WO2021157809A1 - 신규한 핵산 분자 전달용 조성물 및 그 용도 - Google Patents

신규한 핵산 분자 전달용 조성물 및 그 용도 Download PDF

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WO2021157809A1
WO2021157809A1 PCT/KR2020/013354 KR2020013354W WO2021157809A1 WO 2021157809 A1 WO2021157809 A1 WO 2021157809A1 KR 2020013354 W KR2020013354 W KR 2020013354W WO 2021157809 A1 WO2021157809 A1 WO 2021157809A1
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acid molecule
peptide
shrna
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PCT/KR2020/013354
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황병희
류영채
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인천대학교 산학협력단
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    • C07K2319/00—Fusion polypeptide

Definitions

  • the present invention relates to a composition for delivering nucleic acid molecules comprising a fusion peptide of a skin permeating and cell entering (SPACE) peptide and polyarginine as an active ingredient.
  • SPACE skin permeating and cell entering
  • Psoriasis is an autoimmune disease accompanied by chronic skin inflammation, the cause of which is not clearly known.
  • the pathophysiology of psoriasis is mostly characterized by abnormal proliferation of epidermal keratinocytes and infiltration of immune cells, which involves the immune system involving T cells [1]. Therefore, it is known that various cytokines involved in T cell activity play a key role in the development process as regulatory factors. Among them, IL-12 (interleukin-12) and IL-23 (interleukin-23) stimulate TH1 and TH17 cells differentiated from T cells, respectively, and induce proliferation and inflammatory response of keratinocytes through a cascade reaction [2] ].
  • shRNA short-hairpin RNA
  • shRNA is a mediator of RNA interference (RNAi), which is processed into siRNA (short-interfering RNA) of 21-23 bp by Dicer enzyme in the cell, which complementarily binds to the target mRNA and degrades it [6]. Therefore, shRNA has the advantage of being able to act with high specificity for almost all genes.
  • the present inventors have made intensive research efforts to develop an excellent gene delivery system capable of delivering a nucleic acid molecule into a target cell with high efficiency.
  • a complex with a nucleic acid molecule to be delivered is formed using a combination of a SPACE peptide and a polyarginine peptide, the permeability to the cell membrane is greatly improved, and the efficiency of delivery of the nucleic acid molecule to the target cell is significantly increased.
  • the present invention has been completed.
  • Another object of the present invention is to provide a composition for preventing or treating inflammatory or autoimmune diseases.
  • the present invention provides a composition for delivering a nucleic acid molecule into a cell comprising a Skin Permeating And Cell Entering (SPACE) peptide and a polyarginine peptide.
  • SPACE Skin Permeating And Cell Entering
  • the present inventors have made intensive research efforts to develop an excellent gene delivery system capable of delivering a nucleic acid molecule into a target cell with high efficiency. As a result, it was found that when a complex with a nucleic acid molecule to be delivered is formed using a combination of a SPACE peptide and a polyarginine peptide, the permeability to the cell membrane is greatly improved, and the efficiency of delivering the nucleic acid molecule to the target cell is remarkably increased.
  • SPACE peptide is a synthetic polypeptide consisting of about 10 amino acids used to improve permeability to the stratum corneum or cell membrane of the skin, and is mainly used for local delivery of macromolecules.
  • polyarginine is a cationic synthetic peptide in which a plurality of arginine (Arg) residues are continuously linked, and improves the permeability of a cell membrane composed of a lipid bilayer by neutralizing the charge of a nucleic acid molecule having an anion.
  • the polyarginine peptide used in the present invention consists of 7 to 15 arginine residues, more specifically 9 to 13 arginine residues, and even more specifically 10 to 12 It consists of five arginine residues, most specifically 11 arginine residues.
  • the SPACE peptide includes the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 (ACTGSTQHQCG).
  • the SPACE peptide and polyarginine peptide of the present invention may be added simultaneously or sequentially in any order to a sample containing the target nucleic acid molecule as separate molecules, or may be used in a fused form. there is.
  • the SPACE peptide and the polyarginine peptide may directly covalently or non-covalently bond, or the two peptides may be linked by a linker.
  • the linker is a polypeptide comprising SEQ ID NO: 3 (GCG).
  • the ratio (N/P ratio) of the amine group (N) of the peptide of the present invention and the phosphate group (P) of the nucleic acid molecule to be delivered is 5:1 to 20:1.
  • nucleic acid molecule has a meaning encompassing DNA (gDNA and cDNA) and RNA molecules, and nucleotides, which are the basic structural units in nucleic acid molecules, include natural nucleotides as well as analogs ( analogues) (Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York (1980); Uhlman and Peyman, Chemical Reviews , 90:543-584 (1990)).
  • the composition for delivering a nucleic acid molecule of the present invention may be a research tool for delivering a gene to transform a cell for research purposes, or a therapeutic composition for delivering a therapeutic gene to a patient to treat a disease (therapeutic composition) ) can be
  • the nucleic acid molecule is negatively charged.
  • the nucleic acid molecule is a nucleic acid molecule for inhibiting the expression of a target gene.
  • the term “inhibition of expression” means to cause a decrease in the activity or expression of a target gene, whereby the activity or expression of the target gene becomes undetectable or exists at an insignificant level, as well as the target gene. It means to reduce the activity or expression to the extent that the biological function of the drug can be significantly reduced.
  • the nucleic acid molecule for inhibiting expression of the present invention is specifically a nucleic acid molecule complementary to the sequence of a target gene, and includes, for example, shRNA, siRNA, miRNA, gRNA (guideRNA) and antisense oligonucleotide, but is not limited thereto.
  • Nucleic acid molecules which are known means of suppressing all genes, can be used.
  • the nucleic acid molecule for suppression of expression used in the present invention is shRNA.
  • RNA small hairpin RNA
  • shRNA small hairpin RNA
  • a long RNA of 19-29 nucleotides is base-paired on both sides of a loop of 5-10 nucleotides to form a double-stranded stem, and in order to always be expressed, it is introduced into a cell through a vector containing a U6 promoter. It is transduced and is usually passed on to daughter cells so that suppression of the expression of the target gene is inherited.
  • RNA refers to a short double-stranded RNA capable of inducing an RNAi (RNA interference) phenomenon through cleavage of a specific mRNA. It is composed of a sense RNA strand having a sequence homologous to the mRNA of a target gene and an antisense RNA strand having a sequence complementary thereto. The total length is 10 to 100 bases, preferably 15 to 80 bases, most preferably 20 to 70 bases, and if the expression of the target gene can be inhibited by the RNAi effect, blunt ends or cohesive ends Both ends are possible.
  • the structure of the adhesive end can be both a structure in which the three-terminal protrudes and a structure in which the five-terminal side protrudes.
  • microRNA refers to a single-stranded RNA molecule that is not expressed in cells, has a short stem-loop structure, and inhibits the expression of a target gene through complementary binding to the mRNA of the target gene. do.
  • antisense oligonucleotide refers to a nucleotide sequence complementary to a sequence of a specific mRNA, which binds to a complementary sequence in a target mRNA and translates its protein into a protein, translocation into the cytoplasm, maturation, or any other It refers to a nucleic acid molecule that inhibits an essential activity for an overall biological function.
  • Antisense oligonucleotides may be modified at one or more bases, sugars or backbone positions to enhance efficacy (De Mesmaeker et al., Curr Opin Struct Biol. , 5(3):343-55, 1995). .
  • the oligonucleotide backbone can be modified with phosphorothioates, phosphotriesters, methyl phosphonates, short chain alkyls, cycloalkyls, short chain heteroatomics, heterocyclic sugarscholphonates, and the like.
  • gRNA guideRNA
  • CRISPR Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats
  • the term “express” means that a gene is introduced into a cell of a subject by artificially introducing it using a gene delivery system to allow a subject to express an exogenous gene or to increase the natural expression level of an endogenous gene. It means becoming capable of replication as an extrachromosomal factor or by the completion of chromosomal integration. Accordingly, the term “expression” is synonymous with “transformation”, “transfection” or “transduction”.
  • gene delivery system refers to any means of delivering a gene into a cell, and gene delivery has the same meaning as intracellular transduction of a gene. At the tissue level, the term gene transfer has the same meaning as the spread of a gene. Accordingly, the gene delivery system of the present invention can be described as a gene penetration system and a gene diffusion system.
  • the target gene for which expression is to be suppressed by the composition of the present invention is IL-23p19.
  • p19 is a subunit of IL-23, a pro-inflammatory cytokine that stimulates TH17 cells, and can treat various inflammatory and autoimmune diseases through its inhibition.
  • the present invention provides a composition for preventing or treating inflammatory or autoimmune diseases comprising the above-described composition for delivery of a nucleic acid molecule and a nucleic acid molecule that inhibits the expression of IL-23p19 as an active ingredient.
  • nucleic acid molecule to be delivered in the composition of the present invention Since the nucleic acid molecule to be delivered in the composition of the present invention has already been described above, the description thereof will be omitted to avoid excessive duplication.
  • prevention refers to inhibiting the occurrence of a disease or disease in a subject who has never been diagnosed as having a disease or disease, but is likely to be afflicted with the disease or disease.
  • the term “treatment” refers to (a) inhibiting the development of a disease, disorder or condition; (b) alleviation of the disease, condition or condition; or (c) eliminating the disease, condition or symptom.
  • the composition of the present invention When the composition of the present invention is administered to a subject, the cascade reaction that starts while stimulating TH17 cells is blocked through suppression of the expression of IL-23p19, thereby inhibiting, eliminating, or alleviating the development of symptoms due to excessive immune response and inflammation do
  • the composition of the present invention may be a therapeutic composition for inflammatory or autoimmune diseases by itself, or may be administered together with other pharmacological components to be applied as a therapeutic adjuvant for the disease.
  • the term “treatment” or “therapeutic agent” includes the meaning of “therapeutic adjuvant” or “therapeutic adjuvant”.
  • administering refers to directly administering a therapeutically effective amount of the composition of the present invention to a subject so that the same amount is formed in the subject's body.
  • the term “therapeutically effective amount” refers to the content of the composition contained in an amount sufficient to provide a therapeutic or prophylactic effect to an individual to whom the composition of the present invention is to be administered, and includes a “prophylactically effective amount”. it means
  • the term “subject” includes, without limitation, humans, mice, rats, guinea pigs, dogs, cats, horses, cattle, pigs, monkeys, chimpanzees, baboons or rhesus monkeys. Specifically, the subject of the present invention is a human.
  • the inflammatory or autoimmune disease to be prevented or treated with the composition of the present invention is skin psoriasis, rheumatoid arthritis, reactive arthritis, type 1 diabetes, type 2 diabetes mellitus, systemic lupus erythematosus, multiple sclerosis, Idiopathic fibroalveolitis, polymyositis, dermatomyositis, localized scleroderma, systemic scleroderma, colitis, inflammatory bowel disease, Sjorgen's syndrome, Raynaud's phenomenon, Bechet's disease, Kawasaki disease (Kawasaki's disease), primary biliary sclerosis, primary sclerosing cholangitis, ulcerative colitis (ulcerative olitis) or Crohn's disease, more specifically skin psoriasis.
  • the present invention provides a method for preventing or treating an inflammatory or autoimmune disease comprising administering to a subject the composition for delivery of a nucleic acid molecule and a nucleic acid molecule that inhibits the expression of IL-23p19 to provide. Since the composition for delivery of nucleic acid molecules of the present invention, nucleic acid molecules to be delivered through the composition, and inflammatory or autoimmune diseases that can be prevented or treated using the same have already been described above, description thereof will be omitted to avoid excessive duplication.
  • the present invention provides a composition for delivering a nucleic acid molecule of the present invention and a method for delivering the target nucleic acid molecule to the cell, comprising the step of contacting the target nucleic acid molecule with the cell.
  • composition for delivery of a nucleic acid molecule of the present invention and a nucleic acid molecule to be delivered using the same have already been described above, description thereof will be omitted to avoid excessive duplication.
  • the present invention provides a composition for delivery of nucleic acid molecules to cells and a composition for preventing or treating inflammatory or autoimmune diseases using the same.
  • the present invention uses a combination of a SPACE peptide and a polyarginine peptide to form a complex with a nucleic acid molecule to be delivered, thereby remarkably improving the permeability to the cell membrane, and can be usefully used as an efficient gene delivery system.
  • composition of the present invention not only enhances the intracellular permeation efficiency of shRNA, but also prevents shRNA from being degraded in the cell for a long period of time, thereby achieving suppression of expression of a target gene using shRNA with excellent efficiency.
  • FIG. 1 is a diagram showing the results of gel delay analysis (gel delay analysis) for shRNA/FP complexes.
  • Nitrogen/phosphate (N/P) ratios between the fusion peptide (FP) and shRNA are 1:1, 5:1, 10:1, 20:1, 30:1, 40:1, 50:1 and 100:1. mixed as much as possible.
  • agarose gel electrophoresis was performed at room temperature.
  • FIG. 2 is a diagram showing the results of measurement of size ( FIG. 2a ), polydispersity index ( FIG. 2b ) and zeta potential ( FIG. 2c ), respectively.
  • FP and control shRNA were incubated at room temperature for 30 minutes at a ratio of 1:1, 5:1, 10:1 and 20:1. All measured values were expressed as mean ⁇ standard deviation after three measurements using a Zetasizer.
  • FIG. 3 is a diagram showing the stability test results. Incubation was performed for 0, 4, 8, 12, 24 and 48 hours at 37°C in the presence of 50% FBS and confirmed by agarose gel electrophoresis.
  • FIG. 5 shows the results of analysis through flow cytometry analysis of the uptake of the Cy3-labeled siRNA/FP complex in cells.
  • the fluorescence intensity in the control group treated with only siRNA and the group treated with the siRNA/FP complex is shown in red and green, respectively, indicating the number of cells.
  • FIG. 6 is a diagram showing the result of IL-23p19 mRNA knockdown in RAW264.7.
  • Cells activated with poly(I:C) were treated with shRNA/FP complexes. After RNA extraction and cDNA synthesis, quantitative PCR was performed. All values were measured three times and expressed as mean ⁇ standard deviation.
  • FP was treated to a concentration of 0.2 mg/mL.
  • LDH levels released from HDFn cells were measured via absorbance. All values were measured three times and expressed as mean ⁇ standard deviation.
  • Control shRNA (Genolution, Seoul, Korea), Cy3-labeled control siRNA (GenePharma, Shanghai, China), and IL-23p19 shRNA (Genolution, Seoul, Korea) were synthesized and nuclease-free water (Integrated DNA Technologies Inc., IA) , USA) was dissolved to 1 ⁇ M.
  • the fusion peptide (GL Biochem Ltd., Shanghai, China) was synthesized to have a purity of 95% or more and dissolved in tertiary distilled water to 1 mg/mL. In the present invention, it was designed by adding a linker sequence (GCG) between the peptide sequences having two functionalities.
  • GCG linker sequence
  • the structure of the fusion peptide is largely composed of a linker sequence between the SPACE peptide and the polyarginine peptide.
  • the SPACE peptide has a tissue transfer function
  • the polyarginine has a positive charge and electrostatic interaction with a negatively charged nucleic acid to have a self-assembly function.
  • the linker sequence acts as an intermediate bridge through which the two peptides can act without affecting each other.
  • the amino acid composition of the fusion peptide is analyzed, it is composed of non-polar amino acids (A, G), uncharged polar amino acids (C, T, S, Q), and positively charged amino acids (H, R), and the basic portion is 48% of the total.
  • the N/P ratio of the control shRNA and the peptide was calculated to 1, 5, 10, 20, 30, 40, 50, and 100, and incubated for 30 minutes at room temperature, respectively.
  • a 2% agarose gel (w/v) was prepared in 1X TAE buffer containing 10,000X TopRed Nucleic Acid Gel Stain (GenomicBase, Seoul, Korea), and 6X loading dye (Biofact) was added to each sample and loaded onto the gel. did.
  • electrophoresis was performed for 30 minutes using the Mupid-2plus electrophoresis system (Optima Inc., Tokyo, Japan), the results were confirmed with the gel recording system LSG 1000 (iNtRON biotechnology, Seongnam, Korea).
  • the N/P ratio of the control shRNA and the peptide was 1, 5, 10, and 20, and incubated for 30 minutes at room temperature, respectively. After dilution by adding nuclease-free water so that the final shRNA concentration was 200 nM, it was filtered using a 10 mL syringe and a 0.45 ⁇ m syringe filter and vortexed for 30 seconds. The size and zeta potential were measured using a Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments Ltd., Worcestershire, UK).
  • Control shRNA and peptide were incubated for 30 minutes at room temperature with an N/P ratio of 20.
  • Fetal bovine serum FBS; PAN Biotech, Bavaria, Germany
  • FBS Fetal bovine serum
  • 1 mg/mL of hairpin sodium salt Sigma-aldrich, MO, USA
  • electrophoresis was performed under the same conditions as in the previous example to confirm the results.
  • Human skin fibroblast RAW264.7 (HDF, neonatal) cells were cultured in DMEM (dulbecco's modified eagle's medium, Corning, MA, USA) containing 10% FBS and 1% penicillin-streptomycin (Life Technologies, CA, USA). Incubated at 37°C and 5% CO2 standard conditions. Subcultures were performed at intervals of 2-3 days depending on the confluency of the cells.
  • RNA extraction and cDNA synthesis were performed according to the product protocol.
  • a reaction mixture was prepared using SYBR qPCR mix (TOYOBO Co., Ltd., Osaka, Japan) and forward and reverse primers, and PCR was performed according to a three-step cycle.
  • HDFn cells were cultured in the same medium and conditions. Fully grown cells were seeded in 96-well plates at 8.0 ⁇ 103 cells/well and cultured for one day. After diluting the peptides to a concentration of 1, 0.5, 0.25, 0.125, 0.0625 mg/mL and treating the cells for 5 hours, a CytoTox 96® non-radioactive cytotoxicity assay was performed according to the protocol.
  • the complex formed by interaction of the shRNA and the fusion peptide was identified and characterized.
  • an RNA band was identified. Based on this position, it was confirmed that when the peptide was added at an N/P ratio of 1:1, a band appeared at almost the same position and the brightness was slightly decreased.
  • the peptide increased to an N/P ratio of 5:1, the RNA band was delayed and a band was observed in the loading well (Fig. 1). Therefore, it was confirmed that the peptide can effectively interact with shRNA from an N/P ratio of 5:1 or higher to form a complex.
  • the size and zeta potential of the shRNA and fusion peptide complex were measured by dynamic light scattering (DLS) analysis.
  • the composite exhibited an average size of 267 nm at an N/P ratio of 1:1, 125.6 nm at 5:1, 135.4 nm at 10:1, and 120.5 nm at 20:1 (Fig. 2a).
  • the average PdI value in all ratios had a very uniform size below 0.25 (Fig. 2b).
  • shRNA of the shRNA/peptide complex It was observed whether the degradation pattern of shRNA of the shRNA/peptide complex was changed when serum was added in excess. First, in the case of shRNA without peptide, a distinct band was observed at 0 hours without the addition of serum, but no band was observed from 4 hours after the addition of serum. On the other hand, the shRNA of the shRNA/peptide complex showed a band with almost the same brightness from 4 hours to 0 hours after serum addition, and it was observed that a gradually faded band remained when incubated for up to 48 hours (FIG. 3). Therefore, it was confirmed that the fusion peptide of the present invention has a function of maintaining stability by preventing shRNA from being degraded in cells for a long time as a carrier of shRNA.
  • Cy3-labeled siRNA was used to evaluate the cell delivery efficiency of shRNA through the peptide.
  • the nucleus and actin were stained by Hochst 33342 and phalloidin staining and observed under a microscope.
  • Cy3 was not observed, and in the case of the LipofectamineTM 2000 complex, partially weak fluorescence was observed.
  • Cy3 fluorescence showing a strong signal was observed as a whole, and it was confirmed that it was located in the cytoplasm (FIG. 4).
  • IL-23p19 shRNA was delivered and the change in mRNA expression level was confirmed by qRT-PCR.
  • the relative mRNA expression level was fixed at 1 and analyzed by ⁇ Ct calculation.
  • the mRNA expression level by the SPACE complex was not different from that of the control group, and the R11 complex suppressed mRNA expression by about 80%.
  • the LipofectamineTM 2000 complex inhibited mRNA expression by an average of about 28.1% and the peptide complex by about 33.8% (FIG. 6).
  • the fusion peptide As a result of statistical processing, there was no significance between the two conditions, so it was evaluated that the fusion peptide exhibited an efficiency within the range of LipofectamineTM 2000. In addition, a synergistic effect was confirmed by the peptide combination compared to the case where each of the SPACE peptide and the R11 peptide was used alone. Therefore, the fusion peptide was evaluated as a very efficient delivery vehicle capable of increasing the expression inhibition of the target mRNA by delivering shRNA.
  • the toxic effect of the peptide on the cells was confirmed in the primary cells.
  • the final concentrations indicated by the peptide treatment in the cells were 0.2, 0.1, 0.05, 0.025, and 0.0125 mg/mL.
  • LDH lactate dehydrogenase

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Abstract

본 발명은 세포로의 핵산 분자 전달용 조성물 및 이를 이용한 염증 또는 자가면역 질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 SPACE 펩타이드 및 폴리아르기닌 펩타이드의 조합을 이용하여 전달하고자 하는 핵산 분자와 복합체를 형성함으로써 세포막에 대한 투과성이 현저하게 개선되어, 효율적인 유전자 전달 시스템으로 유용하게 이용될 수 있다. 본 발명의 조성물은 특히 shRNA의 세포 내 투과 효율을 증진시킬 뿐 아니라 shRNA가 세포 내에서 장기간 분해되는 것을 동안 막아, shRNA를 이용한 목적 유전자의 발현 억제를 우수한 효율로 달성한다.

Description

신규한 핵산 분자 전달용 조성물 및 그 용도
본 발명은 피부 침투 및 세포 진입(Skin Permeating And Cell Entering, SPACE）펩타이드 및 폴리아르기닌(polyarginine)의 융합 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 핵산 분자 전달용 조성물에 관한 것이다.
건선은 만성적인 피부 염증을 동반하는 자가면역질환으로, 발병 원인이 명확하게 밝혀지지 않았다. 건선의 병리생리학은 대부분 표피의 케라틴 생성 세포(keratinocyte)의 비정상적인 증식과 면역 세포의 침윤 등을 특징으로 하는데, 이 때 T 세포가 관여하는 면역계가 관련된다[1]. 따라서 T 세포 활성에 관여하는 다양한 사이토카인들이 조절 인자로써 발생 과정에 핵심 역할을 한다고 알려졌다. 그 중 IL-12(interleukin-12)와 IL-23(interleukin-23)은 각각 T 세포에서 분화한 TH1, TH17 세포를 자극하여 캐스케이드 반응을 통해 케라틴 생성 세포의 증식과 염증 반응을 유발한다[2]. IL-12와 IL-23은 p40 서브유닛을 공유하고 있어 두 가지 사이토카인을 동시에 타겟팅하는 치료제들이 개발되었다[3]. 최근에 개발된 치료제는 IL-23만을 선택적으로 억제하여 IL-12에 의존적인 캐스케이드 반응을 기능적으로 유지하기 때문에 우수한 효과를 얻을 수 있다고 보고되었다[4,5].
본 발명자들은 IL-23p19를 타겟팅하기 위하여 유전자 발현억제 시스템의 일종으로 shRNA(short-hairpin RNA) 전달 기술을 도입하였다. shRNA는 RNA 간섭(RNAi)의 매개자로, 세포 내에서 Dicer 효소에 의해 21-23 bp의 siRNA (short-interfering RNA)로 프로세싱되어 타겟 mRNA에 상보적으로 결합하여 이를 분해한다[6]. 따라서 shRNA는 거의 모든 유전자에 대해 높은 특이성으로 작용할 수 있는 이점을 가진다.
한편, shRNA는 강한 음전하로 인하여 분자 자체로는 세포막을 투과하기가 어려워 전달 효율을 향상시킬 수 있는 전달체의 개발이 요구된다. 세포 투과성 펩타이드는 약 5-30개의 아미노산으로 구성되어 대부분 양전하성 또는 양친매성 성질을 가진다[7]. 특히 양전하성 펩타이드는 핵산 분자와 정전기적 인력을 바탕으로 한 상호작용이 용이하다. 또한 직접 투과 또는 엔도사이토시스(endocytosis) 등의 기작을 통해 세포막을 효과적으로 가로지르는 능력이 있으며 세포막의 손상을 최소화하기 때문에 활용 가능성이 높다[8,9]. 그러나 기존의 단일 펩타이드는 shRNA와의 상호작용이 불안정하며 전달 효율이 낮다는 제한점이 있었다. 따라서 본 발명자들은 복수개의 펩타이드가 융합된 융합 펩타이드를 설계함으로써 shRNA와의 복합체에서의 안정성을 높이고 전달 효율을 증가시키고자 하였다.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
본 발명자들은 높은 효율로 핵산 분자를 목적 세포 내로 전달할 수 있는 우수한 유전자 전달 시스템(gene delivery system)을 개발하기 위하여 예의 연구 노력하였다. 그 결과, SPACE 펩타이드와 폴리아르기닌 펩타이드의 조합을 이용하여 전달하고자 하는 핵산 분자와 복합체를 형성할 경우 세포막에 대한 투과성이 크게 개선되어 목적 세포로의 핵산 분자 전달 효율이 현저하게 상승함을 발견함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서 본 발명의 목적은 세포로의 핵산 분자 전달용 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 염증 또는 자가면역 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 피부 침투 및 세포 진입(Skin Permeating And Cell Entering, SPACE）펩타이드 및 폴리아르기닌(polyarginine) 펩타이드를 포함하는 세포로의 핵산 분자 전달용 조성물을 제공한다.
본 발명자들은 높은 효율로 핵산 분자를 목적 세포 내로 전달할 수 있는 우수한 유전자 전달 시스템(gene delivery system)을 개발하기 위하여 예의 연구 노력하였다. 그 결과, SPACE 펩타이드와 폴리아르기닌 펩타이드의 조합을 이용하여 전달하고자 하는 핵산 분자와 복합체를 형성할 경우 세포막에 대한 투과성이 크게 개선되어 목적 세포로의 핵산 분자 전달 효율이 현저하게 상승함을 발견하였다.
본 발명에 따르면, 하기 실시예에서 보는 바와 같이 SPACE 펩타이드와 폴리아르기닌 펩타이드를 각각 단독으로 사용한 경우에 비해 이들을 함께 사용한 경우 핵산 분자의 전달의 효율에 있어 유의한 상승적 효과(synergistic effect)를 나타낸다.
SPACE 펩타이드는 피부 각질층 또는 세포막에 대한 투과성을 개선하기 위해 사용되는 10개 내외의 아미노산으로 이루어진 합성 폴리펩타이드로서, 거대분자의 국소적 전달에 주로 사용된다. 한편, 폴리아르기닌은 다수의 아르기닌(Arg) 잔기가 연속적으로 연결된 양이온성 합성 펩타이드로서, 음이온을 띄는 핵산 분자의 전하를 중화시켜 지질 이중막으로 구성된 세포막의 투과성을 향상시킨다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 본 발명에서 사용되는 폴리아르기닌 펩타이드는 7 내지 15개의 아르기닌 잔기로 구성되며, 보다 구체적으로는 9 내지 13개의 아르기닌 잔기로 구성되고, 보다 더 구체적으로는 10 내지 12개의 아르기닌 잔기로 구성되며, 가장 구체적으로는 11개의 아르기닌 잔기로 구성된다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 SPACE 펩타이드는 서열목록 제1서열의 아미노산 서열(ACTGSTQHQCG)을 포함한다.
본 발명의 SPACE 펩타이드 및 폴리아르기닌 펩타이드는 분리된 각각의 분자로서 목적 핵산분자를 포함하는 시료에 동시에 또는 임의의 순서로 순차적으로 첨가될 수도 있고, 또는 하나의 융합된(fused) 형태로 이용될 수도 있다. 융합된 형태로 이용되는 경우, 상기 SPACE 펩타이드 및 상기 폴리아르기닌 펩타이드가 직접 공유 또는 비공유 결합을 할 수도 있고, 또는 두 펩타이드가 링커로 연결될 수도 있다. 두 펩타이드가 링커로 연결될 경우, 상기 링커는 서열목록 제3서열(GCG)을 포함하는 폴리펩타이드이다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 본 발명의 펩타이드의 아민 그룹(N)과 전달하고자 하는 핵산 분자의 인산 그룹(P)의 비율(N/P ratio)는 5:1 내지 20:1이다.
본 명세서에서, 용어“핵산 분자”는 DNA(gDNA 및 cDNA)와 RNA 분자를 포괄하는 의미를 가지며, 핵산 분자에서 기본 구성 단위인 뉴클레오타이드는 자연의 뉴클레오타이드뿐만 아니라, 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체(analogue)도 포함한다(Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York(1980); Uhlman 및 Peyman, Chemical Reviews, 90:543-584(1990)). 본 발명의 핵산 분자 전달용 조성물은 연구 목적으로 세포를 형질전환하기 위해 유전자를 전달하는 리서치 툴(research tool)일 수도 있고, 질환을 치료하기 위해 치료 유전자를 환자에 전달하는 치료용 조성물(therapeutic composition)일 수 있다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 핵산 분자는 음전하를 띈다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 핵산 분자는 목적 유전자의 발현 억제용 핵산 분자이다. 본 명세서에서 용어“발현의 억제”는 목적 유전자의 활성 또는 발현의 저하를 야기시키는 것을 의미하며, 이에 의해 목적 유전자의 활성 또는 발현이 탐지 불가능해지거나 무의미한 수준으로 존재하게 되는 경우 뿐 아니라, 타겟 유전자의 생물학적 기능이 유의하게 저하될 수 있을 정도로 활성 또는 발현을 저하시키는 것을 의미한다. 본 발명의 발현 억제용 핵산 분자는 구체적으로는 목적 유전자의 서열에 상보적인 핵산분자로서, 예를 들어 shRNA, siRNA, miRNA, gRNA(guideRNA) 및 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 포함하나, 이에 제한되지 않고 당업계에 공지된 모든 유전자의 억제수단인 핵산분자가 이용될 수 있다. 구체적으로는, 본 발명에서 사용되는 발현 억제용 핵산 분자는 shRNA이다.
본 명세서에서 용어“shRNA(small hairpin RNA)”는 인 비보 상에서 스템-루프(stem-loop) 구조를 이루는 단일 가닥으로 50-70개로 구성된 뉴클레오타이드로서, RNA 간섭을 통해 타겟 유전자의 발현을 억제하기 위한 타이트한 헤어핀 구조를 만드는 RNA 서열을 의미한다. 통상적으로 5-10개의 뉴클레오타이드의 루프 부위 양쪽으로 상보적으로 19-29개의 뉴클레오타이드의 긴 RNA가 염기쌍을 이루어 이중가닥의 스템을 형성하며, 언제나 발현되도록 하기 위하여 U6 프로모터를 포함하는 벡터를 통해 세포 내로 형질도입되며 대개 딸세포로 전달되어 타겟 유전자의 발현억제가 유전되도록 한다.
본 명세서에서 용어“siRNA”는 특정 mRNA의 절단(cleavage)을 통하여 RNAi(RNA interference) 현상을 유도할 수 있는 짧은 이중사슬 RNA를 의미한다. 타겟 유전자의 mRNA와 상동인 서열을 가지는 센스 RNA 가닥과 이와 상보적인 서열을 가지는 안티센스 RNA 가닥으로 구성된다. 전체 길이는 10 내지 100 염기, 바람직하게는 15 내지 80 염기, 가장 바람직하게는 20 내지 70 염기이고, 타겟 유전자의 발현을 RNAi 효과에 의하여 억제할 수 있는 것이면 평활(blunt)말단 혹은 점착(cohesive) 말단 모두 가능하다. 점착 말단 구조는 3 말단 돌출한 구조와 5 말단 쪽이 돌출한 구조 모두 가능하다.
본 명세서에서 용어“miRNA(microRNA)”는 세포내에서 발현되지 않는 올리고뉴클레오타이드로서 짧은 스템-루프 구조를 가지면서 타겟 유전자의 mRNA와 상보적인 결합을 통하여 타겟 유전자 발현을 억제하는 단일 가닥 RNA분자를 의미한다.
본 명세서에서 용어 “안티센스 올리고뉴클레오타이드”는 특정 mRNA의 서열에 상보적인 뉴클레오타이드 서열로서 타겟 mRNA 내의 상보적 서열에 결합하여 이의 단백질로의 번역, 세포질내로의 전위(translocation), 성숙(maturation) 또는 다른 모든 전체적인 생물학적 기능에 대한 필수적인 활성을 저해하는 핵산 분자를 의미한다. 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 효능을 증진시키기 위하여 하나 이상의 염기, 당 또는 골격(backbone)의 위치에서 변형될 수 있다(De Mesmaeker et al., Curr Opin Struct Biol., 5(3):343-55, 1995). 올리고뉴클레오타이드 골격은 포스포로티오에이트, 포스포트리에스테르, 메틸 포스포네이트, 단쇄 알킬, 시클로알킬, 단쇄 헤테로아토믹, 헤테로시클릭 당숄포네이 등으로 변형될 수 있다.
본 명세서에서 용어“gRNA(guideRNA)”는 타겟 유전자를 인식하여 핵산분해효소(nuclease)를 유도함으로써 인식된 분위를 특이적으로 절단하는 유전자 편집 시스템에 사용되는 RNA 분자를 의미한다. 이러한 유전자 편집 시스템에는 대표적으로 CRISPR(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) 시스템이 있다.
본 명세서에서 용어“발현시키다”는 대상체가 외래(exogenous) 유전자를 발현하게 하거나 또는 내인성(endogenous) 유전자의 자연적 발현량을 증가시키기 위해 유전자 전달체를 이용하여 인위적으로 이를 도입함으로써 유전자가 대상체 세포 내에서 염색체외 인자로서 또는 염색체 통합 완성에 의해 복제 가능하게 되는 것을 의미한다. 따라서, 용어“발현”은“형질전환(transformation)”, "형질감염(transfection)" 또는 "형질도입(transduction)"과 동일한 의미이다.
본 명세서에서, 용어“유전자 전달 시스템(gene delivery system)”는 유전자를 세포 내로 운반하는 모든 수단을 의미하며, 유전자 전달은 유전자의 세포내 침투(transduction)와 동일한 의미를 가진다. 조직 수준에서, 상기 용어 유전자 전달은 유전자의 확산(spread)과 동일한 의미를 가진다. 따라서, 본 발명의 유전자 전달 시스템은 유전자 침투 시스템 및 유전자 확산 시스템으로 기재될 수 있다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물로 발현을 억제하고자 하는 목적 유전자는 IL-23p19이다. p19는 TH17 세포를 자극하는 친염증성 사이토카인인 IL-23의 서브유닛으로서, 이의 억제를 통해 다양한 염증 및 자가면역 질환을 치료할 수 있다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 핵산분자 전달용 조성물 및 IL-23p19의 발현을 억제하는 핵산분자를 유효성분으로 포함하는 염증 또는 자가면역 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명의 조성물로 전달하고자 하는 핵산 분자에 대해서는 이미 상술하였으므로, 과도한 중복을 피하기 위해 그 기재를 생략한다.
본 명세서에서 용어“예방”은 질환 또는 질병을 보유하고 있다고 진단된 적은 없으나, 이러한 질환 또는 질병에 걸릴 가능성이 있는 대상체에서 질환 또는 질병의 발생을 억제하는 것을 의미한다.
본 명세서에서 용어“치료”는 (a) 질환, 질병 또는 증상의 발전의 억제; (b) 질환, 질병 또는 증상의 경감; 또는 (c) 질환, 질병 또는 증상을 제거하는 것을 의미한다. 본 발명의 조성물이 대상체에 투여되면 IL-23p19의 발현 억제를 통해 TH17 세포를 자극하면서 시작되는 캐스케이드 반응이 차단됨으로써 과도한 면역반응 및 염증에 따른 증상의 발전을 억제하거나, 이를 제거하거나 또는 경감시키는 역할을 한다. 따라서, 본 발명의 조성물은 그 자체로 염증 또는 자가면역 질환의 치료 조성물이 될 수도 있고, 혹은 다른 약리성분과 함께 투여되어 상기 질환에 대한 치료 보조제로 적용될 수도 있다. 이에, 본 명세서에서 용어“치료”또는“치료제”는“치료 보조”또는“치료 보조제”의 의미를 포함한다.
본 명세서에서 용어“투여”또는“투여하다”는 본 발명의 조성물의 치료적 유효량을 대상체에 직접적으로 투여함으로써 대상체의 체내에서 동일한 양이 형성되도록 하는 것을 말한다.
본 발명에서 용어“치료적 유효량”은 본 발명의 조성물을 투여하고자 하는 개체에게 치료적 또는 예방적 효과를 제공하기에 충분한 정도로 함유된 조성물의 함량을 의미하며, 이에“예방적 유효량”을 포함하는 의미이다.
본 명세서에서 용어“대상체”는 제한없이 인간, 마우스, 래트, 기니아 피그, 개, 고양이, 말, 소, 돼지, 원숭이, 침팬지, 비비 또는 붉은털 원숭이를 포함한다. 구체적으로는, 본 발명의 대상체는 인간이다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물로 예방 또는 치료하고자 하는 염증 또는 자가면역질환은 피부 건선, 류마티스 관절염, 반응성 관절염, 1형 당뇨병, 2형 당뇨병, 전신성 홍반성 낭창, 다발성경화증, 특발성섬유성폐포염, 다발성근염, 피부근염, 국한피부경화증, 전신피부경화증, 대장염, 염증성 장질환, 조르젠신드롬(Sjorgen's syndrome), 레이노현상(Raynaud's phenomenon), 베쳇병(Bechet's disease), 가와사키병(Kawasaki's disease), 원발성담즙성경화증(primary biliary sclerosis), 원발성경화성담관염(primary sclerosing cholangitis), 궤양성대장염(ulcerative olitis) 또는 크론병(Crohn's disease)이며, 보다 구체적으로는 피부 건선이다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 핵산분자 전달용 조성물 및 IL-23p19의 발현을 억제하는 핵산분자를 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 염증 또는 자가면역 질환의 예방 또는 치료 방법을 제공한다. 본 발명의 핵산분자 전달용 조성물, 이를 통해 전달하고자 하는 핵산 분자 및 이를 이용하여 예방 또는 치료할 수 있는 염증 또는 자가면역 질환에 대해서는 이미 상술하였으므로, 과도한 중복을 피하기 위해 그 기재를 생략한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 본 발명의 핵산 분자 전달용 조성물 및 목적 핵산분자를 세포와 접촉시키는 단계를 포함하는 상기 목적 핵산분자를 상기 세포에 전달하는 방법을 제공한다.
본 발명의 핵산 분자 전달용 조성물 및 이를 이용하여 전달하고자 하는 핵산 분자에 대해서는 이미 상술하였으므로, 과도한 중복을 피하기 위해 그 기재를 생략한다.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(a) 본 발명은 세포로의 핵산 분자 전달용 조성물 및 이를 이용한 염증 또는 자가면역 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
(b) 본 발명은 SPACE 펩타이드 및 폴리아르기닌 펩타이드의 조합을 이용하여 전달하고자 하는 핵산 분자와 복합체를 형성함으로써 세포막에 대한 투과성이 현저하게 개선되어, 효율적인 유전자 전달 시스템으로 유용하게 이용될 수 있다.
(c) 본 발명의 조성물은 특히 shRNA의 세포 내 투과 효율을 증진시킬 뿐 아니라 shRNA가 세포 내에서 장기간 분해되는 것을 동안 막아, shRNA를 이용한 목적 유전자의 발현 억제를 우수한 효율로 달성한다.
도 1은 shRNA/FP 복합체에 대한 겔 지연분석(겔 지연 분석) 결과를 보여주는 그림이다. 융합 펩타이드(FP)와 shRNA 간의 질소/인산(N/P) 비율이 1:1, 5:1, 10:1, 20:1, 30:1, 40:1, 50:1 및 100:1이 되도록 혼합하였다. 30분 뒤 상온에서 아가로스 겔 전기영동을 수행하였다.
도 2는 크기(도 2a), 다분산 지수(도 2b) 및 zeta potential(도 2c)을 측정한 결과를 각각 보여주는 그림이다. FP 및 대조군 shRNA를 1:1, 5:1, 10:1 및 20:1의 비율로 30분 간 상온에서 배양하였다. 모든 측정값들은 Zetasizer를 이용하여 3번 측정 후 평균 ± 표준편차로 나타내었다.
도 3은 안정성 시험 결과를 보여주는 그림이다. 50% FBS의 존재 하에 37℃에서 0, 4, 8, 12, 24 및 48시간 동안 배양을 수행하고 아가로스 겔 전기영동으로 확인하였다.
도 4는 형광 현미경을 이용하여 Cy3-표지된 siRNA/FP 복합체의 세포 내 위치를 확인한 결과를 보여주는 그림이다. 핵 및 F-액틴을 호케스트 33342(파란색) 및 팔로이딘(녹색)으로 각각 표지하였다. Cy3-표지된 siRNA는 오렌지색으로 시각화하였다(스케일바 = 100μm)
도 5는 세포에서 Cy3-표지된 siRNA/FP 복합체가 흡수되는 것을 유세포 분석을 통해 분석한 결과를 보여준다. siRNA만 처리한 대조군 및 siRNA/FP 복합체 처리군에서의 형광 강도가 각각 붉은색 및 녹색으로 나타나 세포의 수를 보여준다.
도 6은 RAW264.7에서의 IL-23p19 mRNA가 녹다운된 결과를 보여주는 그림이다. poly(I:C)로 활성화된 세포에 shRNA/FP 복합체를 처리하였다. RNA 추출 및 cDNA 합성 후에, 정량적 PCR을 수행하였다. 모든 값은 3번 측정하고 평균 ± 표준편차로 나타내었다.
도 7은 FP의 세포 독성을 측정한 결과를 나타낸다. FP는 0.2 mg/mL의 농도까지 처리되었다. HDFn 세포로부터 방출된 LDH 수준은 흡광도를 통해 측정하였다. 모든 값은 3번 측정하고 평균 ± 표준편차로 나타내었다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예
실험방법
shRNA/융합 펩타이드 복합체 형성
대조군 shRNA(Genolution, Seoul, Korea), Cy3로 표지된 대조군 siRNA (GenePharma, Shanghai, China), IL-23p19 shRNA (Genolution, Seoul, Korea)를 합성하여 nuclease-free water(Integrated DNA Technologies Inc., IA, USA)에 1 μM가 되도록 녹였다. 융합 펩타이드(GL Biochem Ltd., Shanghai, China)는 95% 이상의 순도를 가지도록 합성하여 3차 증류수에 1 mg/mL이 되도록 녹였다. 본 발명에서는 두 가지의 기능성을 가지는 펩타이드 서열 사이에 링커 서열(GCG)을 추가하여 디자인하였다. 융합 펩타이드의 구조는 크게 SPACE 펩타이드 및 폴리아르기닌 펩타이드 사이에 링커 서열로 구성되며, SPACE 펩타이드는 조직전달 기능을, 폴리아르기닌은 양전하를 띄어 음전하인 핵산과 정전기적인 상호작용을 하여 자가조립 기능을 가진다. 반면에 링커 서열은 두 펩타이드가 서로 영향을 주고 받지 않으며 활동할 수 있는 중간다리 역할을 한다. 융합펩타이드의 아미노산 조성을 분석하면 비극성 아미노산(A, G), 전하를 띠지 않는 극성 아미노산(C, T, S, Q), 양전하를 가지는 아미노산(H, R)으로 이루어져 있으며 염기성 부분이 전체의 48%이기 때문에 siRNA 또는 shRNA와의 정전기적 상호작용이 가능하다. shRNA/펩타이드의 자가 조립 복합체 형성을 위하여, 펩타이드의 아민 그룹(N)과 RNA의 인산 그룹(P)의 비율을 계산한 후 적절한 비율에 따라 상온에서 30분 동안 배양하였다.
겔 지연 분석
대조군 shRNA와 펩타이드의 N/P 비율을 1, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 100까지 계산하여 각각 상온에서 30분 동안 배양하였다. 2% 아가로스 겔 (w/v)을 10,000X TopRed Nucleic Acid Gel Stain (GenomicBase, Seoul, Korea)이 들어있는 1X TAE 완충액에서 제조하고 각 샘플에 6X 로딩 dye (Biofact)를 첨가한 후 겔에 로딩하였다. Mupid-2plus 전기영동 시스템(Optima Inc., Tokyo, Japan)을 이용하여 30분 동안 전기영동을 수행한 후 결과를 겔 기록 시스템 LSG 1000(iNtRON biotechnology, Seongnam, Korea)으로 확인하였다.
복합체의 크기 및 제타 전위 측정
대조군 shRNA와 펩타이드의 N/P 비율을 1, 5, 10, 20으로 하여 각각 상온에서 30분 동안 배양하였다. 최종 shRNA의 농도가 200 nM이 되도록 nuclease-free water를 첨가하여 희석한 후, 10 mL 주사기와 0.45 μm 주사기 필터를 이용하여 여과하고 30초 동안 볼텍싱하였다. Zetasizer Nano ZS(Malvern Instruments Ltd., Worcestershire, UK)를 이용하여 크기와 제타 전위를 측정하였다.
shRNA의 안정성 확인
대조군 shRNA와 펩타이드의 N/P 비율을 20으로 하여 상온에서 30분 동안 배양하였다. 형성된 shRNA/펩타이드 복합체에 우태아 혈청(FBS; PAN Biotech, Bavaria, Germany)을 50% (v/v)로 첨가한 후 37℃에서 배양하였다. 0, 4, 8, 12, 24, 48시간 동안 각각 샘플링하여 -80℃에 보관한 후, RNA 밴드를 확인하기 위해 1 mg/mL의 헤어핀 나트륨 염(Sigma-aldrich, MO, USA)을 첨가하여 37℃에서 30분 동안 배양한 뒤 앞선 실시예에서 언급한 조건과 동일하게 전기영동을 수행하여 결과를 확인하였다.
세포 배양
인간 피부 섬유아세포인 RAW264.7(HDF, neonatal) 세포를 10% FBS와 1% 페니실린-스트렙토마이신(Life Technologies, CA, USA)이 포함된 DMEM(dulbecco’s modified eagle’s medium, Corning, MA, USA)에서 37℃, 5% CO₂표준 조건에서 배양하였다. 계대 배양은 세포의 컨플루언시에 따라 2-3일 간격으로 수행하였다.
형광 현미경 관찰
충분히 자란 RAW264.7 세포를 24-웰 플레이트에 105 세포/웰로 총 0.5 mL씩 씨딩한 후 표준 조건에서 하루 동안 배양하였다. 배지를 혈청이 최소화된 Opti-MEM (Thermo Fisher Scientific, MA, USA)으로 교체한 후, Cy3가 표지된 대조군 siRNA와 펩타이드를 20:1의 N/P 비율로 상온에서 30분 동안 배양하여 형성된 복합체를 세포에 처리하고 표준조건에서 4시간 동안 배양하였다. PBS로 세척한 후, 10% 포르말린(Sigma-aldrich, MO, USA) 용액을 상온에서 10분 동안, 0.1% Triton X-100(Bio-Rad Laboratories Inc., CA, USA)이 포함된 PBS(0.1% PBST)를 10분 동안, 2% BSA(Generay Biotech Co., Ltd., Shanghai, China)가 포함된 0.1% PBST를 30분 동안 처리하였다. 빛을 차단한 상태에서 호케스트 33342 염색(Invitrogen, CA, USA) 용액을 상온에서 10분 동안, 팔로이딘 염색(BioActs, Incheon, Korea) 용액을 1시간 동안 처리하여 염색하였다. 각 과정 사이에 PBS 세척을 수행하고, 결과를 형광 현미경으로 분석하였다.
유세포 분석
충분히 자란 RAW264.7 세포를 6-웰 플레이트에 106 세포/웰로 총 1 mL씩 씨딩한 후 표준 조건에서 하루 동안 배양하였다. 배지를 Opti-MEM으로 교체한 후, Cy3가 표지된 대조군 siRNA와 펩타이드를 20:1의 N/P 비율로 상온에서 30분 동안 배양하여 형성된 복합체를 세포에 처리하고 표준 조건에서 4시간 동안 배양하였다. PBS로 세척한 후 각 웰에 트립신-EDTA(Thermo Fisher Scientific, MA, USA)를 첨가하여 세포 부착성을 떨어뜨리고, 배지를 첨가하여 360g에서 5분 동안 원심분리하였다. 상층액을 제거하고 PBS로 재부유한 후 동일한 조건에서 원심분리를 2번 반복하였다. 최종적으로 pellet을 차가운 PBS로 재부유하여 유세포 분석기 전용 튜브에 옮겨 측정하였다.
qRT-PCR
충분히 자란 RAW264.7 세포를 6-웰 플레이트에 106 세포/웰로 총 1 mL씩 씨딩한 후 표준 조건에서 하루 동안 배양하였다. 배지를 교체하고 각 웰에 Poly (I:C)(Invivogen, CA, USA)를 처리한 후 표준 조건에서 6시간 동안 배양하였다. IL-23p19 shRNA와 펩타이드를 20:1 N/P 비율로 상온에서 30분 동안 배양한 후 Opti-MEM으로 배지를 교체한 세포에 처리하여 5시간 동안 배양하였다. 대조군인 리포펙타민™ 2000 (Invitrogen, CA, USA)은 제공된 프로토콜에 따라 수행하였다. 배지를 DMEM으로 교체하여 추가적으로 13시간 동안 배양한 후 제품 프로토콜에 따라 RNA 추출과 cDNA 합성을 진행하였다. SYBR qPCR mix (TOYOBO Co., Ltd., Osaka, Japan)와 정방향 및 역방향 프라이머를 이용하여 반응 혼합물을 제조하였고 3단계 사이클에 따라 PCR을 수행하였다.
세포 독성 확인
HDFn 세포를 동일한 배지와 조건에서 배양하였다. 충분히 자란 세포를 96-웰 플레이트에 8.0×10³ 세포/웰로 씨딩하여 하루 동안 배양하였다. 펩타이드를 1, 0.5, 0.25, 0.125, 0.0625 mg/mL의 농도로 희석하여 세포에 5시간 처리한 후 프로토콜에 따라 CytoTox 96® 비-방사성 세포독성 어세이를 수행하였다.
실험결과
shRNA/펩타이드 복합체 형성 및 특성 분석
shRNA와 융합 펩타이드가 상호작용하여 형성한 복합체를 확인하고 특성을 분석하였다. 펩타이드 없이 shRNA만 로딩하였을 때 RNA 밴드를 확인하였다. 이 위치를 기준으로 펩타이드가 N/P 비율 1:1로 첨가되었을 때 거의 동일한 위치에 밴드가 나타났고 밝기는 조금 감소한 것을 확인하였다. 펩타이드가 N/P 비율 5:1로 증가하였을 때부터는 RNA 밴드의 지연이 일어나 로딩 웰에 밴드가 관찰되었다 (Fig. 1). 따라서 펩타이드는 5:1의 N/P 비율 이상부터 shRNA와 효과적으로 상호작용하여 복합체를 형성할 수 있음을 확인하였다.
shRNA와 융합 펩타이드 복합체의 크기와 제타 전위를 DLS(dynamic light scattering) 분석으로 측정하였다. 복합체는 N/P 비율 1:1에서 267 nm, 5:1에서 125.6 nm, 10:1에서 135.4 nm, 20:1에서 120.5 nm의 평균 크기를 나타내었다(도 2a). 또한 모든 비율에서 평균 PdI 값이 0.25 아래로 매우 균일한 크기를 가지는 것을 확인하였다(도 2b). 따라서 1:1에서는 펩타이드와 shRNA의 상호작용이 부족하여 크기가 크고 불균일한 복합체를 형성하였지만, 5:1부터는 상호작용이 충분하여 좀 더 응축되고 균일한 복합체가 형성된 것임을 알 수 있으며 이는 겔 지연 분석 결과와 일치하는 양상을 보였다. 한편 1:1, 5:1, 10:1의 복합체는 강한 음전하를 나타냈지만 20:1의 복합체는 강한 양전하를 나타내었기 때문에(도 2c), 이후 실험에서는 비율을 20:1로 고정하여 세포 내 투과 효율을 높이고자 하였다.
혈청을 과량으로 첨가하였을 때 shRNA/펩타이드 복합체의 shRNA가 분해되는 양상이 변화되는지를 관찰하였다. 먼저 펩타이드가 없는 shRNA는 혈청을 첨가하지 않은 0시간에서 뚜렷한 밴드가 관찰되었으나 혈청을 첨가한 후 4시간부터는 밴드가 관찰되지 않았다. 반면 shRNA/펩타이드 복합체의 shRNA는 혈청 첨가 후 4시간에서 0시간과 거의 동일한 밝기의 밴드를 나타냈고, 48시간까지 배양하였을 때 점점 희미해지는 밴드가 남아있는 것이 관찰되었다(도 3). 따라서 본 발명의 융합 펩타이드는 shRNA의 전달체로써 shRNA가 세포 내에서 분해되는 것을 장시간 동안 막아 안정성을 유지할 수 있는 기능이 있음을 확인하였다.
siRNA/펩타이드 복합체의 세포 내 투과 효율 평가
펩타이드를 통한 shRNA의 세포 전달 효율을 평가하기 위해 Cy3로 표지한 siRNA를 사용하였다. 모든 조건에서 호케스트 33342, 팔로이딘 염색에 의해 핵과 액틴이 염색되어 현미경 상에서 관찰되었다. siRNA만 전달하였을 때는 Cy3가 관찰되지 않았고, 리포펙타민™ 2000 복합체의 경우에는 부분적으로 약한 형광이 관찰되었다. 반면 펩타이드 복합체에서는 전체적으로 강한 시그널을 보이는 Cy3 형광이 관찰되었고, 세포질 내에 위치하는 양상을 확인하였다(도 4).
정량적인 결과 확인을 위하여 유세포 분석기를 사용하여 앞의 실험과 동일한 조건에서 Cy3 형광세기를 비교하였다. 펩타이드가 없는 siRNA에 비하여 리포펙타민™ 2000 복합체의 경우 형광 세기가 증가한 세포들이 측정되어 뚜렷한 이동(shift)이 30.13%로 분석되었다. 펩타이드 복합체의 경우 매우 강한 이동이 관찰되었고 87.08%로 나타났다(도 5). 두 결과를 종합하였을 때, 기존의 리포펙타민™ 2000 시약에 비하여 본 발명의 융합 펩타이드가 siRNA의 세포 내 전달 효율을 증가시킬 수 있음을 확인하였다.
IL-23p19 mRNA 발현 억제 평가
RAW264.7 세포에서 poly (I:C)에 의한 활성화로 IL-23p19의 발현 양을 증가시킨 후 IL-23p19 shRNA를 전달하여 mRNA 발현량 변화를 qRT-PCR로 확인하였다. shRNA만을 전달한 조건을 대조군으로 하여 상대적인 mRNA 발현량을 1로 고정하고 ΔΔCt 계산으로 분석하였다. SPACE 복합체에 의한 mRNA 발현량은 대조군과 차이가 없었으며, R11 복합체는 약 80%까지 mRNA 발현을 억제하였다. 반면에 리포펙타민™ 2000 복합체는 평균 약 28.1%, 펩타이드 복합체는 약 33.8%까지 mRNA 발현을 억제하였다(도 6). 통계처리 결과 두 조건 사이에서 유의성이 없었기 때문에 융합 펩타이드는 리포펙타민™ 2000의 범위 내의 효율을 나타낸 것으로 평가되었다. 또한 SPACE 펩타이드와 R11 펩타이드 각각을 단독으로 사용한 경우보다 펩타이드 조합에 의한 상승효과(synergistic effect)를 확인하였다. 따라서 융합 펩타이드는 shRNA를 전달하여 목적 mRNA의 발현 억제를 증가시킬 수 있는 매우 효율적인 전달체로써 평가되었다.
펩타이드의 세포 독성 평가
펩타이드가 세포에 미치는 독성의 영향을 1차 세포에서 확인하였다. 펩타이드가 세포에 처리되어 나타내는 최종 농도는 0.2, 0.1, 0.05, 0.025, 0.0125 mg/mL이었다. 펩타이드가 처리되지 않은 세포의 LDH(lactate dehydrogenase) 수준을 1로 고정하여 비교한 결과, 펩타이드 농도가 증가하여도 LDH 수준은 대조군과 비교하여 통계적으로 차이나지 않았다(도 7). 앞선 세포 실험에서 사용한 펩타이드 농도는 이 범위 안에 포함되기 때문에 실제로 적용하였을 때 생체적합성을 가질 수 있을 것이라고 판단되었다.
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이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (16)

  1. 피부 침투 및 세포 진입(Skin Permeating And Cell Entering, SPACE）펩타이드 및 폴리아르기닌(polyarginine) 펩타이드를 포함하는 세포로의 핵산 분자 전달용 조성물.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 폴리아르기닌 펩타이드는 11개의 아르기닌 잔기로 구성된 것을 특징으로 하는 조성물.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 SPACE 펩타이드는 서열목록 제1서열의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  4. 제 1 항에 있어서, 상기 SPACE 펩타이드 및 상기 폴리아르기닌 펩타이드는 링커로 연결된 것을 특징으로 하는 조성물.
  5. 제 3 항에 있어서, 상기 링커는 서열목록 제3서열의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드인 것을 특징으로 하는 조성물.
  6. 제 1 항에 있어서, 상기 핵산 분자는 음전하를 띄는 것을 특징으로 하는 조성물.
  7. 제 1 항에 있어서, 상기 핵산 분자는 목적 유전자의 발현 억제용 핵산 분자인 것을 특징으로 하는 조성물.
  8. 제 7 항에 있어서, 상기 핵산 분자는 shRNA, siRNA, miRNA, gRNA(guideRNA) 및 안티센스 올리고뉴클레오타이드로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 핵산 분자인 것을 특징으로 하는 조성물.
  9. 제 8 항에 있어서, 상기 핵산 분자는 shRNA인 것을 특징으로 하는 조성물.
  10. 제 7 항에 있어서, 상기 목적 유전자는 IL-23p19인 것을 특징으로 하는 조성물.
  11. 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 하나의 조성물 및 IL-23p19의 발현을 억제하는 핵산분자를 유효성분으로 포함하는 염증 또는 자가면역 질환의 예방 또는 치료용 조성물.
  12. 제 11 항에 있어서, 상기 핵산분자는 음전하를 띄는 것을 특징으로 하는 조성물.
  13. 제 12 항에 있어서, 상기 핵산분자는 shRNA, siRNA, miRNA, gRNA(guideRNA) 및 안티센스 올리고뉴클레오타이드로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 핵산 분자인 것을 특징으로 하는 조성물.
  14. 제 11 항에 있어서, 상기 염증 또는 자가면역질환은 피부 건선, 류마티스 관절염, 반응성 관절염, 1형 당뇨병, 2형 당뇨병, 전신성 홍반성 낭창, 다발성경화증, 특발성섬유성폐포염, 다발성근염, 피부근염, 국한피부경화증, 전신피부경화증, 대장염, 염증성 장질환, 조르젠신드롬(Sjorgen's syndrome), 레이노현상(Raynaud's phenomenon), 베쳇병(Bechet's disease), 가와사키병(Kawasaki's disease), 원발성담즙성경화증(primary biliary sclerosis), 원발성경화성담관염(primary sclerosing cholangitis), 궤양성대장염(ulcerative olitis) 또는 크론병(Crohn's disease)인 것을 특징으로 하는 조성물.
  15. 제 14 항에 있어서, 상기 염증 또는 자가면역질환은 피부 건선인 것을 특징으로 하는 조성물.
  16. 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 하나의 조성물 및 목적 핵산분자를 세포와 접촉시키는 단계를 포함하는 상기 목적 핵산분자를 상기 세포에 전달하는 방법.
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