CN114107397A - 递送带负电荷的核酸的递送系统、复合物及药物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种递送带负电荷的核酸的递送系统、复合物及药物。该递送带负电荷的核酸的递送系统包括融合蛋白，该融合蛋白包括依次连接的热休克蛋白Hsp16.5、柔性Linker和的阳离子多肽。上述递送带负电荷的核酸的递送系统通过能自组装形成中空球形纳米笼结构的热休克蛋白Hsp16.5与能吸附带负电荷的核酸的阳离子多肽的结合，使得递送带负电荷的核酸的递送系统的递送效率高，从而提高带负电荷的核酸递送效果，利于带负电荷的核酸发挥其生物学功能。

Description

递送带负电荷的核酸的递送系统、复合物及药物
技术领域
本发明涉及基因技术领域，特别是涉及一种递送带负电荷的核酸的递送系统、复合物及药物。
背景技术
RNA干扰(RNAi)是生物进化上高度保守的基因转录后沉默机制之一，目前已成为特异性调控基因表达的有效手段。RNAi是指由双链RNA(dsRNA)介导的特异性降解具有序列同源性的信使RNA(mRNA)，进而导致相应基因表达沉默的现象。RNAi主要通过dsRNA被细胞内的内切核酸酶Dicer(一种具有RNaseⅢ样活性的核酸酶)加工切割成21～23个碱基的小干扰RNA(siRNA)来实现。siRNA在细胞内RNA解旋酶的作用下解链成正义链和反义链，siRNA中的反义链进一步指导形成一种被称为RNA诱导的沉默复合体(RNA induced silencingcomplex，RISC)的复合物。RISC由多种蛋白成分组成，包括内切核酸酶、外切核酸酶、解旋酶和同源RNA链搜索活性等。RISC与靶点基因表达的mRNA的同源区进行特异性结合，RISC具有核酸酶的功能，在结合部位切割mRNA，切割位点即是与siRNA中反义链互补结合的两端。被切割后的断裂mRNA随即降解，从而达到干扰基因表达作用。
siRNA介导的基因表达抑制具有高特异性的特点。siRNA只降解与siRNA完全配对的mRNA，1～2个碱基错配会大大降低对靶mRNA的降解效果。并且，采用数量远远少于内源性mRNA的siRNA就可以实现对靶基因显著的抑制效应。因此，siRNA已经成为基因功能研究、药靶发现等基础研究的重要手段。
目前，将siRNA导入体内并使其具有药效的方法有化学修饰法、快速静脉注射法、阳离子聚合物法和脂质体法。化学修饰法主要是通过将siRNA结构中的对内切酶敏感的磷酸二酯结构替换为其他结构(例如用S(PS)代替磷酸二酯结构中的O(PO))而避免其被快速降解，在一定时间内维持药效浓度。快速静脉注射法是通过静脉将siRNA快速注射到体内，使其维持一定的浓度，从而导入体内并使其发挥药效。阳离子聚合物法是通过将siRNA与阳离子聚合物(例如聚乙烯亚胺)形成复合物而转运到体内而发挥药效。脂质体法是通过将siRNA包裹到脂质体中转运到体内而发挥药效。然而，通过目前这些方法导入siRNA后，siRNA的抑制效果还较差，还需要进一步改善。
发明内容
基于此，有必要提供一种能够改善带负电荷的核酸的递送效率的递送带负电荷的核酸的递送系统，使用该系统可以进一步改善siRNA的抑制效果。
一种递送带负电荷的核酸的递送系统，包括融合蛋白，所述融合蛋白包括依次连接的热休克蛋白Hsp16.5、柔性Linker和的阳离子多肽。
上述递送带负电荷的核酸的递送系统通过融合蛋白中能自组装形成中空球形纳米笼结构的热休克蛋白Hsp16.5与能吸附带负电荷的核酸的阳离子多肽的结合，改善递送带负电荷的核酸的递送系统的递送效率，利于带负电荷的核酸发挥其生物学功能。
在其中一个实施例中，所述热休克蛋白Hsp16.5的氨基酸序列如SEQNO：1所示。
在其中一个实施例中，所述阳离子多肽选自聚精氨酸七肽、聚精氨酸九肽和聚精氨酸十一肽中的一种。
在其中一个实施例中，所述柔性Linker的氨基酸序列SEQNO：2所示。
在其中一个实施例中，所述融合蛋白还包括透皮增强肽，所述透皮增强的一端与所述热休克蛋白Hsp16.5连接，另一端与所述阳离子多肽连接，所述透皮增强肽选自SPACE片段、TD1片段和T2片段中的一种，所述SPACE片段的氨基酸序列如SEQNO：3所示，所述TD1片段的氨基酸序列如SEQNO：13所示，所述T2片段的氨基酸序列如SEQNO：14所示。
在其中一个实施例中，所述SPACE片段通过连接片段与阳离子多肽连接，所述连接片段的氨基酸序列如SEQNO：4所示。
一种复合物，包括上述的递送带负电荷的核酸的递送系统和负载于所述递送系统上的带负电荷的核酸。
在其中一个实施例中，所述带负电荷的核酸为siRNA,所述siRNA的靶标基因为FGF5，所述siRNA的正义链的核苷酸序列如SEQNO：5所示，所述siRNA的反义链的核苷酸序列如SEQNO：6所示。
一种药物，包括上述的复合物和药学上可接受的辅料。
在其中一个实施例中，所述药学上可接受的辅料包括渗透剂、防腐剂、乳化剂和溶剂中的至少一种。
附图说明
图1为实施例3中的qPCR的结果；
图2为实施例4中的qPCR的结果。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使本发明公开内容更加透彻全面。当一个元件被表述“连接”另一个元件，它可以是直接连接到另一个元件、或者其间可以存在一个或多个居中的元件。术语“第一”、“第二”等仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性。
术语“Linker”是基因融合表达技术中的元件，在基因融合表达过程中，通过选择一段适当的核苷酸序列将不同的目的基因连接起来，使其在适当的生物体内表达成为一条单一的肽链，其中起连接连作用的氨基酸组成的多肽称为Linker。
本文中使用的核酸序列的“表达”表示以下事件中的一个或多个：(1)从DNA序列产生RNA模板(例如，通过转录)；(2)加工RNA转录物(例如，通过剪接、编辑、5′帽形成和/或3’端加工)；(3)RNA翻译成多肽或蛋白；和(4)多肽或蛋白的翻译后修饰。
本文使用的术语“转染”表示将外源核酸引入细胞中的方法。转染的方法包括、但不限于化学方法、物理处理和阳离子脂质或混合物。
本文中使用的短语“抑制基因的表达”是指造成基因的表达产物的量的减少；所述表达产物可以是从基因转录的RNA(例如mRNA)或从基因转录的RNA所翻译成的多肽。通常，mRNA水平的降低会导致从其翻译的多肽的水平的降低。使用用于测量mRNA或蛋白的标准技术，可以确定表达的水平。
短语“药学上可接受的”在本文中用于表示这样的化合物、物质、复合物和/或剂型：在合理的医学判断范围内，其适用于接触人类和动物的组织，而没有过度的毒性、刺激、变应性应答或其它问题或并发症，与合理的收益/风险比相称。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。
本发明一实施方式提供了一种递送带负电荷的核酸的递送系统，该递送带负电荷的核酸的递送系统包括融合蛋白，融合蛋白包括依次连接的热休克蛋白Hsp16.5、柔性Linker和的阳离子多肽。
从詹氏甲烷球菌(Methanococcus jannaschii)分离到一种分子量约为16.5kDa的热休克蛋白称为HSP16.5。研究发现，HSP16.5是由24个相同的亚基自组装成外径12nm、内径6.5nm的空心球形聚合体，也即是形成中空球形的纳米笼结构。其笼内腔可以用来担载药物。阳离子多肽是一类主要由含正电荷氨基酸(例如赖氨酸、精氨酸)组成的小分子量多肽。由于阳离子多肽富含正电荷，可以通过静电吸附担载带负电荷的核酸(例如siRNA和pDNA(plasmid DNA))类药物，并与之形成稳定的复合体结构，该复合体被细胞内吞后随即释放。因此，可以应用于核酸类药物的输送体系。上述递送带负电荷的核酸的递送系统通过融合蛋白中能自组装形成中空球形纳米笼结构的热休克蛋白Hsp16.5与能吸附带负电荷的核酸(例如siRNA、pDNA等)的阳离子多肽的结合，改善递送带负电荷的核酸的递送系统的递送效率，利于带负电荷的核酸发挥其生物学功能。
可选地，热休克蛋白Hsp16.5的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。
可选地，阳离子多肽选自聚精氨酸七肽(R7)、聚精氨酸九肽(R9)和聚精氨酸十一肽(R11)中的一种。
可选地，柔性Linker的氨基酸序列SEQ ID NO：2所示(即GSGGSG)。通过选用GSGGSG作为在热休克蛋白Hsp16.5和阳离子多肽之间的柔性Linker，可以使得热休克蛋白Hsp16.5和阳离子多肽能够形成正确的空间结构，更好地发挥生物学功能。可以理解的是，在其他一些实施例中，热休克蛋白Hsp16.5和阳离子多肽之间的柔性Linker不限于上述，还可以是其他能用于融合蛋白表达的Linker。
在一些实施例中，融合蛋白还包括透皮增强肽。透皮增强肽是用于促进蛋白质透皮的短肽。具体地，透皮增强的一端与热休克蛋白Hsp16.5连接，另一端与阳离子多肽连接。更具体地，透皮增强肽的氨基端与柔性linker的羧基端连接，透皮增强肽的羧基端与阳离子多肽连接。进一步地，透皮增强肽选自SPACE片段、TD1片段和T2片段中的一种。SPACE片段能通过胞吞作用进入细胞，并非只是皮肤渗透，还可以细胞穿透，SPACE片段可以通过交联的方式携带siRNA进入细胞；同时SPACE片段还与热休克蛋白相连，利于蛋白正确折叠，形成更加稳定的分子。SPACE片段的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示；TD1片段的氨基酸序列如SEQ ID NO：13所示；T2片段的氨基酸序列如SEQ ID NO：14所示。
可选地，透皮增强肽通过连接片段与阳离子多肽连接，连接片段的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示(即GCG)。当然，在一些实施例中，透皮增强肽可以省略，此时，融合蛋白包括依次连接的热休克蛋白Hsp16.5、柔性Linker和阳离子多肽，柔性Linker的氨基端与热休克蛋白Hsp16.5的羧基端连接，柔性Linker的羧基端与阳性多肽的氨基端连接。进一步地，柔性Linker通过连接片段(GCG)与阳离子多肽连接。
此外，本申请一实施方式还提供了一种上述递送带负电荷的核酸的递送系统的制备方法，该制备方法利用DNA重组技术进行蛋白融合表达，从而制备用于运载带负电荷的核酸的融合蛋白。具体地，递送带负电荷的核酸的递送系统的制备方法包括以下步骤：根据上述递送带负电荷的核酸的递送系统的氨基酸序列设计目的表达片段；将目的表达片段插入空表达载体中形成表达载体；及将表达载体转入宿主细胞中表达，制备递送带负电荷的核酸的递送系统。可以理解的是，上述递送带负电荷的核酸的递送系统的制备方法不限于上述，还可以采用其他方法合成。
上述递送带负电荷的核酸的递送系统包括融合蛋白。基于此，本申请一实施方式提供了一种表达基因，该表达基因用于表达上述递送带负电荷的核酸的递送系统中的融合蛋白。
此外，本申请一实施方式还提供了一种表达载体，该表达载体包括空表达载体和上述表达基因，用于表达上述递送带负电荷的核酸的递送系统的融合蛋白。在一些实施例中，空表达载体为pET-21b质粒。可以理解的是，空表达载体并不限于上述，还可以其他表达载体。
基于上述，本申请一实施方式还提供了一种siRNA的递送方法，该递送方法包括以下步骤：将siRNA与递送带负电荷的核酸的递送系统混合，制备纳米复合物；及纳米复合物注射入体内。进一步地，在制备纳米复合物时，N/P比率为(10～60)：1。N/P比率是指阳离子多肽中胺基团与siRNA中磷酸基团的摩尔比。更进一步地，N/P比率为(10～40)：1。
基于上述，本申请一实施方式还提供了一种复合物，该复合物包括上述递送带负电荷的核酸的递送系统和带负电荷的核酸。可选地，带负电荷的核酸为siRNA。在递送时，带负电荷的核酸与递送带负电荷的核酸的递送系统形成纳米复合物。可以理解的是，上述复合物可以根据带负电荷的核酸的功能作为不同用途的产品的原料或直接作为不同的产品。
在其中一个实施例中，siRNA的靶基因为FGF5和/或FGF18。成纤维细胞生长因子5(FGF5)和成纤维细胞生长因子18(FGF18)是毛囊周期的重要调控因子，FGF5高表达于毛囊生长期后期，是促进毛囊周期由生长期进入退行期的关键调控因子，FGF18高表达于毛囊休止期，主要功能是维持毛囊处于休止期，阻止其进入生长期。因此，FGF5和FGF18可作为防脱育发的潜在靶标。上述复合物可以作为制备防脱预防的产品的成分。
在一个具体示例中，siRNA的靶基因为FGF5，siRNA的正义链的核苷酸序列如SEQID NO：5所示，siRNA的反义链的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示。可以理解的是，siRNA的靶基因不限于上述，还可以是其他需要沉默的基因。当然，针对FGF5的siRNA也不限于上述，还可以是其他核酸。
上述复合物包括上述递送带负电荷的核酸的递送系统和siRNA，上述递送带负电荷的核酸的递送系统与siRNA的配合使用可以使得siRNA不容易被降解而递送量高，递送效率高，从而使得siRNA能更好的发挥抑制靶基因表达的功能，抑制效果好。
此外，本申请一实施方式还提供了一种药物，该药物包括上述递送带负电荷的核酸的递送系统、药学上可接受的辅料和负载于上述递送带负电荷的核酸的递送系统上的带负电荷的核酸。
在一些实施例中，带负电荷的核酸为siRNA。具体地，siRNA与上述递送带负电荷的核酸的递送系统形成纳米复合物。可选地，在制备纳米复合物时，N/P比率为(10～60)：1。
在一些实施例中，药学上可接受的辅料满足美国药典(USP)、欧洲药典(EP)、英国药典和/或国际药典的标准。可选地，药学上可接受的辅料包括渗透剂、防腐剂、乳化剂及溶剂中的至少一种。可选地，渗透剂选自氮酮及棕榈酸异辛酯(2EHP)中的至少一种。乳化剂选自阿拉伯胶、烷基苯磺酸钠、聚氧乙烯醚及烷基苯磺酸钠中的至少一种。可选地，防腐剂选自苄索氯铵、苯甲酸、山梨酸、脱氢乙酸、尼泊金酯、双乙酸钠、丙酸钙及乳酸钠中的至少一种。溶剂选自丙二醇和水中的至少一种。可以理解的是，渗透剂、防腐剂、乳化剂及溶剂均不限于上述。此外，药学上可接受的辅料的种类也不限于上述，还可以是其他，例如填充剂、表面活性剂等。
具体地，上述药物的剂型没有特别限制。可选地，上述药物的剂型为干粉剂、注射针剂、干混悬剂、胶囊剂或片剂。
在一些实施例中，以质量份数计，上述药物包括380份～420份的siRNA与递送带负电荷的核酸的递送系统形成的纳米复合物、0.1份～2份的氮酮、1份～5份的棕榈酸异辛酯、0.1份～2份的苄索氯铵、0.5份～5份的丙二醇、1份～5份的乳化剂和30份～50份的水。进一步地，以质量份数计，上述药物包括380份～400份的siRNA与递送带负电荷的核酸的递送系统形成的纳米复合物、0.1份～1份的氮酮、1份～3份的棕榈酸异辛酯、0.1份～1份的苄索氯铵、0.5份～2份的丙二醇、1份～3份的乳化剂和30份～50份的水。该药物的制备包括以下步骤：将氮酮、2EHP和siRNA与递送带负电荷的核酸的递送系统形成的纳米复合物混合溶解作为油相；将水、丙二醇和苄索氯铵混合溶解作为水相；先将乳化剂加入油相，缓慢且均匀的搅拌，然后将水相缓慢分次加入油相，搅拌均匀的，制备药物。
在一个具体的示例中，以质量份数计，上述药物包括400份的siRNA与递送带负电荷的核酸的递送系统形成的纳米复合物、0.3份的氮酮、2份的棕榈酸异辛酯、0.3份的苄索氯铵、1份的丙二醇、1.5份的乳化剂305和44份的水。
尽管本文中提供的药物或复合物，例如包含要递送的siRNA的描述主要涉及适合用于施用给人类的药物复合物，技术人员会理解，这样的药物或复合物通常适合用于施用给任意其它动物，例如，非人动物，例如非人哺乳动物。对适合施用给人类的药物或复合物进行修改以便使其适合施用给各种动物是被充分理解的，并且具有普通技术的兽医药理学家仅用普通(如果有的话)实验就可以设计和/或执行这样的修改。预见到对其施用药物复合物的受试者包括但不限于人类和/或其它灵长类动物；哺乳动物，包括商业上相关的哺乳动物诸如牛、猪、马、绵羊、猫、狗、小鼠和/或大鼠；和/或禽类，包括商业上相关的禽类诸如家禽、鸡、鸭、鹅和/或火鸡。
上述药物包括上述递送带负电荷的核酸的递送系统和负载于该递送带负电荷的核酸的递送系统上的带负电荷的核酸，该药物中带负电荷的核酸的递送效率高，带负电荷的核酸作为药物有效成分时能发挥更好的效果。
具体实施例
以下结合具体实施例进行详细说明。以下实施例如未特殊说明，则不包括除不可避免的杂质外的其他组分。实施例中采用试剂和仪器如非特别说明，均为本领域常规选择。实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规条件，例如文献、书本中所述的条件或者生产厂家推荐的方法实现。以下实施例中，“mM”指mmol/L；“μM”指μmol/L。
实施例1
1.热休克蛋白Hsp16.5+SPACE-R11基因合成与克隆：
(1)通过上海生物工程有限公司人工合成含有用于表达递送带负电荷的核酸的递送系统的目的表达片段的质粒，其中：递送带负电荷的核酸的递送系统(简称Hsp16.5+SPACE-R11)由热休克蛋白Hsp16.5、柔性Linker、SPACE片段、连接片段和聚精氨酸十一肽组成，热休克蛋白Hsp16.5的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，柔性Linker的氨基酸序列SEQID NO：2所示，SPACE片段的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示，连接片段的氨基酸序列如SEQID NO：4所示。聚精氨酸十一肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示。目的表达片段的核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示。
(2)以人工合成的质粒为模板，利用设计的克隆上游引物和下游引物(上游引物：5’-CTTATAGAATTCATGTCCATCATTCCAATCG-3’(SEQ ID NO：9)；下游引物：5’-TCTGAAGCTTCTAACGCCGACGTCTGCGACG-3’(SEQ ID NO：10))，通过PCR扩增得到Hsp16.5-SPACE-R11融合蛋白基因片段。其中，反应条件：①95℃预变性2min；②95℃预变性20s；③53℃退火30s；④72℃延伸50s；⑤重复30个循环；⑥72℃延伸5min；⑦降温至4℃。
(3)将PCR扩增产物纯化后与pET-21b质粒利用限制性内切酶Eco RI，HindIII分别酶切后采用T4 DNA连接酶酶切、连接，酶连时质粒和PCR产物的摩尔比为6:1，酶连反应总体积为20μL，基因克隆片段插入质粒载体后获得构建重组融合蛋白表达载体，并将重组质粒测序并同核苷酸序列SEQ ID No.8比对验证，获得插入正确的重组融合蛋白表达载体。
2.表达与纯化
(1)将1μL上述构建并测序验证无误的重组蛋白表达载体加入到200μL大肠杆菌BL21(DE3)感受态细菌中，置于冰上30min；42℃热击90s，迅速置于冰水浴中5min，加500μL冰水浴的LB液体培养基；37℃，200r/min振摇1.5h，离心后全部涂布于含100μg/mL Amp的LB平板，风干后37℃倒置培养过夜。
(2)挑取转化平板上的单克隆菌落接种于含100μg/mL Amp的5mL LB培养液的试管中，37℃，200r/min振摇过夜；次日按1:100接种于100μg/mL Amp的50mL LB培养液的培养瓶中，37℃，200r/min振摇至菌体OD600为0.6～0.8；向培养液中加入IPTG至终浓度为0.5mM，20℃，200r/min振摇8h，诱导融合蛋白表达。
(3)通过Ni柱亲和层析纯化融合蛋白，利用低压层析纯化系统，上清液以0.5mL/min流速上样至Ni-IDA结合缓冲液(Binding-Buffer)预平衡的Ni-IDA-Sepharose CL-6B亲和层析柱，用Ni-IDA清洗缓冲液(Washing-Buffer)以0.5mL/min流速冲洗，至流出液OD280值达到基线；再用Ni-IDA洗脱液(Elution-Buffer)以1mL/min流速洗脱目的蛋白，收集洗脱液；然后将上述收集的洗脱液加入到透析袋中，使用20mM Tris-HCl、150mM NaCl和5％甘油的混合物，pH8.0进行透析过夜；然后用12％的SDS-PAGE分析。其中：Ni-IDA结合缓冲液含20mM Tris-HCl、20mM咪唑和150mM NaCl；Ni-IDA洗脱液含有20mM Tris-HCl、250mM咪唑和150mM NaCl。
经过Ni柱和SDS-PAGE分析，融合蛋白(Hsp16.5+SPACE-R11)得到高效表达，且纯度较高。
实施例2
(1)将实施例1中纯化后的上述融合蛋白(Hsp16.5+SPACE-R11)经低温冷冻浓缩后融于无菌水中，并调至终浓度2mg/mL，制得融合蛋白溶液。
(2)将与人工合成的具备刺激毛囊再生的siRNA融于HBSS(Hank's平衡盐溶液)，并调至终浓度为1μM，制得siRNA溶液。其中siRNA具体序列为：
正义链：5’-CAGUGUGUUAAGUAUUUUGGAAAUA-3’(SEQ ID NO：5)；
反义链：5’-UAUUUCCAAAAUACUUAACACACUGGC-3’(SEQ ID NO：6)。
(3)在室温(26℃)条件下，按照N/P比率为20：1，将步骤(1)制得的融合蛋白溶液和步骤(2)制得的siRNA溶液混合，并静置30min，使得融合蛋白与siRNA自组装成纳米复合物。
实施例3
细胞水平上验证实施例2制得的纳米复合物的功能
(1)将已转染FGF5表达质粒的NIH/3T3(小鼠胚胎细胞)以1×105cells/孔的密度接种到孔板，培养于2mL含有血清和双抗的细胞培养基中，当细胞密度达到70％时，更换新鲜的完全培养基。
(2)取200pmol实施例2制得的纳米复合物(以纳米复合物中的siRNA的摩尔量计)稀释于200μL无血清无双抗的培养基中，混合后，静置10min，加入到孔板中，置放在5％CO2，37℃细胞培养箱中培养。同时设置空白对照、裸siRNA组、hsp+R11组和hsp+siRNA组。
(3)收集细胞，qPCR法检测细胞中FGF5的mRNA水平。其中，FGF5的引物序列为：F：5’-AAGTCAATGGCTCCCACGAAG-3’(SEQ ID NO：11)；R：5’-CCGTAAATTTGGCACTTGCATG-3’(SEQID NO：12)。
qPCR扩增操作步骤：
1)使用PowerUp TM SYBRTM Green进行qPCR扩增反应，反应总体系为10μL，各组分的加样量分别为：SYBRTM Green Master Mix 5μL；Forward Primer(10μM)0.4μL；ReversePrimer(10μM)0.4μL；cDNA模板0.8μL；RNase-free ddH2O补齐至10μL。
2)按照设定好的扩增程序进行qPCR反应：UDG活化：50℃1min；95℃预变性2min；95℃15s 60℃1min条件下进行PCR扩增，次步骤循环40次。
3)对所得溶解曲线进行分析：每个待测样品均设置3个复孔，用2-ΔΔCt(RQ值)表示实验组和对照组的目的基因mRNA水平的倍数关系，ΔCt＝Ct(目的基因)-Ct(GAPDH)，ΔΔCt＝ΔCt(实验组)-ΔCt(空白组)，空白组的RQ值为1。
分析结果如图1所示，图1中，“ck”代表空白组(无处理)；“siRNA”代表裸siRNA组(即没有载体搭载siRNA)；“hsp+R11”代表的是空载体组(即采用实施例1制得的融合蛋白作为载体不搭载siRNA)；“hsp+siRNA”代表的是采用Hsp16.5作为载体搭载siRNA；“纳米复合物”代表融合蛋白与siRNA自组装形成的纳米复合物组。
由图1可知，空白组的小鼠胚胎细胞中FGF5基因的表达没有受到抑制；裸siRNA组和hsp+siRNA组的小鼠胚胎细胞的FGF5基因的表达受到抑制；纳米复合物组的小鼠胚胎细胞的FGF5基因的表达受到了明显抑制
实施例4
小鼠模型上验证实施例2制得的纳米复合物的功能
为进一步验证本发明构建的纳米双载体输送模式的siRNA在体内对靶基因的干扰效应，用生理盐水配制20μM的siRNA纳米颗粒复合物(以纳米复合物中的siRNA的摩尔量计)与裸siRNA溶液，于小鼠背部皮肤皮内注射50μL，空白对照组注射等量生理盐水的，24h后取注射区域皮肤组织，以qPCR法检测注射区域皮肤组织中FGF5的mRNA水平，结果如图2所示。
由图2可知，实施例2制得的纳米复合物、裸siRNA与空白对照组相比，均能够有效的抑制FGF5的表达水平，但siRNA纳米颗粒复合物干扰效率更高，远高于裸siRNA和空白对照组。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，便于具体和详细地理解本发明的技术方案，但并不能因此而理解为对发明专利保护范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。应当理解的是，在本领域技术人员在本发明提供的技术方案的基础上，通过合乎逻辑的分析、推理或有限的试验得到的技术方案，均在本发明所附权利要求的保护范围内。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求的内容为准，说明书及附图可以用于解释权利要求的内容。
序列表
<110> 深圳市大鳄生物科技股份有限公司
<120> 递送带负电荷的核酸的递送系统、复合物及药物
<160> 14
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 148
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Met Ser Ile Ile Pro Ile Gly Gly Gln Asp Gly Arg Ile Ser Asn Thr
1 5 10 15
Ser Pro Ser Asn Ile Leu Asn Arg Phe Pro Asn Phe Pro Phe Pro Leu
20 25 30
Asp Leu Trp His Asp Phe Pro Phe Pro Ser Ser Ile Ser Asp Pro Phe
35 40 45
Ser Trp Gly Gly Thr Val Asn Thr Arg Leu Asp Trp Thr Glu Thr Pro
50 55 60
Asn Ala His Val Leu Arg Ala Ser Leu Pro Gly Phe Gly Gly Glu Asp
65 70 75 80
Val Leu Val Glu Leu Gln Asp Asp Arg Met Leu Gln Ile Ser Thr Glu
85 90 95
Ser Gly Gly Phe Val Ser Arg Phe Lys Ile Pro Glu Thr Gly Lys Ile
100 105 110
Glu Glu Leu Ser Ala Phe Met Asp Phe Gly Ile Leu Thr Val Phe Val
115 120 125
Pro Lys Glu Asp Asp Asp Arg Ser Arg Arg Asp Val Arg Val Val Glu
130 135 140
Ile Thr Gly Glu
145
<210> 2
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Gly Ser Gly Gly Ser Gly
1 5
<210> 3
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Ala Cys Thr Gly Ser Thr Gln His Gln Cys Gly
1 5 10
<210> 4
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Gly Cys Gly
1
<210> 5
<211> 25
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
caguguguua aguauuuugg aaaua 25
<210> 6
<211> 27
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
uauuuccaaa auacuuaaca cacuggc 27
<210> 7
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg
1 5 10
<210> 8
<211> 540
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
atgtccatca ttccaatcgg cggccaagac ggccgtattt ccaacacttc cccttcaaac 60
atcctcaatc gcttcccaaa tttccccttc cctctcgacc tatggcacga tttccctttc 120
ccttcctcaa tctccgaccc cttctcttgg ggaggcaccg tcaacactcg cctcgactgg 180
actgagacac ccaacgctca tgtcctcaga gcctcccttc ccggcttcgg cggtgaagac 240
gttctcgtcg agcttcagga tgaccggatg cttcagatca gcaccgagag cggcggcttc 300
gttagcagat tcaagattcc ggagactggg aaaatcgagg agttaagtgc gtttatggat 360
tttgggattc ttacagtgtt tgttcctaaa gaagatgatg accggagcag acgcgatgtc 420
cgagtggtgg agatcactgg ggagggtagc ggtggcagcg gtgcatgtac cggtagcaca 480
cagcatcagt gtggtggatg cggtcgtcgc cgtcgcagac gtcgcagacg tcggcgttag 540
<210> 9
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
cttatagaat tcatgtccat cattccaatc g 31
<210> 10
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
tctgaagctt ctaacgccga cgtctgcgac g 31
<210> 11
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
aagtcaatgg ctcccacgaa g 21
<210> 12
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
ccgtaaattt ggcacttgca tg 22
<210> 13
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
Ala Cys Ser Ser Ser Pro Ser Lys His Cys Gly
1 5 10
<210> 14
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
Leu Val Gly Val Phe His
1 5

Claims (10)

1.一种递送带负电荷的核酸的递送系统，其特征在于，包括融合蛋白，所述融合蛋白包括依次连接的热休克蛋白Hsp16.5、柔性Linker和的阳离子多肽。
2.根据权利要求1所述的递送带负电荷的核酸的递送系统，其特征在于，所述热休克蛋白Hsp16.5的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。
3.根据权利要求1所述的递送带负电荷的核酸的递送系统，其特征在于，所述阳离子多肽选自聚精氨酸七肽、聚精氨酸九肽和聚精氨酸十一肽中的一种。
4.根据权利要求1所述的递送带负电荷的核酸的递送系统，其特征在于，所述柔性Linker的氨基酸序列SEQ ID NO：2所示。
5.根据权利要求1～4任一项所述的递送带负电荷的核酸的递送系统，其特征在于，所述融合蛋白还包括透皮增强肽，所述透皮增强的一端与所述热休克蛋白Hsp16.5连接，另一端与所述阳离子多肽连接，所述透皮增强肽选自SPACE片段、TD1片段和T2片段中的一种，所述SPACE片段的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示，所述TD1片段的氨基酸序列如SEQ ID NO：13所示，所述T2片段的氨基酸序列如SEQ ID NO：14所示。
6.根据权利要求5所述的递送带负电荷的核酸的递送系统，其特征在于，所述SPACE片段通过连接片段与阳离子多肽连接，所述连接片段的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。
7.一种复合物，其特征在于，包括权利要求1～7任一项所述的递送带负电荷的核酸的递送系统和负载于所述递送系统上的带负电荷的核酸。
8.根据权利要求7所述的复合物，其特征在于，所述带负电荷的核酸为siRNA,所述siRNA的靶标基因为FGF5，所述siRNA的正义链的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示，所述siRNA的反义链的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示。
9.一种药物，其特征在于，包括权利要求7或8所述的复合物和药学上可接受的辅料。
10.根据权利要求9所述的药物，其特征在于，所述药学上可接受的辅料包括渗透剂、防腐剂、乳化剂和溶剂中的至少一种。
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