지 60%일 수 있다. 상기 조성물 중 활성 화합물의 양은 적합한 용량이 수득될 수 있도록 하는 것이다.
수용액 중 비경구 투여를 위해, 예를 들어, 상기 용액은 적합하게 완충되어야만 하고 액체 희석제는 처음에 충분한 식염수 또는 글루코스와 등장성이 되게 한다. 수용액, 특히, 멸균 수성 매질은 특히 정맥내, 근육내, 피하 및 복강내 투여를 위해 적합하다. 예를 들어, 하나의 용량은 1ml의 등장성 NaCl 용액 중에 용해시킬 수 있고 경막외강 유체 1000ml에 부가되거나 제안된 주입 부위에 주사된다.
멸균성 주사용 용액은 적당한 용매 중에 요구되는 양으로 활성 화합물 또는 작제물을 혼입함에 의해 이어서 여과 멸균함에 의해 제조될 수 있다. 일반적으로, 분산제는 다양한 멸균 활성 성분을 염기성 분산 매질을 함유하는 멸균 비히클에 혼입시킴에 의해 제조된다. 활성 성분 및 임의의 추가의 목적하는 성분의 산제를 생성시키는 진공 건조 및 동결 건조 기술을 사용하여 멸균 주사가능한 용액의 재구성을 위해 멸균 산제를 제조할 수 있다. 직접 주사를 위한 보다 농축되거나 고도로 농축된 용액의 제제가 또한 고려된다. DMSO는 극히 신속한 침투를 위해 용매로서 사용될 수 있고 고농도의 활성 제제를 작은 영역으로 전달한다.
화합물의 제형은 단위 용량 또는 다중 용량 밀봉된 컨테이너, 예를 들어, 앰푸울 및 바이엘에 제공될 수 있다. 따라서, 상기 조성물은 단위 용량 형태로 존재할 수 있다. 상기 형태에서, 상기 제제는 적당한 양의 활성 성분을 함유하는 단위 용량을 세분된다. 따라서, 상기 조성물은 투여 방법에 따라 다양한 단위 용량 형태로 투여될 수 있다. 예를 들어, 경구 투여를 위해 적합한 단위 용량 형태는 산제, 정제, 환제, 캡슐 및 로젠지를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
조성물은 당해 기술에 공지된 절차를 채용함으로써 투여 후 빠르거나, 지속되거나 또는 지연된 방출을 제공하도록 제형화될 수 있다. 특정 담체는 예를 들면, 투여된 조성물의 투여 경로 및 농도에 따라 더욱 바람직할 수 있다. 제공된 조성물 내에 사용되기 위한 적절한 제형은 하기에서 발견할 수 있다: Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21st Edition, David B. Troy, ed., Lippicott Williams & Wilkins (2005).
하나 이상의 제공된 콘주게이트 및/또는 조성물 및 사용 설명서를 포함하는 키트가 본원에 제공된다. 따라서, 콘주게이트 및 사용설명서를 포함하는 하나 이상의 세포침투 콘주게이트 또는 약제학적 조성물을 포함하는 키트가 제공된다. 일부 구현예에서, 상기 키트는 하나 이상의 포스포로티오에이트 핵산 또는 폴리머 골격에 부착된 제2 비-세포침투 단백질을 추가로 포함한다. 임의로, 제2 비-세포침투 단백질 개별 용기 내에 있다. 임의로, 본 키트는 제1 세포침투 콘주게이트 및 제2 세포침투 콘주게이트를 포함한다. 임의로, 제1 및 제2 비-세포침투 콘주게이트는 개별 용기 내에 있다. 임의로, 제2 세포침투 콘주게이트의 제2 비-세포침투 단백질은 상기 제1 비-세포침투 단백질과 비교하여 세포내 표적 상에 상이한 에피토프에 결합한다. 임의로, 제2 비-세포침투 단백질은 제2 세포내 표적에 결합한다. 제2 비-세포침투 단백질은 제2 비-세포침투 단백질 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약제학적 조성물로서 제형화된다. 임의로, 제2 비-세포침투 단백질는 항체이다. 임의로, 본 키트는 질환의 하나 이상의 증상을 치료 또는 예방하기 위한 하나 이상의 추가 제제를 포함한다. 임의로, 본 키트는 조성물의 투여 수단, 예컨대, 예를 들면, 주사기, 바늘, 튜우빙, 카테터, 패치, 등을 포함한다. 상기 키트는 또한 상기 제형 및/또는 멸균을 요하는 물질 및/또는 사용전 희석을 포함할 수 있다.
비-세포침투 단백질을 세포로 전달하는 방법으로서, 세포침투 단백질과 접촉시키는 단계를 포함하는, 방법이 제공된다. 상기 세포침투 콘주게이트는 포스포로티오에이트 핵산 또는 폴리머 골격에 부착된 제2 비-세포침투 단백질을 포함한다. 포스포로티오에이트 핵산 또는 폴리머 골격은비-세포침투 단백질의 세포내 전달을 향상시킨다. 상기 비-세포침투 단백질은 상기 세포질 내의 핵 단백질에 결합하여, 이로써 비-세포침투 단백질-핵 단백질 복합체를 형성한다. 상기 비-세포침투 단백질-핵 단백질 복합체는 상기 세포 핵으로 진입할 수 없다.
임의로, 상기 세포침투 콘주게이트는 대상체에서의 질환을 진단하는데 사용된다. 따라서, 대상체에서 질환을 진단하는 방법이 제공되며, 이는 본원에 기재된 바와 같은 세포침투 콘주게이트를 포함하는 세포침투 콘주게이트 또는 조성물의 효과적인 양을 상기 대상체에 투여하는 단계를 포함한다. 콘주게이트의 투여는 상기 대상체에서 질환 또는 상기 질환의 하나 이상의 증상을 진단한다. 개시된 방법은 바이오마커의 수준 또는 활성을, 예를 들면, 시험 샘플로부터의 질환의 세포내 표적을 대조군 샘플과 비교하는 단계를 포함한다. 상기에서 논의된 바와 같이, 대조군 샘플 또는 값은 표준, 일반적으로 시험 샘플과 비교하기 위해 공지된 표준으로서 작용하는 샘플을 지칭한다. 대조군은 또한 주어진 질환을 가지지 않은 유사한 개인(즉, 표준 대조군 집단), 예를 들면, 유사한 의료 배경, 동일한 연령, 체중 등을 지닌 건강한 개인의 집단으로부터 수집한 평균 측정 또는 값을 나타낸다. 대조군 값은 또한 동일한 개인, 예를 들면, 질환 개시 전 환자로부터 조기-수득된 샘플로부터 수득될 수 있다. 상기 논의된 바와 같이, "진단"은 질환(예를 들면, 자가면역, 염증성 자가면역, 암, 감염성, 면역, 또는 기타 질환)이 상기 시험대상자에 존재하는 상대적인 개연성을 말한다.
질병 위험 인자의 측정에 대해 참고하여, 용어 비교하는 것, 관련짓는 것, 및 연관짓는 것은 개체 내에서 위험 인자의 존재 및 양 (예를 들면, 질환의 세포내 표적의 양)을 질환으로 고통받는 것으로 알려지거나, 이의 위험에 처해 있는 것으로 알려지고나, 이의 질환이 없는 것으로 알려진 개인 내의 이의 존재 또는 양과 비교하는 것; 및 검정 결과(들)에 기반하여 개체에 상기 질환을 갖고/발병하는 증가 또는 감소된 가능성을 배정하는 것을 지칭한다.
세포 내에 세포내 표적을 검출하는 방법이 본원에 제공되며, 상기 방법은 상기 세포를, 세포침투 콘주게이트에 접촉시키는 단계 및 상기 세포침투 콘주게이트의 상기 세포내 표적의 결합을 검출하는 단계를 포함하고, 여기서 상기 세포침투 콘주게이트는 포스포로티오에이트 핵산에 부착된 비-세포침투 단백질을 포함하고, 상기 포스포로티오에이트 핵산은 비-세포침투 단백질의 세포내 전달을 향상시킨다. 상기 세포는 고정 세포 또는 생존 세포일 수 있다. 임의로, 상기 세포는 시험관내 또는 생체내에 위치할 수 있다. 결합은 직접적으로 또는 간접적으로 검출될 수 있다. 수많은 방법이 세포침투 콘주게이트의 세포내 표적으로의 결합을 검출하는데 사용될 수 있다는 것이 이해되고 고려된다. 예를 들면, 결합은 직접적으로 세포침투 콘주게이트 및 그것의 세포내 표적 사이의 커플링을 검정함으로써 직접적으로 검출될 수 있다. 결합은, 예를 들면, 하기 기술된 바와 같이, 공면역침강 검정, 공국지화 검정, 또는 형광 극성화 검정으로 구성된 군으로부터의 검정을 선택함으로써 측정될 수 있다. 검정은 본 분야에 잘 알려져 있으며, 예를 들면 다음을 참고: Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Ed., Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY (2001); Dickson, Methods Mol. Biol. 461:735-44 (2008); Nickels, Methods 47(1):53-62 (2009); and Zinchuk et al., Acta Histochem. Cytochem. 40(4):101-11 (2007).
임의로, 결합은 영상화 방법 또는 시스템에 의하여 측정된다. 따라서, 제공된 세포침투 콘주게이트는 세포내 표적 수준 및/또는 활성을 분석하기 위하여 영상화 적용 또는 기타 응용에서 사용된다. 예를 들면, 제공된 세포침투 콘주게이트 관심 세포내 표적의 시험관내 또는 생체내 영상화를 위하여 사용될 수 있다. 임의로, 세포침투 콘주게이트는 생존 세포 영상화를 위하여 사용된다. 예를 들면, 생존 세포 영상화는 살아있는 세포 내 세포내 표적 분포 및/또는 동력학을 모니터링하기 위하여 사용될 수 있으며, 이는 또한 표적 상호작용을 모니터링하는데 응용가능하다. 예를 들면, 세포침투 콘주게이트는 세포 내, 임의로, 살아있는 세포 내에서 단백질-단백질 상호작용을 연구하기 위하여 면역침강 및 공-면역침강 검정에서 사용될 수 있다. 임의로, 세포침투 콘주게이트는 유세포측정에 의한 세포내 표적 분석을 위하여 사용될 수 있다. 영상화 적용에서, 세포침투 콘주게이트는, 임의로, 사용된 응용에 적절하도록 임의로 표지된다. 상기 기재된 바와 같이, "표지" 또는 "검출가능한 모이어티"는 분광, 광화학적, 생화학적, 면역화학적, 화학적, 또는 기타 물리적 수단에 의하여 검출가능한 조성물이다. 유용한 표지는, 예를 들면, 방사선표지를 표적 펩타이드와 특이적으로 반응성인 펩타이드 또는 항체에 편입시킴으로써 검출가능하게 제조될 수 있는, 32P, 형광성 염료, 전자 치밀 시약, 효소 (예를 들면, ELISA 통상적으로 사용된 바와 같은), 바이오틴, 디곡시제닌, 또는 합텐 및 단백질 또는 기타 독립체를 포함한다. 표지에 항체를 콘주게이트하기 위한 당해분야에 공지된 임의의 방법이 예를 들면 Hermanson, Bioconjugate Techniques 1996, Academic Press, Inc., San Diego에 기술된 방법을 사용하여 채용될 수 있다.
임의로, 본원에 기재된 세포침투 콘주게이트 및 상기 세포침투 콘주게이트를 포함하는 조성물은 예방학적 및 치료학적 치료 둘다를 위해 유용하다. 예방학적 사용을 위해, 본원에 기재된 치료학적 유효량의 제제들은 조기 발병 전 또는 동안에(예를 들어, 자가 면역 질환의 초기 징후 및 증상시) 대상체에게 투여된다. 치료학적 치료는 질환의 진단 또는 발병 후 본원에 기재된 치료학적 유효량의 제제를 대상체에게 투여함을 포함한다.
따라서, 대상체에서 질환을 치료하는 방법이 제공되며, 이는 본원에 기재된 바와 같은 세포침투 콘주게이트를 포함하는 세포침투 콘주게이트 또는 조성물의 효과적인 양을 상기 대상체에 투여하는 단계를 포함한다. 콘주게이트의 투여는 상기 대상체에서 질환 또는 상기 질환의 하나 이상의 증상을 치료한다.
임의로, 상기 방법은 하나 이상의 포스포로티오에이트 핵산에 부착된 제2 비-세포침투 단백질을 상기 대상체에 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 임의로, 이 방법은 포스포로티오에이트 핵산 또는 폴리머 골격에 부착된 제1 비-세포침투 단백질을 포함하는 제1 콘주게이트 및 포스포로티오에이트 핵산 또는 폴리머 골격에 부착된 제2 비-세포침투 단백질을 포함하는 제2 콘주게이트를 포함한다. 임의로, 제2 비-세포침투 단백질은 상기 제1 비-세포침투 단백질과 비교하여 세포내 표적 상에 상이한 에피토프에 결합한다. 임의로, 제2 비-세포침투 단백질은 제2 세포내 표적에 결합한다. 상기 제1 및 제2 콘주게이트 동시에 또는 순차적으로 투여될 수 있다. 임의로, 제2 비-세포침투 단백질는 항체이다. 임의로, 상기 질환은 자가면역 질환, 발달 장애, 염증성 질환, 대사성 장애, 심혈관 질환, 간 질환, 창자 질환, 감염성 질환, 내분비 질환, 신경적 장애, 및 암로 이루어진 군으로부터 선택된다. 임의로, 상기 질환은 암이다. 상기 콘주게이트의 비-세포침투 단백질은 세포내 표적에 결합하고, 상기 세포내 표적은 엑스포틴 7에 결합한다. 임의로, 제1 비-세포침투 단백질은 STAT3에 특이적으로 결합하는 항체이고, 상기 제2 비-세포침투 단백질은 엑스포틴 7에 결합하는 항체이다. 상기 콘주게이트의 비-세포침투 단백질은 STAT3에 특이적으로 결합하는 항체이며, 상기 제2 비-세포침투 단백질은 STAT3의 또다른 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체이다.
제공된 치료 방법에서, 치료될 질환에 적합한 추가의 치료제가 사용될 수 있다. 따라서, 일부 구현예에서, 상기 제공된 방법은 상기 대상체에 제2 치료제를 추가로 포함한다. 적합한 추가의 치료제는, 비제한적으로, 치료제를 포함하고, 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된다: 진통제, 마취제, 강장제, 코르티코스테로이드, 항콜린성 제제, 항콜린에스테라아제, 항경련제, 항신생물성 제제, 알로스테릭 억제제, 단백동화 스테로이드, 항-류마티스성 제제, 심리치료적 제제, 신경 차단제, 항-염증제, 구충제, 항생제, 항응고제, 항진균제, 항히스타민제, 항무스카린 제제, 항마이코박테리아제, 항-원생생물 제제, 항바이러스제, 도파민작용성, 혈액 제제, 면역학적 제제, 무스카린성, 프로테아제 억제제, 비타민, 성장 인자, 및 호르몬 . 제제 및 투여량의 선택은 당해분야의 숙련가에 의하여 치료될 소정의 질병에 기반하여 용이하게 측정될 수 있다.
병용되는 제제 또는 조성물은 일시에(예를 들어, 혼합물로서), 별도이지만 동시에 (예를 들어, 별도의 정맥선을 통해) 또는 후속적으로(예를 들어, 하나의 제제가 먼저 투여되고 이어서 제2 제제가 투여된다) 투여될 수 있다. 따라서, 상기 용어 병용은 2개 이상의 제제 또는 조성물의 일시, 동시 또는 후속적 투여를 지칭하기 위해 사용된다. 치교 과정은 상기 대상체의 특정 특성 및 선택된 치료에 유형에 따라 개별적인 기초에 따라 최적 결정된다. 치료, 예컨대 본원에 개시된 바와 같은 것들은 매일, 1일 2회, 격주, 매달 또는 치료적으로 효과적인 임의의 적용 가능한 기초 상에서 상기 대상체에 투여될 수 있다. 상기 치료는 본원에 개시되거나 당해 기술에 공지된 바와 같은 임의의 다른 치료와 병용하여, 또는 단독으로 투여될 수 있다. 추가의 치료는 제1 치료와 상이한 시간에, 또는 완전히 상이한 치료 일정 상에서 동시에 투여될 수 있다 (예를 들면, 제1 치료는 매일일 수 있고, 한편 추가의 치료는 매주일 수 있다).
본원에 제공된 방법에 따라서, 상기 대상체에게 본원에 제공된 하나 이상의 상기 제제의 효과적인 양이 투여된다. 용어들 효과적인 양 및 효과적인 투여량은 상호교환적으로 사용된다. 용어 효과적인 양은 원하는 생리적 반응 (예를 들면, 염증의 감소)을 생성하기 위하여 필요한 임의의 양으로서 정의된다. 제제의 투여를 위한 효과적인 양 및 일정은 당해분야의 숙련가에 의하여 실험적으로 결정될 수 있다. 투여를 위한 투여 범위는, 질환 또는 장애의 하나 이상의 증상이 영향받는 (예를 들면, 감소된 또는 지연된) 원하는 효과를 생성하기에 충분히 큰 것을이다. 투여량은 실질적인 불리한 부작용, 예컨대 원치않는 교차-반응, 과민성 반응, 등을 야기하기에 너무 크지 않아야 한다. 일반적으로, 투여량은 연령, 병태, 성별, 질환의 유형, 질환 또는 장애의 정도, 투여 경로, 또는 다른 약물이 레지멘에 포함되었는지 여부에 따라 달라질 수 있으며, 이는 당해 분야의 숙련가에 의하여 결정될 수 있다. 복용량은 임의의 사용금지사유가 있을 경우에는 개별 의사에 의해 조정될 수 있다. 복용량은 가변적일 수 있으며, 1일 또는 며칠 동안 매일 1회 또는 그 이상의 용량 투여로 투여될 수 있다. 안내 사항은 의약품의 소정의 분류에 대한 적절한 복용량에 대한 문헌에서 발견될 수 있다. 예를 들어, 소정의 파라미터에 대해, 유효량은 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 40%, 50%, 60%, 75%, 80%, 90%, 또는 적어도 100%의 증가 또는 감소를 보여준다. 효능은 또한 "배수" 증가 또는 감소로서 표현될 수 있다. 예를 들어, 치료학적 유효량은 대조군에 비해 적어도 1.2-배, 1.5-배, 2-배, 5-배 이상의 효과를 가질 수 있다. 정확한 용량 및 제형은 치료 목적에 의존할 것이며, 공지된 기술(참고: 예를 들면, Lieberman, Pharmaceutical Dosage Forms(vols. 1-3, 1992); Lloyd, The Art, Science and Technology of Pharmaceutical Compounding (1999); Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th Edition, Gennaro, Editor (2003), and Pickar, Dosage Calculations (1999)).
이를 위해 사용될 수 있거나 이와 연계하여 사용될 수 있거나 이에 대한 제제 중에 사용될 수 있는 물질, 조성물 및 성분들 및 기재된 방법의 생성물 및 조성물이 기재되어 있다. 이들 및 다른 물질은 본원에 기재되어 있고 이들 물질의 조합, 서브세트, 상호작용, 그룹 등이 기재되어 있고 각각의 다양한 개별 및 총체적 조합 및 이들 제제의 치환에 대한 특정 지칭이 명백히 기재되지 않을 수 있고 각각은 구체적으로 고려되고 본원에 기재된 것으로 이해된다. 예를 들어, 방법이 기재된 경우 및 논의된 경우 및 상기 방법을 포함하는 다수의 분자에게 부가될 수 있는 다수의 변형이 논의되는 경우각각 및 모든 조합 및 방법의 치환, 및 가능한 변형은 달리 반대로 지적되지 않는 경우 구체적으로 고려된다. 마찬가지로, 이들의 임의의 서브세트 또는 조합이 고려되고 기재된다. 이러한 개념은 상기된 조성물을 사용하는 방법에서의 단계를 포함하지만 이에 제한되지 않는 상기 기재된 모든 측면에 적용된다. 따라서, 수행될 수 있는 다양한 추가의 단계가 존재하는 경우, 이들 추가의 단계들 각각은 임의의 특정 방법 단계 또는 기재된 방법의 방법 단계의 조합으로 수행될 수 있고 상기 각각의 조합 또는 조합의 서브세트는 구체적으로 고려되고 기재된 것으로 고려되어야 한다.
본원에 인용된 공보 및 이들이 인용된 자료는 이들의 전문이 본원에 구체적으로 인용된다.
다수의 양태가 기재되어 있다. 그럼에도 불구하고 다양한 변형이 만들어 질 수 있는 것으로 이해된다. 따라서, 다른 양태는 특허청구범위내에 있다.
실시예
실시예 1. 세포-침투 항체에 의한 핵 전사 인자 STAT3의 불활성화
이하에서 더 상세히 기재된 바와 같이, 항체에 의한 복합체내 단백질 또는 2개의 단백질의 2개의 별개의 부분을 동시에 표적화하는 것이 세포질내에서 핵 단백질을 보유함이 본원에서 입증된다. 엑스포틴 7은 STAT3 핵세포질 셔틀링을 매개하는 필수적인 단백질로서 확인되었다. STAT3 및 엑스포틴 7 항체의 세포내 전달은 세포질내에서 STAT3 핵세포질 셔틀링, 트랩핑 STAT3을 효과적으로 방지한다. 시험관내 및 생체내에서 항체의 효율적인 세포침투를 허용하는 기술이 개발되었다. 특이적으로, 항체에 대한 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오타이드의 부착은 효율적인 항체 세포성 내재화 및 표적 인식을 가능하도록 한다. 개질된 STAT3/엑스포틴 7 항체의 국소 및 전신계 전달 둘 다는 종양내에서 STAT3 활성을 효과적으로 억제하여, 다양한 모델에서 종양 세포 세포자멸사 및 종양 퇴행을 생성한다. 당해 기술은, 항체가 핵 전사 인자를 포함하는 세포내 분자를 표적화하는 것이 가능하도록 한다.
물질 및 방법
살아 있는 세포에서 STAT3-GFP의 국재화는 LSM 510 메타 도립 현미경(Meta Inverted microscope)(제조원: 독일 예나 소재의 Zeiss)을 사용하여 영상화하고 분석하였으며 iFLAP 영상화를 생성하는 표백 실험은 기술된 바와 같이 수행하였다(참조: Herrmann et al., J. Cell Science 120:3249-3261 (2007)). 간단히, STAT3-CFP-YFP 융합 단백질의 YFP 및 CFP 방출 신호는 동등하게 증폭되었다. λ = 514 nm 레이저 라인을 사용하여, 융합 단백질의 YFP 잔기를 수개의 라운드에 대해 표백시키고, 이미지 취득에 의해 차단시켰다. 후-취득 절차에서, 알고리즘/=1-/YFP//CFP을 수집된 이미지에 적용시켜 시간의 함수로서 STAT3-CFP-YFP의 공간 분포를 생성하였다. 종양 단면을 이전에 기재된 바와 같이 간접적인 면역형광을 위한 프로토콜을 사용하여 염색하였다(참고: Herrmann et al., Cancer Res. 70:7455-7464 (2010)).
세포 배양에서 STAT3(참고: Santa Cruz, sc-482, Dallas, TX), 엑스포틴 7(참고: Santa Cruz, sc-98639, Dallas, TX), 또는 GFP(참고: Rockland, Gilbertsville, PA)에 대한 항체의 전달은 제조자의 설명서에 따라 지질 캐리어 시스템을 사용하여 달성하였다(참고: GenLantis, BP509604, San Diego, CA). 지질 캐리어(GenLantis, BP509604, 캘리포니아주 샌 디에고 소재) 또는 STAT3 및 엑스포틴 7 각각에 대한 올리고뉴클레오타이드 개질된 항체와의 복합체 중 10μg의 총용량의 면역글로불린을 각각의 치료를 위해 투여하였다.
항체에 대한 올리고의 콘주게이션. 올리고뉴클레오타이드(200-300 nmol)를 30-몰 과잉의 TCEP(400μL, 5 mM TEAA, pH 6.8)에 의해 실온에서 아르곤 하에 2시간 동안 환원시키고 역 상 크로마토그래피(PRP1, 5mM TEAA 내지 95% MeOH로부터의 선형 구배로 30분에 걸쳐)로 정제하였다. 티올 보호 그룹의 제거는 질량-분광분석법(LTQ FT, Thermo)에 이어 동결건조로 확인하였다. 환원된 올리고뉴클레오타이드를 0.5mL의 물/DMSO(4:1) 속에 재용해시키고, 25-배 과잉의 비닐 설폰을 부가하고, pH를 8.5로 조정하고, 3시간 동안 실온에서 아르곤 하에 반응시키고, 역상 HPLC(위에서와 같이)로 정제하고, 정확한 생성물을 질량-분광분석법으로 확인하고 샘플을 동결건조시켰다. 다클론성 IgG(1.6mg, PBS 속에서 48시간 동안 투석시킴)를 PBS 속에서 2 시간 동안 37℃에서 아르곤 하에 30-몰 과잉의 TCEP로 환원시켰다. 과잉의 TCEP(Zeba 스핀 칼럼, Thermo; 2,000rpm에서 2분)를 제거한 후, 감소된 항체를 20-몰 과잉의 VS-올리고뉴클레오타이드와 pH 7.5에서 아르곤 하에 밤새 반응시켰다. 성공적인 올리고-대-항체-콘주게이션을, 비콘주게이트된 항체를 콘주게이트된 항체와 비교함으로써 IEF 겔 전기영동(pH 3-9, 제조원: GE Health Sciences, 펜실베니아주 피츠버그 소재)으로 확인하였다.
생존 세포 영상화 및 면역형광성. STAT3-GFP 또는 STAT3-CFP-YFP를 과발현하는 세포를 유리 바닥 세포 배양 접시(제조원: MatTek, 매사추세츠주 애쉬랜드 소재) 속에서 성장시켰다. 온도조절장치-조절된 및 CO2 조절된 조건하에서 생존 세포 속에서 STAT3의 국재화를 LSM 510 메타 도립 현미경(제조원: Zeiss, 독일 예나 소재)을 사용하여 분석하였다. 핵산을 Hoechst33342(제조원: Sigma-Aldrich, 미주리주 세인트 루이스 소재)를 사용하여 100ng/ml에서 염색시켰다. 세포내로 전달된 항체를 제논 라벨링 기술(Zenon labeling technology)(제조원: Invitrogen, 캘리포니아주 칼스바드 소재)을 사용하여 제조자의 설명서에 따라 가시화하였다. FPP 분석(참고: Lorenz et al., Nature Protoc. 1:276-9 (2006))을 채택하여 STAT3 및 STAT3K685R의 핵 체류를 가시화하였다. 간단히, STAT3-GFP 또는 STAT3K685R-GFP 발현 세포를 KHM 버퍼(110mM 칼륨 아세테이트, 20mM HEPES, 2mM MgCl2) 중 20μm 디기토닌으로 처리하여 외부 세포막을 침투시켰다. 생존 세포에서 STAT3-GFP 또는 STAT3K685R-GFP의 핵 배출을 공초점 현미경검사에 의해 시간에 따라 모니터링하였다. 렙토마이신 B(제조원: Sigma-Aldrich, 미주리주 세인트 루이스 소재) 처리시 STAT3-GFP 또는 NFκB 서브유닛 p65-GFP의 국재화를 간접적인 면역형광으로 평가하였다. 커버슬립(제조원: Fisher Scientific, 매사츄세츠주 왈탐 소재) 위에 성장시킨 STAT3-GFP 또는 p65-GFP를 발현하는 세포를 2% 파라포름알데하이드(PBS, pH 7.4 속에 용해시킴)로 고정시키고 배지가 놓여있는 DAPI 함유 벡타쉴드(Vectashield)(제조원: Vector Laboratories, 캘리포니아주 버링갬 소재)에 탑재하였다. 종양 또는 정상 조직으로부터의 미세단면을 이전에 기재된 바와 같이 간접적인 면역형광을 사용하여 염색하였다(참고: Kujawski et al., J. Clin. Invest. 118:3367-3377 (2008)). 간단히, 단면을 10% 염소 혈청 및 2.5% 마우스 혈청으로 차단하고, PBS로 세정하고 100ng/ml Hoechst33342(제조원: Sigma-Aldrich, 미주리주 세인트 루이스 소재)를 함유하는 차단 용액 속에서 1:50으로 희석시킨 엑스포틴 7, 뉴클레오포린 50, 뉴클레오포린 153(제조원: Santa Cruz Biotechnology, Inc., 텍사스주 달라스 소재), Ki67(제조원: eBioscience, 캘리포니아주 샌 디에고 소재), 및 CD31/PECAM-1(제조원: BD Pharmingen, 캘리포니아주 샌 디에고 소재)에 대한 항체와 함께 인큐베이트하였다. 슬라이드를 PBS로 세정하고(매번 5분 동안 3회), 적절한 2차 형광성 항체와 함께 인큐베이트하고, PBS로 세정하고 모위올(Mowiol)(제조원: Calbiochem, 캘리포니아주 샌 디에고 소재)와 함께 탑재하였다. 단면을 LSM 510 메타 도립 현미경(제조원: Zeiss, 독일 예나 소재)을 사용하여 분석하였다. 생체내 전달된 항체를 알렉사 플루오르(alexa fluor) 488(제조원: Invitrogen, 캘리포니아주 칼스바드 소재)에 콘주게이트된 항-토끼 IgG를 사용하여 가시화하였다.
형광성 방출 신호의 정량화. 핵 잔류 단백질을 세포 핵 속에서 평균 형광 강도로 정량화하였다(Hoechst+). 완전한 핵 축적을 1(100%)로 정규화하였다. 평균 형광 강도, 조직 구조, 예컨대 CD31+ 혈관 길이, 시계에서 이중-양성 픽셀의 이미지 마스크, 또는 형광성 신호 밀도 각각을 Zeiss 영상화 소프트웨어(제조원: Zeiss, 독일 예나 소재) 또는 이미지-Pro 6.3(제조원: Media Cybernetics, 메릴랜드 록크빌 소재)을 사용하여 정량화하였다. STAT3-GFP 또는 STAT3K685R-GFP의 핵 유인을 이전에 기재된 바와 같이 FLIP(광표백에서 형광 손실) 파라미터의 적용으로 측정하였다(참고: Rabut and Ellenberg, "Photobleaching Technique to Study Mobility and Molecular Dynamics of Protein in Live Cells. In: Live Cell Imaging, A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press. pp. 101-126 (2004)). FLIP와는 대조적으로, 목적한 영역(ROI)은 도 6a 및 도 6b에 도식적으로나타낸 바와 같이 조직화되었다. 간단히 말해서, 획득된 신호는 배경(BG) 삭감 후 ROI1/ROI2에 의해 수정되었으며(도 6a 및 6b), 및 e-t/x(여기서, t는 시간이고 x는 이웃하는 대조군 세포(ROI2)의 형광성 신호이다)를 사용하여 정규화하였다. 표백전 시점에서 방출 강도는 1로 정규화하였다.
생체내 다광자 현미경검사(IVMPM). 흑색종 B16 종양을 지닌 C57BL/6 마우스를 이소플루란/산소에 이어, 10μg 아넥신-V-FITC(제조원: BioVision, 캘리포니아주 밀피타스 소재)를 사용한 정맥내(오비탈뒤 경로를 통해) 주사로 마취시켰다. 주사후 즉시, 마우스를 수술로 개방시키고 종양 조직을 IVMPM에 대해 노출시키고, 울티마 다광자 현미경검사 시스템(Ultima Multiphoton Microscopy)(제조원: Prairie Technologies, 위스콘신주 미들톤 소재)을 사용하여 수행하였다. 영상화 플루오레신 콘주게이트를 위해, 여기 파장(excitation wavelength)을 λ= 890nm로 설정하였다. 플루오레신에 대해 최적화된 대역통과 필터(BPλ= 525/50nm)를 검출에 사용하였다. 세포외 매트릭스의 신호는 여기 파장 λ= 890nm에서 제2의 하모니 생성으로 제공하고 BPλ= 460/50nm으로 검출하였다.
단백질 상호작용의 원위치 국재화. 인간 U251 뇌 종양 세포를 유리 챔버 슬라이드 시스템(제조원: Fisher Scientific, 매사츄세츠주 왈탐 소재) 속에서 성장시키고 Duolink® 절차를 제조자의 설명서(제조원: OLINK Bioscience, 스웨덴 업살라 소재)에 따라 수행하였다. 사용된 항체의 검출은 업자(Santa Cruz)(STAT3, 카탈로그 번호 sc-482) 및 업자(Acris)(엑스포틴 7, 카탈로그 번호 AP16201PU-N)로부터 구매하였다. 업자(Santa Cruz)(텍사스주 달라스 소재)로부터 구매한 STAT3 차단 펩타이드를 0.01mg/ml에서 사용하였다.
올리고-풀다운(pulldown) 분석. STAT3 DNA-결합 활성을 측정하기 위하여, 올리고-풀다운 분석을 무흉선 nu/nu 마우스에서 성장시킨 U87 종양으로부터 분리한 핵 추출물을 사용하여 수행하였다. 종양 조직을 균질화한 후, 핵 추출물을 (i) 10mM HEPES-KOH(pH 7.9), 1.5mM MgCl2, 10mM KCl을 함유하는 저삼투압 버퍼 A 및 (ii) 20mM HEPES-KOH(pH 7.9), 420mM NaCl, 1.5mM MgCl2, 0.2mM EDTA, 25% 글리세롤을 함유하는 고-염 버퍼 C의 조합을 사용하여 단리하였다. 프로테아제 억제제 0.2mM PMSF, 0.5mM DTT, 1mM Na3VO4를 새로이 첨가하였다. 바이오티닐화된 올리고, 5'-AGCTTCATTTCCCGTAAATCCCTAAGCT-3'(서열식별번호:1) (볼드체의 STAT3 결합 부위를 지닌 시스-유도성 성분 SIE)을, 결합 버퍼(12 mM HEPES pH 7.9, 12% 글리세롤, 4 mM 트리스 pH 7.9, 150 mM KCl, 1 mM EDTA; 신선한: 1 mM DTT, 0.1μg/μl 폴리(dI:dC), 0.5μg/μl BSA) 중 400μg 핵 추출물과 함께 2시간 동안 실온에서 인큐베이트하였다. 샘플 당 50μl에서 사용된 스트렙타비딘 자기 비드(제조원: Thermo Scientific, 매사츄세츠주 발탐 소재)를 1ml의 결합 버퍼로 3회 예비세척하고, 자기 스탠드 속에서 수집하고, 상청액을 제거하였다. 스트렙타비딘 자기 비드를 30분 동안 실온에서 100μg BSA, 10μg 폴리(dI:dC), 10μg ssDNA([10μg/μl]에서 연어 정자 DNA가 사용됨)를 함유하는 50μl의 차단 버퍼 속에서 차단한 후, 샘플과 함께 2시간 동안 실온에서 인큐베이트하였다. 침전물을 자기 스탠드 속에서 수집하고, 결합 버퍼를 사용하여 3회 세척하고, 40μl의 4x 환원 단백질 샘플 버퍼(제조원: Laemmli) 속에서 재현탁시켰다. 단백질-침전물을 SDS-PAGE에 의해 전기영동적으로 분리하였다. 초기 청소능 후 상청액을 수집하고 핵 단백질을 전기영동적으로 분리하여 단백질 투입의 로딩 대조군을 평가하였다.
항체에 대한 올리고의 콘주게이션. 하기 DNA 올리고뉴클레오타이드 서열을 항체에 부착시키기 위해 합성하였다:
항체에 콘주게이션시키기 위해 사용된 올리고뉴클레오타이드 서열:
포스포티오에이트화된/5티오MC6-D//iSpC3//iSpC3//iFAM//iSpC3//iSpC3/T*C*C*A*T*G*A*G*C*T*T*C*C*T*G*A*T*G*C*T (서열식별번호:2)
비-포스포티오에이트화된/5티오MC6-D//iSpC3//iSpC3//iFAM//iSpC3//iSpC3/TCCATGAGCTTCCTGATGCT (서열식별번호:3)
포스포티오에이트화된 랜덤 1/5티오MC6-D//iSpC3//iSpC3//iFAM//iSpC3//iSpC3/C*T*G*T*A*G*T*C*C*T*C*T*G*A*G*T*A*C*C*T (서열식별번호:4)
포스포티오에이트화된 랜덤 2/5티오MC6-D//iSpC3//iSpC3//iFAM//iSpC3//iSpC3/C*C*C*A*G*G*A*G*T*C*T*C*C*T*G*A*T*T*T*T (서열식별번호:5)
T, 티민; A, 아데닌; G, 구아닌; C, 시토신; (*)는 포스포로티오에이트화를 나타낸다. 5티오MC6-D, 1-O-디메톡시트리틸-헥실-디설파이드,1'-[(2-시아노에틸)-(N,N-디이소프로필)]-포스포르아미다이트(티올-조절제 C6 S-S); iSpC3, C3 3-(4,4'-디메톡시트리틸옥시)-프로필-1-[(2-시아노에틸)-(N,N-디이소프로필)]-포스포르아미다이트(스페이서 포스포르아미다이트); iFAM, 2-디메톡시트리틸옥시메틸-6-(3',6'-디피발로일플루오레신-6-일-카복사미도)-헥실-1-O-[(2-시아노-에틸)-(N,N-디이소프로필)]-포스포르아미다이트 (6-플루오레신 포스포르-아미다이트)(제조원: Glen Research, 버지니아주 스털링 소재).
면역블로팅 및 면역침강. 전체의 세포 용해물 또는 종양 조직 균질물을 50mM 트리스(pH 7.4), 150mM NaCl, 1mM EDTA, 0.5% NP-40, 1mM NaF, 15% 글리세롤, 및 20mM β-글리세롤포스페이트를 함유하는 RIPA 세포용해 버퍼를 사용하여 제조하였다.프로테아제 억제제 칵테일을 세포용해 버퍼(미니 프로테아제 억제제 칵테일, 카탈로그 번호 04693124001, 제조원: Roche, 스위스 바젤 소재)에 새로이 제조하여 부가하였다. 레스베라트롤(제조원: Cayman Chemical, 미들랜드 앤 아보어 소재)을 시험관내에서 명시된 시간 동안 10μm의 차선 농도(suboptimal concentration)에서 사용하였다. 정규화된 단백질 양을 SDS-PAGE에 의해 전기영동 분리에 적용시키고, 웨스턴 블랏팅을 위해 니트로셀룰로오스에 이전시키고, 후속적인 면역검출을 엑스포틴 1, 2, 5, 7, STAT3, VEGF, 뉴클레오포린 50(제조원: Santa Cruz, 텍사스주 달라스 소재), 인산화된 STAT3(Tyr705), 아세틸화된 STAT3(Lys685), 절단된 PARP1, 절단된 카스파제 3, Bcl-2, 사이클린 D1(제조원: Celll Signaling Technology, 매사츄세츠주 보스톤 소재), 안지오포이에틴 1, 엑스포틴 T(제조원: Millipore, 매사츄세츠주 빌레리카 소재), 엑스포틴 4(제조원: Epitomics/Abcam, 캘리포니아주 버링갬 소재), 엑스포틴 6(제조원: Proteintech Group, 일리노이주 시카고 소재), 및 β-액틴(제조원: Sigma-Aldrich, 미주리주 세인트 루이스 소재)에 대한 항체를 사용하여 수행하였다. 면역침강을 위해, 인간 U251 뇌 종양 세포 또는 전체의 종양 균질물의 전체의 세포 용해물을 샘플 당 1mg의 총 농도에서 단백질 G 아가로스 비드(제조원: Invitrogen, 캘리포니아주 칼스바드 소재)에 커플링된 명시된 항체를 사용하여 선명하도록 하였다. 비-표적화 토끼 면역글로불린(제조원: Abcam, 캘리포니아주 버링갬 소재)을 대조군으로서 포함시켰다. 정규화된 단백질 양을 비드에 커플링된 항체와 함께 4℃에서 16시간 동안 진탕시켜 인큐베이트하고, 4℃에서 빙냉된 PBS를 사용하여 3회 세척하고 SDS-PAGE에 적용시켰다.
마우스 및 세포 배양. 모든 동물을 호프시(City of Hope) 조사 동물 설비에서 무병원체 룸(room)에 유지시켰다. 동물 사용 절차는 호프시 의료센타의 베크맨 조사 위원회(Beckman Research Institute)의 기관 위원회에 의해 승인되었다. 피하 종양 챌린지를 위해, 무흉선 nu/nu 마우스(제조원: NCI, 매릴랜드주 프레데릭 소재)에게 STAT3 또는 STAT3K685R를 안정하게 발현하는 5 x 106 MEF 세포, 또는 106 U87 인간 뇌 종양 세포를 측면에 주사하였다. 동계의 모델에서, C57BL/6 마우스(제조원: The Jackson Laboratory, ME 바 하버 소재)에게 105 B16 흑색종 세포를 피하 주사하였다. 종양이, 5 내지 7mm의 직경에 도달한 후, 항체 치료제를 매 격일마다 투여하였다. 섬유아세포 3T3/v-Src 세포, MEF 세포, 및 인간 U87 뇌 종양 세포를 10% 열 불활성화된 FBS(제조원: Sigma-Aldrich, 미주리주 세인트 루이스 소재)를 함유하는 DMEM 속에 유지시켰다. 마우스 흑색종 B16 세포를 10% FBS가 보충된 RPMI 1640 배지 속에서 성장시켰다. STAT3 작제물을 안정되게 발현하는 세포주를 확립하기 위하여, STAT3 결핍된 MEF 세포를 STAT3-YFP 또는 STAT3K685-YFP를 사용하여, Flp-In 프로토콜(제조원: Invitrogen, 캘리포니아주 칼스바드 소재)에 따라 형질감염시켰다. 재구성된 MEF 세포를 YFP+를 위한 유세포측정으로 차후에 분급하여 순도를 > 95%로 개선시켰다.
결과 및 논의
기재된 방법의 도 및 결과는 하기에서 더 상세히 논의된다. 간단히, 도 1 내지 도 3은, 세포-침투 항체가 핵 전사 인자, 예컨대 STAT3에 부착할 수 있음을 나타낸다. 도 5 내지 도 12는 핵 단백질(예를 들면, STAT3) 및 핵 단백질과 상호작용하는 단백질(예를 들면, 엑스포틴 7)에 대한 2개의 세포-침투 항체를 사용하여 핵 단백질(예를 들면, STAT3)의 활성을 차단할 수 있는 방법을 나열한다. 도 13 내지 도 18은 핵산 서열이 아니라, 포스포로티오에이트화가 포스포로티오에이트 핵산 개질된 항체의 세포침투를 가능하게 하여, 생체내 및 시험관내에서 표적 인식 및 표적 단백질 기능의 불활성화를 가능하게 하는데 중요함을 나타낸다.
활성화된 STAT3이 핵에 크게 국한된다고 해도, STAT3은 세포질을 셔틀링하여 재활성화되도록 한다. 구형 입자의 확산 특성에 따라, 분자량에 있어서의 증가는 단백질의 구획적 축적과 균형을 이룰 수 없다. 따라서, 핵 단백질 또는 추가의 상호작용 단백질의 2개의 별개 부분들을 인식하기 위해 2개의 항체를 사용하는 것은 안정한 거대 복합체를 형성할 수 있음으로써, 핵 단백질(들)의 세포질성 구획적 축적을 위해 균형을 맞출(tipping) 수 있다. 이러한 가설을 시험하기 위해, 제1 항체를 STAT3 및 GFP 단백질에 대한 액체 캐리어를 사용하여 STAT3을 지속적으로 활성화시키는 v-Src로 형질전환된 STAT3-GFP 발현 3T3 세포에 이전시켰다. 2개의 항체가 지질 캐리어에 의해 촉진된 세포내로 전달된 경우, STAT3-GFP 융합 단백질은 세포질내에서 주로 트랩핑되어 발견되었다(도 1a).
생리적으로 STAT3을 표적화하기 위한 당해 시도를 확장시키기 위하여, 세포질내에서 STAT3과 상호작용하는 내인성 단백질을 확인함으로써, STAT3/GFP 2-항체 치료에 의해 나타낸 동일한 원리를 기반으로 하여 세포질내 STAT3의 트랩핑을 허용하였다. 이는, STAT3을 세포질내로 셔틀링하는 엑스포틴(들)이 STAT3과 비교적 안정한 복합체를 형성할 수 있다는 취지였다. 따라서, 주요한 엑스포틴이 세포질 내로의 STAT3 셔틀링에 관여되었음을 확인하기 위해 시도되었다. STAT1 및 어느 정도까지, 또한 STAT3의 핵세포질 셔틀링에서 엑스포틴 1의 관여가 나타나 있다(참고: Bhattacharya and Schindler, J. Clin. Invest. 111:553-9 (2003); Reich and Liu, Nature Rev. Immunol. 6:602-12 (2006); McBride et al., Embo J. 21:1754-63 (2002)). STAT3 항체를 사용한 면역침전에 이어 다양한 엑스포틴에 대한 항체를 사용한 웨스턴 블랏 분석은, 엑스포틴 7이 STAT3과 관련되었음을 나타내었다(도 1b 및 도 5a). 엑스포틴 7과 STAT3의 특이적인 관여가 또한 확인되었다(도 5b). 엑스포틴 1은 또한 고 농도에서 Crm1-특이적인 억제제를 사용한 연장된 치료에 의해 나타난 바와 같이 세포질내로의 STAT3 셔틀링에 대해 일부 검출가능한 활성을 가졌다(도 5b). 세포질내 STAT3과 배출 7 사이의 상호작용은 Duolink®(제조원: Olink Technologies, 스웨덴 업살라 소재) 기술(도 1c 및 1d)에 의해 추가로 입증되었다. GFP 항체를 엑스포틴 7 항체로 대체하는 것은, STAT3-GFP의 세포질 축적이 달성되었음을 나타내었다(도 1e).
엑스포틴 7은 카고 단백질의 모티프를 함유하는 라이신을 인식하여 기질을 구별하는 것으로 밝혀졌으므로, 라이신 685에서 STAT3의 아세틸화가 STAT3 세포질 셔틀링에 중요한지를 실험하였다. STAT3wt 및 STAT3K685R 의 핵세포질성 셔틀링은 iFLAP 생존 세포 공초점 현미경검사로 평가하였다. 이들 분석으로부터의 결과는, STAT3K685R 셔틀링이 핵 체류로 인하여 상당히 감소하였음을 나타내었다(도 2a, 2b, 6a, 6b, 7a, 7b, 및 7c). 라이신 K685에서 STAT3를 돌연변이시키거나 STAT3 아세틸화를 억제할 수 있는 레스제라트롤을 사용한 세포의 치료에 의해, STAT3/엑스포틴 7 상호작용을 위한 아세틸화의 요건이 실증되었다(도 2c 및 2d).
생체내에서 세포질 내로 STAT3의 엑스포틴 7-매개된 핵 배출을 차단하는 것의 영향을 STAT3wt 또는 STAT3K685R을 과발현하는 마우스 Stat3-null 배아 섬유아세포 (MEF)를 사용하여 추가로 실험하였다. 종양 성장 동력학은 STAT3K685R-발현 MEF의 실질적으로 감소된 종양유발성 포텐셜을 나타낸다(도 8a). 엑스포틴 7과 STAT3K685R 사이의 상호작용에 있어서의 동반된 감소가 검출되었다(도 2e). 더욱이, STAT3K685R 과 뉴클레오포린 사이의 엑스포틴 7-매개된 상호작용, 핵으로부터 세포질내로 단백질의 이동을 촉진하는 것으로 고려되는, NPC의 특이적으로 핵세포질성인 FG-풍부 반복체 Nup50 및 Nup153은 상당히 감소되었다(도 2e, 8c 및 8d). 핵 배출에 있어서 아세틸화된 STAT3의 중요한 역활이 추가로 지지되므로, STAT3K685R-발현 MEF는 핵내에서 엑스포틴 7의 축적을 나타내며, 이는 핵 직경의 실질적인 증가와 관련되며(도 2f 및 2g), 이는 단백질 핵 배출의 효과적인 억제를 나타낸다. 이것은 엑스포틴 7이 세포질에서 주로 발견되는 정상 장기/조직과는 매우 대조적이다(도 9).
생체내에서 STAT3 활성을 억제하는 STAT3 및 엑스포틴 7 항체의 능력을 핵세포질 셔틀링을 차단함으로써 MEF에서 시험하였다. 이들 실험으로부터의 결과를 도 10a, 10b, 10c, 11a, 11b, 11c 및 11d에 나타낸다. 종양을 지닌 마우스를 엑스포틴 7/STAT3에 대한 항체로 치료하는 것은 종양에서 강한 항체 세포내 흡수(도 10a 및 12a), 및 유의미한 종양 성장 억제(도 3a, 11a 및 12b)를 생성하였다. IgG 대조군 항체와 조합된, STAT3 또는 엑스포틴 7을 사용한 단일 항체 치료는 단지 종양 성장을 미미하게 억제시켰다(도 3a). 2-항체 치료는 Nup153 및 Nup50과의 엑스포틴 7-매개된 STAT3 상호작용의 파괴에 의해 또한 동반된다(도 3b). 종양을 지닌 마우스를 단독으로가 아닌, STAT3/엑스포틴 7 항체들로 처리하는 것은 종양 맥관구조 및 종양 증식을 유의미하게 파괴하고(도 3c 및 3d), 종양 세포 생존, 및 증식에 관여된 STAT3 다운스트림 유전자의 발현을 억제할 수 있었다(도 3e). 2-항체 치료의 효능을 또한 인간 이종이식 종양 모델에서 시험하였다. 인간 U87 신경아교종 종양을 지닌 마우스를 STAT3/엑스포틴 7 항체로 치료하는 것은 종양 성장을 유의미하게 감소시킬 수 있었으며(도 3f) 및 이의 DNA 부위에 대한 STAT3 부착을 방지하였다(도 3g). 종양 성장 억제는 세포자멸적 종양 세포에 있어서 실질적인 증가 및 생체내-다광자 현미경검사에 의해 가시화되는 바와 같이 종양 맥관형성의 감소와 관련되었다(도 3h 및 3i).
지금까지의 결과는, 전사 인자, 예컨대 STAT3가 항체에 의해 표적화될 수 있음을 입증한다. 그러나, 지질 캐리어는 항체를 세포내적으로 전달하는 것에 의존하였다. 항체 및 단백질이 효율적인 세포성 단백질 표적화를 위해 세포내로 침투하도록 하는 방법은 달성하기 힘든채로 남아있다. 이러한 목적을 위해 기술이 개발되었다. 특이적으로, 포스포로티오에이트화된 올리고뉴클레오타이드를 항체에 부착시켜 이들이 세포를 침투하여 이들의 의도된 분자를 표적화하는 것이 가능하도록 시도되었다. 포스포로티오에이트화된 올리고뉴클레오타이드의 STAT3 또는 엑스포틴 7 다클론성 IgG 항체에 대한 부착은 시험관내 세포 세포질에서 항체의 효율적인 세포성 내재화를 시간- 및 투여량-의존적인 방식으로 이끌었다(도 4a 및 4b). 주목하게도, 2개의 개질된 항체 독립체의 동시 전달이 실증되었다(도 4b, 우측 패널). 추가의 특성규명은 세포질내에서 개질된 항체에 의한 의도된 표적 인식을 나타내었다(도 13a 및 13b). 게다가, 형광성으로 표지된, 포스포로티오에이트화된 올리고뉴클레오타이드 개질된 항체가 국소 및 전신 투여 둘 다에서 종양 속에서 검출되었다(도 14 및 15a). 온전한 올리고뉴클레오타이드 개질된 항체는 마지막 전신 치료 후 8일째에 종양 조직에서 발견되었으며(도 15b), 이는, 개질된 항체의 강력한 바이오안정성을 나타낸다. 암 세포를 침투하는 것 외에, 올리고뉴클레오타이드 개질된 항체는 또한 면역 세포(도 16a 및 16b)에 도입될 수 있다. 항체에 부착된 올리고뉴클레오타이드의 서열 특이성이 아닌 DNA 골격 포스포로티오에이트화는 세포성 흡수 및 차후의 표적/항원 인식 둘다에 중요하다(도 17a 및 17b).
포스포로티오에이트화된 올리고뉴클레오타이드-개질된 항체의 항-종양 효능을 평가하기 위해, STAT3/엑스포틴 7 항체를 흑색종 B16 종양을 지닌 마우스, 및 인간 U251 신경아교종을 지닌 면역-결핍 마우스에게 국소 투여하였다. 미치료된 마우스 및 단일 항체로 치료된 것들과 비교하여, 모델 둘 다에서 종양 성장 동력학은 개질된 STAT3/엑스포틴 7 항체의 조합을 제공받은 마우스에서 유의적으로 감소하였으며(도 4c 및 18), 이는 급격하게 감소된 STAT3 활성(도 4f), 및 증가된 세포자멸적 세포사(도 4g)에 의해 동반되었다.
개질된 STAT3/엑스포틴 7 항체의 항종양 효능을 전신 투여를 통해 시험하였다. 개질된 STAT3/엑스포틴 항체의 전신 전달은 또한 종양 성장에 있어서 매우 극적인 항종양 효과를 나타내었다(도 4d). 포스포로티오에이트화된 뉴클레오타이드-개질된 항체는 효율적으로 도달되어 종양 조직을 침투하여, 항종양 기능을 발휘하였다(도 15a). 조합된 항체 치료의 항종양 효능을 이후에 치료당 2.5μg의 총 항체까지 감소되는 용량으로 전신적으로 제공하여 평가하였다. 강력한 항종양 효과가, 전신 치료를 단지 3회 치료 후 중지된 경우(도 4e) 잔류하였고, 뉴클레오포린 50 및 153과의 STAT3 상호작용에 있어서 감소에 의해 나타난 바와 같이, STAT3 구획 턴오버의 억제에 의해 동반되었다(도 4g). 게다가, 종양을 지닌 마우스의 개질된 STAT3/엑스포틴 항체를 사용한 전신 치료는 종양에서 STAT3 DNA-결합 능력을 효과적으로 감소시켰다(도 4h).
표적 세포내 분자에 대해 항체를 사용할 필요성이 필수적으로 되고 있다. 항체는 종양 세포내로 확산되어 생체내에서 의도된 단백질을 차단할 수 있는 것으로 보고되었지만, 어떠한 분자 메카니즘도 제공되지 않았으며, 암 세포에 의한 항체 흡수는 B 세포에 의해 매개됨이 추측되었다. 항체를 개질시켜 이들을 자가-침투성으로 만드는 방법이 본원에 기술되어 있으며, 이들을 심지어 전신 투여에서도 세포내 분자를 효과적으로 표적화할 수 있도록 한다. 단백질의 2개의 별개의 부분 또는 항체와의 복합체인 2개의 단백질을 표적화하는 것은 전사 인자의 재-활성화에 요구되는 핵세포질성 셔틀링을 감소시킬 수 있다는 직접적인 실험적인 증거가 제공된다. STAT3 외에, 핵 단백질은 항체에 의해 표적화되는 것이 불가능한 것으로 간주되었으며, 세포-침투 항체 기술은 다양한 세포내 단백질(예를 들면, 종양발생 단백질 및 세포내 잔류하는 바이러스 단백질)을 표적화하는데 광범위하게 사용될 수 있다.
실시예 2. 효과적인 세포-침투 단백질 전달 기술
본 실시예에서, 항체를 포스포로티오에이트화된 올리고로 개질시키는 것은, 이들이 세포를 침투할 수 있도록 하며, 여기서 이들이 의도된 세포내 표적 항원/분자에 부착하도록 함을 실증하였다. 게다가, 유세포측정 및 공초점 현미경검사에 의해 세포내 표적을 구체적으로 검출하는 개질된 항체의 능력이 살아 있는 세포에서 뿐만 아니라 웨스턴 블랏팅에 의한 이의 원 상태의 단백질을 검출시 실증되었다. 더욱이, 그와 같은 개질된 항체를 사용하여 세포내 티로신 키나제(포스포-Src), 세포내/핵 바이러스 단백질(HPV16/18 E6 단백질) 뿐만 아니라 전사 인자(STAT3)의 활성을 효과적으로 차단할 수 있음이 실증되었다.
물질 및 방법
살아 있는 세포에서 STAT3-GFP의 국재화는 LSM 510 메타 도립 현미경(Zeiss)을 사용하여 영상화하고 분석하며 iFLAP 영상화를 생성하는 표백 실험을 수행하였다(참고: Herrmann, et al., J. Cell Sci. 120:3249-3261 (2007)). 간단히, STAT3-CFP-YFP 융합 단백질의 YFP 및 CFP 방출 신호를 동등하게 증폭시켰다. λ = 514 nm 레이저 라인을 사용하여, 융합 단백질의 YFP 잔기를 수회 라운드로 표백시켜, 이미지 취득에 의해 차단하였다. 취득 절차 후, 알고리즘/=1-/YFP//CFP을 시간의 함수로서 STAT3-CFP-YFP의 공간 분포를 생성하는 수집된 이미지에 적용하였다. 종양 단면을 이전에 기재된 바와 같이 간접적인 면역형광을 위한 프로토콜을 사용하여 염색하였다(참고: Herrmann, et al., Cancer Research 70:7455-7464 (2010)).
세포 배양물 속에서 STAT3(제조원: Santa Cruz, sc-482), 엑스포틴 7(제조원: Santa Cruz, sc-98639), 또는 GFP(제조원: Rockland)에 대한 항체의 전달은 지질 캐리어 시스템(제조원: GenLantis, BP509604)을 사용하여 제조자의 설명서에 따라 달성하였다. 생체내에서, 지질 캐리어(제조원: GenLantis, BP509604) 또는 STAT3 및 엑스포틴 7 각각에 대한 올리고-뉴클레오타이드 개질된 항체와의 복합체 중 10μg의 총용량의 면역글로불린을 각각의 치료를 위해 투여하였다.
항체에 대한 올리고의 콘주게이션. 항체에 콘주게이션시키기 위해 사용된 올리고뉴클레오타이드 서열:
포스포티오에이트화된 T*C*C*A*T*G*A*G*C*T*T*C*C*T*G*A*T*G*C*T (서열식별번호:2)
비-포스포티오에이트화된 TCCATGAGCTTCCTGATGCT (서열식별번호:3)
포스포티오에이트화된 스크램블드 1(scr1) T*C*G*T*A*G*T*C*C*T*T*C*G*A*G*T*A*C*C*T (서열식별번호:6)
포스포티오에이트화된 스크램블드 2(scr2) C*C*C*A*G*G*A*G*T*C*T*C*C*T*G*A*T*T*T*T (서열식별번호:5)
포스포티오에이트화된 스크램블드 3(scr3) T*A*G*A*T*G*A*C*C*T*T*C*C*T*G*C*T*G*C*T (서열식별번호:7)
T, 티민; A, 아데닌; G, 구아닌; C, 시토신; (*)는 포스포로티오에이트화를 나타낸다.
올리고뉴클레오타이드(200-300nmol)는 30-몰 과잉의 TCEP(400μL, 5mM TEAA, pH 6.8)에 의해 2 시간 동안 실온(RT)에서 아르곤 하에 환원시키고 역 상 크로마토그래피(PRP1, 30분에 걸쳐 5mM TEAA 내지 95% MeOH의 선형 구배)로 정제하였다. 티올 보호 그룹의 제거는 질량-분광분석법(LTQ FT, 제조원: Thermo)에 이어 동결건조로 확인하였다. 환원된 올리고뉴클레오타이드를 0.5mL의 물/DMSO(4:1) 속에 재용해시키고, 25-배 과잉의 비닐 설폰을 부가하고, pH를 8.5로 조절하고, 3시간 동안 실온에서 아르곤하에 반응시키고, 역 상 HPLC(위에서와 같이)로 정제하고, 정확한 생성물을 질량-분광분석법으로 확인하고 샘플을 동결건조시켰다(VS-올리고뉴클레오타이드). 대안적으로, 올리고뉴클레오타이드를 티올 보호 그룹의 제거에 적용시키고 하기와 같이 추가로 가공시켰다(SSR-올리고뉴클레오타이드). 다클론성 IgG(1.6 mg, PBS 속에서 48시간 동안 투석시킴)를 PBS중 30-몰 과잉의 TCEP로 2시간 동안 37℃에서 아르곤 하에 환원시켰다. 과잉의 TCEP(제바 스핀 칼럼, 제조원: Thermo; 2,000rpm에서 2분 동안)를 제거한 후, 환원된 항체를 20-몰 과잉의 VS-올리고뉴클레오타이드 또는 SSR-올리고뉴클레오타이드와 pH 7.5에서 아르곤하에 밤새 반응시켰다. 성공적인 올리고-대-항체-콘주게이션을, 비콘주게이트된 항체를 콘주게이트된 항체와 비교하는 IEF 겔 전기영동(pH 3-9, 제조원: GE Health Sciences)로 확인하였다.
결과 및 논의
개질된 항체의 세포침투 및 표적 인식. STAT3 IgG 항체를 포스포로티오에이트화된 올리고-뉴클레오타이드로 개질시키는 것은 시험관내에 살아 있는 세포내에서 항체의 세포성 내재화 및 의도된 표적/항원 인식을 가져왔다(도 23a). 이것은 대안적인 면역침강: 개질된 항체를 살아 있는 세포에 가하여 그것이 그의 원 상태로 표적에 결합하도록 한 후 세포를 용해하고 전기영동 전에 아가로스 비드로 침전시키는 것을 사용한 항체-표적 복합체의 검출로 입증된다. 항체 및 포스포로티오에이트화된 올리고는 생체내에서 동시-국재화됨이 확인되었다(도 28). 상이한 올리고-뉴클레오타이드의 DNA 골격 포스포로티오에이트화는 유세포측정 분석 및 웨스턴 블랏팅 둘 다에 의해 입증된 바와 같이, 항체의 세포 흡수 및 차후의 표적/항원 인식을 달성할 수 있음이 추가로 실증되었다(도 23b, 23c). 또한, 엑스포틴 7 항체의 포스포로티오에이트화 개질은 항체 내재화를 촉진시키고(도 23b) 개질된 항체의 내재화는 특정한 세포형에 한정되지 않았음(도 23b)이 입증되었다. 개질된 STAT3 항체가 세포막을 침투할 수 있고 이들이 EEA-1+ 엔도조말 구획 외부에 존재할 수 있음이 공초점 영상화에 의해 또한 실증되었다. 또한, 개질된 STAT3 항체는 또한 핵 구획에 도입될 수 있었다(도 23d).
포스포로티오에이트화된 올리고로 개질된 포스포-Src (p-Src) 항체가 상세히 추가로 특성화되어 있다. 개질된 및 개질되지 않은 p-Src 항체의 세포침투 능력을 유세포측정 분석을 사용하여 비교하였다(도 23e). 또한, 형광성 신호가 거의 없는 세포의 공초점 영상화는, 개질된 p-Src 항체가 p-Src와 함께 동시-국재화되었음을 나타내었다(도 23f). 게다가, 항체가 세포 용해물을 제조하기 전에 생존 세포에 부가되는 독특한 면역침전에 이은 웨스턴 블랏팅은, 개질된 p-Src 항체가 세포내로 내부화되어 그것의 의도된 표적에 결합할 수 있었음을 실증하였다(도 23g).
표적은 세포-침투 항체 세포내 체류에 요구된다. 지금까지의 데이타는, 포스포로티오에이트화된 올리고 개질된 항체가 세포내로 침투할 수 있음을 실증한다. 형광적으로 표지된 개질된 IgG 대조군 항체가 아닌, 형광성으로 표지된, 개질된 p-Src 항체는 v-Src로 형질감염된 3T3 섬유아세포내에서 유세포측정 분석에 의해 쉽게 검출가능하였음이 입증되었다(도 24, 최상부 패널). Stat3이 있거나 없는 마우스 배아 섬유아세포 (MEF)를 사용하여, 유세포측정 분석에 의해, Stat3 단백질이 포스포로티오에이트화된 올리고-뉴클레오타이드 개질된 Stat3 항체의 체류에 요구되었음이 밝혀졌다(도 24, 하부 패널).
개질된 항-포스포Src 항체에 의한 강력한 항종양 효과. 생체내 항종양 효과를 포스포로티오에이트화된 올리고로 개질된 다양한 항체에 대해 다음에 평가하였다. v-Src로 형질전환된 3T3 세포를 면역 능숙한, 동계의 마우스내로 이식하였다. 동등량의 개질된 IgG 또는 항-p-Src 항체(마우스당 10μg)를 종양내로 주사하였다. 종양의 성장 곡선은 어떠한 치료도 없는 것들과 개질된 IgG 항체로 치료한 것들 사이에서 유사하였지만, 이는 개질된 p-Src 항체를 제공받은 것들보다 유의적으로 더 느렸다(도 25a). 치료받지 않거나, 개질된 대조군 또는 p-Src 항체를 제공받은 종양으로부터의 균질물을 제조한 후, 웨스턴 블랏팅 분석하여 그것의 표적 및 표적 다운스트림 유전자에 있어서 개질된 항체의 생체내 효과를 평가하였다. 이러한 분석으로부터의 결과는, 생체내에서 개질된 p-Src 항체가 인산화된 Src 및 그것의 다운스트림 표적, 인산화된 Stat3(도 25b, 좌측 패널)뿐만 아니라 다른 공지된 p-Src 다운스트림 표적, FAK, β-액틴 및 E-카드헤린(도 25b, 우측 패널)을 효과적으로 억제할 수 있었음을 나타내었다. 세포 액틴 필라멘트 구조내에서 활성화된 Src의 역활은 공지되어 있다. 개질된 p-Src 항체는 또한 세포 이동 및 종양 침입에 있어서 중요한 역활을 하는 종양 세포 액틴 필라멘트 구조(도 29)를 억제할 수 있었다.
인간 흑색종 A2058 종양 세포의 생존 및 성장은 p-Src-의존적이므로, 개질된 p-Src 항체의 생체내 효과를 A2058 이종이식 종양 모델에서 추가로 평가하였다. 3T3 v-Src 마우스 종양 모델에서 알 수 있는 바와 같이, 인간 흑색종 종양을 개질된 p-Src 항체로 치료하는 것은 마우스에서 종양 성장을 유의미하게 억제하였다(도 25c). 대조군 및 시험 그룹 둘 다로부터의 종양으로부터 제조한 균질물을 사용한 웨스턴 블랏팅은, 결합하는 표적 단백질을 갖지 않은, 개질된 IgG 항체가 아닌 개질된 p-Src 항체가 생체내 종양내에서 보유되었음을 나타내었다(도 25d). 게다가, 종양 단면의 현미경적 분석은, 개질된 IgG 항체가 아닌, 개질된 p-Src 항체만이 종양내에 보유되었음을 나타내었다(도 25e 최상부 패널). 표적 항체의 체류는 종양 맥관구조의 손실(도 25e 최상부 패널) 뿐만 아니라 종양 세포자멸사에 있어서의 증가(도 25e 하부 패널)와도 관련되었다. 대조군과 표적 항체 처리된 종양 사이의 항체 종양 체류에 있어서의 차이, 종양 세포 세포자멸사 및 종양 맥관구조의 손실은 유의미하였다(도 25f).
개질된 항-HPV E6 항체는 종양 성장을 억제한다. 몇개의 세포내 바이러스 단백질은 질환, 예컨대 암을 치료하기 위한 우수한 표적이다. 예를 들면, HPV16/18 E6 및 E7 단백질은 다수의 자궁경부암 및 두경부암에서 형질전환 및 세포의 악성종양에 중요한 잘 알려진 종양단백질이다. 그러나, 그것의 종양발생 활성을 차단하는 효과적인 약물은 존재하지 않는다. 따라서, HPV16/18 E6에 대한 단클론성 항체를 개질시키는 것이 E6 기능 및 종양 성장을 차단하는 효과적인 억제제를 생성할 수 있는지를 시험하였다. E6(또한 E7) 단백질은 매우 작으므로, 항체는 전체 단백질을 "완전히 에워싸서(engulf)" 그의 기능을 차단할 수 있음이 타당하였다. 인간 카스키(CaSki) 자궁경부암 세포를 피하 주사하여 누드 마우스내에서 종양을 형성시켰다. 종양이, 직경이 평균 5mm에 도달하면, 동등량의 개질된 IgG 또는 항-E6 항체(마우스당 10μg)를 종양내로 주사하였다. 개질된 IgG 항체로 치료한 종양은 치료되지 않은 종양 종양과 유사하게 성장하였지만, 개질된 E6 항체가 주사된 것들은 2개의 대조군 그룹과 비교하여 유의미한 성장 지연을 가졌다(도 26a). 전신으로 투여된 개질된 E6 단클론성 항체의 항종양 효과를 또한 시험하였다. 카스키 종양 성장에 있어서 전신으로 전달된 개질된 E6 항체의 억제 효과가 관찰되었다(도 26b). H&E 염색은, 개질된 E6 항체를 사용한 전신 및 국소 치료 둘 다가 종양 조직에서 파괴 효과를 가졌음을 나타내었다(도 26c). 생체내 실험으로부터 종양을 사용한 웨스턴 블랏팅 분석 및 실시간 RT-PCR(도 26a 및 26b)은 Fas-수용체의 구성원을 전-카스파제에 브릿징하여 세포사를 유도하는 복합체 및 카스파제 8 유전자를 형성하는, FADD 유전자의 상향조절된 발현을 나타내었다(도 26d 및 26e). 카스키 종양 단면(도 26a에서 동일한 종양)의 공초점 현미경적 분석은, 개질된 IgG 항체가 아닌 개질된 E6 항체만이 치료된 종양에서 쉽게 검출가능하였음을 나타내었다(도 26f, 최상부 패널). 종양을 개질된 항-E6 항체로 치료하는 것은 또한 CD31-양성률의 감소에 의해 명시되는 바와 같이, 종양 맥관구조의 파괴를 생성하였다(도 26f, 최상부 패널). 동일한 종양 조직을 사용하여, 절단된 카스파제 3 단백질 수준이 상승되었음을 추가로 입증하였다(도 26f, 하부 패널).
생체내에서 세포-침투 항체에 의한 STAT3 표적화. 항체에 의한 STAT3 활성 차단을 평가하였다. 그러나, Src 티로신 키나제 분자 표면상에 노출된, Src의 인산화된 부위와는 달리, STAT3의 주요 티로신 인산화된 및 아세틸화된 부위는 접혀진 STAT3 분자내 그것의 위치로 인하여 접근하기 어렵다. 활성화된 STAT3가 핵내로 크게 국한된다고 해도, STAT3은 세포질에 대해 셔틀링되어 재활성화된다. 구형 입자의 확산 특성에 따라, 분자량에 있어서의 증가는 단백질의 구획적 축적을 불균형화시킬 수 있다. 따라서, STAT3 또는 또 하나의 상호작용 단백질의 2개의 별개의 부분을 인식하는 2개의 항체를 사용하는 것은 안정한 거대 복합체를 형성함으로써 활성화된 STAT3의 세포질 구획적 축적을 위하여 균형을 맞출 수 있다. 공초점 현미경적 분석은, STAT3의 별개의 부위를 인식하는 2개의 개질된 STAT3 항체가 STAT3-mCherry로 일시적으로 형질감염된 3T3v-Src 세포에서 STAT3 단백질의 증가된 세포질 축적을 촉진하며, 이는 핵내에서 STAT3-mCherry를 지닌 세포의 분획을 허용하였다(도 27a). 토끼 항-STAT3 항체 및 항-토끼 항체를 사용한 동일한 세포의 치료는 또한 STAT3 단백질의 세포질 축적에 있어서의 증가를 생성하였다(도 27a). 그러나, 세포질내 STAT3 단백질을 트랩핑(trapping)하기 위한 이중 항체의 가장 효과적인 조합은 STAT3 및 엑스포틴 7이었다(도 27a). 엑스포틴 7은 STAT3 핵세포질 셔틀링에 중요한 것으로 입증되었다(Herrmann et al., Cancer Res. 70:7455-7464 (2010)).
STAT3/엑스포틴 7 이중 항체는 세포질내에서 STAT3을 보유하는데 가장 효과적이었고(도 27a), 및 STAT3 및 엑스포틴 7 상호작용이 STAT3685 아세틸화를 필요로 하고, STAT3의 아세틸화는 종양 및 종양유발성에 우세하므로, 개질된 STAT3 및 엑스포틴 7 항체를 생체내 종양 치료에 사용하였다. 사실상, 확립된 B16 마우스 흑색종을 개질된 STAT3 및 엑스포틴 7 둘 다로 치료하는 것은 유의미한 종양 성장 지연을 초래하지만, 개질된 항체 단독만으로는 그렇지 않았다(도 27b, 좌측 패널). 개질된 STAT3/엑스포틴 7 항체의 국소 및 전신 주사는 B16 흑색종 종양 성장을 효과적으로 억제하였다(도 27b, 중간 패널). 개질된 STAT3/엑스포틴 7 항체의 전신 주사는, 치료당 2.5μg의 낮은 용량에서도, 종양 성장을 효과적으로 억제하였으며, 전신 치료를 단지 3회 치료 후 중지하였던 경우에도 강력한 항종양 효과가 남았음이 또한 입증되었다(도 27b 우측 패널). 전신 항체 치료는 또한 STAT3-DNA 부착을 측정함으로써 평가되는 바와 같이 종양 STAT3 활성을 억제하였다(도 27c). 또한, 전신으로 전달된 개질된 STAT3/엑스포틴 7 항체는 마지막 치료 후 심지어 8일째까지 종양 속에서 보유되었다(도 27d).
인간 신경아교종 이종이식 모델에서 개질된 STAT3/엑스포틴 7 항체의 항종양 효능이 시험되었다. 확립된 인간 U87 신경아교종을 지닌 마우스에 대한 개질된 STAT3/엑스포틴 7 항체의 국소 치료 및 전신 투여 둘 다는 효과적인 항종양 효과를 초래하였다(도 27e, 상부 패널). 게다가, STAT3의 별개의 부위, 및 개질된 항-STAT3 항체(토끼) 및 항-토끼 항체의 별개의 부위를 인식하는 2개의 개질된 STAT3 항체를 전신 투여하는 항종양 효과가 STAT3/엑스포틴 7 및 다른 대조군 항체화 함께 평가되었다(도 27E 하부 패널). 당해 실험 세트의 항종양 효과는 종양내 항체의 검출(도 30a, 30b) 및 종양 맥관구조의 파괴, STAT3 다운스트림 종양발생 유전자 c-Myc의 억제 및 세포자멸적 절단된 카스파제 3에 있어서의 증가와 관련되었다(도 31a, 31b). 인간 U251 신경아교종 종양을 지닌 마우스에서 개질된 항체의 조직 분포를 평가하기 위하여, STAT3/엑스포틴 7 항체를 국소 복강 및 전신 주사 둘 다를 통해 투여하였다. 항체 주사 후 24 시간째에, 종양 외에 몇개의 기관으로부터의 조직을 공초점 현미경적 분석을 위해 제조하여 형광-표지된 항체 뿐만 아니라 CD31 및 절단된 카스파제 3의 존재를 검출하여 맥관구조 및 종양 세포 세포자멸사에 있어서 항체의 효과를 평가하였다. 당해 실험 세트로부터 생성된 데이타는, 최종 주사 후 24시간째에(국소 및 전신 둘 다에서) 개질된 항체는 종양, 종양 맥관구조 파괴 및 세포자멸사 유도에 가장 우세하였음을 나타내었다(도 27f).
연구는, 항체를 포스포로티오에이트화된-올리고로 개질시키는 것이, 항체가 세포막을 침투하도록 함을 실증하였다. 또한 표적 단백질에 대한 결합은 표적화 항체의 세포내 체류를 촉진하여, 세포가 효율적으로 이동하는 것을 허용하지 않는 것으로 보인다. 본원에 나타낸 결과가 항체의 세포내 전달에 있어서의 유효성만을 나타낸다고 해도, 기술 플랫폼은 다양한 단백질/효소의 세포침투가 가능하도록 하는데 적용할 수 있다.
시험관내 및 생체내 결과는 다클론성 및 단클론성 항체 둘 다의 사용을 포함한다. 단클론성 항체가 오늘날 임상에서 사용된 유일한 것이고 순수하다는 이점이 있지만, 다클론성 항체가 항원/표적의 다중 에피토프를 인식하는 그것의 능력으로 인하여 잠재적으로 더 나은 효능을 가질 수 있다. 다클론성 항체가 또한 임상 용도에 적합한지의 여부는 추가의 고려사항들을 기다려야 하고 추가의 조사가 보장되어야 한다. 현재, 2개의 상이한 접근법을 사용하여 포스포로티오에이트화된 올리고를 항체와 부착시켜왔다. 그럼에도 불구하고, 현재의 연구는, 거대분자, 예컨대 항체가 현재 다루기 힘든것으로 고려되는 것들을 포함하는 세포내 분자를 표적화하는데 사용될 수 있다는 원리의 증거를 실증하여 왔다.
실시예 3. 포스포로티오에이트화된-올리고 개질된 항체는 세포내로 도입되어 세포내 표적을 인식한다.
핵산은 단백질, 예컨대 항체에 다양한 방식으로 부착될 수 있다. 활성에 있어서의 부착의 효과를 시험하기 위해, 세포를 비닐 설폰 반응성 모이어티 또는 S-S-헥사놀 반응성 모이어티를 통해 포스포로티오에이트화된 핵산에 부착된 항체와 함께 인큐베이트하였다. 항체를 실시예 2에 대한 방법에서 개괄된 바와 같이 제조하였다. αSTAT3-VS-올리고 P를 위해, 당해 항체를 HPLC에 의해 VS-올리고(αSTAT3-VS-올리고 UP)와 반응한 항체를 정제함으로써 제조하였다. P는 정제됨을 나타내고 UP는 정제되지 않음을 나타낸다.
인간 Karpas299 림프종 세포를 2시간 동안 포스포로티오에이트화된 DNA-20량체(meric)-올리고 또는 정제되지 않은 SSR-올리고-항체 콘주게이트/복합체의 비닐설폰 (VS) 매개된 부착을 통해 개질된 10μg/ml의 정제된 (P) 또는 정제되지 않은(UP) aSTAT3 토끼-항체와 함께 인큐베이트하였다. 세포를 고정시키고 투과시킨 후, 토끼 IgG 종을 세포내로 염색하고 세포를 토끼 IgG 함량에 대해 게이팅(gating)에 의해 명시된 바와 같은 유동 세포분석을 통해 분석하였다. 결과는 도 32에 나타낸다. 특이적으로, 이 결과는, 상이한 화학적 수단을 통해 포스포로티오에이트화된 핵산에 부착된 항체가 세포내 전달을 달성할 수 있음을 나타낸다.
전달 및 인식을 확인하기 위하여, 인간 U251 신경아교종 세포를 2시간 동안 10μg/ml의, 포스포로티오에이트화된 DNA-20량체(meric)-올리고의 비닐설폰 (VS)의 매개된 부착을 통해 개질된 정제된(P) aSTAT3 항체(레인 1) 또는 개질되지 않은 aSTAT3 단독(레인 3) 또는 VS를 통해 부착된 바와 동일한, aSTAT3 및 500 pmol/ml 포스포로티오에이트화된 GpC1668(레인 4; 비어있는 레인 2)과 함께 인큐베이트하였다. 세포 잔해물로부터 청소된 전체의 세포 용해물을 제조한 후, 단백질 G 커플링된 아가로스 비드를 부가하고 웨스턴 블랏 절차 전에 4℃에서 밤새 인큐베이트하였다. 결과는 도 33a에 나타낸다.
인간 U251 세포를 2시간 동안 10μg/ml의, SSR을 통해 개질된 정제되지 않은(UP) aSTAT3 항체(레인 2), 포스포로티오에이트화된 올리고의 비닐설폰(VS) 매개된 부착을 통해 개질된 정제되지 않은(UP) aSTAT3 항체(레인 3) 또는 포스포로티오에이트화된 비닐설폰(VS) 매개된 부착을 통해 개질된 정제된(P) aSTAT3 항체(레인 4); 항체 IgG의 미부가(레인 1)와 함께 인큐베이트하였다. 세포 잔해로부터 청소된 전체의 세포 용해물을 제조한 후, 단백질 G 커플링된 아가로스 비드를 부가하고 웨스턴 블랏 절차 전에 4℃에서 밤새 인큐베이트하였다. 결과는 도 33b에 나타낸다.
도 33a 및 33b는, 비닐 설폰 반응성 모이어티를 통해 부착된 포스포로티오에이트화된 핵산을 지닌 항체의 집단이 세포로 도입되어 세포내 표적을 인식할 수 있음을 나타낸다. 게다가, 도면은, 상이한 화학적 부착, 예를 들면, S-S-헥사놀을 통해 부착된 포스포로티오에이트화된 핵산을 지닌 항체의 집단이 또한 세포내 전달 및 표적 인식을 초래함을 입증한다.
구현예
구현예 P1. 세포침투 콘주게이트로서, 포스포로티오에이트 핵산에 부착된 비-세포침투 단백질을 포함하고, 상기 포스포로티오에이트 핵산은 비-세포침투 단백질의 세포내 전달을 향상시키는, 세포침투 콘주게이트.
구현예 P2. 구현예 1에 있어서, 복수의 포스포로티오에이트 핵산은 상기 비-세포침투 단백질에 부착된다.
구현예 P3. 구현예 2에 있어서, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25개, 또는 그 이상의 포스포로티오에이트 핵산은 상기 단백질에 부착된다.
구현예 P4. 구현예 1 내지 3 중 어느 한 구현예에 있어서, 각각의 포스포로티오에이트 핵산은 비-세포침투 단백질의 라이신, 아르기닌, 시스테인, 또는 히스티딘에 독립적으로 부착된다.
구현예 P5. 구현예 4에 있어서, 각각의 포스포로티오에이트 핵산은 상기 단백질의 라이신에 부착된다.
구현예 P6. 구현예 4에 있어서, 상기 단백질은 상기 단백질의 라이신, 아르기닌, 시스테인, 히스티딘, 또는 이들의 조합의 10%, 25%, 50%, 75%, 90%, 95%, 또는 100%에 부착되는 포스포로티오에이트 핵산을 포함한다.
구현예 P7. 구현예 1 내지 6 중 어느 한 구현예에 있어서, 각각의 포스포로티오에이트 핵산은 독립적으로 길이가 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100개 또는 그 초과인 핵산 잔기이다.
구현예 P8. 구현예 7에 있어서, 각각의 포스포로티오에이트 핵산은 독립적으로 길이가 10개 내지 30개 잔기이다.
구현예 P9. 구현예 1 내지 8 중 어느 한 구현예에 있어서, 각각의 포스포로티오에이트 핵산은 상기 단백질에 공유부착된다.
구현예 P10. 구현예 1 내지 9 중 어느 한 구현예에 있어서 , 각각의 포스포로티오에이트 핵산은 비특이적 서열을 포함한다.
구현예 P11. 구현예 1 내지 10 중 어느 한 구현예에 있어서 , 상기 비-세포침투 단백질은 고분자량 단백질이다.
구현예 P12. 구현예 1 내지 10 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 비-세포침투 단백질은 25 kD 초과의 분자량을 갖는다.
구현예 P13. 구현예 1 내지 10 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 비-세포침투 단백질은 25 내지 750 kD의 분자량을 갖는다.
구현예 P14. 구현예 1 내지 13 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 비-세포침투 단백질은 항체이다.
구현예 P15. 구현예 14에 있어서, 상기 항체는 IgG 항체이다.
구현예 P16. 구현예 14에 있어서, 상기 항체는 IgA, IgM, IgD 또는 IgE 항체이다.
구현예 P17. 구현예 14에 있어서, 상기 항체는 Fv 단편이다.
구현예 P18. 구현예 14 내지 17 중 어느 한 구현예에 있어서 , 상기 항체는 인간화된 항체이다.
구현예 P19. 구현예 1 내지 18 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 비-세포침투 단백질은 세포내 표적에 결합한다.
구현예 P20. 구현예 19에 있어서, 상기 세포내 표적은 자가면역 질환, 염증성 질환, 대사성 장애, 발달 장애, 심혈관 질환, 간 질환, 창자 질환, 감염성 질환, 내분비 질환, 신경적 장애, 및 암으로 구성된 군으로부터 선택된 질환의 표적이다.
구현예 P21. 구현예 19 또는 20에 있어서, 상기 세포내 표적은 신호전달 분자 또는 전사 인자이다.
구현예 P22. 구현예 21에 있어서, 상기 신호전달 분자는 포스파타제 또는 키나아제이다.
구현예 P23. 구현예 20에 있어서, 상기 세포내 표적은 암 표적이다.
구현예 P24. 구현예 19에 있어서, 상기 세포내 표적은 STAT3이다.
구현예 P25. 구현예 19에 있어서, 상기 세포내 표적은 엑스포틴 7이다.
구현예 P26. 구현예 1 내지 25 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 비-세포침투 단백질은 상기 단백질에 부착된 표지, 소분자 또는 기능적 핵산을 추가로 포함한다.
구현예 P27. 세포내 표적에 결합된, 구현예 1 내지 26 중 어느 한 구현예의 콘주게이트.
구현예 P28. 구현예 1 내지 26 중 어느 한 구현예의 세포침투 콘주게이트를 포함하는, 세포.
구현예 P29. 구현예 1 내지 26 중 어느 한 구현예의 세포침투 콘주게이트 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는, 약제학적 조성물.
구현예 P30. 구현예 29에 있어서, 하나 이상의 포스포로티오에이트 핵산에 부착된 제2 비-세포침투 단백질을 추가로 포함하는, 조성물.
구현예 P31. 구현예 30에 있어서, 제2 비-세포침투 단백질 세포내 표적에 결합한다.
구현예 P32. 구현예 31에 있어서, 제2 비-세포침투 단백질은 구현예 19 내지 25 중 어느 한 구현예의 비-세포침투 단백질과 비교하여, 세포내 표적 상의 상이한 에피토프에 결합한다.
구현예 P33. 구현예 31에 있어서, 제2 비-세포침투 단백질 제2 세포내 표적에 결합한다.
구현예 P34. 구현예 30 내지 33 중 어느 한 구현예에 있어서, 제2 비-세포침투 단백질은 항체이다.
구현예 P35. 구현예 1 내지 26 중 어느 한 구현예의 세포침투 콘주게이트 또는 구현예 29의 약제학적 조성물 및 사용을 위한 설명서를 포함하는, 키트.
구현예 P36. 구현예 35에 있어서, 하나 이상의 포스포로티오에이트 핵산에 부착된 제2 비-세포침투 단백질을 추가로 포함하는, 키트.
구현예 P37. 구현예 36에 있어서, 구현예 1 내지 26 중 어느 한 구현예의 콘주게이트 및 제2 비-세포침투 단백질은 개별 용기 내에 있다.
구현예 P38 . 구현예 36에 있어서, 구현예 29의 약제학적 조성물 및 제2 비-세포침투 단백질은 개별 용기 내에 있다.
구현예 P39. 구현예 36 내지 38 중 어느 한 구현예에 있어서, 제2 비-세포침투 단백질은 구현예 19 내지 25 중 어느 한 구현예의 비-세포침투 단백질과 비교하여 세포내 표적 상의 상이한 에피토프에 결합한다.
구현예 P40. 구현예 36 내지 38 중 어느 한 구현예에 있어서, 제2 비-세포침투 단백질은 제2 세포내 표적에 결합한다.
구현예 P41. 구현예 36 내지 40 중 어느 한 구현예에 있어서, 제2 비-세포침투 단백질은 제2 비-세포침투 단백질 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약제학적 조성물로서 제형화된다.
구현예 P42. 구현예 35 내지 41 중 어느 한 구현예에 있어서, 제2 비-세포침투 단백질은 항체이다.
구현예 P43. 비-세포침투 단백질을 세포로 전달하는 방법으로서, 구현예 1 내지 26 중 어느 한 구현예의 세포침투 단백질과 접촉시키는 단계를 포함하는, 방법.
구현예 P44. 구현예 43에 있어서, 상기 비-세포침투 단백질은 상기 세포질 내의 핵 단백질에 결합하여, 이로써 비-세포침투 단백질-핵 단백질 복합체를 형성한다.
구현예 P45. 구현예 44에 있어서, 상기 비-세포침투 단백질-핵 단백질 복합체는 상기 세포 핵으로 진입할 수 없다.
구현예 P46. 대상체에서 질환을 치료하는 방법으로서, 구현예 1 내지 26 중 어느 한 구현예의 세포침투 콘주게이트의 효과적인 양을 상기 대상체에 투여하는 단계를 포함하고, 상기 콘주게이트의 투여는 상기 대상체에서의 질환을 치료하는, 방법.
구현예 P47. 구현예 46에 있어서, 하나 이상의 포스포로티오에이트 핵산에 부착된 제2 비-세포침투 단백질을 상기 대상체에 투여하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
구현예 P48. 구현예 47에 있어서, 제2 비-세포침투 단백질은 구현예 19 내지 26 중 어느 한 구현예의 콘주게이트와 비교하여, 세포내 표적 상의 상이한 에피토프에 결합한다..
구현예 P49. 구현예 47에 있어서, 제2 비-세포침투 단백질은 제2 세포내 표적에 결합한다.
구현예 P50. 구현예 47 내지 49 중 어느 한 구현예에 있어서, 구현예 1 내지 26 중 어느 한 구현예의 콘주게이트 및 제2 비-세포침투 단백질은 동시에 투여된다.
구현예 P51. 구현예 47 내지 49 중 어느 한 구현예에 있어서, 구현예 1 내지 26 중 어느 한 구현예의 콘주게이트 및 제2 비-세포침투 단백질은 순차적으로 투여된다.
구현예 P52. 구현예 47 내지 51 중 어느 한 구현예에 있어서, 제2 비-세포침투 단백질은 항체이다.
구현예 P53. 구현예 46 내지 52 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 대상체에 제2 치료제를 추가로 포함하는, 방법.
구현예 P54. 구현예 46 내지 53 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 질환은 자가면역 질환, 발달 장애, 염증성 질환, 대사성 장애, 심혈관 질환, 간 질환, 창자 질환, 감염성 질환, 내분비 질환, 신경적 장애, 및 암으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
구현예 P55. 구현예 54에 있어서, 상기 질환은 암이다.
구현예 P56. 구현예 55에 있어서, 상기 콘주게이트의 비-세포침투 단백질은 세포내 표적에 결합하고, 상기 세포내 표적은 STAT3.
구현예 P57. 구현예 55에 있어서, 상기 콘주게이트의 비-세포침투 단백질은 세포내 표적에 결합하고, 상기 세포내 표적은 엑스포틴 7에 부착한다.
구현예 P58. 구현예 52에 있어서, 상기 콘주게이트의 비-세포침투 단백질은 STAT3에 특이적으로 결합하는 항체이며, 상기 제2 비-세포침투 단백질은 엑스포틴 7에 특이적으로 결합하는 항체이다.
구현예 P59. 구현예 52에 있어서, 상기 콘주게이트의 비-세포침투 단백질은 STAT3에 특이적으로 결합하는 항체이며, 상기 제2 비-세포침투 단백질은 STAT3의 또다른 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체이다.
구현예 P2 1. 세포침투 콘주게이트로서, 포스포로티오에이트 핵산에 부착된 비-세포침투 단백질을 포함하고, 상기 포스포로티오에이트 핵산은 비-세포침투 단백질의 세포내 전달을 향상시키는, 세포침투 콘주게이트.
구현예 P2 2. 구현예 1에 있어서, 복수의 포스포로티오에이트 핵산은 상기 비-세포침투 단백질에 부착된다.
구현예 P2 3. 구현예 2에 있어서, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25개, 또는 그 이상의 포스포로티오에이트 핵산은 상기 단백질에 부착된다.
구현예 P2 4. 구현예 1 내지 3 중 어느 한 구현예에 있어서, 각각의 포스포로티오에이트 핵산은 비-세포침투 단백질의 라이신, 아르기닌, 시스테인, 또는 히스티딘에 독립적으로 부착된다.
구현예 P2 5. 구현예 4에 있어서, 각각의 포스포로티오에이트 핵산은 상기 단백질의 라이신에 부착된다.
구현예 P2 6. 구현예 4에 있어서, 상기 단백질은 상기 단백질의 라이신, 아르기닌, 시스테인, 히스티딘, 또는 이들의 조합의 10%, 25%, 50%, 75%, 90%, 95%, 또는 100%에 부착되는 포스포로티오에이트 핵산을 포함한다.
구현예 P2 7. 구현예 1 내지 6 중 어느 한 구현예에 있어서, 각각의 포스포로티오에이트 핵산은 독립적으로 길이가 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100개 또는 그 초과인 핵산 잔기이다.
구현예 P2 8. 구현예 7에 있어서, 각각의 포스포로티오에이트 핵산은 독립적으로 길이가 10개 내지 30개 잔기이다.
구현예 P2 9. 구현예 1 내지 8 중 어느 한 구현예에 있어서, 각각의 포스포로티오에이트 핵산은 상기 단백질에 공유부착된다.
구현예 P2 10. 구현예 1 내지 9 중 어느 한 구현예에 있어서 , 각각의 포스포로티오에이트 핵산은 비특이적 서열을 포함한다.
구현예 P2 11. 구현예 1 내지 10 중 어느 한 구현예에 있어서 , 상기 비-세포침투 단백질은 고분자량 단백질이다.
구현예 P2 12. 구현예 1 내지 10 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 비-세포침투 단백질은 25 kD 초과의 분자량을 갖는다.
구현예 P2 13. 구현예 1 내지 10 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 비-세포침투 단백질은 25 내지 750 kD의 분자량을 갖는다.
구현예 P2 14. 구현예 1 내지 13 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 비-세포침투 단백질은 항체이다.
구현예 P2 15. 구현예 14에 있어서, 상기 항체는 IgG 항체이다.
구현예 P2 16. 구현예 14에 있어서, 상기 항체는 IgA, IgM, IgD 또는 IgE 항체이다.
구현예 P2 17. 구현예 14에 있어서, 상기 항체는 Fv 단편이다.
구현예 P2 18. 구현예 14 내지 17 중 어느 한 구현예에 있어서 , 상기 항체는 인간화된 항체이다.
구현예 P2 19. 구현예 1 내지 18 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 비-세포침투 단백질은 세포내 표적에 결합한다.
구현예 P2 20. 구현예 19에 있어서, 상기 세포내 표적은 자가면역 질환, 염증성 질환, 대사성 장애, 발달 장애, 심혈관 질환, 간 질환, 창자 질환, 감염성 질환, 내분비 질환, 신경적 장애, 및 암으로 구성된 군으로부터 선택된 질환의 표적이다.
구현예 P2 21. 구현예 19 또는 20에 있어서, 상기 세포내 표적은 신호전달 분자 또는 전사 인자이다.
구현예 P2 22. 구현예 21에 있어서, 상기 신호전달 분자는 포스파타제 또는 키나아제이다.
구현예 P2 23. 구현예 20에 있어서, 상기 세포내 표적은 암 표적이다.
구현예 P2 24. 구현예 19에 있어서, 상기 세포내 표적 은 STAT3, 엑스포틴 7, Her2, 및 Src로 이루어진 군으로부터 선택된다.
구현예 P2 25. 구현예 19에 있어서, 상기 세포내 표적은 인산화된 Src이다.
구현예 P2 26. 구현예 1 내지 25 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 비-세포침투 단백질은 상기 단백질에 부착된 표지, 소분자 또는 기능적 핵산을 추가로 포함한다.
구현예 P2 27. 세포내 표적에 결합된, 구현예 1 내지 26 중 어느 한 구현예의 콘주게이트.
구현예 P2 28. 구현예 1 내지 26 중 어느 한 구현예의 세포침투 콘주게이트를 포함하는, 세포.
구현예 P2 29. 구현예 1 내지 26 중 어느 한 구현예의 세포침투 콘주게이트 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는, 약제학적 조성물.
구현예 P2 30. 구현예 29에 있어서, 하나 이상의 포스포로티오에이트 핵산에 부착된 제2 비-세포침투 단백질을 추가로 포함하는, 약제학적 조성물.
구현예 P2 31. 구현예 30에 있어서, 제2 비-세포침투 단백질 세포내 표적에 결합한다.
구현예 P2 32. 구현예 31에 있어서, 제2 비-세포침투 단백질은 구현예 19 내지 25 중 어느 한 구현예의 비-세포침투 단백질과 비교하여, 세포내 표적 상의 상이한 에피토프에 결합한다.
구현예 P2 33. 구현예 31에 있어서, 제2 비-세포침투 단백질 제2 세포내 표적에 결합한다.
구현예 P2 34. 구현예 30 내지 33 중 어느 한 구현예에 있어서, 제2 비-세포침투 단백질은 항체이다.
구현예 P2 35. 구현예 1 내지 26 중 어느 한 구현예의 세포침투 콘주게이트 또는 구현예 29의 약제학적 조성물 및 사용을 위한 설명서를 포함하는, 키트.
구현예 P2 36. 구현예 35에 있어서, 하나 이상의 포스포로티오에이트 핵산에 부착된 제2 비-세포침투 단백질을 추가로 포함하는, 키트.
구현예 P2 37. 구현예 36에 있어서, 구현예 1 내지 26 중 어느 한 구현예의 콘주게이트 및 제2 비-세포침투 단백질은 개별 용기 내에 있다.
구현예 P2 38 . 구현예 36에 있어서, 구현예 29의 약제학적 조성물 및 제2 비-세포침투 단백질은 개별 용기 내에 있다.
구현예 P2 39. 구현예 36 내지 38 중 어느 한 구현예에 있어서, 제2 비-세포침투 단백질은 구현예 19 내지 25 중 어느 한 구현예의 비-세포침투 단백질과 비교하여 세포내 표적 상의 상이한 에피토프에 결합한다.
구현예 P2 40. 구현예 36 내지 38 중 어느 한 구현예에 있어서, 제2 비-세포침투 단백질은 제2 세포내 표적에 결합한다.
구현예 P2 41. 구현예 36 내지 40 중 어느 한 구현예에 있어서, 제2 비-세포침투 단백질은 제2 비-세포침투 단백질 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약제학적 조성물로서 제형화된다.
구현예 P2 42. 구현예 35 내지 41 중 어느 한 구현예에 있어서, 제2 비-세포침투 단백질은 항체이다.
구현예 P2 43. 비-세포침투 단백질을 세포로 전달하는 방법으로서, 구현예 1 내지 26 중 어느 한 구현예의 세포침투 단백질과 접촉시키는 단계를 포함하는, 방법.
구현예 P2 44. 구현예 43에 있어서, 상기 비-세포침투 단백질은 상기 세포질 내의 핵 단백질에 부착하여, 이로써 비-세포침투 단백질-핵 단백질 복합체를 형성한다.
구현예 P2 45. 구현예 44에 있어서, 상기 비-세포침투 단백질-핵 단백질 복합체는 상기 세포 핵으로 진입할 수 없다.
구현예 P2 46. 대상체에서 질환을 치료하는 방법으로서, 구현예 1 내지 26 중 어느 한 구현예의 세포침투 콘주게이트의 효과적인 양을 상기 대상체에 투여하는 단계를 포함하고, 상기 콘주게이트의 투여는 상기 대상체에서의 질환을 치료하는, 방법.
구현예 P2 47. 구현예 46, 하나 이상의 포스포로티오에이트 핵산에 부착된 제2 비-세포침투 단백질을 상기 대상체에 투여하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
구현예 P2 48. 구현예 47에 있어서, 제2 비-세포침투 단백질은 구현예 19 내지 26 중 어느 한 구현예의 콘주게이트와 비교하여, 세포내 표적 상의 상이한 에피토프에 결합한다..
구현예 P2 49. 구현예 47에 있어서, 제2 비-세포침투 단백질은 제2 세포내 표적에 결합한다.
구현예 P2 50. 구현예 47 내지 49에 있어서, 구현예 1 내지 26 중 어느 한 구현예의 콘주게이트 및 제2 비-세포침투 단백질은 동시에 투여된다.
구현예 P2 51. 구현예 47 내지 49에 있어서, 구현예 1 내지 26 중 어느 한 구현예의 콘주게이트 및 제2 비-세포침투 단백질은 순차적으로 투여된다.
구현예 P2 52. 구현예 47 내지 51에 있어서, 제2 비-세포침투 단백질은 항체이다.
구현예 P2 53. 구현예 46 내지 52, 상기 대상체에 제2 치료제를 추가로 포함하는, 방법.
구현예 P2 54. 구현예 46 내지 53에 있어서, 상기 질환은 자가면역 질환, 발달 장애, 염증성 질환, 대사성 장애, 심혈관 질환, 간 질환, 창자 질환, 감염성 질환, 내분비 질환, 신경적 장애, 및 암으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
구현예 P2 55. 구현예 54에 있어서, 상기 질환은 암이다.
구현예 P2 56. 구현예 55에 있어서, 상기 콘주게이트의 비-세포침투 단백질은 세포내 표적에 결합하고, 상기 세포내 표적은 STAT3, 엑스포틴 7, Her2 또는 Src이다.
구현예 P2 57. 구현예 55에 있어서, 상기 콘주게이트의 비-세포침투 단백질은 세포내 표적에 결합하고, 상기 세포내 표적은 인산화된 Src이다.
구현예 P2 58. 구현예 52에 있어서, 상기 콘주게이트의 비-세포침투 단백질은 STAT3에 특이적으로 결합하는 항체이며, 상기 제2 비-세포침투 단백질은 엑스포틴 7에 특이적으로 결합하는 항체이다.
구현예 P2 59. 구현예 52에 있어서, 상기 콘주게이트의 비-세포침투 단백질은 STAT3에 특이적으로 결합하는 항체이며, 상기 제2 비-세포침투 단백질은 STAT3의 또다른 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체이다.
구현예 1. 세포침투 콘주게이트로서, 포스포로티오에이트 핵산에 부착된 비-세포침투 단백질을 포함하고, 상기 포스포로티오에이트 핵산은 비-세포침투 단백질의 세포내 전달을 향상시키는, 세포침투 콘주게이트.
구현예 2. 구현예 1에 있어서, 상기 포스포로티오에이트 핵산은 상기 비-세포침투 단백질에 공유부착된다.
구현예 3. 구현예 1에 있어서, 상기 포스포로티오에이트 핵산은 비-상기 비-세포침투 단백질에 공유부착된다.
구현예 4. 구현예 1에 있어서, 복수의 포스포로티오에이트 핵산은 상기 비-세포침투 단백질에 부착된다.
구현예 5. 구현예 4에 있어서, 각각의 상기 복수의 포스포로티오에이트 핵산 상기 단백질에 공유부착된다.
구현예 6. 구현예 4에 있어서, 각각의 상기 복수의 포스포로티오에이트 핵산 상기 단백질에 비-공유부착된다.
구현예 7. 구현예 4에 있어서, 상기 단백질은 공유적으로, 그리고 비-공유적으로 부착된 포스포로티오에이트 핵산을 포함한다.
구현예 8. 구현예 1 내지 7 중 어느 한 구현예에 있어서, 각각의 포스포로티오에이트 핵산은 상기 비-세포침투 단백질의 라이신, 아르기닌, 시스테인, 또는 히스티딘에 독립적으로 부착된다.
구현예 9. 구현예 8에 있어서, 각각의 포스포로티오에이트 핵산은 상기 단백질의 시스테인에 부착된다.
구현예 10. 구현예 1 내지 9 중 어느 한 구현예에 있어서, 각각의 포스포로티오에이트 핵산은 독립적으로 길이가 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100개 또는 그 초과인 핵산 잔기이다.
구현예 11. 구현예 10, 각각의 포스포로티오에이트 핵산은 독립적으로 길이가10개 내지 30개 잔기이다.
구현예 12. 구현예 1 내지 11 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 비-세포침투 단백질은 25 kD 초과의 분자량을 갖는다.
구현예 13. 구현예 1 내지 12 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 비-세포침투 단백질은 25 내지 750 kD의 분자량을 갖는다.
구현예 14. 구현예 1 내지 13 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 비-세포침투 단백질은 항체이다.
구현예 15. 구현예 14에 있어서, 상기 항체는 IgG 항체이다.
구현예 16. 구현예 14에 있어서, 상기 항체는 IgA, IgM, IgD 또는 IgE 항체이다.
구현예 17. 구현예 14에 있어서, 상기 항체는 Fv 단편이다.
구현예 18. 구현예 14 내지 17 중 어느 한 구현예에 있어서 , 상기 항체는 인간화된 항체이다.
구현예 19. 구현예 1 내지 18 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 비-세포침투 단백질은 세포내 표적에 결합한다.
구현예 20. 구현예 19에 있어서, 상기 세포내 표적은 자가면역 질환, 염증성 질환, 대사성 장애, 발달 장애, 심혈관 질환, 간 질환, 창자 질환, 감염성 질환, 내분비 질환, 신경적 장애, 및 암으로 구성된 군으로부터 선택된 질환의 표적이다.
구현예 21. 구현예 19 또는 20에 있어서, 상기 세포내 표적은 신호전달 분자 또는 전사 인자이다.
구현예 22. 구현예 21에 있어서, 상기 신호전달 분자는 포스파타제 또는 키나아제이다.
구현예 23. 구현예 20에 있어서, 상기 세포내 표적은 암 표적이다.
구현예 24. 구현예 19에 있어서, 상기 세포내 표적 은 STAT3, 엑스포틴 7, Her2, 및 Src로 이루어진 군으로부터 선택된다.
구현예 25. 구현예 19에 있어서, 상기 세포내 표적은 인산화된 Src이다.
구현예 26. 구현예 1 내지 25 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 비-세포침투 단백질은 상기 단백질에 부착된 표지, 소분자 또는 기능적 핵산을 추가로 포함한다.
구현예 27. 세포내 표적에 결합된, 구현예 1 내지 26 중 어느 한 구현예의 콘주게이트.
구현예 28. 구현예 1에 있어서, 비-부착된 비-세포침투 단백질을 비-부착된 포스포로티오에이트 핵산에 접촉시키는 단계 및 상기 비-부착된 포스포로티오에이트 핵산을 상기 비-부착된 비-세포침투 단백질의 아미노산에 공유적으로 부착시켜, 이로써 상기 세포침투 콘주게이트를 부착시키고 형성하는 단계에 의하여 제조된, 세포침투 콘주게이트.
구현예 29. 구현예 28에 있어서, 상기 포스포로티오에이트 핵산은 공유 반응성 모이어티를 포함한다.
구현예 30. 구현예 29에 있어서, 상기 공유 반응성 모이어티는 상기 단백질의 라이신, 아르기닌, 시스테인 또는 히스티딘과 반응성이다.
구현예 31. 구현예 29에 있어서, 상기 공유 반응성 모이어티는 시스테인과 반응성이다.
구현예 32. 구현예 28 내지 31 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 공유 반응성 모이어티는 비닐 설폰이다.
구현예 33. 구현예 1에 있어서, 비-부착된 비-세포침투 단백질을 비-부착된 포스포로티오에이트 핵산에 접촉시키는 단계 및 상기 비-부착된 포스포로티오에이트 핵산을 상기 비-부착된 비-세포침투 단백질에 부착시켜, 이로써 상기 세포침투 콘주게이트를 부착시키고 형성하는 단계에 의하여 제조된, 세포침투 콘주게이트로서, 상기 비-부착된 포스포로티오에이트 핵산은 화학식 -S-S-(CH2)z-OH를 갖는 치환체를 포함하고, z는 1 내지 10의 정수이다.
구현예 34. 구현예 28 내지 33에 있어서, 접촉은 환원 조건 하에서 수행된다.
구현예 35. 구현예 28 내지 33 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 비부착된 포스포로티오에이트 핵산은 몰과잉의 상기 비부착된 비-세포침투 단백질 내에 존재한다.
구현예 36. 구현예 1 내지 35 중 어느 한 구현예의 세포침투 콘주게이트를 포함하는, 세포.
구현예 37. 구현예 1 내지 35 중 어느 한 구현예의 세포침투 콘주게이트 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는, 약제학적 조성물.
구현예 38. 구현예 37에 있어서, 하나 이상의 포스포로티오에이트 핵산에 부착된 제2 비-세포침투 단백질을 추가로 포함하는, 약제학적 조성물.
구현예 39. 구현예 38에 있어서, 제2 비-세포침투 단백질 세포내 표적에 결합한다.
구현예 40. 구현예 39에 있어서, 제2 비-세포침투 단백질은 구현예 19 내지 25 중 어느 한 구현예의 비-세포침투 단백질과 비교하여, 세포내 표적 상의 상이한 에피토프에 결합한다.
구현예 41. 구현예 39에 있어서, 제2 비-세포침투 단백질 제2 세포내 표적에 결합한다.
구현예 42. 구현예 38 내지 41 중 어느 한 구현예에 있어서, 제2 비-세포침투 단백질은 항체이다.
구현예 43. 구현예 1 내지 35 중 어느 한 구현예의 세포침투 콘주게이트 또는 구현예 37의 약제학적 조성물 및 사용을 위한 설명서를 포함하는, 키트.
구현예 44. 구현예 43에 있어서, 하나 이상의 포스포로티오에이트 핵산에 부착된 제2 비-세포침투 단백질을 추가로 포함하는, 키트.
구현예 45. 구현예 44에 있어서, 구현예 1 내지 27 중 어느 한 구현예의 콘주게이트 및 제2 비-세포침투 단백질은 개별 용기 내에 있다.
구현예 46 . 구현예 44에 있어서, 구현예 37의 약제학적 조성물 및 제2 비-세포침투 단백질은 개별 용기 내에 있다.
구현예 47. 구현예 44 내지 46 중 어느 한 구현예에 있어서, 제2 비-세포침투 단백질은 구현예 19 내지 25 중 어느 한 구현예의 비-세포침투 단백질과 비교하여 세포내 표적 상의 상이한 에피토프에 결합한다.
구현예 48. 구현예 44 내지 46 중 어느 한 구현예에 있어서, 제2 비-세포침투 단백질은 제2 세포내 표적에 결합한다.
구현예 49. 구현예 44 내지 48 중 어느 한 구현예에 있어서, 제2 비-세포침투 단백질은 제2 비-세포침투 단백질 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약제학적 조성물로서 제형화된다.
구현예 50. 구현예 43 내지 49 중 어느 한 구현예에 있어서, 제2 비-세포침투 단백질은 항체이다.
구현예 51. 비-세포침투 단백질을 세포로 전달하는 방법으로서, 구현예 1 내지 35 중 어느 한 구현예의 세포침투 단백질과 접촉시키는 단계를 포함하는, 방법.
구현예 52. 구현예 51에 있어서, 상기 비-세포침투 단백질은 상기 세포질 내의 핵 단백질에 부착하여, 이로써 비-세포침투 단백질-핵 단백질 복합체를 형성한다.
구현예 53. 구현예 52에 있어서, 상기 비-세포침투 단백질-핵 단백질 복합체는 상기 세포 핵으로 진입할 수 없다.
구현예 54. 대상체에서 질환을 치료하는 방법으로서, 구현예 1 내지 35 중 어느 한 구현예의 세포침투 콘주게이트의 효과적인 양을 상기 대상체에 투여하는 단계를 포함하고, 상기 콘주게이트의 투여는 상기 대상체에서의 질환을 치료하는, 방법.
구현예 55. 구현예 54에 있어서, 하나 이상의 포스포로티오에이트 핵산에 부착된 제2 비-세포침투 단백질을 상기 대상체에 투여하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
구현예 56. 구현예 55에 있어서, 제2 비-세포침투 단백질은 구현예 19 내지 26 중 어느 한 구현예의 콘주게이트와 비교하여, 세포내 표적 상의 상이한 에피토프에 결합한다..
구현예 57. 구현예 55에 있어서, 제2 비-세포침투 단백질 제2 세포내 표적에 결합한다.
구현예 58. 구현예 55 내지 57에 있어서, 구현예 1 내지 26 중 어느 한 구현예의 콘주게이트 및 제2 비-세포침투 단백질은 동시에 투여된다.
구현예 59. 구현예 55 내지 57에 있어서, 구현예 1 내지 26 중 어느 한 구현예의 콘주게이트 및 제2 비-세포침투 단백질은 순차적으로 투여된다.
구현예 60. 구현예 55 내지 59에 있어서, 제2 비-세포침투 단백질은 항체이다.
구현예 61. 구현예 54 내지 60, 상기 대상체에 제2 치료제를 추가로 포함하는, 방법.
구현예 62. 구현예 54 내지 61에 있어서, 상기 질환은 자가면역 질환, 발달 장애, 염증성 질환, 대사성 장애, 심혈관 질환, 간 질환, 창자 질환, 감염성 질환, 내분비 질환, 신경적 장애, 및 암으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
구현예 63. 구현예 62에 있어서, 상기 질환은 암이다.
구현예 64. 구현예 63에 있어서, 상기 콘주게이트의 비-세포침투 단백질은 세포내 표적에 결합하고, 상기 세포내 표적은 STAT3, 엑스포틴 7, Her2 또는 Src이다.
구현예 65. 구현예 63에 있어서, 상기 콘주게이트의 비-세포침투 단백질은 세포내 표적에 결합하고, 상기 세포내 표적은 인산화된 Src이다.
구현예 66. 구현예 60에 있어서, 상기 콘주게이트의 비-세포침투 단백질은 STAT3에 특이적으로 결합하는 항체이며, 상기 제2 비-세포침투 단백질은 엑스포틴 7에 특이적으로 결합하는 항체이다.
구현예 67. 구현예 60에 있어서, 상기 콘주게이트의 비-세포침투 단백질은 STAT3에 특이적으로 결합하는 항체이며, 상기 제2 비-세포침투 단백질은 STAT3의 또다른 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체이다.
SEQUENCE LISTING <110> City of Hope Li, Lin Shively, John Swiderski, Piotr Herrmann, Andreas Yu, Hua <120> Cell Penetrating Conjugates and Methods of Use Thereof <130> 95058-02710PC-912746 <140> PCT/US2014/053549 <141> 2014-08-29 <150> 61/871,729 <151> 2013-08-29 <150> 61/939,993 <151> 2014-02-14 <160> 7 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 1 agcttcattt cccgtaaatc cctaagct 28 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> misc_feature <222> (1)..(20) <223> Oligo has phosphorothioated backbone <400> 2 tccatgagct tcctgatgct 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 3 tccatgagct tcctgatgct 20 <210> 4 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> misc_feature <222> (1)..(19) <223> Oligo has phosphorothioated backbone <400> 4 ctgtagtcct ctgagtacc 19 <210> 5 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> misc_feature <222> (1)..(19) <223> Oligo has phosphorothioated backbone <400> 5 cccaggagtc tcctgattt 19 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> misc_feature <223> Oligo has phosphorothioated backbone <400> 6 tcgtagtcct tcgagtacct 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> misc_feature <222> (1)..(20) <223> Oligo has phosphorothioated backbone <400> 7 tagatgacct tcctgctgct 20

Claims (67)

  1. 세포침투 콘주게이트(cell penetrating conjugate)로서,
    포스포로티오에이트 핵산에 부착된 비-세포침투 단백질을 포함하고,
    상기 포스포로티오에이트 핵산은 상기 비-세포침투 단백질의 세포내 전달을 향상시키는, 세포침투 콘주게이트.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 포스포로티오에이트 핵산은 상기 비-세포침투 단백질에 공유적으로 부착되는, 세포침투 콘주게이트.
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 포스포로티오에이트 핵산은 상기 비-세포침투 단백질에 비-공유적으로 부착되는, 세포침투 콘주게이트.
  4. 청구항 1에 있어서, 복수의 포스포로티오에이트 핵산은 상기 비-세포침투 단백질에 부착되는, 세포침투 콘주게이트.
  5. 청구항 4에 있어서, 상기 복수의 포스포로티오에이트 핵산 각각은 상기 단백질에 공유적으로 부착되는, 세포침투 콘주게이트.
  6. 청구항 4에 있어서, 상기 복수의 포스포로티오에이트 핵산 각각은 상기 단백질에 비-공유적으로 부착되는, 세포침투 콘주게이트.
  7. 청구항 4에 있어서, 상기 단백질은 공유적으로, 그리고 비-공유적으로 부착된 포스포로티오에이트 핵산을 포함하는, 세포침투 콘주게이트.
  8. 청구항 1 내지 7 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 포스포로티오에이트 핵산은 상기 비-세포침투 단백질의 라이신, 아르기닌, 시스테인, 또는 히스티딘에 독립적으로 부착되는, 세포침투 콘주게이트.
  9. 청구항 8에 있어서, 각각의 포스포로티오에이트 핵산은 상기 단백질의 시스테인에 부착되는, 세포침투 콘주게이트.
  10. 청구항 1 내지 9 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 포스포로티오에이트 핵산은 독립적으로 길이가 10개, 20개, 30개, 40개, 50개, 60개, 70개, 80개, 90개, 100개 또는 그 초과인 핵산 잔기인, 세포침투 콘주게이트.
  11. 청구항 10에 있어서, 각각의 포스포로티오에이트 핵산은 독립적으로 길이가 10개 내지 30개 잔기인, 세포침투 콘주게이트.
  12. 청구항 1 내지 11 중 어느 한 항에 있어서, 상기 비-세포침투 단백질은 25 kD 초과의 분자량을 갖는, 세포침투 콘주게이트.
  13. 청구항 1 내지 12 중 어느 한 항에 있어서, 상기 비-세포침투 단백질은 25 kD 내지 750 kD의 분자량을 갖는, 세포침투 콘주게이트.
  14. 청구항 1 내지 13 중 어느 한 항에 있어서, 상기 비-세포침투 단백질은 항체인, 세포침투 콘주게이트.
  15. 청구항 14에 있어서, 상기 항체는 IgG 항체인, 세포침투 콘주게이트.
  16. 청구항 14에 있어서, 상기 항체는 IgA, IgM, IgD 또는 IgE 항체인, 세포침투 콘주게이트.
  17. 청구항 14에 있어서, 상기 항체는 Fv 단편인, 세포침투 콘주게이트.
  18. 청구항 14 내지 17 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 인간화된 항체인, 세포침투 콘주게이트.
  19. 청구항 1 내지 18 중 어느 한 항에 있어서, 상기 비-세포침투 단백질은 세포내 표적에 결합하는, 세포침투 콘주게이트.
  20. 청구항 19에 있어서, 상기 세포내 표적은 자가면역 질환, 염증성 질환, 대사성 장애, 발달 장애, 심혈관 질환, 간 질환, 창자 질환, 감염성 질환, 내분비 질환, 신경적 장애, 및 암으로 구성된 군으로부터 선택된 질환의 표적인, 세포침투 콘주게이트.
  21. 청구항 19 또는 20에 있어서, 상기 세포내 표적은 신호전달 분자 또는 전사 인자인, 세포침투 콘주게이트.
  22. 청구항 21에 있어서, 상기 신호전달 분자는 포스파타제 또는 키나아제인, 세포침투 콘주게이트.
  23. 청구항 20에 있어서, 상기 세포내 표적은 암 표적인, 세포침투 콘주게이트.
  24. 청구항 19에 있어서, 상기 세포내 표적은 STAT3, 엑스포틴 7, Her2, 및 Src로 이루어진 군으로부터 선택되는, 세포침투 콘주게이트.
  25. 청구항 19에 있어서, 상기 세포내 표적은 인산화된 Src인, 세포침투 콘주게이트.
  26. 청구항 1 내지 25 중 어느 한 항에 있어서, 상기 비-세포침투 단백질은 상기 단백질에 부착된 표지, 소분자 또는 기능적 핵산을 추가로 포함하는, 세포침투 콘주게이트.
  27. 세포내 표적에 결합된, 청구항 1 내지 26 중 어느 한 항의 세포침투 콘주게이트.
  28. 청구항 1에 있어서,
    비-부착된 비-세포침투 단백질을 비-부착된 포스포로티오에이트 핵산에 접촉시키는 단계, 및
    상기 비-부착된 포스포로티오에이트 핵산을 상기 비-부착된 비-세포침투 단백질의 아미노산에 공유적으로 결합시켜, 이로써 상기 세포침투 콘주게이트를 부착시키고 형성하는 단계에 의하여 제조된, 세포침투 콘주게이트.
  29. 청구항 28에 있어서, 상기 포스포로티오에이트 핵산은 공유 반응성 모이어티를 포함하는, 세포침투 콘주게이트.
  30. 청구항 29에 있어서, 상기 공유 반응성 모이어티는 상기 단백질의 라이신, 아르기닌, 시스테인 또는 히스티딘과 반응성인, 세포침투 콘주게이트.
  31. 청구항 29에 있어서, 상기 공유 반응성 모이어티는 시스테인과 반응성인, 세포침투 콘주게이트.
  32. 청구항 28 내지 31 중 어느 한 항에 있어서, 상기 공유 반응성 모이어티는 비닐 설폰인, 세포침투 콘주게이트.
  33. 청구항 1에 있어서,
    비-부착된 비-세포침투 단백질을 비-부착된 포스포로티오에이트 핵산에 접촉시키는 단계, 및
    상기 비-부착된 포스포로티오에이트 핵산을 상기 비-부착된 비-세포침투 단백질에 결합시켜, 이로써 상기 세포침투 콘주게이트를 부착시키고 형성하는 단계에 의하여 제조된, 세포침투 콘주게이트로서,
    상기 비-부착된 포스포로티오에이트 핵산은 화학식 -S-S-(CH2)z-OH을 갖는 치환체를 포함하고, z는 1 내지 10의 정수인, 세포침투 콘주게이트.
  34. 청구항 28 내지 33에 있어서, 상기 접촉은 환원 조건 하에서 수행되는, 세포침투 콘주게이트.
  35. 청구항 28 내지 33 중 어느 한 항에 있어서, 상기 비부착된 포스포로티오에이트 핵산은 몰과잉의 상기 비부착된 비-세포침투 단백질 내에 존재하는, 세포침투 콘주게이트.
  36. 청구항 1 내지 35 중 어느 한 항의 세포침투 콘주게이트를 포함하는, 세포.
  37. 청구항 1 내지 35 중 어느 한 항의 세포침투 콘주게이트 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는, 약제학적 조성물.
  38. 청구항 37에 있어서, 하나 이상의 포스포로티오에이트 핵산에 부착된 제2 비-세포침투 단백질을 추가로 포함하는, 약제학적 조성물.
  39. 청구항 38에 있어서, 상기 제2 비-세포침투 단백질은 세포내 표적에 결합하는, 약제학적 조성물.
  40. 청구항 39에 있어서, 상기 제2 비-세포침투 단백질은 청구항 19 내지 25 중 어느 한 항의 비-세포침투 단백질과 비교하여, 상기 세포내 표적 상의 상이한 에피토프에 결합하는, 약제학적 조성물.
  41. 청구항 39에 있어서, 상기 제2 비-세포침투 단백질은 제2 세포내 표적에 결합하는, 약제학적 조성물.
  42. 청구항 38 내지 41 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 비-세포침투 단백질은 항체인, 약제학적 조성물.
  43. 청구항 1 내지 35 중 어느 한 항의 세포침투 콘주게이트 또는 청구항 37의 약제학적 조성물 및 사용을 위한 설명서를 포함하는, 키트.
  44. 청구항 43에 있어서, 하나 이상의 포스포로티오에이트 핵산에 부착된 제2 비-세포침투 단백질을 추가로 포함하는, 키트.
  45. 청구항 44에 있어서, 청구항 1 내지 27 중 어느 한 항의 콘주게이트 및 제2 비-세포침투 단백질은 개별 용기 내에 있는, 키트.
  46. 청구항 44에 있어서, 청구항 37의 약제학적 조성물 및 상기 제2 비-세포침투 단백질은 개별 용기 내에 있는, 키트.
  47. 청구항 44 내지 46 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 비-세포침투 단백질은 청구항 19 내지 25 중 어느 한 항의 비-세포침투 단백질과 비교하여, 상기 세포내 표적 상의 상이한 에피토프에 결합하는, 키트.
  48. 청구항 44 내지 46 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 비-세포침투 단백질은 제2 세포내 표적에 결합하는, 키트.
  49. 청구항 44 내지 48 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 비-세포침투 단백질은 상기 제2 비-세포침투 단백질 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약제학적 조성물로서 제형화되는, 키트.
  50. 청구항 43 내지 49 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 비-세포침투 단백질은 항체인, 키트.
  51. 비-세포침투 단백질을 세포로 전달하는 방법으로서,
    상기 세포를 청구항 1 내지 35 중 어느 한 항의 세포침투 단백질과 접촉시키는 단계를 포함하는, 방법.
  52. 청구항 51에 있어서, 상기 비-세포침투 단백질은 상기 세포질 내의 상기 핵 단백질에 결합하여, 이로써 비-세포침투 단백질-핵 단백질 복합체를 형성하는, 방법.
  53. 청구항 52에 있어서, 상기 비-세포침투 단백질-핵 단백질 복합체는 상기 세포 핵으로 진입할 수 없는, 방법.
  54. 대상체에서 질환을 치료하는 방법으로서,
    청구항 1 내지 35 중 어느 한 항의 세포침투 콘주게이트의 효과적인 양을 상기 대상체에 투여하는 단계를 포함하고,
    상기 콘주게이트의 투여는 상기 대상체에서의 상기 질환을 치료하는, 방법.
  55. 청구항 54에 있어서, 하나 이상의 포스포로티오에이트 핵산에 부착된 제2 비-세포침투 단백질을 상기 대상체에 투여하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  56. 청구항 55에 있어서, 상기 제2 비-세포침투 단백질은 청구항 19 내지 26 중 어느 한 항의 콘주게이트와 비교하여, 상기 세포내 표적 상의 상이한 에피토프에 결합하는, 방법.
  57. 청구항 55에 있어서, 상기 제2 비-세포침투 단백질은 제2 세포내 표적에 결합하는, 방법.
  58. 청구항 55 내지 57 중 어느 한 항에 있어서, 청구항 1 내지 26 중 어느 한 항의 콘주게이트 및 상기 제2 비-세포침투 단백질은 동시에 투여되는, 방법.
  59. 청구항 55 내지 57 중 어느 한 항에 있어서, 청구항 1 내지 26 중 어느 한 항의 콘주게이트 및 제2 비-세포침투 단백질은 순차적으로 투여되는, 방법.
  60. 청구항 55 내지 59에 있어서, 상기 제2 비-세포침투 단백질은 항체인, 방법.
  61. 청구항 54 내지 60에 있어서, 상기 대상체에 제2 치료제를 투여하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  62. 청구항 54 내지 61 중 어느 한 항에 있어서, 상기 질환은 자가면역 질환, 발달 장애, 염증성 질환, 대사성 장애, 심혈관 질환, 간 질환, 창자 질환, 감염성 질환, 내분비 질환, 신경적 장애, 및 암으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  63. 청구항 62에 있어서, 상기 질환은 암인, 방법.
  64. 청구항 63에 있어서, 상기 콘주게이트의 상기 비-세포침투 단백질은 세포내 표적에 결합하고, 상기 세포내 표적은 STAT3, 엑스포틴 7, Her2 또는 Src인, 방법.
  65. 청구항 63에 있어서, 상기 콘주게이트의 상기 비-세포침투 단백질은 세포내 표적에 결합하고, 상기 세포내 표적은 인산화된 Src인, 방법.
  66. 청구항 60에 있어서, 상기 콘주게이트의 상기 비-세포침투 단백질은 STAT3에 특이적으로 결합하는 항체이며, 상기 제2 비-세포침투 단백질은 엑스포틴 7에 특이적으로 결합하는 항체인, 방법.
  67. 청구항 60에 있어서, 상기 콘주게이트의 상기 비-세포침투 단백질은 STAT3에 특이적으로 결합하는 항체이며, 상기 제2 비-세포침투 단백질은 STAT3의 또다른 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체인, 방법.
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