CN105658230A - 细胞穿透缀合物及其使用方法 - Google Patents

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Abstract

本文中提供了细胞穿透缀合物。所述缀合物包含附接于硫代磷酸酯核酸或硫代磷酸酯聚合物主链的非细胞穿透蛋白，其中所述硫代磷酸酯核酸或硫代磷酸酯聚合物主链增强所述非细胞穿透蛋白的细胞内递送。还提供了包含所述缀合物的组合物和试剂盒。

Description

细胞穿透缀合物及其使用方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2013年8月29日提交的美国临时申请第61/871,729号以及2014年2月14日提交的美国临时申请第61/939,993号的优先权，所述美国临时申请通过引用整体并入本文。
关于在联邦资助的研究和开发下进行的本发明的权利的声明
本发明是使用在由美国国家卫生研究院颁发的第CA122976号基金下的资助进行的。政府具有本发明的某些权利。
发明背景
抗体因其相对于其它类型的药物诸如小分子药物的容易产生、特异性和生物耐久性而已经被证明是有效的药物形式。目前的抗体疗法只能靶向细胞外分子。然而，对于疾病治疗和疾病诊断的许多重要靶是细胞内的。例如，许多转录因子，诸如STAT3，是用于癌症治疗的最重要的然而具有挑战性的靶之一。本文中提供了用于本领域中的这些和其它需求的解决方案。
发明简述
需要使用肽和蛋白(例如抗体)来靶向细胞内的分子。然而，肽和蛋白质(例如抗体)以有效方式靶向细胞内分子的能力已证明是困难的。如在下面的实例中详尽描述的和证明的，除其它以外，本文中提供了修饰肽和蛋白质(例如抗体)，以使它们具有细胞穿透性，从而使它们能够甚至通过全身性施用有效地靶向细胞内分子的方法。另外，已显示，复合物中的两种不同的蛋白质可被提供的经修饰的抗体靶向。所提供的细胞穿透肽(蛋白质)技术可被广泛地用于靶向各种细胞内蛋白质(例如，致癌蛋白、细胞内驻留的病毒蛋白质等)。
除其它外，本文还提供了细胞穿透缀合物。在一个方面，所述缀合物包括附接于硫代磷酸酯核酸或硫代磷酸酯聚合物主链的非细胞穿透蛋白，其中所述硫代磷酸酯核酸或硫代磷酸酯聚合物主链增强了非细胞穿透蛋白的细胞内递送。在其它方面，提供了组合物和包含所述缀合物的试剂盒。
在另一个方面中，提供了将非细胞穿透蛋白递送入细胞的方法。所述方法包括将细胞与细胞穿透缀合物(包括附接于硫代磷酸酯核酸或硫代磷酸酯聚合物主链的非细胞穿透蛋白)接触，其中所述硫代磷酸酯核酸或硫代磷酸酯聚合物主链增强了非细胞穿透蛋白的细胞内递送。
在另一个方面，提供了治疗受试者的疾病的方法。所述方法包括向受试者施用有效量的细胞穿透缀合物(包括附接于硫代磷酸酯核酸或硫代磷酸酯聚合物主链的非细胞穿透蛋白)，其中所述硫代磷酸酯核酸或硫代磷酸酯聚合物主链增强了非细胞穿透蛋白的细胞内递送，并且其中所述缀合物的施用治疗受试者的疾病。
附图简述
图1A、1B、1C、1D和1E显示利用抗体靶向STAT3融合蛋白或STAT3/输出蛋白7复合物的两个分立部分将STAT3保留在细胞质中。图1A是显示通过针对STAT3-GFP的STAT3和GFP抗体至小鼠3T3/v-Src细胞的递送将STAT3-GFP限制在细胞质中的图像。添加Hoechst33342以对核酸进行染色。比例尺为10μm。图1B是肿瘤裂解物的STAT3或输出蛋白7免疫沉淀后的免疫印迹分析的图像，显示了STAT3与输出蛋白7相互作用。PIS：免疫前血清。图1C是使用(Uppsala,Sweden)技术进行的U251细胞中的相互作用的STAT3和输出蛋白7的原位位定的图像。相互作用事件显示为点样结构。将阻止检测抗体对STAT3识别的STAT3阻断肽用作对照。在右下角放大显示选定的区域(虚线)。比例尺为10μm(左图)。图1D是STAT3与输出蛋白7相互作用的定量分析的图表，n＝4(总信号，左)；细胞核对比细胞质信号事件，n＝26(右)。学生T检验***，P<0.001；**，P<0.01；*P<0.05。图1E是显示STAT3和输出蛋白7抗体的细胞内递送将STAT3捕获在细胞质中的图像。活细胞共焦成像表明对双抗体法对STAT3细胞再分布的作用。比例尺为10μm。
图2A、2B、2C、2D、2E、2F和2G表明STAT3的赖氨酸乙酰化决定STAT3核质穿梭和输出蛋白7的亚细胞定位。图2A是显示赖氨酸685对于STAT3核质穿梭是至关重要的iFLAP活细胞共焦成像的图像。通过多轮细胞质YFP漂白将与CFP和YFP融合的STAT3或STAT3K685R的细胞内移动作为时间的函数进行跟踪。比例尺10μm。图2B是显示STAT3K685R经历核保留并且未被STAT3和GFP抗体保留在细胞质中的图像。比例尺10μm。图2C是显示STAT3赖氨酸乙酰化而非酪氨酸磷酸化对于与输出蛋白7的相互作用是至关重要的免疫印迹的图像。图2D是显示突变具有组成型活性的STAT3中的K685消除STAT3与输出蛋白7之间的相互作用的图像。STAT3和STAT3K685R在U251人细胞中过表达，并且从全细胞裂物进行共沉淀实验。图2E是显示突变K685在体内减小STAT3与输出蛋白7、出核转运检查点核孔蛋白50和核孔蛋白153的相互作用的图像。显示的是在从通过在无胸腺裸鼠中植入利用STAT3wt-YFP或STAT3K685R-YFP重建的STAT3缺陷MEF细胞生长的肿瘤制备的裂解物的免疫沉淀后的免疫印迹分析。图2F是显示乙酰化不足的STAT3K685R在体内限制输出蛋白7的细胞核输出的图像。显示的是共聚焦显微照片。用Hoechst33342对核酸进行染色。比例尺为50μm。图2G是显示STAT3wt和STAT3K685R肿瘤中的细胞核输出蛋白7的定量的图，n＝6(左图)和细胞核直径，n＝6(右图)。***，P<0.001；**，P<0.01。
图3A、3B、3C、3D、3E、3F、3G、3H和3I显示在体内靶向STAT3和体内输出蛋白7复合物对于癌症治疗是有效的。图3A是显示当用指定的抗体治疗时C57BL/6小鼠中的小鼠B16黑素瘤的肿瘤生长动力学的图表。每一个点代表治疗。学生T检验***，P<0.001；**，P<0.01；*P<0.05。图3B是如通过肿瘤的STAT3和核孔蛋白50或153的免疫共沉淀后的免疫印迹分析所显示的，在肿瘤中中断STAT3穿梭的双抗体治疗的图像。图3C是显示双抗体治疗在体内对肿瘤、肿瘤脉管血管和增殖活性的效果的苏木精和伊红(H&E)染色的图像和共聚焦图像。比例尺为100μm。图3D是显示CD31+肿瘤血管(n＝4)和Ki67+增殖活性(n＝3)的定量的柱状图柱形图。学生T检验***，P<0.001；**，P<0.01；*P<0.05。图3E是显示STAT3靶基因，Bcl-2和周期蛋白D1在用指定的抗体治疗的肿瘤中的蛋白质表达的免疫印迹的图像。图3F是利用指定的抗体局部治疗无胸腺nu/nu小鼠中的植入的人U87脑瘤的肿瘤生长动力学的图表。学生T检验***，P<0.001；**，P<0.01；*P<0.05。图3G是使用Sis可诱导元件(SIE)寡核苷酸的寡核苷酸-下拉测定，随后免疫印迹分析的图像，所述图像显示利用双抗体法治疗的肿瘤中的消失的STAT3DNA-结合活性。首先通过SDS-PAGE分离沉淀物。图3H是所述双抗体捕获法在体内有效地诱导肿瘤细胞细胞凋亡和肿瘤血管瓦解的图像。上图：检测膜联蛋白V信号的活体多光子成像。在即将进行肿瘤成像前全身性注射膜联蛋白V。CD31+肿瘤血管的共聚焦图像示于下图中。比例尺为100μm。图3I是显示利用指定的抗体治疗的肿瘤中的膜联蛋白V+肿瘤细胞的细胞凋亡(n＝4)和CD31+肿瘤血管(n＝7)的定量的柱形图。学生T检验***，P<0.001；**，P<0.01；*P<0.05。
图4A、4B、4C、4D、4E、4F、4G、4H和4I显示利用硫代磷酸酯核酸修饰的细胞穿透STAT3和输出蛋白7抗体的高效抗肿瘤功效。图4A是在指定的时间和使用荧光标记的经修饰的抗体的剂量上细胞内流式细胞术分析的图表。图4B是硫代磷酸酯核酸修饰的抗体的亚细胞定位的共聚焦显微分析的图像。将抗体(抗-Stat3-寡核苷酸-FAM和抗-输出蛋白7-寡核苷酸-TAMRA)以10μg/ml孵育2小时。比例尺为20μm。图4C是显示每隔一天用10μg总剂量的指定的硫代磷酸酯核酸修饰的抗体治疗的具有B16黑素瘤肿瘤的小鼠的肿瘤体积的图表。显示了标准偏差(SD)。学生T检验***，P<0.001；**，P<0.01；*P<0.05。图4D是显示每隔一天用10μg总剂量的寡核苷酸修饰的抗体局部或全身性治疗的或不治疗的具有B16黑素瘤肿瘤的小鼠的肿瘤体积的图表。显示了SD。学生T检验***，P<0.001；**，P<0.01；*P<0.05。图4E是显示每隔一天用递减剂量的指定抗体组合全身性治疗3次的(箭头)或不治疗的具有B16黑素瘤肿瘤的小鼠的肿瘤体积的图表。显示了SD。学生T检验***，P<0.001；**，P<0.01；*P<0.05。图4F是Stat3活性的流式细胞术分析的图表。图4G是细胞的细胞凋亡的流式细胞术分析的图表。图4F和4G使用从利用经修饰的抗体治疗的肿瘤制备的单细胞悬浮液。图4H为显示经历核孔蛋白50(上图)或核孔蛋白153(下图)的免疫沉淀，随后进行STAT3免疫印迹以评估蛋白质相互作用的从上面针对图4E描述的实验制备的肿瘤匀浆的图像。图4I为显示硫代磷酸酯核酸修饰的双抗体的有效STAT3活性阻断的电泳迁移率变化测定(EMSA)的图像。从与图4E中的肿瘤相同的肿瘤分离细胞核提取物。
图5A和5B显示STAT3与输出蛋白7相互作用。图5A是如通过在使用来自U251人脑肿瘤细胞的全细胞裂解物的共免疫沉淀后通过免疫印迹显示的，STAT3与输出蛋白7之间的相互作用的图像。通过SDS-PAGE分离STAT3蛋白沉淀，并利用免疫印迹分析对所述沉淀进行分析以鉴定其与各种指定的输出蛋白的相互作用。将全细胞裂解物包括作为对照(右边的泳道)。图5B是在MEF细胞中表达的并在指定浓度和时间点上用输出蛋白1/Crm1-特异性抑制剂细霉素B治疗的STAT3-GFP融合蛋白(上图)或NFkB亚单位p65-GFP(下图)的共聚焦显微镜检查的图像。使用共聚焦显微镜检查评估在LMB治疗后的蛋白质定位。比例尺为10mm。
图6A和6B显示分别通过iFLAP或FLIP进行的STAT3核质穿梭分析。将利用v-Src转成纤维细胞用于进行内链漂白实验(FLAP，光漂白后荧光损失)以测定STAT3的区室周转率。iFLAP技术的示意性实验设计显示用于测定(在可选择地于FLIP测定设置中进行重复轮的细胞质漂白法后)激活的STAT3或核YFP诱饵的时空分布的所有目标区域(ROI)。图6A是描绘几个表达STAT3-YFP的3T3/v-Src细胞的图像，其中一个用作对照，然而使用共聚焦显微镜检查在其相邻细胞中进行iFLAP。比例尺为10μm。图6B是显示在连续细胞质漂白和记录细胞核YFP发射时测定的在3T3/v-Src细胞中表达的细胞核STAT3-YFP或STAT3-K685R-YFP的发射信号诱饵的图表。使用FLIP参数校正和标准化获得的YFP强度。
图7A、7B和7C显示STAT3-K685R经历核保留。图7A是用Stat3-WT-YFP和Stat3-K685R-YFP瞬时转染并在指定的时间点上用10ng/ml制癌素M刺激的Stat3缺陷型MEF的共聚焦显微镜检查的图像。使用共聚焦显微镜检查评估STAT3-WT-YFP和STAT3-K685RYFP的核保留。比例尺为10μm。图7B为显示通过基于洋地黄皂苷的荧光蛋白酶保护(FPP)测定(如示意图中所示设计的)分析STAT3-WT-YFP和STAT3-K685R-YFP的细胞核输出动力学的示意图。图7C是显示3T3/v-Src转成纤维细胞中表达的STAT3-WT-YFP(上图)或STAT3-K685R-YFP(下图)的图像。在施用洋地黄皂苷后于指定的时间点上获得的活细胞的图像。以强度编码的错误颜色模式(黑色，高强度；白色，低强度)显示细胞核YFP发射的诱饵。比例尺10μm。
图8A、8B、8C和8D显示在赖氨酸K685上突变STAT3在体内消除了其与内核孔复合物(NPC)的相互作用。分别用STAT3wt或STAT3K685R稳定地重建STAT3缺陷型MEF细胞。图8A是显示移植入无胸腺nu/nu小鼠中的稳定表达STAT3-WT或STAT3-K685R的MEF细胞系的肿瘤体积的图表。图8B是突出显示如所指示的核篮(左图)中的核孔蛋白50(Nup50)和153(Nup153)的定位的NPC的示意图。当输出蛋白7通过介导与内篮(右图)的核孔蛋白的物理相互作用被识别为货物时，其帮助STAT3的细胞核输出。图8C是通过STAT3和核孔蛋白的间接免疫荧光评估的STAT3-WT和STAT3-K685R与Nup50(上图)和Nup153(下图)在体内的相互作用的共聚焦显微镜检查的图像。使用十字线功能产生STAT3和核孔蛋白双正像素，从而给予双正像素的图像掩模。比例尺为10μm。图8D是比较共定位的STAT3-WT(黑色)和STAT3-K685R(灰色)与Nup50，n＝3(左图)和Nup153，n＝3(右图)比较的双正像素的定量的图。
图9是显示输出蛋白7的定位被限制于正常组织的细胞质的图像。通过间接免疫荧光对来自指定的组织的显微切片的共聚焦显微图像的输出蛋白7、CD31和核酸进行染色。输出蛋白7+区域(虚线)的较高放大倍数分别示于右上或右下角。比例尺为50μm。
图10A、10B和10C显示利用双抗体靶向STAT3和输出蛋白g7复合物在体内阻断STAT3穿梭和功能。图10A是显示与非靶向IgG对照抗体相比较的靶向抗体的高效细胞质递送的共聚焦图像。共聚集图像是显示抗体负荷和定位的过表达STAT3-GFP的MEF肿瘤的显微切片。从选定的区域(虚线)放大(右下角)显示靶向抗体的细胞质定位。比例尺为100μm。组织显微切片的共聚焦显微图像显示局部递送的抗体的肾清除和全身性分布。比例尺为100μm。图10B是肿瘤裂解物的STAT3和核孔蛋白50的共免疫沉淀后的免疫印迹分析的图像，其显示在体内靶向抗体的细胞内递送后中断的STAT3核质穿梭。图10C是显示体内递送的靶抗体在施用后至少24小时稳定的的图像。在非还原条件下于SDSPAGE上进行蛋白质分离后进行的免疫印迹显示注射的抗体，其为兔免疫球蛋白。
图11A、11B、11C和11D显示双抗体疗法在人工肿瘤模型中的体内作用。通过将用STAT3wt稳定地重建的STAT3缺陷型MEF细胞移植入无胸腺nu/nu小鼠来生长肿瘤，并如所指示的，治疗所述肿瘤。图11A是显示肿瘤生长动力学的图表。图11B是显示利用对照以及抗-STAT3和抗-输出蛋白7抗体治疗的肿瘤中的血管生成因子的蛋白质表达水平的免疫印迹的图像。图11C是作为如所指定的抗体治疗的结果的肿瘤血管的共聚焦图像。显示(左图)和定量(右图)CD31+细胞；n＝6。学生T检验***，P<0.001；**，P<0.01；*P<0.05。比例尺10μm。图11D为显示免疫印迹揭示因双抗体治疗而引起的促细胞凋亡基因表达的增加的图像。从如所指定地治疗的肿瘤制备用于免疫印迹的裂解物。重复这些实验至少2次，结果类似。
图12A、12B和12C显示双抗体在体内在肿瘤中被高效地内化在细胞质中。图12A是显示体内施用的抗体的定位(如从针对兔免疫球蛋白染色的B16肿瘤显微切片评估的)的共聚焦显微图像。比例尺100μm(左图)。图12B是显示通过肿瘤显微切片中每视野平均荧光强度对保留在肿瘤组织中的抗体的定量的图表；非靶向免疫球蛋白(IgG，黑色)、靶向STAT3/输出蛋白7抗体组合(灰色)；n＝3。图12C是显示在C57BL/6小鼠中生长黑素瘤B16肿瘤并如所指示的，每隔一天用抗-STAT3/抗输出蛋白7免疫球蛋白、非靶向IgG对照的组合治疗其或不治疗其，并且监测肿瘤生长动力学。学生T检验***，P<0.001；**，P<0.01；*P<0.05。
图13A和13B显示自我递送抗体对细胞内靶的识别。用10μg的分别用硫代磷酸酯化的寡核苷酸修饰的αStat3(图13A)或α输出蛋白7(图13B)抗体治疗人胶质瘤U251细胞，持续指定的时间。制备全细胞裂解物，并在添加琼脂糖珠以在4℃诱导免疫沉淀过夜之前清除细胞碎片。仔细地洗涤沉淀，将其经历免疫印迹分析以测定抗体靶向识别动态学。
图14是显示细胞穿透抗体的体内肿瘤内摄取的图表。在局部施用后2小时评估在体内肿瘤对缀合于荧光寡核苷酸(oligoFAM)的硫代磷酸酯核酸修饰的抗体的细胞内摄取。解剖小鼠黑色素B16肿瘤，并制备单细胞悬浮物以用于细胞计数分析，以测定FAM(FITC)+细胞群体。用指定的经修饰的抗体治疗荷瘤小鼠，在单次治疗中提供10μg的总剂量的经寡核苷酸修饰的抗体。
图15A和15B显示细胞穿透抗体在体内至肿瘤组织的归巢和生物稳定性。图15A是被进行来评估在分别局部(s.c.，上中和上右图)或全身性(i.v.，下图)注射后荧光标记的硫代磷酸酯核酸修饰的抗体的肿瘤内分布的活体多光子显微镜检查的图像。积累的寡核苷酸修饰的抗体的点样位点与体外研究中看到的那些点样位点类似(图1B)。在施用后2小时评估在经眼眶后途径(i.v.)的全身性递送后归巢至肿瘤组织的硫代磷酸酯核酸修饰的抗体。肿瘤中积累的寡核苷酸修饰的抗体(下图)的点样变点的检测。白色虚线圆指示细胞核。比例尺为50μm。图15B是显示在最终的全身性施用后8天测定的硫代磷酸酯核酸修饰的抗体的肿瘤归巢能力和生物稳定性的免疫印迹分析的图像。如所指示，每隔一天注射不同剂量的硫代磷酸酯核酸修饰的抗体3次。在最后一次治疗后8天收获肿瘤以进行分析。将肿瘤匀浆物经历非还原SDS-PAGE，随后进行免疫印迹检测以评估肿瘤IgG负荷。
图16A和16B显示硫代磷酸酯化的核酸修饰的细胞穿透抗体至免疫细胞群体的细胞内化。图16A是以不同浓度的指定的荧光标记的寡核苷酸修饰的αStat3抗体(αStat3oligoFITC)治疗2小时的脾细胞的流式细胞术分析，以及测定由免疫细胞群体CD3+、CD11b+和B220+产生的剂量依赖性内化的图表。图16B是10μg/ml寡核苷酸修饰的抗体(绿色)至指定的脾免疫细胞群体的细胞内化的共聚焦激光扫描显微图像。用Hoechst33342对核酸进行染色。显示微分干涉对比(DIC)。比例尺为10μm。
图17A和17B显示寡核苷酸主链的硫代磷酸酯化对于细胞内抗体递送和抗原识别是至关重要的。用10μg/ml荧光标记的硫代磷酸酯化核酸修饰的αStat3抗体治疗人胶质瘤U251，持续指定的时间。通过流式细胞术分析单细胞悬浮物的经修饰的抗体的摄取。图17A是显示相较于利用缀合于不存在主链的硫醇寡核苷酸(下图)的抗体治疗的细胞，利用缀合有硫代磷酸酯化寡核苷酸主链(上图)的抗体治疗的胶质瘤细胞。缀合的寡核苷酸的不同的序列对抗体的细胞内化具有可忽略不计的作用。测试两个随机化的寡核苷酸序列。图17B是显示不同的硫代磷酸酯化的寡核苷酸序列不改变经修饰的抗体的抗原识别。用10μg的具有指定的修饰的αStat3抗体处理U251细胞。制备全细胞裂解物，添加琼脂糖珠粒以诱导免疫沉淀。将沉淀物经历免疫印迹分析以测定抗体靶向识别。
图18是显示异种移植人胶质瘤模型中由经修饰的STAT3/输出蛋白7抗体产生的高效抗肿瘤作用。将人胶质瘤U251细胞(2x106)皮下注射入免疫低下NSG/NOD小鼠。当肿瘤直径达到平均5mm时，每隔一天用10μg指定的经修饰的抗体局部治疗小鼠。每隔一天评估肿瘤体积。显示了SD。学生T检验***，P<0.001；**，P<0.01；*P<0.05。
图19是拥有具有式-S-S-R的部分的示例性硫代磷酸酯核酸的结构的示意图。为了举例说明用于硫代磷酸酯核酸序列的附接点，显示了连接于所述部分的一个硫代磷酸酯核酸。在该情况下，R为己醇，并且接头部分(具有磷酸二酯丙基重复单体单元)将–SSR连接于硫代磷酸酯核酸的其余部分。
图20显示具有乙烯砜(VS)反应性部分和将VS连接于硫代磷酸酯核酸的其余部分的接头部分(具有磷酸二酯丙基重复单体单元)的示例性硫代磷酸酯核酸的结构。为了举例说明硫代磷酸酯核酸序列的附接点，显示了连接于所述部分的一个硫代磷酸酯核酸碱基。
图21是显示用于从具有式-S-S-R的部分的硫代磷酸酯核酸合成具有乙烯砜的硫代磷酸酯核酸的示例性方法的示意图。
图22是显示用于从具有末端磷酸(PS)的核酸合成具有乙烯砜反应性部分的核酸的示例性方法的示意图。
图23A、23B、23C、23D、23E、23F和23G显示硫代磷酸酯化-寡核苷酸-修饰的抗体内化和识别细胞内靶。图23A是显示通过可选择的免疫沉淀验证的经修饰的抗体的细胞穿透和靶识别的免疫印迹的图像。通过探测STAT3的免疫印迹分析从用经修饰的STAT3抗体孵育的活细胞制备的全细胞裂解物。图23B是显示寡核苷酸的硫代磷酸酯化(PS)促进不依赖于核酸序列(第二图)或IgG种类(第三图)或细胞类型(底图)的经修饰的STAT3抗体(顶图)的细胞摄取的流式细胞术分析的图表。图23C是显示在可选择的IP之后，免疫印迹确认图23B中的流式细胞术数据的免疫印迹的图像。利用硫代磷酸酯化亲代寡核苷酸(泳道2)、非硫代磷酸酯化寡核苷酸(泳道3)和亲代寡核苷酸的硫代磷酸酯化序列-无规形式(泳道4-6)修饰的STAT3抗体。图23D是荧光标记的硫代磷酸酯化寡核苷酸修饰的抗体的细胞内分布的共聚焦显微图像。比例尺分别为20μm和10μm。图23E是显示鼠3T3/vSrc细胞对经修饰的和未修饰的p-Src抗体的细胞内摄取的流式细胞术图表。图23F是指示经修饰的p-Src抗体与其细胞内靶蛋白p-Src共定位的共聚焦显微图像。下图显示指定的区域(虚线框)的放大。以强度编码的错误颜色模式显示沿细胞膜的经修饰的p-Src抗体的细胞内分布。比例尺为10μm。图23G是显示在可选择的免疫沉淀之后利用免疫印迹检测利用修饰的经修饰的p-Src抗体或修饰的IgG抗体孵育的3T3/vSrc细胞中的经修饰的抗体-p-Src复合物复合物的免疫印迹的图像。将寡核苷酸和通过乙烯砜附接于寡核苷酸的抗体用于这些图的实验。
图24是显示经修饰的抗体的细胞内活性的流式细胞术分析的图表。流式细胞术分析表明需要靶蛋白来细胞内保留经修饰的抗体。用经修饰的p-Src抗体或经修饰的IgG抗体(上图)孵育鼠3T3/vSrc细胞。将经修饰的Stat3抗体(1μg/ml)与Stat3+或Stat3-鼠MEF细胞一起孵育2小时，随后进行流式细胞术分析(下图)。将寡核苷酸和通过乙烯砜附接于寡核苷酸的抗体用于这些图的实验。
图25A、25B、25C、25D、25E和25F显示细胞穿透p-Src抗体的抗肿瘤作用。图25A是由每隔一天用指定的经修饰的抗体局部治疗的转化鼠3T3/vSrc细胞形成的肿瘤的生长动力学的图表。显示了SD，显著性**)P≤0.01，P≤0.001。图25B是显示p-Src及其下游蛋白质在如所指示地治疗的3T3/vSrc肿瘤的匀浆物中损失的免疫印迹的图像，将所述匀浆物经历免疫印迹并探测其的激活的pY416-Src、激活的pY705-Stat3，以及几个Src下游基因的表达，如所指示的。将微管蛋白作为蛋白质上样对照来进行探测。图25C是显示经修饰的p-Src抗体在无胸腺裸鼠中有效地抑制人A2058黑素瘤生长的图表。评估肿瘤生长动力学，并每隔一天局部治疗肿瘤。显示了SD，显著性***)P≤0.001。图25D为显示将如所指示地治疗的A2058黑素瘤肿瘤的匀浆物在非还原条件下经历免疫印迹并探其测兔IgG的免疫印迹的图像。将微管蛋白作为蛋白质上样对照来进行探测。图25E是显示经修饰的p-Src抗体治疗在体内引起肿瘤血管破裂和肿瘤细胞凋亡(如通过与共聚焦显微镜检查组合折免疫组织化学显示的)的共聚焦显微图像。对如所指示地治疗的A2058黑素瘤肿瘤的肿瘤组织切片的荧光素(FITC)、CD31+肿瘤血管(上图)和裂解的半胱天冬酶3(下图)进行染色。比例尺为100μm。图25F是显示荧光信号的定量的图表。显示了SD，显著性***)P≤0.001。将与含S-S-己醇基团的寡核苷酸复合的/用其附接的抗体的混合物用于这些图的实验。
图26A、26B、26C、26D、26E、26F和26G显示靶向E6癌蛋白的经修饰的抗体在宫颈癌中的抗肿瘤功效。图26A和26B是显示人宫颈癌生长动力学的图表。将人CaSki癌细胞移植至无胸腺裸鼠中，并且每隔一天不用任何物质或用经修饰的IgG对照或如所指定的HPV16/18E6抗体局部(图26A)或全身性(图26B)治疗所述小鼠。显示了SD，显著性*)P≤0.05，**)P≤0.01，***)P≤0.001。图26C是显示经修饰的E6抗体对CaSki肿瘤的破坏的显微图像。显示的是通过H&E染色和通过亮视野显微镜检查分析的图像。比例尺为100μm。图26D是显示利用经修饰的E6抗体治疗的CaSki宫颈肿瘤的匀浆物中的FADD蛋白质水平的升高的免疫印迹的图像。将肌动蛋白作为蛋白质上样对照来进行探测。图26E是显示指示利用经修饰的E6抗体治疗的CaSki肿瘤中的半胱天冬酶8mRNA的升高的表达的RT-PCR的图表。显示了SD，显著性**)P≤0.01。图26F是显示在免疫染色之后，共聚焦显微镜检查显示经修饰的E6抗体但非对照IgG抗体的体内保留，从而导致肿瘤血管的损失和裂解的半胱天冬酶3的增加的图像。对如所指示的治疗的CaSki宫颈肿瘤的肿瘤组织切片的荧光素(FITC)、CD31+肿瘤血管和裂解的半胱天冬酶3进行染色。比例尺为100μm。图26G是显示荧光信号的定量的图表。显示了SD，显著性**)P≤0.01，***)P≤0.001。将具有附接的含有S-S-己醇基团的寡核苷酸的抗体的混合物用于这些图中的实验中。
图27A、27B、27C、27D、27E、27F和27G显示用经修饰的抗体靶向STAT3。图27A是显示经修饰的抗体在体餐诱导细胞核积累的Stat3的细胞质再定位的图像。利用指定的抗体治疗表达Stat3-mCherry融合蛋白的鼠3T3/vSrc细胞。利用共聚焦显微镜术分析活细胞中的Stat3区室定位。比例尺为10μm。图27B是显示经修饰的STAT3和输出蛋白7抗体治疗诱导高效的抗肿瘤作用的图表。利用指定的抗体治疗的小鼠中的B16黑素瘤肿瘤生长动力学。左图：局部注射；中图：局部对比全身性治疗，右图：以递减剂量进行的三个全身性治疗(箭头)。显示了SD，显著性**)P≤0.01，***)P≤0.001。图27C是显示利用经修饰的STAT3/输出蛋白7抗体的全身性治疗消除了肿瘤中的Stat3DNA-结合(如使用来自图27B的右图中的肿瘤匀浆物的细胞核提取物通过EMSA评估的)的免疫印迹的图像。图27D是显示全身施用的靶向抗体的延长的体内稳定性的免疫印迹的图像。将图27C的右图的肿瘤匀浆物在非还原条件下经历免疫印迹并探测其兔免疫球蛋白。图27E是显示利用指定的抗体局部治疗的无胸腺裸鼠中的人U87胶质瘤的肿瘤生长动力学的图表。图27F显示利用指定的抗体全身性治疗的无胸腺裸鼠中的人U87胶质瘤的肿瘤生长动力学。显示了SD，显著性*)P≤0.05，**)P≤0.01，***)P≤0.001。图27G是显示积累在其中存在靶的肿瘤中的并且产生抗肿瘤作用的经修饰的抗体的图像。如所指示的，每隔一天局部或全身性治疗，或不治疗移植有人U251胶质瘤细胞的无胸腺裸鼠。对来自指定的器官(肿瘤)的组织切片的荧光素(FITC)(以检测经修饰的抗体)、CD31+(针对肿瘤血管)和裂解的半胱天冬酶3(针对肿瘤细胞的细胞凋亡)进行染色。插图显示指定区域(虚线框)的放大。比例尺为100μm。将寡核苷酸和通过乙烯砜附接于寡核苷酸的抗体用于图27A、27B、27C、27D、27E和27G的实验。对于图27F，STAT3/Exp7为寡核苷酸和通过乙烯砜附接有寡核苷酸的抗体，然而对于STAT3Rb/STAT3M和STAT3Rb/Rb，使用具有附接的含有S-S-己醇基团的寡核苷酸的抗体的混合物。
图28是显示磷硫酯化的寡核苷酸(FAM-阳性)和递送的抗体在体内的共定位的图像。每隔一天局部治疗人U251胶质瘤3次，随后解剖肿瘤。用针对IgG兔物种的标记的抗体对肿瘤切片进行染色。通过共聚焦显微镜检查分析染色的切片。插图显示指定的区域(虚线的白色框)的放大。比例尺为50μm。
图29是显示利用10μg/ml的如所指定的经修饰的抗体治疗小鼠3T3/vSrc细胞24小时的图像。对固定的细胞的β-微管蛋白和β-肌动蛋白进行染色，并通过共聚焦显微镜检查进行分析。每一个通道的发射单独地显示在右边。比例尺为50μm.
图30A和30B显示每隔一天全身性治疗人U87胶质瘤。对肿瘤切片的荧光素进行染色。通过共聚焦显微镜术分析染色的切片。比例尺为50μm(图30A)。定量荧光素发射信号。显示SD(图30B)。
图31A和31B显示每隔一天全身性治疗人U87胶质瘤。对肿瘤切片的CD31+肿瘤脉管血管(左图)、c-Myc表达(中图)和由裂解的半胱天冬酶3指导的肿瘤细胞的细胞凋亡(右图)进行染色。通过共聚焦显微镜术分析染色的切片。比例尺分别为100μm和50μm(图31A)。定量发射信号。显示SD；显著性：*)P<0.05，**)P<0.01，***)P<0.001，(图31B)。
图32是利用10mg/ml纯化的(P)或未纯化的(UP)经由乙烯砜(VS)介导的硫代磷酸酯化的DNA-20聚体-寡核苷酸的附接修饰的抗-STAT3兔抗体，或未纯化的SSR-寡核苷酸-抗体缀合物/复合物孵育的人Karpas299淋巴瘤细胞的流式细胞分析的图。
图33A和33B是显示硫代磷酸酯化的寡核苷酸修饰的抗体进入细胞并识别细胞内靶，诸如STAT3的免疫印迹的图像。图33A是用单独的10mg/ml纯化的(P)aSTAT3抗体(经由乙烯砜(VS)介导的硫代磷酸酯化的DNA-20聚体寡核苷酸的附接修饰的(泳道1)或未经修饰的aSTAT3(泳道3))或aSTAT3和500pmol/ml硫代磷酸酯化的GpC1668(同样经由VS附接的)(泳道4；泳道2为空)孵育的人U251胶质瘤细胞的免疫印迹的图像。图33B是显示用10mg/ml未纯化的(UP)aSTAT3抗体(经由SSR修饰的)(泳道2)、未纯化的(UP)aSTAT3抗体(经由乙烯砜(VS)介导的硫代磷酸酯化的寡核苷酸的附接修饰的)(泳道3)或纯化的(P)aSTAT3(经由乙烯砜(VS)介导的硫代磷酸酯化的寡核苷酸的附接修饰的)(泳道4)；未添加抗体IgG(泳道1)孵育人U251细胞的免疫印迹的图像。
发明详述
术语“受试者”、“患者”、“个体”等并非旨在进行限制，并且通常可互换。即，被描述为“患者”的个体不一定具有给定的疾病，但可以仅仅是就医。
“对照”或“标准对照”是指用作与测试样品、测量或值比较的参照(通常已知的参照)的样品、测量或值。例如，测试样品可采自疑似患有给定的疾病(例如自身免疫性疾病、炎性自身免疫疾病、癌症、感染性疾病、免疫疾病或其它疾病)的患者，并且将其与已知的正常(非患病的)个体(例如标准对照受试者)相比较。标准对照也可代表从不具有给定的疾病的相似个体(例如标准对照受试者)，例如，具有相似医学背景、相同年龄、体重等的健康个体的群体(即标准对照群体)收集的平均测量或值。标准对照值还可获自相同个体，例如，获自疾病发作前的患者的较早获得的样品。本领域技术人员将认识到，标准对照可被设计来用于评估许多参数(例如RNA水平、蛋白质水平、特定细胞类型、特定的体液、特定的组织、滑膜细胞、滑液、滑膜组织、成纤维细胞样滑膜细胞、巨噬细胞样滑膜等)。
本领域技术人员将理解哪种标准对照最适合于特定的情况，并且能够与标准对照值的比较分析数据。标准对照对于测定数据的显著性(例如统计显著性)也是有价值的。例如，如果对于给定的参数的值在标准对照中是广泛变化的，则测试样品中的变化将不被视为显著的。
术语“剂量”和“药量”在本文中可互换使用。剂量是指在每次施用时给予体的活性成分的量。剂量将取决于许多因素，包括用于给定的疗法的正常剂量的范围、施用频率；个体的尺寸和耐受性；病况的严重度；副作用风险；以及施用途径。本领域技术人员将认识到，可取决于上述因素或基于治疗进展修改剂量。术语“剂型”是指药物或药物组合物的特定形式，并取决于施用途径。例如，剂型可以呈用于喷雾(例如，用于吸入剂)的液体形式，用于口服递送的片剂或液体，或例如用于注射的盐溶液。
如本文中所用，术语“治疗”和“预防”可指发病的任何延迟、症状的频率或严重度的降低、症状的改善、患者舒适度或功能(例如关节功能)的改善、疾病状态的严重度的下降等。可将治疗的效果与未接受给定的治疗的个体或个体群比较，或与治疗前或治疗停止后的同一患者相比较。术语“防止”通常指给定的疾病(例如自体免疫性疾病、炎性疾病、癌症、感染性疾病、代谢疾病、发育疾病、心血管疾病、肝病、肠病、内分泌疾病、神经疾病或其它疾病)或疾病症状在患者中发生的减少。如上所示，预防可以是完全的(无可检测的症状)或部分的，以使得观察到比治疗不存在时可能发生的更少的症状。
如本文中所用，“治疗有效剂量或量”意指“治疗有效剂量或量”意指对于其的施用产生作用(例如治疗或预防疾病)的剂量。确切剂量和制剂将取决于治疗的目的，并且将可由本领域技术人员使用已知的技术(参见，例如，Lieberman,PharmaceuticalDosageForms(第1-3卷，1992)；Lloyd,TheArt,ScienceandTechnologyofPharmaceuticalCompounding(1999)；Remington:TheScienceandPracticeofPharmacy，第20版，Gennaro，编辑(2003)，和Pickar,DosageCalculations(1999))。例如，对于给定的参数，治疗有效量将显示至少5％、10％、15％、20％、25％、40％、50％、60％、75％、80％、90％或至少100％的增加或减少。治疗功效还可被表达为“-倍”增加或减少。例如，治疗有效量可具有高于标准对照的至少1.2倍、1.5倍、2倍、5倍或更多倍的作用。治疗有效剂量或量可改善疾病的一个或多个症状。当施用其的作用是治疗处于发展疾病的风险中的人时，治疗有效剂量或量可预防或延迟疾病或疾病的一个或多个症状的发作。
术语“诊断”是指疾病(例如自身免疫性疾病、炎性自身免疫疾病、癌症、感染性疾病、免疫疾病或其它疾病)存在于受试者中的相对概率。类似地，术语“预后”是指对于疾病状态某些将来的结果可在受试者中发生的相对概率。例如，在本发明的上下文中，预后可以指个体将发展疾病(例如自身免疫、炎性自身免疫、癌症、感染性疾病、免疫或其它疾病)，或该疾病的可能严重度(例如，疾病的持续时间)的可能性。术语不旨在是绝对的，这将被医学诊断领域技术人员所理解。
本文中使用的“核酸”或“寡核苷酸”或“多核苷酸”或语法上的等同物意指至少两个共价地连接在一起的核苷酸。术语“核酸”包括单链、双链、多链或支链DNA、RNA及其类似物(衍生物)。术语“硫代磷酸酯核酸”是指其中一个或多个核苷酸间键联是通过磷代磷酸酯部分(硫代磷酸)部分的核酸。磷代磷酸酯部分可以是单硫代磷酸(-P(O)3(S)3--)或二硫代磷酸(-P(O)2(S)2 3--)。在本文所提供的所有方面的实施方案中，所述硫代磷酸酯部分是单硫代磷酸酯(-P(O)3(S)3--)。即，在本文中提供的所有方面的实施方案中，所述硫代磷酸酯核酸是单硫代磷酸酯核酸。在实施方案中，硫代磷酸酯核酸的一个或多个核苷通过硫代磷酸酯部分(例如单硫代磷酸酯)连接，而其余核苷通过磷酸二酯部分(-P(O)4 3--)连接。在实施方案中，硫代磷酸酯核酸的一个或多个核苷通过硫代磷酸酯基团(例如单硫代磷酸酯)部分连接，而其余核苷通过甲基膦酸酯键联连接。在实施方案中，硫代磷酸酯核酸的所有核苷通过硫代磷酸酯部分(例如单硫代磷酸酯)部分连接。
硫代磷酸酯寡核苷酸(硫代磷酸酯核酸)的长度通常为约5、6、7、8、9、10、12、15、25、30、40、50或更多个核苷酸，长度可达约100个核苷酸。硫代磷酸酯核酸的长度还可以更长，例如，200、300、500、1000、2000、3000、5000、7000、10,000个核苷酸等。如上所述，在某些实施方案中。本文中的硫代磷酸酯核酸包含一个或多个磷酸二酯键。在其它实施方案中，硫代磷酸酯核酸包括备选主链(例如，如本领域中已知的磷酸二酯的模拟物或类似物，诸如，硼烷磷酸、甲基膦酸酯，氨基磷酸酯或O-甲基亚磷酰胺键联)(见Eckstein,OligonucleotidesandAnalogues:APracticalApproach,OxfordUniversityPress)。硫代磷酸酯核酸还可包括本领域已知的一个或多个核酸类似物单体，诸如，肽核酸单体或聚合物、锁核酸单体或聚合物、吗啉代单体或聚合物、乙二醇核酸单体或聚合物，或苏糖核酸单体或聚合物。其它类似物核酸包括具有正主链、非离子主链和非核糖主链的那些类似物核酸，包括在以下专利和文献中描述的那些类似物核酸：美国专利第5,235,033和5,034,506号，以及第6和第7章，ASCSymposiumSeries580,CarbohydrateModificationsinAntisenseResearch,Sanghui&Cook,编辑。含有一个或多个碳环糖的核酸也包括在核酸的一个定义内。可出于各种原因进行核糖-磷酸主链的修饰，例如，为了增加此类分子在生理环境中或作为探针在生物芯片上的稳定性和半衰期。可产生天然存在的核酸与类似物的混合物；或者，可产生不同核酸类似物的混合物，和天然存在的核酸与类似物的混合物。硫代磷酸酯核酸和硫代磷酸酯聚合物主链可以是直链或支链的。例如，将支链核酸重复分支，以形成高级有序结构，例如树状聚合物等。
如本文中所用，“硫代磷酸酯聚合物主链”是具有至少两个硫代磷酸酯键联(例如单硫代磷酸酯)(例如将糖亚单位、环状亚单位或烷基亚单位连接在一起)的化学聚合物。所述硫代磷酸酯聚合物主链可以是硫代磷酸酯糖聚合物，其为其中一个或多个(或所有)戊糖链不存在通常存在于核酸中的碱基(核碱基)的硫代磷酸酯核酸。硫代磷酸酯聚合物主链可包括两个或更多个硫代磷酸酯键联。所述硫代磷酸酯聚合物主链可以包括5、6、7、8、9、10、12、15、25、30、40、50或更多个键联，并且可含有高达约100个硫代磷酸酯键联。硫代磷酸酯聚合物主链还可含有较大数目的键联，例如，200、300、500、1000、2000、3000、5000、7000、10,000个等。
硫代磷酸酯核酸和硫代磷酸酯聚合物主链可被部分或完全硫代磷酸酯化。例如，50％或更多的硫代磷酸酯核酸的核苷酸间键联可以是硫代磷酸酯键联。任选地，5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％的硫代磷酸酯核酸的核苷酸间键联为硫代磷酸酯键联。任选地，50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％的硫代磷酸酯核酸的核苷酸间键联为硫代磷酸酯键联。任选地，75％、80％、85％、90％、95％或99％的硫代磷酸酯核酸的核苷酸间键联为硫代磷酸酯键联。任选地，90％、95％或99％硫代磷酸酯核酸的核苷酸间键联为硫代磷酸酯键联。在实施方案中，剩余的核苷酸间键联为磷酸二酯键联。在实施方案中，剩余的核苷酸间键联为甲基膦酸酯键联。任选地，100％的硫代磷酸酯核酸的核苷酸间键联为硫代磷酸酯键联。类似地，5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％,或99％的硫代磷酸酯聚合物主链中的糖间键联可为硫代磷酸酯键联。任选地，50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％的硫代磷酸酯聚合物主链中的糖间键联可为硫代磷酸酯键联。任选地，75％、80％、85％、90％、95％或99％的硫代磷酸酯聚合物主链中的糖间键联可为硫代磷酸酯键联。任选地，90％、95％或99％的硫代磷酸酯聚合物主链的糖间键联可以是硫代磷酸酯键联。在实施方案中，剩余的核苷酸间键联为磷酸二酯键联。在实施方案中，剩余的核苷酸间键联为甲基膦酸酯键联。任选地，100％的硫代磷酸酯聚合物主链中的糖间键联为硫代磷酸酯键联。
核酸可包括非特异性序列。如本文中所用，术语“非特异性序列”是指含有未被设计来与任何其它核酸序列互补或仅与所述其它核酸序列部分互补的一系列残基的核酸。通过举例的方式，非特异性核酸序列为当与细胞或生物体接触时不充当抑制性核酸的核酸残基的序列。“抑制性核酸”是能够结合于靶核酸(例如可翻译成蛋白质的mRNA)并减少所述靶核酸(例如，(例如来自DNA的mRNA)的转录或减少所述靶核酸(例如mRNA)的释放或改变转录剪接(例如单链吗啉代寡核苷酸)的核酸(例如DNA、RNA、核苷酸类似物的聚合物)。
本文所提供的硫代磷酸酯核酸和硫代磷酸酯聚合物主链可包括一个或多个反应性部分，例如共价反应性部分。可使用任何适当的接头，诸如本领域中已知的聚合物接头(如图19和20中显示的，或可选择地聚乙二醇接头或等同物)将反应性部分附接于硫代磷酸酯核酸和硫代磷酸酯聚合物主链。在实施方案中，所述接头包括如本文所述(即被附接于)如本文中所述的可检测标记物。如本文中所用，术语“共价反应性部分”是指能够与非细胞穿透蛋白的氨基酸化学反应，如本文中所述的，以形成共价键，和从而形成本文中提供的缀合物的化学部分。
“经标记的核酸或寡核苷酸”是指通过接头或化学键共价地，或通过离子键、范德瓦尔斯力、静电力或氢键非共价地结合于标记物，以使得核酸的存在可通过检测结合于所述核酸的可检测标记物的存在来检测。或者，使用高亲和力相互作用的方法可实现相同的结果，其中一对结合伴侣中的一个结合于另一个例如生物素、链霉。在实施方案中，硫代磷酸酯核酸或硫代磷酸酯聚合物主链包括可检测的标记物，如本文所公开的和本领域中公知的。
“生物样品”或“样品”是指从受试者或患者获得的或衍生的材料。生物样品包括组织诸如活检和尸检样品的切片，和为了组织学目的而采用的冰冻切片。此类样品包括体液，例如血液和血液级分或产品(例如，血清、血浆、血小板、红血细胞等)、痰、组织、培养的细胞(例如，原代培养物、外植体和转化的细胞)、粪便、尿、滑液、关节组织、滑膜组织、滑膜、成纤维细胞样滑膜细胞、巨噬细胞样滑膜细胞、免疫细胞、造血细胞、成纤维细胞、巨噬细胞、T细胞等。通常从真核生物诸如哺乳动物，诸如灵长类动物(例如黑猩猩或人)、牛、狗、猫、啮齿类动物(例如豚鼠、大鼠，小鼠)、兔或鸟、爬行动物或鱼获取生物样品。
术语“多肽”，“肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，意指氨基酸残基的聚合物。术语适用于其中一个或多个氨基酸残基是对应的天然存在的氨基酸的人工化学模拟物的氨基酸聚合物，以及适用于天然存在的氨基酸聚合物和非天然存在的氨基酸聚合物。
术语“氨基酸”是指天然存在的和合成的氨基酸，以及以类似于天然存在的氨基酸的方式发挥作用的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然存在的氨基酸是由遗传密码编码的那些氨基酸，以及后来被修饰的那些氨基酸，例如，羟脯氨酸、γ羧基谷氨酸和O-磷酸丝氨酸。氨基酸类似物是指具有与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构(即，结合于氢、羧基、氨基和R基团的α碳)的化合物，例如，高丝氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亚砜、甲硫氨酸甲基锍。此类类似物具有经修饰的R基团(例如，正亮氨酸)或经修饰的肽主链，但保留了与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构。氨基酸模拟物是指具有与氨基酸的一般化学结构不同的结构，但以与天然存在的氨基酸类似的方式起作用的化合物。
在本文中可通过它们公知的三字母符号或由IUPAC-IUB生物化学命名委员会推荐的单字母符号来提及氨基酸。同样地，可通过它们的共同接受的单字母代码提及核苷酸。
“标记物”或“可检测的部分”是可通过光谱学、光化学、生物化学、免疫化学、化学或其它物理手段检测的组合物。例如，有用的标记物包括32P、荧光染料、电子致密试剂、酶(例如，如ELISA中常用的)、生物素、洋地黄毒苷或半抗原以例如通过将放射性标记掺入与靶肽特异性反应的肽或抗体而可被检测的和蛋白质或其它实体。可使用本领域中已知的用于将抗体缀合于标记物的任何适当的方法，例如通过使用Hermanson,BioconjugateTechniques1996,AcademicPress,Inc.,SanDiego中描述的方法。
当参考例如细胞或核酸、蛋白质或载体使用时，术语“重组”表示所述细胞、核酸、蛋白质或载体已被实验室方法修饰或为所述实验室方法的结果。因此，例如，重组蛋白包括通过实验室方法产生的蛋白质。重组蛋白可包括未在蛋白质的天然(非重组)形式中发现的氨基酸残基或可包括已被修饰，例如，标记的氨基酸残基。
当参考核酸的部分使用时，术语“异源的”表示所述核酸包含未以与彼此在自然界中的关系相同的关系发现的两个或更多个的子序列。例如，所述核酸通常被重组产生，具有被排列来产生新的功能性核酸的来自无关基因的两个或更多个序列，例如，来自一个来源的启动子和来自另一个来源的编码区。类似地，异源蛋白质表示所述蛋白质包含未以与彼此在自然界中的关系相同的关系发现的两个或更多个子序列(例如，融合蛋白)。
“抗体”是指包含来自免疫球蛋白基因或其片段的框架区的多肽，其特异性结合并识别抗原。公认的免疫球蛋白基因包括κ、λ、α、γ、δ、ε和μ恒定区基因，以及众多免疫球蛋白可变区基因。轻链被分类为κ或λ。重链被分类为γ、μ、α、δ或ε，这又分别定义了免疫球蛋白类型IgG、IgM、IgA、IgD和IgE水平。通常地，抗体的抗原结合区在结合的特异性和亲和力中是最关键的。在一些实施方案中，抗体或抗体的片段可来源于不同的生物体，包括人、小鼠、大鼠、仓鼠、骆驼等。本发明的抗体可包括在一个或多个氨基酸位置上已被修饰或突变以提高或调节所需的抗体功能(例如糖基化、表达、抗原识别、效应子功能、抗原结合、特异性等)的抗体。
示例性免疫球蛋白(抗体)结构单元包含四聚体。每一个四聚体由两对相同的多肽链组成，每一对具有一条“轻”(约25kD)和一条“重”链(约50-70kD)。每一条链的N末端定义了主要负责抗原识别的上仍约100至110个或更多个氨基酸的可变区。术语可变轻链(VL)和可变重链(VH)分别指这些轻链和重链。
抗体例如作为完整免疫球蛋白或作为许多通过利用各种肽酶消化产生的良好表征的片段存在。因此，例如，胃蛋白酶在铰链区中的二硫键以下消化抗体以产生F(ab)’2，其本身为通过二硫键联接于VH-CH1的轻链的Fab的二聚体。可在温和条件下还原F(ab)’2以破坏铰链区中的二硫键，从而将F(ab)’2二聚体转化为Fab’单体。所述Fab’单体本质上是具有铰链区的部分的Fab(参见基础免疫学(Paul编辑，第3版1993))。虽然根据完整抗体的消化定义了各种抗体片段，但本领域技术人员将理解，可化学地重新合成或通过使用重组DNA方法合成此类片段。因此，如本文中所用，术语抗体还包括通过完整抗体的修饰产生的抗体片段，或使用重组DNA方法重新合成的那些抗体片段(例如单链Fv)或使用噬菌体展示文库鉴定的那些抗体片段(参见，例如，McCafferty等，Nature348:552-554(1990))。
为了制备本发明的和用于根据本发明使用的合适的抗体，例如，重组、单克隆或多克隆抗体，可使用本领域中已知的许多技术(参见，例如，Kohler&Milstein,Nature256:495-497(1975)；Kozbor等，ImmunologyToday4:72(1983)；Cole等，MonoclonalAntibodiesandCancerTherapy,AlanR.Liss,Inc.(1985)中的第77-96页；Coligan,CurrentProtocolsinImmunology(1991)；Harlow&Lane,Antibodies,ALaboratoryManual(1988)；和Goding,MonoclonalAntibodies:PrinciplesandPractice(第2版1986))。编码目标抗体的重和轻链的基因可从细胞克隆，例如，可从杂交瘤克隆编码单克隆抗体的基因，并且将其用于产生重组单克隆抗体。还可从杂交瘤或浆细胞产生编码单克隆抗体的重和轻链的基因文库。重和轻链基因产物的随机重组产生大的具有不同抗原特异性的抗体库(参见，例如，Kuby,Immunology(第3版1997))。用于产生单链抗体或重组抗体的技术(美国专利4,946,778、美国专利4,816,567)可适合产生针对本发明的多肽的抗体。同样地，还可将转基因小鼠或其它生物体诸如其它动物用于表达人源化或人抗体(参见，例如，美国专利第5,545,807、5,545,806、5,569,825、5,625,126、5,633,425、5,661,016号，Marks等，Bio/Technology10:779-783(1992)；Lonberg等，Nature368:856-859(1994)；Morrison,Nature368:812-13(1994)；Fishwild等，NatureBiotechnology14:845-51(1996)；Neuberger,NatureBiotechnology14:826(1996)；和Lonberg&Huszar,Intern.Rev.Immunol.13:65-93(1995))。或者，可将噬菌体展示技术用于鉴定特异性结合所选定的抗原的抗体和异聚Fab片段(参见，例如，McCafferty等，Nature348:552-554(1990)；Marks等，Biotechnology10:779-783(1992))。还可产生双特异性(即，能够识别两种不同抗原)的抗体(参见，例如，WO93/08829,Traunecker等，EMBOJ.10:3655-3659(1991)；和Suresh等，MethodsinEnzymology121:210(1986))。抗体可以是异源缀合物，例如两个共价联接的抗体，或免疫毒素(参见，例如，美国专利第4,676,980号、WO91/00360；WO92/200373；和EP03089)。
用于人源化或灵长类动物化非人抗体的方法在本领域中是公知的(例如，美国专利第4,816,567、5,530,101、5,859,205、5,585,089、5,693,761、5,693,762、5,777,085、6,180,370、6,210,671和6,329,511号；WO87/02671；EP专利申请0173494；Jones等(1986)Nature321:522；和Verhoyen等(1988)Science239:1534)。在例如Winter和Milstein(1991)Nature349:293中进一步描述人源化抗体。通常地，人源化抗体具有从非人来源引入其的一个或多个氨基酸残基。这些非人氨基酸残基通常被称为输入残基，其通常取自输入可变结构域。可基本上按照Winter和同事的方法(参见，例如，Morrison等，PNASUSA,81:6851-6855(1984),Jones等，Nature321:522-525(1986)；Riechmann等，Nature332:323-327(1988)；Morrison和Oi,Adv.Immunol.,44:65-92(1988),Verhoeyen等，Science239:1534-1536(1988)以及Presta,Curr.Op.Struct.Biol.2:593-596(1992),Padlan,Molec.Immun.,28:489-498(1991)；Padlan,Molec.Immun.,31(3):169-217(1994))的方法，通过用啮齿类动物的多个CDR或CDR序列取代人抗体的对应序列来进行人源化。因此，此类人源化抗体是嵌合抗体(美国专利第4,816,567号)，其中显著少于完整人可变结构域已被来自非人物种的对应序列取代。实际上，人源化抗体通常为其中一些CDR残基和可能地一些FR残基被来自啮齿类动物抗体中的类似位点的残基取代。例如，包含编码人源化免疫球蛋白框架区的第一序列和编码期望的免疫球蛋白的互补决定区的第二序列的多核苷酸可通过合成或通过组合适当的cDNA和基因组DNA区段来产生。可按照公知的方法从多种人细胞分离人恒定区DNA序列。
“嵌合抗体”是这样的抗体分子，在所述抗体分子中(a)恒定区或其部分被改变、替换或交换，以使得抗原结合部位(可变区)连接于不同的或改变的种类的恒定区、效应子功能和/或物种或赋予嵌合抗体新的性质的完全不同的分子，例如，酶、毒素、激素、生长因子、药物等；或(b)可变区或其部分被改变、替换或与具有不同或改变的抗原特异性的可变区交换。本发明的和用于按照本发明使用的优选抗体包括人源化和/或嵌合单克隆抗体。
用于将治疗剂缀合于抗体的技术是公知的(参见，例如，Arnon等，MonoclonalAntibodiesAndCancerTherapy,Reisfeld等(编辑)，第243-56页(AlanR.Liss,Inc.1985)中的“MonoclonalAntibodiesForImmunotargetingOfDrugsInCancerTherapy”；Hellstrom等，ControlledDrugDelivery(第2版),Robinson等(编辑)，第623-53页(MarcelDekker,Inc.1987)中的“AntibodiesForDrugDelivery”；Thorpe,MonoclonalAntibodies‘84:BiologicalAndClinicalApplications,Pinchera等(编辑)，第475-506页(1985)中的“AntibodyCarriersOfCytotoxicAgentsInCancerTherapy:AReview”；和Thorpe等，“ThePreparationAndCytotoxicPropertiesOfAntibody-ToxinConjugates”,Immunol.Rev.,62:119-58(1982))。
短语“特异性(或选择性)结合于”抗体或“与…...特异性(或选择性)免疫反应的”，当提及蛋白质或肽时，是指确定蛋白质通常在蛋白质的异质群体或其它生物制品中的存在的结合反应。因此，在指定免疫测定条件下，所指定的抗体以至少两倍于本底，更常见地超过10至100倍于本底的强度结合特定蛋白质。在此类条件下对抗体的特异性结合需要针对其对于特定蛋白质的特异性选择的抗体。例如，多克隆抗体可被选择来只获得与所选定的抗原特异性免疫反应但不与其它蛋白质特异性免疫反应的那些多克隆抗体。该选择可通过减去与其它分子交叉反应的抗体来实现。可将多种免疫测定形式用于选择与特定蛋白质特异性免疫反应的抗体。例如，将固相ELISA免疫测定常规地用于选择与蛋白质特异性免疫反应的抗体(关于可用于测定特异性免疫反应的免疫测定和条件的描述，参见，例如，Harlow&Lane,UsingAntibodies,ALaboratoryManual(1998))。
如本文中所用，术语“药学上可接受的”可与“生理上可接受的”和“药理学上可接受的”同义地使用。药物组合物通常将包含用于在贮存中缓冲和保存的试剂，并且可包括用于适当的递送的缓冲液和载体，这取决于施用途径。
如本文中所用，术语“癌症”是指在哺乳动物中发现的所有类型的癌症、肿瘤或恶性肿瘤，包括白血病、癌和肉瘤。示例性癌症包括脑癌、乳腺癌、宫颈癌、结肠癌、头颈癌、肝癌、肾癌、肺癌、非小细胞肺癌、黑素瘤、间皮瘤、卵巢癌、肉瘤、胃癌、子宫癌和髓母细胞瘤。另外的实例包括霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤、多发性骨髓瘤、神经母细胞瘤、卵巢癌、横纹肌肉瘤、原发性血小板增多症、原发性巨球蛋白血症、原发性脑瘤、癌、恶性胰岛肿瘤、恶性类癌瘤、膀胱癌、恶变前皮肤损伤、睾丸癌、淋巴瘤、甲状腺癌、神经母细胞瘤、食管癌、泌尿生殖道癌、恶性高钙血症、子宫内膜癌、肾上腺皮质癌、内分泌和外分泌胰腺肿瘤和前列腺癌。
术语“白血病”广义地指血液形成器官的进行性、恶性疾病，并且通常特征在于血液和骨髓中的白细胞及其前体的扭曲增殖和发育。一般基于如下方面在临床上分类白血病：(1)疾病的持续时间和特征-急性或慢性；(2)所牵涉的细胞类型；骨髓(骨髓性)、淋巴样(成淋巴的)或单核细胞；和(3)血液中的异常细胞-白血型或非白血型(亚白血病的)的数目的增加或非增加。P388白血病模型被广泛地接受为体内抗-白血病活性的预测。据信，在P388测定中测试为阳性的化合物将通常在体内表现出一定水平的抗-白血病活性而无论待治疗的白血病的类型。因此，本申请包括治疗白血病的方法，优选地治疗如下疾病的方法：急性非淋巴细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、急性粒细胞性白血病、慢性粒细胞性白血病、急性早幼粒细胞性白血病、成人T细胞性白血病、非白血性白血病、白血性白血病(leukocythemicleukemia)、嗜碱性白血病(basophylicleukemia)、胚细胞性白血病、牛白血病、慢性髓细胞性白血病、皮肤白血病、胚胎细胞性白血病、嗜酸性粒细胞性白血病、格罗斯白血病、毛细胞白血病、成血细胞性白血病、血胚细胞性白血病、组织细胞性白血病、干细胞性白血病、急性单核细胞性白血病、白细胞减少性白血病、淋巴性白血病、淋巴母细胞性白血病、淋巴细胞性白血病、成淋巴白血病、淋巴样白血病、淋巴肉瘤细胞性白血病、肥大细胞白血病、巨核细胞白血病、小原粒型白血病、单核细胞性白血病、成髓细胞性白血病、髓细胞性白血病、骨髓性粒细胞性白血病、骨髓单核细胞性白血病、Naegeli白血病、浆细胞白血病、多发性骨髓瘤、浆细胞白血病、早幼粒细胞性白血病、李德尔氏细胞性白血病、希林氏白血病、干细胞性白血病、亚白血病性白血病和未分化细胞性白血病。
术语“肉瘤”通常是指由物质如胚胎结缔组织构成的并且通常由嵌入纤维状或均质物质中的紧密堆积的细胞组成的肿瘤。可利用抗肿瘤硫醇结合线粒体氧化剂和抗癌药物的组合治疗的肉瘤包括软骨肉瘤、纤维肉瘤、淋巴肉瘤、黑色素肉瘤、粘液肉瘤、骨肉瘤、Abemethy肉瘤、脂肉瘤、脂肪肉瘤、软组织腺泡状肉瘤、成釉细胞肉瘤、葡萄状肉瘤、绿色瘤、绒毛膜癌、胚胎性肉瘤、肾母细胞瘤肉瘤、子宫内膜肉瘤、间质肉瘤、Ewing肉瘤、筋膜肉瘤、成纤维细胞肉瘤、巨细胞肉瘤、粒细胞肉瘤、霍奇金氏淋巴瘤、特发性多发性色素沉着出血性肉瘤、B细胞的免疫母细胞肉瘤、淋巴瘤、T细胞的免疫母细胞性、詹森肉瘤、卡波西氏肉瘤、枯否细胞肉瘤、血管肉瘤、白血病性肉瘤、恶性间叶瘤肉瘤、骨旁肉瘤、网状细胞肉瘤、Rous肉瘤、浆液囊性肉瘤、滑膜肉瘤和毛细血管扩张性肉瘤。
术语“黑素瘤”意为从皮肤或其它器官的黑色素细胞系统产生的肿瘤。可利用抗肿瘤硫醇结合线粒体氧化剂与抗癌剂的组合治疗的黑素瘤包括，例如，肢端-雀斑样痣性黑素瘤、无色素性恶性黑素瘤、良性幼年黑素瘤、克劳德曼氏黑素瘤、S91黑素瘤、哈-腊二氏黑素瘤、幼年型黑素瘤、恶性雀斑样黑素瘤、恶性黑素瘤、结节性黑素瘤、甲下黑素瘤和浅表扩散性黑素瘤。
术语“癌”是指由趋于浸润周围组织并引起转移的上皮细胞组成的恶性新生长。可用抗肿瘤硫醇结合线粒体氧化剂与抗癌剂的组合治疗的示例性癌包括，例如，腺泡癌、腺泡状癌、囊性腺样癌、腺样囊性癌、癌性腺瘤、肾上腺皮质癌、肺泡癌、肺泡细胞癌、基底细胞癌、基质细胞癌(carcinomabasocellulare)、基底细胞样癌、基底鳞状细胞癌、细支气管肺泡癌、细支气管癌、支气管原癌、髓样癌、胆管细胞癌、绒毛膜癌、胶样癌、粉刺状癌、子宫体癌、筛状癌、铠甲状癌、癌疮、柱状细胞癌、圆柱细胞癌、导管癌、硬癌、胚胎性癌、髓样癌、腺样上皮细胞癌、腺样上皮癌(carcinomaepithelialeadenoides)、外植癌、溃疡性癌、纤维癌、胶样癌(gelatinifornicarcinoma)、胶状癌、巨细胞癌、巨细胞癌、腺癌、颗粒细胞癌、毛基质癌、多血癌、肝细胞癌、Hurthle细胞癌、粘液癌、肾细胞癌(hypemephroidcarcinoma)、幼稚型胚胎性癌、原位癌、表皮内癌、上皮内癌、克罗姆佩柯赫尔肿瘤、库尔契茨基细胞癌、大细胞癌、透镜状癌、豆状癌、脂瘤样癌、淋巴上皮癌、髓腔癌、髓样癌、黑色素癌、软癌、粘液癌、粘液癌(carcinomamuciparum)、克鲁肯伯格瘤(carcinomamucocellulare)、粘液表皮样癌、粘液癌、粘液癌、粘液瘤样癌、鼻咽癌、燕麦细胞癌、骨化性癌、类骨质癌、乳头状癌、门脉周癌、浸润前癌、棘细胞癌、粉刺癌、肾的肾细胞癌、储备细胞癌、肉瘤样癌、schneiderian癌、硬癌、阴囊癌、印戒细胞癌、单纯癌、小细胞癌、马铃薯状癌、球状细胞癌、梭形细胞癌、尿道海绵体癌、鳞状癌、鳞状细胞癌、绳捆癌、毛血管扩张性癌、血管扩张性癌、移行细胞癌、马铃薯癌、结节性皮癌、疣状癌和绒毛状癌。
如本文中所用，术语“转移”、“转移性”和“转移性癌症”可互换使用并且是指增殖性疾病或病症例如癌症从一个器官或另一个非相邻器官或身体部分的扩散。癌症在始发部位例如乳腺发生，所述部位被称为原发性肿瘤，例如，原发性乳腺癌。原发性肿瘤或始发部位中的一些癌细胞获得穿透和浸润局部区域中的正常组织的能力和/或穿透淋巴系统或血管系统的壁，通过所述系统循环至身体中的其它部位和组织的能力。从原发性肿瘤的癌细胞形成的第二临床可检测的肿瘤被称为转移性或继发性肿瘤。当癌细胞转移时，转移性肿瘤和其细胞被假定与原始肿瘤的那些细胞类似。因此，如果肺癌转移至乳腺，乳腺部位上的继发性肿瘤由异常肺细胞，而非异常乳腺细胞组成。乳腺中的继发性肿瘤被称为转移性肺癌。因此，该短语转移性癌症是指其中受试者具有或已具有原发性肿瘤并且具有一个或多个继发性肿瘤的疾病。短语非转移性癌症或具有不是转移性的癌症的受试者是指其中受试者具有原发性肿瘤，但无一个或多个继发性肿瘤的疾病。例如，转移性肺癌是指具有原发性肺肿瘤或具有原发性肺肿瘤的历史并且在第二位置或多个位置(例如在乳腺中)具有一个或多个继发性肿瘤的受试者中的疾病。
如本文中所用，“自身免疫性疾病”是指因改变的免疫反应(由受试者的免疫系统例如针对通常存在于受试者的身体中的物质、组织和/或细胞产生的)而引发的疾病或病症。自身免疫性疾病包括，但不限于，关节炎、类风湿关节炎、银屑病关节炎、青少年特发性关节炎、硬皮病、全身性硬皮病、多发性硬化症、系统性红斑狼疮(SLE)、重症肌无力、青少年型糖尿病、1型糖尿病、格-巴二氏综合征、桥本氏脑炎、桥本氏甲状腺炎、强直性脊柱炎、银屑病、Sjogren综合症、血管炎、肾小球肾炎、自身免疫性甲状腺炎、白塞氏病、克罗恩病、溃疡性结肠炎、大疱性类天疱疮、结节病、银屑病、鱼鳞病、格拉夫斯眼病、炎性肠病、艾迪生病、白癜风、哮喘和过敏性哮喘。
如本文中所用，“炎性疾病”是指与异常或改变的炎症相关的疾病或病症。炎症是由作为愈合过程的部分的免疫系统响应于病原体、受损细胞或组织或刺激物而启动的生物反应。慢性炎症可以导致多种疾病。炎性疾病包括，但不限于，动脉粥样硬化、过敏症、哮喘、类风湿性关节炎、移植排斥、乳糜泻、慢性前列腺炎、炎性肠病、盆腔炎性疾病和炎性肌病。
如本文中所用，“代谢障碍”是指牵涉多种分子和物质(包括，例如，碳水化合物、氨基酸、有机酸)的异常代谢的疾病或病症。代谢障碍包括，但不限于，碳水化合物代谢的障碍，例如，糖原贮积病，氨基酸代谢的障碍，例如，苯丙酮尿症、枫糖尿症、戊二酸血症1型，尿素循环病症或尿素循环缺乏症，例如氨甲酰磷酸合成酶I缺乏症，有机酸代谢的障碍(有机酸尿症)，例如，尿黑酸尿症，脂肪酸氧化和线粒体代谢的障碍，例如，中链酰基辅酶A脱氢酶缺乏症，卟啉代谢的障碍，例如急性间歇性卟啉症，嘌呤或嘧啶代谢的障碍，例如Lesch-Nyhan综合征、类固醇代谢的障碍，例如类脂先天性肾上腺增生、先天性肾上腺皮质增生症，线粒体功的障碍，例如，卡恩斯-塞尔综合征，过氧化物酶体功能的障碍，例如，齐薇格综合征和溶酶体贮积症，例如，戈谢病和尼曼皮克病。
如本文中所用，“发育障碍”是指通常源于童年的与语言障碍、学习障碍、运动障碍和神经发育障碍相关的疾病或病症。实例包括，但不限于，自闭症谱系障碍和注意力缺陷障碍。
如本文中所用，“心血管疾病”是指与心脏、血管或两者相关的疾病。心血管疾病包括，但不限于，冠心病、心肌病、高血压性心脏疾病、心力衰竭、心律紊乱、炎性心脏病、外周动脉疾病、脑血管疾病和炎性心脏病。
如本文中所用，“肝疾病”是指与肝和/或肝功能中的异常相关的疾病。肝脏疾病包括但不限于，肝炎、酒精性肝病、脂肪肝疾病、肝硬化、Budd-Chiari综合征、Gilbert综合征和癌症。
如本文中所用，术语“肠疾病”是指与肠(小或大)中的异常相关的疾病或病症。肠疾病包括，但不限于，肠胃炎、大肠炎、回肠炎、阑尾炎、乳糜泻、克罗恩病、肠病毒、肠易激综合征和憩室病。
如本文中所用，术语“内分泌疾病”是指内分泌系统的疾病或病症，包括内分泌腺分泌过少、内分泌腺体分泌过多和肿瘤。内分泌疾病包括，但不限于，艾迪生病、糖尿病，康恩综合征，库欣综合征，糖皮质激素可治疗醛固酮增多症、低血糖症，甲状腺功能亢进症，甲状腺功能减退，甲状腺炎，垂体功能减退症，性腺功能减退症和甲状旁腺功能紊乱。
如本文中所用，术语“神经障碍”是指身体的神经系统的疾病或病症，包括结构、生物化学或电异常情况。神经障碍包括，但不限于，脑损伤、脑功能障碍、脊髓障碍、末梢神经病、脑神经障碍、自主神经系统障碍、癫痫症、运动障碍，例如，帕金森氏病和多发性硬化与中央神经病。
如本文中所用，术语“感染性疾病”是指与宿主受试者中病原体的感染、存在和/或生长相关的疾病或病症。感染性病原体包括，但不限于，病毒、细菌、真菌、原生动物、多细胞寄生虫和异常蛋白，例如，朊病毒。与感染性疾病相关的病毒包括但不限于，单纯疱疹病毒、巨细胞病毒、爱泼斯坦-巴尔病毒、水痘-带状疱疹病毒，疱疹病毒，水泡性口炎病毒，肝炎病毒，鼻病毒，冠状病毒，流感病毒，麻疹病毒，多瘤病毒，人乳头瘤病毒，呼吸道合胞病毒，腺病毒，柯萨奇病毒，登革热病毒，腮腺炎病毒，脊髓灰质炎病毒，狂犬病病毒，劳斯肉瘤病毒，黄热病毒，埃博拉病毒，猿猴免疫缺陷病毒，人免疫缺陷病毒。与感染性疾病相关的细菌包括，但不限于，结核分枝杆菌(M.tuberculosis)、沙门菌属(Salmonella)的种、大肠杆菌(E.coli)、衣原体属(Chlamydia)的种、葡萄球菌属(Staphylococcus)的种、芽孢杆菌属(Bacillus)的种和假单胞菌属(Psudomonas)的种。
如本文中所用，“治疗”病况、疾病或病症或与病况、疾病或病症相关的症状或病况、疾病或病症或与病况、疾病或病症相关的症状“的治疗”是指用于获得有益的或期望的结果，包括临床结果的方法。有益或期望的临床结果可包括，但不限于，一个或多种症状或病况的减轻或改善、病况、病症或疾病的程度的降低、病况、病症或疾病的状态的稳定、病况、病症或疾病的发展的预防、病况、病症或疾病的传播的预防、病况、病症或疾病进展的延迟或减缓、病况、病症或疾病发作的延迟或减缓、病况、病症或疾病状态的改善或缓和以及缓解，无论是部分的还是完全的。“治疗”也可意指延长受试者的存活超出在治疗不存在的情况下所预期的时间。“治疗”也可意指抑制病况、病症或疾病的进展，暂时减缓病况、病症或疾病的进展，尽管在某些情况下，其涉及永久性停止病况、病症或病症的进展。如本文中所用，术语治疗、医治或医疗是指减少特征在于蛋白酶的表达的疾病或病况一个或多个症状或特征在于蛋白酶的表达的疾病或病况的症状的效应的方法。因此，在公开的方法中，治疗可指10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的已建立的疾病、病况或所述疾病或病况的症状的严重度的减轻。例如，如果受试者中的疾病的一个或多个症状相较于对照存在10％的减少，则用于治疗疾病的方法被认为是治疗。从而减少可以是相较于天然或对照水平的10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或10％与100％之间的任何百分比减少。应理解的是，治疗并不一定指疾病、病况或所述疾病、病况的症状的治愈或完全消除。此外，如本文中所用，提及减少、降低或抑制包括相较于对照水平的10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更大的变化，并且此类术语可包括，但不一定包括全消除。
如本文中所用，术语“细胞穿透”或“细胞渗透”是指分子(例如蛋白质)以显著或有效的量从细胞外环境通过进入细胞中的能力。因此，细胞穿透缀合物是从细胞外环境通过细胞膜并进入细胞的分子。
如本文中所用，术语“非细胞穿透”或“非细胞渗透”是指细胞不能以显著或有效量从细胞外环境通过进入细胞。因此，非细胞穿透肽或蛋白质通常不能从细胞外环境穿过细胞膜，并进入细胞以实现对细胞、器官或生物体的群体的显著生物作用。术语不排除少数肽或蛋白质的一个或多个可进入细胞。然而，术语指通常不能以显著的程度从细胞外环境进入细胞。非细胞穿透分子和物质的表达包括，但不限于，大分子诸如，例如，高分子量蛋白质。可使用本领域普通技术人员已知的方法将肽或蛋白质确定为非细胞穿透性的。通过举例的方式，可荧光标记肽或蛋白质，并且可通过流式细胞术分析或共聚焦显微镜检查体外测定肽或蛋白质从细胞外环境通过进入细胞的能力。在一些实施方案中，“非细胞穿透蛋白”是指以为附接于硫代磷酸酯核酸或硫代磷酸酯聚合物主链的同一蛋白质的至多约1/2、1/3、1/4、1/5、1/6、1/7、1/8、1/9、1/10、1/20、1/30、1/40、1/50、1/60、1/70、1/80、1/90、1/100、1/200、1/300、1/400、1/500、1/600、1/700、1/800、1/900、1/1000、1/10,000或1/100,000的量穿透细胞的蛋白质。在一些实施方案中，“非细胞穿透蛋白”是指不可测量地穿透细胞的蛋白质。
如本文中所用，“分子量”(M.W.)或“分子质量”是指分子中所有原子的原子量的总和。关于分子，具有高分子量的分子通常具有25kDa或更多的分子量。通过举例的方式，高分子量蛋白可具有约25kDa至1000kDa或更多的M.W.。
如本文中所用，术语“细胞内”意指在细胞内部。如本文中所用，“细胞内靶”是位于细胞内部的并且为本文中提供的非细胞穿透蛋白所结合的靶，例如核酸、多肽或其它分子(例如，碳水化合物)。结合可以是直接或间接的。任选地，所述非细胞穿透蛋白选择性结合细胞内靶。提及选择性结合，选择性结合或特异性是指结合一种试剂(例如，细胞内靶)至部分或完全排除其它试剂的试剂(例如，非细胞穿透蛋白)。提及结合意指为测定方法的本底的至少约1.5倍的可检测的结合。对于选择性或特异性结合，可检测给定的试剂而非对照试剂的此类可检测的结合。或者或另外地，可通过测定下游分子或事件的存在来测定结合的检测。
如本文中所用，术语“缀合物”是指原子或分子之间的结合。所述结合可以是直接或间接的。例如，核酸与蛋白质之间的缀合物可以是直接的，例如通过共价键，或间接的，例如通过非共价键(例如静电相互作用(例如离子键、氢键、卤键)、范德瓦尔斯相互作用(例如偶极-偶极、偶极诱导的偶极、伦敦分散)、环堆叠(pi效应)、疏水相互作用等)。任选地，使用缀合化学来形成缀合物，所述缀合化学包括，但不限于亲核取代(例如，胺和醇与酰卤、活性酯的反应)、亲电取代(例如，烯胺反应)和至碳-碳和碳-杂原子重键的加成(例如，Michael反应、Diels-Alder加成)。这些和其它有用的反应论述于例如March,ADVANCEDORGANICCHEMISTRY，第3版，JohnWiley&Sons,NewYork,1985；Hermanson,BIOCONJUGATETECHNIQUES,AcademicPress,SanDiego,1996；和Feeney等，MODIFICATIONOFPROTEINS；AdvancesinChemistrySeries，第198卷，AmericanChemicalSociety,Washington,D.C.,1982中。在实施方案中，所述硫代磷酸酯核酸和硫代磷酸酯主链聚合物通过硫代磷酸酯核酸和硫代磷酸酯主链聚合物的组分(例如单硫代磷酸酯)与蛋白质的组分(例如氨基酸)之间的非共价化学相互作用，共价地附接于蛋白质。在其它实施方案中，所述硫代磷酸酯核酸或硫代磷酸酯主链聚合物包括一个或多个反应性部分，例如，共价反应性部分，如本文中论述的(例如，氨基酸反应性部分诸如乙烯砜部分(-S(O)2CH＝CH2)。
用于本文中的缀合化学的包括共价反应性部分或功能性基团的有用的反应性部分包括，例如：
(a)羧基及其各种衍生物包括，但不限于，N-羟基琥珀酰亚胺酯、N-羟基苯并三唑酯、酰基卤、酰基咪唑、硫酯、对硝基苯基酯、烷基、烯基、炔基和芳族酯；
(b)可被转化成酯、醚、醛等的羟基基团。
(c)卤代烷基，其中可在更晚时用亲核基团诸如，例如，胺、羧酸阴离子、硫醇阴离子、负碳离子或醇盐离子替代卤化物，从而导致新基团在卤原子的位点上的共价附接；
(d)亲双烯体基团，其能够参与狄尔斯-阿德尔反应诸如，例如，马来酰亚胺基团；
(e)醛或酮基团，以使得随后的衍生作用通过羰基衍生物诸如，例如，亚胺类、腙类、缩氨基脲类或肟类的形成，或通过此类机制如是可能的；格林纳加成或烷基锂加成；
(f)磺酰卤化物基团，用于随后与胺的反应，例如，以形成磺胺；
(g)硫醇基团，其可以被转化为二硫化物，与酰基卤反应，或键合于金属诸如金；
(h)胺或巯基，其可被例如酰基化、烷基化或氧化；
(i)烯烃，其可以经历，例如，环加成、酰化、Michael加成等；
(j)环氧化物，其可与例如胺和羟基化合物反应；
(k)亚磷酰胺和用于核酸合成的其它标准官能团；
(l)金属氧化硅键合；
(m)键合于反应性磷基团(例如膦)以形成例如磷酸二酯键的金属；和
(n)砜类，例如，乙烯砜。
所述反应性官能团可经选择，以使得它们不参与，或干扰本文中描述的蛋白质的化学稳定性。通过举例的方式，所述核酸可包括乙烯砜或其它反应性部分。图21是显示从具有S-S-R部分的核酸形成具有乙烯砜反应性部分的核酸的示意图，其中R为–(CH2)6-OH。图22是示从具有末端磷酸(PS)的核酸形成具有乙烯砜的核酸的示意图。
本文中提供了细胞穿透缀合物。所述缀合物包括附接于硫代磷酸酯核酸的非细胞穿透蛋白，其中所述硫代磷酸酯核酸增强非细胞穿透蛋白的细胞内递送。任选地，每一个硫代磷酸酯核酸包含非特异性序列。在一些实施方案中，将非细胞穿透蛋白附接于硫代磷酸酯聚合物主链。因此，本文中提供了细胞穿透缀合物，包括附接于硫代磷酸酯聚合物主链的非细胞穿透蛋白，其中所述硫代磷酸酯聚合物主链增强了非细胞穿透蛋白的细胞内递送。如上所述，除聚合物主链缺少通常存在于核酸序列的碱基外，所述聚合物主链含有与核酸序列相同的结构(即，含有连接在一起的两个或更多的糖残基的链)。还提供了包含细胞穿透缀合物的细胞。
所述硫代磷酸酯核酸或硫代磷酸酯聚合物主链可具有任何合适的长度。任选地，每一个硫代磷酸酯核酸或硫代磷酸酯聚合物主链的长度独立地为10、20、30、40、50、60、70、80、90、100或更多个核苷酸残基或糖。任选地，每一个硫代磷酸酯核酸或硫代磷酸酯聚合物主链的长度独立地为10至30个残基。因此，每一个核酸或聚合物主链的长度可为至少约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100或更多个核酸残基或糖残基。任选地，每一个硫代磷酸酯核酸或硫代磷酸酯聚合物主链的长度独立地为5至50个、10至50个、15至50个、20至50个、25至50个、30至50个、35至50个、40至50个、45至50个、5至75个、10至75个、15至75个、20至75个、25至75个、30至75个、35至75个、40至75个、45至75个、50至75个、55至75个、60至75个、65至75个、70至75个、5至100个、10至100个、15至100个、20至100个、25至100个、30至100个、35至100个、40至100个、45至100个、50至100个、55至100个、60至100个、65至100个、70至100个、75至100个、80至100个、85至100个、90至100个、95至100个或更多个残基。任选地，每一个硫代磷酸酯核酸或硫代磷酸酯聚合物主链的长度独立地为10至15个、10至20个、10至30个、10至40个或10至50个残基。
任选地，一个硫代磷酸酯核酸或硫代磷酸酯聚合物主链的长度与另一硫代磷酸酯核酸或硫代磷酸酯聚合物主链不同。通过举例的方式，如果将两个硫代磷酸酯核酸或硫代磷酸酯聚合物主链附接于非细胞穿透蛋白，则所述第一硫代磷酸酯核酸或硫代磷酸酯聚合物主链可具有一种长度(例如，22个残基)并且所述第二硫代磷酸酯核酸或硫代磷酸酯聚合物主链可具有不同的长度(例如25个残基)。因此，如果将多个硫代磷酸酯核酸和硫代磷酸酯聚合物主链附接于非细胞穿透蛋白，则所述硫代磷酸酯核酸和硫代磷酸酯聚合物主链可具有许多不同的长度，例如，长度在10至30个残基的范围内。
任选地，将多个硫代磷酸酯核酸或硫代磷酸酯聚合物主链附接于非细胞穿透蛋白。任选地，将1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多个硫代磷酸酯核酸或硫代磷酸酯聚合物主链附接于蛋白质。在实施方案中，附接是共价的。所述附接可以是非共价的。可将硫代磷酸酯核酸或硫代磷酸酯聚合物主链独立地附接于非细胞穿透蛋白的赖氨酸、精氨酸、半胱氨酸或组氨酸。任选地，将每一个硫代磷酸酯核酸或硫代磷酸酯聚合物主链附接于蛋白质的半胱氨酸。任选地，所述蛋白包含附接于10％、25％、50％、75％、90％、95％或100％的蛋白质的赖氨酸，精氨酸，半胱氨酸，组氨酸或其组合的硫代磷酸酯核酸或硫代磷酸酯聚合物主链。
如上所讨论的，可通过多种机制将核酸，例如，硫代磷酸酯核酸或硫代磷酸酯聚合物主链附接于非细胞穿透蛋白。可将硫代磷酸酯核酸或硫代磷酸酯聚合物主链共价键或非共价地附接于非细胞穿透蛋白。任选地，当将多个硫代磷酸酯核酸或硫代磷酸酯聚合物主链附接于蛋白质时，可将所述多个硫代磷酸酯核酸或硫代磷酸酯聚合物主链的每一个共价或非共价地附接于蛋白质。任选地，所述蛋白质包含共价和非共价附接的硫代磷酸酯核酸或硫代磷酸酯聚合物主链。任选地，所述蛋白质包含共价附接的硫代磷酸酯核酸或硫代磷酸酯聚合物主链，并且不包含非共价附接的硫代磷酸酯核酸或硫代磷酸酯聚合物主链。任选地，所述蛋白包含非共价附接的硫代磷酸酯核酸或硫代磷酸酯聚合物主链，并且确实不包括共价附接的硫代磷酸酯核酸或硫代磷酸酯聚合物主链。硫代磷酸酯核酸或硫代磷酸酯聚合物主链的每一个可含有反应性部分，例如，氨基酸反应性部分或共价反应性部分，所述反应性部分便于将硫代磷酸酯核酸或硫代磷酸酯聚合物主链附接于非细胞穿透蛋白。因此，可通过反应性部分将硫代磷酸酯核酸或硫代磷酸酯聚合物主链附接于蛋白质。
可通过将未附接的非细胞穿透蛋白与未附接的硫代磷酸酯核酸或未附接的硫代磷酸酯聚合物主链接触并使未附接的硫代磷酸酯核酸或未附接的硫代磷酸酯聚合物主链共价结合于未附接的非细胞穿透蛋白的氨基酸，从而附接和形成所述细胞穿透缀合物来制备本文中提供的细胞穿透缀合物。如在制造细胞穿透缀合物的上下文中所用，术语“未附接的”的使用旨在表示非细胞穿透蛋白、硫代磷酸酯核酸或硫代磷酸酯聚合物主链在缀合物的附接和形成之前的状态。即，术语“未附接的”表示非细胞穿透蛋白、硫代磷酸酯核酸或硫代磷酸酯聚合物主链相对于它们在细胞穿透缀合物内的结合形式是游离的，并且以其未结合状态存在。
在实施方案中，所述硫代磷酸酯核酸或硫代磷酸酯聚合物主链包括共价反应性部分。如上所述，所述共价反应性部分可蛋白质的赖氨酸、精氨酸、半胱氨酸或组氨酸(例如与氨基酸侧链)反应。在实施方案中，所述共价反应性部分与半胱氨酸反应。共价反应性部分可以是乙烯砜。
在实施方案中，可通过将未附接的非细胞穿透蛋白与未附接的硫代磷酸酯核酸或未附接的硫代磷酸酯聚合物主链接触，并使未附接的硫代磷酸酯核酸或未附接的硫代磷酸酯聚合物主链共价结合于未附接的非细胞穿透蛋白的氨基酸，从而附接和形成所述细胞穿透缀合物来制备本文中提供的细胞穿透缀合物。
在本文所提供的该实施方案或其它实施方案中，硫代磷酸酯核酸、硫代磷酸酯聚合物主链、未附接的硫代磷酸酯核酸或未附接的硫代磷酸酯聚合物主链可包括具有下式–S-S-(CH2)z-OH的取代基，其中z是从1至50、1至40、1至30、1至20、1至10或1至5的整数。变量z可以是1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。变量z可以是1、2、3、4、5、6、7、8或9。变量z可以是1、2、3、4、5、6、7或8。变量z可以是1、2、3、4、5、6或7。变量z可以是1、2、3、4、5或6。
在实施方案中，当将未附接的硫代磷酸酯核酸或未附接的硫代磷酸酯聚合物主链与非细胞穿透蛋白接触时，在还原条件下进行所述接触。还可在低于约9.0、8.5、8.0、7.9、7.8、7.7、7.6、7.5、7.4、7.3、7.2、7.1或7.0的pH下进行接触。在实施方案中，pH值小于8.0。在实施方案中，pH值小于7.9。在实施方案中，pH值小于7.8。在实施方案中，pH值小于7.7。在实施方案中，pH值小于7.6。在实施方案中，pH值小于7.5。在实施方案中，pH值小于7.4。在实施方案中，pH值小于7.3。在实施方案中，pH值小于7.2。在实施方案中，pH值小于7.1。在实施方案中，pH值小于7.0。在实施方案中，在还原条件下和在小于约8.0的pH(例如约7.9、7.8、7.7、7.6、7.5、7.4、7.3、7.2、7.1或7.0)下进行接触。
在实施方案中，未附接的硫代磷酸酯核酸或未附接的硫代磷酸酯聚合物主链以摩尔过量的未附接的非细胞穿透性蛋白质(例如在接触的时间)存在。所述摩尔过量可以是约2至100倍，诸如约2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、11倍、12倍、13倍、14倍、15倍、1倍、617倍、18倍、19倍、20倍、25倍、30倍、35倍、40倍、45倍、50倍、55倍、60倍、65倍、70倍、75倍、80倍、85倍、90倍、95倍或100倍的过量。在实施方案中，所述摩尔过量为约2至90倍、3至80倍、4至70倍、5至60倍、6至50倍、7至40倍、8至30倍、9至30倍、10至30倍、15至25倍或约20倍。在实施方案中，所述摩尔过量为约10倍、20或30倍。在实施方案中，所述摩尔过量为约是20倍。在实施方案中，所述摩尔过量为至少约5倍。在实施方案中，所述摩尔过量为至少约10倍。在实施方案中，所述摩尔过量为至少约15倍。在实施方案中，所述摩尔过量为至少约20倍。
在本文中提供的任何方面的实施方案中，硫代磷酸酯核酸或硫代磷酸酯聚合物主链包括具有式S-S-R的反应性部分，其中R为保护基团。任选地，R为己醇(单价取代基)。如本文中所用，术语己醇包括具有式C6H13OH的化合物，包括，1-己醇、2-己醇、3-己醇、2-甲基-1-戊醇、3-甲基-1-戊醇、4-甲基-1-戊醇、2-甲基-2-戊醇、3-甲基-2-戊醇、4-甲基-2-戊醇、2-甲基-3-戊醇、3-甲基-3-戊醇、2,2-二甲基-1-丁醇、2,3-二甲基-1-丁醇、3,3-二甲基-1-丁醇、2,3-二甲基-2-丁醇、3,3-二甲基-2-丁醇和2-乙基-1-丁醇。任选地，R是1-己醇。
可通过将非细胞穿透蛋白与硫代磷酸酯核酸接触，并使硫代磷酸酯核酸结合于蛋白质来制备所提供的细胞穿透缀合物。通过举例的方式，所提供的细胞穿透缀合物可通过将非细胞穿透蛋白与硫代磷酸酯核酸接触，并使硫代磷酸酯核酸共价结合于蛋白质的氨基酸来制备。任选地，所述硫代磷酸酯核酸包含反应性部分。通过举例的方式，所述反应性部分可以是乙烯砜或具有式S-S-R的反应性部分，如上所述的。任选地，R为己醇，例如，1-己醇。具有式S-S-R的反应性部分的示例性硫代磷酸酯核酸示于图19中，并且具有乙烯砜反应性部分的示例性硫代磷酸酯核酸示于图20中。任选地，在还原条件下进行接触，但可在本领域技术人员已知的其它条件下进行接触。任选地，硫代磷酸酯核酸相对于非细胞穿透蛋白是摩尔过量的。
任选地，所述非细胞穿透蛋白是高分子量的蛋白质。所述非细胞穿透蛋白任选具有至少约25kD或更大的分子量。在一些实施方案中，所述非细胞穿透蛋白具有至少约25至至少约750kD的分子量。因此，所述非细胞穿透蛋白可以具有至少约25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、200、205、210、215、220、225、230、235、240、245、250、255、260、265、270、275、280、285、290、295、300、305、310、315、320、325、330、335、340、345、350、355、360、365、370、375、380、385、390、395、400、405、410、415、420、425、430、435、440、445、450、455、460、465、470、475、480、485、490、495、500、505、510、515、520、525、530、535、540、545、550、555、560、565、570、575、580、585、590、595、600、605、610、615、620、625、630、635、640、645、650、655、660、665、670、675、680、685、690、695、700、705、710、715、720、725、730、735、740、745、750或更多千道尔顿(kD)的分子量。任选地，所述非细胞穿透蛋白具有至少约25至100kD、至少约25至150kD、至少约25至200kD、至少约25至250kD、至少约分子量25至300kD、至少约25至350kD、至少约25至400kD、至少约25至450kD、至少约25至500kD、至少约25至550kD、至少约25至600kD、至少约25至650kD、至少约25至700kD的或至少约25至750kD的分子量。
任选地，所述非细胞穿透蛋白为抗体。如上文中更详细论述的，抗体可以是全长抗体诸如IgG、IgA、IgM、IgD或IgE抗体或其片段。任选地，所述抗体为IgG抗体或其片段。任选地，所述抗体为Fv片段或人源化抗体。因此，提供了附接于硫代磷酸酯核酸或聚合物主链的抗体，其中所述硫代磷酸酯核酸或聚合物主链增强了抗体至细胞内的递送。任选地，所述抗体是治疗性抗体，即，在疾病的治疗中使用的抗体。因此，还提供了附接于一个或多个硫代磷酸酯核酸或聚合物主链的治疗性抗体，其中所述抗体结合细胞内靶。
任选地，所述非细胞穿透蛋白结合细胞内靶。所述细胞内靶标可以是位于细胞内的治疗性靶或诊断性靶或其它目标靶，例如，可通过例如共聚焦显微镜观察对靶或结构，例如组蛋白成像。因此，提供了结合于细胞内靶的细胞穿透缀合物。任选地，所述细胞内靶为选自由以下组成的组的疾病的靶：自身免疫性疾病、炎性疾病、代谢障碍、发育障碍、心血管疾病、肝病、肠道疾病、感染性疾病、内分泌疾病、神经障碍和癌症。疾病的靶可以是诊断性靶或治疗性或与疾病相关的其它目标靶。癌症的示例性细胞内靶包括，但不限于，STAT(例如，STAT3)、NFκB、PKB/Akt和Myc家族成员、类固醇激素受体(例如，雌激素受体)、类固醇激素受体的配体(例如，细胞周期蛋白D1)、受体酪氨酸激酶(RTK)、HER2、EGFR、VEGFR、PDGFR、Src家族成员、Ras、Abl、BCR-Abl、NPM-AlK、Janus激酶(JAK)、Brutun酪氨酸激酶(BTK)和病毒癌基因蛋白(例如，EBV蛋白或HPV蛋白质，例如，E6和E7)。任选地，所述感染性疾病的细胞内靶为病毒蛋白或病毒转录物。因此，所述细胞内靶可以是人免疫缺陷病毒(HIV)、流感病毒、单纯疱疹病毒、EB病毒、巨细胞病毒、人乳头状瘤病毒或肝炎病毒的病毒蛋白或病毒转录物。任选地，所述细胞内靶为DNA结合蛋白，包括，但不限于，转录因子、转录增强子、转录阻遏物、组蛋白或翻译后修饰的组蛋白。任选地，细胞内靶是表观遗传学修饰的DNA，例如，甲基化或羟甲基胞嘧啶(5mC或5hmC)、5-甲酰胞嘧啶(5fC)和5-羧基胞嘧啶(5caC)。任选地，所述细胞内靶是核酸，例如，RNA转录或核酸。例如，细胞内靶可以是感染性病原体，例如，寄生虫、病毒或细菌的核酸。任选地，细胞内靶为信号转导分子或转录因子。任选地，所述信号转导分子为磷酸酶或激酶。任选地，细胞内靶为癌症靶或位于癌细胞内。任选地，细胞内靶为STAT，例如，STAT3或输出蛋白7。任选地，所述非细胞穿透蛋白还包含附接于蛋白质的标记物、小分子或功能性核酸。
提供了多个包含附接于硫代磷酸酯核酸或硫代磷酸酯聚合物主链的非细胞穿透蛋白的细胞穿透缀合物，其中所述硫代磷酸酯核酸或硫代磷酸酯聚合物主链增强非细胞穿透蛋白的细胞内递送。所述硫代磷酸酯核酸或硫代磷酸酯聚合物主链共价或非共价地附接于非细胞穿透蛋白。任选地，所述多个缀合物包含共价附接的硫代磷酸酯核酸或硫代磷酸酯聚合物主链，并且不包含具有非共价连接的硫代磷酸酯核酸或硫代磷酸酯聚合物主链的蛋白质。任选地，所述硫代磷酸酯核酸或硫代磷酸酯聚合物主链被非共价地附接于非细胞穿透蛋白，并且所述多个缀合物不包含具有共价附接的硫代磷酸酯核酸或硫代磷酸酯聚合物主链的蛋白质。在一些实施方案中，所述多个缀合物包含一个或多个包含非共价附接的硫代磷酸酯核酸或硫代磷酸酯聚合物主链的蛋白质，和一个或多个包含共价附接的硫代磷酸酯核酸或硫代磷酸酯聚合物主链的蛋白质。由此，所述多个缀合物可包含含有非共价和共价附接的硫代磷酸酯核酸或硫代磷酸酯聚合物主链的蛋白质。此外，每一个缀合物可包含含有非共价和/或共价附接的硫代磷酸酯核酸或硫代磷酸酯聚合物主链的蛋白质。
提供了包含一个或多个所提供的细胞穿透缀合物的细胞，例如，所述细胞可包含多个细胞穿透缀合物。任选地，所述缀合物在细胞内结合于细胞内靶。通过举例的方式，所述细胞可包含附接于一个或多个硫代磷酸酯核酸或聚合物主链的第一非细胞穿透蛋白和第二非细胞穿透蛋白。所述第一和第二非细胞穿透蛋白可在细胞内结合于细胞内靶。任选地，所述第二非细胞穿透蛋白相对于所述第一非细胞穿透蛋白结合于细胞内靶上的不同表位。任选地，所述第二非细胞穿透蛋白结合第二细胞靶。任选地，所述第一和/或第二非细胞穿透蛋白为抗体。因此，所述第一和第二非细胞穿透蛋白可以是相同的蛋白质或不同的蛋白质。
本文提供了包含细胞穿透缀合物和药学上可接受的载体的药物组合物。所提供的组合物任选地适用于在体外或体内配制和施用。合适的载体和赋形剂及它们的制剂在Remington:TheScienceandPracticeofPharmacy，第21版，DavidB.Troy，编辑.,LippicottWilliams&Wilkins(2005)中进行了描述。药学上可接受的载体是指不是生物学上或其它方面不期望的材料，即，将所述材料施用于受试者而不会引起不期望的生物效应或以有害方式与包含其的药物组合物的其它组分相互作用。如果向受试者施用，则所述载体任选地被选择来使活性成分的降解降至最低，并使受试者的不良副作用减小至最小。
所提供的组合物可包括单一试剂或不止一种试剂。在一些实施方案中，所枕席组合物还包括附接于一个或多个硫代磷酸酯核酸或聚合物主链的第二非细胞穿透蛋白。因此，本文提供了组合物，所述组合物包含含有附接于一个或多个硫代磷酸酯核酸或聚合物主链的第一细胞穿透蛋白的第一细胞穿透缀合物，和含有附接于一个或多个硫代磷酸酯核酸或聚合物主链的第二细胞穿透蛋白的第二细胞穿透缀合物。任选地，所述第二非细胞穿透蛋白结合细胞内靶。任选地，所述第二非细胞穿透蛋白相对于所述第一非细胞穿透蛋白结合细胞内靶上的不同表位。任选地，所述第二非细胞穿透蛋白结合第二细胞靶。任选地，所述第一和/或第二非细胞穿透蛋白为抗体。所述第一和第二非细胞穿透蛋白可以是相同的蛋白质或不同的蛋白质。
用于施用的组合物将通常包含溶解于药学上可接受的载体，优选含水载体中的如本文中所述的试剂。可使用多种含水载体，例如，缓冲盐水等。这些溶液是无菌的，并且通常不含不期望的物质。可通过常规的公知的灭菌技术对这些组合物进行灭菌。必要时，所述组合物可含有药学上可接受的辅助物质以接近生理条件，例如pH调节和缓冲剂、张力调节剂等，例如，醋酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、醋酸钠等。这些制剂中的活性剂的浓度可广泛变化，并且将按照所选定的特定施用模式和受试者的需要，主要基于流体体积、粘度、体重等来进行选择。
可通过在水中适当地与表面活性剂诸如羟丙基纤维素混合来制备作为游离碱或药理学上可接受的盐的活性化合物的溶液。还可在甘油、液体聚乙二醇及其混合物中和油中制备分散体。在普通贮存和使用条件下，这些制剂可含有防腐剂以防止微生物的生长。
药物组合物可以通过鼻内或可吸入溶液或喷雾剂、气雾剂或吸入剂来递送。鼻用溶液可以是被设计来以滴剂或喷雾剂施用至鼻腔的水溶液。鼻用溶液可被制备来以使得它们在许多方面与鼻分泌物相似。因此，所述水性鼻用溶液通常是等渗的并被略微缓冲以保持5.5至6.5的pH。此外，必要时，可在制剂中包含抗微生物防腐剂，类似于眼用制剂和合适的药物稳定剂中使用的那些防腐剂。各种商业鼻制剂是已知的，并且可以包括，例如，抗生素和抗组胺剂。
口服制剂可包含赋形剂如，例如，药用级甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、甲基纤维素、碳酸镁等。这些组合物采用溶液、混悬剂、片剂、丸剂、胶囊、缓释制剂或粉剂的形式。在一些实施方案中，口服药物组合物包含惰性稀释剂或可同化的可食用载体，或它们可被封装在硬或软壳明胶胶囊中，或它们可被压制成片剂，或可将它们直接掺入饮食的食物中。对于口服治疗剂施用，所述活性化合物可与赋形剂结合并以可摄取的片剂、口含片剂、锭剂、胶囊、酏剂、混悬剂、糖浆、干胶片等形式使用。此类组合物和制剂应含有至少0.1％的活性化合物。所述组合物和制剂的百分比当然可变化，并且可方便地在约2％至约75％的单位的重量之间，优选在约25-60％之间。此类组合物中的活性化合物的量为使得可获得合适的剂量的量。
对于在水溶液中的肠胃外施用，例如，应当适当地缓冲所述溶液，首先用充足的盐水或葡萄糖使液体稀释剂等渗。水溶液，尤其是无菌水介质，尤其适合于静脉内、肌内、皮下和腹膜内施用。例如，可将一个剂量溶解于1ml等渗NaCl溶液中，以及添加至1000ml皮下灌注液中或在建议的输注部位进行注射。
无菌可注射溶液可以通过将活性化合物或构建体以所需的量掺入适当的溶剂中，随后进行过滤灭菌来制备。通常地，通过将各种灭菌的活性成分掺入含有基本分散介质的无菌媒介物来制备分散体。可将产生活性成分加上任何另外的所需成分的粉剂的真空干燥和冷冻干燥技术，用于制备用于无菌可注射液的重构的无菌粉末。更多的或高度浓缩的用于直接注射的溶液的制备也可以考虑。DMSO可用作用于极快穿透，将高浓度的活性剂递送至小区域的溶剂。
可在单位剂量或多剂量封闭容器诸如安瓿和小瓶中提供化合物的制剂。因此，所述组合物可以以单位剂型存在。在此类形式中，将所述制剂细分至含有适当量的活性组分的单位剂量中。因此，取决于施用方法，可以以多种单位剂型施用所述组合物。例如，适于口服施用的单位剂型包括，但不限于，粉末、片剂、丸剂、胶囊和锭剂。
组合物可被配制来在通过使用本领域中已知的方法施用后提供快速、持续或延迟的释放。某些载体可更优选地取决于例如待施用的组合物的施用途径和浓度。用于提供的组合物的合适的制剂可见于Remington:TheScienceandPracticeofPharmacy，第21版，DavidB.Troy，编辑，LippicottWilliams&Wilkins(2005)。
本文中提供了包含一种或多种所提供的缀合物和/或组合物以及使用说明的试剂盒。因此，提供了包含一种或多种细胞穿透缀合物或包含所述缀合物的药物组合物以及说明书的试剂盒。任选地，所述试剂盒还包含附接于一个或多个硫代磷酸酯核酸或聚合物主链的第二非细胞穿透蛋白。任选地，所述第二非细胞穿透蛋白存在于分开的容器中。任选地，所述试剂盒包含第一细胞穿透缀合物和第二细胞穿透缀合物。任选地，所述第一和第二细胞穿透缀合物存在于分开的容器中。任选地，所述第二非细胞穿透缀合物的第二细胞穿透蛋白相对于所述第一细胞穿透缀合物的非细胞穿透蛋白结合细胞内靶上不同的表位。任选地，所述第二非细胞穿透蛋白结合第二细胞内靶。任选地，所述第二非细胞穿透蛋白被配制为包含所述第二非细胞穿透蛋白和药学上可接受的载体的药物组合物。任选地，所述第二非细胞穿透蛋白为抗体。任选地，所述试剂盒包括一种或多种用于治疗或预防疾病的一个或多个症状的另外的试剂。任选地，所述试剂盒包括施用组合物的工具，诸如，例如，注射器、针、输液管、导管、贴剂等。所述试剂盒还可包含在使用前需要灭菌和/或稀释的制剂和/或材料。
本文提供了将非细胞穿透蛋白递送入细胞的方法，所述方法成包括将所述细胞与细胞穿透缀合物接触。所述细胞穿透缀合物包括附接于硫代磷酸酯核酸或聚合物主链的非细胞穿透蛋白。所述硫代磷酸酯核酸或聚合物主链增强了非细胞穿透蛋白的细胞内递送。任选地，所述非细胞穿透蛋白在细胞质中结合核蛋白，从而形成非细胞穿透蛋白-核蛋白复合物。任选地，所述非细胞穿透蛋白-核蛋白复合物不能进入细胞的细胞核。
任选地，所述细胞穿透缀合物用于诊断受试者中的疾病。因此，提供了诊断受试者中的疾病的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的细胞穿透缀合物或包含如本文中描述的细胞穿透缀合物的组合物。缀合物的施用诊断受试者中的疾病或所述疾病的一个或多个症状。所公开的方法涉及来自测试样品的生物标志物例如细胞内靶的水平或活性与对照样品相比较。如上所论述的，对照样品或值是指用作用于与测试样品比较的参照，通常已知的参照的样品。对照也可代表从类似个体，例如具有相似医学背景、相同年龄、重量等的癌症患者或健康个体的群体收集的平均值。对照值也可获自同一个体，例如获自疾病之前或治疗之前的早期获得的样品。如也在上文中论述的，诊断是指疾病(例如自身免疫性疾病、炎性自身免疫性疾病、癌症、感染、免疫或其它疾病)存在于受试者中的相对概率。
参考疾病风险因素的测定，术语比较、使发生关系和相关联的是指将风险因素(例如，疾病的细胞内靶的量)在个体存在或量与其在已知患有疾病或已知处于发生所述疾病的风险中的人中，或已知无病的人中的存在或量相比较，和基于测定结果将增加的或减少的具有/发生疾病的概率赋予个体。
本文中还提供了在检测细胞中的细胞内靶的方法，所述方法包括将细胞与细胞穿透缀合物接触，和检测所述细胞穿透缀合物与细胞内靶的结合，其中所述细胞穿透缀合物包含附接于硫代磷酸酯核酸的非细胞穿透蛋白，并且其中所述硫代磷酸酯核酸增强非细胞穿透蛋白的细胞内递送。所述细胞可以是固定的细胞或活细胞。任选地，所述细胞位于体外或体内。可直接或间接地检测接结。在本文中应当理解并且预期，许多方法可用于检测细胞穿透缀合物与其细胞内靶的结合。例如，可通过测定细胞穿透缀合物与其细胞内靶之间的偶联来直接检测结合。可以例如通过从由免疫沉淀测定、共定位测定或荧光偏振测定组成的组选择测定来测定结合，如下文中所述的。这些测定在本领域中是已知的，例如，参见Sambrook等，MolecularCloning:ALaboratoryManual，第3版，ColdSpringHarborPress,ColdSpringHarbor,NY(2001)；Dickson,MethodsMol.Biol.461:735-44(2008)；Nickels,Methods47(1):53-62(2009)；和Zinchuk等，ActaHistochem.Cytochem.40(4):101-11(2007)。
任选地，通过成像法或系统测定结合。因此，所提供的细胞穿透缀合物也可用于成像应用或用于分析细胞内靶水平和或活性的其它应用。例如，所提供的细胞穿透缀合物可用于细胞内目标靶的体外或体内成像。任选地，所述细胞穿透缀合物被用于活细胞成像。例如，活细胞成像可用于监测活细胞内的细胞内靶分布和/或动力学，并且也适用于监控靶相互作用。例如，所述细胞穿透缀合物可在免疫沉淀和共免疫沉淀测定法中用于研究细胞，任选地活细胞中的蛋白质-蛋白质相互作用。任选地，所述细胞穿透缀合物通过流式细胞术用于细胞内靶的分析。在成像应用中，视待使用的应用而定，任选地标记所使用的细胞穿透缀合物。如上所述，标记或可检测部分是可通过光谱学、光化学、生物化学、免疫化学、化学或其它物质手段检测的组合物。有用的标记包括，但不限于，32P、荧光染料、电子致密试剂、酶(例如，ELISA中常用的)、生物素、洋地黄毒苷或半抗原和可以例如通过将放射性标记掺入与靶肽特异性反应的肽或抗体来检测的蛋白质或其它实体。可使用本领域中已知的用于将抗体缀合于标记物的任何方法，例如，使用在Hermanson,BioconjugateTechniques1996,AcademicPress,Inc.,SanDiego中描述的方法。
任选地，所述细胞穿透缀合物和包含如本文所述的细胞穿透缀合物的组合物对于预防性和治疗性治疗都是有用的。对于预防用途，在发作之前或在早期发作过程中(例如，当自身免疫性疾病的初始体征和症状出现时)向受试者施用治疗有效量的所述试剂。治疗性治疗包括在疾病的诊断或发展后向受试者施用治疗有效量的本文所述的试剂。
因此，提供了治疗受试者中的疾病的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的细胞穿透缀合物或包含如本文所述的细胞穿透缀合物的组合物。所述缀合物的施用治疗所述受试者中的疾病或所述疾病的一个或多个症状。
任选地，治疗方法还包括向受试者施用附接于一个或多个硫代磷酸酯核酸的第二非细胞穿透蛋白。任选地，所述方法包括第一包含附接于硫代磷酸酯核酸或聚合物主链的第一非细胞穿透蛋白的第一缀合物和包含附接于硫代磷酸酯核酸或聚合物主链的第二非细胞穿透蛋白的第二缀合物的施用。任选地，所述第二非细胞穿透蛋白相对于所述第一非细胞穿透蛋白结合细胞内靶上不同的表位。任选地，所述第二非细胞穿透蛋白结合第二细胞内靶。可同时或相继地施用所述第一和第二缀合物。任选地，所述第二非细胞穿透蛋白为抗体。任选地，所述疾病选自由以下组成的组：自身免疫性疾病、发育障碍、炎性疾病、代谢障碍、心血管疾病、肝病、肠道疾病、感染性疾病、内分泌疾病、神经障碍和癌症。任选地，所述疾病是癌症。任选地，所述缀合物的非细胞穿透蛋白结合细胞内靶并且所述细胞内靶为STAT3或输出蛋白7。任选地，所述第一非细胞穿透蛋白为特异性结合STAT3的抗体，并且所述第二非细胞穿透蛋白为特异性结合输出蛋白7的抗体。任选地，所述缀合物的第一非细胞穿透蛋白为特异性结合STAT3的抗体并且所述第二非细胞穿透蛋白为特异性结合STAT3的另一表位的抗体。
在所提供的治疗方法中，可使用适用于待治疗的疾病的另外的治疗剂。因此，在一些实施方案中，所提供的治疗方法还包括向受试者施用第二治疗剂。合适的另外的治疗剂包括但不限于以下治疗剂，所述治疗剂选自由以下组成的组：镇痛剂、麻醉剂、苏醒药、皮质类固醇、抗胆碱能药、抗胆碱酯酶、抗惊厥药、抗肿瘤药、变构抑制剂、促蛋白合成类固醇、抗风湿药、精神治疗药物、神经阻断剂、抗炎剂、驱虫药、抗生素、抗凝血剂、抗真菌剂、抗组胺剂、抗毒蕈碱剂、抗分枝杆菌(antimycobacterial)剂、抗原生动物剂、抗病毒剂、多巴胺能药、血液制剂、免疫剂、毒蕈碱、蛋白酶抑制剂、维生素、生长因子和激素。试剂和剂量的选择可由本领域技术人员基于待治疗的给定的疾病来容易地确定。
可伴时(例如，作为混合物)、单独但同时地(例如，通过单独的静脉注射管)或相继地(例如，首先施用一种药剂，随后施用第二药剂)施用试剂或组合物的组合。因此，术语组合被用于指两种或更多种试剂或组合物的伴随、同时或顺序施用。取决于受试者的特定特征和所选定的治疗类型，基于个体最佳地测定治疗过程。可将治疗(诸如本文中公开的那些治疗)每日一次、每日两次、每两周一次、每月一次或为治疗有效的任何适用的基础向受试者施用。治疗可以单独施用或与本领域中公开的或本领域中已知的任何其它治疗组合施用。可在不同的时间，或按照完全不同的治疗方案(例如，可每日施用第一治疗，而所述另外的治疗为每周一次)将另外的治疗与第一治疗同时施用。
根据本文中提供的方法，向受试者施用有效量的一种或多种本文中提供的试剂。术语有效量和有效剂量可以互换使用。术语有效量被定义为产生所需生理反应(例如，炎症的减轻)所必需的任何量。用于施用试剂的有效量和时间安排可由本领域技术人员凭经验确定。用于施用的剂量范围是大到足以产生其中疾病或病症的一个或多个症状受到影响(例如，被减轻或延迟)的期望的作用的那些剂量范围。该剂量不应大到引起实质性的不利的副作用，诸如不希望的交叉反应、过敏反应等。通常地，剂量随着年龄、状况、性别、疾病的类型、疾病或病症的严重程度、施用途径或其它药物是否被包括在治疗方案而变化，并且可以由本领域技术人员来确定。如果存在任何禁忌症，可由个体医生调整剂量。剂量可以变化，并且可以以每日一个或多个剂量施用，持续一或数天来进行施用。指导可见于关于给定种类的药物产品的合适剂量的文献。例如，对于给定的参数，有效量将显示至少5％、10％、15％、20％、25％、40％、50％、60％、75％、80％、90％或至少100％的增加或减少。功效也可被表示为“倍”的增加或减少。例如，治疗有效量可具有高于对照至少1.2倍、1.5倍、2倍、5倍、或更多倍的作用。确切的剂量和制剂将取决于治疗的目的，并且将可由本领域技术人员使用已知的技术(参见，例如，Lieberman,PharmaceuticalDosageForms(第1-3卷，1992)；Lloyd,TheArt,ScienceandTechnologyofPharmaceuticalCompounding(1999)；Remington:TheScienceandPracticeofPharmacy，第20版，Gennaro，编辑(2003)，和Pickar,DosageCalculations(1999))来确定的。
公开了可用于所公开的方法和组合物，可结合所述方法和组合物使用的，可用于制备所述方法和组合物的或为所述方法和组合物的产品的材料、组合物和组分。在本文中公开了这些和其它材料，并且应当理解，当公开这些材料的组合，子集、相互作用、种类时，虽然这些化合物的每一个不同的个体和集体组合以及排列的具体参考可以不被明确公开，但每一个在本文中被具体考虑和描述。例如，如果公开并讨论了方法以及讨论可对许多分子进行的许多修改(包括所述方法)，则除非相反地明确指出，否则具体地考虑所述方法的每个和每一个组合和排列以及可能的修改。同样地，也具体地考虑和公开了这些的任何子集或组合。该概念用于本公开的所有方面，包括但不限于使用所公开的组合物的方法中的步骤。因此，如果存在各种可进行的附加步骤，则应理解，这些这些附加步骤的每一个可用任何特定的方法步骤或所公开的方法的方法步骤的组合来进行，并且每个此类组合或组合的子集被具体地考虑并应被视为是公开的。
本文中引用的出版物以及针对其引用它们的材料由此明确地通过引用整体并入。
已经描述了许多实施方案。然而，应当理解，可进行各种修改。因此，其它实施方案在权利要求的范围之内。
实施例
实施例1.利用细胞穿透抗体使核转录因子STAT3失活
如下面更详细地描述的，在本文中已证明，利用抗体同时靶向蛋白质的两个分立的部分或复合物中的两种蛋白质将核蛋白保留在细胞质中。输出蛋白7被鉴定为介导STAT3核质穿梭的必需蛋白质。STAT3和输出蛋白抗体7的细胞内递送有效地防止了STAT3核质穿梭，将STAT3捕获在细胞质中。技术被开发来在体外和体内使抗体能够进行高效的细胞穿透。具体地，硫代磷酸酯寡核苷酸至抗体的附接使得能够进行高效的抗体细胞内化和靶识别。经修饰的STAT3/输出蛋白7抗体的局部和全身性递送有效地抑制了STAT3在肿瘤中的活性，从而在各种模型中导致肿瘤细胞的细胞凋亡和肿瘤消退。该技术使抗体能够靶向细胞内分子(包括核转录因子)。
材料和方法
设想STAT3-GFP在活细胞中的定位并使用LSM510Meta倒置显微镜(Zeiss,Jena,Germany)对其进行分析，并且如所描述的(Herrmann等，J.CellScience120:3249-3261(2007))，导致iFLAP成像的漂白实验。简言之，等同地放大STAT3-CFP-YFP融合蛋白的YFP和CFP发射信号。通过使用λ＝514nm的激光线，漂白融合蛋白的YFP部分数轮，其间被图像采集中断。在采集后程序中，将算法/＝1-/YFP//CFP应用于收集的图像，从而产生作为时间的函数的STAT3-CFP-YFP的空间分布。使用如先前所述的(Herrmann等，CancerRes.70:7455-7464(2010))用于间接免疫荧光的方案对肿瘤切片进行染色。
按照制造商的说明书，使用脂质载体系统(GenLantis,BP509604,SanDiego,CA)实现针对STAT3的抗体(SantaCruz,sc-482,Dallas,TX)、输出蛋白7(SantaCruz,sc-98639,Dallas,TX)或GFP(Rockland,Gilbertsville,PA)在细胞培养物中的递送。对于每一个治疗分别施用总剂量10μg的与脂质载体(GenLantis,BP509604,SanDiego,CA)复合的免疫球蛋白或针对STAT3和输出蛋白7的寡核苷酸修饰的抗体。
寡核苷酸至抗体的缀合。在氩气下于室温利用30倍摩尔过量的TCEP(400μL,5mMTEAA,pH6.8)还原寡核苷酸(200-300nmol)2小时，并通过反相色谱法(PRP1，在30分钟内从5mMTEAA至95％MeOH的线性梯度)进行纯化。通过质谱(LTQFT,Thermo)确认硫醇保护基团的去除，随后冷冻干燥。将还原的寡核苷酸重新溶解于0.5mL水/DMSO(4:1)中，添加25倍过量的乙烯砜，将pH调节至8.5，在氩气下于室温反应3小时，通过反相HPLC(如上)纯化，通过质谱确认正确的产物，并将样品冷冻干燥。在氩气下于37℃用30倍摩尔过量的PBS中的TCEP还原多克隆抗体IgG(1.6mg，于PBS中透析48小时)2小时。在除去过量的TCEP(Zeba旋转柱，Thermo；2,000rpm持续2分钟)后，在氩气下于pH7.5将还原的抗体与20倍摩尔过量的VS-寡核苷酸反应过夜。通过比较未缀合的抗体与缀合的抗体的IEF凝胶电泳(pH3-9,GEHealthSciences,Pittsburgh,PA)确认成功的寡核苷酸-至-抗体-缀合。
活细胞成像和免疫荧光。将过表达STAT3-GFP或STAT3-CFP-YFP的细胞生长在玻璃底细胞培养皿(MatTek,Ashland,MA)中。使用LSM510Meta倒置显微镜(Zeiss,Jena,Germany)分析在恒温器控制的和CO2控制的条件下的活细胞中的STAT3的定位。利用100ng/ml的Hoechst33342(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)对核酸进行染色。按照制造商的说明书，使用Zenon标记技术(Invitrogen,Carlsbad,CA)使胞内递送的抗体可视化。FPP测定(Lorenz等，NatureProtoc.1:276-9(2006))适用于使STAT3和STAT3K685R的核保留可视化。简言之，用20μm的KHM缓冲液(110mM醋酸钾,20mMHEPES,2mMMgCl2)中的洋地黄皂苷处理表达STAT3-GFP或STAT3K685R-GFP的细胞以透化外层细胞膜。利用共聚焦显微镜检查随时间推移监测活细胞中的STAT3-GFP或STAT3K685R-GFP的细胞核输出。通过间接免疫荧光评估细霉素B(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)处理后的STAT3-GFP或NFκB亚单位P65-GFP的定位。用2％多聚甲醛(溶解于PBS中，pH7.4)固定生长在盖玻片(FisherScientific,Waltham,MA)上的表达STAT3-GFP或p65-GFP的细胞，并用含DAPI的Vectashield(VectorLaboratories,Burlingame,CA)封固剂进行封片。如先前所述(Kujawski等，J.Clin.Invest.118:3367-3377(2008))使用间接免疫荧光对来自肿瘤或正常组织的显微切片进行染色。简而言之，用10％山羊血清和2.5％小鼠血清封闭切片，用PBS漂洗，随后用在含有100ng/mlHoechst33342(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)的封闭溶液中1:50稀释的针对输出蛋白7、核孔蛋白50、核孔蛋白153(SantaCruzBiotechnology,Inc.,Dallas,TX)、Ki67(eBioscience,SanDiego,CA)和CD31/PECAM-1(BDPharmingen,SanDiego,CA)的抗体进行孵育。将载片在PBS进行漂洗(3次，每次5分钟)，用适当的第二荧光抗体进行孵育，用PBS漂洗，和用Mowiol(Calbiochem,SanDiego,CA)封片。使用LSM510Meta倒置显微镜(Zeiss,Jena,Germany)分析切片。使用缀合于alexafluor488(Invitrogen,Carlsbad,CA)的抗-兔IgG使体内递送的抗体可视化。
荧光发射信号的定量。通过细胞核(Hoechst+)中的平均荧光强度定量核驻留蛋白。将完全核积累标准化为1(100％)。使用Zeiss成像软件(Zeiss,Jena,Germany)或Image-Pro6.3(MediaCybernetics,Rockville,MD)分别定量平均荧光强度、组织结构诸如CD31+血管长度、视野中的双正像素的图像掩模或荧光信号密度。如先前所述(Rabut和Ellenberg,“PhotobleachingTechniquestoStudyMobilityandMolecularDynamicsofProteinsinLiveCells.In:LiveCellImaging,ALaboratoryManualColdSpringHarborLaboratoryPress.第101-126页(2004))，通过FLIP(光漂白中的荧光损失)参数的适应测定STAT3-GFP或STAT3K685R-GFP的核诱饵。与FLIP相反，目标区域(ROI)已如图6A和6B中示意性显示的被组织。简言之，在本底(BG)扣除后通过ROI1/ROI2修正获得的信号(图6A和6B)，并使用e-t/x进行标准化，其中t为时间并且x为相邻对照细胞(ROI2)的荧光信号。将预漂白时间点的发射强度标准化为1。
活体多光子显微镜检查(IVMPM)。利用异氟烷/氧气麻醉具有黑素瘤B16肿瘤的C57BL/6小鼠，随后用10μg膜联蛋白-V-FITC(BioVision,Milpitas,CA)进行静脉内(经由眶后途径)注射。注射后，立即将小鼠手术打开，将肿瘤组织暴露于IVMPM，通过使用Ultima多光子显微镜系统(PrairieTechnologies,Middleton,WI)来进行。对于成像荧光素缀合物，将激发波长设定为λ＝890nm。将针对荧光素(BPλ＝525/50nm)优带通滤波器用于检测。细胞外基质的信号由在激发波长λ＝890nm的二次谐波生成提供并且利用BPλ＝460/50nm来检测。
蛋白质相互作用的原位定位。将人U251脑肿瘤细胞在玻璃腔室载片系统(FisherScientific,Waltham,MA)中生长，并且控制制造商的说明书(OLINKBioscience,Uppsala,Sweden)进行法。所使用的检测抗体购自SantaCruz(STAT3，目录号sc-482)和Acris(输出蛋白7，目录号AP16201PU-N)。以0.01mg/ml使用购自SantaCruz(Dallas,TX)的STAT3封闭肽。
寡核苷酸-下接测定。为了测定STAT3DNA-结合活性，使用从无胸腺nu/nu小鼠中生长的U87肿瘤分离的细胞核提取物进行寡核苷酸-下拉测定。在将肿瘤组织匀浆后，使用以下缓冲液的组合分离核提取物：(i)含有10mMHEPES-KOH(pH7.9)、1.5mMMgCl2、10mMKCl的低渗缓冲液A和(ii)含有20mMHEPES-KOH(pH7.9)、420mMNaCl、1.5mMMgCl2、0.2mMEDTA、25％甘油的高盐缓冲液C。添加新鲜蛋白酶抑制剂0.2mMPMSF、0.5mMDTT、1mMNa3VO4。用400μg结合缓冲液(12mMHEPESpH7.9、12％甘油、4mMTrispH7.9,150mMKCl、1mMEDTA；新鲜的：1mMDTT、0.1μg/μl聚(dI:dC)、0.5μg/μlBSA)中的核提取物在室温下孵育生物素化寡核苷酸，5’-AGCTTCATTTCCCGTAAATCCCTAAGCT-3’(SEQIDNO：1)(顺式可诱导元件SIE，STAT3结合位点以粗体标示)2小时。用1ml结合缓冲液预洗涤以每样品50μl使用的链霉抗生物素蛋白磁珠(ThermoScientific,Waltham,MA)三次，在磁性支架上收集所述磁珠，并除去上清液。在室温下于50μl含100μgBSA、10μg聚(dI:dC)、10μgssDNA(以[10μg/μl]使用的鲑精DNA)的封闭缓冲液中封闭链霉抗生物素蛋白磁珠，随后在室温下孵育样品2小时。在磁性支架上收集沉淀，使用结合缓冲液洗涤三次，并重悬浮于40μl4x还原蛋白样品缓冲液(Laemmli)中。通过SDS-PAGE电泳分离蛋白质-沉淀。收集初始清除后的上清液，将核蛋白电泳分离以评估蛋白质输入的上样对照。
寡核苷酸至抗体的缀合。以下DNA寡核苷酸序列已被合成用来附接于抗体：
用于至抗体的缀合的寡核苷酸序列：
硫代硫酸酯化的/5ThioMC6-
D//iSpC3//iSpC3//iFAM//iSpC3//iSpC3/T*C*C*A*T*G*A*G*C*T*T*C*C*T*G*A*T*G*C*T(SEQIDNO:2)
非硫代硫酸酯化的/5ThioMC6-
D//iSpC3//iSpC3//iFAM//iSpC3//iSpC3/TCCATGAGCTTCCTGATGCT(SEQIDNO:3)
硫代硫酸酯化的随机1/5ThioMC6-
D//iSpC3//iSpC3//iFAM//iSpC3//iSpC3/C*T*G*T*A*G*T*C*C*T*C*T*G*A*G*T*A*C*C*T(SEQIDNO:4)
硫代硫酸酯化的随机2/5ThioMC6-
D//iSpC3//iSpC3//iFAM//iSpC3//iSpC3/C*C*C*A*G*G*A*G*T*C*T*C*C*T*G*A*T*T*T*T(SEQIDNO:5)
T，胸腺嘧啶；A，腺嘌呤；G，鸟嘌呤；C，胞嘧啶；(*)表示硫代磷酸酯化。5ThioMC6-D，1-O-二甲氧基三苯甲基-己基-二硫化物，1'-[(2-氰乙基)-(N,N-二异丙基)]-亚磷酰胺(巯基-修饰C6S-S)；iSpC3，C33-(4,4'-二甲氧基三苯甲氧基)-丙基-1-[(2-氰乙基)-(N,N-二异丙基)]-亚磷酰胺(间隔子亚磷酰胺)；iFAM，2-二甲氧基三苯甲氧基甲基-6-(3',6'-二特戊酰基荧光素-6-基-甲酰胺基)-己基-1-O-[(2-氰基-乙基)-(N,N-二异丙基)]-亚磷酰胺(6-荧光素磷亚酰胺)(GlenResearch,Sterling,VA)。
免疫印迹和免疫沉淀。使用含有50mMTris(pH7.4)、150mMNaCl、1mMEDTA、0.5％NP-40、1mMNaF、15％甘油和20mMβ-甘油磷酸的RIPA裂解缓冲液制备全细胞裂解物或肿瘤组织匀浆物。将新鲜蛋白酶抑制剂混合物添加至裂解缓冲液(MiniProteaseInhibitorCocktail，目录号04693124001,Roche,Basel,Switzerland)。以10μM的最适度以下浓度体外使用白藜芦醇(CaymanChemical,AnnArbor,MI)，持续指定的时间。通过SDS-PAGE将标准化的蛋白质的量经历电泳分离，转移至硝酸纤维素上进行免疫印迹，使用针对以下物质的抗体进行随后的免疫检测：输出蛋白1、2、5、7、STAT3、VEGF、核孔蛋白50(SantaCruz,Dallas,TX)、磷酸化的STAT3(Tyr705)、乙酰化的STAT3(Lys685)、裂解的PARP1、裂解的半胱天冬酶3、Bcl-2、细胞周期蛋白D1(CellSignalingTechnology,Boston,MA)、血管生成素1、输出蛋白T(Millipore,Billerica,MA)、输出蛋白4(Epitomics/Abcam,Burlingame,CA)、输出蛋白6(ProteintechGroup,Chicago,IL)和β肌动蛋白(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)。对于免疫沉淀，使用偶联于蛋白G琼脂糖珠(Invitrogen,Carlsbad,CA)的指定抗体清除每样品1mg的总浓度的人U251脑肿瘤细胞的全细胞裂解物或全肿瘤匀浆物。将非靶向兔免疫球蛋白(Abcam,Burlingame,CA)包括作为对照。在振荡的情况下用偶联于珠粒的抗体在4℃孵育标准化的蛋白质量16小时，在4℃下使用冰冷PBS洗涤3次，随后经历SDS-PAGE。
小鼠和细胞培养。将所有动物保持在Hope市研究动物设施的无病原体房间中。动物使用流程由Hope市医学中心的贝克曼研究所的机构委员会批准。对于皮下肿瘤攻击，用5x106个稳定地表达STAT3或STAT3K685R的MEF细胞或106个U87人脑肿瘤细胞注射入无胸腺nu/nu小鼠(NCI,Frederick,MD)的侧腹。在同基因模型中，用105个B16黑素瘤细胞皮下注射C57BL/6小鼠(TheJacksonLaboratory,BarHarbor,ME)。在肿瘤直径达到5-7mm后，每隔一天施用抗体治疗。将成纤维细胞3T3/v-Src细胞、MEF细胞和人U87脑肿瘤细胞保持在含10％热灭活的FBS(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)的DMEM中。将小鼠黑素瘤B16细胞生长在补充有10％FBS的RPMI1640培养基中。为了建立稳定表达STAT3构建体的细胞系，在Flp-In方案(Invitrogen,Carlsbad,CA)后，用STAT3-YFP或STAT3K685-YFP转染STAT3缺陷型MEF细胞。随后通过流式细胞术分选重建的MEF细胞的YFP+以将纯度提高至>95％。
结果和讨论
下面更详细地论述所述方法的图和结果。简言之，图1-3举例说明细胞穿透抗体可结合核转录因子诸如STAT3。图5-12还举例说明如何可使用两种针对核蛋白(例如STAT3)的细胞穿透抗体和与核蛋白(例如，输出蛋白7)相互作用的蛋白质阻断核蛋白(例如，STAT3)的活性。图13-18显示硫代磷酸酯化但非核酸序列对于使得硫代硫酸酯核酸修饰的抗体能够穿透细胞，从而允许在体内和体外靶向识别并灭活靶蛋白功能是非常重要的。
虽然激活的STAT3大部分被限制在细胞核中，但STAT3穿梭至细胞质以被再活化。根据球状颗粒的扩散性质，分子量的增加可破坏蛋白质的区室积累的平衡。因此假设使用识别核蛋白或另外的相互作用蛋白质的两个分立部分的两种抗体可形成大的稳定复合物，从而打破有利于核蛋白的细胞质区室积累的平衡。为了测试该假说，使用脂质载体针对STAT3和GFP蛋白将第一抗体递送至利用持续激活STAT3的v-Src转化的表达STAT3-GFP的3T3细胞。当所述两种抗体被递送入通过脂质载体促进的细胞时，发现STAT3-GFP融合蛋白主要被捕获在细胞质中(图1A)。
为了将该方法扩展用于在生理上靶向STAT3，鉴定在细胞质中与STAT3相互作用的内源性蛋白质，从而允许基于由STAT3/GFP两抗体治疗显示的相同原理将STAT3捕获在细胞质中。据说将STAT3穿梭至细胞质中的输出蛋白可与STAT3形成相对稳定的复合物。因此试图鉴定参与STAT3至细胞质中的穿梭的关键输出蛋白。已显示了输出蛋白1参与STAT1以及在一定程度上还有STAT3的核质穿梭(Bhattacharya和Schindler,J.Clin.Invest.111:553-9(2003)；Reich和Liu,NatureRev.Immunol.6:602-12(2006)；McBride等，EmboJ.21:1754-63(2002))。利用STAT3抗体的免疫沉淀，随后利用针对各种输出蛋白的抗体的免疫印迹分析显示，输出蛋白7与STAT3缔合(图1B和图5A)。进一步确认了输出蛋白7与STAT3的明确参与(图5B)。对于STAT3至细胞质中的穿梭，输出蛋白1具有一定的可检测活性，如通过利用高浓度的Crm1-特异性抑制剂的长期治疗所显示的(图5B)。通过(OlinkTechnologies,Uppsala,Sweden)技术进一步证明了STAT3与输出蛋白7在细胞质中的相互作用(图1C和1D)。用输出蛋白7抗体取代GFP抗体显示实现了STAT3-GFP的细胞质积累(图1E)。
因为已显示输出蛋白7识别货物蛋白质的含赖氨酸基序以区分底物，因此检查STAT3在赖氨酸685上的乙酰化对于STAT3细胞质穿梭是否是至关重要的。通过iFLAP活细胞共聚焦显微镜检查评估STAT3wt和STAT3K685R的核质穿梭。来自这些分析的结果显示STAT3K685R穿梭因核保留而显著减少(图2A、2B、6A、6B、7A、7B和7C)。通过在赖氨酸K685上突变STAT3或用白藜芦醇(其可抑制STAT3乙酰化)处理细胞，证明了STAT3/输出蛋白7相互作用需要乙酰化(图2C和2D)。
使用过表达STAT3wt或STAT3K685R的小鼠Stat3-无效力胚胎成纤维细胞(MEF)进一步检查阻断输出蛋白7-介导的STAT3至细胞质内的细胞核输出在体内的影响。肿瘤生长动力学显示显著降低的表达STAT3K685R的MEF的致瘤潜能(图8A)。检测到输出蛋白7与STAT3K685R之间的相互作用的伴随减小(图2E)。此外，输出蛋白7-介导的STAT3K685R与核孔蛋白，尤其是NPC的核浆富含FG的重复的Nup50和Nup153之间的相互作用(该相互作用被认为有利于蛋白质从细胞核至细胞质的迁移)显著减小(图2E、8C和8D)。进一步支持乙酰STAT3在细胞核输出中的重要作用，表达STAT3K685R的MEF显示输出蛋白7在细胞核中的积累，这与细胞核直径的显著增加相关(图2F和2G)，从而表明蛋白质核输出的有效抑制。这与正常器官/组织中的细胞(其中发现输出蛋白7主要存在于细胞质中)呈鲜明对比(图9)。
通过阻断核质穿梭在MEF中测试STAT3和输出蛋白7抗体在体内抑制STAT3活性的能力。来自这些实验的结果示于图10A、10B、10C、11A、11B、11C和11D中。利用针对输出蛋白7/STAT3的抗体治疗荷瘤小鼠导致肿瘤中的强抗体细胞内摄取(图10A和12A)，和显著的肿瘤生长抑制(图3A、11A和12B)。利用与IgG对照抗体组合的STAT3或输出蛋白7的单一抗体治疗仅略微抑制肿瘤生长(图3A)。两抗体治疗也伴随输出蛋白7-介导的STAT3与Nup153和Nup50的相互作用的破坏(图3B)。利用STAT3/输出蛋白7抗体但非利用单独的一种抗体治疗荷瘤小鼠能够显著破坏肿瘤血管和肿瘤增殖(图3C和3D)，抑制参与肿瘤细胞存活和增殖的STAT3下游基因的表达(图3E)。还在人异种移植物肿瘤模型中测试两抗体治疗的功效。利用STAT3/输出蛋白7抗体治疗具有人U87胶质瘤肿瘤的小鼠能够显著减少肿瘤生长(图3F)并阻止STAT3结合于其DNA位点(图3G)。肿瘤生长抑制与凋亡的肿瘤细胞的增显著增加和肿瘤血管的减少相关，如通过活体多光子显微镜检查显现的(图3H和3I)。
迄今为止的结果表明，转录因子诸如STAT3可被抗体靶向。然而，依赖脂质载体来细胞内递送抗体。使抗体和蛋白质能够渗透进细胞以进行高效细胞蛋白质靶向的方法仍然难以实现。为此目的开发技术。具体地，将硫代磷酸酯化的寡核苷酸附接于抗体以试图使它们能够穿透细胞和靶向它们预期的分子。硫代磷酸酯化的寡核苷酸至STAT3或输出蛋白7多克隆IgG抗体的附接导致在体外抗体以时间和剂量依赖性方式在细胞质胞质中的高效细胞内化(图4A和4B)。值得注意的是，证明了两种经修饰的抗体实体的同时递送(图4B，右图)。进一步表征显示了在细胞质中经修饰的抗体的预期的靶识别(图13A和13B)。此外，在局部和全身性施用后在肿瘤中检测到荧光标记的硫代磷酸酯化的寡核苷酸修饰的抗体(图14和15A)。在最后一次全身性治疗后8天在肿瘤组织中发现完整的寡核苷酸修饰的抗体(图15B)，这显示了经修饰的抗体的强大的生物稳定性。除了穿透癌细胞以外，寡核苷酸修饰的抗体还可进入免疫细胞(图16A和16B)。DNA主链的硫代磷酸酯化而非附接于抗体的寡核苷酸的序列特异性对于细胞摄取和随后的靶/抗原识别是至关重要的(图17A和17B)。
为了评估硫代磷酸酯化的寡核苷酸修饰的抗体的抗肿瘤功效，将STAT3/输出蛋白7抗体局部施用于具有黑素瘤B16肿瘤的小鼠，以及具有人U251胶质瘤的免疫缺陷小鼠。相较于未治疗的小鼠和利用单一抗体治疗的那些小鼠，两个模型中的肿瘤生长动力学在接受经修饰的STAT3/输出蛋白7抗体的组合的小鼠中显著减少(图4C和18)，这是伴随着急剧降低的STAT3活性(图4F)，和增加的细胞凋亡死亡(图4G)。
经修饰的STAT3/输出蛋白7抗体的抗肿瘤功效通过全身性施用来测试。经修饰的STAT3/输出蛋白抗体的全身性递送也显示对肿瘤生长的非常显著的抗肿瘤作用(图4D)。硫代磷酸酯化的核苷酸修饰的抗体有效地到达和穿透肿瘤组织，并发挥抗肿瘤功能(图15A)。随后通过以降至每治疗2.5μg总抗体的递减剂量全身性给予抗体来评估联合抗体治疗的抗肿瘤功效。当仅在3次治疗后中断全身性治疗时，强效抗肿瘤作用得以保存(图4E)，伴随着STAT3区室周转的抑制，如通过STAT3与核孔蛋白50和153的相互作用的减小指示的(图4G)。此外，利用经修饰的STAT3/输出蛋白抗体对荷瘤小鼠的全身性治疗有效地在肿瘤中减小了STAT3DNA-结合能力(图4H)。
使用抗体靶向细胞内分子的需要是令人信服的。虽然已经报道抗体可扩散进入肿瘤细胞来在体内阻断预期的蛋白质，没有提供分子机制，并且有人推测癌细胞对抗体的摄取由B细胞介导。修饰抗体以使它们成为自我穿透的方法在本文中进行了描述，这使得它们甚至在全身性施用的情况下有效地靶向细胞内分子。提供了直接实验证据，即利用抗体靶向蛋白质的两个分立部分或复合物中的两种蛋白质可减少转录因子再激活所需的核质穿梭。除了STAT3(一种被认为不可能被抗体靶向的核蛋白)以外，细胞穿透抗体技术可被广泛用于靶向各个细胞内蛋白质(例如，致癌蛋白和细胞内驻留病毒蛋白)。
实施例2.有效的细胞穿透蛋白递送技术
在本实施例中，证明了利用硫代磷酸酯化的寡核苷酸修饰抗体使得它们能够穿透细胞，在所述细胞中它们结合于预期的细胞内靶抗原/分子。此外，通过流式细胞术和共聚焦显微镜检查在活细胞中显示了所述经修饰的抗体特异性检测细胞内靶的能力，以及通过免疫印迹检测以其天然形式存在的蛋白质。此外，证明了此类经修饰的抗体可用于有效地阻断细胞内酪氨酸激酶(磷酸-Src)、细胞内/核病毒蛋白(HPV16/18E6蛋白)以及转录因子(STAT3)的活动。
材料和方法
想像STAT3-GFP在活细胞中的定位，使用LSM510Meta倒置显微镜(Zeiss)进行分析，并进行导致iFLAP成像的漂白实验(Herrmann,等，J.CellSci.120:3249-3261(2007))。简言之，同等放大STAT3-CFP-YFP融合蛋白的YFP和CFP发射信号。通过使用λ＝514nm激光线，漂白融合蛋白的YFP部分数轮，其间被图像采集中断。在后获取过程中，将算法/＝1-/YFP//CFP用于收集的图像，从而产生作为时间的函数的STAT3-CFP-YFP的空间分布。使用如先前所述的(Herrmann等，CancerResearch70:7455-7464(2010))用于间接免疫荧光的方案对肿瘤切片进行染色。
按照制造商的说明书，使用脂质载体系统(GenLantis,BP509604)实现针对STAT3(SantaCruz,sc-482)、输出蛋白7(SantaCruz,sc-98639)或GFP(Rockland)在细胞培养物中的递送。在体内，对于每一个治疗，分别施用10μg总剂量的与脂质载体(GenLantis,BP509604)复合的免疫球蛋白或针对STAT3和输出蛋白7的经寡核苷酸修饰的抗体。
寡核苷酸至抗体的缀合。用于至抗体的缀合的寡核苷酸序列：
硫代磷酸酯化的
T*C*C*A*T*G*A*G*C*T*T*C*C*T*G*A*T*G*C*T(SEQIDNO:2)
非硫代磷酸酯化的TCCATGAGCTTCCTGATGCT(SEQIDNO:3)
硫代磷酸酯化的无规序列1(scr1)T*C*G*T*A*G*T*C*C*T*T*C*G*A*G*T*A*C*C*T(SEQIDNO:6)
硫代磷酸酯化的无规序列2(scr2)C*C*C*A*G*G*A*G*T*C*T*C*C*T*G*A*T*T*T*T(SEQIDNO:5)
硫代磷酸酯化的无规序列3(scr3)T*A*G*A*T*G*A*C*C*T*T*C*C*T*G*C*T*G*C*T(SEQIDNO:7)
T，胸腺嘧啶；A，腺嘌呤；G，鸟嘌呤；C，胞嘧啶；(*)表示硫代磷酸酯化。
在氩气下于室温(RT)利用30倍摩尔过量的TCEP(400μL,5mMTEAA,pH6.8)还原寡核苷酸(200-300nmol)2小时，并通过反相色谱法(PRP1，在30分钟内从5mMTEAA至95％MeOH的线性梯度)进行纯化。通过质谱(LTQFT,Thermo)确认硫醇保护基团的去除，随后冷冻干燥。将还原的寡核苷酸重新溶解于0.5mL水/DMSO(4:1)中，添加25倍过量的乙烯砜，将pH调节至8.5，在氩气下于RT反应3小时，通过反相HPLC(如上)纯化，通过质谱确认正确的产物，并将样品冷冻干燥(VS-寡核苷酸)。或者，将寡核苷酸经历硫醇保护基团的去除，并如下进行进一步治疗(SSR-寡核苷酸)。在氩气下于37℃用30倍摩尔过量的PBS中的TCEP还原多克隆抗体IgG(1.6mg，于PBS中透析48小时)2h。在除去过量的TCEP(Zeba旋转柱，Thermo；2,000rpm持续2分钟)后，在氩气下于pH7.5将还原的抗体与20倍摩尔过量的VS-寡核苷酸或SSR-寡核苷酸反应过夜。通过比较未缀合的抗体与缀合的抗体的IEF凝胶电泳(pH3-9,GEHealthSciences)确认成功的寡核苷酸-至-抗体-缀合。
结果和讨论
经修饰的抗体的细胞穿透和靶识别。利用硫代磷酸酯化的寡核苷酸修饰STAT3IgG抗体在体外在活细胞中导致所述抗体的细胞内化和预期的靶/抗原识别(图23A)。这通过使用以下替代性免疫沉淀检测抗体-靶复合来证明：将经修饰的抗体添加至活细胞，以使它们能够结合以其天然形式存在的靶，随后裂解细胞，并用琼脂糖珠进行预沉淀，随后进行电电泳。已确认抗体和硫代磷酸酯化的寡核苷酸在体内共定位(图28)。还已知，不同寡核苷酸的DNA主链硫代磷酸酯化能够实现抗体的细胞摄取和随后靶/抗原识别，如通过流式细胞术分析和免疫印迹证明的(图23B,23C)。此外，已显示输出蛋白7抗体的硫代磷酸酯修饰有利于抗体内化(图23B)并且经修饰的抗体的内化不限于特定的细胞类型(图23B)。通过共聚焦成像还证明了经修饰的STAT3抗体可穿透细胞膜，并且它们可存在于EEA-1+内体区室的外部。另外，经修饰的STAT3抗体还可进入细胞核区室(图23D)。
进一步详细表征的是利用硫代磷酸酯化寡聚核苷酸修饰的磷酸-Src(p-Src)抗体。使用流式细胞术分析比较经修饰的和未修饰的p-Src抗体的细胞穿透能力(图23E)。另外，具有较少荧光信号的细胞的共聚焦成像表明经修饰的p-Src抗体与p-Src共定位(图23F)。此外，独特的免疫沉淀和随后免疫印迹(其中在制备细胞裂解物之前将抗体添加至活细胞)确认经修饰的p-Src抗体能够内化入细胞并且结合它们的预期的靶(图23G)。
靶是细胞穿透抗体的细胞内保留所需的。迄今为止的数据证明硫代磷酸酯化的寡核苷酸修饰的抗体可穿透进细胞。已显示，荧光标记的经修饰的p-Src抗体而非标记的经修饰的IgG对照抗体可在用v-Src转染的3T3成纤维细胞中利用流式细胞术来容易地检测(图24，上图)。通过使用具有或不具有Stat3的小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)，已通过流式细胞术分析显示，Stat3蛋白是硫代磷酸酯化的寡核苷酸修饰的Stat3抗体的保留所需要的(图24，下图)。
经修饰的抗-磷酸Src抗体的抗肿瘤作用。随后评估各种由硫代磷酸酯化的寡核苷酸修饰的抗体的体内抗肿瘤作用。将利用v-Src转化的3T3细胞植入具有免疫能力的同系小鼠。将等量的经修饰的IgG或抗-p-Src抗体(每只小鼠10μg)注射入肿瘤。虽然肿瘤生长曲线在无任何治疗的那些肿瘤与利用经修饰的IgG抗体治疗的那些肿瘤之间相似，但对于接受经修饰的p-Src抗体的那些肿瘤，所述肿瘤生长曲线显著较慢(图25A)。随后从未接受治疗或接受经修饰的对照或p-Src抗体的肿瘤制备匀浆物，然后对其进行免疫印迹分析以评估经修饰的抗体对其靶和靶下游基因的体内作用。来自此类分析的结果表明，在体内经修饰的p-Src抗体可有效地抑制磷酸化Src和其下游靶磷酸Stat3(图25B，左图)，以及其它已知的p-Src下游靶FAK、β-肌动蛋白和E-钙粘蛋白(图25B，右图)。激活的Src在细胞肌动蛋白丝结构中的作用是已知的。经修饰的p-Src抗体还可抑制肿瘤细胞的肌动蛋白丝结构(图29)，所述肌动蛋白丝结构在细胞迁移和肿瘤侵袭中起作用。
由于人黑素瘤A2058肿瘤细胞的存活和生长为p-Src依赖性的，因此在A2058异种移植肿瘤模型中进一步评价经修饰的p-Src抗体的体内作用。如在3T3v-Src小鼠肿瘤模型中看到的，利用经修饰的p-Src抗体治疗人黑素瘤肿瘤在小鼠中显著抑制肿瘤生长(图25C)。使用从来自对照和测试组的肿瘤制备的匀浆物的免疫印迹显示，经修饰的p-Src抗体而非不具有要结合的靶蛋白的经修饰的IgG抗体在体内被保留在肿瘤中(图25D)。此外，肿瘤切片的显微分析表明，只有经修饰的p-Src抗体，但没有经修饰的IgG抗体被保留在肿瘤中(图25E顶图)。靶抗体的保留与肿瘤血管的损失(图25E顶图)以及肿瘤的细胞凋亡的增加(图25E下图)相关。对照与靶抗体治疗的肿瘤之间的抗体肿瘤保留、肿瘤的细胞凋亡和肿瘤周转的损失的差异是显著的(图25F)。
经修饰的抗-HPVE6抗体抑制肿瘤生长。几种细胞内病毒蛋白质是用于治疗疾病诸如癌症的良好靶。HPV16/18E6和E7蛋白，例如，是公知的对于多数宫颈癌和头颈癌中的细胞的转化和恶性是至关重要的癌基因蛋白。然而，不存在阻断它们的致癌活性的有效药物。因此，测试修饰针对HPV16/18E6的单克隆抗体是否可产生阻断E6功能和肿瘤生长的有效抑制剂。因为E6(还有E7)蛋白非常小，因此推断抗体可“吞噬”完整的蛋白质，从而阻断其功能。皮下注射人CaSki宫颈癌细胞，以在裸鼠中形成肿瘤。当肿瘤直径达到约5mm的平均值时，将等量的经修饰的IgG或抗-E6抗体(10μg/小鼠)注射入肿瘤。当如未治疗的肿瘤类似地生长利用经修饰的IgG抗体治疗的肿瘤时，利用经修饰的E6抗体注射的那些肿瘤相较于两个对照组具有显著的生长迟滞(图26A)。还测试全身性施用的经修饰的E6单克隆抗体的抗肿瘤作用。观察到全身性递送的经修饰的E6抗体对CaSki肿瘤生长的抑制作用(图26B)。H&E染色表明利用经修饰的E6抗体的全身性和局部治疗对肿瘤组织具有破坏性作用(图26C)。使用来自体内实验的肿瘤进行的免疫印迹分析和实时RT-PCR(图26A和26B)显示上调FADD基因(其将Fas-受体的成员与半胱天冬酶原桥连以形成用于诱导细胞死亡的复合物)以及半胱天冬酶8基因的表达(图26D和26E)。CaSki肿瘤切片(图26A中的相同肿瘤)的共聚焦显微分析表明只有经修饰的E6抗体而非经修饰的IgG抗体才可在治疗的肿瘤中被检测到(图26F，顶图)。利用经修饰的抗-E6抗体治疗肿瘤还导致肿瘤血管的破坏，如通过CD31-阳性的减少指示的(图26F，顶图)。通过使用相同肿瘤组织，进一步显示裂解的半胱天冬酶3的蛋白质水平升高(图26F，下图)。
利用细胞穿透抗体在体内靶向STAT3。评估抗体对STAT3活性的阻断。然而，与Src的磷酸化位点(其暴露在Src酪氨酸激酶分子表面上)不同，STAT3的大部分酪氨酸磷酸化和乙酰化位点因它们在折叠的STAT3分子内的位置而难以接近。虽然激活的STAT3大部分被限制在细胞核中，但STAT3穿梭至细胞质中以被再激活。根据球状颗粒的扩散性质，分子量的增加可破坏蛋白质的区室积累的平衡。因此假设使用识别STAT3或另外的相互作用蛋白质的两个分立部分的两种抗体可形成大的稳定复合物，从而打破有利于激活的STAT3的细胞质区室积累的平衡。共聚焦显微分析表明，识别STAT3的分立位点的两个经修饰的STAT3抗体有利于增加STAT3蛋白在利用STAT3-mCherry瞬时转染的3T3v-Src细胞中的细胞质积累，这允许一部分细胞在细胞核中具有STAT3-mCherry(图27A)。利用兔抗-STAT3抗体和抗-兔抗体治疗相同细胞也导致STAT3蛋白的细胞质积累的增加(图27A)。然而，在细胞质中捕获STAT3蛋白的双重抗体的最有效组合是STAT3和输出蛋白7(图27A)。已显示输出蛋白7对于STAT3核质穿梭是至关重要的(Herrmann等，CancerRes.70:7455-7464(2010))。
因为STAT3/输出蛋白7双重抗体在于细胞质中保持STAT3是最有效的(图27A)，并且因为发现STAT3与输出蛋白7的相互作用需要STAT3685乙酰化，并且STAT3的乙酰化在肿瘤中普遍存在并且是致瘤性，因此将经修饰的STAT3和输出蛋白7抗体用于体内肿瘤治疗。事实上，利用经修饰的STAT3和输出蛋白7治疗建立的B16小鼠黑素瘤导致显著的肿瘤生长延迟，然而单独的任一种经修饰的抗体不能显著延迟肿瘤生长(图27B，左图)。经修饰的STAT3/输出蛋白7抗体的局部和全身性注射有效地抑制B16黑素瘤的肿瘤生长(图27B，中图)。还已显示，经修饰的STAT3/输出蛋白7抗体的全身性注射，即使在每治疗2.5μg的低剂量上，有效地抑制肿瘤生长，并且当在仅3次治疗后中断全身性治疗，仍然保持强抗肿瘤作用(图27B，右图)。全身性抗体治疗还抑制肿瘤STAT3活性，如通过测量STAT3-DNA结合评估的(图27C)。此外，全身性递送的经修饰的STAT3/输出蛋白7抗体甚至在最后一次治疗后8天保留在肿瘤中(图27D)。
在人胶质瘤异种移植模型中测试经修饰的STAT3/输出蛋白7抗体的抗肿瘤功效。对具有建立的人U87胶质瘤的小鼠的经修饰的STAT3/输出蛋白7抗体的局部治疗和全身性施用导致有效的抗肿瘤作用(图27E，上图)。此外，将全身性施用两种经修饰的STAT3抗体(所述抗体识别STAT3的分立部位)的抗肿瘤作用和经修饰的抗-STAT3抗体(兔)和抗-兔抗体的抗肿瘤作用连同STAT3/输出蛋白7和其它对照抗体一起进行评估(图27E下图)。该组实验的抗肿瘤作用与肿瘤中抗体的检测(图30A,30B)和肿瘤血管的破坏、STAT3下游致癌基因c-Myc的抑制以及细胞凋亡裂解的半胱天冬酶3的增加相关联(图31A，31B)。为了评估经修饰的抗体在具有U251胶质瘤肿瘤的小鼠中的组织分布，通过局部肿瘤旁和全身性注射施用STAT3/输出蛋白7抗体。抗体注射后24小时，除了肿瘤外以外，还有几个器官的组织被制备来用于共聚焦显微分析以检测荧光标记的抗体以及CD31和裂解的半胱天冬酶3的存在，以评价所述抗体对血管和肿瘤细胞的细胞凋亡的作用。从该组实验产生的数据表明在最后一次注射(局部和全身性的)后24小时，所述经修饰的抗体在肿瘤细胞中最多，破坏了肿瘤血管并诱导细胞凋亡(图27F)。
研究表明，利用硫代磷酸酯化的寡核苷酸修饰抗体使得抗体能够穿透细胞膜。对靶蛋白的结合似乎也促进靶向抗体的细胞内保留，从而不许它们有效地离开细胞。虽然此处呈现的结果仅显示在抗体的细胞内递送中的效力，但该技术平台应当适用于使得各种蛋白质/酶能够进行细胞穿透。
体外和体内结果包括多克隆和单克隆抗体的用途。虽然单克隆抗体是当今用于临床的唯一抗体，并且具有纯的有利方面，但多克隆抗体可因它们识别抗原/靶的多个表位的能力而潜在地具有更好的功效。多克隆抗体是否也适合于临床使用，等待进一步考虑和保证更多调察。目前，已使用两种不同的方法来用抗体附接硫代磷酸酯化的寡核苷酸。然而，当前的研究已显示现可将大分子诸如抗体用于靶向细胞内分子(包括被认为棘手的那些分子)的原理的证明。
实施例3.硫代磷酸酯化的寡核苷酸修饰的抗体进入细胞并识别细胞内靶
可以以多种方式将核酸附接于蛋白质诸如抗体。为了研究附接对活性的作用，用经由乙烯砜反应性部分或通过S-S-己醇反应性部分附接于硫代磷酸酯化的核酸的抗体孵育细胞。如针对实施例2的方法中所概述的，制备抗体。对于αSTAT3-VS-寡核苷酸P，通过HPLC纯化与VS-寡核苷酸(αSTAT3-VS-寡核苷酸UP)反应的抗体来制备该抗体。P代表纯化的，UP代表未纯化的。
用10μg/ml的纯化的(P)或未纯化的(UP)经由乙烯砜(VS)介导的硫代磷酸酯化的DNA-20聚体寡核苷酸的附接修饰的aSTAT3兔-抗体或未纯化的SSR-寡核苷酸-抗体缀合物/复合物孵育人Karpas299淋巴瘤细胞2小时。在将细胞固定和透化后，对兔IgG种类进行细胞内染色，并经由流式细胞术(如通过如门控指示的)分析细胞的兔IgG含量。结果示于图32中。具体地，所述结果显示通过不同化学手段附接于硫代磷酸酯化的核酸的抗体可实现细胞内递送。
为了确认递送和识别，用10μg/ml的纯化的(P)经由乙烯砜(VS)介导的硫代磷酸酯化的DNA-20聚体寡核苷酸的附接修饰的aSTAT3抗体(泳道1)或单独的未修饰的aSTAT3(泳道3)或aSTAT3和500pmol/ml硫代磷酸酯化的GpC1668(同样地经由VS附接的)(泳道4；泳道2为空)孵育人U251胶质瘤细胞2小时。在制备全细胞裂解物后，清除细胞碎片，添加蛋白G偶联的琼脂糖珠粒，在4℃孵育过夜，随后进行免疫印迹法。结果示于图33A中。
用10μg/ml的未纯化的(UP)经SSR修饰的aSTAT3抗体(泳道2)、未纯化的(UP)经由乙烯砜(VS)介导的硫代磷酸酯化的寡核苷酸的附接修饰的aSTAT3抗体(泳道3)或纯化的(P)经由乙烯砜(VS)介导的硫代磷酸酯化的寡核苷酸的附接修饰的aSTAT3抗体(泳道4)孵育人U251细胞2小时；不添加抗体IgG(泳道1)。在制备全细胞裂解物后，清除细胞碎片，添加蛋白G偶联的琼脂糖珠粒，在4℃孵育过夜，随后进行免疫印迹法。结果示于图33B中。
图33A和33B显示具有经由乙烯砜反应部分附接的硫代磷酸酯化的核酸的抗体群可进入细胞并识别细胞内靶。此外，所述图显示具有经由不同化学附接例如通过S-S-己醇附接的硫代磷酸酯核酸的抗体群还导致细胞内递送和靶向识别。
实施方案
实施方案P1.一种包含附接于硫代磷酸酯核酸的非细胞穿透蛋白的细胞穿透缀合物，其中所述硫代磷酸酯核酸增强所述非细胞穿透蛋白的细胞内递送。
实施方案P2.实施方案1的细胞穿透缀合物，其中多个硫代磷酸酯核酸附接于所述非细胞穿透蛋白。
实施方案P3.实施方案2的细胞穿透缀合物，其中1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多个硫代磷酸酯核酸附接于所述蛋白。
实施方案P4.实施方案1至3的任一项的细胞穿透缀合物，其中每一个硫代磷酸酯核酸独立地附接于所述非细胞穿透蛋白的赖氨酸、精氨酸、半胱氨酸或组氨酸。
实施方案P5.实施方案4的细胞穿透缀合物，其中每一个硫代磷酸酯核酸附接于所述蛋白的赖氨酸。
实施方案P6.实施方案4的细胞穿透缀合物，其中所述蛋白包含附接于10％、25％、50％、75％、90％、95％或100％的所述蛋白的赖氨酸、精氨酸、半胱氨酸、组氨酸或其组合的硫代磷酸酯核酸。
实施方案P7.实施方案1至6的任一项的细胞穿透缀合物，其中每一个硫代磷酸酯核酸的长度独立地为10、20、30、40、50、60、70、80、90、100个或更多个核酸残基。
实施方案P8.实施方案7的细胞穿透缀合物，其中每一个硫代磷酸酯核酸的长度独立地为10至30个残基。
实施方案P9.实施方案1至8的任一项的细胞穿透缀合物，其中每一个硫代磷酸酯核酸共价地附接于所述蛋白。
实施方案P10.实施方案1至9的任一项的细胞穿透缀合物，其中每一个硫代磷酸酯核酸包含非特异性序列。
实施方案P11.实施方案1至10的任一项的细胞穿透缀合物，其中所述非细胞穿透蛋白是高分子量蛋白质。
实施方案P12.实施方案1至10的任一项的细胞穿透缀合物，其中所述非细胞穿透蛋白具有大于25kD的分子量。
实施方案P13.实施方案1至10的任一项的细胞穿透缀合物，其中所述非细胞穿透蛋白具有25至750kD的分子量。
实施方案P14.实施方案1至13的任一项的细胞穿透缀合物，其中所述非细胞穿透蛋白为抗体。
实施方案P15.实施方案14的细胞穿透缀合物，其中所述抗体为IgG抗体。
实施方案P16.实施方案14的细胞穿透缀合物，其中所述抗体为IgA、IgM、IgD或IgE抗体。
实施方案P17.实施方案14的细胞穿透缀合物，其中所述抗体为Fv片段。
实施方案P18.实施方案14至17的任一项的细胞穿透缀合物，其中所述抗体为人源化抗体。
实施方案P19.实施方案1至18的任一项的细胞穿透缀合物，其中所述非细胞穿透蛋白结合细胞内靶。
实施方案P20.实施方案19的细胞穿透缀合物，其中所述细胞内靶是选自由以下组成的组的疾病的靶：自身免疫性疾病、炎性疾病、代谢障碍、发育障碍、心血管疾病、肝病、肠道疾病、感染性疾病、内分泌疾病、神经障碍和癌症。
实施方案P21.实施方案19或20的细胞穿透缀合物，其中所述细胞内靶为信号转导分子或转录因子。
实施方案P22.实施方案21的细胞穿透缀合物，其中所述信号转导分子为磷酸酶或激酶。
实施方案P23.实施方案20的细胞穿透缀合物，其中所述细胞内靶为癌症靶。
实施方案P24.实施方案19的细胞穿透缀合物，其中所述细胞内靶为STAT3。
实施方案P25.实施方案19的细胞穿透缀合物，其中所述细胞内靶为输出蛋白7。
实施方案P26.实施方案1至25的任一项的细胞穿透缀合物，其中所述非细胞穿透蛋白还包含附接于所述蛋白的标记物、小分子或功能性核酸。
实施方案P27.一种结合于细胞内靶的实施方案1至26的任一项的细胞穿缀合物。
实施方案P28.一种细胞，所述细胞包含实施方案1至26的任一项的细胞穿透缀合物。
实施方案P29.一种药物组合物，所述药物组合物包含实施方案1至26的任一项的细胞穿透缀合物和药学上可接受的载体。
实施方案P30.实施方案29的组合物，所述组合物还包含附接于一个或多个硫代磷酸酯核酸的第二非细胞穿透蛋白。
实施方案P31.实施方案30的组合物，其中所述第二非细胞穿透蛋白结合细胞内靶。
实施方案P32.实施方案31的组合物，其中所述第二非细胞穿透蛋白相对于实施方案19至25的任一项的非细胞穿透蛋白结合所述细胞内靶上的不同表位。
实施方案P33.实施方案31的组合物，其中所述第二非细胞穿透蛋白结合第二细胞内靶。
实施方案P34.实施方案30至33的任一项的组合物，其中所述第二非细胞穿透蛋白为抗体。
实施方案P35.一种试剂盒，所述试剂盒包含实施方案1至26的任一项的细胞穿透缀合物或实施方案29的药物组合物以及使用说明书。
实施方案P36.实施方案35的试剂盒，所述试剂盒还包含附接于一个或多个硫代磷酸酯核酸的第二非细胞穿透蛋白。
实施方案P37.实施方案36的试剂盒，其中实施方案1至26的任一项的缀合物和所述第二非细胞穿透蛋白存在于分开的容器中。
实施方案P38.实施方案36的试剂盒，其中实施方案29的药物组合物和所述第二非细胞穿透蛋白存在于分开的容器中。
实施方案P39.实施方案36至38的任一项的试剂盒，其中所述第二非细胞穿透蛋白相对于实施方案19至25的任一项的非细胞穿透蛋白结合所述细胞内靶上的不同表位。
实施方案P40.实施方案36至38的任一项的试剂盒，其中所述第二非细胞穿透蛋白结合第二细胞内靶。
实施方案P41.实施方案36至40的任一项的试剂盒，其中将所述第二非细胞穿透蛋白配制为包含所述第二非细胞穿透蛋白和药学上可接受的载体的药物组合物。
实施方案P42.实施方案35至41的任一项的试剂盒，其中所述第二非细胞穿透蛋白为抗体。
实施方案P43.一种将非细胞穿透蛋白递送入细胞的方法，所述方法包括将所述细胞与实施方案1至26的任一项的细胞穿透缀合物接触。
实施方案P44.实施方案43的方法，其中所述非细胞穿透蛋白结合细胞质中的核蛋白，从而形成非细胞穿透蛋白-核蛋白复合物。
实施方案P45.实施方案44的方法，其中所述非细胞穿透蛋白-核蛋白复合物不能进入所述细胞的细胞核。
实施方案P46.一种治疗受试者中的疾病的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的实施方案1至26的任一项的细胞穿透缀合物，其中所述缀合物的施用治疗所述受试者的疾病。
实施方案P47.实施方案46的方法，所述方法还包括向所述受试者施用附接于一个或多个硫代磷酸酯核酸的第二非细胞穿透蛋白。
实施方案P48.实施方案47的方法，其中所述第二非细胞穿透蛋白相对于实施方案19至26的任一项的缀合物结合所述细胞内靶上的不同表位。
实施方案P49.实施方案47的方法，其中所述第二非细胞穿透蛋白结合第二细胞内靶。
实施方案P50.实施方案47至49的任一项的方法，其中同时施用实施方案1至26的任一项的缀合物和所述第二非细胞穿透蛋白。
实施方案P51.实施方案47至49的任一项的方法，其中相继施用实施方案1至26的任一项的缀合物和所述第二非细胞穿透蛋白。
实施方案P52.实施方案47至51的任一项的方法，其中所述第二非细胞穿透蛋白为抗体。
实施方案P53.实施方案46至52的任一项的方法，所述方法还包括向所述受试者施用第二治疗剂。
实施方案P54.实施方案46至53的任一项的方法，其中所述疾病选自由以下组成的组：自身免疫性疾病、发育障碍、炎性疾病、代谢障碍、心血管疾病、肝病、肠道疾病、感染性疾病、内分泌疾病、神经障碍和癌症。
实施方案P55.实施方案54的方法，其中所述疾病为癌症。
实施方案P56.实施方案55的方法，其中所述缀合物的非细胞穿透蛋白结合细胞内靶并且所述细胞内靶为STAT3。
实施方案P57.实施方案55的方法，其中所述缀合物的非细胞穿透蛋白结合细胞内靶并且所述细胞内靶为输出蛋白7。
实施方案P58.实施方案52的方法，其中所述缀合物的非细胞穿透蛋白为特异性结合STAT3的抗体，并且所述第二非细胞穿透蛋白为特异性结合输出蛋白7的抗体。
实施方案P59.实施方案52的方法，其中所述缀合物的非细胞穿透蛋白为特异性结合STAT3的抗体并且所述第二非细胞穿透蛋白为特异性结合STAT3的另一个表位的抗体。
实施方案P21.一种包含附接于硫代磷酸酯核酸的非细胞穿透蛋白的细胞穿透缀合物，其中所述硫代磷酸酯核酸增强所述非细胞穿透蛋白的细胞内递送。
实施方案P22.实施方案1的细胞穿透缀合物，其中多个硫代磷酸酯核酸附接于所述非细胞穿透蛋白。
实施方案P23.实施方案2的细胞穿透缀合物，其中1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多个硫代磷酸酯核酸附接于所述蛋白。
实施方案P24.实施方案1至3的任一项的细胞穿透缀合物，其中每一个硫代磷酸酯核酸独立地附接于所述非细胞穿透蛋白的赖氨酸、精氨酸、半胱氨酸或组氨酸。
实施方案P25.实施方案4的细胞穿透缀合物，其中所述每一个硫代磷酸酯核酸附接于所述蛋白的赖氨酸。
实施方案P26.实施方案4的细胞穿透缀合物，其中所述蛋白包含附接于10％、25％、50％、75％、90％、95％或100％的所述蛋白的赖氨酸、精氨酸、半胱氨酸、组氨酸或其组合的硫代磷酸酯核酸。
实施方案P27.实施方案1至6的任一项的细胞穿透缀合物，其中每一个硫代磷酸酯核酸的长度独立地为10、20、30、40、50、60、70、80、90、100个或更多个核酸残基。
实施方案P28.实施方案7的细胞穿透缀合物，其中每一个硫代磷酸酯核酸的长度独立地为10至30个残基。
实施方案P29.实施方案1至8的任一项的细胞穿透缀合物，其中每一个硫代磷酸酯核酸共价地附接于所述蛋白。
实施方案P210.实施方案1至9的任一项的细胞穿透缀合物，其中每一个硫代磷酸酯核酸包含非特异性序列。
实施方案P211.实施方案1至10的任一项的细胞穿透缀合物，其中所述非细胞穿透蛋白是高分子量蛋白质。
实施方案P212.实施方案1至10的任一项的细胞穿透缀合物，其中所述非细胞穿透蛋白具有大于25kD的分子量。
实施方案P213.实施方案1至10的任一项的细胞穿透缀合物，其中所述非细胞穿透蛋白具有25至750kD的分子量。
实施方案P214.实施方案1至13的任一项的细胞穿透缀合物，其中所述非细胞穿透蛋白为抗体。
实施方案P215.实施方案14的细胞穿透缀合物，其中所述抗体为IgG抗体。
实施方案P216.实施方案14的细胞穿透缀合物，其中所述抗体为IgA、IgM、IgD或IgE抗体。
实施方案P217.实施方案14的细胞穿透缀合物，其中所述抗体为Fv片段。
实施方案P218.实施方案14至17的任一项的细胞穿透缀合物，其中所述抗体为人源化抗体。
实施方案P219.实施方案1至18的任一项的细胞穿透缀合物，其中所述非细胞穿透蛋白结合细胞内靶。
实施方案P220.实施方案19的细胞穿透缀合物，其中所述细胞内靶是选自由以下组成的组的疾病的靶：自身免疫性疾病、炎性疾病、代谢障碍、发育障碍、心血管疾病、肝病、肠道疾病、感染性疾病、内分泌疾病、神经障碍和癌症。
实施方案P221.实施方案19或20的细胞穿透缀合物，其中所述细胞内靶为信号转导分子或转录因子。
实施方案P222.实施方案21的细胞穿透缀合物，其中所述信号转导分子为磷酸酶或激酶。
实施方案P223.实施方案20的细胞穿透缀合物，其中所述细胞内靶为癌症靶。
实施方案P224.实施方案19的细胞穿透缀合物，其中所述细胞内靶选自由STAT3、输出蛋白7、Her2和Src组成的组。
实施方案P225.实施方案19的细胞穿透缀合物，其中所述细胞内靶为磷酸化Src。
实施方案P226.实施方案1至25的任一项的细胞穿透缀合物，其中所述非细胞穿透蛋白还包含附接于所述蛋白的标记物、小分子或功能性核酸。
实施方案P227.一种结合于细胞内靶的实施方案1至26的任一项的细胞穿透缀合物。
实施方案P228.一种细胞，所述细胞包含实施方案1至26的任一项的细胞穿透缀合物。
实施方案P229.一种药物组合物，所述药物组合物包含实施方案1至26的任一项的细胞穿透缀合物和药学上可接受的载体。
实施方案P230.实施方案29的组合物，所述组合物还包含附接于一个或多个硫代磷酸酯核酸的第二非细胞穿透蛋白。
实施方案P231.实施方案30的组合物，其中所述第二非细胞穿透蛋白结合细胞内靶。
实施方案P232.实施方案31的组合物，其中所述第二非细胞穿透蛋白相对于实施方案19至25的任一项的非细胞穿透蛋白结合所述细胞内靶上的不同表位。
实施方案P233.实施方案31的组合物，其中所述第二非细胞穿透蛋白结合第二细胞内靶。
实施方案P234.实施方案30至33的任一项的组合物，其中所述第二非细胞穿透蛋白为抗体。
实施方案P235.一种试剂盒，所述试剂盒包含实施方案1至26的任一项的细胞穿透缀合物或实施方案29的药物组合物以及使用说明书。
实施方案P236.实施方案35的试剂盒，所述试剂盒还包含附接于一个或多个硫代磷酸酯核酸的第二非细胞穿透蛋白。
实施方案P237.实施方案36的试剂盒，其中实施方案1至26的任一项的缀合物和所述第二非细胞穿透蛋白存在于分开的容器中。
实施方案P238.实施方案36的试剂盒，其中实施方案29的药物组合物和所述第二非细胞穿透蛋白存在于分开的容器中。
实施方案P239.实施方案36至38的任一项的试剂盒，其中所述第二非细胞穿透蛋白相对于实施方案19至25的任一项的非细胞穿透蛋白结合所述细胞内靶上的不同表位。
实施方案P240.实施方案36至38的任一项的试剂盒，其中所述第二非细胞穿透蛋白结合第二细胞内靶。
实施方案P241.实施方案36至40的任一项的试剂盒，其中将所述第二非细胞穿透蛋白配制为包含所述第二非细胞穿透蛋白和药学上可接受的载体的药物组合物。
实施方案P242.实施方案35至41的任一项的试剂盒，其中所述第二非细胞穿透蛋白为抗体。
实施方案P243.一种将非细胞穿透蛋白递送入细胞的方法，所述方法包括将所述细胞与实施方案1至26的任一项的细胞穿透缀合物接触。
实施方案P244.实施方案43的方法，其中所述非细胞穿透蛋白结合细胞质中的核蛋白，从而形成非细胞穿透蛋白-核蛋白复合物。
实施方案P245.实施方案44的方法，其中所述非细胞穿透蛋白-核蛋白复合物不能进入所述细胞的细胞核。
实施方案P246.一种治疗受试者中的疾病的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的实施方案1至26的任一项的细胞穿透缀合物，其中所述缀合物的施用治疗所述受试者的疾病。
实施方案P247.实施方案46的方法，所述方法还包括向所述受试者施用附接于一个或多个硫代磷酸酯核酸的第二非细胞穿透蛋白。
实施方案P248.实施方案47的方法，其中所述第二非细胞穿透蛋白相对于实施方案19至26的任一项的缀合物结合所述细胞内靶上的不同表位。
实施方案P249.实施方案47的方法，其中所述第二非细胞穿透蛋白结合第二细胞内靶。
实施方案P250.实施方案47至49的任一项的方法，其中同时施用实施方案1至26的任一项的缀合物和所述第二非细胞穿透蛋白。
实施方案P251.实施方案47至49的任一项的方法，其中相继施用实施方案1至26的任一项的缀合物和所述第二非细胞穿透蛋白。
实施方案P252.实施方案47至51的任一项的方法，其中所述第二非细胞穿透蛋白为抗体。
实施方案P253.实施方案46至52的任一项的方法，所述方法还包括向所述受试者施用第二治疗剂。
实施方案P254.实施方案46至53的任一项的方法，其中所述疾病选自由以下组成的组：自身免疫性疾病、发育障碍、炎性疾病、代谢障碍、心血管疾病、肝病、肠道疾病、感染性疾病、内分泌疾病、神经障碍和癌症。
实施方案P255.实施方案54的方法，其中所述疾病为癌症。
实施方案P256.实施方案55的方法，其中所述缀合物的非细胞穿透蛋白结合细胞内靶并且所述细胞内靶为STAT3、输出蛋白7、Her2或Src。
实施方案P257.实施方案55的方法，其中所述缀合物的非细胞穿透蛋白结合细胞内靶并且所述细胞内靶为磷酸化Src。
实施方案P258.实施方案52的方法，其中所述缀合物的非细胞穿透蛋白为特异性结合STAT3的抗体，并且所述第二非细胞穿透蛋白为特异性结合输出蛋白7的抗体。
实施方案P259.实施方案52的方法，其中所述缀合物的非细胞穿透蛋白为特异性结合STAT3的抗体并且所述第二非细胞穿透蛋白为特异性结合STAT3的另一个表位的抗体。
实施方案1.一种包含附接于硫代磷酸酯核酸的非细胞穿透蛋白的细胞穿透缀合物，其中所述硫代磷酸酯核酸增强所述非细胞穿透蛋白的细胞内递送。
实施方案2.实施方案1的细胞穿透缀合物，其中所述硫代磷酸酯核酸共价地附接于所述非细胞穿透蛋白。
实施方案3.实施方案1的细胞穿透缀合物，其中所述硫代磷酸酯核酸非共价地附接于所述非细胞穿透蛋白。
实施方案4.实施方案1的细胞穿透缀合物，其中多个硫代磷酸酯核酸附接于所述非细胞穿透蛋白。
实施方案5.实施方案4的细胞穿透缀合物，其中所述多个硫代磷酸酯核酸的每一个共价地附接于所述蛋白。
实施方案6.实施方案4的细胞穿透缀合物，其中所述多个硫代磷酸酯核酸的每一个非共价地附接于所述蛋白。
实施方案7.实施方案4的细胞穿透缀合物，其中所述蛋白包含共价和非共价附接的硫代磷酸酯核酸。
实施方案8.实施方案1至7的任一项的细胞穿透缀合物，其中每一个硫代磷酸酯核酸独立地附接于所述非细胞穿透蛋白的赖氨酸、精氨酸、半胱氨酸或组氨酸。
实施方案9.实施方案8的细胞穿透缀合物，其中所述每一个硫代磷酸酯核酸附接于所述蛋白的半胱氨酸。
实施方案10.实施方案1至9的任一项的细胞穿透缀合物，其中每一个硫代磷酸酯核酸的长度独立地为10、20、30、40、50、60、70、80、90、100个或更多个核酸残基。
实施方案11.实施方案10的细胞穿透缀合物，其中每一个硫代磷酸酯核酸的长度独立地为10至30个残基。
实施方案12.实施方案1至11的任一项的细胞穿透缀合物，其中所述非细胞穿透蛋白具有大于25kD的分子量。
实施方案13.实施方案1至12的任一项的细胞穿透缀合物，其中所述非细胞穿透蛋白具有25至750kD的分子量。
实施方案14.实施方案1至13的任一项的细胞穿透缀合物，其中所述非细胞穿透蛋白为抗体。
实施方案15.实施方案14的细胞穿透缀合物，其中所述抗体为IgG抗体。
实施方案16.实施方案14的细胞穿透缀合物，其中所述抗体为IgA、IgM、IgD或IgE抗体。
实施方案17.实施方案14的细胞穿透缀合物，其中所述抗体为Fv片段。
实施方案18.实施方案14至17的任一项的细胞穿透缀合物，其中所述抗体为人源化抗体。
实施方案19.实施方案1至18的任一项的细胞穿透缀合物，其中所述非细胞穿透蛋白结合细胞内靶。
实施方案20.实施方案19的细胞穿透缀合物，其中所述细胞内靶是选自由以下组成的组的疾病的靶：自身免疫性疾病、炎性疾病、代谢障碍、发育障碍、心血管疾病、肝病、肠道疾病、感染性疾病、内分泌疾病、神经障碍和癌症。
实施方案21.实施方案19或20的细胞穿透缀合物，其中所述细胞内靶为信号转导分子或转录因子。
实施方案22.实施方案21的细胞穿透缀合物，其中所述信号转导分子为磷酸酶或激酶。
实施方案23.实施方案20的细胞穿透缀合物，其中所述细胞内靶为癌症靶。
实施方案24.实施方案19的细胞穿透缀合物，其中所述细胞内靶选自由STAT3、输出蛋白7、Her2和Src组成的组。
实施方案25.实施方案19的细胞穿透缀合物，其中所述细胞内靶为磷酸化Src。
实施方案26.实施方案1至25的任一项的细胞穿透缀合物，其中所述非细胞穿透蛋白还包含附接于所述蛋白的标记物、小分子或功能性核酸。
实施方案27.一种结合于细胞内靶的实施方案1至26的任一项的细胞穿透缀合物。
实施方案28.实施方案1的细胞穿透缀合物，所述细胞穿透缀合物是通过将未附接的非细胞穿透蛋白与未附接的硫代磷酸酯核酸接触和使所述未附接的硫代磷酸酯核酸共价结合于所述未附接的非细胞穿透蛋白的氨基酸，从而附接和形成所述细胞穿透缀合物产生的。
实施方案29.实施方案28的细胞穿透缀合物，其中所述硫代磷酸酯核酸包含共价反应性部分。
实施方案30.实施方案29的细胞穿透缀合物，其中所述共价反应性部分与所述蛋白的赖氨酸、精氨酸、半胱氨酸或组氨酸具有反应性。
实施方案31.实施方案29的细胞穿透缀合物，其中所述共价反应性部分与半胱氨酸具有反应性。
实施方案32.实施方案28至31的任一项的细胞穿透缀合物，其中所述共价反应性部分为乙烯砜。
实施方案33.实施方案1的细胞穿透缀合物，所述细胞穿透缀合物是通过将未附接的非细胞穿透蛋白与未附接的硫代磷酸酯核酸接触和使所述未附接的硫代磷酸酯核酸结合于所述未附接的非细胞穿透蛋白，从而附接和形成所述细胞穿透缀合物产生的，其中所述未附接的硫代磷酸酯核酸包含具有式–S-S-(CH2)z-OH的取代基，其中z为1至10的整数。
实施方案34.实施方案28至33的任一项的细胞穿透缀合物，其中在还原条件下进行所述接触。
实施方案35.实施方案28至33的任一项的细胞穿透缀合物，其中所述未附接的硫代磷酸酯核酸相对于所述未附接的非细胞穿透蛋白是摩尔过量的。
实施方案36.一种细胞，所述细胞包含实施方案1至35的任一项的细胞穿透缀合物。
实施方案37.一种药物组合物，所述组合物包含实施方案1至35的任一项的细胞穿透缀合物和药学上可接受的载体。
实施方案38.实施方案37的药物组合物，所述组合物还包含附接于一个或多个硫代磷酸酯核酸的第二非细胞穿透蛋白。
实施方案39.实施方案38的药物组合物，其中所述第二非细胞穿透蛋白结合细胞内靶。
实施方案40.实施方案39的药物组合物，其中所述第二非细胞穿透蛋白相对于实施方案19至25的任一项的非细胞穿透蛋白结合所述细胞内靶上的不同表位。
实施方案41.实施方案39的药物组合物，其中所述第二非细胞穿透蛋白结合第二细胞内靶。
实施方案42.实施方案38至41的任一项的药物组合物，其中所述第二非细胞穿透蛋白为抗体。
实施方案43.一种试剂盒，所述试剂盒包含实施方案1至35的任一项的细胞穿透缀合物或实施方案37的药物组合物以及使用说明书。
实施方案44.实施方案43的试剂盒，所述试剂盒还包含附接于一个或多个硫代磷酸酯核酸的第二非细胞穿透蛋白。
实施方案45.实施方案44的试剂盒，其中实施方案1至27的任一项的缀合物和所述第二非细胞穿透蛋白存在于分开的容器中。
实施方案46.实施方案44的试剂盒，其中实施方案37的药物组合物和所述第二非细胞穿透蛋白存在于分开的容器中。
实施方案47.实施方案44至46的任一项的试剂盒，其中所述第二非细胞穿透蛋白相对于实施方案19至25的任一项的非细胞穿透蛋白结合所述细胞内靶上的不同表位。
实施方案48.实施方案44至46的任一项的试剂盒，其中所述第二非细胞穿透蛋白结合第二细胞内靶。
实施方案49.实施方案44至48的任一项的试剂盒，其中将所述第二非细胞穿透蛋白配制为包含所述第二非细胞穿透蛋白和药学上可接受的载体的药物组合物。
实施方案50.实施方案43至49的任一项的试剂盒，其中所述第二非细胞穿透蛋白为抗体。
实施方案51.一种将非细胞穿透蛋白递送入细胞的方法，所述方法包括将所述细胞与实施方案1至35的任一项的细胞穿透缀合物接触。
实施方案52.实施方案51的方法，其中所述非细胞穿透蛋白结合细胞质中的核蛋白，从而形成非细胞穿透蛋白-核蛋白复合物。
实施方案53.实施方案52的方法，其中所述非细胞穿透蛋白-核蛋白复合物不能进入所述细胞的细胞核。
实施方案54.一种治疗受试者中的疾病的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的实施方案1至35的任一项的细胞穿透缀合物，其中所述缀合物的施用治疗所述受试者的疾病。
实施方案55.实施方案54的方法，所述方法还包括向所述受试者施用附接于一个或多个硫代磷酸酯核酸的第二非细胞穿透蛋白。
实施方案56.实施方案55的方法，其中所述第二非细胞穿透蛋白相对于实施方案19至26的任一项的缀合物结合所述细胞内靶上的不同表位。
实施方案57.实施方案55的方法，其中所述第二非细胞穿透蛋白结合第二细胞内靶。
实施方案58.实施方案55至57的任一项的方法，其中同时施用实施方案1至26的任一项的缀合物和所述第二非细胞穿透蛋白。
实施方案59.实施方案55至57的任一项的方法，其中相继地施用实施方案1至26的任一项的缀合物和所述第二非细胞穿透蛋白。
实施方案60.实施方案55至59的任一项的方法，其中所述第二非细胞穿透蛋白为抗体。
实施方案61.实施方案54至60的任一项的方法，所述方法还包括向所述受试者施用第二治疗剂。
实施方案62.实施方案54至61的任一项的方法，其中所述疾病选自由以下组成的组：自身免疫性疾病、发育障碍、炎性疾病、代谢障碍、心血管疾病、肝病、肠道疾病、感染性疾病、内分泌疾病、神经障碍和癌症。
实施方案63.实施方案62的方法，其中所述疾病为癌症。
实施方案64.实施方案63的方法，其中所述缀合物的非细胞穿透蛋白结合胞内靶并且所述细胞内靶为STAT3、输出蛋白7、Her2或Src。
实施方案65.实施方案63的方法，其中所述缀合物的非细胞穿透蛋白结合细胞内靶并且所述细胞内靶为磷酸化Src。
实施方案66.实施方案60的方法，其中所述缀合物的非细胞穿透蛋白为特异性结合STAT3的抗体，并且所述第二非细胞穿透蛋白为特异性结合输出蛋白7的抗体。
实施方案67.实施方案60的方法，其中所述缀合物的非细胞穿透蛋白为特异性结合STAT3的抗体，并且所述第二细胞穿透蛋白为特异性结合STAT3的另一个表位的抗体。

Claims (67)

1.一种包含附接于硫代磷酸酯核酸的非细胞穿透蛋白的细胞穿透缀合物，其中所述硫代磷酸酯核酸增强所述非细胞穿透蛋白的细胞内递送。
2.根据权利要求1所述的细胞穿透缀合物，其中所述硫代磷酸酯核酸共价地附接于所述非细胞穿透蛋白。
3.根据权利要求1所述的细胞穿透缀合物，其中所述硫代磷酸酯核酸非共价地附接于所述非细胞穿透蛋白。
4.根据权利要求1所述的细胞穿透缀合物，其中多个硫代磷酸酯核酸附接于所述非细胞穿透蛋白。
5.根据权利要求4所述的细胞穿透缀合物，其中所述多个硫代磷酸酯核酸的每一个共价地附接于所述蛋白。
6.根据权利要求4所述的细胞穿透缀合物，其中所述多个硫代磷酸酯核酸的每一个非共价地附接于所述蛋白。
7.根据权利要求4所述的细胞穿透缀合物，其中所述蛋白包含共价和非共价地附接的硫代磷酸酯核酸。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的细胞穿透缀合物，其中每一个硫代磷酸酯核酸独立地附接于所述非细胞穿透蛋白的赖氨酸、精氨酸、半胱氨酸或组氨酸。
9.根据权利要求8所述的细胞穿透缀合物，其中每一个硫代磷酸酯核酸附接于所述蛋白的半胱氨酸。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的细胞穿透缀合物，其中每一个硫代磷酸酯核酸的长度独立地为10、20、30、40、50、60、70、80、90、100个或更多个核酸残基。
11.根据权利要求10所述的细胞穿透缀合物，其中每一个硫代磷酸酯核酸的长度独立地为10至30个残基。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的细胞穿透缀合物，其中所述非细胞穿透蛋白具有大于25kD的分子量。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的细胞穿透缀合物，其中所述非细胞穿透蛋白具有25至750kD的分子量。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的细胞穿透缀合物，其中所述非细胞穿透蛋白为抗体。
15.根据权利要求14所述的细胞穿透缀合物，其中所述抗体为IgG抗体。
16.根据权利要求14所述的细胞穿透缀合物，其中所述抗体为IgA、IgM、IgD或IgE抗体。
17.根据权利要求14所述的细胞穿透缀合物，其中所述抗体为Fv片段。
18.根据权利要求14至17中任一项所述的细胞穿透缀合物，其中所述抗体为人源化抗体。
19.根据权利要求1至18中任一项所述的细胞穿透缀合物，其中所述非细胞穿透蛋白结合细胞内靶。
20.根据权利要求19所述的细胞穿透缀合物，其中所述细胞内靶是选自由以下组成的组的疾病的靶：自身免疫性疾病、炎性疾病、代谢障碍、发育障碍、心血管疾病、肝病、肠道疾病、感染性疾病、内分泌疾病、神经障碍和癌症。
21.根据权利要求19或20所述的细胞穿透缀合物，其中所述细胞内靶为信号转导分子或转录因子。
22.根据权利要求21所述的细胞穿透缀合物，其中所述信号转导分子为磷酸酶或激酶。
23.根据权利要求20所述的细胞穿透缀合物，其中所述细胞内靶为癌症靶。
24.根据权利要求19所述的细胞穿透缀合物，其中所述细胞内靶选自由STAT3、输出蛋白7、Her2和Src组成的组。
25.根据权利要求19所述的细胞穿透缀合物，其中所述细胞内靶为磷酸化Src。
26.根据权利要求1至25中任一项所述的细胞穿透缀合物，其中所述非细胞穿透蛋白还包含附接于所述蛋白的标记物、小分子或功能性核酸。
27.一种结合于细胞内靶的权利要求1至26的任一项的细胞穿透缀合物。
28.根据权利要求1所述的细胞穿透缀合物，所述细胞穿透缀合物是通过将未附接的非细胞穿透蛋白与未附接的硫代磷酸酯核酸接触和使所述未附接的硫代磷酸酯核酸共价地结合于所述未附接的非细胞穿透蛋白的氨基酸，从而附接和形成所述细胞穿透缀合物制成的。
29.根据权利要求28所述的细胞穿透缀合物，其中所述硫代磷酸酯核酸包含共价反应性部分。
30.根据权利要求29所述的细胞穿透缀合物，其中所述共价反应性部分与所述蛋白的赖氨酸、精氨酸、半胱氨酸或组氨酸具有反应性。
31.根据权利要求29所述的细胞穿透缀合物，其中所述共价反应性部分与半胱氨酸具有反应性。
32.根据权利要求28至31中任一项所述的细胞穿透缀合物，其中所述共价反应性部分为乙烯砜。
33.根据权利要求1所述的细胞穿透缀合物，所述细胞穿透缀合物是通过将未附接的非细胞穿透蛋白与未附接的硫代磷酸酯核酸接触和使所述未附接的硫代磷酸酯核酸结合于所述未附接的非细胞穿透蛋白，从而附接和形成所述细胞穿透缀合物制成的，其中所述未附接的硫代磷酸酯核酸包含具有式–S-S-(CH2)z-OH的取代基，其中z为1至10的整数。
34.根据权利要求28至33中任一项所述的细胞穿透缀合物，其中在还原条件下进行所述接触。
35.根据权利要求28至33中任一项所述的细胞穿透缀合物，其中所述未附接的硫代磷酸酯核酸相对于所述未附接的非细胞穿透蛋白是摩尔过量的。
36.一种细胞，所述细胞包含权利要求1至35的任一项的细胞穿透缀合物。
37.一种药物组合物，所述组合物包含权利要求1至35的任一项的细胞穿透缀合物和药学上可接受的载体。
38.根据权利要求37所述的药物组合物，所述组合物还包含附接于一个或多个硫代磷酸酯核酸的第二非细胞穿透蛋白。
39.根据权利要求38所述的药物组合物，其中所述第二非细胞穿透蛋白结合细胞内靶。
40.根据权利要求39所述的药物组合物，其中所述第二非细胞穿透蛋白相对于权利要求19至25的任一项的非细胞穿透蛋白结合所述细胞内靶上的不同表位。
41.根据权利要求39所述的药物组合物，其中所述第二非细胞穿透蛋白结合第二细胞内靶。
42.根据权利要求38至41中任一项所述的药物组合物，其中所述第二非细胞穿透蛋白为抗体。
43.一种试剂盒，所述试剂盒包含权利要求1至35的任一项的细胞穿透缀合物或权利要求37的药物组合物以及使用说明书。
44.根据权利要求43所述的试剂盒，所述试剂盒还包含附接于一个或多个硫代磷酸酯核酸的第二非细胞穿透蛋白。
45.根据权利要求44所述的试剂盒，其中权利要求1至27的任一项的缀合物和所述第二非细胞穿透蛋白存在于分开的容器中。
46.根据权利要求44所述的试剂盒，其中权利要求37的药物组合物和所述第二非细胞穿透蛋白存在于分开的容器中。
47.根据权利要求44至46中任一项所述的试剂盒，其中所述第二非细胞穿透蛋白相对于权利要求19至25的任一项的非细胞穿透蛋白结合所述细胞内靶上的不同表位。
48.根据权利要求44至46中任一项所述的试剂盒，其中所述第二非细胞穿透蛋白结合第二细胞内靶。
49.根据权利要求44至48中任一项所述的试剂盒，其中将所述第二非细胞穿透蛋白配制为包含所述第二非细胞穿透蛋白和药学上可接受的载体的药物组合物。
50.根据权利要求43至49中任一项所述的试剂盒，其中所述第二非细胞穿透蛋白为抗体。
51.一种将非细胞穿透蛋白递送入细胞的方法，所述方法包括将所述细胞与权利要求1至35的任一项的细胞穿透缀合物接触。
52.根据权利要求51所述的方法，其中所述非细胞穿透蛋白结合细胞质中的核蛋白，从而形成非细胞穿透蛋白-核蛋白复合物。
53.根据权利要求52所述的方法，其中所述非细胞穿透蛋白-核蛋白复合物不能进入所述细胞的细胞核。
54.一种治疗受试者中的疾病的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的权利要求1至35的任一项的细胞穿透缀合物，其中所述缀合物的施用治疗所述受试者的所述疾病。
55.根据权利要求54所述的方法，所述方法还包括向所述受试者施用附接于一个或多个硫代磷酸酯核酸的第二非细胞穿透蛋白。
56.根据权利要求55所述的方法，其中所述第二非细胞穿透蛋白相对于权利要求19至26的任一项的缀合物结合所述细胞内靶上的不同表位。
57.根据权利要求55所述的方法，其中所述第二非细胞穿透蛋白结合第二细胞内靶。
58.根据权利要求55至57中任一项所述的方法，其中同时施用权利要求1至26的任一项的缀合物和所述第二非细胞穿透蛋白。
59.根据权利要求55至57中任一项所述的方法，其中相继地施用权利要求1至26的任一项的缀合物和所述第二非细胞穿透蛋白。
60.根据权利要求55至59中任一项所述的方法，其中所述第二非细胞穿透蛋白为抗体。
61.根据权利要求54至60中任一项所述的方法，所述方法还包括向所述受试者施用第二治疗剂。
62.根据权利要求54至61中任一项所述的方法，其中所述疾病选自由以下组成的组：自身免疫性疾病、发育障碍、炎性疾病、代谢障碍、心血管疾病、肝病、肠道疾病、感染性疾病、内分泌疾病、神经障碍和癌症。
63.根据权利要求62所述的方法，其中所述疾病为癌症。
64.根据权利要求63所述的方法，其中所述缀合物的非细胞穿透蛋白结合细胞内靶并且所述细胞内靶为STAT3、输出蛋白7、Her2或Src。
65.根据权利要求63所述的方法，其中所述缀合物的非细胞穿透蛋白结合细胞内靶并且所述细胞内靶为磷酸化Src。
66.根据权利要求60所述的方法，其中所述缀合物的非细胞穿透蛋白为特异性结合STAT3的抗体，并且所述第二非细胞穿透蛋白为特异性结合输出蛋白7的抗体。
67.根据权利要求60所述的方法，其中所述缀合物的非细胞穿透蛋白为特异性结合STAT3的抗体，并且所述第二细胞穿透蛋白为特异性结合STAT3的另一个表位的抗体。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110913913A (zh) * 2017-01-04 2020-03-24 索伦托治疗有限公司 含有与细胞表面巯基反应的巯基反应性基团的细胞内化偶联物

Families Citing this family (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2731876T3 (es) 2014-10-23 2019-11-19 Singh Molecular Medicine Llc Anticuerpos de dominio sencillo contra antígenos intracelulares
US20170267784A1 (en) 2014-10-23 2017-09-21 Singh Molecular Medicine, Llc Single domain antibodies directed against intracellular antigens
KR20170098957A (ko) * 2015-01-16 2017-08-30 시티 오브 호프 세포 침투성 항체
JP7104462B2 (ja) * 2015-08-06 2022-07-21 シティ・オブ・ホープ 細胞透過性タンパク質－抗体コンジュゲートおよび使用方法
CN108136042A (zh) * 2015-08-06 2018-06-08 希望之城 治疗性细胞内化缀合物
EP3365375A4 (en) * 2015-10-20 2019-09-04 Sorrento Therapeutics, Inc. INTRACELLULAR ADMINISTRATION COMPOUNDS
TWI746473B (zh) 2015-11-02 2021-11-21 美商辛分子醫藥有限公司 針對細胞內抗原之單域抗體
EP3386549A4 (en) * 2015-12-10 2019-08-07 City of Hope ANTIBODIES COUPLED WITH CYANINE WITH CELL PENETRATION
KR20180059091A (ko) 2016-11-25 2018-06-04 김정수 소비자 패션선호도 기반의 가상 피팅 방법, 그 시스템 및 시스템의 작동을 제어하기 위한 제어방법
EP3610022A1 (en) 2017-04-14 2020-02-19 Tollnine, Inc. Immunomodulating polynucleotides, antibody conjugates thereof, and methods of their use
EP3651807B1 (en) * 2017-07-13 2023-11-01 City of Hope Phosphorothioate-conjugated peptides and methods of using the same
US11607457B2 (en) * 2017-07-13 2023-03-21 City Of Hope Anti-cancer phosphorothioate-coupled peptide conjugates and methods of using the same
EP3730150A4 (en) * 2017-12-22 2021-10-06 Rophibio, Inc. ANTI-STAT3 BISPECIFIC ANTIBODY WITH CELL-PENETRATING ABILITY AND THIS PHARMACEUTICAL COMPOSITION
KR20190076354A (ko) * 2017-12-22 2019-07-02 주식회사 로피바이오 세포 내 침투능을 갖는 항 stat3 이중특이 항체를 포함하는, 염증성 질환 치료용 약학적 조성물
EP3805400A4 (en) 2018-06-04 2022-06-29 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antigen-binding molecule showing changed half-life in cytoplasm
JPWO2019235581A1 (ja) 2018-06-06 2021-07-08 国立大学法人大阪大学 Ｒｅｇｎａｓｅ−１が関与する疾患の治療および／または予防方法
EP4153762A2 (en) * 2020-05-22 2023-03-29 City of Hope Phosphorothioate nucleic acid conjugates including dna editing enzymes
WO2021260061A2 (en) * 2020-06-24 2021-12-30 Sapreme Technologies B.V. Saponin derivatives with improved therapeutic window
EP4171645A2 (en) * 2020-06-24 2023-05-03 Sapreme Technologies B.V. Hydrazone-based saponin derivatives
WO2024091824A1 (en) 2022-10-26 2024-05-02 Ada Forsyth Institute, Inc. Differentiation and reprogramming of chondrocyte

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20040147027A1 (en) * 2003-01-28 2004-07-29 Troy Carol M. Complex for facilitating delivery of dsRNA into a cell and uses thereof
US20110218334A1 (en) * 2008-07-11 2011-09-08 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. PHOSPHOROTHIOATE OLIGONUCLEOTIDES AND NON-NUCLEOSIDIC PHOSPHOROTHIOATES AS DELIVERY AGENTS FOR iRNA AGENTS
CN102448494A (zh) * 2009-02-13 2012-05-09 免疫医疗公司 具有胞内可裂解的键的免疫共轭物

Family Cites Families (50)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2413974A1 (fr) 1978-01-06 1979-08-03 David Bernard Sechoir pour feuilles imprimees par serigraphie
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
EP0173494A3 (en) 1984-08-27 1987-11-25 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Chimeric receptors by dna splicing and expression
US5034506A (en) 1985-03-15 1991-07-23 Anti-Gene Development Group Uncharged morpholino-based polymers having achiral intersubunit linkages
US5235033A (en) 1985-03-15 1993-08-10 Anti-Gene Development Group Alpha-morpholino ribonucleoside derivatives and polymers thereof
US4676980A (en) 1985-09-23 1987-06-30 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Target specific cross-linked heteroantibodies
WO1987002671A1 (en) 1985-11-01 1987-05-07 International Genetic Engineering, Inc. Modular assembly of antibody genes, antibodies prepared thereby and use
US4946778A (en) 1987-09-21 1990-08-07 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
GB8823869D0 (en) 1988-10-12 1988-11-16 Medical Res Council Production of antibodies
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
DK0479909T3 (da) 1989-06-29 1997-04-07 Medarex Inc Bispecifikke reagenser til AIDS-behandling
US5859205A (en) 1989-12-21 1999-01-12 Celltech Limited Humanised antibodies
US5633425A (en) 1990-08-29 1997-05-27 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
KR100272077B1 (ko) 1990-08-29 2000-11-15 젠팜인터내셔날,인코포레이티드 이종 항체를 생산할 수 있는 전이유전자를 가진 인간이외의 동물
US5661016A (en) 1990-08-29 1997-08-26 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5625126A (en) 1990-08-29 1997-04-29 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
CA2102511A1 (en) 1991-05-14 1992-11-15 Paul J. Higgins Heteroconjugate antibodies for treatment of hiv infection
WO1993008829A1 (en) 1991-11-04 1993-05-13 The Regents Of The University Of California Compositions that mediate killing of hiv-infected cells
US5777085A (en) 1991-12-20 1998-07-07 Protein Design Labs, Inc. Humanized antibodies reactive with GPIIB/IIIA
KR20030097604A (ko) 1992-07-13 2003-12-31 유카리언, 인코포레이티드 세포의 세포내 구획으로 지질화된 면역글로불린을전달하기 위한 조성물, 지질화된 단백질 및 지질화된 항체
AU687010B2 (en) 1992-07-17 1998-02-19 Dana-Farber Cancer Institute Method of intracellular binding of target molecules
US6210671B1 (en) 1992-12-01 2001-04-03 Protein Design Labs, Inc. Humanized antibodies reactive with L-selectin
WO1995002422A1 (en) 1993-07-12 1995-01-26 Weltman Joel K Method for conjugating nucleotides and nucleosides to disulfide-, maleimide-, and thiol-containing compounds
EP0745134A1 (en) 1994-02-22 1996-12-04 Danafarber Cancer Institute Nucleic acid delivery system, method of synthesis and uses thereof
MXPA01005515A (es) 1998-12-01 2003-07-14 Protein Design Labs Inc Anticuerpos humanizados para gamma-interferon.
US6903077B1 (en) 1999-01-04 2005-06-07 University Of Vermont And State Agricultural College Methods and products for delivering nucleic acids
DK1233782T3 (da) 1999-12-01 2009-02-09 Novartis Vaccines & Diagnostic Fremkaldelse af HCV-specifikke antistoffer
US20040052762A1 (en) * 2001-09-10 2004-03-18 Hua Yu Stat3 agonists and antagonists and therapeutic uses thereof
US20030158109A1 (en) 2000-11-13 2003-08-21 Klaus Giese Metastatic breast and colon cancer regulated genes
KR20040058229A (ko) 2001-10-22 2004-07-03 더 스크립스 리서치 인스티튜트 항체 표적화 화합물
US20050042632A1 (en) 2002-02-13 2005-02-24 Sirna Therapeutics, Inc. Antibodies having specificity for nucleic acids
CA2529752A1 (en) 2003-06-20 2005-09-15 The Regents Of The University Of California Polypeptide transduction and fusogenic peptides
US20070167388A1 (en) * 2003-09-11 2007-07-19 Universitätsklinikum Schleswig-Holstein Campus Lübeck Nucleotide sequences promoting the trans-membrane transport of nucleic acids
WO2005082935A1 (en) 2004-02-26 2005-09-09 Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Stamp modulation of glucocorticoid-responsive gene expression
CA2573656A1 (en) 2004-07-13 2006-02-16 Cell Genesys, Inc. Aav vector compositions and methods for enhanced expression of immunoglobulins using the same
CA2633063A1 (en) * 2005-12-16 2007-06-21 Diatos Cell penetrating peptide conjugates for delivering of nucleic acids intocells
US20070225213A1 (en) 2006-03-23 2007-09-27 Kosak Matthew K Nucleic acid carriers for delivery of therapeutic agents
RS54163B1 (en) * 2006-05-30 2015-12-31 Genentech Inc. ANTI-CD22 ANTIBODIES, THEIR IMMUNCONJUGATES AND THEIR USE
JP6125741B2 (ja) * 2006-07-12 2017-05-17 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア 可逆的なホスホトリエステル電荷中和保護基による核酸の形質導入可能な送達
US20110129421A1 (en) 2007-07-17 2011-06-02 The General Hospital Corporation Matrix metalloprotease targeting nucleic acids
MX2010001194A (es) * 2007-07-31 2010-07-30 Univ Louisiana State Conjugado de polipeptido-acido nucleico para inmunoprofilaxis o inmunoterapia para desordenes neoplasicos o infecciones.
EP2355852A4 (en) * 2008-09-16 2015-06-24 Ge Healthcare Bio Sciences Ab CHEMICALLY MODIFIED CELL-PENETRATING PEPTIDES FOR IMPROVED DELIVERY OF GENE MODULATING COMPOUNDS
US20100190691A1 (en) * 2009-01-27 2010-07-29 Trojan Technologies, Ltd Delivery of nucleic acids using cell-penetrating peptides
US8552167B2 (en) * 2009-10-20 2013-10-08 Arizona Board Of Regents, A Body Corporate Of The State Of Arizona Acting For And On Behalf Of Arizona State University Multifunctional aptamer-nucleic acid nanostructures for tumor-targeted killing
NZ586074A (en) * 2010-06-10 2013-07-26 Auckland Uniservices Ltd LCLRP peptides, constructs and uses thereof
US20120122795A1 (en) 2010-08-09 2012-05-17 University Of Southern California Accelerated extension of axons
US9045750B2 (en) * 2011-03-18 2015-06-02 Yuelong Ma Humanized lewis-Y specific antibody-based delivery of dicer substrate siRNA (D-siRNA) against STAT3
JP6178785B2 (ja) * 2011-04-01 2017-08-09 イェール ユニバーシティーＹａｌｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ 細胞浸透性抗ｄｎａ抗体およびｄｎａ修復を阻害するためのその使用
EP3453761A1 (en) 2011-08-29 2019-03-13 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Oligomer-conjugate complexes and their use

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20040147027A1 (en) * 2003-01-28 2004-07-29 Troy Carol M. Complex for facilitating delivery of dsRNA into a cell and uses thereof
US20110218334A1 (en) * 2008-07-11 2011-09-08 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. PHOSPHOROTHIOATE OLIGONUCLEOTIDES AND NON-NUCLEOSIDIC PHOSPHOROTHIOATES AS DELIVERY AGENTS FOR iRNA AGENTS
CN102448494A (zh) * 2009-02-13 2012-05-09 免疫医疗公司 具有胞内可裂解的键的免疫共轭物

Non-Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ANDREAS HERRMANN ET AL: "Nucleocytoplasmic shuttling of persistently activated STAT3", 《JOURNAL OF CELL SCIENCE》 *
C. A. STEIN1 ET AL: "Efficient gene silencing by delivery of locked nucleic acid antisense oligonucleotides, unassisted by transfection reagents", 《NUCLEIC ACIDS RESEARCH》 *
FATIH M. UCKUN ET AL: "Rational design of an immunoconjugate for selective knock-down of leukemia-specific E2A–PBX1 fusion gene expression in human Pre-B leukemia", 《INTEGRATIVE BIOLOGY》 *
JOHANNES WINKLER: "Oligonucleotide conjugates for therapeutic applications", 《THER.DELIV》 *
LANXI SONG ET AL: "JAK1 Activates STAT3 Activity in Non-Small-Cell Lung Cancer cells and IL-6 Neutralizing Antibodies can Suppress JAK1-STAT3 Signaling", 《MOL CANCER THER.》 *
MAXIM ANTOPOLSKY ET AL: "Peptide-Oligonucleotide Phosphorothioate Conjugates with Membrane Translocation and Nuclear Localization Properties", 《BIOCONJUGATE CHEM.》 *
WERE LL MUNYENDO ET AL: "Cell Penetrating Peptides in the Delivery of Biopharmaceuticals", 《BIOMOLECULES》 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110913913A (zh) * 2017-01-04 2020-03-24 索伦托治疗有限公司 含有与细胞表面巯基反应的巯基反应性基团的细胞内化偶联物

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