CN102209726A - 具有细胞穿透性、序列特异性和核酸水解性的抗体、其制备方法及包含所述抗体的药物组合物 - Google Patents

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Abstract

公开了一具有细胞穿透性，碱基序列特异性和核酸水解性的抗体、其制备方法及包含所述抗体的药物组合物。所述抗体可通过改变无底物特异性的细胞穿透性，核酸水解性抗体的特定位点制备，不改变抗体的核酸水解能力并赋予其序列特异性。当该抗体自身渗透到细胞内或在细胞内异位表达时，其与单链或双链目标核酸特异性结合并水解核酸，因此下调了目标基因的表达。

Description

具有细胞穿透性、序列特异性和核酸水解性的抗体、其制备方法及包含所述抗体的药物组合物
技术领域
本发明涉及一种具有细胞穿透能力和碱基序列特异性的核酸水解性抗体，其作为克服传统siRNA技术存在问题的新一代基因沉默技术。更特别的是，本发明涉及一种核酸水解性抗体，其通过改变无底物特异性的具有细胞穿透性、核酸水解性抗体的特定位点制备，而不改变抗体的核酸水解能力并赋予其序列特异性，当其自身渗透到细胞内或在细胞内异位表达时，其与单链或双链目标核酸特异性结合并水解核酸，从而使目标基因的表达下降。本发明同样涉及一种该抗体的制备方法及包含该抗体的药物组合物。
背景技术
在分子生物学的中心法则中，主要有三类生物聚合物起重要作用：DNA、RNA和蛋白质。需要某些蛋白质和核糖体的帮助才能将DNA转录为RNA。这些蛋白质在特异位点与DNA结合以开始转录。转录得到的RNA在核糖体内翻译成蛋白质。检查蛋白质产物具有哪些功能的典型方法包括从生物系统中去除该蛋白质。生物体具有和不具有目标蛋白质所表现的不同解释了该蛋白质在生物系统中起的作用。然而，很难控制目标蛋白质在生物体内随意地表达水平。最近，已经建立了各种能够特异性识别并水解目标RNA（包括mRNA）特定区域的控制蛋白质表达的以核酸为基础的方法，其包括反义寡聚核苷酸、RNA干扰（RNAi）、核酶、DNA酶等（Scherer 等, Nature Biotechnology, 21:1457-1465, 2003；Tafech 等, Current Medical Chemistry, 13:863-881, 2006）。尤其是，发现于1998年的RNA干扰，现在随时可获得，且与现有技术相比更容易实现RNA敲除（Fire A 等, Nature, 391:806-811, 1998；Scherer 等, Nature Biotechnology, 21:1457-1465, 2003）。所谓的siRNA（小分子干扰RNA），21-23碱基长度的双链（ds）RNA，是RNA干扰的核心。这些有特定序列的小分子RNA，不管其产生于内部还是来自于外部转移，能结合并水解特异性mRNA以下调目标蛋白质在细胞内的表达（称为基因敲除）。虽然其原理的建立还不到10年，但siRNA技术是目前在降低植物/动物细胞中蛋白质表达水平方面应用最广泛的。然而，RNA干扰的实际应用存在几个问题。一个典型的例子是脱靶效应，在当即使21碱基长度的RNA，不能与目标配对时发生。此外，如果siRNA与目标只有1或2个碱基对不同时，则siRNA诱导的基因敲除显著降低或不引起干扰。此外，RNA干扰可能在一靶基因的特定区域有效运作，但在多数例子中在其他区域不工作。此外，包括不需要的免疫反应，不恰当的细胞运送，核酸酶敏感性等作为siRNAs实际应用中的抑制因子（Scherer LJ 等, Nat Biotechnol, 21:1457-1465, 2003；Tafech A 等, Curr Med Chem, 13:863-881, 2006）。
1957年首次发现于系统性红斑狼疮（SLE）病人的血清中有核酸（DNA/RNA）结合抗体，其是一种自身抗体，在自身免疫性疾病的患者或小鼠中被检测到（Robbins W 等, Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 96(3): 575-9, 1957）。许多抗核酸自身抗体实际上发现于系统性红斑狼疮或多发性硬化症患者中。通常，它们与缺乏序列特异性的核酸结合（Jang YJ 等., Cell.Mol.Life Sci., 60(2):309-20, 2003；Marion TN 等, Methods 11:3-11, 1997）。据报道，SLE患者和SLE小鼠模型MRL-lpr/lpr 的血清具有高浓度的抗核酸抗体，并且主要在自身免疫性疾病的患者中进行自身抗体的研究（Dubrivskaya V等, Biochemistry (Mosc), 68(10):1081-8, 2003）。
在1992年，首次发现了一种能够水解核酸的核酸结合抗体（Shuster A 等, Science, 256 (5057):665-7, 1992）。从那时起，生物化学研究集中于此（Nevinsky G 等, J. Immunol. Methods, 269(1-2):235-49, 2002）。因此，核酸水解抗体的研究在生物化学方面处于领先，但是却仍然处于抗体工程方面的初级阶段，如在各种应用中抗体稳定性、亲和力和特异性仍需改善（Cerutti M 等, J. Biol. Chem., 276(16): 12769-73, 2001；Kim YR 等, J. Biol. Chem., 281(22): 15287-95, 2006）。
多份报告中公开了抗体与核酸的结合及非抗体蛋白与核酸的结合。首先，锌指结构，非抗体蛋白，是自然发生的DNA结合基序的代表，如亮氨酸拉链和螺旋-转角-螺旋（Jamieson A 等, Nat. Rev. Drug Discov., 2(5):361-8, 2003）。锌指结构，由大约20-30个氨基酸残基组成的小蛋白结构域，使锌离子(Zn2+)与4个不同方向的2个半胱氨酸和2个组氨酸残基的常见组合物配位结合。作为DNA实际结合的原因，锌指结构的α-螺旋与DNA的大沟结合且与3个碱基相互作用。DNA三级结构的不同取决于锌指结构的氨基酸序列。因此，当α-螺旋改变但不发生构象变化时，锌指结构可识别不同于之前的新碱基序列。自1999年，成功改变了16 GNN三级结构的特定指结构（Segal D 等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96(6):2758-63, 1999），开展了广泛研究以建立改变底物特异性的方法（Caroll D 等, Nat. Protoc. 1(3):1329-41, 2006）。因为，它们只有结合核酸的能力，然而，改性后的锌指结构还需要用于与核酸水解酶结合的其他改变（Mani M. 等, Biochem. Biophys. Res. Commun., 334(4):1191-7, 2005）。
第二种方法是一种经验方法，其充分利用人乳头状瘤病毒（HPV）E2蛋白（E2C）的DNA结合域与靶DNA结合（M. Laura 等, J. Bio. Chem., 276(16): 12769-73, 2001）。将DNA-E2C复合物注入小鼠，通过体细胞高频突变产生抗DNA抗体。在这方面，小鼠将DNA识别为抗原。为此，首先，DNA-蛋白（E2C）复合物通过内部腹腔注射进入小鼠以引起免疫反应。当DNA-E2C复合物在一定时间内被重复注射以增强免疫应答时，通过体细胞高频突变产生了注入的DNA-E2C复合物DNA的特异性抗体。扩增后，从小鼠中分离所产生的抗体。从这些能够与DNA特异性结合的分离物中，通过使其与目的DNA作用选择对DNA亲和性最高的抗体。
一个合理设计提供了描述抗体与核酸结合的第三种方法。在这种方法中，使用人类γ-B-晶状体的β-折叠，通过根据结构和序列分析选择的溶剂暴露氨基酸残基的不规则分布，产生一通用的结合位点 （Hilmar E. 等, J. Mol. Biol., 372:172-85, 2007）。作为一般规则，抗体被结构性地分为阅读框和灵活的、序列可变的CDRs（互补性决定区）。CDRs的灵活性允许抗体与抗原形成诱导契合。高特异性和亲和性的另一个机理是——锁钥模型。在这方面，因为蛋白质已经形成一互补结构以维持与底物的高亲和性，所以其能维持重要的抗体稳定性并在结合时构象不发生改变，因此能与底物更紧密地结合（Jackson R. 等, Protein Sci.,8:603-13, 1999）。
因此，蛋白质工程和文库筛选的近期研究趋势从互补性决定区转移到阅读框。实际上，首先，采用合理设计将功能性锌结合位点引入到哺乳动物血清视黄醇结合蛋白β-筒（β-barrel）的表面（Muller H. 等, Biochemistry, 33: 14126-35,1994）。其次，源自里氏木霉CBH（纤维二糖水解酶）Cel7A的纤维素结合域的β-折叠通过突变被赋予结合活性（Lehtio J. 等, Proteins: Struct. Funct. Genet., 41:316-22, 2000）。另一项研究是关于一由两个反向平行的α-螺旋和一个β-转角组成的锚蛋白重复蛋白（Binz H. 等, J.Mol.Biol., 332:489-503, 2003）。
已知通过靶向特定基因以降低mRNA水平，从而下调编码的蛋白质表达的基因沉默是基因功能分析的极为重要工具和包括癌症和病毒感染的人类疾病的有力的治疗策略。传统的基因沉默技术通常是基于核酸与单链核酸互补以抑制mRNA的翻译的能力（Scherer LJ 等, Nat Biotechnol, 21:1457-65, 2003；Tafech A 等, Curr Med Chem, 13:863-81, 2006）。其中包括代表性的siRNA（小分子干扰RNA）。然而，siRNA具有缺少细胞穿透性的缺点，由于RNA酶的敏感性造成的低稳定性，可能产生脱靶，导致免疫原性。
如上所述，传统的基因沉默技术如应用siRNA能引起特定基因在表达水平的下降，但是需要能够水解核酸的其它的改性，以这种方式，其与核酸酶水解酶共轭。
目前销售的药物和当前研究下的药物开发是以小分子，蛋白质和单克隆抗体为基础的。大多数被设计为能与可被控制活性而引起药效的蛋白质结合。尤其是，几乎所有的单克隆抗体和蛋白都靶向膜蛋白或胞外蛋白。尽管许多不同的基因与多种疾病相关，但迄今为止药物开发一直关注于靶向蛋白，产生数量非常有限的药物。如果开发的药物可在RNA或DNA水平控制疾病，而不是蛋白质水平，其能够靶向胞内RNA或DNA，可覆盖更广泛的疾病。此外，能够渗透进入细胞并识别特定碱基序列的核酸酶水解抗体极有可能发展为下一代基因沉默和抗病毒因子。
因此，需要无外部蛋白运输系统时自身能够渗透进入细胞的抗体，且能与特定序列的单链/双链靶核酸特异性结合并使其水解。
发明内容
技术问题
本发明进行了关于基因沉默的密集和深入的研究，以克服现有技术所遇到的问题为目标，结果发现了一种无底物特异性的细胞穿透性、核酸水解性抗体可通过改变特异位点而被赋予单链或双链目标的特异性且不改变其核酸水解性，当改性的抗体自身渗透进入细胞或在细胞内表达时，可与单链或双链核酸目标特异性结合并使其水解，因此使特定基因的表达下调。
解决方案
因此，本发明的一个目的在于提供一种能够渗透进入细胞，与特定碱基序列的单链或双链核酸靶标特异性结合并使其水解的核酸水解性抗体。
本发明的另一个目的在于提供一制备该核酸水解性抗体的方法。
本发明的再一个目的在于提供一包括该核酸水解性抗体的药物组合物。
附图说明
图1示意地示出了根据本发明的核酸水解性抗体（A）和特定碱基序列的单链或双链目标核酸的水解（B）。
图2是一过程示意图，其中，具有本发明序列特异性的核酸水解性抗体通过细胞渗透移位进入细胞质或通过转染细胞质内表达后，特异性识别并水解由外源物质（例如，病毒）携带的外源性靶基因或内源性靶mRNA，从而抑制病毒增殖或蛋白表达。
图3 示出了3D8 VL的三级结构（A）及c-(41~45位残基)，c'-(50~54位残基) 和 f-β-链(90~94位残基)的氨基酸序列和碱基序列，其构成野生型3D8 VL的推定的DNA/RNA识别位点和用于突变的NNB密码子（B）。
图4示出了基于3D8 VL 4M模板的核酸水解性抗体文库的构建(A)，通过电穿孔与酵母显示载体(pCTCON)共转化后该文库在酵母细胞表面的表达（B），以及该文库表达水平的流式细胞仪分析（C）。
图5示出了分离优先与来自酵母表面3D8 VL文库的两个单链DNA目标底物G18 (A)和Her218 (B)结合的3D8 VL变体的代表性筛选程序。
图6示出了3D8 VL野生型和通过18个碱基的目的单链DNA，G18 (4MG1-4MG6)和Her218 (4MH1-4MH5)选择的3D8 VL 4M变体的氨基酸序列比对，重点在于c-（41~45位残基），c'-（50~54位残基）和 f-β-链（90~94位残基）的15个随机位置。
图7示出了纯化的11个变体的SDS-PAGE分析数据（A），及代表性变体（4MG3、4MG5、4MH2）与3D8 VL野生型和4M 相比的体积排阻HPLC（B）和远紫外CD（圆形二色性）光谱（C）。
图8示出了用于分析11个变体的DNA水解活性（A）和4MG3、4MG5和4MH2的RNA水解活性（B）的琼脂糖凝胶电泳结果。
图9示出了作为16nM～2μM FRET底物 （A18, T18, C18, (G4T)3G3、Her218、 N18）的浓度函数的3D8 VL野生型和3D8 VL 4M及其变体（4MG3、4MG5、4MH2）的酶动力学绘制图。
图10示出了用于细胞内表达3D8 VL野生型和其变体(4MG3、4MG5)的质粒示意图，（A, pcDNA3.1），GFP （B, pEGFP-N1），GFP（C，G18 在pG18-EGFP中位于EGFP的N-末端上游），和EGFP (D，Her218 在pHer218-EGFP 中位于EGFP的N-末端上游）。
图11示出了选定的3D8 VL变体的靶标基因沉默活性，其在HeLa细胞中与携带EGFP的靶序列异位共表达。HeLa细胞是未转染的或由编码质粒的EGFP（完整EGFP，G18-EGFP或 Her218-EGFP）单独转染或与编码3D8 VLs（野生型，G18-选择性4MG3和4MG5，及 Her218-选择性4MH2）的质粒一起转染，如上所述，然后通过流式细胞仪（A），共聚焦荧光显微镜（B），免疫印迹（C，D）和RT-PCR （E，F）监测EGFP表达。
图12示出了Her2基因表达上的Her218碱基序列特异性，核酸水解性4MH2在HeLa细胞中的效果，其通过RT-PCR（A）进行mRNA水平分析，并通过免疫印迹（B）进行蛋白质表达水平分析。
图13示出了说明3D8 VL变体渗透进入活细胞并主要定位于细胞质中的数据。（A）野生型3D8 VL和其变体（4MG3、4MG5、4MH2）细胞内化进入人宫颈癌细胞（HeLa细胞）和人乳腺癌细胞（SK-BR3）的流式细胞仪数据。（B）HeLa细胞中3D8 VLs内化和亚细胞定位的共聚焦荧光显微镜。（C）分析可溶肝素或对野生型3D8 VL和其变体(4MG3、4MG5、4MH2)的细胞摄取特异性内吞作用抑制剂的预处理效果的流式细胞仪数据。
图14示出了细胞穿透性3D8 VL变体在HeLa细胞中表达外源靶标基因中的靶标基因沉默活性。HeLa细胞是未转染的或由编码EGFP 或G18-EGFP的质粒转染的，为未处理的或由野生型3D8 VL及G18-选择性4MG3和4MG5处理的，且通过流式细胞仪（A），RT-PCR（B）和免疫印迹（C）分析。Her2-阴性HeLa细胞是未转染的或由编码全长Her2基因的质粒转染，为未处理的或由3D8 VL野生型及Her218-选择性4MG2处理的。Her2表达通过RT-PCR（D）和免疫印迹（E）分析。
图15示出了通过MTT法（A）和流式细胞仪（B）分析用Her218特异性4MH2变体处理的Her2-过表达人类乳腺癌细胞（SK-BR-3， MDA-MB-231）或Her2-阴性人类宫颈癌细胞（HeLa细胞）的存活率。
图16示出了细胞穿透性Her218-选择性4MH2敲除Her2-过表达 SK-BR-3细胞中的内源性Her2表达。Her2表达通过流式细胞仪在细胞表面监测（A），通过RT-PCR在mRNA水平监测（B），并通过免疫印迹在蛋白质水平监测（C）。
实施本发明的最佳模式
根据其中一个方面，本发明涉及一种核酸水解性抗体，其具有细胞穿透性，且能特异性结合并水解特定碱基序列的单链或双链的靶核酸。
根据其中另一个方面，本发明涉及一种制备细胞穿透性、序列特异性和核酸水解性抗体的方法，其包括：
1）构建缺失底物特异性的细胞穿透性核酸水解性抗体模板的基因文库；
2）通过表面显示载体在细胞表面表达步骤1）构建的基因文库，以产生蛋白质文库；且
3）从步骤2）表达的蛋白质文库选择能与特定碱基序列的核酸目标特异性结合的变体。
根据其中另一个方面，本发明涉及一包括核酸水解性抗体的药物组合物。
以下，将对本发明进行详细叙述。
通过改变具有细胞穿透性但无底物特异性的核酸水解性抗体的特定区域作为抗体工程构建的结果，根据本发明的核酸水解性抗体被进一步赋予序列特异性。当其渗透进入细胞质或在胞内表达时，本发明的核酸水解性抗体能够特异性结合并水解特定碱基序列的单链或双链核酸目标以使特定基因的表达下调。
本发明设计的核酸水解性抗体具有SEQ ID NOS：14~24的氨基酸序列，优选为SEQ ID NOS：16、18和21。本发明核酸水解性抗体的碱基序列代表为SEQ ID NOS：25~35，优选为SEQ ID NOS：27、29和32。
本发明的核酸水解性抗体可以是全部片段或是一个功能性片段。整个抗体可是一个单体或两个或多个完整抗体相互结合成的多聚体，且包括整个IgG。本文中使用的关于抗体的术语“功能片段”意指具有重链可变区域和轻链可变区域的抗体片段，抗体片段可如整个抗体一样，识别大致相同的抗原表位。抗体功能片段的例子包括重链可变区域的单结构域、轻链可变区域的单结构域、单链可变片段(scFv)、(scFv)2、Fab、Fab'、F(ab')2、双链抗体和二硫键稳定可变片段(dsFv)，但不局限于此，优选为轻链可变区域的单链区域。
参照图1，本发明的核酸水解性抗体示意图说明其样式（A）及特定碱基序列的单链或双链靶标核酸的水解（B）。参照图2，显示了一过程示意图，其中，具有本发明序列特异性的核酸水解性抗体通过细胞渗透移位进入细胞质或通过转染细胞质内表达后，可特异性识别并水解由外源物质（例如，病毒）携带的外源靶基因或内源性靶mRNA，从而抑制病毒增殖或蛋白表达。
接下来，转向制备本发明的核酸水解性抗体的方法，如下以循序渐进的方式对其进行描述。
步骤1）是使用缺乏序列特异性的细胞穿透性、核酸水解性抗体作为模板合成一基因文库。因为该抗体能渗透进入细胞并水解核酸，但缺乏序列特异性，优选为3D8 VL 4M或其变体。3D8 VL的结构分析允许由c-，c'-和f-β-链组成的推定的核酸结合位点。这个推定的结合位点由简并NNB密码子（N=A/T/C/G，B=C/G/T）随机组合，在酵母细胞表面构建所有残基的突变库。
步骤2）是在细胞表面构建文库。扩增的3D8 VL基因通过电穿孔与显示载体共转化以在酵母细胞表面构建3D8 VL文库。本发明中使用的显示载体的例子包括噬菌体显示载体、细菌显示载体、核糖体显示载体、RNA显示载体和酵母细胞显示载体，但不局限于此。在本发明中，用酵母显示载体构建文库。文库可在酵母细胞表面很好地表达。
在步骤3）中，3D8 VL 4M抗体文库被靶标核酸序列筛选以选择可特异性结合的3D8 VL变体。在这方面，用5'-生物素化的靶标核酸分析抗体的特异亲和性。靶标核酸可是内源性或外源性的。优选地，内源性核酸可为编码在癌细胞中过度特定反应的蛋白质。优选的外源性核酸为病毒基因组核酸或编码病毒蛋白的核酸。更详细地，抗体库由5'-生物素化的靶标DNA（G18,，Her218）筛选，在此期间通过磁性细胞分选和流式细胞仪分析其相比较于非靶标核酸与各自靶标（G18,，Her218）的亲和力。在分析的基础上，选择与靶标（G18,，Her218）特异性强的变体。结果，六个变体，4MG1、4MG2、4MG3、4MG4、4MG5和4MG6被选择用于单链DNA靶标（G18），然而据观察，5个变体，4MH1、4MH2、4MH3、4MH4 和4MH5与单链DNA靶标（Her218）有较强亲和力。总共这11个变体分别具有SEQ ID NOS：14~24的氨基酸序列，优选为SEQ ID NOS：16(4MG3)，18(4MG5)和21(4MH2)。相应地，11个变体的碱基序列分别代表为SEQ ID NOS：25~35。因此，优选为SEQ ID NOS：27(4MG3)，29(4MG5) 和32(4MH2)。选择的变体被纯化，纯度大于90%，以具有二级结构的可溶解的单体存在。而且，相比较于非靶标，3D8 VL变体对于各自的靶标底物显现出10-100倍大的KD，4MH2对于Her218及4MG3和4MG5对于G18，因为对于靶标底物其亲和力大幅增加，但对于非靶标其保持不变。此外，与3D8 VL野生型和3D8 VL 4M相比，变异的抗体表现为底物降解率具有更高的Vmax值，更快的识别、特异性结合并水解靶标核酸序列。因此，根据本发明的变体可适应于具有序列特异性并保留了水解DNA和RNA的能力。
无G18或Her218靶标序列的EGFP（增强型绿色荧光蛋白）的表达水平既不受本发明变体的影响，也不受3D8 VL野生型的影响。同时，细胞与携带本发明3D8 VL变体的载体和携带N-末端有G18或Her218靶标序列的载体一起共转染比与3D8 VL野生型共转染表达的EGFP信号低得多。强烈建议在细胞内表达的变体水解携带靶标序列的mRNA，如G18-EGFP mRNA 和Her218-EGFP mRNA，从而降低GFP的表达水平。当在胞内表达时，突变为可识别靶标碱基序列的核酸水解性抗体能水解包含靶标碱基序列的mRNA，从而下调由mRNA编码的蛋白质的表达。本发明的变体已被证明当其在胞内移位表达时，具有序列特异性和核酸水解活性。
此外，本发明的变体被发现可渗透进入人类宫颈癌细胞(HeLa)和人类乳腺癌细胞(SK-BR3)，某种程度类上似于3D8 VL野生型。变体内化进入细胞继续行进到氯丙嗪预处理细胞抑制网格蛋白依赖型内吞作用和细胞松弛素D预处理细胞抑制大胞饮作用（macropinocytosis）相似的程度。相反地，变体的细胞穿透能力因为带正电荷的变体和带负电荷的细胞表面蛋白多糖（硫酸乙酰肝素）的电相互作用的干扰在具有肝素预处理的细胞上显著降低，或因为抑制小窝/脂筏内吞作用在甲基-β-环糊精(MβCD) 预处理的细胞上显著降低，证明变体是通过小窝/脂筏内吞途径进入细胞，并与细胞表面丰富的蛋白多糖发生电相互作用。
此外，根据本发明的变体显示了对于人类乳腺癌细胞（SK-BR3， MDA-MB-231）或人类宫颈癌细胞（HeLa）的低细胞毒性。尤其是，Her2-过表达SK-BR-3或MDA-MB-231 细胞的存活率由于带有Her2序列特异性的核酸水解性4MH2的强细胞毒性而显著降低。该结果归因于4MH2下调Her2表达，与以前的认为随着Her2表达的下降Her2-过表达细胞存活率降低的报告相一致。此时，观察到细胞死亡显示出凋亡模式（阳性膜联蛋白V）。
如上所述，根据本发明的核酸水解性抗体通过改变无底物特异性的细胞穿透性、核酸水解性抗体的特定位点制备，赋予其序列特异性且不改变其核酸水解能力。当该设计的核酸水解性抗体自身渗透进入细胞或在胞内表达时，其与单链或双链核酸靶标特异性结合并将其水解，从而下调特定基因的表达。因此，根据本发明的核酸水解性抗体可是如siRNA传统基因沉默技术的另一选择或替代技术。尤其是，本发明的核酸水解性抗体能下调靶标蛋白的表达或通过特异性结合并水解RNA或DNA下调靶标基因组在RNA或DNA水平的增殖，但不在蛋白质水平上，所以可用于癌症或病毒疾病的治疗。因此，本发明的核酸水解性抗体可开发为新的带有进入市场预期的抗癌药物或抗病毒药物。
根据其另一方面，本发明涉及一药物组合物，其包括单独的作为一种活性成分的本发明核酸水解性抗体或包括该抗体与至少一种传统抗癌或抗病毒成分的组合。
用于实际给药中，除了活性成分之外，该药物组合为可能包括至少一种药物学上可接受的赋形剂。药物学上可接受的赋形剂的例子包括生理盐水、无菌水、林格氏液、缓冲盐水、葡萄糖溶液、麦芽糊精溶液、甘油、乙醇等。可选地，其他典型的添加剂，如抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂等可加入本发明的药物组合物。可使用稀释剂、分散剂、表面活性剂、粘合剂和/或润滑油将该组合物配制成如水溶液、悬浮液、乳化液等注射液、丸剂、胶囊、颗粒或片剂。此外，该组合物可根据本领域已知的方法或雷明顿药物科学（最新的）（Mack出版公司，Easton PA）上公开的方法配制成合适的剂型。
本发明的组合物可为口服地或非口服地（静脉、皮下、内腹部或局部）给药。其剂量根据病人的体重、年龄、性别、健康状况和饮食，给药时间，给药途径，排泄率，疾病严重程度等变化。核酸水解性抗体的日给药量约为0.01~10mg/kg，优选为日剂量为1~5mg/kg，一天一次或多次给药。
为了抑制致病蛋白的表达或病毒基因的增殖，本发明的组合物可单独使用或与手术、荷尔蒙治疗、化学治疗或生物反应调节剂相结合。
具体实施方式
将通过以下用于说明的实施例对本发明进行更好的理解，但其并不旨在限制本发明。
实施例1: 3D8 VL 4M 抗体的设计
1. 3D8 VL 4M 抗体在酵母细胞表面的表达
将3D8 VL抗体设计为序列特异性，核酸水解性抗体的第一步是在酵母细胞表面显示该抗体。该抗体为3D8 VL 4M，其与野生型（WT）相比，具有更好的DNA/RNA水解活性。3D8 VL 4M具有4个突变体—Q52R、Y55H、W56R和H100A。为了能够在酵母细胞表面表达3D8 VL 4M抗体，将3D8 VL 4M基因从大肠杆菌表达载体pET23M 3D8 VL 4M亚克隆进入酵母细胞表面显示载体pCTCON。为了扩增3D8 VL4M基因，设计了具有NheI/BamHI识别位点的引物对。通过碱基测序分析确定pCTCON中的3D8 VL 4M基因的准确插入，接着将重组载体转化到酿酒酵母EBY100。转化的菌落在选择性SD-CAA培养基（20g/L葡萄糖，6.7g/L无氨基酸的酵母氮基，5.4g/L Na2HPO4，8.6g/L NaH2PO4·H2O，5g/L酪蛋氨基酸）中在30℃下振荡培养20小时。通过在选择性SG-CAA培养基（20g/L葡萄糖，6.7g/L无氨基酸的酵母氮基，5.4g/L Na2HPO4，8.6g/L NaH2PO4·H2O，5g/L酪蛋氨基酸）中30℃下振荡培养20小时完成蛋白质的表达。使用FACS测定目标蛋白质的细胞表面表达。通过检测C端myc标签能够识别酵母细胞表面的3D8 VL 4M表达。使用抗-myc9E10抗体（Sigma，USA）作为初级抗体和FITC标记的羊抗鼠IgG（Sigma，USA）作为第二抗体对该表达进行定性和定量分析，该第二抗体用于识别初级抗体的恒定区。为了确定细胞表面表达和3D8 VL文库的目标底物结合水平，大约有2x106酵母细胞用生物素标记的核酸在50μLTris缓冲液（25mM Tris，137mM NaCl，2.7mM KCl，0.1% BSA）被处理，然后用抗myc抗体处理，并用Tris缓冲液洗涤，用FITC标记的羊抗鼠IgG标记。在BD FACS Calibur（Becton Dickinson, USA）上进行定量分析，其示出了在酵母细胞表面有高表达水平的3D8 VL 4M。
模式序列的选择
选择一模式序列用于将3D8 VL 4M抗体修饰进入一有序列特异性的变体中。在1中使用的生物素化核酸用作模式序列。相应的序列为人类表皮生长因子-2（Her2/ErbB2），其已知在乳腺癌细胞中过表达并且因此与癌细胞的生长和转移有关。在整个Her2序列中，只有18个残基，对应的位置为2391-2408，确定为5'-AAT TCC AGT GGC CAT CAA-3'，这些被用于抗体工程，并且被称为Her218。另一个模式序列，称为G18，确定为5'-GGG GGG GGG GGG GGG GGG-3'，其也被用于模式目标底物中。
3D8 VL 野生型和3D8 VL 4M的氨基酸序列分别为SEQ ID NOS：1和2。它们各自相应的碱基序列分别用SEQ ID NOS：3和4表示。
实施例2: 3D8 VL 4M抗体文库的构建
观察到3D8 VL 4M在酵母细胞表面高水平表达之后，构建3D8 VL 4M文库。为了产生能够特异性的结合并水解特定碱基序列的变体，文库基于3D8 VL 4M的模板进行构建。首先，分析3D8 VL的结构以确定由c-，c'-和f-β-链构成的推定的核酸结合位点。设计其可以随机地在c-(41~45位残基)，c'- (50~54位残基)和f-β-链 (90~94位残基)用简并NNB密码子（N=A/T/C/G，B=C/G/T）靶定突变体残基以在酵母细胞表面产生文库。因为3D8 VL并不是所有的残基都突变，使用4M作为模板和突变引物（其某些残基突变）进行重叠PCR构建酵母表面显示的基因文库。用于文库构建的引物（1F、2R、3R、4F、5R、6F、7R）的碱基序列分别为SEQ ID NOS：5~11。在NNB密码子中，N代表等摩尔的A、T、C和G（各25%）的核酸混合物，B代表等摩尔C、G和T的核酸混合物（各33%）。NNB密码子是所有20种具有2.1%比率终止密码子的氨基酸密码子的组合。
扩增的文库与酵母表面显示载体一起通过同源重组转化到酵母细胞中。为此，使用电穿孔技术将扩增的基因组文库（10 μg/mL）和酵母表面显示载体（pCTCON，Colby 等，Methods enzymol，388:248-258）（1 μg/mL）引入酵母细胞中以在酵母细胞表面显示文库（Lee HW 等, Biochem Biophys Res Commun, 343:896-903, 2006；Kim YS 等, Proteins: structure, function, and bioinformatics, 62:1026-1035, 2006）。文库基因以总量300μg制备，同时使用载体的量为30μg。通过在选择性琼脂平板上将连续稀释转化的细胞倒平板，测定的3D8 VL 4M文库大小约为2×108。
使用FACS定量分析文库的表达。因为任何在构建中发生的问题都不允许文库基因的正常表达。FACS分析同样也可以用于检测是否正确构建文库。
图3示出了3D8 VL (A)的三级结构和氨基酸序列以及c- (41~45位残基)，c'- (50~54位残基)和 f-β-链 (90~94位残基)的碱基序列，其构成了3D8 VL野生型的推定的DNA/RNA识别位点和用于突变体(B)的NNB密码子。
参照图4，以下的示意图示出了3D8 VL 4M (A) 的模板上核酸水解性抗体的文库构建，在通过电穿孔（B）将酵母显示载体共转移和用FACS（分析文库的表达水平（C）之后进行酵母细胞表面的文库表达。
在构建体文库中的突变体频率如下表1所示：
[表1]
Figure 229916DEST_PATH_IMAGE002
如图4所示，基于3D8 VL 4M (A)模板构建的文库正常表达，表示该文库在酵母细胞表面很好地显示。
实施例3: 从3D8 VL 4M文库中选择靶序列的特异性变体
1.使用竞争剂筛选3D8 VL 4M文库
使用MACS和FACS筛选两种对抗5'-生物素化DNA的构建的文库。在高盐浓度（0.3M）下进行MACS和FACS筛选以排除非特异性粘合剂，其通过静电作用与DNA磷酸骨架相互作用。为了确保选择的3D8 VL变体将特异性地结合到给定的目标序列上，将非生物素化的非靶竞争剂（DNA）加入到目标底物中。N18 DNA用作Her218的竞争剂。为了检测选择性地结合到G18的克隆子，在0.3M浓度的NaCl下，将A18, T18 和C18三种类型的DNA用作竞争剂。5'-生物素化底物（G18，Her218）的碱基序列用于筛选特异于靶碱基序列的变体，所述靶碱基序分别用SEQ ID NOS：12~13表示。
图5示出了用于从酵母表面显示3D8 VL文库中，分离优选与两个单链DNA目标底物G18 (A) 和Her218 (B)结合的3D8 VL变体的代表性筛选程序。
如图5所示，随着筛选的轮数的增加，特异性结合靶序列的变体增加。发现每一轮筛选增加的变体具有对靶序列的高亲和性，但对非靶序列具有低亲和性。
结合特异性的高亲和性变体的分析
用FACS分析结合靶标（G18，Her218）和非靶标的变体的之后，选择了11种对抗单链DNA靶标（G18，Her218）的变体：抗单链DNA靶标G18的4MG1、4MG2、4MG3、4MG4、4MG5和4MG6，抗单链DNA靶标Her218的4MH1、4MH2、4MH3、4MH4和4MH5。这11种变体的氨基酸序列分别用SEQ ID NOS：14~24表示，相应的碱基序列用SEQ ID NOS：25~35表示。
通过FACS分析选择的11种变体特异性结合目标底物（G18，Her218）和非靶标的情况。筛选与文库重合的数据，对于它们的靶单链DNA底物（G18，Her218）而言，它们的亲和性高，但是对于非靶底物亲和性低。
为了检测11种变体的序列，在纯化和扩增之后，对11个携带有突变体的质粒进行碱基序列分析。参照图6，11个变体示出了它们的c- (41~45位残基)，c'- (50~54位残基)和 f-β-链 (90~94位残基)的碱基序列。
实施例 4 :选择的变体的表达、纯化及HLPC和CD分析
为了纯化实施例3中可溶形式的选择的变体，首先进行的实验是用酵母和大肠杆菌表达载体将它们进行表达。因为变体在酵母细胞表面的高表达水平，它们首先被亚克隆进入酵母表达载体中的表达框内，接着转化进酿酒酵母2805菌株。与表面表达形成对比，在酵母菌株中它们没有很好地表达。因此使用大肠杆菌BL21（DE3）作为表达系统。尽管在大肠杆菌中高水平表达，选择的变体没有以可溶性成分纯化。几乎所有的变体主要在不可溶形式的包涵体内表达。因此，包涵体形式的蛋白质被纯化并且进行再折叠（Lee SH 等, Protein Science, 15:304-313, 2006）。
通过SDS-PAGE测定纯化的11个变体的纯度，同时进行HPLC以检查从包涵体中纯化后的变体是否以可溶的单体存在。此外，根据本发明的抗体文库设计为具有在阅读框内的突变体，但是其不位于CDR区，其不像典型的抗体文库。因此，使用远紫外CD（圆二色性）光谱检测选择变体的二级结构。
参照图7，给出了纯化的11个变体的SDS-PAGE (A)、HPLC (B)和远紫外CD光谱(C)的数据。
如图7所示，用SDS-PAGE (A)测定后发现所有的11种变体纯度都大于90%。变体（4MG3、4MG5和4MH2）的主要HPLC峰值与3D8 VL 野生型和3D8 VL 4M的峰值在相同位置，其表明大多数纯化的蛋白质以可溶形式的单体(B)存在。至于二级结构，变体4MG3、4MG5和4MH2示出的远紫外CD光谱与3D8 VL 野生型和3D8 VL示出的光谱类似。
实施例5 : 选择的变体的核酸亲和性与核酸水解活性
1.变体的核酸亲和性
使用Biacore2000对选择的变体进行SPR分析。评估选择的变体和3D8 VL野生型对于靶标（G18）和非靶标的特异性与亲和性。
结果总结在下表2中。
[表2]
Figure 271690DEST_PATH_IMAGE004
如表2所示，变体对于靶标和非靶标的亲和性显示了极大的不同，然而野生型和4M在序列间没有显著的差异。从以3D8 VL 4M为模板构建的文库中选择的变体极大地改进了对于靶标Her218和G18的亲和性，但是仍旧没有改变对非靶标的亲和性，它们之间的亲和性大约有10~100倍的差异，这表明本发明的变体被修饰以特异性的结合靶标。
选择的变体的核酸水解活性
用琼脂糖凝胶电泳分析纯化的变体的核酸水解活性。使用pUC19质粒作为底物。用小量制备试剂盒进行纯化（Intron Inc., Korea）。大于95%的纯化的pUC19质粒以超螺旋质粒的形式在0.7%的琼脂糖上成像。在含有2 mM MgCl2或50 mM EDTA的的TBS（Tris缓冲盐水）上进行质粒底物与变体之间的水解反应。在所有的水解反应中，用TBS的NaCl将离子强度固定在150 mM。抗体与核酸在37℃下培养1小时。培养之后，反应混合物在37℃下用胰蛋白酶（20μg/mL） （Sigma，USA）处理1小时，从而防止发生3D8抗体-结合核酸残留在琼脂糖凝胶电泳的上部位置的现象。在0.7%的琼脂糖凝胶上电泳之后，样品用溴化乙锭染色。
同样，将一些变体用于检测RNA水解活性。三种变体4MG3、4MG5和4MH2与3D8 VL 野生型和3D8 VL 3M一起进行RNA水解，使用核糖核酸酶A和HW1作为对照。如后来即将说明的，这些变体显示了序列特异性水解的良好性能。使用从HeLa细胞中分离的总RNA，在含有2 mM MgCl2或50 mM EDTA的的TBS（Tris缓冲液）中进行RNA水解。
图8示出了11种变体的DNA水解活性（A）和4MG3、4MG5与4MH2的RNA水解活性（B）的琼脂糖凝胶电泳结果。
如图8所示，发现11种变体中的7种（4MG2、4MG3、4MG5、4MH1、4MH2、4MH3和4MH5）具有DNA水解活性且剩下的4种变体（4MG1、4MG4、4MG6和4MH4)与3D8 VL 4M (A)相比，水解活性显著降低。核糖核酸酶A几乎水解所有的RNA，而HW1不能水解，如缓冲液对照。另一方面，变体示出了RNA水解活性，甚至是在存在EDTA时，像野生型、4M和核糖核酸酶A(B)。
因此，根据本发明的变体能够在体内水解DNA和RNA。
实施例6 : 选择的变体的序列特异性、核酸水解活性
根据本发明的目的，将已证明具有核酸水解活性的变体进行序列特异性检测。纯化的变体用荧光标记的引物培养，之后使用基于FRET（荧光共振能量转移）的酶切法分析荧光信号。引物用绿色荧光6-FAM在5'末端和其淬火剂BHQ-1在3'末端进行双重标记。当引物未被水解时，因为6-FAM的荧光被邻近的BHQ-1吸收，所以检测不到荧光信号。另一方面，当引物在5'端和3'端之间的残基被变体水解时，将可能看见6-FAM的荧光信号，因为6-FAM远离BHQ-1。在这点上，用于文库筛选的引物A 18、T18、C18、Her218和N18在各自的末端用6-FAM和BHQ-1标记。至于G18，因为其难于合成，用引物(G4T)3G3替代，其中，组中的4个鸟嘌呤残基和1个胸腺嘧啶残基随机排列。FRET底物（A18、T18、C18、(G4T)3G3、Her218、N18）的碱基序列用于检测序列特异性、核酸水解活性，所述碱基序列分别用SEQ ID NOS: 36~41表示。
通过FRET分析测定发现三个变体4MG3、4MG5和4MH2具有序列特异性、核酸水解活性。为了获得更精确的酶动力参数，将固定浓度为100 nM的抗体与不同浓度（16 nM~2 μM)的底物一起培养，在此期间，在每个底物浓度下测量抗体的解离常数。总的来说，如果其他条件固定的话，随着底物浓度的增加，酶的反应速率增加，但是如果接近Vmax时，就不显著增加了。
对3D8 VL 野生型和3D8 VL 4M抗体以及变体（4MG3、4MG5、4MH2）进行酶促反应动力学测定，同时FRET底物（A18、T18、C18、(G4T)3G3、Her218、N18）浓度为16nM~2μM，结果如图9所示。从FRET数据中计算出抗体的Km、Kcat、Kcat/Km值并如下表3所示。
[表3]
Figure 113744DEST_PATH_IMAGE006
如图9和表3所示，关于各自的目标底物，相比于3D8 VL 野生型和3D8 VL 4M，变体（4MG3、4MG5、4MH2）具有更大的Vmax，这表明当存在充足底物时，变体水解目标底物的速度比水解其他底物快。相反，3D8 VL 野生型和3D8 VL 4M的反应速率与底物序列无关。从获得的结果计算抗体的动力参数Km、Kcat和Kcat/Km。三个变体中，4MG3和4MG5水解具有高序列特异性的靶标G18，这表现为对于靶标G18比非靶标具有更大的Vmax。至于变体4MH2，其对于靶标Her218的Vmax高于非靶标，从而解释了Her218的特异性识别和水解。相对于非靶标，这些变体对靶标底物显示出了更低的Km和更高的Kcat/Km。Km指的是抗体达到Vmax时，底物浓度的一半。因此，Km值越小，抗体对底物的亲和能力越高。相对于其他底物，变体4MG3、4MG5和4MH2对于各自的底物具有较小的Km值。使用Biacore2000测定的Km和Kd之间的差异被认为是由于这样的事实，即Km并不仅解释亲和力。变体对于靶标的Kcat/Km相对于非靶标而言高2~5倍。更高的Kcat/Km值表示对于底物具有更强的水解活性。
因此，变体4MG3、4MG5 和4MH2能够特异性地识别并水解各自靶序列的速度快于非靶序列。
实施例7 :变体在细胞内的序列特异性和核酸水解活性
应用带有绿色荧光EGFP基因的报告系统评估变体的细胞溶质、序列特异性和核酸水解活性。合成的靶标序列G18和Her218被放置在pEGFP-N1质粒的ATG起始密码子和EGFP编码序列之间，使其分别变成pEGFP-N1- G18和pEGFP-N1-Her218。为了用于转染到哺乳动物细胞内，3D8 VL 野生型和变体 （4MG3、4MG5、4MH2）分别被亚克隆进入到各表达载体pcDNA3.1 (+)。具体来说，HeLa细胞以2x105细胞/孔的密度涂覆于6孔板上，所述板含有2 mL补充添加有10% FBS的DMEM上，在37℃下，5% CO2的环境中培养24小时。一旦细胞稳定，除去培养基，并且每孔用1 mLPBS清洗。然后向每孔加入800 μLTOM（转染优化培养基，WelGENE Inc., Korea）以获得最大效率的转染。500ng的 pEGFP-N1单独地，500ng的pEGFP-N1-G18单独地，500ng的pEGFP-N1-Her18单独地，500ng的pEGFP-N1与500ng的 pcDNA3.1(+)-野生型，pcDNA3.1(+)-4MG3，pcDNA3.1(+)-4MG5或pcDNA3.1(+)-4MH2各自结合；500ng的pEGFP-G18 与500 ng 的pcDNA3.1(+)-野生型，pcDNA3.1(+)-4MG3，或pcDNA3.1(+)-4MG5各自结合；或500 ng 的pEGFP-Her218与500ng 的pcDNA3.1(+)-野生型或pcDNA3.1(+)-4MH2 各自结合在室温下用5 μL脂质体2000（Invitrogen, USA)在200 μLTOM培养基中培养20分钟进行反应并加入每孔。接着在37℃下，5% CO2的环境中培养6小时，TOM培养基用2 mL10% FBS补充的DMEM培养基更换。转染24小时后，去除培养基并用胰蛋白酶-EDTA获得细胞，用PBS清洗。使用 FACS Caliber（荧光活细胞分选）测定每个样品的GFP荧光。
每个转染的样品用兔抗-3D8多克隆抗体处理并随后用TRITC标记的抗兔抗体染色3D8 VL野生型、4MG3、4MG5和4MH2。用DAPI染色细胞核。用共聚焦显微镜检测EGFP（绿色）和3D8 VL野生型、4MG3、4MG5及MH2蛋白（红色）的表达水平。
从每个转染的样品中分离蛋白质和总RNA，并分别进行免疫印迹和RT-PCR，以在蛋白质和mRNA水平检查被3D8 VL 野生型和变体 （4MG3、4MG5、4MH2）降低的EGFP。
参照图10，示出了用于3D8 VL 野生型和变体（4MG3，4MG5）（A， pcDNA3.1），GFP （B，pEGFP-N1)，GFP （C，pG18-EGFP，其中G18位于EGFP的N末端上游)和EGFP （D，pHer218-EGFP，其中Her218 8位于EGFP的N末端上游)的细胞内表达的质粒。
图11示出了报告子EGFP的表达水平，所述EGFP含有3D8 VL变体的靶碱基序列，当3D8 VL野生型或变体（4MG3、4MG5、4MH2），和各种EGFP报告基因（EGFP、G18-EGFP、Her218-EGFP) 在HeLa细胞中被图10中的表达载体转染时，其通过FACS (A)，共聚焦显微镜(B)，免疫印迹(C，D)和RT-PCR (E，F)测定荧光水平。
如图11A所示，在缺少G18和Her218时，3D8 VL野生型和变体（4MG3、4MG5、4MH2）的EGFP的表达水平并没有显著差异。另一方面，当G18位于EGFP5'端之前，在表达变体（4MG3、4MG5)的细胞中检测到的EGFP荧光信号水平低于在表达3D8 VL野生型的细胞。同样，当它们被用这样的载体转染时，细胞产生的EGFP信号也更弱，所述载体中Her218位于EGFP5'端之前，与携带4MH2的载体而不是携带有3D8 VL野生型的载体一起转染。因此，当在细胞溶质中表达时，变体4MG3和4MG5水解包含靶序列的G18-EGFP mRNA，并且变体4MH2催化地作用于含有靶序列的Her218-EGFP mRNA，从而降低由mRNA编码的蛋白质的表达水平。
同样地，如图11A所示的相同的结果在图11B中以共聚焦显微镜数据给出。在缺少G18和Her218时，表达3D8 VL野生型的细胞和表达4MG3, 4MG5及4MH2的细胞中的EGFP表达水平没有显著差异。相反地，当细胞用载体转染时，表达变体（4MG3、4MG5）时比表达3D8 VL野生型时检测出的EGFP荧光信号低，所述载体中G18位于EGFP5'端之前。同样，当细胞用载体转染时，表达4MH2时比表达VL野生型时检测出的EGFP荧光信号低，所述载体中Her218位于EGFP5'端之前。这些图像结果证明了图11A的数据，表明4MG3、4MG5和4MH2能够识别各自的靶序列并保持核酸水解活性。
在图11C~11F中，变体（4MG3、4MG5和4MH2）的细胞表达引起GFP表达水平（蛋白质水平和mRNA水平）的下降。因此，变体（4MG3、4MG5和4MH2）能识别特异性碱基序列并将其水解。
实施例8: 用于下调Her2的Her2碱基序列特异性、水解性变体（表达载体）的分析
为了评估被含有Her2碱基序列特异性的变体4MH2下调Her2 和Her2水解活性，将Her2基因表达载体转染到人类宫颈癌细胞（HeLa），其不表达Her2。Her2 siRNA用作下调Her2mRNA表达的阳性对照。具体来说，HeLa细胞以2x105细胞/孔的密度涂覆于6孔板上，所述板含有每孔2 mL补充添加有10% FBS的DMEM上，接着在37℃下，5% CO2的环境中培养24小时。当稳定时，每孔中的细胞用1 mL的PBS清洗。然后向每孔加入800 μLTOM（转染优化培养基，WelGENE Inc., Korea）。500 ng 的pcDNA3.1(+)-Her2在室温下用加入5 μL脂质体2000（Invitrogen, USA)的200 μLTOM培养基在管中培养20分钟并加入每孔。接着在37℃下，5% CO2的环境中培养6小时。培养基用2 mL10% FBS补充的DMEM培养基更换，细胞进一步培养24小时。然后，每个孔用1 mLPBS清洗。向每孔加入800 μLTOM（WelGENE Inc., Korea）。在室温下用加入5 μL脂质体2000（Invitrogen, USA)的200 μLTOM培养基在管中培养20分钟后，将500 ng 的pcDNA3.1(+)-野生型、Her2 siRNA 或 pcDNA3.1(+)-4MH2加入到每孔中。接着在37℃下，5% CO2的环境中培养6小时。培养基用2 mL10% FBS补充的DMEM培养基更换，细胞进一步培养24小时或48小时。去除培养基并用胰蛋白酶-EDTA处理获得细胞，并用PBS清洗。从每个样品中分离总RNA和目的蛋白质并分别进行RT-PCR和免疫印记，以检查野生型，Her2 siRNA和4MH2对于Her2表达在蛋白质和mRNA水平上的影响。
参照图12，在HeLa细胞中，对于Her218碱基序列特异性、核酸水解性4MH2的Her2基因的表达结果，通过RT-PCR (A)分析其mRNA水平，并且通过免疫印记(B)分析其蛋白表达水平。
从图12的数据可明显地看出，4MH2显著地下调了Her2的表达，然而3D8 VL野生型没有获得明显的改变。尤其是，转染24小时后，观察到4MH2引起了比对Her2 siRNA更强烈的Her2下调，表明4MH2能够特异性地识别Her2序列，并将其水解。同样，观察到4MH2下调Her2 mRNA和蛋白质，在某种程度上类似于Her2 siRNA引起的下调。特别地，转染后24小时，观察到4MH2比Her2 siRNA引起更强烈的下调。
实施例9: 变体（蛋白质）的细胞内化及其途径
1.变体（蛋白质）的细胞穿透能力
已知3D8 scFV具有细胞穿透能力。使用FACS和共聚焦显微镜检测3D8 VL野生型及其变体是否能够穿透细胞。具体来说，HeLa细胞以2x105细胞/孔的密度涂覆于6孔板上，所述板的每孔含有2 mL补充添加有10% FBS的DMEM上，并在37℃下，5% CO2的环境中培养24小时。当细胞稳定时，每孔用1 mLPBS清洗。然后向每孔加入800 μLTOM（转染优化培养基，WelGENE Inc., Korea）。在37℃下，5% CO2的环境中培养2小时之前，细胞用变体（10 μM）处理。去除培养基并用胰蛋白酶-EDTA处理获得细胞，用PBS清洗。每个样品用特异于3D8 scFv的初级抗体处理，然后用TRITC（红色）标记的二抗对3D8 VL野生型、4MG3、4MG5和4MH2进行染色。 使用FACS Calibur（荧光激活细胞分选）检测TRITC信号。此时，细胞被胰蛋白酶处理，从而防止检测到未内化到细胞中但仍粘附于细胞表面的蛋白质。
每个转染的样品用特异于3D8 scFv的初级抗体处理，然后用TRITC标记的二抗对3D8 VL野生型、4MG3、4MG5和4MH2蛋白质进行染色。用DAPI染色细胞核。用共聚焦显微镜检测EGFP（绿色荧光）和3D8 VL野生型、4MG3、4MG5和4MH2蛋白（红色荧光)的表达水平。
在图13A和13B中分别给出了关于3D8 VL野生型和变体（4MG3、4MG5、4MH2)内化进入人类宫颈癌细胞（HeLa）和人类乳腺癌细胞(SK-BR3)的FACS数据和共聚焦显微镜数据。
如图13A所示，观察到3D8 VL野生型和变体（4MG3、4MG5、4MH2)类似程度地穿透进入HeLa和SK-BR-3。换句话说，变体具有相似的细胞穿透能力，从而表明并不需要考虑进行或进一步的关于变体之间不同的细胞内化水平的实验。
如图13B所示，红色荧光表示3D8 VL野生型和变体（4MG3、4MG5、4MH2)，蓝色荧光代表核。因此，大多数蛋白质并没有穿透进入核膜，并且转移到胞质中。
变体（蛋白质）的细胞内化途径
为了说明变体的特异性内化机制，细胞用以下三种用于干扰主要细胞内吞途径的药物抑制剂预处理：用于抑制网格蛋白依赖的内吞作用的氯丙嗪(CPZ)；用于抑制胞膜小窝/脂筏内吞作用的甲基-β-环糊精(MβCD)，和用于抑制大胞饮的细胞松弛素D(Cyt-D)。此外，还使用了肝素（100 IU/mL)去干扰带正电荷的变体和在细胞表面的带负电荷的蛋白聚糖（硫酸乙酰肝素）之间的相互电作用。具体来说，HeLa细胞以2x105细胞/孔的密度涂覆于6孔板上，所述板每孔含有2 mL补充添加有10% FBS的DMEM上，并在37℃下，5% CO2的环境中培养24小时。在细胞稳定后，每孔用1 mLPBS清洗。然后向每孔加入800 μLTOM（转染优化培养基，WelGENE Inc.，Korea）。细胞用肝素(5mM)、MβCD (5mM)、氯丙嗪(10 μg/mL)、或细胞松弛素D (1μg/mL)预处理30分钟，然后在37℃下，5%CO2的环境中培养2小时。去除培养基后，细胞用PBS清洗并用胰蛋白酶-EDTA处理。每个样品用特异于3D8 scFv的初级抗体处理，然后用TRITC（红色）标记的二抗对3D8 VL野生型、4MG3、4MG5和4MH2进行染色。使用FACS Calibur（荧光激活细胞分选）检测TRITC信号。3D8 VLs在HeLa细胞中的内化作用作为对照，没有用可溶性肝素或者特异性内吞作用抑制剂处理，3D8 VL被内化到HeLa细胞中并用兔抗-3D8多克隆抗体和TRITC标记的兔抗IgG抗体染色。
在图13C中示出了可溶性肝素或特异性内吞抑制剂对于细胞摄取3D8 VL野生型和变体(4MG3、4MG5、4MH2)的预处理的作用分析。
从图13的数据中可明显地看出，变体的细胞内吞作用并不受氯丙嗪或细胞松弛素的影响，然而用肝素或者MβCD预处理引起了变体细胞内吞作用的显著下降，这表明变体主要与细胞表面物质例如蛋白聚糖进行电的相互作用，然后经历小窝/脂筏内吞作用。
实施例10: 变体（蛋白质）的细胞内序列特异性、核酸水解活性
使用一个报告基因系统以评估变体的细胞溶质性、序列特异性和核酸水解活性。为此，使用了携带有EGFP（绿色荧光）的表达载体pEGFP-N1和其中18个鸟嘌呤残基和Her218基因位于EGFP上游的表达载体。具体来说，HeLa细胞以2x105细胞/孔的密度涂覆于6孔板上，所述板每孔含有2 mL补充添加有10% FBS的DMEM，并在37℃下，5% CO2的环境中培养24小时。当细胞稳定时，每孔用1 mLPBS清洗。然后向每孔加入800 μLTOM（转染优化培养基，WelGENE Inc., Korea）。在室温下用加入5 μL脂质体2000（Invitrogen, USA)的200 μLTOM培养基在管中培养20分钟后，将500ng的pEGFP-N1或pEGFP-N1-G18单独加入到每孔中。接着在37℃下，5% CO2的环境中培养6小时。培养基用2 mL补充有10% FBS的DMEM培养基更换，细胞进一步培养24小时。每孔用1 mLPBS清洗。然后向每孔加入800 μLTOM（转染优化培养基，WelGENE Inc., Korea）。在37℃下，细胞用变体（10 μM）处理，5% CO2的环境中培养2小时。去除培养基并用胰蛋白酶-EDTA处理获得细胞，用PBS清洗。使用FACS Calibur（荧光激活细胞分选）检测EGFP信号。
从每个样品中分离总RNA和蛋白质，并分别进行RT-PCR和免疫印迹，以在蛋白质和mRNA水平检查被3D8 VL 野生型和变体 （4MG3、4MG5)降低的EGFP。
对于变体4MH2，其RT-PR和免疫印迹分析如下。具体来说，HeLa细胞以2x105细胞/孔的密度涂覆于6孔板上，所述板每孔含有2 mL补充添加有10% FBS的DMEM，并在37℃下，5% CO2的环境中培养24小时。在细胞稳定后，每孔用1 mLPBS清洗。然后向每孔加入800 μLTOM（转染优化培养基，WelGENE Inc., Korea）。在室温下用5 μL脂质体2000（Invitrogen, USA)在200 μLTOM培养基中在管中培养20分钟后，单独将500nM的Her2 或将其与siRNAme相结合加入到每孔中。接着在37℃下，5% CO2的环境中培养6小时。之后，培养基用2 mL补充有10% FBS的DMEM培养基更换，细胞进一步培养24小时。每孔用1 mLPBS清洗。然后向每孔加入800 μLTOM（转染优化培养基，WelGENE Inc., Korea）。在37℃下，细胞用3D8 VL野生型和4MH2 （10 μM）在5% CO2的环境中培养2小时。去除培养基并用胰蛋白酶-EDTA处理获得细胞，用PBS清洗。使用FACS Calibur（荧光激活细胞分选）检测EGFP信号。从每个样品中分离总RNA和目标蛋白质，并分别进行RT-PCR和免疫印迹。
图14示出了细胞穿透性3D8 VL变体在HeLa细胞中表达外源靶标基因的靶标基因沉默活性。HeLa细胞没有被转染（“对照”）或者用编码EGFP 或G18-EGFP的质粒转染，12小时后，无论是未处理的还是在37℃下用3D8 VL野生型（10μM）和G18-选择性4MG3 (10 μM)和 4MG5 (10 μM)处理2小时的，在用流式细胞仪(A)，RT-PCR (B、D)，和免疫印迹(C、E)分析之前再进一步培养12小时。
如图14A所示，3D8 VL野生型和4MG3、4MG5之间的EGFP信号强度并没有显著的差异，然而用其中G18位于EGFP上游的载体转染，则使得表达4MG3或4MG5细胞相比于表达3D8 VL野生型的细胞，显著地降低了EGFP信号强度。因此，在细胞内表达时，变体4MG3和4MG5能够水解具有靶碱基序列的G18-EGFP mRNA，从而下调EGFP的表达。
同样，图14B~14E示出了在蛋白质和mRNA水平上，被细胞内表达的变体（4MG3、4MG5、4MH2)下调的GFP。因此，发现变体（4MG3、4MG5、4MH2)具有碱基序列特异性和核酸水解活性。
实施例11:变体（蛋白质）的细胞毒性
对变体（蛋白质）的细胞毒性进行了测定。在这方面，通过MTT法测定用变体（蛋白质）处理一定时间的细胞的存活率。人类乳腺癌细胞（SK-BR-3、MDA-MB-231)或人类宫颈癌细胞（HeLa）以2×104/孔密度接种于96孔板中，所述板每孔含有200 μL 补充添加10% FBS的DMEM，在37℃下，5% CO2的环境中培养24小时。当细胞稳定时，每个孔用200 μL PBS冲洗。然后向每孔加入80 μL TOM（转染优化培养基，WelGENE Inc., Korea）。细胞经每个变体（0 μM）处理后，监测其24、48和72小时的存活率。
为了研究变体引起的细胞死亡的类型，每个经如上所述的相同程序处理的样品用FITC-膜联蛋白 V和 PI染色，并用FACS Calibur（荧光激活细胞分选）测定。
参照图15，通过MTT法(A)和流式细胞仪(B)分析变体处理的人类乳腺癌细胞(SK-BR-3，MDA-MB-231)或人类宫颈癌细胞(HeLa)的存活率。
如图15A所示，每个抗体显示了低水平的细胞毒性。尤其是，观察到能特异性水解Her2碱基序列的变体4MH2在Her2-表达 SK-BR-3 和MDA-MB-231上产生强细胞毒性，与以前的报告认为随着Her2表达的减少Her2-过表达细胞的存活率降低相一致。因此，我们认为，4MH2下调Her2表达，减少了细胞存活率。
如图15B所示，每个抗体显示相同程度的毒性，与图15A的结果相一致。4MH2和Her2 siRNA，都具有Her2 碱基序列特异性的核酸水解活性，被观察到对于Her2-过表达 SK-BR-3和MDA-MB-231细胞是有毒的。此时，细胞发生凋亡（阳性膜联蛋白V）。
实施例 12 : 通过具有Her2碱基特异性、核酸水解活性的变体导致的Her2表达良好的下调
SK-BR-3，其过量表达Her2，用于评估通过具有Her2特异性、核酸水解活性的变体导致的Her2表达的下调。具体来说，SK-BR-3细胞以2x105细胞/孔的密度涂覆于6孔板上，所述板每孔含有2 mL补充添加有10% FBS的DMEM，并在37℃下，5% CO2的环境中培养24小时。当细胞稳定时，每孔用1 mLPBS清洗。然后向每孔加入800 μLTOM（转染优化培养基，WelGENE Inc., Korea）。细胞用每个变体（10 μM）处理2、12、24或48小时。去除培养基并用胰蛋白酶-EDTA处理获得细胞，并用PBS清洗。使用FACS Calibur（荧光激活细胞分选）检测Her2蛋白在细胞表面的表达水平。
从每个样品中分离总RNA和蛋白质，并分别进行RT-PCR和免疫印迹，其中再次观察到4MH2抗体水解核酸，并保留了碱基序列特异性。
在图16中，在4MH2，细胞穿透性Her218-选择性变体存在时，Her2表达水平在Her2-过表达 S K-BR-3细胞中具有Her2序列特异性，核酸水解活性，其通过FACS (A)、RT-PCR (B)和免疫印迹(C)进行分析。
如图16A所示，4MH2选择地下调细胞表面蛋白质Her2的表达水平。从转染后2小时开始，变体需要充足的时间进行内化作用并且下调需要48小时达到峰值。与Her2 siRNA阳性对照相比，观察到4MH2从更早的时间便施加了更高的下调，这表明在活性和时间方面，4MH2比Her2 siRNA具有优势。
同样，图16B和16C示出了在细胞表面的Her2表达选择性地被4MH2（如图16A所示）降低。观察到在4MH2中比Her2 siRNA更快更强的下调。
工业实用性
如上所述，根据本发明的核酸水解性抗体通过改变无底物特异性的细胞穿透性、核酸水解性抗体的特定位点制备，赋予其序列特异性且不改变其核酸水解能力。当该设计的核酸水解性抗体自身渗透进入细胞或在胞内表达时，其与单链或双链核酸靶标特异性结合并将其水解，从而下调特定基因的表达。因此，根据本发明的核酸水解性抗体可是如siRNA传统基因沉默技术的另一选择或替代技术。尤其是，本发明的核酸水解性抗体能下调靶标蛋白的表达或通过特异性结合并水解RNA或DNA下调靶标基因组在RNA或DNA水平而不是蛋白质水平上的增殖，所以可用于癌症或病毒疾病的治疗。因此，本发明的核酸水解性抗体可被开发为新的抗癌药物或抗病毒药物。
<110>    亚州大学校产学协力团
 
<120>    具有细胞穿透性、序列特异性和核酸水解性的抗体、其制备方法及包含所述抗体的药物组合物
 
<130>    FP11KR1235
 
<140>    PCT/KR2009/006628
<141>    2009-11-11
 
<150>    KR10-2008-0111712
<151>    2008-11-11
 
<160>    41
 
<170>    KopatentIn 1.71
 
<210>    1
<211>    113
<212>    PRT
<213>    Artificial Sequence
 
<220>
<223>    amino acid sequence of 3D8 VL WT
 
 
<400>    1
Asp Leu Val Met Ser Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Ala Gly
  1               5                  10                  15
 
Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Phe Asn Ser
             20                  25                  30
 
Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
         35                  40                  45
 
Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
     50                  55                  60
 
Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
 65                  70                  75                  80
 
Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Lys Gln
                 85                  90                  95
 
Ser Tyr Tyr His Met Tyr Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile
            100                 105                 110
 
Lys
  
 
 
<210>    2
<211>    113
<212>    PRT
<213>    Artificial Sequence
 
<220>
<223>    amino acid sequence of 3D8 VL 4M
 
 
<400>    2
Asp Leu Val Met Ser Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Ala Gly
  1               5                  10                  15
 
Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Phe Asn Ser
             20                  25                  30
 
Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Arg
         35                  40                  45
 
Ser Pro Lys Leu Leu Ile His Arg Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
     50                  55                  60
 
Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
 65                  70                  75                  80
 
Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Lys Gln
                 85                  90                  95
 
Ser Tyr Tyr Ala Met Tyr Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile
            100                 105                 110
 
Lys
  
 
 
<210>    3
<211>    339
<212>    DNA
<213>    Artificial Sequence
 
<220>
<223>    nucleotide sequence of 3D8 VL WT
 
 
<400>    3
gatcttgtga tgtcacagtc tccatcctcc ctggctgtgt cagcaggaga gaaggtcact         60
 
atgagctgca aatccagtca gagtctgttc aacagtagaa cccgaaagaa ctacttggct        120
 
tggtaccagc agaaaccagg gcagtctcct aaactgctga tctactgggc atccactagg        180
 
gaatctgggg tccctgatcg cttcacaggc agtggatctg ggacagattt cactctcacc        240
 
atcagcagtg tgcaggctga agacctggca gtttattact gcaagcaatc ttattatcac        300
 
atgtatacgt tcggatcggg gaccaagctg gaaataaaa                               339
 
 
<210>    4
<211>    339
<212>    DNA
<213>    Artificial Sequence
 
<220>
<223>    nucleotide sequence of 3D8 VL 4M
 
 
<400>    4
gatcttgtga tgtcacagtc tccatcctcc ctggctgtgt cagcaggaga gaaggtcact         60
 
atgagctgca aatccagtca gagtctgttc aacagtagaa cccgaaagaa ctacttggct        120
 
tggtaccagc agaaaccagg gcggtctcct aaactgctga tccaccgggc atccactagg        180
 
gaatctgggg tccctgatcg cttcacaggc agtggatctg ggacagattt cactctcacc        240
 
atcagcagtg tgcaggctga agacctggca gtttattact gcaagcaatc ttattatgcc        300
 
atgtatacgt tcggatcggg gaccaagctg gaaataaaa                               339
 
 
<210>    5
<211>    24
<212>    DNA
<213>    Artificial Sequence
 
<220>
<223>    nucleotide sequence of primer 1F
 
 
<400>    5
caggctagtg gtggtggtgg ttct                                                24
 
 
<210>    6
<211>    60
<212>    DNA
<213>    Artificial Sequence
 
<220>
<223>    nucleotide sequence of primer 2R
 
 
<400>    6
cagcagttta ggagaccgcc ctggvnnvnn vnnvnnvnna gccaagtagt tctttcgggt         60
 
                                                                          60
 
 
<210>    7
<211>    51
<212>    DNA
<213>    Artificial Sequence
 
<220>
<223>    nucleotide sequence of primer 3R
 
 
<400>    7
agattcccta gtggatgccc ggtgvnnvnn vnnvnnvnna gaccgccctg g                  51
 
 
<210>    8
<211>    24
<212>    DNA
<213>    Artificial Sequence
 
<220>
<223>    nucleotide sequence of primer 4F
 
 
<400>    8
caccgggcat ccactaggga atct                                                24
 
 
<210>    9
<211>    24
<212>    DNA
<213>    Artificial Sequence
 
<220>
<223>    nucleotide sequence of primer 5R
 
 
<400>    9
caggtcttca gcctgcacac tgct                                                24
 
 
<210>    10
<211>    60
<212>    DNA
<213>    Artificial Sequence
 
<220>
<223>    nucleotide sequence of primer 6F
 
 
<400>    10
agcagtgtgc aggctgaaga cctgnnbnnb nnbnnbnnba agcaatctta ttatgccatg         60
 
                                                                          60
 
 
<210>    11
<211>    30
<212>    DNA
<213>    Artificial Sequence
 
<220>
<223>    nucleotide sequence of primer 7R
 
 
<400>    11
gatctcgcgc tattacaagt cctcttcaga                                          30
 
 
<210>    12
<211>    18
<212>    DNA
<213>    Artificial Sequence
 
<220>
<223>    nucleotide sequence of 5'-biotinylated substrate(G(18))
 
 
<400>    12
gggggggggg gggggggg                                                       18
 
 
<210>    13
<211>    18
<212>    DNA
<213>    Artificial Sequence
 
<220>
<223>    nucleotide sequence of 5'-biotinylated substrate(Her2(18))
 
 
<400>    13
aattccagtg gccatcaa                                                       18
 
 
<210>    14
<211>    113
<212>    PRT
<213>    Artificial Sequence
 
<220>
<223>    amino acid sequence of 3D8 VL mutant(4MG1)
 
 
<400>    14
Asp Leu Val Met Ser Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Ala Gly
  1               5                  10                  15
 
Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Phe Asn Ser
             20                  25                  30
 
Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Asn Gln Arg Lys Pro Gly Arg
         35                  40                  45
 
Ser Arg Lys Ser Leu Ile His Arg Ala Ser Thr Arg Glu Pro Gly Val
     50                  55                  60
 
Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
 65                  70                  75                  80
 
Ile Ser Ser Val Glu Pro Glu Glu Leu Ala Gly Tyr Tyr Cys Lys Gln
                 85                  90                  95
 
Cys Tyr Tyr Ala Met Tyr Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile
            100                 105                 110
 
Lys
  
 
 
<210>    15
<211>    113
<212>    PRT
<213>    Artificial Sequence
 
<220>
<223>    amino acid sequence of 3D8 VL mutant(4MG2)
 
 
<400>    15
Asp Leu Val Met Ser Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Ala Gly
  1               5                  10                  15
 
Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Phe Asn Ser
             20                  25                  30
 
Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Gln Gln Arg Lys Pro Gly Arg
         35                  40                  45
 
Ser Arg Lys Arg Leu Ile His Arg Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
     50                  55                  60
 
Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
 65                  70                  75                  80
 
Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Glu Val Gly Arg Gly Gly Asp Lys Gln
                 85                  90                  95
 
Ser Tyr Tyr Ala Met Tyr Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile
            100                 105                 110
 
Lys
  
 
 
<210>    16
<211>    113
<212>    PRT
<213>    Artificial Sequence
 
<220>
<223>    amino acid sequence of 3D8 VL mutant(4MG3)
 
 
<400>    16
Asp Leu Val Met Ser Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Ala Gly
  1               5                  10                  15
 
Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Phe Asn Ser
             20                  25                  30
 
Arg Ala Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Arg Gln Lys Lys Pro Gly Arg
         35                  40                  45
 
Ser Arg Lys Gln Leu Ile His Arg Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
     50                  55                  60
 
Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
 65                  70                  75                  80
 
Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Glu Leu Arg Glu Glu Asn Arg Lys Glu
                 85                  90                  95
 
Ser Tyr Tyr Ala Met Tyr Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile
            100                 105                 110
 
Lys
  
 
 
<210>    17
<211>    113
<212>    PRT
<213>    Artificial Sequence
 
<220>
<223>    amino acid sequence of 3D8 VL mutant(4MG4)
 
 
<400>    17
Asp Leu Val Met Ser Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Ala Gly
  1               5                  10                  15
 
Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Phe Asn Ser
             20                  25                  30
 
Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Asn Asn Arg Arg Arg Pro Gly Arg
         35                  40                  45
 
Ser Arg Asn Lys His Glu His Arg Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
     50                  55                  60
 
Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
 65                  70                  75                  80
 
Ile Ser Ser Val Gln Gly Glu Glu Leu Pro Glu Asp Pro His Lys Gln
                 85                  90                  95
 
Ser Tyr Tyr Ala Met Tyr Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile
            100                 105                 110
 
Lys
  
 
 
<210>    18
<211>    113
<212>    PRT
<213>    Artificial Sequence
 
<220>
<223>    amino acid sequence of 3D8 VL mutant(4MG5)
 
 
<400>    18
Asp Leu Val Met Ser Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Ala Gly
  1               5                  10                  15
 
Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Phe Asn Ser
             20                  25                  30
 
Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Lys Asn Gln Gly Gln Pro Gly Arg
         35                  40                  45
 
Ser Arg Lys Asn Asn Arg His Arg Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
     50                  55                  60
 
Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
 65                  70                  75                  80
 
Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Gly Arg Tyr Asn Ser Asn Gln
                 85                  90                  95
 
Ser Tyr Tyr Ala Met Tyr Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile
            100                 105                 110
 
Lys
  
 
 
<210>    19
<211>    113
<212>    PRT
<213>    Artificial Sequence
 
<220>
<223>    amino acid sequence of 3D8 VL mutant(4MG6)
 
 
<400>    19
Asp Leu Val Met Ser Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Ala Gly
  1               5                  10                  15
 
Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Phe Asn Ser
             20                  25                  30
 
Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Ser Arg Lys Arg Gly Pro Gly Arg
         35                  40                  45
 
Ser Gly Lys Asn His Arg His Arg Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
     50                  55                  60
 
Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
 65                  70                  75                  80
 
Ile Ser Ser Val Glu Gly Glu Asp Leu Gly Glu Tyr Trp Cys Lys Glu
                 85                  90                  95
 
Ser Tyr Tyr Ala Met Tyr Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile
            100                 105                 110
 
Lys
  
 
 
<210>    20
<211>    113
<212>    PRT
<213>    Artificial Sequence
 
<220>
<223>    amino acid sequence of 3D8 VL mutant(4MH1)
 
 
<400>    20
Asp Leu Val Met Ser Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Ala Gly
  1               5                  10                  15
 
Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Phe Asn Ser
             20                  25                  30
 
Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Ser Lys Glu Lys His Pro Gly Arg
         35                  40                  45
 
Ser Asn Gly Ser Arg Gln His Arg Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
     50                  55                  60
 
Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
 65                  70                  75                  80
 
Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Glu Leu Ala Tyr Tyr Asn Cys Lys Gln
                 85                  90                  95
 
Ser Tyr Tyr Ala Met Tyr Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile
            100                 105                 110
 
Lys
  
 
 
<210>    21
<211>    113
<212>    PRT
<213>    Artificial Sequence
 
<220>
<223>    amino acid sequence of 3D8 VL mutant(4MH2)
 
 
<400>    21
Asp Leu Val Met Ser Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Ala Gly
  1               5                  10                  15
 
Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Phe Asn Ser
             20                  25                  30
 
Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Asn Gln Cys Lys Pro Gly Arg
         35                  40                  45
 
Ser Glu Lys Asn Leu Ile His Arg Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
     50                  55                  60
 
Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
 65                  70                  75                  80
 
Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Asp Ile Gln Gln Ala Lys Gln
                 85                  90                  95
 
Cys Tyr Tyr Ala Met Tyr Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile
            100                 105                 110
 
Lys
  
 
 
<210>    22
<211>    113
<212>    PRT
<213>    Artificial Sequence
 
<220>
<223>    amino acid sequence of 3D8 VL mutant(4MH3)
 
 
<400>    22
Asp Leu Val Met Ser Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Ala Gly
  1               5                  10                  15
 
Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Phe Asn Ser
             20                  25                  30
 
Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Ser Glu Arg Lys Arg Pro Gly Arg
         35                  40                  45
 
Ser Glu Asn Asn Arg Arg His Arg Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
     50                  55                  60
 
Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
 65                  70                  75                  80
 
Ile Ser Ser Val Gln Ala Gln Asp Leu Gly Asp Gln Gln Gly Lys Glu
                 85                  90                  95
 
Cys Tyr Tyr Ala Met Tyr Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile
            100                 105                 110
 
Lys
  
 
 
<210>    23
<211>    113
<212>    PRT
<213>    Artificial Sequence
 
<220>
<223>    amino acid sequence of 3D8 VL mutant(4MH4)
 
 
<400>    23
Asp Leu Val Met Ser Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Ala Gly
  1               5                  10                  15
 
Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Phe Asn Ser
             20                  25                  30
 
Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln His Lys Pro Gly Arg
         35                  40                  45
 
Ser Gly Lys Ser Leu Ile His Arg Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
     50                  55                  60
 
Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
 65                  70                  75                  80
 
Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Gly Asn Tyr Gly Cys Lys Glu
                 85                  90                  95
 
Cys Tyr Tyr Ala Met Tyr Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile
            100                 105                 110
 
Lys
  
 
 
<210>    24
<211>    113
<212>    PRT
<213>    Artificial Sequence
 
<220>
<223>    amino acid sequence of 3D8 VL mutant(4MH5)
 
 
<400>    24
Asp Leu Val Met Ser Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Ala Gly
  1               5                  10                  15
 
Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Phe Asn Ser
             20                  25                  30
 
Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Arg
         35                  40                  45
 
Ser Ser Lys Gly Leu Ile His Arg Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
     50                  55                  60
 
Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
 65                  70                  75                  80
 
Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Glu Leu Arg Gly Lys Arg Gly Lys Gln
                 85                  90                  95
 
Cys Tyr Tyr Ala Met Tyr Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile
            100                 105                 110
 
Lys
  
 
 
<210>    25
<211>    339
<212>    DNA
<213>    Artificial Sequence
 
<220>
<223>    nucleotide sequence of 3D8 VL mutant(4MG1)
 
 
<400>    25
gatcttgtga tgtcacagtc tccatcctcc ctggctgtgt cagcaggaga gaaggtcact         60
 
atgagctgca aatccagtca gagtctgttc aacagtagaa cccgaaagaa ctacttggct        120
 
tggaaccagc gcaaaccagg gcggtctcgc aaaagcctga tccaccgggc atccaccagg        180
 
gaacctgggg tccctgatcg cttcacaggc agtggatctg ggacagattt cactctcacc        240
 
atcagcagtg tggagcctga agagctggca gggtattact gcaagcaatg ttattatgcc        300
 
atgtatacgt tcggatcggg gaccaagctg gaaataaaa                               339
 
 
<210>    26
<211>    339
<212>    DNA
<213>    Artificial Sequence
 
<220>
<223>    nucleotide sequence of 3D8 VL mutant(4MG2)
 
 
<400>    26
gatcttgtga tgtcacagtc tccatcctcc ctggctgtgt cagcaggaga gaaggtcact         60
 
atgagctgca aatccagtca gagtctgttc aacagtagaa cccgaaagaa ctacttggct        120
 
tggcagcagc gtaaaccagg gcggtctcgc aaacgcctga tccaccgggc atccactagg        180
 
gaatctgggg tccctgatcg cttcacaggc agtggatctg ggacagattt cactctcacc        240
 
atcagcagtg tgcaggctga agaggtgggt cggggtgggg acaagcaatc ttattatgcc        300
 
atgtatacgt tcggatcggg gaccaagctg gaaataaaa                               339
 
 
<210>    27
<211>    339
<212>    DNA
<213>    Artificial Sequence
 
<220>
<223>    nucleotide sequence of 3D8 VL mutant(4MG3)
 
 
<400>    27
gatcttgtga tgtcacagtc tccatcctcc ctggctgtgt cagcaggaga gaaggtcact         60
 
atgagctgca aatccagtca gagtctgttc aacagtagag cccgaaagaa ctacttggct        120
 
tggaggcaga agaaaccagg gcggtctcgc aaacagctga tccaccgggc atccactagg        180
 
gaatctgggg tccctgatcg cttcacaggc agtggatctg ggacagattt cactctcacc        240
 
atcagcagtg tgcaggctga agagctgagg gaagaaaacc ggaaggaatc ttattatgcc        300
 
atgtatacgt tcggatcggg gaccaagctg gaaataaaa                               339
 
 
<210>    28
<211>    339
<212>    DNA
<213>    Artificial Sequence
 
<220>
<223>    nucleotide sequence of 3D8 VL mutant(4MG4)
 
 
<400>    28
gatcttgtga tgtcacagtc tccatcctcc ctggctgtgt cagcaggaga gaaggtcact         60
 
atgagctgca aatccagtca gagtctgttc aacagtagaa cccgaaagaa ctacttggct        120
 
aataacaggc gtaggccagg gcggtctcgg aataaacatg aacaccgggc atccactagg        180
 
gaatctgggg tccctgatcg cttcacaggc agtggatctg ggacagattt cactctcacc        240
 
atcagcagtg tgcagggtga agagctgccg gaggatcctc acaagcaatc ttattatgcc        300
 
atgtatacgt tcggatcggg gaccaagctg gaaataaaa                               339
 
 
<210>    29
<211>    339
<212>    DNA
<213>    Artificial Sequence
 
<220>
<223>    nucleotide sequence of 3D8 VL mutant(4MG5)
 
 
<400>    29
gatcttgtga tgtcacagtc tccatcctcc ctggctgtgt cagcaggaga gaaggtcact         60
 
atgagctgca aatccagtca gagtctgttc aacagtagaa cccgaaagaa ctacttggct        120
 
aaaaatcaag gacaaccagg gcggtctaga aaaaacaaca ggcaccgggc atccactagg        180
 
gaatctgggg tccctgatcg cttcacaggc agtggatctg ggacagattt cactctcacc        240
 
atcagcagtg tgcaggctga agacctggga cgttataatt ccaaccaatc ttattatgcc        300
 
atgtatacgt tcggatcggg gaccaagctg gaaataaaa                               339
 
 
<210>    30
<211>    339
<212>    DNA
<213>    Artificial Sequence
 
<220>
<223>    nucleotide sequence of 3D8 VL mutant(4MG6)
 
 
<400>    30
gatcttgtga tgtcacagtc tccatcctcc ctggctgtgt cagcaggaga gaaggtcact         60
 
atgagctgca aatccagtca gagtctgttc aacagtagaa cccgaaagaa ctacttggct        120
 
agtagaaagc gaggaccagg gcggtctggt aagaaccaca gacaccgggc atccactagg        180
 
gaatctgggg tccctgatcg cttcacaggc agtggatctg ggacagattt cactctcacc        240
 
atcagcagtg tggagggtga agacctggga gagtattggt gcaaggaatc ttattatgcc        300
 
atgtatacgt tcggatcggg gaccaagctg gaaataaaa                               339
 
 
<210>    31
<211>    339
<212>    DNA
<213>    Artificial Sequence
 
<220>
<223>    nucleotide sequence of 3D8 VL mutant(4MH1)
 
 
<400>    31
gatcttgtga tgtcacagtc tccatcctcc ctggctgtgt cagcaggaga gaaggtcact         60
 
atgagctgca aatccagtca gagtctgttc aacagtagaa cccgaaagaa ctacttggct        120
 
agtaaggaaa aacacccagg gcggtctaac ggcagccgac agcaccgggc atccactagg        180
 
gaatctgggg tccctgatcg cttcacaggc agtggatctg ggacagattt cactctcacc        240
 
atcagcagtg tgcaggctga agagctggca tattataact gcaagcaatc ttattatgcc        300
 
atgtatacgt tcggatcggg gaccaagctg gaaataaaa                               339
 
 
<210>    32
<211>    339
<212>    DNA
<213>    Artificial Sequence
 
<220>
<223>    nucleotide sequence of 3D8 VL mutant(4MH2)
 
 
<400>    32
gatcttgtga tgtcacagtc tccatcctcc ctggctgtgt cagcaggaga gaaggtcact         60
 
atgagctgca aatccagtca gagtctgttc aacagtagaa cccgaaagaa ctacttggct        120
 
tggaaccagt gcaaaccagg gcggtctgag aaaaatctga tccaccgggc atccactagg        180
 
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atcagcagtg tgcaggctga agacctggat attcagcaag cgaagcaatg ttattatgcc        300
 
atgtatacgt tcggatcggg gaccaagctg gaaataaaa                               339
 
 
<210>    33
<211>    339
<212>    DNA
<213>    Artificial Sequence
 
<220>
<223>    nucleotide sequence of 3D8 VL mutant(4MH3)
 
 
<400>    33
gatcttgtga tgtcacagtc tccatcctcc ctggctgtgt cagcaggaga gaaggtcact         60
 
atgagctgca aatccagtca gagtctgttc aacagtagaa cccgaaagaa ctacttggct        120
 
agtgagcgaa agcgaccagg gcggtctgag aataacaggc ggcaccgggc atccactagg        180
 
gaatctgggg tccctgatcg cttcacaggc agtggatctg ggacagattt cactctcacc        240
 
atcagcagtg tgcaggctca agacctgggt gatcagcaag ggaaggaatg ttattatgcc        300
 
atgtatacgt tcggatcggg gaccaagctg gaaataaaa                               339
 
 
<210>    34
<211>    339
<212>    DNA
<213>    Artificial Sequence
 
<220>
<223>    nucleotide sequence of 3D8 VL mutant(4MH4)
 
 
<400>    34
gatcttgtga tgtcacagtc tccatcctcc ctggctgtgt cagcaggaga gaaggtcact         60
 
atgagctgca aatccagtca gagtctgttc aacagtagaa cccgaaagaa ctacttggct        120
 
tggtaccagc ataaaccagg gcggtctggc aaaagtctga tccaccgggc atccactagg        180
 
gaatctgggg tccctgatcg cttcacaggc agtggatctg ggacagattt cactctcacc        240
 
atcagcagtg tgcaggctga agacctggga aactatggtt gcaaggaatg ttattatgcc        300
 
atgtatacgt tcggatcggg gaccaagctg gaaataaaa                               339
 
 
<210>    35
<211>    339
<212>    DNA
<213>    Artificial Sequence
 
<220>
<223>    nucleotide sequence of 3D8 VL mutant(4MH5)
 
 
<400>    35
gatcttgtga tgtcacagtc tccatcctcc ctggctgtgt cagcaggaga gaaggtcact         60
 
atgagctgca aatccagtca gagtctgttc aacagtagaa cccgaaagaa ctacttggct        120
 
tggtaccagc agaaaccagg gcggtctagc aaagggctga tccaccgggc atccactagg        180
 
gaatctgggg tccctgatcg cttcacaggc agtggatctg ggacagattt cactctcacc        240
 
atcagcagtg tgcaggctga agagctgagg gggaagcggg gcaagcaatg ttattatgcc        300
 
atgtatacgt tcggatcggg gaccaagctg gaaataaaa                               339
 
 
<210>    36
<211>    18
<212>    DNA
<213>    Artificial Sequence
 
<220>
<223>    nucleotide sequence of FRET substrate(A18) which was labeled with
         6-FAM at 5'-terminus and BHQ-1 at 3'-terminus
 
 
<400>    36
aaaaaaaaaa aaaaaaaa                                                       18
 
 
<210>    37
<211>    18
<212>    DNA
<213>    Artificial Sequence
 
<220>
<223>    nucleotide sequence of FRET substrate(T18) which was labeled with
         6-FAM at 5'-terminus and BHQ-1 at 3'-terminus
 
 
<400>    37
tttttttttt tttttttt                                                       18
 
 
<210>    38
<211>    18
<212>    DNA
<213>    Artificial Sequence
 
<220>
<223>    nucleotide sequence of FRET substrate(C18) which was labeled with
         6-FAM at 5'-terminus and BHQ-1 at 3'-terminus
 
 
<400>    38
cccccccccc cccccccc                                                       18
 
 
<210>    39
<211>    18
<212>    DNA
<213>    Artificial Sequence
 
<220>
<223>    nucleotide sequence of FRET substrate((G4T)3G3) which was labeled
         with 6-FAM at 5'-terminus and BHQ-1 at 3'-terminus
 
 
<400>    39
ggggtggggt ggggtggg                                                       18
 
 
<210>    40
<211>    18
<212>    DNA
<213>    Artificial Sequence
 
<220>
<223>    nucleotide sequence of FRET substrate(Her2(18)) which was labeled
         with 6-FAM at 5'-terminus and BHQ-1 at 3'-terminus
 
 
<400>    40
aattccagtg gccatcaa                                                       18
 
 
<210>    41
<211>    18
<212>    DNA
<213>    Artificial Sequence
 
<220>
<223>    nucleotide sequence of FRET substrate(N18) which was labeled with
         6-FAM at 5'-terminus and BHQ-1 at 3'-terminus
 
 
<400>    41
actgactgac tgactgac                                                       18
 
 

Claims (17)

1.一种核酸水解性抗体，其能够渗透进入细胞并特异性结合特定碱基序列的单链或双链核酸靶标，且水解该靶标核酸。
2.根据权利要求1所述的核酸水解性抗体，其中靶标为G18 或Her218。
3.根据权利要求2所述的核酸水解性抗体，其中G18具有SEQ ID NO：12的碱基序列。
4.根据权利要求2所述的核酸水解性抗体，其中Her218具有SEQ ID NO：13的碱基序列。
5.根据权利要求1所述的核酸水解性抗体，其中抗体具有从包括SEQ ID NOS：14 ~24氨基酸序列的组中选择的氨基酸序列。
6.根据权利要求5所述的核酸水解性抗体，其中抗体具有从包括SEQ ID NOS：25~35碱基序列的组中选择的碱基序列。
7.根据权利要求1所述的核酸水解性抗体，其中抗体选自下组中的一个：完整的IgG、重链可变区域的单结构域、轻链可变区域的单结构域、单链可变片段(scFv)、(scFv)2、Fab、Fab'、F(ab')2、双链抗体和dsFv及其组合。
8.一制备权利要求1中所述核酸水解性抗体的方法，包括：1）构建一没有底物特异性的细胞穿透性、核酸水解性抗体的模板的基因文库；2）通过使用表面显示载体在细胞表面表达步骤1）中构建的基因文库以生成蛋白质文库；3）从步骤2）中表达的蛋白质文库中选择能特异性结合特定碱基序列的核酸靶标的变体。
9.根据权利要求8所述的方法，其中没有底物特异性的细胞穿透性、核酸水解性抗体是从包括一完整的IgG，重链可变区域的单结构域，轻链可变区域的单结构域，单链可变片段(scFv)，(scFv)2，Fab，Fab'，F(ab')2，双链抗体和dsFv及其组合的组中选择的。
10.根据权利要求8所述的方法，其中没有底物特异性的细胞穿透性、核酸水解性抗体是3D8 VL 4M或其变体。
11.根据权利要求10所述的方法，其中3D8 VL 4M是以这样的方式突变的，包括c- (41~45位残基)，c'- (50~54位残基) 和f-β-链(90~94位残基)的3D8 VL 的DNA/RNA结合位点用NNB密码子（N=A/T/C/G，B=C/G/T）随机组合。
12.根据权利要求8所述的方法，其中步骤2）中的表面显示载体是从包括噬菌体显示载体、细菌显示载体、核糖体显示载体、RNA显示载体和酵母细胞显示载体及其组合的组中选择的。
13.据权利要求8所述的方法，其中步骤3）中的核酸靶标是内源性核酸或外源性核酸。
14..据权利要求13所述的方法，其中内源性核酸是编码在癌细胞中特异性过表达的蛋白质的核酸。
15.据权利要求13所述的方法，其中外源性核酸是病毒基因组核酸或编码病毒蛋白的核酸。
16.一种预防或治疗癌症的组合物，其包括权利要求1中所述的核酸水解性抗体作为活性成分。
17.一种预防或治疗病毒增殖的组合物，其包括权利要求1中所述的核酸水解性抗体作为活性成分。
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