JP2000178207A - 家庭動物及び家畜の貧血治療におけるエリスロポイエチンの使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 家庭動物及び家畜の貧血を治療するための新
規な手段の提供。 【解決手段】 本発明は、イヌ、ネコ又はブタのエリス
ロポイエチンをコードする発現ベクターを投与すること
により、家庭動物及び家畜（特にネコ、イヌ及びブタ）
の貧血を治療する方法に向けられている。さらに、本発
明は、発現ベクターを含有する薬学組成物をも含む。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、家庭用動物及び家
畜に応用されるような遺伝子治療に向けられている。特
に、本発明は、エリスロポイエチンの供給のための方法
及び組成物に関する。

【０００２】

【従来の技術】慢性腎不全、化学療法剤又は外科手術に
よってひき起こされる貧血は、家庭用動物及び家畜の死
亡及び能力障害の主たる原因である。輸血を別にして、
現在イヌ、ネコ又はブタの貧血に対して利用可能な唯一
の療法は、組換え型ヒトエリスロポイエチン（ＥＰＯ）
タンパク質の投与である。この治療は動物にとって生活
の質を改善する可能性があるものの、これには主に２つ
の欠点がある。まず第１に、この療法は費用が高くつき
しかも不便である（注射は典型的には、動物の一生にわ
たり一週間に３回投与されなくてはならない）。

【０００３】第２に治療された動物は往々にして、ヒト
タンパク質に対する抗体を発生させ、この抗体が投与し
たＥＰＯの有効性を低減させ、かつ動物自身のＥＰＯと
交叉反応してさらに貧血を悪化させることがある（Cowg
ill et al., J.Am. Vet. Med, Assoc. 212:521-528 (19
98))。イヌ、ネコ及びブタ形のＥＰＯが近年入手可能に
なったことは（Wen et al., Blood 82:1507-1516 (199
3))，種系統を横断してのＥＰＯの投与に付随する免疫
学的効果を克服する一助となるかもしれない。しかしな
がら、治療は、なおも高価であり続け、頻繁な反復を必
要とする確率も高い。これらの問題を回避するＥＰＯ供
給方法は、獣医学における明らかな進歩を意味してい
る。

【０００４】

【発明の要約】本発明は、ＥＰＯをコードする発現ベク
ターを投与することによって、イヌ、ネコ及びブタの貧
血を軽減することができるという発見に基づくものであ
る。かかるベクターは、in vivo で細胞により取り込ま
れ、持続的期間（３〜４カ月）中動物の体内のヘマトク
リットレベルを著しく増大させるのに充分なホルモンを
産生する。治療対象の動物の体内に通常見い出されるＥ
ＰＯの形態（イヌについてはイヌＥＰＯ，ネコについて
はネコＥＰＯ，そしてブタについてはブタＥＰＯ）をコ
ードするベクターを使用することにより、これらの動物
に対しヒトＥＰＯを投与することに付随する免疫学的問
題を回避することができる。

【０００５】

【発明の実施の形態】本発明は、その第１の態様におい
て、イヌエリスロポイエチンをコードするヌクレオチド
から本質上成る個別のＥＰＯ配列要素をもつ発現ベクタ
ーを投与することによって、イヌにおける貧血を治療す
る方法に向けられている。「から本質上成る」という語
は、イヌＥＰＯの正確なアミノ酸配列をコードする核酸
配列ならびに、それらがイヌのホルモンの基本的な機能
的及び免疫学的特性を保持していることによって実証さ
れるように実質的でないアミノ酸の差異を伴うタンパク
質をコードする核酸を包含するものとして意図されてい
る。

【０００６】この点において、コードされたＥＰＯが治
療対象動物体内での抗ＥＰＯ抗体の生成を誘発しないこ
とがとくに重要である。ＥＰＯ配列要素は、イヌＥＰＯ
の場合、残基は１６６個である、成熟ＥＰＯタンパク質
のアミノ酸をコードする。典型的には、これはそのＮ末
端にシグナル配列（好ましくは相同なシグナル配列）を
有する。この「相同なシグナル配列」という語は、コー
ドされたＥＰＯに通常結合しているシグナル配列を意味
し、例えば、イヌのＥＰＯシグナル配列は好ましくは、
イヌＥＰＯ構造配列と共に使用される。イヌのホルモン
の完全アミノ酸は図１に示されている（配列番号１）。
最初の２６個のアミノ酸（図中下線入り）は、イヌシグ
ナル配列を表わし、残りのアミノ酸は成熟イヌＥＰＯの
構造配列を表わす。

【０００７】動物を治療するのに使用される発現ベクタ
ーは好ましくは、ＥＰＯ配列要素に作用可能に連結され
たプロモーター要素を有しているべきである。この「作
用可能に連結された」という語は、２つの配列要素（す
なわちプロモーターとＥＰＯ構造配列）が、転写がその
プロモーターの制御下にありＥＰＯタンパク質が正しく
作られるような形で連結されているということを意味し
ている。発現ベクターは、治療対象動物のヘマトクリッ
トの統計的に有意な増大をひき起こすのに充分な用量で
投与されるべきである。

【０００８】In vivo で投与された核酸の細胞への取り
込みを増強するのに使用できるいくつかの異なる作用物
質が記述されてきた。これらのうちのいずれも本発明と
相容性（compatible) があるが、発現ベクターはカチオ
ン性脂質と複合された (complexed ) 状態、リポソーム
の一部として、又はトランスフェクション促進物質すべ
てを含まない形態、のいずれかで投与されるのが好まし
い。発現ベクターは一般的には、０. ０１mg/ml と１０
mg/ml の間の濃度で投与されるべきであるが、好ましい
濃度は約０. １mg/ml である。好ましい供給方法は、筋
内注射を用いるものであるが、その他の方法、例えば
「遺伝子ガン」を用いる方法も同様に使用可能である。

【０００９】本発明のもう１つの形態においては、上述
の貧血を治療するための方法は、ネコのＥＰＯ配列要素
又はブタの配列要素で発現ベクター中のイヌＥＰＯ配列
を置換することによって、ネコ及びブタに適用すること
ができる。かくして、ネコには、ネコＥＰＯをコードす
るヌクレオチドから本質上成り、プロモーター要素に作
用可能に連結された個別のＥＰＯ配列要素をもつ発現ベ
クターが投与される。ブタの場合には、発現ベクター内
の個別のＥＰＯ配列要素はブタＥＰＯをコードするヌク
レオチドから本質上成る。イヌの場合と同様、典型的に
はコードされたＥＰＯのＮ末端には１つのシグナル配列
が存在すべきであり、発現ベクターは、治療対象動物の
ヘマトクリットの統計的に有意な増大をひき起こすのに
充分な用量で投与されるべきである。

【００１０】投与される発現ベクターは、カチオン性脂
質と複合されているか、リポソームの一部として取込ま
れるか又は、トランスフェクション促進物質を含まない
形態にあることが好ましい。イヌのＥＰＯの配列は図２
（配列番号２）に示されている。図中の下線入りアミノ
酸は、ネコのシグナル配列を表わす。ブタＥＰＯの構造
配列は図３（配列番号３）に示されている。本発明は同
様に、上述のイヌ、ネコ又はブタの発現ベクターのいず
れかを含有する非経口投与のための薬学組成物をも包含
する。ベクターは、食塩水といった水性溶媒の中で懸濁
又は溶解させられるべきであり、約０. ０１mg/ml 〜１
０mg/ml の間の濃度で存在すべきである。好ましい濃度
は約０. １mg/ml である。

【００１１】定義 以下の記述では、組換え型ＤＮＡ技術に言及するいくつ
かの用語が使用されている。明細書の記載を明確かつ一
貫した形で理解するため、以下の定義が提供される。

【００１２】クローニングベクター： 宿主細胞中で自
律的に複製することができかつ１つ又は少数の制限エン
ドヌクレアーゼ認識部位により特徴づけられるプラスミ
ドもしくはファージＤＮＡ又はその他のＤＮＡ配列。フ
ラグメントの複製及びクローニングをもたらすためこれ
らの部位でベクター内に外来性のＤＮＡフラグメントを
スプライシングすることができる。ベクターは、形質転
換された細胞の識別において使用するのに適したマーカ
ーを含有することができる。例えば、マーカーはテトラ
サイクリン耐性又はアンピシリン耐性を提供することが
できる。

【００１３】発現ベクター： クローニングベクターに
類似しているものの、宿主内への形質転換の後その中に
クローニングされたＤＮＡの発現を誘発する能力をもつ
ベクター。クローニングされたＤＮＡは通常、プロモー
ター又はエンハンサーといった調節配列の制御下に置か
れる（すなわちこれに対し作用可能に連結される）。プ
ロモーター配列は、構成的、誘導的又は制御的であるこ
とができる。宿主 ： 発現ベクター又はクローニングベクターの受容
体であるあらゆる原核細胞又は真核細胞が、そのベクタ
ーの「宿主」である。宿主として役立つことのできる細
胞の例は、細胞形質転換のための技術と同様、当該技術
分野において周知のものである（例えば Sambrook et a
l., 分子クローニング：実験室マニュアル、第２版、Co
ld Spring Harbor Press（1989）を参照）。宿主細胞は
in vivoで存在でき、そして注射により動物に投与され
る核酸のトランスフェクションを受ける。

【００１４】プロモーター： 開始コドンの近くに配置
された、遺伝子の５Ｎ領域内に標準的に見られるＤＮＡ
配列。プロモーターにおいて転写が開始される、プロモ
ーターが誘導のものである場合には、誘発剤に応じて転
写速度は増大する。発現 ： 発現は、ＤＮＡからポリペプチドが産生される
プロセスである。このプロセスには、ｍＲＮＡ内へのポ
リペプチドをコードするＤＮＡセグメトの転写及び、最
終的ポリペプチド産物内へのこのｍＲＮＡのトランスレ
ーションが関与する。

【００１５】発明の詳細な説明 発現ベクターの調製 本発明は、イヌ、ネコ、及びブタのＥＰＯをコードする
発現ベクターをそれぞれ投与することによりイヌ、ネコ
及びブタにおける貧血を治療するための方法に向けられ
ている。これらの形態のＥＰＯの全長アミノ酸配列は、
図１〜３に示されている。Wen et al., (Blood 82:1507
-1516 (1993)) は、これらの種の各々からのＥＰＯをＰ
ＣＲ増幅するための手順を記述している。Macleod. et
al.(Am.J. Vet. Res. 59:1144-1148 (1998)) は同様
に、イヌＥＰＯを分離しそれを発現ベクター内に取込む
ための手順についても記述している。

【００１６】これらの手順は本発明での使用に適したＥ
ＰＯ配列を得るのに使用可能であるが、遺伝的要素を分
離するための数多くの代替的技術が記述されてきており
これらを使用することも可能である（例えば、Sombrook
et al., 分子クローニング：実験室マニュアル、第２
版、Cold Spring Harbor Press（1989）を参照のこ
と）。かくして、ＤＮＡは化学的に合成することもでき
るし、又ｃＤＮＡライブラリをスクリーニングすること
によって得ることもでき、又既知のＥＰＯ配列の領域に
対応するＰＣＲプローブでｃＤＮＡから増幅させること
もできる。好ましい手順は、そのＳＮ末端でシグナル配
列をコードするセグメントを用いて望ましいＥＰＯヌク
レオチド配列を化学的に合成することである。

【００１７】シグナル配列は、送達中のＥＰＯの形態と
相同性をもつことが好ましい（例えば、イヌのシグナル
配列は好ましくはイヌのホルモンと共に使用されるべき
である）。しかしながら、望ましい場合にはその他のシ
グナル配列も使用でき、例えば、ブタ構造配列と共にイ
ヌのシグナル配列を使用することもできる。シグナル配
列をコードする領域に対し５Ｎ、及びＥＰＯ構造配列に
対し３Ｎのところに、制限配列も含まれているべきであ
る。これらの制限配列は、ＥＰＯを発現するために使用
されるべきベクター内の対応する部位と整合するように
選択されるべきである。好ましいVR1012ベクターの場
合、ＤＮＡは、その５Ｎ末端にＥｃｏＲＶを又その３Ｎ
末端にＢｇＩIIを伴って構築できる。

【００１８】発現ベクターは、標準的技術を用いて構築
でき、ＥＰＯをコードするＤＮＡ要素に対し作用可能に
連結されたプロモーターを含むべきである。転写エンハ
ンサー及びその他の調節要素も同様に存在しうる。好ま
しくは、転写はＣＭＶ（サイトメガロウイルス）プロモ
ーターにおいて開始される。使用可能なその他のプロモ
ーターの例としては、マウスメタロチオネインＩ遺伝子
プロモーター（Haymeret al., J. Mol. Appl. Gem. 1;
273 (1982)) ；ヘルペスウイルスのＴＫプロモーター
（McKnight, Cell 31:355-365 (1982)) 及びＳＶ４０早
期プロモーター（Benoist, et al., Nature 290:304 (1
981)) が含まれる。

【００１９】本発明において使用するのに適した数多く
のプラスミドが記述されている（Botstein, et al., Mi
ami Winter Symp. 19:265 (1982)) ； Broach, Cell 2
8:203(1982) ； Bollon. et al., J. Clin. Hematol. O
ncol. 10:39 (1980)；及び Maniatis, in Cell Biology
; A Comprehensive Treatise 第３巻中、Academic Pre
ss, N.Y., pp. 563-608 (1980)) 好ましい発現ベクタ
ー，「VR1012」は Hartikka et al.により記述された通
りに構築することができる（Hum. Gene Ther 7:1205-12
17 (1996))。

【００２０】発現ベクターの化学的形態 in vivo での細胞によるＤＮＡの取り込みを容易にする
ために、さまざまな異なる作用物質が使用されてきた。
当該方法は、これらの作用物質のいずれの使用とも相容
性があるが、好ましくは、発現ベクターは、トランスフ
ェクション促進物質を含まない形態で投与されるか又
は、カチオン性脂質を複合される。

【００２１】「裸の」ＤＮＡを調製するための適切な方
法が U.S.5,703,055号中に記述されている。使用可能な
カチオン性脂質の例は、U.S.5,264,68号及び 5,459,127
号に記述されており、カチオン性リポソームの例は、
U.S.4,897,355号中に見い出すことができる。トランス
フェクション促進物質が使用されるとき、それは、治療
対象動物内に不利な副作用をひき起こすことなく投与さ
れた発現ベクターの細胞摂取を最大限にすることを目的
として選択されるべきである。

【００２２】用量形態と投与経路 細胞の in vivoトランスフェクション及びその後の機能
的ＥＰＯの発現を相容性のあるあらゆる投与経路を本発
明で使用することができる。ＥＰＯをコードする発現ベ
クターは、唯一の活性作用物質として又はその他の核酸
又は治療上有効な薬物と組合わせた形で投与することが
できる。筋内注射が好ましいが、使用可能なその他の経
路としては、真皮内、経皮、静脈内、動脈内、腹腔内、
皮内及び皮下経路が含まれる。ベタクーは同様に、「遺
伝子ガン」を用いて動物に供給することもできる。

【００２３】発現ベクターは、当該技術分野において標
準的である方法を用いて作られた薬学調製物の中に取り
込むことも可能である（例えば、Remington's Pharmace
utical Sciences.第１６版、A. Oslo 編集. Easton PA
(1980)) 。一般に、調製物は、非経口投与に適している
べきであり、無菌等張塩水、エタノール、水と混合した
ポリグリコール、リンガー液などといった水性溶媒を含
む。典型的には、発現ベクターは、最終組成物の約０.
０１mg/ml 〜１０mg/ml を構成すべきである。

【００２４】治療方法 貧血を患うものと診断された動物は、通常約０. ５〜３
０mlの間の量の筋内注射により０. ０１mg〜２０. ０mg
の間の用量で投与されるべきである。１回又は複数回の
注射を行なうことができる。かくして、複数の注射を受
けた動物は、合計１００mg以上の用量を受ける可能性が
ある。適切であることが判明した１つの養生法には、動
物の各後脚内に３回ＤＮＡを注射することを含み、ここ
で各々の注射には３０分の間隔がおかれる。有効り治療
は、６回の注射の各々において２５ml中２. ５mgのＥＰ
Ｏ ＤＮＡを投与することによって達成された。

【００２５】これらの用量は、単なる指針にすぎず、個
々の動物のために選択される実際の用量は、臨床的条件
に基づき担当獣医により決定されることになる。与えら
れる用量の有効性は規則的間隔、例えば２週間に一度の
割合で、治療対象動物のヘマトクリットを測定すること
によって監視可能である。３カ月又は４カ月に一回投与
を反復することが必要である場合もあり、その頻度は、
個々の動物の応答性に基づいて調整される。用量に影響
を及ぼしうるその他の要因としては、細胞が発現ベクタ
ーを摂取する効率及びプロモーター及びその他の調節要
素がトランスフェクションの後ＥＰＯ合成を誘発する速
度が含まれる。

【００２６】当該方法は、当該技術分野において記述さ
れてきた in vivoトランスフェクションのあらゆる方法
と相容性をもつ。好ましい手順は、 WO 90/11092号及び
本書の実施例の節で記述されているものである。これら
の又はそれに類似する手順は、原因の如何に関わらずイ
ヌ及びネコの貧血を治療するのに有効に用いることがで
きる。かくして、動物は、貧血が慢性腎不全、化学療法
又は単なる加齢のいずれに起因するものかにかかわらず
治療手順に応答するはずである。

【００２７】

【実施例】例１：ＥＰＯをコードするＤＮＡ調製 イヌ及びネコ形のＥＰＯをコードするＤＮＡ配列を、図
１及び２に示された配列（シグナル配列をコードするヌ
クレオチドを含む）に対応するように合成した。合成さ
れたＤＮＡの５Ｎ末端には、ＥcoＲＶ部位が含まれ、３
Ｎ末端にはＢalII 部位が含まれた。次に、ＤＮＡをプ
ラスミドVR1012内にクローニングした。このプラスミド
は、in vitro及び in vivoの両方で哺乳動物細胞内のク
ローニングされた遺伝子の発現を容易にする、ＣＭＶプ
ロモーターを含めた遺伝的要素を含有している。

【００２８】イヌＥＰＯ遺伝子を含有する組換え型VR10
12を以下では「イヌＥＰＯ ＤＮＡ」と呼び、ネコＥＰ
Ｏ遺伝子を含有する組換え型VR1012を「ネコＥＰＯ Ｄ
ＮＡ」と呼ぶ。プラスミドを大腸菌(E. coli) 培養から
抽出し、塩化カルシウム勾配超遠心分離又はアニオン交
換クロマトグラフィのいずれかを用いて精製した。分光
光度法及びアガロースゲル電気泳動法により、ＤＮＡ調
製物の品質を見極めた。

【００２９】例２：イヌＥＰＯ ＤＮＡの注射後のマウ
スヘマトクリットの上昇 この研究では、各々２０匹のマウスを含む３グループが
使用された。１つのグループはイヌＥＰＯ ＤＮＡでの
治療を受け：第２のグループは、イヌＥＰＯ遺伝子無し
でプラスミドＤＮＡで治療され、第３のグループは治療
を受けていない対照として用いられた。マウスには、各
後脚の大腿直筋内に３回ＤＮＡが注射された。各注射
は、５０μｌのリン酸緩衝液（ＰＢＳ）５０μｌ中２５
μｇのＤＮＡを含有し、投与間隔は３０分であった。ヘ
マトクリットを、０日の最初の治療の前、及び治療後９
日目、１６日目、２３日目及び３６日目に測定した。ヘ
パリン化ヘマトクリット管を用いて眼の後ろの静脈穿刺
により、血液を収集した。血液管を遠心分離に付し、マ
イクロ−ヘマトクリット毛細管読取り器でヘマトクリッ
トを測定した。収集したデータは表１に示す。

【００３０】

【表１】

【００３１】データの対分析（pairwise analysis)は、
注射を受けていない対照グループのマウスにおけるヘマ
トクリットに比べた、治療後３６日目までのイヌＥＰＯ
ＤＮＡで治療されたマウスにおける著しい上昇（０.
０５未満のＰ値）を示した。イヌＥＰＯ遺伝子無しのプ
ラスミドＤＮＡを受けたマウスと注射を受けていないマ
ウスの比較は、０日目における著しい差異を示した。こ
れは、血液を収集した時点で動物がまだ治療を受けてい
なかったことから、実験上の異常であるとみなされた。
他のいかなる時点においても２つの対照グループ間には
有意な差異は全く見られなかった。イヌＥＰＯ ＤＮＡ
治療マウスのヘマトクリットの減少が、治療後２週間で
見られたが、これは、マウスにおけるイヌＥＰＯに対す
る免疫応答の誘発のせいであると考えることができる。

【００３２】例３：ネコＥＰＯ ＤＮＡの注射を受けた
マウスにおけるヘマトクリットの上昇 各々５匹のマウスから成る２つのグループを、ネコのＥ
ＰＯ ＤＮＡ又は単なる溶媒のみ（ＰＢＳ，「治療を受
けていない対照」）で治療した。濃度、体積及び注射養
生法は例２で記述した通りであった。０日目の治療前及
び治療後７，１４及び２１日目にヘマトクリットを測定
した。結果は統計的に分析され、表２に示されている。

【００３３】

【表２】

【００３４】表２に示されたようなデータの対分析か
ら、治療後７日，１４日及び２１日目の治療を受けてい
ない対照グループに比べて、ネコＥＰＯ ＤＮＡの治療
を受けたマウスにおいてヘマトクリットの著しい増大が
存在したことがわかる。

【００３５】例４：イヌＥＰＯ ＤＮＡでの注射を受け
たイヌにおけるヘマトクリットの上昇 イヌのヘマトクリットの上昇を誘発するのに必要とされ
るイヌのＥＰＯ ＤＮＡの量を見積るため、動物を３つ
の実験グループに分割した。各グループは、例２に記述
された一般的手順の後６回の注射を受けた。各注射で使
用された体積及び量は表３に示されている。

【００３６】

【表３】

【００３７】各グループは、４頭のイヌを含み、うち２
頭はイヌＥＰＯ ＤＮＡでの治療を受け、２頭の対照
は、ヒト可溶性胚アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）
遺伝子を含有するプラスミドＤＮＡで処置された。イヌ
ＥＰＯ ＤＮＡの投与は、全てのグループにおいて３２
日以上持続するヘマトクリットの上昇を導き、一方ＳＥ
ＡＰ ＤＮＡの投与は、ヘマトクリットに対しいかなる
効果ももたらさなかった。

【００３８】標本のサイズが比較的小さいため統計的分
析は制限されたが、全てのグループにおけるヘマトクリ
ットレベルの増加百分率は、生理学的に実際的意味のあ
るものとみなされた。データが示すところによれば、
（ｉ）イヌＥＰＯ ＤＮＡがイヌにおけるヘマトクリッ
トの上昇を導き、遺伝子療法の概念を検証しているこ
と、及び（ii）ヘマトクリットの上昇がさらに長い時間
持続され、これは治療を受けたイヌがＥＰＯに対する免
疫応答を発生させなかったことを示唆している。

【００３９】個々の動物に関しては、「高体積低用量」
グループ（合計１５０ml中１５ml投与）内の両方のイヌ
が、ヘマトクリットの上昇で応答した。「高体積高用
量」及び「低体積低用量」グループの各々においては、
グループ内の２頭の動物のうちの一方の応答がもう一方
の動物より優れていた。応答が低い動物を、「高体積低
用量」条件下で「ブースター」投与量のイヌＥＰＯ Ｄ
ＮＡで処理したとき、両方のイヌは共にヘマトクリット
の上昇で応答した。このことはすなわち、「高体積低用
量」条件下でイヌＥＰＯ ＤＮＡをイヌに投与した場合
にヘマトクリット応答により高い一貫性が存在しうると
いうことを示唆している。

【００４０】例５：腎切除術及び静脈切開を受けたイヌ
におけるヘマトクリット回復速度の評価 貧血からの回復速度に対するイヌＥＰＯ ＤＮＡ投与の
効果を、腎不全の実験モデルにおいて検査した。健康な
１６頭のビーグル犬を麻酔し、その左腎の腎動脈、静脈
及び尿管を結紮し切断した。次に、腎臓を周囲から分離
して摘出した。右腎の腎動脈を結紮し第１分岐点で切断
し、残りの腎臓のほぼ半分を正常に灌流された状態に残
した。静脈切開より少なくとも１週間前に、イヌが回復
できるようにした。

【００４１】貧血を誘発するため腎切除を施したイヌ
を、２４時間間隔で３回放血させた。各々の予定された
静脈切開において、体重の２パーセントに等しい体積の
血液をとり出し、直ちに２倍の体積の乳酸加リンガー液
で置換した。前述の要領で１２頭のイヌに対し、イヌＥ
ＰＯ ＤＮＡを投与した（「高体積低用量」条件）。６
頭のイヌに対し、裸のイヌＥＰＯ ＤＮＡを、又６頭に
対し、３mlのリポフェクタミン中４mgのＤＮＡの比率で
脂質（Lipofectamine, Life Technologies Inc.Gaither
burg, MD ）で複合されたイヌＥＰＯ ＤＮＡを投与し
た。４頭のイヌは、腎切除術及び静脈切開の後、未治療
の状態に残された。

【００４２】腎切除術及び静脈切開を受けたイヌは全
て、静脈切開の直後に記録された値から上昇したヘマト
クリットを示した。対照グループ（すなわちイヌＥＰＯ
ＤＮＡで治療されなかったイヌ）内の４頭のイヌのう
ち３頭は、腎切除術と静脈切開に先立ちイヌについて記
録されたベースライン値より低いところで安定した高い
ヘマトクリットを示した。これとは対照的に、イヌＥＰ
Ｏ ＤＮＡでの治療を受けたイヌのヘマトクリットは、
腎切除術と静脈切開に先立ち観察された値に匹敵する値
で安定した。このことは、これらのイヌにおけるヘマト
クリットの上昇が、投与されたＤＮＡからのＥＰＯ産生
に起因することを示唆している。

【００４３】全体として、ヘマトクリット上昇速度は、
裸のＤＮＡで治療されたイヌ又は未処置のイヌのいずれ
よりも、リポフェクタミン複合ＤＮＡで治療されたイヌ
において優れていた。これらの観察事実と一貫して、網
赤血球数は、対照に比べ、リポフェクタミン複合イヌＥ
ＰＯ ＤＮＡで治療されたイヌにおいてさらに高く、赤
血球形成の上昇を示した。これらの結果は、投与された
ＤＮＡからのＥＰＯが、貧血のイヌにおいてより高いヘ
マトクリット及びより速い上昇の両方を誘発したことを
示唆している。貧血からの回復速度は、裸のイヌＥＰＯ
ＤＮＡで治療されたイヌ及び未処置のままのイヌの間
で比較可能なものであったものの、この研究結果を全体
として考慮すると、ＥＰＯ遺伝子療法がイヌにおいて首
尾よく使用され得たということを表わしている。

【００４４】例６：イヌＥＰＯ ＤＮＡの注射の後のマ
ウス（ＣＤ１）の異系交配株におけるヘマトクリットの
上昇 上述の例２及び３においては、同系交配株からのマウス
BalB/C に、５０μｌの体積でＤＮＡを注入した。この
例においては、イヌＥＰＯ ＤＮＡは、異系交配株のマ
ウス、ＣＤ１に対し２５μｌの体積で投与された。一部
の注射は、溶媒としてリン酸ナトリウム（１５０ｍＭ，
ｐＨ７. ２〜７. ４）を用いて行なわれ、その他の注射
はＰＢＳ（ダルベッコのリン酸緩衝溶液、Life Technol
ogies, Inc., Gaitherburg, MD）中で行なわれた。

【００４５】

【表４】

【００４６】得られた結果は、ＤＮＡベースのＥＰＯ遺
伝子療法が、異系交配個体群内で首尾よく使用され得る
ことを示唆していた。同様に、リン酸ナトリウム内のＤ
ＮＡが、ＰＢＳ中のＤＮＡとの関係において優れたヘマ
トクリット応答を惹起すること、及び後脚１本あたり１
回の注射を用いた２５μｌの体積でのＤＮＡの投与が、
ヘマトクリットの有意な上昇を誘発するのに充分なもの
であることもわかった。

【００４７】例７：イヌのＥＰＯ ＤＮＡを注射した後
の「老年」マウスにおけるヘマトクリットの上昇 この研究には「老年」（引退した種畜）Balb/ Ｃマウス
におけるヘマトクリットの上昇を実証することが関与し
ていた。

【００４８】

【表５】 得られた結果は、「老年」の哺乳動物個体群を治療する
上でＤＮＡベースのＥＰＯ遺伝子療法を首尾よく使用で
きることを示唆している。

【００４９】例８：ネコのＥＰＯ ＤＮＡを注射した後
のネコにおけるヘマトクリットの上昇 生後６〜８カ月のネコに、以下で記述する養生法に従っ
てネコのＥＰＯ ＤＮＡを注射し、２５日目に脾を摘出
し、治療した。プラスミドＤＮＡを上述の通りリン酸ナ
トリウム中で摂取させ、大腿部直筋内に筋内注射した。
負の対照として、ネコにｐＨ７. ２〜７. ４のリン酸ナ
トリウム１５０ｍＭを注射した。各グループには５匹の
ネコがいた。

【００５０】

【表６】

【００５１】得られた結果は、ネコにおいてプラスミド
ＤＮＡベースのＥＰＯ遺伝子療法を首尾よく使用できる
ことを示唆している。全てのＥＰＯ ＤＮＡ治療は、ヘ
マトクリットの有意な上昇を導いた。用量に関して言う
と、後脚１本につき１回ずつの２回の同体積の注射にお
いて１０ｍｌのリン酸ナトリウム中で投与された０.１m
g/ml の濃度のＤＮＡ１mgが、未処置のネコと比べた場
合に有意なヘマトクリット上昇を惹起することがわかっ
た。

【００５２】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> PFIZER PRODUCTS INC. <120> ERYTHROPOIETIN IN THE TREATMENT OF DOMESTIC AND LIVESTOCK ANIMALS FOR ANEMIA <130> PC10485A <140> <141> <160> 3 <170> PatentIn Ver. 2.0 <210> 1 <211> 192 <212> PRT <213> Canis familiaris <400> 1 Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Leu Leu Leu Leu Leu Ser Leu Leu 1 5 10 15 Leu Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu Ile 20 25 30 Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Ile Leu Glu Ala Arg Glu Ala 35 40 45 Glu Asn Val Thr Met Gly Cys Ala Gln Gly Cys Ser Phe Ser Glu Asn 50 55 60 Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Thr Trp Lys Arg Met 65 70 75 80 Asp Val Gly Gln Gln Ala Leu Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu Leu 85 90 95 Ser Glu Ala Ile Leu Arg Gly Gln Ala Leu Leu Ala Asn Ala Ser Gln 100 105 110 Pro Ser Glu Thr Pro Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser Ser Leu 115 120 125 Arg Ser Leu Thr Ser Leu Leu Arg Ala Leu Gly Ala Gln Lys Glu Ala 130 135 140 Met Ser Leu Pro Glu Glu Ala Ser Pro Ala Pro Leu Arg Thr Phe Thr 145 150 155 160 Val Asp Thr Leu Cys Lys Leu Phe Arg Ile Tyr Ser Asn Phe Leu Arg 165 170 175 Gly Lys Leu Thr Leu Tyr Thr Gly Glu Ala Cys Arg Arg Gly Asp Arg 180 185 190

【００５３】 <210> 2 <211> 192 <212> PRT <213> Felis catus <400> 2 Met Gly Val Arg Glu Cys Pro Ala Leu Leu Leu Leu Leu Ser Leu Leu 1 5 10 15 Leu Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu Ile 20 25 30 Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Ile Leu Glu Ala Arg Glu Ala 35 40 45 Glu Asn Val Thr Met Gly Cys Ala Glu Gly Cys Ser Phe Ser Glu Asn 50 55 60 Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Thr Trp Lys Arg Met 65 70 75 80 Asp Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu Leu 85 90 95 Ser Glu Ala Ile Leu Arg Gly Gln Ala Leu Leu Ala Asn Ser Ser Gln 100 105 110 Pro Ser Glu Thr Pro Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser Ser Leu 115 120 125 Arg Ser Leu Thr Ser Leu Leu Arg Ala Leu Gly Ala Gln Lys Glu Ala 130 135 140 Thr Ser Leu Pro Glu Ala Thr Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Phe Thr 145 150 155 160 Val Asp Thr Leu Cys Lys Leu Phe Arg Ile Tyr Ser Asn Phe Leu Arg 165 170 175 Gly Lys Leu Thr Leu Tyr Thr Gly Glu Ala Cys Arg Arg Gly Asp Arg 180 185 190

【００５４】 <210> 3 <211> 166 <212> PRT <213> Sus scrofa <400> 3 Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Ile 1 5 10 15 Leu Glu Ala Arg Glu Ala Glu Asn Val Thr Met Gly Cys Ala Glu Gly 20 25 30 Cys Ser Phe Ser Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe 35 40 45 Tyr Thr Trp Lys Arg Met Asp Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp 50 55 60 Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Ile Leu Arg Gly Gln Ala Leu 65 70 75 80 Leu Ala Asn Ser Ser Gln Pro Ser Glu Thr Pro Gln Leu His Val Asp 85 90 95 Lys Ala Val Ser Ser Leu Arg Ser Leu Thr Ser Leu Leu Arg Ala Leu 100 105 110 Gly Ala Gln Lys Glu Ala Thr Ser Leu Pro Glu Ala Thr Ser Ala Ala 115 120 125 Pro Leu Arg Thr Phe Thr Val Asp Thr Leu Cys Lys Leu Phe Arg Ile 130 135 140 Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Thr Leu Tyr Thr Gly Glu Ala 145 150 155 160 Cys Arg Arg Gly Asp Arg 165

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、イヌＥＰＯの完全アミノ酸配列を示
す。下線の付されたアミノ酸は、イヌのシグナル配列を
表わし、残りのアミノ酸は成熟イヌＥＰＯの構造配列を
表わす。

【図２】図２は、ネコＥＰＯの完全アミノ酸配列を示
す。下線の付されたアミノ酸は、イヌのシグナル配列を
表わし、残りのアミノ酸は成熟イヌＥＰＯの構造配列を
表わす。

【図３】図３は、成熟したブタのＥＰＯの完全構造アミ
ノ酸配列を示す。

【図４】図４は、ヘマトクリットの変化の百分率の経時
変化を示すグラフである。

【図５】図５は、ヘマトクリットの変化の百分率の経時
変化を示すグラフである。

【図６】図６は、ヘマトクリットの経時変化を示すグラ
フである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 7/06 Ｃ０７Ｋ 14/505 43/00 １７１ Ａ６１Ｋ 37/02 Ｃ０７Ｋ 14/505 37/24 Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (72)発明者 マイケル ジョージ シェパード アメリカ合衆国，コネチカット 06359, ノース ストニングトン，キングスウッド ドライブ 29

Claims (30)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 イヌの貧血症を治療する方法において、
   このイヌに発現ベクターを投与する段階を含む方法であ
   って、 （ａ）前記発現ベクターが、イヌエリスロポイエチンを
   コードするヌクレオチドから本質上成る個別のＥＰＯ配
   列を含み； （ｂ）前記発現ベクターがさらに、前記ＥＰＯ配列要素
   に作用可能に連結されたプロモーター要素を含んで成
   り；そして （ｃ）前記発現ベクターが、前記イヌのヘマトクリット
   の統計的に有意な増加をひき起こすのに充分な用量で投
   与される；治療方法。
2. 【請求項２】 前記発現ベクターがトランスフェクショ
   ン促進物質を含まない形で投与される、請求項１に記載
   の方法。
3. 【請求項３】 前記発現ベクターがカチオン性脂質と複
   合されている、請求項１に記載の方法。
4. 【請求項４】 前記発現ベクターがリポソームの一部と
   して投与される請求項１に記載の方法。
5. 【請求項５】 前記ベクターが、約０. ０１mg/ml 〜１
   ０mg/ml の間の濃度で投与される、請求項１に記載の方
   法。
6. 【請求項６】 前記発現ベクターが約０. １mg/ml の濃
   度で投与される、請求項１に記載の方法。
7. 【請求項７】 前記ベクターが筋内注射を用いて投与さ
   れる、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
8. 【請求項８】 非経口投与のための薬学組成物におい
   て、 （ａ）発現ベクター；及び（ｂ）この発現ベクターが中
   で溶解し又は懸濁する水性溶媒；を含んで成り、 ｉ）前記発現ベクターが、イヌのエリスロポイエチンを
   コードするヌクレオチドから本質上成る個別のＥＰＯ配
   列を含み；そして ii）前記発現ベクターがさらに、前記ＥＰＯ配列要素に
   作用可能に連結されたプロモーター要素を含んで成る；
   薬学組成物。
9. 【請求項９】 前記発現ベクターが約０. ０１mg/ml 〜
   １０mg/ml の間の濃度で存在する、請求項８に記載の薬
   学組成物。
10. 【請求項１０】 前記発現ベクターが約０. １mg/ml の
    濃度で存在する、請求項８に記載の薬学組成物。
11. 【請求項１１】 ネコの貧血症を治療する方法におい
    て、このネコに発現ベクターを投与する段階を含む方法
    であって、 （ａ）前記発現ベクターが、ネコエリスロポイエチンを
    コードするヌクレオチドから本質上成る個別のＥＰＯ配
    列を含み； （ｂ）前記発現ベクターがさらに、前記ＥＰＯ配列要素
    に作用可能に連結されたプロモーター要素を含んで成
    り；そして （ｃ）前記発現ベクターが、前記ネコのヘマトクリット
    の統計的に有意な増加をひき起こすのに充分な用量で投
    与される；治療方法。
12. 【請求項１２】 前記発現ベクターがトランスフェクシ
    ョン促進物質を含まない形で投与される、請求項11に記
    載の方法。
13. 【請求項１３】 前記発現ベクターがカチオン性脂質と
    複合されている、請求項11に記載の方法。
14. 【請求項１４】 前記発現ベクターがリポソームの一部
    として投与される請求項11に記載の方法。
15. 【請求項１５】 前記ベクターが、約０. ０１mg/ml 〜
    １０mg/ml の間の濃度で投与される、請求項11に記載の
    方法。
16. 【請求項１６】 前記発現ベクターが約０. １mg/ml の
    濃度で投与される、請求項11に記載の方法。
17. 【請求項１７】 前記ベクターが筋内注射を用いて投与
    される、請求項11〜16のいずれか１項に記載の方法。
18. 【請求項１８】 非経口投与のための薬学組成物におい
    て、 （ａ）発現ベクター；及び（ｂ）この発現ベクターが中
    で溶解し又は懸濁する水性溶媒；を含んで成り、 ｉ）前記発現ベクターが、ネコのエリスロポイエチンを
    コードするヌクレオチドから本質上成る個別のＥＰＯ配
    列を含み； ii）前記発現ベクターがさらに、前記ＥＰＯ配列要素に
    作用可能に連結されたプロモーター要素を含んで成る；
    薬学組成物。
19. 【請求項１９】 前記発現ベクターが約０. ０１mg/ml
    〜１０mg/ml の間の濃度で存在する、請求項18に記載の
    薬学組成物。
20. 【請求項２０】 前記発現ベクターが約０. ０１mg/ml
    の濃度で存在する、請求項18に記載の薬学組成物。
21. 【請求項２１】 ブタの貧血症を治療する方法におい
    て、このブタに発現ベクターを投与する段階を含む方法
    であって、 （ａ）前記発現ベクターが、ブタエリスロポイエチンを
    コードするヌクレオチドから本質上成る個別のＥＰＯ配
    列を含み； （ｂ）前記発現ベクターがさらに、前記ＥＰＯ配列要素
    に作用可能に連結されたプロモーター要素を含んで成
    り； （ｃ）前記発現ベクターが、前記ブタのヘマトクリット
    の統計的に有意な増加をひき起こすのに充分な用量で投
    与される；治療方法。
22. 【請求項２２】 前記発現ベクターがトランスフェクシ
    ョン促進物質を含まない形で投与される、請求項21に記
    載の方法。
23. 【請求項２３】 前記発現ベクターがカチオン性脂質と
    複合されている、請求項21に記載の方法。
24. 【請求項２４】 前記発現ベクターがリポソームの一部
    として投与される請求項21に記載の方法。
25. 【請求項２５】 前記ベクターが、約０. ０１mg/ml 〜
    １０mg/ml の間の濃度で投与される、請求項21に記載の
    方法。
26. 【請求項２６】 前記発現ベクターが約０. １mg/ml の
    濃度で投与される、請求項21に記載の方法。
27. 【請求項２７】 前記ベクターが筋内注射を用いて投与
    される、請求項21〜26のいずれか１項に記載の方法。
28. 【請求項２８】 非経口投与のための薬学組成物におい
    て、 （ａ）発現ベクター；及び（ｂ）この発現ベクターが中
    で溶解し又は懸濁する水性溶媒；を含んで成り、 ｉ）前記発現ベクターが、ブタのエリスロポイエチンを
    コードするヌクレオチドから本質上成る個別のＥＰＯ配
    列を含み； ii）前記発現ベクターがさらに、前記ＥＰＯ配列要素に
    作用可能に連結されたプロモーター要素を含んで成る；
    薬学組成物。
29. 【請求項２９】 前記発現ベクターが約０. ０１mg/ml
    〜１０mg/ml の間の濃度で存在する、請求項28に記載の
    薬学組成物。
30. 【請求項３０】 前記発現ベクターが約０. １mg/ml の
    濃度で存在する、請求項28に記載の薬学組成物。