KR20190076354A - 세포 내 침투능을 갖는 항 stat3 이중특이 항체를 포함하는, 염증성 질환 치료용 약학적 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 세포 내 침투능을 갖는 항 STAT3 이중특이 항체를 유효성분으로 포함하는 염증성 질환 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 STAT3/DNA 이중 특이적 항체는 세포 내로 침투하여 핵 내 DNA에 특이적으로 결합하는 DNA 결합부위를 포함함으로써 종래 세포 외에 존재하는 단백질만을 표적으로 하는 항체 의약품의 한계점을 극복할 수 있으며, 인산화된 활성화 형태의 STAT3에만 특이적으로 결합하여 이의 전사인자 활성을 억제할 수 있음을 확인하였는바 STAT3의 활성화에 의해 발병하는 류마티스 관절염을 포함하는 염증성 질환에 대한 부작용이 없는 치료제 개발에 효율적으로 이용될 수 있을 것이다.

Description

세포 내 침투능을 갖는 항 STAT3 이중특이 항체를 포함하는, 염증성 질환 치료용 약학적 조성물{Pharmaceutical composition for treating inflammatory disease containing anti-STAT3 bispecific antibody having cell penetrating ability}

본 발명은 세포 내 침투능을 갖는 항 STAT3 이중특이 항체를 유효성분으로 포함하는 염증성 질환 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.

염증성 질환은 염증반응이 주병변으로 나타나는 질환을 총칭하는 것으로, 이 중 류마티스 관절염(rheumatoid arthritis)은 다발성 관절염을 특징으로 하는 원인 불명의 만성 염증성 질환이다. 초기에는 관절을 싸고 있는 활막에 염증이 발생하지만 점차 주위의 연골과 뼈로 염증이 퍼져 관절의 파괴와 변형을 초래하게 되며, 관절뿐만 아니라 관절 외 증상으로 빈혈, 건조증후군, 피하 결절, 폐섬유화증, 혈관염, 피부 궤양 등 전신을 침범할 수 있는 질환이다.

류마티스 관절염의 정확한 원인은 아직 밝혀지지 않았지만 자가면역 현상이 주요 기전으로 알려져 있다. 자가면역(autoimmune)이란 외부로부터 인체를 지키는 면역계의 이상으로 오히려 자신의 인체를 공격하는 현상이다. 일반적으로는 유전적 소인, 세균이나 바이러스 감염 등이 류마티스 관절염의 원인으로 생각되고 있으며, 신체적 또는 정신적 스트레스를 받은 후 발병하기 쉽다고 알려져 있다. 또한 폐경 초기에도 발병률이 높다고 보고되어 있는데, 이는 류마티스 관절염이 호르몬의 영향을 받는다는 것을 보여주는 예이다.

이러한 류마티스 관절염의 치료방법으로, 면역병리학적 기작들과 연관된 치료전략이 알려져 있고 몇몇 생물요법(biotherapy)이 이용되고 있으나 임상적으로 지족 가능한 효과적인 치료제는 없는 실정이다.

한편, 최근까지 다양한 연구를 통해 STAT3(signal transducers and activators of transcription 3)가 류마티스 관절염을 포함한 자가면역 질환에서 NF-κB와는 또 다른 하나의 중요한 전사인자로서 역할을 하는 것이 보고되어 왔다. 특히, STAT3는 염증반응을 매개하는 사이토카인인 인터류킨-6(interleukin-6, IL-6)에 의해서 활성화 되는 것이 잘 알려져 있으며 이에 의해 지속적으로 활성화된 STAT3가 류마티스 관절염의 발병과 밀접한 연관이 있음이 보고되어 있다(Rheumatology (Oxford). 2015 Jun;54(6):1103-13).

세포의 증식을 유도하는 신호전달 단백질인 STAT3(signal transducers and activators of transcription 3)는, 인터루킨(interleukin, IL) 또는 인터페론-감마 (IFN-γ)와 같은 외부 신호(extracellular signal)에 의해 인산화가 유도되면, 짝을 이루어(동종이합체(homo-dimer) 또는 이종이합체(hetero-dimer) 형성) 핵 안으로 이동하여 특정 유전자의 발현을 유도한다. 특히, STAT3는 암 유발 인자로 알려지면서 많은 주목을 받고 있으며, 실제로, 다양한 암 조직에서 STAT3의 비정상적인 활성화가 보고된 바가 있으며, 이에 따라 STAT3의 비정상적인 활성화를 억제할 수 있는 항암제 개발에 많은 연구자들이 참여하고 있다. 하지만, 아직까지 효과적으로 STAT3를 억제시킬 수 있는 약물의 개발은 미비한 수준이다.

항체는 모든 포유동물의 혈청이나 조직 체액 중에 존재하는 당단백질이며, 생체 내에서 외래 항원을 인식한다. 항체는 보체계의 활성화나, 세포 표면에 존재하는 수용체(FcR)로의 결합을 통해, FcR 발현 세포의 탐식능, 항체 의존성 세포 상해능, 메디에이터의 유리능 및 항원 제시능과 같은 이펙터 기능을 활성화하고, 생체방어에 관여한다. 이러한 항체의 항원 특이적인 결합능에 기반하여 다양한 의약품들은 세포 내 질병의 원인이 되는 물질에 결합하여 이의 활성을 억제하는 재조합 항체의 형태로 개발되고 있으며, 다른 유형의 약물 예컨대 저분자 약물에 비해 생산의 용이성, 특이성, 및 생체-내구성 때문에 효과적인 약물형태로 입증되었다.

그러나 일반적인 항체는 오직 세포외 분자만을 표적으로 삼을 수 있는데, 질환의 치료 및 질환 진단을 위한 수많은 중요한 표적들이 세포내에 있다. 예컨대 많은 전사 인자들, 특히 STAT3는 그 중에서도 다양한 질환의 치료를 위해 가장 핵심적이지만 도전적인 표적으로 인식되고 있다.

이에, 본 발명은 상기 활성화된 STAT3만을 표적으로 하는 세포 내 침투가 가능한 항체를 개발하였으며 이를 통해 STAT3 관련 질환 치료에 이용하고자 한다.

본 발명은 상기와 같은 종래의 한계점을 극복하기 위하여 안출된 것으로, 본 발명자들은 인산화된 STAT3 및 세포 내 DNA에 특이적으로 결합하며 세포 침투능을 갖는 이중 특이적 항체를 개발하였는바, 이에 기초하여 본 발명을 완성하였다.

이에, 본 발명은 STAT3/DNA 이중 특이적 항체 또는 그 단편을 유효성분으로 포함하는, 염증성 질환 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 STAT3/DNA 이중 특이적 항체 또는 그 단편을 유효성분으로 포함하는, 염증성 질환 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 일구현예로, 상기 염증성 질환은 류마티스 관절염(rheumatoid arthritis)일 수 있다.

본 발명의 다른 구현예로, 상기 항체 또는 그 단편은 STAT3(Signal transducer and activator of transcription 3)에 특이적으로 결합하는 제 1 항원 결합 부위 및 DNA에 특이적으로 결합하는 제 2 항원 결합 부위를 포함하는 것일 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 STAT3에 특이적으로 결합하는 제 1 항원 결합 부위는 서열번호 1 내지 3의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 상보성 결정영역(complementarity determining region, CDR) 및 서열번호 4 내지 6의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 상보성 결정영역을 포함하는 것일 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 STAT3에 특이적으로 결합하는 제 1 항원 결합 부위는 서열번호 7 내지 9의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 상보성 결정영역(complementarity determining region, CDR) 및 서열번호 10 내지 12의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 상보성 결정영역을 포함하는 것일 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 STAT3에 특이적으로 결합하는 제 1 항원 결합 부위는 서열번호 13 내지 15의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 상보성 결정영역(complementarity determining region, CDR) 및 서열번호 16 내지 18의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 상보성 결정영역을 포함하는 것일 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 STAT3에 특이적으로 결합하는 제 1 항원 결합 부위는 서열번호 19 내지 21의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 상보성 결정영역(complementarity determining region, CDR) 및 서열번호 22 내지 24의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 상보성 결정영역을 포함하는 것일 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 STAT3에 특이적으로 결합하는 제 1 항원 결합 부위는 서열번호 25 내지 27의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 상보성 결정영역(complementarity determining region, CDR) 및 서열번호 28 내지 30의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 상보성 결정영역을 포함하는 것일 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 STAT3에 특이적으로 결합하는 제 1 항원 결합 부위는 서열번호 31 내지 33의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 상보성 결정영역(complementarity determining region, CDR) 및 서열번호 34 내지 36의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 상보성 결정영역을 포함하는 것일 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 STAT3에 특이적으로 결합하는 제 1 항원 결합 부위는 서열번호 37 내지 39의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 상보성 결정영역(complementarity determining region, CDR) 및 서열번호 40 내지 42의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 상보성 결정영역을 포함하는 것일 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 STAT3는 705번째 티로신 잔기가 인산화된 것일 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 항체 또는 그 단편은 세포 내로의 침투능을 갖는 것일 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 약학적 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 염증성 질환 치료방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 약학적 조성물의, 염증성 질환 치료용도를 제공한다.

본 발명에 따른 STAT3/DNA 이중 특이적 항체는 세포 내로 침투하여 핵 내 DNA에 특이적으로 결합하는 DNA 결합부위를 포함함으로써 종래 세포 외에 존재하는 단백질만을 표적으로 하는 항체 의약품의 한계점을 극복할 수 있으며, 인산화된 활성화 형태의 STAT3에만 특이적으로 결합하여 이의 전사인자 활성을 억제할 수 있음을 확인하였는바 STAT3의 활성화와 관련된 류마티스 관절염을 포함하는 염증성 질환에 대한 부작용이 없는 치료제 개발에 효율적으로 이용될 수 있을 것이다.

도 1a는 인산화된 STAT3에 특이적으로 결합하는 이중항체(이하, pSTAT3 항체)의 구조를 간단히 도시한 것이고, 도 1b는 본 발명의 상기 항체 구조 및 이의 서열을 도시한 것이다.
도 2는 본 발명의 pSTAT3 이중 특이적 항체를 생산한 후 SDS-PAGE를 실시하여 인산화된 STAT3에 대한 결합능을 확인한 결과이다.
도 3은 면역세포화학염색법을 통해 본 발명의 pSTAT3 이중 특이적 항체의 세포 침투능을 확인한 결과이다.
도 4는 본 발명의 pSTAT3 이중 특이적 항체의 pSTAT3 억제능을 확인한 것으로서, 도 4a 및 도 4c는 마우스 대식세포주(RAW264.7)와 관절골수세포(Synoviocyte) 각각에 LPS 또는 TNFα를 처리하여 STAT3의 활성을 유도한 후 상기 항체를 처리하고 pSTAT3 단백질의 발현수준을 관찰한 결과이며, 도 4c는 마우스 대식세포주에 LPS와 pSTAT3를 처리한 후 pSTAT3 및 COX-2의 발현수준을 측정하여 본 발명에 따른 항체의 pSTAT3에 대한 특이적 결합을 확인한 결과이다.
도 5는 HepG2 간암세포주에서 IL-6 자극 시 STAT3-RE의 조절 하에 루시퍼레이즈 리포터(luciferase reporter) 유전자가 발현되는 조건에서 본 발명의 pSTAT3 이중 특이적 항체 처리에 의해 상기 유전자의 발현이 억제됨을 확인한 결과이다.

본 발명자들은 인산화된 STAT3 및 세포 내 DNA에 특이적으로 결합하며 세포 침투능을 갖는 이중 특이적 항체를 개발하였는바, 이에 기초하여 본 발명을 완성하였다.

이에, 본 발명은 STAT3/DNA 이중 특이적 항체 또는 그 단편을 유효성분으로 포함하는, 염증성 질환 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명자들은 실시예를 통해 상기 STAT3/DNA 이중 특이적 항체 또는 그 단편을 제조하고 이의 기능을 검증하였다.

본 발명의 일실시예에서는 파지 디스플레이 방법으로 인간 scFv(Single-chain variable fragment) 라이브러리를 이용해 pY705 STAT3 펩타이드 항원에 결합하는 총 24개의 특이적 항체 서열을 도출하였으며, 이에 대하여 친화도(KD)를 측정하여 pY705 STAT3에 대한 친화도가 높은 항체 후보 7개를 최종 선별하였다(실시예 1 참조).

본 발명의 다른 실시예에서는, 상기 7개 후보 중 3가지 서열을 이용해 재조합 항체를 제조하였고, SDA-PAGE를 실시하여 이중 한 가지 서열을 이용해 제작한 항체가 pSTAT3를 효과적으로 검출할 수 있음을 확인하였다(실시예 2 참조).

본 발명의 또 다른 실시예에서는, 대장암 세포주에서 세포면역화학염색법을 통해 상기 항체의 세포 내 침투능을 검증한 결과 DNA 결합 도메인을 포함하는 pSTAT3 항체가 효과적인 세포 내 침투능을 갖는 것을 확인하였다(실시예 3 참조).

본 발명의 또 다른 실시예에서는, 마우스 대식세포주 및 관절골수세포에 본 발명에 따른 항체를 처리하고 웨스턴 블롯으로 pSTAT3의 발현수준을 측정하여 상기 항체의 pSTAT3 억제능을 확인하였고 이러한 기능은 다른 신호전달 분자에는 영향을 미치지 않는 것을 확인하였다(실시예 4-1 참조).

본 발명의 또 다른 실시예에서는, STAT3-RE의 조절 하에 발현되는 루시퍼레이즈 리포터(luciferase reporter) 유전자를 이용해 IL-6 자극 조건에서 상기 항체가 상기 루시퍼레이즈 리포터 유전자의 발현을 억제하는 것을 확인하였다(실시예 4-2 참조).

상기 실시예 결과들은 본 발명에 따른 STAT3/DNA 이중 특이적 항체가 효과적인 세포 침투능을 가지며 pSTAT3의 기능을 효과적으로 억제함으로써 STAT3의 활성화와 관련된 염증성 질환의 치료에 유용하게 이용될 수 있음을 입증하는 것이다.

본 발명에서 치료 대상으로 하는 질병인 “염증성 질환”은 염증반응을 주병변으로 하는 질환을 의미하는 것으로, 이와 관련된 다양한 질환들을 포함할 수 있으나 본 발명에 있어서 염증성 질환은 바람직하게는 류마티스 관절염을 의미하는 것이다.

상기 류마티스 관절염은 원인이 정확하게 규명되지 않은 염증성 질환으로, 초기에 관절을 싸고 있는 활막에서 유발된 염증이 점차 주위에 있는 연골과 뼈로 퍼지게 되어 관절의 파괴와 변형들을 초래하는 질병이다. 류마티스 관절염의 발병 기전에 STAT3 및 이의 관련 신호전달이 관여되어 있음은 당해 분야에서 다양한 연구를 통해 보고되어 있다.

본 발명에서 사용되는 용어, “항체(Antibody)”는 면역학적으로 특정 항원과 반응성을 갖는 면역글로불린 분자를 포함하며, 폴리클론날(polyclonal) 항체 및 모노클론날(monoclonal) 항체를 모두 포함한다. 또한, 상기 용어는 키메라성 항체(예를 들면, 인간화 뮤린 항체), 이종결합항체(예를 들면, 양특이성 항체), 이중 특이적(bispecific) 항체와 같은 유전공학에 의해 생산된 형태를 포함한다. 본 발명에 있어서 항체는 이중 특이적 항체이며 이는 하나의 항체가 서로 다른 항원에 특이적인 2가지 결합부위를 갖는 항체를 의미하는 것으로, 본 발명의 항체는 바람직하게 STAT3 및 세포 내 DNA에 각각 결합할 수 있다.

본 발명의 ‘항체’, ‘항 STAT3 이중특이 항체’, ‘STAT3/DNA 이중 특이적 항체’ 및 ‘STAT3 이중 특이적 scFv 항체’는 본 발명에서 가장 광의의 의미로 사용되며, 구체적으로 STAT3에 특이적으로 결합하는 결합 부위 및 DNA에 특이적으로 결합하는 결합 부위를 포함한다.

전형적으로 항체는 중쇄 및 경쇄를 가지며 각각의 중쇄 및 경쇄는 불변영역 및 가변영역(상기 부위는 “도메인”으로 또한 알려져 있음)을 포함한다. 경쇄 및 중쇄의 가변 영역은 “상보성 결정 영역”(complementarity-determining region, 이하, ‘CDR’)라고 불리우는 3개의 다변 가능한 영역 및 4개의 “구조영역”(framework region)을 포함한다. 상기 CDR은 주로 항원의 에피토프(epitope)에 결합하는 역할을 한다. 각각의 사슬의 CDR은 전형적으로 N-말단으로부터 시작하여 순차적으로 CDR1, CDR2, CDR3로 불리우고, 또한 특정 CDR이 위치하고 있는 사슬에 의해서 식별된다. 그러나 모든 CDR 단기들이 항원 결합에 직접 관여할 필요는 없다.

본 발명에 있어서, 상기 STAT3에 특이적으로 결합하는 제 1 항원 결합 부위는 서열번호 1 내지 3의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 상보성 결정영역(complementarity determining region, CDR) 및 서열번호 4 내지 6의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 상보성 결정영역을 포함하는 것일 수 있다.

또한, 상기 STAT3에 특이적으로 결합하는 제 1 항원 결합 부위는 서열번호 7 내지 9의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 상보성 결정영역(complementarity determining region, CDR) 및 서열번호 10 내지 12의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 상보성 결정영역을 포함하는 것일 수 있다.

또한, 상기 STAT3에 특이적으로 결합하는 제 1 항원 결합 부위는 서열번호 13 내지 15의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 상보성 결정영역(complementarity determining region, CDR) 및 서열번호 16 내지 18의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 상보성 결정영역을 포함하는 것일 수 있다.

또한, 상기 STAT3에 특이적으로 결합하는 제 1 항원 결합 부위는 서열번호 19 내지 21의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 상보성 결정영역(complementarity determining region, CDR) 및 서열번호 22 내지 24의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 상보성 결정영역을 포함하는 것일 수 있다.

또한, 상기 STAT3에 특이적으로 결합하는 제 1 항원 결합 부위는 서열번호 25 내지 27의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 상보성 결정영역(complementarity determining region, CDR) 및 서열번호 28 내지 30의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 상보성 결정영역을 포함하는 것일 수 있다.

또한, 상기 STAT3에 특이적으로 결합하는 제 1 항원 결합 부위는 서열번호 31 내지 33의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 상보성 결정영역(complementarity determining region, CDR) 및 서열번호 34 내지 36의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 상보성 결정영역을 포함하는 것일 수 있다.

또한, 상기 STAT3에 특이적으로 결합하는 제 1 항원 결합 부위는 서열번호 37 내지 39의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 상보성 결정영역(complementarity determining region, CDR) 및 서열번호 40 내지 42의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 상보성 결정영역을 포함하는 것일 수 있다.

본 발명의 상기 단편은 디아바디, Fab, Fab′, F(ab)2, F(ab′)2, Fv 및 scFv로 이루어진 군에서 선택되는 단편일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 항체의 단편은 전체 항체의 항원 특이적 결합력을 유지하고 있는 항체의 단편을 의미하며, 바람직하게 상기 단편은 모항체의 STAT3 및 DNA 친화도의 적어도 20%, 50%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 100% 또는 그 이상을 보유한다. 구체적으로는 Fab, F(ab)2, Fab', F(ab')2, Fv, 디아바디(diabody), scFv 등의 형태일 수 있다.

본 발명의 목적상 항체의 단편은 인간 유래 STAT3 단백질 및 DNA 각각에 대한 결합특이성을 유지하고 있는 것이라면 구조나 형태의 제한을 받지 않지만, 바람직하게 scFv일 수 있다. 본 발명에 따른 scFv는 상기한 STAT3 단백질 및 DNA에 특이적인 CDR 구성, 또는 VH와 VL의 구성을 갖는 것으로서 VH의 C-말단과 VL의 N-말단이 링커를 통해 연결된 것이라면 그 서열이 특별히 제한되지 않는다. 상기 링커는 당 업계에 scFv에 적용되는 링커로서 알려진 것이라면 그 종류가 특별히 제한되지 않는다.

본 발명의 항체 또는 그 단편은 이의 생물학적 활성을 실질적으로 변경하지 않는 보존적 아미노산 치환(항체의 보존적 변이체라고 함)을 포함할 수 있다.

상기 STAT3는 STAT3 유전자에 의해 암호화되는 전사인자(Transcription factor)로서, 다양한 사이토카인 및 성장인자들의 자극 시 receptor-associated Janus kinases(JAK)에 의해 인산화되면 동종이합체(homodimer) 또는 이종이합체(heterodimer)를 형성하고 핵으로 이동하여 다양한 유전자들의 발현을 조절하는 전사인자로 작용한다. 인터페론, 표피성장인자( epidermal growth factor; EGF), 인터류킨-5(IL-5), 또는 인터류킨-6(IL-6)가 리간드로 결합하는 경우에는 STAT3의 705번째 티로신(tyrosine) 잔기에 인산화가 일어난다고 알려져 있고, Mitogen-activated protein kinases(MAPK) 또는 c-src non-receptor tyrosine kinase에 의해서는 727번째 세린(serine) 잔기에 인산화가 일어난다고 알려져 있다. 이러한 과정으로 활성화된 STAT3는 세포 자극에 반응하여 다양한 유전자의 발현을 매개하고 세포 성장 및 세포사멸과 같은 여러 세포 반응에서 중요한 역할을 수행한다고 알려져있다.

본 발명에 있어서, STAT3/DNA 이중 특이적 항체 또는 그 단편이 결합하는 STAT3는 바람직하게 705번째 티로신 잔기가 인산화된 STAT3인 것을 특징으로 한다.

한편, 상기 DNA에 특이적으로 결합하는 제 2 항원 결합 부위는 루푸스(lupus)환자에게서 발견되는 자가항체(autoantibody)인 3E10의 DNA 결합 도메인으로(J Autoimmun. 1998 Oct;11(5):539-46. 1998.10), 특이적으로 ‘Variant heavy chain’의 31번째 아스파르트산(aspartic acid)이 아스파라긴(asparagine)으로 치환(D31N)된 것을 특징으로 하나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에 따른 상기 약학적 조성물은 STAT3/DNA 이중 특이적 항체를 유효성분으로 포함하며, 약학적으로 허용 가능한 담체를 더 포함할 수 있다. 상기 약학적으로 허용 가능한 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 사이클로덱스트린, 덱스트로즈 용액, 말토덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올, 리포좀 등을 포함하지만 이에 한정되지 않으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액 등 다른 통상의 첨가제를 더 포함할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제, 윤활제 등을 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 적합한 약학적으로 허용되는 담체 및 제제화에 관해서는 레밍턴의 문헌에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 제형에 특별한 제한은 없으나 주사제, 흡입제, 피부 외용제 등으로 제제화할 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구투여(예를 들어, 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)할 수 있으나, 바람직하게는 경구 투여할 수 있으며, 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 시간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에 있어서 “약학적으로 유효한 양”은 의학적 치료 또는 진단에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료 또는 진단하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 질환 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명에 다른 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

구체적으로 본 발명의 약학적 조성물의 유효량은 환자의 연령, 성별, 상태, 체중, 체내에 활성 성분의 흡수도, 불활성률 및 배설속도, 질병종류, 병용되는 약물에 따라 달라질 수 있으며, 일반적으로는 체중 1 ㎏ 당 0.001 내지 150 ㎎, 바람직하게는 0.01 내지 100 ㎎을 매일 또는 격일 투여하거나, 1일 1 내지 3회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나 투여 경로, 비만의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감 될 수 있으므로 상기 투여량이 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 다른 양태로서, 본 발명은 상기 약학적 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 염증성 질환 치료방법을 제공한다.

본 발명에서 “개체”란 질병의 치료를 필요로 하는 대상을 의미하고, 보다 구체적으로는 인간 또는 비-인간인 영장류, 생쥐(mouse), 쥐(rat), 개, 고양이, 말 및 소 등의 포유류를 의미한다.

본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 약학적 조성물의 염증성 질환 치료용도를 제공한다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

[실시예]

실시예 1. Phagy Display를 이용한 인산화된 STAT3 펩타이드 특이적 항체 서열 발굴 및 후보 선별

본 발명자들은 705번째 티로신 잔기가 인산화된 STAT3(pY705 STAT3)에 특이적으로 결합하는 항체를 제조하기 위하여, 먼저 파지 디스플레이(Phagy Display)를 이용해 상기 인산화된 STAT3에 결합하는 항체를 스크리닝하고자 하였다.

이를 위해, 먼저 오송 첨복단지 신약개발지원센터 후보항체 발굴지원팀으로부터 제공받은 인간 scFv(Single-chain variable fragment) 라이브러리를 이용하였고, pY705 STAT3 펩타이드를 항원으로 이용하여 파지 디스플레이를 실시하였다. 구체적으로는 고체 표면(solid surface) 상에 고정된 항원에 파지 항체 라이브러리를 섞어 주어 항체-항원 결합(Binding)을 유도하고, 결합하지 않은 파지들을 제거하였다(Washing). 다음으로, 항원과 결합하고 있는 파지를 alkaline/acidic pH 용액 또는 경쟁적 펩타이드(competitor peptide) 등을 사용하여 용출시킨 후, 대장균(E. coli)에 감염시켜 용출된 파지를 증폭시키고 증폭된 파지는 다음 라운드 패닝에 이용하여 특정 항체를 농축시키는데 이용하였다. 그 결과, 최종적으로 24개의 pY705 STAT3 펩타이드 특이적 항체 서열을 도출하였다.

이후 하기 표 1에 나타낸 바와 같이 상기 24개 서열들 중 KD가 90 nM보다 낮아 pY705 STAT3에 대한 친화도가 높은 항체 후보 7개를 최종 선별하였으며, KD가 4-6 nM인 3가지 후보 항체(C4, 3A10, 및 C6)를 선택하여 재조합 이중항체의 개발을 진행하였다.

ID	KD (nM)
C4	4
3A10	5
C6	6
H9	12
A12	55
F11	55
A10	85

실시예 2. 인산화된 STAT3 특이적 재조합 항체 제작

본 발명자들은 상기 실시예 1에서 최종 선별한 3가지 항체 후보 서열들을 이용하여 인산화된 STAT3(pY705 STAT3)에 특이적인 재조합 이중항체를 제작하고자 하였다.

본 발명에서 제작한 이중항체는 도 1a에 도시한 바와 같이 한쪽 말단의 항원결합 부위는 인산화된 STAT3에 결합하는 한편, 다른 한쪽의 항원결합 부위는 세포의 핵 내 DNA에 결합하는 구조를 갖는 것이다. 보다 구체적으로는 도 1b에 도시한 바와 같이, 인산화된 STAT3에 결합하는 scFv(STAT3 scFv)과 세포 내로 침투하여 핵 내 DNA에 결합하는 scFv(3E10 scFv)가 회전 고리(swivel) 형태의 링커(linker)로 연결된 구조이다. 상기 3E10 scFv는 루푸스(lupus) 환자에게서 발견되는 자가항체(autoantibody)의 DNA 결합 도메인을 이용한 것이며, 더욱이 세포 내 침투 효율이 더욱 향상된다고 보고된 ‘Variant heavy chain’의 31번째 아스파르트산(파란색으로 표시됨)이 아스파라긴으로 치환(D31N)된 도메인을 이용하였다.

나아가, 상기와 같은 구조로 재조합하여 제작한 본 발명에 따른 인산화된 STAT3 이중 특이적 항체(이하, pSTAT3 항체)를 세포에서 발현시켜 생산한 후 인산화된 STAT3에 결합하는지 알아보기 위해 SDS-PAGE를 실시하였다. 이를 위해, CHO-K1 80M 세포에 100 ug의 재조합 pSTAT3 항체의 발현 플라스미드 DNA를 도입하고 발현시켜 해당 항체를 얻은 후 4-20%의 아크릴아마이드 겔에 각 시료를 19.5 ul씩 로딩해 SDS-PAGE를 실시하여 상기 항체가 인산화된 STAT3를 표적하여 결합하는지 관찰하였다.

그 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이 각각 독립적인 과정을 통해 세포로부터 생산된 pSTAT3 항체(①-④) 시료 모두 pSTAT3에 효과적으로 결합하는 것을 확인하였다.

실시예 3. pSTAT3 항체의 세포 침투능 검증

본 발명에 따른 pSTAT3 항체가 실제로 세포 내로 침투하는 기능을 나타내는지 검증하기 위해 세포 침투능 분석을 실시하였다. 이를 위해, DLD 대장암 세포주에 대하여 3E10 scFv을 포함하는 pSTAT3 이중항체(pSTAT3-C4), 또는 3E10 scFv을 포함하되 31번째 아스파르트산이 아스파라긴으로 치환(D31N)된 pSTAT3 항체(STAT3-D31N)를 처리한 다음, 면역세포화학염색법을 통해 상기 각 pSTAT3 항체를 이용해 세포 내 STAT3 단백질을 표지(STAT3 staining)하고 이와 함께 PI 염색을 통해 세포 핵을 염색(PI staining for nucleus)하여 비교하였다.

그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이 pSTAT3-D31N 항체를 처리한 경우 STAT3 염색 결과가 세포 핵을 염색한 PI 결과와 정확히 일치하는 것을 관찰하였으며 이를 통해 상기 항체가 세포에 침투하여 세포 내 pSTAT3와 결합하는 능력이 있음을 확인하였다. STAT3-C4 항체의 경우에도 세포에 침투해 세포 내 pSTAT3와 결합하는 능력을 나타내고 있으나 pSTAT3-D31N에 비교해서는 세포 침투 효율이 저조함을 알 수 있었다.

실시예 4. pSTAT3 항체의 pSTAT3 억제효과 검증

4-1. pSTAT3 억제효과 검증

상기 실시예 2의 결과를 통해 본 발명의 pSTAT3 항체가 pSTAT3에 효율적으로 결합한다는 것을 확인하였는바, 나아가 상기 항체의 pSTAT3을 억제효과를 검증하기 위해 웨스턴 블롯을 실시하여 단백질 발현수준을 관찰하였다.

보다 구체적으로, 마우스 대식세포주인 RAW264.7와 관절골수세포인 Synoviocyte에 각각 LPS(lipopolysaccharide) 또는 TNFα를 처리하여 pSTAT3를 활성화시킨 다음 본 발명의 pSTAT3 항체를 농도별(20, 50, 100 또는 10, 20, 50 ug/ml)로 처리하고 pSTAT3 단백질의 발현수준을 관찰하였다. 그 결과, 도 4a 및 도 4b에 나타낸 바와 같이 pSTAT3 항체(RSmu)를 처리한 경우 상기 두 가지 세포에서 모두 처리농도에 비례하게 pSTAT3의 발현수준이 감소하는 것을 확인하였다. 이를 통해 본 발명에 따른 pSTAT3 항체가 LPS 또는 TNFα에 의해 활성화된 pSTAT3 단백질을 효과적으로 억제하는 것을 알 수 있었다.

나아가 RAW264.7 세포에 LPS 단독 또는 LPS와 pSTAT3 항체 50 ug을 함께 처리한 후 pSTAT3와 함께 NF-κB 신호전달에 의해 유도되는 COX-2의 발현수준을 관찰하였다. 그 결과, 도 4c에 나타낸 바와 같이 pSTAT3 단백질의 발현은 감소한 반면 COX-2의 발현수준은 변화가 없는 것을 통해 본 발명의 pSTAT3 항체가 COX-2 단백질에는 영향을 미치지 않는 것을 확인하였다. 이러한 결과는 상기 항체가 활성화된 pSTAT3 단백질만을 선택적으로 억제하며 다른 신호전달에는 영향을 미치지 않는 것을 보여주는 것으로 본 발명의 항체 사용 시 부작용을 감소시킬 수 있음을 입증하는 것이다.

4-2. STAT3-RE 매개 유전자 발현 억제효과 검증

상기 실시예 4-1의 결과에 더하여, 본 발명의 pSTAT3 항체가 STAT3의 기능을 억제함으로써 STAT-RE(Response element) 매개 유전자 발현을 억제할 수 있는지 검증하고자 하였다. 이를 위해, HepG2 간암세포주에 STAT3-RE의 조절 하에 발현되는 루시퍼레이즈 리포터(luciferase reporter) 유전자 벡터를 48시간 동안 트랜스펙션 한 다음, 본 발명의 pSTAT3 항체를 1시간 동안 처리하고 100 nM의 IL-6를 24시간 동안 처리하였다. 이후 IL-6 자극에 의한 STAT3-RE 매개 luciferase 유전자의 발현수준을 측정하였다.

그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이 pSTAT3 항체(D31N)를 처리한 경우 대조군(Cont)에 비하여 유전자 발현이 거의 완전히 억제된 것을 확인하였다. 상기 결과로부터 본 발명의 pSTAT3 항체가 STAT3 매개 유전자의 발현을 억제하는 효과가 있음을 알 수 있었다.

상기 진술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

<110> ROPHI BIO <120> Pharmaceutical composition for treating inflammatory disease containing anti-STAT3 bispecific antibody having cell penetrating ability <130> PD17-191 <160> 42 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> pSTAT3 bispecific Ab(C4)_CDR1_Vk <400> 1 Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn His Val Ser 1 5 10 <210> 2 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> pSTAT3 bispecific Ab(C4)_CDR2_Vk <400> 2 Ser Asn Asn Gln Arg Pro Ser 1 5 <210> 3 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> pSTAT3 bispecific Ab(C4)_CDR3_Vk <400> 3 Ala Ser Trp Asp Tyr Ser Leu Asn Ala Tyr Val 1 5 10 <210> 4 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> pSTAT3 bispecific Ab(C4)_CDR1_VH <400> 4 Ser Tyr Tyr Met Ser 1 5 <210> 5 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> pSTAT3 bispecific Ab(C4)_CDR2_VH <400> 5 Leu Ile Ser Pro Gly Ser Gly Ser Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 6 <211> 12 <212> PRT 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Claims (12)

1. STAT3(Signal transducer and activator of transcription 3)/DNA 이중 특이적 항체 또는 그 단편을 유효성분으로 포함하는, 염증성 질환 치료용 약학적 조성물.
   
2. 제1항에 있어서,
   상기 염증성 질환은 류마티스 관절염(rheumatoid arthritis)인 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
   
3. 제1항에 있어서,
   상기 항체 또는 그 단편은 STAT3에 특이적으로 결합하는 제 1 항원 결합 부위 및 DNA에 특이적으로 결합하는 제 2 항원 결합 부위를 포함하는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
   
4. 제3항에 있어서,
   상기 STAT3에 특이적으로 결합하는 제 1 항원 결합 부위는 서열번호 1 내지 3의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 상보성 결정영역(complementarity determining region, CDR) 및 서열번호 4 내지 6의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 상보성 결정영역을 포함하는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
   
5. 제3항에 있어서,
   상기 STAT3에 특이적으로 결합하는 제 1 항원 결합 부위는 서열번호 7 내지 9의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 상보성 결정영역(complementarity determining region, CDR) 및 서열번호 10 내지 12의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 상보성 결정영역을 포함하는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
   
6. 제3항에 있어서,
   상기 STAT3에 특이적으로 결합하는 제 1 항원 결합 부위는 서열번호 13 내지 15의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 상보성 결정영역(complementarity determining region, CDR) 및 서열번호 16 내지 18의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 상보성 결정영역을 포함하는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
   
7. 제3항에 있어서,
   상기 STAT3에 특이적으로 결합하는 제 1 항원 결합 부위는 서열번호 19 내지 21의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 상보성 결정영역(complementarity determining region, CDR) 및 서열번호 22 내지 24의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 상보성 결정영역을 포함하는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
   
8. 제3항에 있어서,
   상기 STAT3에 특이적으로 결합하는 제 1 항원 결합 부위는 서열번호 25 내지 27의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 상보성 결정영역(complementarity determining region, CDR) 및 서열번호 28 내지 30의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 상보성 결정영역을 포함하는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
   
9. 제3항에 있어서,
   상기 STAT3에 특이적으로 결합하는 제 1 항원 결합 부위는 서열번호 31 내지 33의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 상보성 결정영역(complementarity determining region, CDR) 및 서열번호 34 내지 36의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 상보성 결정영역을 포함하는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
   
10. 제3항에 있어서,
    상기 STAT3에 특이적으로 결합하는 제 1 항원 결합 부위는 서열번호 37 내지 39의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 상보성 결정영역(complementarity determining region, CDR) 및 서열번호 40 내지 42의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 상보성 결정영역을 포함하는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
    
11. 제1항에 있어서,
    상기 STAT3는 705번째 티로신 잔기가 인산화된 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
    
12. 제1항에 있어서,
    상기 항체 또는 그 단편은 세포 내로의 침투능을 갖는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.

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