JP2024059823A - 操作された細菌ユビキチンリガーゼ模倣物を用いる、幅広い範囲にわたるプロテオーム編集 - Google Patents

操作された細菌ユビキチンリガーゼ模倣物を用いる、幅広い範囲にわたるプロテオーム編集 Download PDF

Info

Publication number
JP2024059823A
JP2024059823A JP2024026317A JP2024026317A JP2024059823A JP 2024059823 A JP2024059823 A JP 2024059823A JP 2024026317 A JP2024026317 A JP 2024026317A JP 2024026317 A JP2024026317 A JP 2024026317A JP 2024059823 A JP2024059823 A JP 2024059823A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
leu
glu
ser
proteins
ala
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP2024026317A
Other languages
English (en)
Inventor
マシュー ピー． デリーサ
モーガン ビー． ルドヴィッキ
ポーラ ティー． ハモンド
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Cornell University
Original Assignee
Cornell University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Cornell University filed Critical Cornell University
Publication of JP2024059823A publication Critical patent/JP2024059823A/ja
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1025—Acyltransferases (2.3)
    • C12N9/104—Aminoacyltransferases (2.3.2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2863—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for growth factors, growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/93—Ligases (6)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
    • C12Q1/37—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving peptidase or proteinase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/48—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving transferase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y203/00—Acyltransferases (2.3)
    • C12Y203/02—Aminoacyltransferases (2.3.2)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/569—Single domain, e.g. dAb, sdAb, VHH, VNAR or nanobody®
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2318/00—Antibody mimetics or scaffolds
    • C07K2318/20—Antigen-binding scaffold molecules wherein the scaffold is not an immunoglobulin variable region or antibody mimetics
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/95—Fusion polypeptide containing a motif/fusion for degradation (ubiquitin fusions, PEST sequence)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/20—Type of nucleic acid involving clustered regularly interspaced short palindromic repeats [CRISPRs]

Abstract

【課題】目的となる標的に結合するタンパク質に遺伝子融合される、新規のＥ３ユビキチンリガーゼモチーフを提供する。【解決手段】本願は、Ｅ３ユビキチンリガーゼ（Ｅ３）モチーフを含む分解ドメインと、該分解ドメインを基質へと特異的に方向付けることができる標的指向ドメインとを含む単離されたキメラ分子に関し、ここで、標的指向ドメインは、分解ドメインに対して異種である。リンカーは、分解ドメインを標的指向ドメインに結合させる。また、組成物、ならびに疾患を治療する方法、基質サイレンシングの方法、疾患に対する治療有効性について薬剤をスクリーニングする方法、および疾患バイオマーカーについてスクリーニングする方法も開示される。【選択図】なし

Description

本願は、２０１８年３月１６日に出願された米国仮特許出願第６２／６４４，０５５号の優先権の利益を主張し、これは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
分野
本願は、概して、操作された細菌ユビキチンリガーゼ模倣物を用いる、幅広い範囲にわたるプロテオーム編集に関する。
背景
タンパク質機能は、従来、タンパク質をコードする標的遺伝子の発現を破壊すること、および得られた表現型の結果を分析することによって調べられてきた。そのような機能喪失実験は、現在、アンチセンスオリゴヌクレオチド（「ＡＳＯ」）、ＲＮＡ干渉（「ＲＮＡｉ」）、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（「ＺＦＮ」）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（「ＴＡＬＥＮ」）、およびクラスター化された、規則的に間隔をあけた、短い回文反復（「ＣＲＩＳＰＲ」）－Ｃａｓ系等の遺伝子サイレンシングおよびゲノム編集技術を使用して、日常的に実施されている。ＭｃＭａｎｕｓ ｅｔ ａｌ．，“Ｇｅｎｅ Ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ ｉｎ Ｍａｍｍａｌｓ ｂｙ Ｓｍａｌｌ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡｓ，”Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．３（１０）：７３７－４７（２００２）；Ｄｅｌｅａｖｅｙ ｅｔ ａｌ．，“Ｄｅｓｉｇｎｉｎｇ Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｆｏｒ Ｔａｒｇｅｔｅｄ Ｇｅｎｅ Ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ，”Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ＆Ｂｉｏｌｏｇｙ １９（８）：９３７－５４（２０１２）；Ｂｏｅｔｔｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，“Ｃｈｏｏｓｉｎｇ ｔｈｅ Ｒｉｇｈｔ Ｔｏｏｌ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｊｏｂ：ＲＮＡｉ，ＴＡＬＥＮ，ｏｒ ＣＲＩＳＰＲ，”Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ ５８（４）：５７５－８５（２０１５）；ａｎｄ Ｇａｊ ｅｔ ａｌ．，“ＴＡＬＥＮ，ａｎｄ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ－Ｂａｓｅｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｏｍｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，”Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３１（７）：３９７－４０５（２０１３）。これらの方法は、基礎研究において広く使用され、遺伝的障害を治療するために有望なものである。Ｇａｊ ｅｔ ａｌ．，“ＴＡＬＥＮ，ａｎｄ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ－Ｂａｓｅｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｏｍｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，”Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３１（７）：３９７－４０５（２０１３）；Ｃｏｘ ｅｔ ａｌ．，“Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｇｅｎｏｍｅ Ｅｄｉｔｉｎｇ：Ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ ａｎｄ Ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ，”Ｎａｔ．Ｍｅｄ．２１（２）：１２１－３１（２０１５）；Ｓｏｕｔｓｃｈｅｋ ｅｔ ａｌ．，“Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ ｏｆ ａｎ Ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ Ｇｅｎｅ ｂｙ Ｓｙｓｔｅｍｉｃ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｓｉＲＮＡｓ，”Ｎａｔｕｒｅ ４３２（７０１４）１７３－７８（２００４）；Ｂｕｍｃｒｏｔ ｅｔ ａｌ．，“ＲＮＡｉ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ：Ａ Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ Ｎｅｗ Ｃｌａｓｓ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｒｕｇｓ，”Ｎａｔ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．２（１２）：７１１－１９（２００６）；ａｎｄ Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，“Ｎｏｎ－Ｖｉｒａｌ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ Ｇｅｎｏｍｅ－Ｅｄｉｔｉｎｇ Ｎｕｃｌｅａｓｅｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，”Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２４（３）：１４４－５０（２０１７）。しかし、時間的制御の欠如、予測不可能なオフターゲット効果、ゲノム編集の場合において必須遺伝子を除去することが不可能であること、およびそのようなノックアウトの不可逆的な性質、ならびに遺伝子サイレンシングの場合には細胞内に既に存在するタンパク質のレベルを低下させることが不可能であり、それによって安定した長寿命のタンパク質は影響されないままであることを含む、いくつかの課題が残っている。
プロテオーム編集技術は、翻訳後レベルで作動する、タンパク質機能を研究するための直交的アプローチを表し、ＤＮＡまたはＲＮＡを標的とし、翻訳後精度を有する方法よりも高い分解能で複雑なタンパク質機能を詳細に分析する潜在能力がある。最も顕著な方法の１つは、「分解による阻害」を伴い、それによって、細胞ユビキチン－プロテアソーム経路（「ＵＰＰ」）の機構は、目的となるタンパク質を特異的に分解するためにハイジャックされる。古典的ユビキチン化カスケードは、３つの酵素－ユビキチン活性化酵素（Ｅ１）、ユビキチン結合酵素（Ｅ２）、およびユビキチンリガーゼ（Ｅ３）の活性を必要とし、これらは、エネルギー依存的な様式で、リジン残基へのポリユビキチン鎖の共有結合を通じて、分解のためにタンパク質に順次タグ付けするように作用する。
Ｅ３は、ＵＰＰにおいて最も不均一なクラスの酵素であり（ヒトにおいて＞６００種のＥ３が存在する）、特徴的ドメインの存在および基質タンパク質へのユビキチン転移の機構に依存して、ＨＥＣＴ（Ｅ６ＡＰ Ｃ末端と相同である）、ＲＩＮＧ（実に興味深い新しい遺伝子）、およびＲＢＲ（ＲＩＮＧ－ｂｅｔｗｅｅｎ－ＲＩＮＧ）として分類され得る。Ｂｕｅｔｏｗ ｅｔ ａｌ．，“Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｉｎｓｉｇｈｔｓ ｉｎｔｏ ｔｈｅ Ｃａｔａｌｙｓｉｓ ａｎｄ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｅ３ Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ Ｌｉｇａｓｅｓ，”Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１７（１０）：６２６－４２（２０１６）。それらが基質特異性を媒介し、一般に顕著な柔軟性を示すため、Ｅ３ユビキチンリガーゼは、これまでに記載されたプロテオーム編集戦略において最も頻繁に利用される成分である。例えば、化学的ノックダウンは、タンパク質分解標的指向キメラ、すなわちＰＲＯＴＡＣと呼ばれる小分子を使用して達成されており（Ｎｅｋｌｅｓａ ｅｔ ａｌ．，“Ｔａｒｇｅｔｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｂｙ ＰＲＯＴＡＣｓ，”Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．１７：４１３８－１４４（２０１７）およびＤｅｓｈａｉｅｓ，Ｒ．Ｊ．，“Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ：（Ｎｅｋｌｅｓａ ｅｔ ａｌ．，“Ｔａｒｇｅｔｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｂｙ ＰＲＯＴＡＣｓ，”Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｂｉｏｌ．１１（９）：６３４－３５（２０１５））、これらは、Ｅ３ユビキチンリガーゼのための１つのリガンド、分解されるタンパク質のための別のリガンド、および２つを接続するリンカーを含有するヘテロ二官能性分子である。これらの分子は、Ｅ３および標的の両方に結合し、標的ポリユビキチン化、続いてそのプロテアソーム分解を誘発する三元複合体の形成を促進する。細胞およびマウスにおいて化学的ノックアウトを可能にするペプチドベースおよび小分子ベースのＰＲＯＴＡＣが多数報告されている。Ｓｃｈｎｅｅｋｌｏｔｈ ｅｔ ａｌ．，“Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌｅｖｅｌｓ：Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ Ｉｎ Ｖｉｖｏ Ｔａｒｇｅｔｅｄ Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ，”Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２６（１２）：３７４８－５４（２００４）；Ｈｉｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，“Ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｋｎｏｃｋｄｏｗｎ Ｃｏｕｐｌｅｄ ｔｏ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｔｙｒｏｓｉｎｅ Ｋｉｎａｓｅ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ＰｈｏｓｐｈｏＰＲＯＴＡＣｓ，”Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １１０（２２）：８９４２－４７（２０１３）；Ｓｃｈｎｅｅｋｌｏｔｈ ｅｔ ａｌ．，“Ｔａｒｇｅｔｅｄ Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ Ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ａ Ｓｍａｌｌ Ｍｏｌｅｃｕｌｅ：Ｅｎ Ｒｏｕｔｅ ｔｏ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ，”Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．１８（２２）：５９０４－０８（２００８）；Ｂｏｎｄｅｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，“Ｃａｔａｌｙｔｉｃ Ｉｎ Ｖｉｖｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｋｎｏｃｋｄｏｗｎ ｂｙ Ｓｍａｌｌ－Ｍｏｌｅｃｕｌｅ ＰＲＯＴＡＣｓ，”Ｎａｔ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．１１（８）：６１１－１７（２０１５）、およびＳａｋａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，“Ｐｒｏｔａｃｓ：Ｃｈｉｍｅｒｉｃ Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｔｈａｔ Ｔａｒｇｅｔ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｔｏ ｔｈｅ Ｓｋｐ１－Ｃｕｌｌｉｎ－Ｆ Ｂｏｘ Ｃｏｍｐｌｅｘ ｆｏｒ Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ，”Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９８（１５）：８５５４－５９（２００１）。これらの化合物の魅力的な特徴は、細胞透過性を含む薬物様特性であるが、多くのペプチドおよび小分子ベースのＰＲＯＴＡＣは、十分な分解を誘導するためにしばしば最大２５μＭの濃度を必要とする、低い有効性に悩まされており（Ｂｕｃｋｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，“Ｓｍａｌｌ－Ｍｏｌｅｃｕｌｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌｅｖｅｌｓ Ｔｈｒｏｕｇｈ Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ Ｐｒｏｔｅａｓｏｍｅ Ｓｙｓｔｅｍ，”Ａｎｇｅｗ Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．５３（９）：２３１２－３０（２０１４））、カスタムＰＲＯＴＡＣの生成は、Ｅ３ユビキチンリガーゼと所望のタンパク質標的の両方について利用可能なリガンドの相対的な欠如によって、ならびに、このようなリガンドを新たに作製することに関連する技術的課題によって制限されている（Ｏｓｈｅｒｏｖｉｃｈ，Ｌ．，“Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ Ｆｒｏｍ Ｗｉｔｈｉｎ，”Ｓｃｉｅｎｃｅ－Ｂｕｓｉｎｅｓｓ Ｅｘｃｈａｎｇｅ ７：１０－１１（２０１４））。
これらの問題を回避するために、タンパク質ベースのキメラが開発され、ここでは、Ｅ３ユビキチンリガーゼは、目的となる標的に結合するタンパク質に遺伝子融合される。細胞内での異所性発現の後、操作されたタンパク質キメラは、Ｅ３を標的タンパク質に動員し、そのポリユビキチン化およびその後のプロテアソームによる分解をもたらす。最も初期の例では、タンパク質ノックアウトは、網膜芽細胞腫タンパク質ｐＲＢと相互作用することが知られているヒトパピローマウイルス１６型によってコードされるＥ７タンパク質に由来するペプチドに、β－ＴｒＣＰが融合された、Ｆボックスキメラを作製することによって達成された（Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ．，“Ｈａｒｎｅｓｓｉｎｇ ｔｈｅ Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎａｔｉｏｎ Ｍａｃｈｉｎｅｒｙ ｔｏ Ｔａｒｇｅｔ ｔｈｅ Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，”Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ ６（３）：７５１－５６（２０００）ａｎｄ Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，“Ｅｘｐｌｏｒｉｎｇ ｔｈｅ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｃｏｍｐｌｅｘｉｔｙ ｏｆ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｂｙ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｋｎｏｃｋｏｕｔ，”Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １００（２４）：１４１２７－３２（２００３））。異所性発現後、操作されたＦボックスは、ユビキチン化および破壊のために、ｃｕｌｌｉｎ－ＲＩＮＧリガーゼ（「ＣＲＬ」）スーパーファミリーからの多タンパク質Ｅ３複合体であるＳｋｐ１－Ｃｕｌ１－Ｆボックス（「ＳＣＦ」）機構にｐＲＢを動員した。少数の他の研究は、同様に天然タンパク質－タンパク質相互作用を活用しており、それにより、１つの相互作用タンパク質をＥ３に融合させることにより、細胞およびマウスにおける発現後に対応する結合パートナーをサイレンシングするキメラを産生した。Ｈａｔａｋｅｙａｍａ ｅｔ ａｌ．，“Ｔａｒｇｅｔｅｄ Ｄｅｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃ－Ｍｙｃ ｂｙ ａｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ Ｌｉｇａｓｅ Ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｓ Ｃｅｌｌ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｕｍｏｒ Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ，”Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６５（１７）：７８７４－７９（２００５）；Ｍａ ｅｔ ａｌ．，“Ｔａｒｇｅｔｅｄ Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｏｆ ＫＲＡＳ ｂｙ ａｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ Ｌｉｇａｓｅ Ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｓ Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ ａｎｄ Ｉｎ Ｖｉｖｏ，”Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ．１２（３）：２８６－９４（２０１３）；ａｎｄ Ｋｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，“Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ａ Ｓｉｎｇｌｅ Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ Ｌｉｇａｓｅ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｏｆ ａｌｌ Ａｃｔｉｖａｔｅｄ ＥｒｂＢ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｔｙｒｏｓｉｎｅ Ｋｉｎａｓｅｓ，”Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ３３（８）：９８６－９５（２０１４）。
より最近、ユニバーサルプロテオーム編集技術が、天然に存在する結合パートナーを超えて拡張され得ることが示された。このアプローチは、Ｅ３を、一本鎖抗体フラグメント（「ｓｃＦｖ」）、設計されたアンキリン反復タンパク質（「ＤＡＲＰｉｎ」）、またはフィブロネクチンＩＩＩ型（「ＦＮ３」）モノボディ等の合成結合タンパク質に融合することを伴った。Ｐｏｒｔｎｏｆｆ ｅｔ ａｌ．，“Ｕｂｉｑｕｉｂｏｄｉｅｓ，Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｅ３ Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ Ｌｉｇａｓｅｓ Ｅｎｄｏｗｅｄ Ｗｉｔｈ Ｕｎｎａｔｕｒａｌ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｆｏｒ Ｔａｒｇｅｔｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ，”Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８９（１１）：７８４４－５５（２０１４）。「ユビキボディ」（「ｕＡｂ」）と呼ばれるこれらの二官能性キメラは、ヒトＲＩＮＧ／Ｕボックス型Ｅ３－ＣＨＩＰ（Ｈｓｃ７０相互作用タンパク質のカルボキシル末端）のフレキシブルなユビキチンタグ付け能力を、合成結合タンパク質の操作可能な親和性および特異性と組み合わせた。結果は、生物学的機能または相互作用に依存しない分解のために、そうでなければ安定しているタンパク質をＵＰＰへと効率的に方向付けるための、カスタマイズ可能な技術である。確かに、ｕＡｂの最大の利点の１つは、それらの高度なモジュラー構造であり、単に合成結合タンパク質を交換することによって、異なる基質タンパク質を特異的に標的とする新しいｕＡｂを生成することができ（Ｃａｕｓｓｉｎｕｓ ｅｔ ａｌ．，“Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｆｕｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｋｎｏｃｋｏｕｔ Ｍｅｄｉａｔｅｄ ｂｙ Ａｎｔｉ－ＧＦＰ Ｎａｎｏｂｏｄｙ，”Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９（１）：１１７－２１（２０１１）；Ｆｕｌｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，“Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ Ｆｏｒ Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ Ｔｈｒｏｕｇｈ ｔｈｅ Ａｆｆｉｎｉｔｙ－Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍｉｓｓｉｌｅ Ｓｙｓｔｅｍ，”Ｏｐｅｎ Ｂｉｏｌ．７（５）：１７００６６（２０１７）；Ｆｕｌｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，“Ａｎ Ａｆｆｉｎｉｔｙ－Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍｉｓｓｉｌｅ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ Ｔａｒｇｅｔｅｄ Ｐｒｏｔｅｏｌｙｓｉｓ，”Ｏｐｅｎ Ｂｉｏｌ ６（１０）：１６０２５５（２０１６）；Ｓｈｉｎ ｅｔ ａｌ．，“Ｎａｎｏｂｏｄｙ－Ｔａｒｇｅｔｅｄ Ｅ３－Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ Ｌｉｇａｓｅ Ｃｏｍｐｌｅｘ Ｄｅｇｒａｄｅｓ Ｎｕｃｌｅａｒ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，”Ｓｃｉ．Ｒｅｐ．５：１４２６９（２０１５）；およびＫａｎｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，“Ｓｃｕｌｐｔｉｎｇ Ｉｏｎ Ｃｈａｎｎｅｌ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ Ｌｉｇａｓｅｓ，”Ｅｌｉｆｅ ６：ｅ２９７４４（２０１７））、一方、Ｅ３ドメインを交換することで、ユビキチン転移の動態または機構を変更することができる。さらに、特定のタンパク質状態（例えば、活性コンフォメーション対不活性コンフォメーション、変異体対野生型、翻訳後修飾）を認識する合成結合タンパク質を組み込むことによって、他のタンパク質を残しながら、特定のタンパク質亜集団を枯渇させることが可能になる。Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，“Ｅｘｐｌｏｒｉｎｇ ｔｈｅ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｃｏｍｐｌｅｘｉｔｙ ｏｆ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｂｙ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｋｎｏｃｋｏｕｔ，”Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １００（２４）：１４１２７－３２（２００３）およびＢａｌｔｚ ｅｔ ａｌ．，“ Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｅ３ Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ Ｌｉｇａｓｅｓ ｆｏｒ Ｔａｒｇｅｔｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ，”Ｃｕｒｒ．Ｐｒｏｔ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．１０（１）：７２－９０（２０１８）。しかし、現在、ｕＡｂの開発は、比較的限られたセットの哺乳動物Ｅ３、最も顕著には、多タンパク質Ｅ３リガーゼ複合体の「単独」Ｅ３ ＣＨＩＰまたはＣＲＬスーパーファミリーのメンバーを中心としている。
本願は、タンパク質ベースのキメラにおける専門知識を統合し、それによって、新規のＥ３ユビキチンリガーゼモチーフは、上記の課題に対処しかつ当該技術分野におけるこれらおよび他の欠陥を克服すべく、目的となる標的に結合するタンパク質に遺伝子融合される。
概要
本願の第１の態様は、単離されたキメラ分子に関する。単離されたキメラ分子は、Ｅ３ユビキチンリガーゼ（Ｅ３）モチーフを含む分解ドメインと、上記分解ドメインを基質へと特異的に方向付けることができる標的指向ドメインであって、上記分解ドメインに対して異種である、標的指向ドメインと、上記分解ドメインを上記標的指向ドメインに結合させるリンカーとを含む。
本願の第２の態様は、リボヌクレオタンパク質を形成する方法に関する。本方法は、本明細書に記載の単離されたキメラ分子をコードするｍＲＮＡを提供することと、１つ以上のポリアデノシン結合タンパク質（「ＰＡＢＰ」）を提供することと、上記ｍＲＮＡおよび上記１つ以上のＰＡＢＰからリボヌクレオタンパク質複合体をアセンブルすることとを含む。
本願の第３の態様は、本明細書に記載されるキメラ分子と、薬学的に許容される担体とを含む組成物に関する。
本願の第４の態様は、疾患を治療する方法に関する。本方法は、疾患を有する対象を選択することと、本明細書に記載の組成物を上記対象に投与して、上記対象に、疾患に罹患していない対象と比較して、基質の増加した発現レベルを与えることとを含む。
本願の第５の態様は、基質サイレンシングのための方法に関する。本方法は、サイレンシングさせる基質を選択することと、本明細書に記載のキメラ分子を提供することと、基質－分子複合体の形成を可能にするのに有効な条件下で上記基質をキメラ分子と接触させることとを含み、上記複合体は、サイレンシングさせる基質の分解を媒介する。
本願の第６の態様は、疾患に対する治療有効性について薬剤をスクリーニングする方法に関する。本方法は、その存在が疾患状態を媒介する生体分子を提供することと、（ｉ）Ｅ３ユビキチンリガーゼ（Ｅ３）モチーフを含む分解ドメインと、（ｉｉ）上記分解ドメインを生体分子へと特異的に方向付けることができる標的指向ドメインであって、上記分解ドメインに対して異種である、標的指向ドメインと、（ｉｉｉ）上記分解ドメインを上記標的指向ドメインに結合させるリンカーとを含む試験剤を提供することと、試験剤が生体分子の分解を促進するのに有効な条件下で、生体分子を試験剤と接触させることと、接触の結果としての生体分子のレベルを決定することと、決定に基づいて、生体分子のレベルを低下させる試験剤を、疾患に対する治療有効性の候補であるとして同定することとを含む。
本願の第７の態様は、疾患バイオマーカーについてスクリーニングする方法に関する。本方法は、１つ以上のリガンドを発現する疾患細胞の試料を提供することと、（ｉ）Ｅ３ユビキチンリガーゼ（Ｅ３）モチーフを含む分解ドメインと、（ｉｉ）上記分解ドメインを１つ以上のリガンドへと特異的に方向付けることができる標的指向ドメインであって、上記分解ドメインに対して異種である、標的指向ドメインと、（ｉｉｉ）上記分解ドメインを上記標的指向ドメインに結合させるリンカーとを含む複数のキメラ分子を提供することと、上記疾患細胞がキメラ分子の非存在下で増殖することに失敗するのに有効な条件下で、上記試料を複数のキメラ分子と接触させることと、上記キメラ分子のうちのどれが上記疾患細胞の増殖を可能にするかを決定することと、決定に基づいて、上記キメラ分子に結合しかつ上記疾患細胞の増殖を可能にするリガンドを、上記疾患のバイオマーカーとして同定することとを含む。
細胞タンパク質の標的サイレンシングを達成するためのユビキチンプロテアソーム経路の操作は、哺乳動物プロテオームを再構築するための信頼性が高くかつカスタマイズ可能な戦略として現れてきている。１つのこのようなアプローチは、Ｅ３ユビキチンリガーゼに融合した合成結合タンパク質から構成されるユビキボディと呼ばれる二官能性タンパク質を操作することを伴い、したがって、翻訳後のユビキチン化およびその機能に依存しない標的タンパク質の分解を可能にする。ここでは、目的となるタンパク質の選択的除去のために哺乳動物プロテアソーム分解機構と効果的に整合させることが可能な細菌病原体由来のＥ３ユビキチンリガーゼ模倣物に基づいて、新しいユビキボディのパネルを設計した。これらのうちの１つ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を特異的に認識するフィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）モノボディに融合したシゲラ・フレックスネリ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｆｌｅｘｎｅｒｉ）エフェクタータンパク質ＩｐａＨ９．８は、ＧＦＰおよびそのスペクトル誘導体、ならびにサイズ（２７～１７９ｋＤａ）および細胞下局在（細胞質、核、膜結合、および膜貫通）が変化した１５種の異なるＦＰタグ付き哺乳動物タンパク質を強力に排除することが観察された。治療に関連するユビキボディの送達を実証するために、ＧＦＰ特異的ユビキボディをコードする合成ｍＲＮＡをポリＡ結合タンパク質と共アセンブルし、カチオン性アミン側基を保有する生体適合性の構造的に定義されたポリポリペプチドを使用してナノサイズの複合体にパッケージングする、バイオインスパイアード分子アセンブリ法が利用された。得られたナノプレックスは、ＧＦＰを安定的に発現する培養哺乳動物細胞、ならびにＧＦＰを普遍的に発現するトランスジェニックマウスにおいて効率的な標的枯渇を引き起こす様式で、ユビキボディｍＲＮＡを送達した。全体として、ここで提示される結果は、ＩｐａＨ９．８ベースのユビキボディが、疾患を引き起こすタンパク質を薬理学的に調節する可能性がある高度にモジュール化されたプロテオーム編集技術であることを示唆している。
したがって、本願は、キメラ分子、組成物、治療、医薬組成物、タンパク質サイレンシング技術、治療剤の解明、および新規クラスのキメラ分子に基づく標的スクリーニング技術に関する。本明細書で「ユビキボディ」と称されるこのようなキメラは、Ｅ３ユビキチン酵素のリガーゼ機能をインポートして、標的特異性を保有する分子を生成する。このような操作されたキメラは、さもなければプロテアソームに結合しないかもしれない特定の基質標的の再方向付けおよびタンパク質分解を容易にする。
この点において、このような特定の基質、例えば、細胞内タンパク質の、標的とされた排除は、広範な科学的および臨床的適応症を、本明細書に提供されるキメラ分子、組成物、治療、薬学的組成物、タンパク質サイレンシング技術、治療剤の解明、およびスクリーニング技術に帰属させる。したがって、本願は、ユビキチン化を介した、異常発現遺伝子のタンパク質分解に基づいて、特定の予後予測用途および治療用途を採用および開発するための様々な貴重なツールを付与する。
ここでは、二官能性ｕＡｂキメラとして機能的に再プログラムすることができるＥ３の範囲を広げることを追求した。しかし、哺乳動物Ｅ３を伴う以前の取り組みからの顕著な逸脱においては、代わりに、宿主Ｅ３ユビキチンリガーゼを模倣し、感染中に先天性免疫応答を減衰させるためにＵＰＰ機構をハイジャックする微生物病原体由来のエフェクタータンパク質のセットに焦点を当てた。Ｍａｃｕｌｉｎｓ ｅｔ ａｌ．，“Ｂａｃｔｅｒｉａ－Ｈｏｓｔ Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ：Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ Ｌｉｇａｓｅｓ ａｓ Ｗｅａｐｏｎｓ ｏｆ Ｉｎｖａｓｉｏｎ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．２６（４）：４９９－５１０（２０１６）ａｎｄ Ｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，“Ｅｘｐｌｏｉｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｈｏｓｔ Ｃｅｌｌ Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ Ｍａｃｈｉｎｅｒｙ ｂｙ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｅｆｆｅｃｔｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，”Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ．１３０（１２）：１９８５－９６（２０１７）、これらは、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。これらの酵素の固有の柔軟性により、細菌性Ｅ３は、哺乳動物の対応物と同様に、標的タンパク質分解のために操作可能であるという仮説が生じた。実際に、堅牢な標的サイレンシングは、シゲラ・フレックスネリＥ３リガーゼＩｐａＨ９．８からなるｕＡｂで達成され、これは、真核ＨＥＣＴ型Ｅ３と類似性を示すが、任意の真核Ｅ３との配列および構造的相同性の非存在のために、新規のＥ３リガーゼ（「ＮＥＬ」）として分類される。Ｍａｃｕｌｉｎｓ ｅｔ ａｌ．，“Ｂａｃｔｅｒｉａ－Ｈｏｓｔ Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ：Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ Ｌｉｇａｓｅｓ ａｓ Ｗｅａｐｏｎｓ ｏｆ Ｉｎｖａｓｉｏｎ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．２６（４）：４９９－５１０（２０１６）；Ｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，“Ｅｘｐｌｏｉｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｈｏｓｔ Ｃｅｌｌ Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ Ｍａｃｈｉｎｅｒｙ ｂｙ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｅｆｆｅｃｔｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，”Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ．１３０（１２）：１９８５－９６（２０１７）；Ｚｈｕ ｅｔ ａｌ．，“Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ａ Ｓｈｉｇｅｌｌａ Ｅｆｆｅｃｔｏｒ Ｒｅｖｅａｌｓ ａ Ｎｅｗ Ｃｌａｓｓ ｏｆ Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ Ｌｉｇａｓｅｓ，”Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５（１２）：１３０２－０８（２００８）；Ｓｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，“Ａ Ｐａｔｈｏｇｅｎ Ｔｙｐｅ ＩＩＩ Ｅｆｆｅｃｔｏｒ Ｗｉｔｈ ａ Ｎｏｖｅｌ Ｅ３ Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ Ｌｉｇａｓｅ Ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ，”ＰＬｏＳ Ｐａｔｈｏｇｅｎｓ ９（１）：ｅ１００３１２１（２０１３）；ａｎｄ Ｒｏｈｄｅ ｅｔ ａｌ．，“Ｔｙｐｅ ＩＩＩ Ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ Ｅｆｆｅｃｔｏｒｓ ｏｆ ｔｈｅ ＩｐａＨ Ｆａｍｉｌｙ ａｒｅ Ｅ３ Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ Ｌｉｇａｓｅｓ，”Ｃｅｌｌ Ｈｏｓｔ Ｍｉｃｒｏｂｅ １（１）：７７－８３（２００７）、これらは、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。ＩｐａＨ９．８のＣ末端触媒ＮＥＬドメインが、緑色蛍光タンパク質（「ＧＦＰ」）を特異的に認識するＧＦＰ特異的ＦＮ３モノボディＧＳ２に融合されたとき、培養哺乳動物細胞における一過性発現および安定発現の両方の後のＥＧＦＰの強力な分解が観察された。さらに、ＧＳ２－ＩｐａＨ９．８キメラはまた、エメラルド、ビーナス、およびセルリアンを含むＥＧＦＰ、ならびにサイズが２７～１７９ｋＤａまでの範囲であり、細胞質、核、および細胞膜を含む異なる細胞下区画に局在する１５種の異なるＦＰタグ付き哺乳動物タンパク質のスペクトル誘導体の分解を加速させることができた。これらの標的のうちの２つであるＳＨＰ２およびＲａｓについて、ＩｐａＨ９．８がＳＨＰ２特異的またはＲａｓ特異的ＦＮ３ドメインに融合されたときに、効率的なサイレンシングもまた達成され、これは、ＩｐａＨベースのｕＡｂが再構成され得る容易さを強調する。
先に述べたように、ｕＡｂの治療的開発のための主要な障壁は、細胞内送達である。Ｏｓｈｅｒｏｖｉｃｈ，Ｌ．，“Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ Ｆｒｏｍ Ｗｉｔｈｉｎ，”Ｓｃｉｅｎｃｅ－Ｂｕｓｉｎｅｓｓ Ｅｘｃｈａｎｇｅ ７：１０－１１（２０１４）、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。細胞透過性のために設計することができるより小さいＰＲＯＴＡＣとは異なり（Ｂｕｃｋｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，“Ｓｍａｌｌ－Ｍｏｌｅｃｕｌｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌｅｖｅｌｓ Ｔｈｒｏｕｇｈ Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ Ｐｒｏｔｅａｓｏｍｅ Ｓｙｓｔｅｍ，”Ａｎｇｅｗ Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．５３（９）：２３１２－３０（２０１４）、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）、ｕＡｂは、細胞膜を効果的に貫通しない比較的嵩高いタンパク質である。この問題を修正するために、バイオインスパイアードｍＲＮＡ送達戦略を実施し、それによって、追加の３’末端ポリアデノシン（「ポリＡ」）テールを伴うＧＳ２－ＩｐａＨをコードするｍＲＮＡは、ｍＲＮＡ安定性を改善しかつ真核細胞内でｍＲＮＡ翻訳を刺激するように働くポリＡ結合タンパク質（「ＰＡＢＰ」）と化学量論的に複合体化された（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，“Ｐｏｌｙａｍｉｎｅ－Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｓｔｏｉｃｈｉｏｍｅｔｒｉｃ Ａｓｓｅｍｂｌｙ ｏｆ Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎｓ ｆｏｒ Ｅｎｈａｎｃｅｄ ｍＲＮＡ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，”Ａｎｇｅｗ Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．５６（４４）：１３７０９－１２（２０１７）、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。得られたリボヌクレオタンパク質（「ＲＮＰ」）をカチオン性ポリペプチドで安定化して、ｍＲＮＡを分解から保護し、細胞によるその取り込みを可能にし、そのエンドソームエスケープを促進した。重要なことに、これらの共アセンブルしたナノプレックスは、ＧＦＰを安定的に発現する培養哺乳動物細胞への導入後、およびＧＦＰを普遍的に発現するトランスジェニックマウスへの投与後に効率的なＧＦＰサイレンシングを引き起こす様式で、ＧＳ２－ＩｐａＨ９．８ｍＲＮＡを送達した。まとめると、本明細書に記載される結果は、ｕＡｂ媒介性プロテオーム編集が、細胞およびマウスにおけるタンパク質の標的分解のための効果的な戦略であることを実証し、それによって、ｕＡｂのステージを、薬物発見のためのツールとして、およびいわゆる「新薬の開発につながらない（ｕｎｄｒｕｇｇａｂｌｅ）」標的を薬理学的にヒットする可能性を有する治療候補として設定する。
図１Ａ～図１Ｃは、ＧＦＰ特異的ユビキボディとしての細菌性Ｅ３リガーゼＩｐａＨ９．８の操作を示す。図１Ａは、ＩｐａＨ９．８、ＩｐａＨ９．８ΔＬＲＲ、およびＧＳ２－ＩｐａＨ９．８の直線状表現を示す。数値は、Ｎ末端（「Ｎ」）からＣ末端（「Ｃ」）までのアミノ酸位置を指す。タンパク質は、ＩｐａＨ９．８のＬＲＲドメインおよびＮＥＬドメインと垂直方向に整列される。ＩｐａＨ９．８ΔＬＲＲは、ＬＲＲドメインを欠くＩｐａＨ９．８の切断型バージョンである。図１Ｂは、示されるように、プラスミドｐｃＤＮＡ３－ＥＧＦＰ単独をトランスフェクトした、またはｐｃＤＮＡ３－ＥＧＦＰおよび細菌性Ｅ３ベースのｕＡｂのうちの１つをコードするプラスミドを共トランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるＥＧＦＰ蛍光活性のフローサイトメトリー分析を示す。図１Ｃは、１Ｃと同じであるが、示されるように哺乳動物Ｅ３ベースのｕＡｂを用いている。データは、ＥＧＦＰ単独を発現するＨＥＫ２８３Ｔ細胞について測定したＭＦＩに対して正規化された、生物学的三連実験の幾何平均蛍光強度（「ＭＦＩ」）である。エラーバーは、平均値の標準偏差（「ＳＤ」）を表す。 図２Ａ～図２Ｄは、ＩｐａＨ９．８の触媒ドメインがユビキボディ機能に不可欠であることを例証する。図２Ａは、ｐｃＤＮＡ３－ＥＧＦＰ単独をトランスフェクトした、またはｐｃＤＮＡ３－ＥＧＦＰおよび以下のうちの１つをコードするプラスミドを共トランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるＥＧＦＰ蛍光活性のフローサイトメトリー分析によって得られた代表的な蛍光ヒストグラムを示す：ＧＳ２－ＩｐａＨ９．８Ｃ３３７Ａ、ＡＳ１５－ＩｐａＨ９．８、またはＧＳ２－ＩｐａＨ９．８。図２Ｂは、図２Ａに記載の細胞のＥＧＦＰ蛍光活性のフローサイトメトリー定量を示し、データは、ＥＧＦＰ単独を発現するＨＥＫ２８３Ｔ細胞について測定したＭＦＩに対して正規化された、生物学的三連実験の幾何学的ＭＦＩである。エラーバーは、平均値の標準偏差（「ＳＤ」）を表す。図２Ｃは、図２Ａおよび２Ｂと同様にトランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｔ細胞溶解物のウェスタンブロット分析を示す。ブロットは、示されるように、ＧＦＰ、６×Ｈｉｓ（各ｕＡｂ上でタグを検出）、およびＧＡＰＤＨに特異的な抗体でプローブされた。抗ＧＡＰＤＨで免疫ブロットすることによって確認されるように、等量の全タンパク質を各レーンに充填した。分子量（ＭＷ）マーカーは左に示されている。図２Ｄは、示されるように、ｐｃＤＮＡ３－ＥＧＦＰおよびＩｐａＨ９．８ホモログのうちの１つと融合したＧＳ２をコードするプラスミドを共トランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞についてのＥＧＦＰ蛍光活性のフローサイトメトリー定量を示す。データは、ＥＧＦＰ単独を発現するＨＥＫ２８３Ｔ細胞について測定されたＭＦＩに対して正規化された、生物学的三連実験の幾何学的ＭＦＩである。エラーバーは、平均値の標準偏差（「ＳＤ」）を表す。 図３Ａおよび図３Ｂは、ＧＳ２－ＩｐａＨ９．８が構造的に多様な蛍光タンパク質融合物を分解することを示す。図３Ａは、示されるＦＰ融合物単独（濃い灰色）をコードするプラスミドをトランスフェクトした、またはＦＰ融合物プラスミドおよびｐｃＤＮＡ３－ＧＳ２－ＩｐａＨ９．８Ｃ３３７Ａ（白色）もしくはｐｃＤＮＡ３－ＧＳ２－ＩｐａＨ９．８（薄い灰色）のいずれかを共トランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞における蛍光活性のフローサイトメトリー定量を示す。データは、対応するＦＰ融合タンパク質を単独で発現するＨＥＫ２８３Ｔ細胞について測定したＭＦＩに対して正規化された、生物学的三連実験の幾何学的ＭＦＩである。エラーバーは、平均値の標準偏差（「ＳＤ」）を表す。図３Ｂは、図３Ａに記載されるようにトランスフェクト／共トランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｔ細胞において発現されるＦＰ標的を選択するための対応する共焦点顕微鏡画像を示す。Ｈｏｅｓｃｈｔ染色（青色）は細胞核を示し、ＥＧＦＰシグナル（緑色）は蛍光タンパク質を示す。ＥＧＦＲ－ｍＥｍｅｒａｌｄ融合物については、ＥＧＦＲ特異的抗体（赤色）による免疫染色も示される。 図４Ａ～図４Ｃは、疾患関連標的に対して方向付けられるＩｐａＨ９．８ユビキボディを示す。図４Ａは、ｐｃＤＮＡ３－ＳＨＰ２－ＥＧＦＰ単独をトランスフェクトした、またはｐｃＤＮＡ３－ＳＨＰ２－ＥＧＦＰおよび以下のうちの１つをコードするプラスミドを共トランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるＥＧＦＰ蛍光活性のフローサイトメトリー定量を例証する。ＧＳ２－ＩｐａＨ９．８、ＧＳ２－ＩｐａＨ９．８Ｃ３３７Ａ、ＮＳａ５－ＩｐａＨ９．８、またはＮＳａ５－ＩｐａＨ９．８Ｃ３３７Ａ。図４Ｂは、図４Ａと同じであるが、ｐｃＤＮＡ３－ＥＧＦＰ－ＨＲａｓＧ１２Ｖ単独を、またはｐｃＤＮＡ３－ＥＧＦＰ－ＨＲａｓＧ１２Ｖおよび以下のうちの１つをコードするプラスミドを共トランスフェクトしたものである。ＧＳ２－ＩｐａＨ９．８、ＧＳ２－ＩｐａＨ９．８Ｃ３３７Ａ、ＲａｓＩｎＩＩ－ＩｐａＨ９．８、またはＲａｓＩｎＩＩ－ＩｐａＨ９．８Ｃ３３７Ａ。データは、ＥＧＦＰ単独を発現するＨＥＫ２８３Ｔ細胞について測定されたＭＦＩに対して正規化された、生物学的三連実験の幾何学的ＭＦＩである。エラーバーは、平均値の標準偏差（「ＳＤ」）を表す。図４Ｃは、ｐｃＤＮＡ３－ＲａｓＩｎＩＩ－ＩｐａＨ９．８および以下のうちの１つを共トランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるＥＧＦＰ蛍光活性のフローサイトメトリー定量を示す。ｐｃＤＮＡ３－ＥＧＦＰ－ＫＲａｓ、ｐｃＤＮＡ３－ＥＧＦＰ－ＫＲａｓＧ１２Ｃ、ｐｃＤＮＡ３－ＥＧＦＰ－ＫＲａｓＧ１２Ｄ、またはｐｃＤＮＡ３－ＥＧＦＰ－ＫＲａｓＧ１２Ｖ。ＭＦＩ比は、ＫＲａｓ変異体を発現する細胞の幾何学的ＭＦＩを、野生型（ｗｔ）ＫＲａｓを発現する細胞の幾何学的ＭＦＩに対して正規化することによって決定した。データは、生物学的三連実験の平均であり、エラーバーは、平均値の標準偏差（ＳＤ）を表す。 図５Ａ～図５Ｄは、ユビキボディｍＲＮＡのナノプレックス送達を介したマウスにおけるプロテオーム編集を示す。図５Ａは、強化されたｍＲＮＡ送達のためのｍＲＮＡ／ＰＡＢＰリボヌクレオタンパク質のポリアミン（ＴＥＰ（Ｎ４））媒介化学量論的アセンブリの概略図である。細胞（灰色の円）内移行後、ナノプレックスの脱アセンブリにより、分解または翻訳のいずれかを受けてｕＡｂタンパク質を産生するｍＲＮＡ／ＰＡＢＰが放出される。図５Ｂは、ＧＳ２－ＩｐａＨ９．８、ＧＳ２－ＩｐａＨ９．８Ｃ３３７Ａ、もしくはＡＳ１５－ＩｐａＨ９．８をコードするｍＲＮＡ、またはＰＡＢＰおよびＴＥＰ（Ｎ４）ポリアミン（ｍＲＮＡ：ＰＡＢＰ重量比＝１：５）で製剤化された同じｍＲＮＡから構成されるナノプレックスと共にインキュベートされた、ＨＥＫ２９３Ｔｄ２ＥＧＦＰ細胞におけるＥＧＦＰ蛍光活性のフローサイトメトリー定量を示す。送達から２４、４８、および７２時間後に測定を行った。データは、生物学的三連実験の平均±ＳＤとして表される。図５Ｃは、ＧＳ２－ＩｐａＨ９．８（白色の実線の円）、ＧＳ２－ＩｐａＨ９．８Ｃ３３７Ａ（白色の破線の円、上）、またはＡＳ１５－ＩｐａＨ９．８（白色の破線の円、下）をコードするｍＲＮＡを含有するナノプレックスの耳注射の０時間（上）および２４時間（下）後のＵＢＣ－ＧＦＰマウスの落射蛍光画像を示す。ヒートバーの数字は、放射効率（ｐ／ｓｅｃ／ｃｍ２／ｓｒ）／（μＷ／ｃｍ２）を表す。図５Ｄは、図５ＣにおけるＵｂｉ－ＧＦＰマウスの耳におけるＧＦＰ蛍光の定量化を示す。データは、各個々の耳領域（黒丸）の平均放射効率および各試料群の平均放射効率（赤色棒）として報告される（ＧＳ２－ＩｐａＨ９．８についてｎ＝６、ＧＳ２－ＩｐａＨ９．８Ｃ３３７Ａについてｎ＝３、およびＡＳ１５－ＩｐａＨ９．８についてｎ＝３）。ｐ値は、対応のある試料ｔ検定によって決定した。 図６Ａおよび図６Ｂは、細菌および哺乳動物Ｅ３ユビキチンリガーゼドメインを内部に有するｕＡｂによるＧＦＰサイレンシングを示す。示されるように、ｐｃＤＮＡ３－ＥＧＦＰ単独をトランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞、またはｐｃＤＮＡ３－ＥＧＦＰと（図６Ａに示すように）細菌もしくは（図６Ｂに示すように）哺乳動物Ｅ３ユビキチンリガーゼのうちの１つに融合したＧＳ２から構成されるｕＡｂをコードするプラスミドとを共トランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるＥＧＦＰ蛍光活性のフローサイトメトリー分析によって得られる代表的な蛍光ヒストグラム。幾何平均蛍光強度（「ＭＦＩ」）の値を示す。 図７Ａおよび図７Ｂは、ＧＳ２－ＩｐａＨ９．８結合活性および発現の特徴付けを示す。図７Ａにおいて、示されるように、ＧＳ２－ＩｐａＨ９．８の結合活性が、ＧＳ２単独、ＬＲＲドメインを欠くＩｐａＨ９．８（「ＩｐａＨ９．８ ＬＲＲ」）、または触媒不活性ＧＳ２－ＩｐａＨ９．８Ｃ３３７Ａと比較して示される。活性は、固定化抗原としてＧＦＰ、およびウェル当たり適用される１５ｍｇ／ｍＬの各タンパク質を使用してＥＬＩＳＡによって測定した。西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）に結合された抗ＦＬＡＧ抗体を使用して検出を行った。クエンチしたプレートを４５０ｎｍで読み取った（Ａｂｓ４５０）。データは、３回の生物学的反復実験の平均であり、エラーバーは、平均値の標準偏差（「ＳＤ」）である。図７Ｂは、示されるように、ＥＧＦＰをコードするプラスミドＤＮＡをトランスフェクトした、またはＥＧＦＰをコードするプラスミドＤＮＡおよびｐｃＤＮＡ３－ＧＳ２－ＩｐａＨ９．８Ｃ３３７ＡまたはｐｃＤＮＡ３－ＧＳ２－ＩｐａＨ９．８のいずれかを共トランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞に対応する共焦点顕微鏡画像を示す。非トランスフェクトＨＥＫ２９３Ｔ対照細胞も示される。Ｈｏｅｓｃｈｔ染色（青色）は細胞核を示し、ＥＧＦＰシグナル（緑色）はＦＰ標的発現を示し、－Ｈｉｓシグナル（赤色）は、透過処理細胞における発現したｕＡｂの免疫標識に対応する。 図８Ａおよび図８Ｂは、ＦＰ変異体および追加のＦＰ融合タンパク質標的のｕＡｂ媒介サイレンシングを示す。図８Ａは、ＦＰ変異体をコードするプラスミド、および示されるようにｐｃＤＮＡ３－ＧＳ２－ＩｐａＨ９．８Ｃ３３７Ａ（白色）またはｐｃＤＮＡ３－ＧＳ２－ＩｐａＨ９．８（灰色）のいずれかを共トランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞における蛍光活性のフローサイトメトリー定量を示す。ｍＣｈｅｒｒｙは陰性対照として機能した。データは、対応するＦＰ単独を発現するＨＥＫ２８３Ｔ細胞について測定されたＭＦＩに対して正規化された、生物学的三連実験の幾何学的ＭＦＩである。エラーバーは、平均値の標準偏差（ＳＤ）を表す。図８Ｂは、示されるＦＰ融合物単独（濃い灰色）をコードするプラスミドをトランスフェクトした、またはＦＰ融合物プラスミドおよびｐｃＤＮＡ３－ＧＳ２－ＩｐａＨ９．８Ｃ３３７Ａ（白色）またはｐｃＤＮＡ３－ＧＳ２－ＩｐａＨ９．８（薄い灰色）のいずれかを共トランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞における蛍光活性のフローサイトメトリー定量を示す。データは、対応するＦＰ単独を発現するＨＥＫ２８３Ｔ細胞について測定されたＭＦＩに対して正規化された、生物学的三連実験の幾何学的ＭＦＩである。エラーバーは、平均値の標準偏差（ＳＤ）を表す。 図９Ａ～図９Ｃは、ｕＡｂプラットフォームのモジュール性を例証する。図９Ａは、示されるように、ＥＧＦＰをコードするプラスミドＤＮＡをトランスフェクトした、または異なるＧＦＰ指向性結合タンパク質に融合したＩｐａＨ９．８から構成されるｕＡｂキメラをコードするプラスミドを共トランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるＥＧＦＰ蛍光活性のフローサイトメトリー定量を示す。図９Ｂは、示されるように、ＥＧＦＰ、ＥＲＫ２－ＥＧＦＰ、Ｈ２Ｂ－ＥＧＦＰ、またはＥＧＦＰＨＲａｓＧ１２Ｖを一過性または安定的に発現させたＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるＥＧＦＰ蛍光活性のフローサイトメトリー定量を示す。全ての場合において、細胞には、ｐｃＤＮＡ３－ＧＳ２－ＩｐａＨ９．８Ｃ３３７Ａ（白色）またはｐｃＤＮＡ３－ＧＳ２－ＩｐａＨ９．８（灰色）のいずれかをコードするプラスミドＤＮＡを一過性にトランスフェクトした。図９Ｃは、ＥＧＦＰ－ＨＲａｓＧ１２Ｖのみ、ＥＧＦＰ－ＨＲａｓＧ１２ＶおよびＧＳ２－ＩｐａＨ９．８、ＥＧＦＰＨＲａｓＧ１２ＶおよびＧＳ２－ＩｐａＨ９．８Ｃ３３７Ａ、またはＧＳ２－ＩｐａＨ９．８単独をコードするＤＮＡが安定的に組み込まれたＭＣＦ１０ａ細胞におけるＥＧＦＰ蛍光活性のフローサイトメトリー定量を示す。全てのデータは、ＥＧＦＰ単独を発現するＨＥＫ２８３Ｔ細胞について測定されたＭＦＩに対して正規化された、生物学的三連実験の幾何学的ＭＦＩである。エラーバーは、平均値の標準偏差（ＳＤ）を表す。
詳細な説明
本発明の技術の実質的な理解を提供するために、本願の特定の態様、様式、バリエーションおよび特徴が様々な詳細なレベルで以下に記載されることが理解されるべきである。本明細書で使用される特定の用語の定義を以下に提供する。別段の定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、一般に、本願が属する分野の当業者によって一般的に理解される意味と同じ意味を有する。
本願の主題を実施する際に、分子生物学、タンパク質生化学、細胞生物学、免疫学、微生物学、および組換えＤＮＡにおける多くの従来の技法が使用される。これらの技術は周知であり、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｓ．Ｉ－ＩＩＩ，Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｅｄ．（１９９７）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄ．（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８９））；ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｖｏｌｓ．Ｉ ａｎｄ ＩＩ，Ｇｌｏｖｅｒ，Ｅｄ．（１９８５）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｇａｉｔ，Ｅｄ．（１９８４）；Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，Ｈａｍｅｓ＆Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｅｄｓ．（１９８５）；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ，Ｈａｍｅｓ＆Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｅｄｓ．（１９８４）；Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ，Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｅｄ．（１９８６）；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，１９８６）；Ｐｅｒｂａｌ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ；ｔｈｅ ｓｅｒｉｅｓ，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，１９８４）、Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ，Ｍｉｌｌｅｒ＆Ｃａｌｏｓ，Ｅｄｓ．（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８７））；ａｎｄ Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，Ｖｏｌｓ．１５４ ａｎｄ １５５，Ｗｕ＆Ｇｒｏｓｓｍａｎ，ａｎｄ Ｗｕ，Ｅｄｓ．において記載されており、これらのすべては、それぞれ、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。ポリペプチド遺伝子発現産物のレベル、すなわち遺伝子翻訳レベルを検出および測定する方法は、当該技術分野において周知であり、抗体検出および定量化技術等のポリペプチド検出方法の使用を含む。Ｓｔｒａｃｈａｎ＆Ｒｅａｄ，Ｈｕｍａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ．（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９９）もまた参照のこと。これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本願の第１の態様は、単離されたキメラ分子に関する。単離されたキメラ分子は、Ｅ３ユビキチンリガーゼ（Ｅ３）モチーフを含む分解ドメインと、上記分解ドメインを基質へと特異的に方向付けることが可能な標的指向ドメインであって、上記分解ドメインに対して異種である、標的指向ドメインと、上記分解ドメインを上記標的指向ドメインに結合するリンカーとを含む。
本明細書で使用される場合、「キメラ分子」、「キメラポリペプチド」、および「キメラタンパク質」という用語は、第１のタンパク質またはポリペプチド配列の全長配列の少なくとも一部、ならびに第２のタンパク質またはポリペプチド配列の全長配列の少なくとも一部を含む配列を有する分子を包含し、ここで、第１および第２のタンパク質またはポリペプチドは、異なるタンパク質またはポリペプチドである。キメラ分子はまた、同じタンパク質またはポリペプチドに由来する２つ以上の非連続部分を含むタンパク質またはポリペプチドを包含する。キメラ分子はまた、少なくとも１つの置換を有するタンパク質またはポリペプチドも包含し、このキメラ分子は、第１のタンパク質またはポリペプチド配列の一部が第２のタンパク質またはポリペプチド配列の一部によって置換された第１のタンパク質またはポリペプチド配列を含む。本明細書で使用される場合、「キメラ分子」という用語は、本明細書で例示されるように、分解ドメインおよび標的領域を保有する分子をさらに指す。分解ドメインおよび標的領域は、当該技術分野で既知の方法で結合され得る。例えば、それらは、本明細書に例示されるリンカー分子を介して連結されてもよく、融合されてもよく、共有結合されてもよく、共有結合以外で結合されてもよい等である。さらに、分解ドメインおよび標的領域は、直接的に結合されていなくてもよく、および／または結合は一過性であってもよく、例えば、リンカーが使用される場合、リンカーは、切断可能であっても、切断不可能であってもよい。
本明細書で使用される場合、「ユビキチン化」という用語は、タンパク質ユビキチンの、他の分子のリジン残基への結合を指す。ペプチドまたはタンパク質等の分子のユビキチン化は、その急速な細胞分解、およびプロテアソーム複合体への標的指向化のためのシグナルとして作用し得る。
本明細書で使用される場合、「ユビキボディ」および「キメラ分子」という用語は、互換的に使用され、本明細書に例示されるように、リンカー領域によって連結された、少なくとも分解ドメインおよび標的領域を有する分子を指す。
本明細書で使用される場合、「標的ドメイン」または「標的指向ドメイン」または「標的指向部分」という用語は、キメラ分子内の第２の領域に共有結合したかまたは共有結合以外で結合したポリペプチド領域を意味し、これは、周囲の位置、細胞、および／または組織と比較して、標的の細胞下位置、細胞、または組織におけるキメラ分子または組成物の濃度を増強させる。
したがって、本願のキメラ分子は、基質結合のためにアクセス可能である、標的指向ドメインに結合した新規のＥ３リガーゼモチーフ（本明細書では、例えば、「Ｅ３リガーゼ（ＥＬ）」として参照される）ユビキチン領域を保有する。いくつかの実施形態において、基質は細胞内基質である。しかし、汎用性を容易にするために、標的指向ドメインは、モノボディ（例えば、フィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン（「ＦＮ３」））、抗体、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、組換え抗体、抗体フラグメント、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｔａｓｃＦｖ、ビス－ｓｃＦｖ、ｓｄＡｂ、ＶＨ、ＶＬ、Ｖｎａｒ、ｓｃＦｖＤ１０、ｓｃＦｖ１３Ｒ４、ｓｃＦｖＤ１０、ヒト化抗体、キメラ抗体、相補性決定領域（ＣＤＲ）、ＩｇＡ抗体、ＩｇＤ抗体、ＩｇＥ抗体、ＩｇＧ抗体、ＩｇＭ抗体、ナノボディ、イントラボディ、ユニボディ、ミニボディ、ＰＲＯＴＡＣ、アプタマードメイン、ユビキチン結合ドメイン配列、Ｅ３結合ドメイン、非抗体タンパク質骨格、アドネクチン、アフィボディおよびそれらの２ヘリックス変異体、アンチカリン、ラクダ科抗体（例えば、ＶＨＨ）、ノッチン（ｋｎｏｔｔｉｎ）、ＤＡＲＰｉｎ、および／またはＳｓｏ７ｄに由来する。
当業者は、いくつかの実施形態において、このような標的指向ドメインが、本明細書に記載される新規のＥ３リガーゼモチーフ領域に従って細胞／組織特異性を保有することを容易に理解する。一実施形態において、標的指向ドメインは非天然基質に結合する。
本明細書で使用される場合、モノボディという用語は、例えば、ＦＮ３およびＤＡＲＰｉｎ、または、基質等に特異的に結合するか、もしくはそれと反応する結合部位を含有するポリペプチドを含む、非免疫グロブリン分子の任意の結合部分を含み得る。本願によるモノボディには、フィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン（「ＦＮ３」）を分子骨格として使用して構築される合成結合タンパク質が含まれる。モノボディは、標的結合タンパク質を作製するための抗体の単純かつ堅牢な代替物である。モノボディは、天然抗体分子の欠点を克服することを目的とする抗体模倣物（ｍｉｍｉｃｓ）（または抗体模倣物（ｍｉｍｅｔｉｃｓ））および代替骨格と総称される分子のクラスに属する。従来の抗体を超えたモノボディの主な利点は、モノボディが、遺伝子コードされた細胞内阻害物質として容易に使用することができ、すなわち、モノボディ阻害物質は、細胞にモノボディ発現ベクターをトランスフェクションすることによって選択される細胞において発現され得ることである。これは、ＦＮ３骨格の基礎となる特徴、小さな（約９０個の残基）、安定した、産生しやすい、および細胞質および核の還元環境を含む細胞環境の酸化還元電位にかかわらず機能的モノボディを産生することを可能にするジスルフィド結合の欠如に起因する。一実施形態において、標的指向ドメインはモノボディである。モノボディは、ＧＳ２、Ｎｓａ５、およびＲａｓＩｎＩＩからなる群から選択されるフィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン（ＦＮ３）モノボディであり得る。ＧＳ２モノボディは、例えば、緑色蛍光タンパク質（「ＧＦＰ」）を認識することができる。ＮＳａ５モノボディは、例えば、ＳＨＰ２のＳｒｃ相同２（ＳＨ２）ドメイン（Ｓｈａ ｅｔ ａｌ．，“Ｄｉｓｓｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ＢＣＲ－ＡＢＬ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｎｅｔｗｏｒｋ Ｕｓｉｎｇ Ｈｉｇｈｌｙ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｍｏｎｏｂｏｄｙ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｔｏ ｔｈｅ ＳＨＰ２ ＳＨ２ Ｄｏｍａｉｎｓ，”Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １１０（３７）：１４９２４－２９（２０１３）、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）、ならびにＨＲａｓ、ＫＲａｓ、およびＧ１２Ｖ変異体に特異的なＲａｓＩｎＩＩの各々（Ｃｅｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，“ＲａｓＩｎｓ：Ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ Ｅｎｃｏｄｅｄ Ｉｎｔｒａｂｏｄｉｅｓ ｏｆ Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｒａｓ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，”Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４２９（４）：５６２－５７３（２０１７）、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に特異的であり得る。
モノボディである標的指向ドメインは、例えば、フィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン（ＦＮ３）モノボディであってもよい。ＦＮ３モノボディの例としては、限定されないが以下（括弧内に標的抗原を示す）が挙げられる：ＧＳ２（ＧＦＰ）、Ｎｓａ５（ＳＨＰ２）、ＲａｓＩｎＩ（ＨＲａｓ／ＫＲａｓ）、およびＲａｓＩｎＩＩ（ＨＲａｓ／ＫＲａｓ）、１Ｄ１０（ＣＤＣ３４）、１Ｄ７（ＣＯＰＳ５）、１Ｃ４（ＭＡＰ２Ｋ５）、２Ｃ１２（ＭＡＰ２Ｋ５）、１Ｅ２（ＳＦ３Ａ１）、１Ｃ２（ＵＳＰ１１）、１Ａ９（ＵＳＰ１１）、Ｕｂｉ４（ユビキチン）、ＥＩ１．４．１（ＥＧＦＲ）、ＥＩ２．４．６（ＥＧＦＲ）、ＥＩ３．４．３（ＥＧＦＲ）、ＥＩ４．２．１（ＥＧＦＲ）、ＥＩ４．４．２（ＥＧＦＲ）、ＥＩ６．２．６（ＥＧＦＲ）、ＥＩ６．２．１０（ＥＧＦＲ）、Ｅ２４６（ＥＧＦＲ）、Ｃ７４３（ＣＥＡ）、ＩＩＩａ８．２．６（ＦｃγＩＩａ）、ＩＩＩａ６．２．６（ＦｃγＩＩＩａ）、ｈＡ２．２．１（ｈＡ３３）、ｈＡ２．２．２（ｈＡ３３）、ｈＡ３．２．１（ｈＡ３３）、ｈＡ３．２．３（ｈＡ３３）、ｍＡ３．２．１（ｍＡ３３）、ｍＡ３．２．２（ｍＡ３３）、ｍＡ３．２．３（ｍＡ３３）、ｍＡ３．２．４（ｍＡ３３）、ｍＡ３．２．５（ｍＡ３３）、Ａｌｂ３．２．１（ｈＡｌｂ）、ｍＩ２．２．１（ｍＩｇＧ）、ＨＡ４（ＡｂｌＳＨ２）、ＨＡ１０（ＡｂｌＳＨ２）、ＨＡ１６（ＡｂｌＳＨ２）、ＨＡ１８（ＡｂｌＳＨ２）、１５９（ｖＥＧＦＲ）、ＭＵＣ１６（ＭＳＬＮ）、Ｅ２＃３（ＥＲα／ＥＦ）、Ｅ２＃４（ＥＲα／ＥＦ）、Ｅ２＃５（ＥＲα／ＥＦ）、Ｅ２＃６（ＥＲα／ＥＦ）、Ｅ２＃７（ＥＲα／ＥＦ）、Ｅ２＃８（ＥＲα／ＥＦ）、Ｅ２＃９（ＥＲα／ＥＦ）、Ｅ２＃１０（ＥＲα／ＥＦ）、Ｅ２＃１１（ＥＲα／ＥＦ）、Ｅ２＃２３（ＥＲα／ＥＦ）、Ｅ３＃２（ＥＲα／ＥＦ）、Ｅ３＃６（ＥＲα／ＥＦ）、ＯＨＴ＃３１（ＥＲα／ＥＦ）、ＯＨＴ＃３２（ＥＲα／ＥＦ）、ＯＨＴ＃３３（ＥＲα／ＥＦ）、ＡＢ７－Ａ１（ＥＲα／ＥＦ）、ＡＢ７－Ｂ１（ＥＲα／ＥＦ）、ＭＢＰ－７４（ＭＢＰ）、ＭＢＰ－７６（ＭＢＰ）、ＭＢＰ－７９（ＭＢＰ）、ｈＳＵＭＯ４－３３（ｈＳＵＭＯ４）、ｈＳＵＭＯ－３９（ｈＳＵＭＯ４）、ｙＳＵＭＯ－５３（ｙＳＵＭＯ）、ｙＳＵＭＯ－５６（ｙＳＵＭＯ）、ｙＳＵＭＯ－５７（ｙＳＵＭＯ）、Ｔ１４．２５（ＴＮＦα）、Ｔ１４．２０（ＴＮＦα）、ＦＮｆｎ１０－３ＪＣＬ１４（ａｖβ３インテグリン）、１Ｃ９（Ｓｒｃ ＳＨ３）、１Ｆ１１（Ｓｒｃ ＳＨ３）、１Ｆ１０（Ｓｒｃ ＳＨ３）、２Ｇ１０（Ｓｒｃ ＳＨ３）、２Ｂ２（Ｓｒｃ ＳＨ３）、１Ｅ３（Ｓｒｃ ＳＨ３）、Ｅ１８（ＶＥＧＦＲ２）、Ｅ１９（ＶＥＧＦＲ２）、Ｅ２６（ＶＥＧＦＲ２）、Ｅ２９（ＶＥＧＦＲ２）、ＦＧ４．２（リゾチーム）、ＦＧ４．１（リゾチーム）、２Ｌ４．１（リゾチーム）、ＢＦ４．１（リゾチーム）、ＢＦ４．９（リゾチーム）、ＢＦ４．４（リゾチーム）、ＢＦｓ１ｃ４．０１（リゾチーム）、ＢＦｓ１ｃ４．０７（リゾチーム）、ＢＦｓ３＿４．０２（リゾチーム）、ＢＦｓ３＿４．０６（リゾチーム）、ＢＦｓ３＿８．０１（リゾチーム）、１０Ｃ１７Ｃ２５（ホスホ－ＩκＢα）、Ｆｎ－Ｎ２２（ＳＡＲＳ Ｎ）、Ｆｎ－Ｎ１７（ＳＡＲＳ Ｎ）、ＦＮ－Ｎ１０（ＳＡＲＳ Ｎ）、ｇＩ２．５．３Ｔ８８Ｉ（ヤギＩｇＧ）、ｇＩ２．５．２（ヤギＩｇＧ）、ｇＩ２．５．４（ヤギＩｇＧ）、ｒＩ４．５．４（ウサギＩｇＧ）、ｒＩ４．３．１（ウサギＩｇＧ）、ｒＩ３．６．６（ウサギＩｇＧ）、ｒＩ４．３．４（ウサギＩｇＧ）、ｒＩ３．６．４（ウサギＩｇＧ）、およびｒＩ４．３．３（ウサギＩｇＧ）。
本明細書で使用される場合、抗体という用語は、免疫グロブリン、および免疫グロブリン、例えば、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、およびＩｇＥの任意の抗原結合部分、または抗原結合部位を含有するポリペプチドを含み得、これは、免疫原、抗原、基質等に特異的にまたは「免疫特異的に結合する」、または「免疫反応する」。抗体は、少なくとも１つの重（Ｈ）鎖および少なくとも１つのジスルフィド結合によって相互接続された少なくとも１つの軽（Ｌ）鎖を含むことができる。用語「ＶＨ」は、抗体の重鎖可変領域を指す。用語「ＶＬ」は、抗体の軽鎖可変領域を指す。いくつかの実施形態において、用語「抗体」はモノクローナル抗体およびポリクローナル抗体を特異的に包含する。「ポリクローナル抗体」は、抗原（単数または複数）で免疫化された動物の血清に由来する抗体を指す。「モノクローナル抗体」は、ハイブリドーマ細胞の単一クローンによって産生される抗体を指す。
本願の標的指向ドメインとして有用な抗体関連分子、ドメイン、フラグメント、部分等としては、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２、Ｆｄ、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、一本鎖抗体、ジスルフィド連結Ｆｖ（ｓｄＦｖ）、ならびにＶＬまたはＶＨドメインのいずれかを含むフラグメントが挙げられるが、これらに限定されない。例としては、（ｉ）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインからなる一価のフラグメントである、Ｆａｂフラグメント、（ｉｉ）ヒンジ領域でジスルフィド架橋により連結された２つのＦａｂフラグメントを含む二価のフラグメントである、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、（ｉｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄフラグメント、（ｉｖ）抗体の単一アームのＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖフラグメント、（ｖ）ＶＨドメインからなる、ｄＡｂフラグメント（Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．，“Ｂｉｎｄｉｎｇ Ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｏｆ ａ Ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ ｏｆ Ｓｉｎｇｌｅ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｖａｒｉａｂｌｅ Ｄｏｍａｉｎｓ Ｓｅｃｒｅｔｅｄ Ｆｒｏｍ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ，”Ｎａｔｕｒｅ ３４１：５４４－４６（１９８９）、これは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）、ならびに（ｖｉ）単離された相補的決定領域（ＣＤＲ）が挙げられる。そのような「抗体フラグメント」は、全長抗体の一部、概してその抗原結合または可変領域を含むことができる。抗体フラグメントの例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖフラグメント、ダイアボディ、直鎖抗体、一本鎖抗体分子、ならびに抗体フラグメントから形成される多重特異性抗体が挙げられる。一本鎖抗体分子は、いくつかの個々の分子、例えば、二量体、三量体、または他のポリマーを有するポリマーを含んでもよい。
本明細書で使用される「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均質な抗体の集団から得られる抗体を含んでもよく、すなわち、その集団を含む個々の抗体は、少量で存在し得る可能性のある天然に存在する変異を除いて同一である。しかし、本願に従って使用されるモノクローナル抗体は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｋｏｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，“Ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｏｆ Ｆｕｓｅｄ Ｃｅｌｌｓ Ｓｅｃｒｅｔｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｙ ｏｆ Ｐｒｅｄｅｆｉｎｅｄ Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ”Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５（１９７５）によって最初に記載されたハイブリドーマ法によって作製され得るか、または組換えＤＮＡ法によって作製され得る。例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第４，８１６，５６７号を参照のこと。「モノクローナル抗体」はまた、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、Ｃｌａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，“Ｍａｋｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ Ｕｓｉｎｇ Ｐｈａｇｅ Ｄｉｓｐｌａｙ Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ”Ｎａｔｕｒｅ ３５２：６２４－２８（１９９１）およびＭａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．，“Ｂｙ－Ｐａｓｓｉｎｇ Ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ．Ｈｕｍａｎ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｆｒｏｍ Ｖ－Ｇｅｎｅ Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ Ｄｉｓｐｌａｙｅｄ ｏｎ Ｐｈａｇｅ”Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１－９７（１９９１）に記載された技術を使用してファージ抗体ライブラリから単離することができる。
本明細書で使用される場合、「ポリクローナル抗体」という用語は、例えば、少なくとも２つの異なる抗体産生細胞株に由来する抗体の調製物を含む。この用語の使用は、抗原の異なるエピトープまたは領域に特異的に結合する抗体を含有する少なくとも２つの抗体の調製物を含む。
本明細書で使用される場合、用語「一本鎖抗体」または「一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）」は、Ｆｖフラグメント、ＶＬおよびＶＨの２つのドメインの抗体融合分子を指し得る。Ｆｖフラグメントの２つのドメインであるＶＬおよびＶＨは、別個の遺伝子によってコードされるが、それらは、組換え方法を使用して、ＶＬおよびＶＨ領域が対合して一価の分子（一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られる）を形成する単一のタンパク質鎖としてそれらを作製することを可能にする合成リンカーによって結合することができる。例えば、Ｂｉｒｄ ｅｔ ａｌ．，“Ｓｉｎｇｌｅ－Ｃｈａｉｎ Ａｎｔｉｇｅｎ－Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，”Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３－２６（１９８８）ａｎｄ Ｈｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，“Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｓｉｔｅｓ：Ｒｅｃｏｖｅｒｙ ｏｆ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ ａｎ Ａｎｔｉ－Ｄｉｇｏｘｉｎ Ｓｉｎｇｌｅ－Ｃｈａｉｎ Ｆｖ Ａｎａｌｏｇｕｅ Ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ，”Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：５８７９－８３（１９８８）を参照のこと。これらは、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。このような一本鎖抗体は、「抗体」フラグメントという用語への参照によって含まれ、組換え技法またはインタクトな抗体の酵素的もしくは化学的切断によって調製することができる。
本明細書で使用される場合、「可変」という用語は、例えば、可変ドメインの特定のセグメントが、抗体間で配列が大きく異なるという事実を指し得る。Ｖドメインは、抗原結合を媒介し、その特定の抗原に対する特定の抗体の特異性を規定する。しかし、可変性は、可変ドメインのアミノ酸スパンにわたって均等に分布しているわけではない。代わりに、Ｖ領域は、１５～３０個のアミノ酸のフレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる比較的不変の伸長からなり、これは、それぞれ９～１２個のアミノ酸の長さである「超可変領域」と呼ばれる極めて可変性の短い領域によって分離されている。天然の重鎖および軽鎖の可変ドメインは、それぞれ、βシート構造を接続し、場合によってはβシート構造の一部を形成するループを形成する３つの超可変領域によって接続されたβシート構成を主に採用した４つのＦＲを含む。各鎖内の超可変領域は、ＦＲによって密接に一緒に保持され、他方の鎖からの超可変領域と共に、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する。Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ．（１９９１）を参照のこと。これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。定常ドメインは、抗体の抗原への結合に直接関与しないが、抗体の抗体依存性細胞毒性（「ＡＤＣＣ」）への関与等の様々なエフェクター機能を示す。
本願の標的指向ドメインは、例えば、単一特異性、二重特異性、三重特異性、またはより大きな多重特異性であり得る。多重特異性標的指向ドメインは、基質の異なるエピトープに特異的であり得、または本願の基質ポリペプチドおよび異種組成物、例えば、異種ポリペプチドまたは固体支持体材料の両方に特異的であり得る。例えば、ＷＯ ９３／１７７１５；ＷＯ ９２／０８８０２；ＷＯ ９１／００３６０；ＷＯ ９２／０５７９３；Ｔｕｔｔ ｅｔ ａｌ．，“Ｔｒｉｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｆ（ａｂ’）３ Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ Ｔｈａｔ Ｕｓｅ Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｅ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｖｉａ ｔｈｅ ＴＣＲ／ＣＤ３ Ｃｏｍｐｌｅｘ ａｎｄ ＣＤ２ ｔｏ Ａｃｔｉｖａｔｅ ａｎｄ Ｒｅｄｉｒｅｃｔ Ｒｅｓｔｉｎｇ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｔ Ｃｅｌｌｓ，”Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：６０－６９（１９９１）、米国特許第５，５７３，９２０号、第４，４７４，８９３号、第５，６０１，８１９号、第４，７１４，６８１号、第４，９２５，６４８号、第６，１０６，８３５号、Ｋｏｓｔｅｌｎｙ ｅｔ ａｌ．，“Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ａ Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ Ａｎｔｉｂｏｄｙ ｂｙ ｔｈｅ Ｕｓｅ ｏｆ Ｌｅｕｃｉｎｅ Ｚｉｐｐｅｒｓ，”Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：１５４７－５３（１９９２）を参照のこと。これらは、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。本願の標的指向ドメインは、鳥類および哺乳動物を含む任意の動物起源に由来することができる。例えば、標的指向ドメインは、ヒト、海洋動物、ウサギ、ヤギ、モルモット、ラクダ、ウマ、またはニワトリ由来であってもよい。
標的基質へと方向付けられる標的指向ドメインを生成するための技術は、当業者には周知である。そのような技術の例は、限定されないが、例えば、ディスプレイライブラリ、ゼノ（ｘｅｎｏ）マウスまたはｈｕｍａｂマウス、ハイブリドーマ等を伴うものを含む。本願の範囲内において標的指向ドメインが誘導される標的ポリペプチドとしては、抗原性を示すことができる任意のポリペプチドまたはポリペプチド誘導体が挙げられる。例として、限定されないが、基質およびそのフラグメントが挙げられる。いくつかの実施形態において、標的指向ドメインは一本鎖抗体である。
一本鎖抗体（「ｓｃＦｖ」）は、フレキシブル領域によって軽鎖の可変ドメインに結合した、アミノ末端にある重鎖の可変ドメインからなる遺伝子操作抗体である。いくつかの実施形態において、ｓｃＦｖは、既知の標的特異性を有するモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を発現するハイブリドーマ細胞株からＰＣＲによって生成されるか、またはそれらは、脾臓細胞もしくはリンパ球から単離されたライブラリからファージディスプレイによって選択され、親抗体の親和性を保持する。細胞内基質を同定するためのプロトコルを利用して、酵母２ハイブリッド技術は候補ｓｃＦｖ－タンパク質相互作用を同定する役割を果たす。そのようなシステムは、インビボでｓｃＦｖがその標的基質を認識することができるかどうかを予測するのに有用である。Ｐｏｒｔｎｅｒ－Ｔａａｌｉａｎａ ｅｔ ａｌ．，“Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｉｎｇｌｅ ｃｈａｉｎ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ Ｉｎ Ｖｉｖｏ Ｕｓｉｎｇ Ｔｗｏ－Ｈｙｂｒｉｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，”Ｐｒｏｔｅｉｎ－Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ：Ａ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｈａｐｔｅｒ ２４（（著作権）２００２）を参照のこと。これらは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
典型的には、ディスプレイベクターにクローニングされているｓｃＦｖ、ハイブリッド抗体またはハイブリッド抗体フラグメントは、抗体または抗体フラグメントがファージまたはファージミド粒子の表面に存在するため、良好な結合活性を維持した変異体を同定するために適切な抗原に対して選択することができる。例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｂａｒｂａｓ ＩＩＩ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈａｇｅ Ｄｉｓｐｌａｙ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，２００１）を参照のこと。しかし、選択および／またはスクリーニングのために抗体フラグメントライブラリを溶解ファージベクター（修飾Ｔ７またはＬａｍｂｄａ Ｚａｐ系）にクローニングする等の、他のベクターフォーマットを、このプロセスのために使用することができる。
一般に、組換えＤＮＡ技術において有用な発現ベクターは、プラスミド形態であることが多い。しかし、本願は、等価な機能を果たすウイルスベクター、例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルス、およびアデノ関連ウイルス等の技術的にプラスミドではないそのような他の形態の発現ベクターを含むことが意図される。このようなウイルスベクターは、対象の感染および化合物のその対象における発現を可能にする。発現制御配列は、典型的には、真核宿主細胞の形質転換またはトランスフェクションが可能なベクターにおける真核プロモーター系である。一旦ベクターが適切な宿主に組み込まれると、宿主は、標的指向ドメインをコードするヌクレオチド配列の高レベル発現のために、ならびに基質結合物質、例えば、交差反応抗基質抗体の収集および精製のために好適な条件下で、維持される。一般に、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許公開第２００２／０１９９２１３号を参照のこと。ベクターはまた、細胞外抗体フラグメントの分泌を方向付けるのに有用なシグナルペプチド、例えば、ペクチン酸リアーゼをコードすることができる。参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第５，５７６，１９５号を参照のこと。
本明細書で使用される場合、「分解ドメイン」または「分解領域」という用語は、基質のユビキチン化を促進することができるキメラ分子の一部を含む。分解ドメインは、天然結合タンパク質（ｎａｔｉｖｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）との相互作用のための第２の「結合」領域を有し得る。結合領域は、１つ以上の変異、置換、欠失を保有するように修飾され得るか、または完全に欠失され得る。
分解ドメインは、ＨＥＣＴ型、ＲＩＮＧまたはＵボックス（ＲＩＮＧ／Ｕボックス）型、およびＦボックスドメイン等の真核生物Ｅ３に類似した折り畳みを有するＥ３模倣物、ならびにＮＥＬ、ＸＬボックス含有、およびＳｉｄＣ等の任意の他の真核生物Ｅ３とは異なる折り畳みを有する非従来的なＥ３を含んでもよい。分解ドメインは、１つ以上のユビキチン分子および／またはユビキチン様分子を基質に結合させることによって基質を修飾することができるポリペプチドまたはポリペプチド領域に関する。この点において、このような領域は、Ｅ１、Ｅ２、およびＥ３酵素の協調作用を伴う周知のユビキチン化カスケードに適合し、これは、ユビキチンを活性化し、それに付随して基質にユビキチンを結合させるように機能する。いくつかの実施形態において、モチーフは新規のＥ３リガーゼまたはそのフラグメントからなるユビキチン領域であり、これは基質特異的な様式でユビキチンの転移を触媒する。Ｑｉａｎ ｅｔ ａｌ．，“Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ａ Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ Ｌｉｇａｓｅ Ｒｅｖｅａｌｓ Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ Ｆｌｅｘｉｂｉｌｉｔｙ Ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ Ｔｒａｎｓｆｅｒ，”Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８４（３９）：２６７９７－８０２（２００９）を参照のこと。これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本明細書で使用される場合、ポリペプチド、タンパク質、領域、ドメイン等の「修飾（複数可）」または「アミノ酸修飾」という用語は、所望の残基の欠失、付加または変異等の天然配列の変化を指す。このような修飾ポリペプチドは、抗体核酸に適切なヌクレオチド変化を導入することによって、またはペプチド合成によって調製される。目的の抗体を得るために、得られる抗体が所望の特性を保有する限り、欠失、挿入、および置換の任意の組み合わせが行なわれる。修飾はまた、タンパク質のグリコシル化パターンの変化も含む。突然変異誘発のための好ましい位置の特定のための有用な方法は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ ａｎｄ Ｗｅｌｌｓ，“Ｈｉｇｈ－Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｅｐｉｔｏｐｅ Ｍａｐｐｉｎｇ ｏｆ ｈＧＨ－Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｂｙ Ａｌａｎｉｎｅ－Ｓｃａｎｎｉｎｇ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ，”Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：１０８１－８５（１９８９）によって記載されたように、「アラニンスキャニング突然変異誘発」と呼ばれる。次いで、変異抗体が所望の活性についてスクリーニングされる。
用語「ポリペプチド」、「タンパク質」、および「ペプチド」は、アミノ酸残基がペプチド結合または修飾ペプチド結合によって連結されているアミノ酸鎖を指すために本明細書において互換的に使用される。アミノ酸鎖は、２個のアミノ酸を超える任意の長さであり得る。別途指定されない限り、用語「ポリペプチド」、「タンパク質」、および「ペプチド」は、その様々な修飾型も包含する。このような修飾型は、天然に存在する修飾型または化学的に修飾された型であり得る。修飾型の例として、限定されないが、グリコシル化型、リン酸化型、ミリストイル化型、パルミトイル化型、リボシル化型、アセチル化型、ユビキチン化型等が挙げられる。修飾はまた、脂質、フラビン、ビオチン、ポリエチレングリコールまたはその誘導体等の様々な部分への分子内架橋および共有結合を含み、加えて、修飾はまた、環化、分岐および架橋を含んでもよい。さらに、遺伝子によってコードされる従来の２０種のアミノ酸以外のアミノ酸もまたポリペプチドに含まれてもよい。一実施形態において、本明細書においてＥＬまたはＮＥＬとも称されるＥ３ユビキチンリガーゼモチーフ（Ｅ３）は、修飾結合領域を有しない上記Ｅ３モチーフと比較して、上記基質への結合を阻害または減少させる修飾結合領域を含む。別の実施形態において、修飾は、結合領域における変異または欠失である。
本明細書で使用される場合、「変異体（ｖａｒｉａｎｔ）」または「変異体（ｍｕｔａｎｔ）」という用語は、天然に存在するタンパク質またはペプチドへの修飾によって、天然に存在するタンパク質またはペプチド、すなわち「プロトタイプ」または「野生型」タンパク質とは異なるが、天然に存在する型の塩基性タンパク質および側鎖構造を維持するタンパク質またはペプチドを指すために使用される。このような変化としては、限定されないが、１つ、少数、またはいくつかのアミノ酸側鎖における変化；欠失、例えば、タンパク質またはペプチドの切断型バージョン、挿入および／または置換を含む、１つ、少数、またはいくつかのアミノ酸における変化；１つまたはいくつかの原子の立体化学における変化；ならびに／またはメチル化、グリコシル化、リン酸化、アセチル化、ミリストイル化、プレニル化、パルミチン酸化、アミド化、および／またはグリコシルホスファチジルイノシトールの添加を含むが、これらに限定されない軽微な誘導体化が挙げられる。「変異体（ｖａｒｉａｎｔ）」または「変異体（ｍｕｔａｎｔ）」は、天然に存在するタンパク質またはペプチドと比較して、増強された、減少された、変化した、または実質的に類似した特性を有することができる。
いくつかの実施形態において、キメラ分子の分解ドメインは内因性基質認識領域、すなわち天然（ｎａｔｕｒａｌ）または天然結合（ｎａｔｉｖｅ ｂｉｎｄｉｎｇ）パートナーと相互作用するポリペプチドの一部を欠く。分解ドメインのＥ３モチーフは、修飾結合領域を有しないＥ３モチーフと比較して、基質への結合を阻害または減少させる修飾結合ドメインを保有し得る。それにもかかわらず、Ｅ３モチーフは、いくつかの実施形態において基質のタンパク質分解を可能にする。いくつかの実施形態において、修飾は、結合領域の変異、置換、または欠失である。置換は、保存的または非保存的アミノ酸置換等のアミノ酸置換であり得る。
Ｅ３モチーフの非保存的アミノ酸置換は、アルキルアミノ酸が配列中のアルキルアミノ酸以外のアミノ酸に置換され、芳香族アミノ酸がＥ３モチーフ中の芳香族アミノ酸以外のアミノ酸に置換され、硫黄含有アミノ酸がＥ３モチーフ中の硫黄含有アミノ酸以外のアミノ酸に置換され、ヒドロキシ含有アミノ酸がＥ３モチーフ中のヒドロキシ含有アミノ酸以外のアミノ酸に置換され、酸性アミノ酸がＥ３モチーフ中の酸性アミノ酸以外のアミノ酸に置換され、塩基性アミノ酸がＥ３モチーフ中の塩基性アミノ酸以外のアミノ酸に置換され、または二塩基性モノカルボキシルアミノ酸がＥ３モチーフ中の二塩基性モノカルボキシルアミノ酸以外のアミノ酸に置換される置換である。
一般的なアミノ酸のうち、例えば、「非保存的アミノ酸置換」は、以下の群のうちの１つからのアミノ酸を、以下のように、同じ群ではないアミノ酸で置換することによって例証される。（１）グリシン、アラニン、（２）バリン、ロイシン、およびイソロイシン、（３）フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファン、（４）システインおよびメチオニン、（５）セリンおよびトレオニン、（６）アスパラギン酸およびグルタミン酸、（７）グルタミンおよびアスパラギン、ならびに（８）リジン、アルギニン、およびヒスチジン。
例えば、Ｅ３モチーフにおける保存的または非保存的アミノ酸変化は、そのような領域をコードするヌクレオチドに対して適切なヌクレオチドを置換することによって導入することができる。これらの修飾は、例えば、オリゴヌクレオチド指定突然変異誘発、リンカースキャニング突然変異誘発、ポリメラーゼ連鎖反応を使用する突然変異誘発等によって得ることができる。Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．）、Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，５ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（２００２）、概して、ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ（ｅｄ．），Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ（１９９１）を参照されたい、これは、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。配列バリエーションのための位置を同定するための有用な方法は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ ａｎｄ Ｗｅｌｌｓ “Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｓｉｔｅｓ：Ｒｅｃｏｖｅｒｙ ｏｆ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ ａｎ Ａｎｔｉ－Ｄｉｇｏｘｉｎ Ｓｉｎｇｌｅ－Ｃｈａｉｎ Ｆｖ Ａｎａｌｏｇｕｅ Ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ，”Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：１０８１－８５（１９８９）によって記述された「アラニンスキャニング変異誘発」と呼ばれる。
ユビキチンリガーゼファミリーには、Ｅ２コンジュガーゼから基質へのユビキチンの転移に関するＥ６関連タンパク質Ｃ末端（「ＨＥＣＴ」）ドメインリガーゼ、Ｅ２に結合し、Ｅ２－Ｅ３複合体における酵素活性を媒介し得る、実に興味深い新たな遺伝子（「ＲＩＮＧ」）ドメインリガーゼ、およびＺｎ２＋結合リガンドの完全な相補体を有しない修飾ＲＩＮＧモチーフリガーゼファミリーを構成するＵボックスユビキチンリガーゼファミリー（「ＵＵＬ」）が含まれるが、これらに限定されない。Ｃｏｌａｓ ｅｔ ａｌ．，“Ｔａｒｇｅｔｅｄ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｐｏｒｔａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ．”Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９７（２５）：１３７２０－２５（２００５）を参照のこと。これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
Ｕボックスユビキチンリガーゼ（「ＵＬＬ」）は、多くの他のユビキチンリガーゼに典型的なタンパク質ドメインである、ＲＩＮＧフィンガーに構造的に関連するＵボックスを有するとして特徴付けられる。ヒトにおいては、ＵＵＬコード遺伝子としては、限定されないが、ＵＢＥ４ＡおよびＵＢＥ４Ｂ遺伝子（それぞれ、ＵＦＤ２ｂおよびＵＦＤ２ａとも称される）、ＣＨＩＰ（ＳＴＵＢ１とも称される）、ＵＩＰ５（Ｕボックス５とも称される）、ＰＲＰ１９（ＰＲＰＦ１９またはＳＮＥＶとも称される）、ＣＹＣ４（ＰＰＩＬ２またはＣｙｐ－６０とも称される）、ＷＤＳＵＢ１、およびＡＣＴ１（ＴＲＡＦ３ＩＰ２とも称される）が挙げられる。Ｍａｒｉｎ，Ｉ．，“Ａｎｃｉｅｎｔ Ｏｒｉｇｉｎ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｕ－ｂｏｘ Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ Ｌｉｇａｓｅｓ．”ＢＭＣ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ Ｂｉｏｌｏｇｙ １０：３３１，ｐｐ．１－１５（２０１０）を参照のこと。これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
ＨＥＣＴ Ｅ３リガーゼは、ユビキチン化中の触媒作用に直接的な役割を有するが、ＲＩＮＧおよびＵボックスＥ３タンパク質は、基質ユビキチン化を促進するためにＥ２および基質分子を動員するアダプター分子として作用することによって、タンパク質ユビキチン化を容易にする。ＭＤＭ２（マウスダブル微小クローン２腫瘍性タンパク質）およびｃ－Ｃｂｌ等の多くのＲＩＮＧ型Ｅ３リガーゼは、単独で作用し得るが、他のリガーゼは、アナフェーズ促進複合体（「ＡＰＣ」）等のはるかに大きな多タンパク質複合体の成分として見出される。まとめると、これらの多面的な特性および相互作用により、Ｅ３酵素は、真核生物の全ての細胞内のタンパク質クリアランスのための強力かつ特異的な機構を提供することが可能になる。Ａｒｄｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，“Ｅ３ Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ Ｌｉｇａｓｅｓ．”Ｅｓｓａｙｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ．４１：１５－３０（２００５）、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
それでも、Ｅ３遺伝子産物に関する機能情報は変化しやすい。Ｕボックスタンパク質ＣＨＩＰは、コ－シャペロンとして、例えば、Ｈｓｃ７０、Ｈｓｐ７０およびＨｓｐ９０等のシャペロンと共に、ユビキチンリガーゼとして、単独で、または他のＥ３タンパク質を含み得る複合体の一部としての両方として作用する。同文献を参照のこと。しかし、特定の基質に対するユビキチンプロテアソームシステムの選択性は、ユビキチン結合酵素、例えば、Ｅ２とユビキチンタンパク質リガーゼとの間の相互作用に依存する。タンパク質基質の翻訳後修飾、例えば、リン酸化またはヒドロキシル化等は、ユビキチン化の前にしばしば必要とされる。このようにして、特定の基質に対する正確な空間時間的標的指向化および分解を達成することができる。
本明細書に開示される分解ドメインのＥ３モチーフは、天然結合パートナーからの立体破壊なしに基質をユビキチン化することができる機能性Ｅ３リガーゼを保有する。Ｅ３モチーフに加えて、いくつかの実施形態において、分解ドメインは、ＨＥＣＴ型、ＲＩＮＧ型またはＵボックス（ＲＩＮＧ／Ｕボックス）型、およびＦボックス型ドメイン等の真核生物Ｅ３に類似した折り畳みを有するＥ３模倣物であるリガーゼ、ならびにＮＥＬ、ＸＬボックス含有、およびＳｉｄＣ等の任意の他の真核生物Ｅ３とは異なる折り畳みを保有する非従来的なＥ３を有する。このようなドメインは、細胞または組織特異性を保有し得る。
一実施形態では、キメラ分子のＥ３モチーフは、限定されないが、皮膚細胞、筋肉細胞、上皮細胞、内皮細胞、幹細胞、臍帯血管細胞、角膜細胞、心筋細胞、大動脈細胞、角膜上皮細胞、体細胞、線維芽細胞、ケラチノサイト、メラノサイト、脂肪細胞、骨細胞、骨芽細胞、気道細胞、微小血管細胞、乳房細胞、血管細胞、軟骨細胞、胎盤細胞、肝細胞、膠細胞、表皮細胞、角膜輪部幹細胞、歯周幹細胞、骨髄間質細胞、ハイブリドーマ細胞、腎臓細胞、膵島、関節軟骨細胞、神経芽細胞、リンパ球、および赤血球、ならびに／またはそれらの任意の組み合わせに関する細胞型特異的または組織特異的リガーゼ機能を保有し得る。
一実施形態において、分解ドメインは細菌病原体由来であり、この病原体は、シゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、バルトネラ（Ｂａｒｔｏｎｅｌｌａ）、ボルデテラ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ）、ボレリア（Ｂｏｒｒｅｌｉａ）、ブルセラ（Ｂｒｕｃｅｌｌａ）、カンピロバクター（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、クラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ）およびクラミドフィラ（Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ）、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、エンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、フランシセラ（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ）、ヘモフィルス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）、ヘリコバクター（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ）、レジオネラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）、レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）、リステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）、マイコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、マイコプラズマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）、ナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、リケッチア（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ）、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、トレポネーマ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ）、ウレアプラズマ（Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ）、ビブリオ（Ｖｉｂｒｉｏ）、ならびにエルシニア（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）からなる群から任意に選択される。より具体的には、別の実施形態において、細菌病原体はシゲラ・フレックスネリである。任意の細菌に由来し得る分解ドメインは、例えば、シゲラ・フレックスネリＥ３リガーゼ、ＳｓｐＨ１、ＳｓｐＨ２、ＳｌｒＰ、ＡｖｒＰｔｏＢ、ＬｕｂＸ、ＮＬｅＧ５－１、ＮｌｅＧ５－１、ＮｌｅＧ２－３、ＬｅｇＵ１、ＬｅｇＡＵ１３、ＮＩｅＬ、ＳｏｐＡ、ＳｉｄＣ、ＸｏｐＬ、ＧｏｂＸ、ＶｉｒＦ、ＧＡＬＡ、ＡｎｋＢ、および／またはＳｉｄＥに由来し得る。
一実施形態において、分解ドメインは、シゲラＩｐａＨタンパク質ファミリーのメンバーであり、ＩｐａＨ９．８、ＩｐａＨ１．４、ＩｐａＨ２．５、ＩｐａＨ４．５、ＩｐａＨ７．８、ＩｐａＨ０８８７、ＩｐａＨ１３８９、ＩｐａＨ２０２２、ＩｐａＨ２２０２、ＩｐａＨ２６１０、および／またはＩｐａＨ０７２２であり得る。シゲラ属の種は、細菌性赤痢（シゲローシス）を引き起こす高度に適応されたヒト病原体である。ＩＩＩ型分泌系（Ｔ３ＳＳ）を介して、シゲラは、発熱、上皮細胞の侵入、細胞内生存、および宿主免疫応答の回避を含む機能を有する、病原性を担う毒性タンパク質（エフェクター）のサブセットを送達する。
シゲラは、大きなプラスミドと染色体の両方に存在する１２個のｉｐａＨ遺伝子を保有している。例えば、Ａｓｈｉｄａ＆Ｓａｓａｋａｗａ，“Ｓｈｉｇｅｌｌａ ＩｐａＨ Ｆａｍｉｌｙ Ｅｆｆｅｃｔｏｒｓ ａｓ ａ Ｖｅｒｓａｔｉｌｅ Ｍｏｄｅｌ ｆｏｒ Ｓｔｕｄｙ Ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ Ｂａｃｔｅｒｉａ，”Ｆｒｏｎｔ．Ｃｅｌｌ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５：１００（２０１６）を参照のこと。これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。ＩｐａＨファミリータンパク質は、Ｎ末端ロイシンリッチ反復（ＬＲＲ）を含有し、それらの保存されたＣ末端領域にＥ３ユビキチンリガーゼ活性を有する（Ｒｏｈｄｅ ｅｔ ａｌ．，“Ｔｙｐｅ ＩＩＩ Ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ Ｅｆｆｅｃｔｏｒｓ ｏｆ ｔｈｅ ＩｐａＨ Ｆａｍｉｌｙ ａｒｅ Ｅ３ Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ Ｌｉｇａｓｅ，”Ｃｅｌｌ Ｈｏｓｔ Ｍｉｃｒｏｂｅ．１：７７－８３（２００７）およびＡｓｈｉｄａ ｅｔ ａｌ．，“Ｅｘｐｌｏｉｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｈｏｓｔ Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ Ｓｙｓｔｅｍ ｂｙ Ｈｕｍａｎ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｐａｔｈｏｇｅｎｓ，”Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１２：３９９－４１３（２０１４）、これらの両方は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる）。ユビキチン化は、多酵素カスケード、Ｅ１（ユビキチン活性化酵素）、Ｅ２（ユビキチン結合酵素）、およびＥ３（ユビキチンリガーゼ）によって触媒される一連の反応を介して達成される。Ａｓｈｉｄａ＆Ｓａｓａｋａｗａ，“Ｓｈｉｇｅｌｌａ ＩｐａＨ Ｆａｍｉｌｙ Ｅｆｆｅｃｔｏｒｓ ａｓ ａ Ｖｅｒｓａｔｉｌｅ Ｍｏｄｅｌ ｆｏｒ Ｓｔｕｄｙ Ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ Ｂａｃｔｅｒｉａ”Ｆｒｏｎｔ．Ｃｅｌｌ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５：１００（２０１６）、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。ユビキチン化カスケードは、ユビキチンのカルボキシル末端ＧｌｙとＥ１のＣｙｓとの間のチオエステル結合の形成を介したユビキチンのＡＴＰ依存的活性化から開始する。同文献。活性化ユビキチンは、Ｅ２の活性部位Ｃｙｓに移され、最終的にはＥ３リガーゼは、Ｅ２から特定の基質タンパク質へのユビキチンの転移を媒介する（主に基質Ｌｙｓ残基を介して）。同文献。Ｅ３リガーゼは、それらの構造および機能に基づいて、２つの群に分類することができる。ＨＥＣＴ（Ｅ６－ＡＰカルボキシル末端に相同）型およびＲＩＮＧ（実に興味深い新しい遺伝子）／ Ｕボックス型。同文献。ＨＥＣＴ型Ｅ３リガーゼは、その触媒システイン残基とのチオエステル結合の形成を介してＥ２からユビキチンを受け入れ、次いでそれらの標的基質にユビキチンを移すことによって、ユビキチン転移を触媒する。同文献。一方、ＲＩＮＧ／Ｕボックス型Ｅ３リガーゼは、骨格分子として作用してＥ２－ユビキチン複合体に結合し、動員し、次いでＥ２からＥ３結合基質にユビキチンを直接転移させることによって、直接ユビキチン転移を触媒する。同文献。
ＩｐａＨファミリータンパク質は、シゲラ（ＩｐａＨ）、サルモネラ（ＳｓｐＨ１、ＳｓｐＨ２、およびＳｌｒＰ）、エドワージエラ（Ｅｄｗａｒｄｓｉｅｌｌａ）、ブラディリゾビウム（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、およびいくつかのシュードモナス属の種を含む動物および植物病原体の間で広く保存され、細菌感染におけるこれらのエフェクターの重要性を例証する。同文献。ＩｐａＨファミリータンパク質はＥ３ユビキチンリガーゼ活性を有し、それらのＣ末端ドメインは、ＨＥＣＴ型リガーゼのそれと同様のＣｙｓ－ユビキチン中間体を形成する単一の保存Ｃｙｓを含有するが、ＩｐａＨファミリーメンバーの触媒ドメインは、配列および構造レベルが真核Ｅ３ユビキチンリガーゼと異なる。同文献。したがって、ＩｐａＨファミリータンパク質は、Ｅ３ユビキチンリガーゼの典型的なＲＩＮＧ型およびＨＥＣＴ型とは異なる新しいクラスのＥ３ユビキチンリガーゼ、ＮＥＬ（新規なＥ３リガーゼ）を構成すると考えられる（Ｓｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，“Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｈｉｇｅｌｌａ Ｔ３ＳＳ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ＩｐａＨ Ｄｅｆｉｎｅｓ ａ Ｎｅｗ Ｃｌａｓｓ ｏｆ Ｅ３ Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ Ｌｉｇａｓｅｓ，”Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５：１２９３－１３０１（２００８）；Ｚｈｕ ｅｔ ａｌ．，“Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ａ Ｓｈｉｇｅｌｌａ Ｅｆｆｅｃｔｏｒ Ｒｅｖｅａｌｓ ａ Ｎｅｗ Ｃｌａｓｓ ｏｆ Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ Ｌｉｇａｓｅｓ，”Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５：１３０２－０８（２００８）；Ｑｕｅｚａｄａ ｅｔ ａｌ．，“Ａ Ｆａｍｉｌｙ ｏｆ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ Ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ Ｆａｃｔｏｒｓ Ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ａｓ ａ Ｄｉｓｔｉｎｃｔ Ｃｌａｓｓ ｏｆ Ａｕｔｏｒｅｇｕｌａｔｅｄ Ｅ３ Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ Ｌｉｇａｓｅｓ，”Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０６：４８６４－６９（２００９）、これらのすべてが、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。ＩｐａＨファミリータンパク質は互いに高度に類似しているが、基質認識部位とみなされるそれらのＬＲＲ領域の配列、および細胞下局在（例えば、核、細胞質、または形質膜）は異なる。Ａｓｈｉｄａ＆Ｓａｓａｋａｗａ，“Ｓｈｉｇｅｌｌａ ＩｐａＨ Ｆａｍｉｌｙ Ｅｆｆｅｃｔｏｒｓ ａｓ ａ Ｖｅｒｓａｔｉｌｅ Ｍｏｄｅｌ ｆｏｒ Ｓｔｕｄｙ Ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ Ｂａｃｔｅｒｉａ”Ｆｒｏｎｔ．Ｃｅｌｌ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５：１００（２０１６）に記載され、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
ユビキチンリガーゼファミリーには、Ｓｋｐ１－Ｃｕｌｌｉｎ１－Ｆボックス（「ＳＣＦ」）タンパク質複合体にあるような「Ｆボックス」リガーゼも含まれ、このリガーゼは、ユビキチン化基質、例えば、Ｃｄｃ４に結合し、これはその後、Ｃｌｎに結合するＳｉｃ１またはＧｒｒ１等の標的タンパク質と相互作用する。Ｂａｉ ｅｔ ａｌ．，“ＳＫＰ １ Ｃｏｎｎｅｃｔｓ Ｃｅｌｌ Ｃｙｃｌｅ Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｓ ｔｏ ｔｈｅ Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ Ｐｒｏｔｅｏｌｙｓｉｓ Ｍａｃｈｉｎｅｒｙ ｔｈｒｏｕｇｈ ａ Ｎｏｖｅｌ Ｍｏｔｉｆ，ｔｈｅ Ｆ－Ｂｏｘ”Ｃｅｌｌ ８６（２）：２６３－７４（１９９７）を参照のこと。これは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
Ｆボックスは、タンパク質－タンパク質相互作用の部位として機能する約５０個のアミノ酸のタンパク質モチーフである。例えば、Ｋｉｐｒｅｏｓ ｅｔ ａｌ．，“Ｔｈｅ Ｆ－ｂｏｘ Ｐｒｏｔｅｉｎ ｆａｍｉｌｙ．”Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌ．１（５）（２０００）を参照のこと。これは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。Ｆボックスタンパク質は、最初に、ＳＣＦユビキチンリガーゼ複合体の成分として特徴付けられたものであり、これらは、ユビキチン媒介タンパク質分解のために基質に結合する。Ｆボックスモチーフは、コアＳＣＦ成分Ｓｋｐ Ｉに結合することによって、Ｆボックスタンパク質をＳＣＦ複合体の他の成分に連結する。Ｆボックスタンパク質は、様々な細胞機能において非ＳＣＦタンパク質複合体を介して機能することがごく最近発見されている。同文献を参照のこと。Ｆボックスタンパク質は、多くの場合、タンパク質－タンパク質相互作用が可能な追加のカルボキシ末端モチーフを含み、酵母およびヒトＦボックスタンパク質において最も一般的な二次モチーフは、ＷＤ反復およびロイシンリッチ反復であり、これらの両方は、ＳＣＦ複合体にリン酸化基質を結合することが見出されている。同文献を参照のこと。Ｆボックスタンパク質の大部分は、他の関連するモチーフを有し、これらのタンパク質の大部分の機能はまだ定義されていない。同文献を参照のこと。
Ｆボックスモチーフ内の最小変異体位置は、８位（コンセンサスのために使用される２３４個のＦボックスタンパク質の９２％がロイシンまたはメチオニンを有する）、９位（９２％プロリン）、１６位（８６％イソロイシンまたはバリン）、２０位（８１％ロイシンまたはメチオニン）、および３２位（９２％セリンまたはシステイン）を含む。同文献。この厳密なコンセンサスの欠如は、当業者がＦボックス配列を検出するために複数の検索アルゴリズムを用いることの指針となる。例えば、２つのアルゴリズムは、ＰｒｏｓｉｔｅデータベースおよびＰｆａｍデータベースに見出すことができる。時折、あるデータベースが所与のタンパク質中のＦボックスに有意なスコアを与えることがあるため、他のデータベースがそれを検出しない場合は、両方のデータベースを検索する必要がある。同文献。
原核生物における本願のキメラ分子の発現は、融合ポリペプチドまたは非融合ポリペプチドのいずれかの発現を方向付ける構成的プロモーターまたは誘導性プロモーターを含有するベクターを用いて大腸菌において最も多く行われる。融合ベクターは、その中においてコードされるポリペプチドに、通常は組換えポリペプチドのアミノ末端に、一定の数のアミノ酸を付加する。このような融合ベクターは、典型的には、３つの目的、（ｉ）発現を増加させるため、（ｉｉ）溶解度を増加させるため、および（ｉｉｉ）親和性精製においてリガンドとして作用することによって精製を補助するために働く。多くの場合、融合発現ベクターにおいて、融合部分と組換えポリペプチドとの接合部にタンパク質分解切断部位が導入され、融合ポリペプチドの精製後に融合部分からの組換えポリペプチドの分離を可能にする。このような酵素、およびそれらの内因性認識配列は、第Ｘａ因子、トロンビン、およびエンテロキナーゼを含む。典型的な融合発現ベクターとしては、ｐＧＥＸ（Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｊｏｈｎｓｏｎ，“Ｓｉｎｇｌｅ－Ｓｔｅｐ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ Ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ａｓ Ｆｕｓｉｏｎｓ Ｗｉｔｈ Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ Ｓ－Ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ，”Ｇｅｎｅ ６７：３１－４０（１９８８），これは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）、ｐＭＡＬ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，Ｍａｓｓ．）、およびｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎ．Ｊ．）が挙げられ、これらはそれぞれ、標的組換えポリペプチドにグルタチオンＳ－トランスフェラーゼ（「ＧＳＴ」）、マルトースＥ結合ポリペプチド、またはポリペプチドＡを融合させる。
好適な誘導性非融合大腸菌発現ベクターの例としては、ｐＴｒｃ（Ａｍｒａｎｎ ｅｔ ａｌ．，“Ｔｉｇｈｔｌｙ Ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｔａｃ Ｐｒｏｍｏｔｅｒ Ｖｅｃｔｏｒｓ Ｕｓｅｆｕｌ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｕｎｆｕｓｅｄ ａｎｄ Ｆｕｓｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ，”Ｇｅｎｅ ６９：３０１－１５（１９８８）およびｐＥＴ１１ｄ（Ｓｔｕｄｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．６０－８９（１９９０））が挙げられ、これらは、それらの全体が本明細書に組み込まれる。ポリペプチド融合を介して多官能性ポリペプチドを得るための異なる活性ペプチドまたはタンパク質ドメインの標的アセンブリのための方法は、Ｐａｃｋら、米国特許第６，２９４，３５３号、同第６，６９２，９３５号によって記載されており、これらは、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。大腸菌における組換えポリペプチド、例えば、本願のキメラ分子の発現を最大化するための１つの戦略は、組換えキメラをタンパク質分解的に切断する能力が損なわれた宿主細菌においてポリペプチドを発現することである。例えば、Ｇｏｔｔｅｓｍａｎ，Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．１１９－１２８（１９９０）を参照のこと。これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
いくつかの実施形態において、分解ドメインおよび標的領域を含む本願のキメラ分子をコードする核酸は、哺乳動物発現ベクターを使用して哺乳動物細胞において発現される。哺乳動物発現ベクターの例として、例えば、限定されないが、ｐｃＤＮＡ３、ｐＣＤＭ８（Ｓｅｅｄ，“Ａｎ ＬＦＡ－３ ｃＤＮＡ Ｅｎｃｏｄｅｓ ａ Ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ－Ｌｉｎｋｅｄ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｔｏ ｉｔｓ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ＣＤ２，”Ｎａｔｕｒｅ ３２９：８４０（１９８７），これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）、およびｐＭＴ２ＰＣが挙げられる。哺乳動物細胞で使用される場合、発現ベクターの制御機能は、多くの場合、ウイルス調節エレメントによって提供される。例えば、一般に使用されるプロモーターは、ポリオーマ、アデノウイルス２、サイトメガロウイルス、およびシミアンウイルス４０に由来する。キメラ分子の標的指向ドメイン、分解ドメインの発現に有用な原核細胞と真核細胞の両方のための他の好適な発現系について。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．２ｎｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，（１９８９）の第１６章および第１７章を参照のこと。これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
キメラ分子Ｅ３分解ドメインおよび標的指向ドメイン発現にもかかわらず、このようなドメイン／領域の機能は、本願の特異性を付与する。既知または未知の基質は、分解ドメインを介した後続のユビキチン化のために標的指向ドメインによって結合される。いくつかの実施形態において、基質は、限定されないが、細胞内基質、細胞外基質、修飾基質、グリコシル化基質、ファルネシル化基質、翻訳後修飾基質、リン酸化基質、および当該技術分野で既知の他の修飾を含む。
いくつかの実施形態では、基質としては、限定されないが、蛍光タンパク質、ヒストンタンパク質、核局在化シグナル（ＮＬＳ）、Ｈ－Ｒａｓタンパク質、Ｓｒｃ相同２ドメイン含有ホスファターゼ２（ＳＨＰ２）、β－ガラクトシダーゼ、ｇｐＤ、Ｈｓｐ７０、ＭＢＰ、ＣＤＣ３４、ＣＯＰＳ５、ＭＡＰ２Ｋ５、ＳＦ３Ａ１、ＵＳＰ１１、ユビキチン、ＥＧＦＲ、ＣＥＡ、ＦｃγＩＩａ、ＦｃγＩＩＩａ、ｈＡ３３、ｍＡ３３、ｈＡｌｂ、ｍＩｇＧ、ＡｂｌＳＨ２、ｖＥＧＦＲ、ＭＳＬＮ、ＥＲα／ＥＦ、ｈＳＵＭＯ４、ｙＳＵＭＯ、ＴＮＦα、ａｖβ３インテグリン、ＳｒｃＳＨ３、リゾチーム、ホスホ－ＩκＢα、ＳＡＲＳ Ｎ、ヤギＩｇＧ、ウサギＩｇＧ、翻訳後修飾タンパク質、フィブリン、ハンチンチン、腫瘍形成タンパク質、ｐ５３、Ｒｂ、接着タンパク質、受容体、細胞周期タンパク質、チェックポイントタンパク質、ＨＦＥ、ＡＴＰ７Ｂ、プリオンタンパク質、ウイルスタンパク質、細菌タンパク質、寄生生物タンパク質、真菌タンパク質、ＤＮＡ結合タンパク質、代謝タンパク質、調節タンパク質、構造タンパク質、酵素、免疫原性タンパク質、自己免疫原性タンパク質、免疫原、抗原、および病原性タンパク質等が挙げられる。一実施形態において、基質は、蛍光タンパク質、例えば、緑色蛍光タンパク質、エメラルド蛍光タンパク質、ビーナス蛍光タンパク質、セルリアン蛍光タンパク質、および増強シアン蛍光タンパク質である。
本明細書で使用される場合、「アミノ酸」という用語は、天然に存在するアミノ酸、Ｌ－アミノ酸、Ｄ－アミノ酸、および合成アミノ酸、ならびに天然に存在するアミノ酸と同様の様式で機能するアミノ酸類似体およびアミノ酸模倣物を含む。天然アミノ酸は、遺伝コードによってコードされるアミノ酸、ならびに後で修飾されるアミノ酸、例えば、ヒドロキシプロリン、γ－カルボキシグルタミン酸塩、およびＯ－ホスホセリンである。アミノ酸類似体は、天然に存在するアミノ酸と同じ基本化学構造、例えば、水素、カルボキシル基、アミノ基、およびＲ基に結合したα炭素を有する化合物、例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムを指す。このような類似体は、修飾Ｒ基、例えば、ノルロイシン、または修飾ペプチド骨格を有するが、天然に存在するアミノ酸と同じ基本化学構造を保持している。アミノ酸模倣物とは、アミノ酸の一般的な化学構造とは異なる構造を有するが、天然に存在するアミノ酸と同様の様式で機能する化学化合物を指す。アミノ酸は、本明細書において、それらの一般的に知られている３文字記号またはＩＵＰＡＣ－ＩＵＢ生化学的命名委員会によって推奨される１文字記号のいずれかによって言及され得る。
本願による分解ドメインとして有用な例示的なＥ３リガーゼとしては、シュードモナス・シリンゲ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ）由来の、ＵボックスモチーフであるＥ３ユビキチンリガーゼＡｖｒＰｔｏＢが挙げられ、これは配列番号１のアミノ酸配列を有する。
Figure 2024059823000001
シュードモナス・シリンゲ由来のＥ３ユビキチンリガーゼＡｖｒＰｔｏＢは、以下のように、配列番号２のヌクレオチド配列を有する。
Figure 2024059823000002
本願による分解ドメインとして有用なさらなる例示的なＥ３ユビキチンリガーゼとしては、配列番号３のアミノ酸配列を有するシゲラ・フレックスネリ由来の新規のＥ３リガーゼ（本明細書においてＮＥＬまたはＥＬとも称される）であるＥ３ユビキチンリガーゼＩｐａＨ０７２２が挙げられる。
Figure 2024059823000003
シゲラ・フレックスネリ由来の新規のＥ３リガーゼであるＥ３ユビキチンリガーゼＩｐａＨ０７２２は、以下のように、配列番号４のヌクレオチド配列を有する。
Figure 2024059823000004
本願による分解ドメインとして有用なさらなる例示的なＥ３リガーゼとしては、シゲラ・フレックスネリ由来の新規Ｅ３リガーゼであるＥ３ユビキチンリガーゼＩｐａＨ１．４が挙げられ、これは、以下のように配列番号５のアミノ酸配列を有する。
Figure 2024059823000005
シゲラ・フレックスネリ由来の新規のＥ３リガーゼであるＥ３ユビキチンリガーゼＩｐａＨ１．４は、以下のように、配列番号６のヌクレオチド配列を有する。
Figure 2024059823000006
本願による分解ドメインとして有用なさらなる例示的なＥ３ユビキチンリガーゼとしては、配列番号７のアミノ酸配列を有するシゲラ・フレックスネリ由来の新規のＥ３リガーゼであるＥ３ユビキチンリガーゼＩｐａＨ２．５が挙げられる。
Figure 2024059823000007
シゲラ・フレックスネリ由来の新規のＥ３リガーゼであるＥ３ユビキチンリガーゼＩｐａＨ２．５は、以下のように、配列番号８のヌクレオチド配列を有する。
Figure 2024059823000008
本願による分解ドメインとして有用な更なる例示的なＥ３ユビキチンリガーゼとしては、シゲラ・フレックスネリ由来であり、配列番号９のアミノ酸配列を有する、新規のＥ３リガーゼであるＥ３ユビキチンリガーゼＩｐａＨ４．５が挙げられる。
Figure 2024059823000009
シゲラ・フレックスネリ由来の新規のＥ３リガーゼであるＥ３ユビキチンリガーゼＩｐａＨ４．５は、以下のように、配列番号１０のヌクレオチド配列を有する。
Figure 2024059823000010
本願による分解ドメインとして有用なさらなる例示的なＥ３ユビキチンリガーゼとしては、新規のＥ３リガーゼであるＥ３ユビキチンリガーゼＩｐａＨ７．８（シゲラ・フレックスネリ由来であり、配列番号１１のアミノ酸配列を有する）が挙げられる。
Figure 2024059823000011
シゲラ・フレックスネリ由来の新規のＥ３ユビキチンリガーゼであるＥ３ユビキチンリガーゼＩｐａＨ７．８は、以下のように、配列番号１２のヌクレオチド配列を有する。
Figure 2024059823000012
本願による分解ドメインとして有用なさらなる例示的なＥ３ユビキチンリガーゼとしては、新規のＥ３リガーゼであり、シゲラ・フレックスネリ由来であり、配列番号１３のアミノ酸配列を有する、Ｅ３ユビキチンリガーゼＩｐａＨ９．８が挙げられる。
Figure 2024059823000013
シゲラ・フレックスネリ由来の新規のＥ３リガーゼであるＥ３ユビキチンリガーゼＩｐａＨ９．８は、以下のように配列番号１４のヌクレオチド配列を有する。
Figure 2024059823000014
本願による分解ドメインとして有用なさらなる例示的なＥ３ユビキチンリガーゼとしては、Ｆボックスモチーフであり、レジオネラ・ニューモフィラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ）由来であり、配列番号１５のアミノ酸配列を有する、Ｅ３ユビキチンリガーゼＬｅｇＡＵ１３が挙げられる。
Figure 2024059823000015
レジオネラ・ニューモフィラ由来のＦボックスモチーフであるＥ３ユビキチンリガーゼＬｅｇＡＵ１３は、以下のように、配列番号１６のヌクレオチド配列を有する。
Figure 2024059823000016
本願による分解ドメインとして有用なさらなる例示的なＥ３ユビキチンリガーゼとしては、Ｆボックスモチーフであり、レジオネラ・ニューモフィラ由来であり、配列番号１７のアミノ酸配列を有するＥ３ユビキチンリガーゼＬｅｇＵ１が挙げられる。
Figure 2024059823000017
レジオネラ・ニューモフィラ由来のＦボックスモチーフであるＥ３ユビキチンリガーゼＬｅｇＵ１は、以下のように、配列番号１８のヌクレオチド配列を有する。
Figure 2024059823000018
本願による分解ドメインとして有用なさらなる例示的なＥ３ユビキチンリガーゼとしては、Ｕボックスモチーフであり、レジオネラ・ニューモフィラ由来であり、配列番号１９のアミノ酸配列を有するＥ３ユビキチンリガーゼＬｕｂＸが挙げられる。
Figure 2024059823000019
Ｕボックスモチーフであり、レジオネラ・ニューモフィラ由来であるＥ３ユビキチンリガーゼＬｕｂＸは、以下のような配列番号２０のヌクレオチド配列を有する。
Figure 2024059823000020
本願による分解ドメインとして有用なさらなる例示的なＥ３ユビキチンリガーゼとしては、Ｕボックスモチーフであり、腸管出血性大腸菌（Ｅｎｔｅｒｏｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）（ＥＨＥＣ）Ｏ１５７：Ｈ７であり、配列番号２１のアミノ酸配列を有するＥ３ユビキチンリガーゼＮｌｅＧ２－３が挙げられる。
Figure 2024059823000021
Ｕボックスモチーフであり、腸管出血性大腸菌（「ＥＨＥＣ」）Ｏ１５７：Ｈ７由来のＥ３ユビキチンリガーゼＮｌｅＧ２－３は、以下のように、配列番号２２のヌクレオチド配列を有する。
Figure 2024059823000022
本願による分解ドメインとして有用なさらなる例示的なＥ３ユビキチンリガーゼとしては、Ｕボックスモチーフであり、腸管出血性大腸菌（「ＥＨＥＣ」）Ｏ１５７：Ｈ７由来であり、配列番号２３のアミノ酸配列を有する、Ｅ３ユビキチンリガーゼＮｌｅＧ５－１が挙げられる。
Figure 2024059823000023
Ｕボックスモチーフであり、腸管出血性大腸菌（「ＥＨＥＣ」）Ｏ１５７：Ｈ７由来である、Ｅ３ユビキチンリガーゼＮｌｅＧ５－１は、以下のような配列番号２４のヌクレオチド配列を有する。
Figure 2024059823000024
本願による分解ドメインとして有用なさらなる例示的なＥ３ユビキチンリガーゼとしては、ＨＥＣＴモチーフであり、腸管出血性大腸菌（「ＥＨＥＣ」）Ｏ１５７：Ｈ７由来であり、配列番号２５のアミノ酸配列を有する、Ｅ３ユビキチンリガーゼＮｌｅＬが挙げられる。
Figure 2024059823000025
本願による分解ドメインとして有用なさらなる例示的なＥ３ユビキチンリガーゼとしては、ＨＥＣＴモチーフであり、腸管出血性大腸菌（「ＥＨＥＣ」）Ｏ１５７：Ｈ７由来であり、配列番号２６のヌクレオチド配列を有するＥ３ユビキチンリガーゼＮｌｅＬが挙げられる。
Figure 2024059823000026
本願による分解ドメインとして有用なさらなる例示的なＥ３ユビキチンリガーゼとしては、非従来的なモチーフであり、Ｌ．ニューモフィラ由来であり、配列番号２７のアミノ酸配列を有するＥ３ユビキチンリガーゼＳｉｄＣが挙げられる。
Figure 2024059823000027
非従来的なモチーフであり、Ｌ．ニューモフィラ由来のＥ３ユビキチンリガーゼＳｉｄＣは、以下のような配列番号２８のヌクレオチド配列を有する。
Figure 2024059823000028
本願による分解ドメインとして有用なさらなる例示的なＥ３ユビキチンリガーゼとしては、ＮＥＬモチーフであり、ＥＨＥＣ Ｏ１５７：Ｈ７由来であり、配列番号２９のアミノ酸配列を有するＥ３ユビキチンリガーゼＳｌｒＰが挙げられる。
Figure 2024059823000029
ＮＥＬモチーフであり、ＥＨＥＣ Ｏ１５７：Ｈ７由来であるＥ３ユビキチンリガーゼＳｌｒＰは、以下のような配列番号３０のヌクレオチド配列を有する。
Figure 2024059823000030
本願による分解ドメインとして有用なさらなる例示的なＥ３ユビキチンリガーゼとしては、ＨＥＣＴモチーフであり、サルモネラ・ティフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）由来であり、配列番号３１のアミノ酸配列を有するＥ３ユビキチンリガーゼＳｏｐＡが挙げられる。
Figure 2024059823000031
ＨＥＣＴモチーフであり、サルモネラ・ティフィムリウム由来であるＥ３ユビキチンリガーゼＳｏｐＡは、以下のような配列番号３２のヌクレオチド配列を有する。
Figure 2024059823000032
本願による分解ドメインとして有用なさらなる例示的なＥ３ユビキチンリガーゼとしては、新規なＥ３リガーゼモチーフであり、サルモネラ・ティフィムリウム由来であり、配列番号３３のアミノ酸配列を有するＥ３ユビキチンリガーゼＳｓｐＨ１が挙げられる。
Figure 2024059823000033
新規なＥ３リガーゼモチーフであり、サルモネラ・ティフィムリウム由来であるＥ３ユビキチンリガーゼＳｓｐＨ１は、以下のような配列番号３４のヌクレオチド配列を有する。
Figure 2024059823000034
本願による分解ドメインとして有用なさらなる例示的なＥ３ユビキチンリガーゼとしては、新規なＥ３リガーゼモチーフであり、サルモネラ・ティフィムリウム由来であり、配列番号３５のアミノ酸配列を有するＥ３ユビキチンリガーゼＳｓｐＨ２が挙げられる。
Figure 2024059823000035
新規なＥ３リガーゼモチーフであり、サルモネラ・ティフィムリウム由来のＥ３ユビキチンリガーゼＳｓｐＨ２は、配列番号３６のヌクレオチド配列を有する。
Figure 2024059823000036
本願による分解ドメインとして有用なさらなる例示的なＥ３ユビキチンリガーゼとしては、非従来的なモチーフであり、キサントモナス・カンペストリス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）由来であり、配列番号３７のアミノ酸配列を有するＥ３ユビキチンリガーゼＸｏｐＬが挙げられる。
Figure 2024059823000037
非従来的なモチーフであり、キサントモナス・カンペストリス由来であるＥ３ユビキチンリガーゼＸｏｐＬは、以下のような配列番号３８のヌクレオチド配列を有する。
Figure 2024059823000038
標的指向ドメインは、固有の結合相互作用、例えば、二次、三次、または四次フレキシビリティを保有するが、Ｅ３モチーフユビキチン領域との会合に関して依然としてフレキシビリティが存在しなければならない。この点に関して、適切な間隔がない場合、Ｅ３モチーフが基質－標的指向ドメイン相互作用を立体的に妨げることがあり得る。したがって、本願は、いくつかの実施形態において、標的指向ドメインと基質との間の結合の立体破壊を防止するのに十分な長さのポリペプチドリンカーを用いる。
いくつかの実施形態において、標的指向ドメインは、生理学的条件下で切断可能であっても切断不可能であってもよいリンカーを介してユビキチン領域に共有結合する。リンカーは、ユビキチン領域剤への標的指向ドメインへの共有結合を可能にする求核性または求電子性反応基を含む有機部分を含み得る。いくつかの実施形態において、リンカーはエノールエーテル、ケタール、イミン、オキシム、ヒドラゾン、セミカルバゾン、アシルイミド、またはメチレンラジカルである。いくつかの実施形態において、リンカーは、酸切断可能リンカー、加水分解可能リンカー、または酵素切断可能リンカーであってもよい。
ペプチドベースの連結基は、細胞におけるペプチダーゼおよびプロテアーゼ等の酵素によって切断される。ペプチドベースの切断可能な連結基は、オリゴペプチド、例えば、ジペプチド、トリペプチド、およびポリペプチドを得るためにアミノ酸間で形成されるペプチド結合である。ペプチドベースの切断可能基は、アミド基（－Ｃ（Ｏ）ＮＨ－）を含まない。アミド基は、任意のアルキレン、アルケニレンまたはアルキネレンの間に形成することができる。ペプチド結合は、アミノ酸間で形成され、ペプチドおよびタンパク質を得るための特別なタイプのアミド結合である。ペプチドベースの切断基は、一般に、アミノ酸間で形成されるペプチド結合、すなわちアミド結合に限定され、ペプチドおよびタンパク質が得られ、アミド官能基全体が含まれない。ペプチド切断可能な連結基は、一般式－ＮＨＣＨＲ１Ｃ（Ｏ）ＮＨＣＨＲ２Ｃ（Ｏ）－を有し、式中、Ｒ１およびＲ２は、２つの隣接アミノ酸のＲ基である。これらの候補は、上述のものと類似の方法を使用して評価することができる。
インビトロ用途のために、ポリペプチドを固体支持体に結合させるための使用のための架橋剤であり得る適切なリンカーには、支持体の表面上に存在する官能基と反応することができるか、またはポリペプチドと反応することができるか、またはその両方である様々な薬剤が含まれる。架橋剤として有用な試薬としては、ホモ二官能性試薬、および特にヘテロ二官能性試薬が挙げられる。有用な二官能性架橋剤としては、限定されないが、Ｎ－ＳＩＡＢ、ジマレイミド、ＤＴＮＢ、Ｎ－ＳＡＴＡ、Ｎ－ＳＰＤＰ、ＳＭＣＣ、および６－ＨＹＮＩＣが挙げられる。架橋剤を選択して、ポリペプチドと固体支持体との間で選択的に切断可能な結合を提供することができる。例えば、ポリペプチドを固体支持体から切断するための手段として、３－アミノ－（２－ニトロフェニル）プロピオン酸等の光不安定性架橋剤を用いることができる。Ｂｒｏｗｎ ｅｔ ａｌ．，“Ａ Ｓｉｎｇｌｅ－Ｂｅａｄ Ｄｅｃｏｄｅ Ｓｔｒａｔｅｇｙ Ｕｓｉｎｇ Ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ ａｎｄ ａ Ｎｅｗ Ｐｈｏｔｏｌａｂｉｌｅ Ｌｉｎｋｅｒ：３－ａｍｉｎｏ－３－（２－ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ）ｐｒｏｐｉｏｎｉｃ Ａｃｉｄ，”Ｍｏｌ．Ｄｉｖｅｒｓ ４－１２（１９９５）および米国特許第５，６４３，７２２号を参照のこと。これらは、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
抗体、ポリペプチド、またはそのフラグメント、例えば標的指向ドメインは、カルボキシル基官能化ビーズとポリペプチドのアミノ末端との間に形成される共有アミド結合を介して、または逆に、アミノ基官能化ビーズとポリペプチドのカルボキシル末端との間に形成される共有アミド結合を介して、ビーズ等の固体支持体上に固定化され得る。さらに、二官能性トリチルリンカーは、アミノ樹脂を介して樹脂上のアミノ基またはカルボキシル基を通して、支持体に、例えば、Ｗａｎｇ樹脂等の樹脂上の４－ニトロフェニル活性エステルに結合することができる。二官能性トリチルアプローチを使用して、固体支持体は、ポリペプチドが切断され、除去され得ることを確実にするために、ギ酸またはトリフルオロ酢酸等の揮発性酸を用いる処理を必要とすることができる。そのような場合、ポリペプチドは、固体支持体のウェルの底部または固体支持体の平坦な表面上にビーズレスパッチとして堆積することができる。マトリックス溶液を添加した後、ポリペプチドはＭＳに堆積することができる。
当業者には、上述の方法および技術が、上記のように、その構成部分、例えば、分解ドメイン、ユビキチン領域、標的領域、およびそれらの修飾、ならびにリンカー分子を含む、本願のキメラ分子のために利用され得ることが容易に明らかになる。
本願の第２の態様は、リボヌクレオタンパク質を形成する方法に関する。本方法は、本明細書に記載の単離されたキメラ分子をコードするｍＲＮＡを提供することと、１つ以上のポリアデノシン結合タンパク質（「ＰＡＢＰ」）を提供することと、ｍＲＮＡおよび１つ以上のＰＡＢＰからリボヌクレオタンパク質複合体をアセンブルすることとを含む。一実施形態において、ｍＲＮＡは３’末端ポリアデノシン（ポリＡ）テールを含む。
本態様に記載されるキメラ分子は、本願の前述の態様に従って行われる。
本明細書に記載のポリアデノシン結合タンパク質（「ＰＡＢＰ」）（ポリ（Ａ）結合タンパク質とも称される）は、ｍＲＮＡのポリ（Ａ）テールに結合するＲＮＡ結合タンパク質を指す。ポリ（Ａ）テールは、ｍＲＮＡの３’末端に位置し、２００～２５０ヌクレオチド長である。結合タンパク質はまた、ポリアデニル酸ポリメラーゼが翻訳の前にポリ（Ａ）ヌクレオチドテールをプレｍＲＮＡに付加することを補助することによって、ｍＲＮＡ前駆体にも関与する。核アイソフォームは、約５０個のヌクレオチドに選択的に結合し、ＲＮＡに対するその親和性を増加させることによってポリアデニル酸ポリメラーゼの活性を刺激する。ポリ（Ａ）結合タンパク質はまた、ナンセンス媒介性分解および核細胞質トラフィッキングを含むｍＲＮＡ代謝の段階の間に存在する。ポリ（Ａ）結合タンパク質はまた、テールを分解から保護し、ｍＲＮＡ産生を調節し得る。
本明細書においてナノプレックスとも称されるリボヌクレオタンパク質は、一実施形態において、ナノ粒子であり得る。好ましい実施形態において、ナノプレックスは、ナノ粒子を含む。リボヌクレオタンパク質またはナノプレックスは、反対に荷電したポリ電解質を有する薬物ナノ粒子によって形成される複合体である。カチオン性薬物およびアニオン性薬物の両方は、反対に荷電したポリ電解質と複合体を形成する。他のナノ構造と比較して、ナノプレックスの収率は概して高く、錯体形成効率は概して良好である。ナノプレックスは、他のナノ構造と比較して調製することも容易である。本願によるリボヌクレオタンパク質またはナノプレックス製剤は、走査型電子顕微鏡、示差走査熱量測定、Ｘ線回折および透析研究を使用した、生成収率、錯体化効率、薬物負荷、粒径およびゼータ電位によって特徴付けられる。ナノプレックスは、癌治療、遺伝子薬物送達、脳への薬物送達、ならびにタンパク質およびペプチド薬物送達等の様々な分野において幅広い用途を有する。
リボヌクレオタンパク質またはナノプレックスは、任意の好適なサイズを有することができる。少なくとも１つの実施形態において、リボヌクレオタンパク質またはナノプレックスは、直径が約２００ｎｍ未満、直径が約１００ｎｍ未満、直径が約９５ｎｍ未満、約９０ｎｍ未満、約８５ｎｍ未満、約８０ｎｍ未満、約７５ｎｍ未満、約７０ｎｍ未満、約６５ｎｍ未満、約６０ｎｍ未満、約５５ｎｍ未満、約５０ｎｍ未満、約４５ｎｍ未満、約４０ｎｍ未満、約３５ｎｍ未満、約３０ｎｍ未満、約２５ｎｍ未満、約２０ｎｍ未満、約１５ｎｍ未満、約１０ｎｍ未満、約９ｎｍ未満、約８ｎｍ未満、約７ｎｍ未満、約６ｎｍ未満、約５ｎｍ未満、約４ｎｍ、約３ｎｍ未満、約２ｎｍ未満、または約１ｎｍ未満である。約１００ｎｍ、約９５ｎｍ、約９０ｎｍ、約８５ｎｍ、約８０ｎｍ、約７５ｎｍ、約７０ｎｍ、約６５ｎｍ、約６０ｎｍ、約５５ｎｍ、約５０ｎｍ、約４５ｎｍ、約４０ｎｍ、約３５ｎｍ、約３０ｎｍ、約２５ｎｍ、約２０ｎｍ、約１５ｎｍ、約１０ｎｍ、約９ｎｍ、約８ｎｍ、約７ｎｍ、約６ｎｍ、約５ｎｍ、約４ｎｍ、約３ｎｍ、または約２ｎｍの上限、および約９５ｎｍ、約９０ｎｍ、約８５ｎｍ、約８０ｎｍ、約７５ｎｍ、約７０ｎｍ、約６５ｎｍ、約６０ｎｍ、約５５ｎｍ、約５０ｎｍ、約４５ｎｍ、約４０ｎｍ、約３５ｎｍ、約３０ｎｍ、約２５ｎｍ、約２０ｎｍ、約１５ｎｍ、約１０ｎｍ、約９ｎｍ、約８ｎｍ、約７ｎｍ、約６ｎｍ、約５ｎｍ、約４ｎｍ、約３ｎｍ、約２ｎｍ、または約１ｎｍの下限、およびこれらの任意の組み合わせ、を有する範囲の直径を有するナノ粒子もまた企図される。本願は、ある特定の実施形態において、ナノプレックスのサイズが約５０ｎｍ～約２００ｎｍまたは約１０ｎｍ～約１００ｎｍの範囲であることをさらに提供する。ある特定の実施形態において、ナノプレックスのサイズは、約５０ｎｍ ～約１５０ｎｍである。他の実施形態において、ナノプレックスのサイズは、約５０ｎｍ、約７５ｎｍ、または約１００ｎｍであり得る。
リボヌクレオタンパク質および／またはナノプレックスのサイズは、対象内の特定の位置に局在化するように最適化され得る。例えば、リボヌクレオタンパク質および／またはナノプレックスは、対象の様々な器官に移動することができるように最適化されてもよい。
一実施形態において、リボヌクレオタンパク質および／またはナノプレックスは有機ゲルを含有する。
本願のリボヌクレオタンパク質および／またはナノプレックスは、任意の適切な形状を有することができる。例えば、本発明のリボヌクレオタンパク質および／またはナノプレックスは、メッシュ、球体、正方形、長方形、三角形、円形ディスク、立方体様形状、立方体、直方体（立方体状）、円錐、円筒、プリズム、多面体、ピラミッド型、直角円筒、ロッド、分岐円筒形、ならびに他の規則的または不規則な形状の形状を有し得る。リボヌクレオタンパク質および／またはナノプレックスのポリマーマトリックスは、一実施形態において、絡まった共有結合ポリマーを含有し得る。一実施形態において、マトリックスはヒドロゲルである。
一実施形態において、リボヌクレオタンパク質および／またはナノプレックスマトリックス中のポリマー単位の数は、ポリマー単位から形成される各粒子について１０～５０００、例えば２０～４００の範囲である。別の実施形態において、ポリマー単位の数は、１０，０００～２００，０００、例えば１５，０００～２００，０００のポリマー単位の範囲である。
本願によるリボヌクレオタンパク質および／またはナノプレックスは、官能基化表面を含み得る。一実施形態において、リボヌクレオタンパク質および／またはナノプレックスは負に官能基化される。代替として、リボヌクレオタンパク質および／またはナノプレックスは、正に官能基化されてもよい。他の実施形態において、リボヌクレオタンパク質および／またはナノプレックスは、電荷を有しないか、または中性である。
一実施形態において、リボヌクレオタンパク質および／またはナノプレックスは生分解性である。別の実施形態において、リボヌクレオタンパク質および／またはナノプレックスは非毒性である。
一実施形態において、リボヌクレオタンパク質および／またはナノプレックスは、少なくとも１つの安定剤をさらに含み得る。安定剤は、リボヌクレオタンパク質および／またはナノプレックスの表面上に吸着され得る。リボヌクレオタンパク質および／またはナノプレックスは、液体培地中に分散され得、安定剤は、分散プロセス中の個々のリボヌクレオタンパク質および／またはナノプレックスの分離を補助するためのアジュバントとして使用され得る。個々のリボヌクレオタンパク質および／またはナノプレックスの分離を補助する安定剤の能力は、安定剤を含有する組成物と、安定剤を含まない対照組成物の分散プロセスを比較することによって決定され得る。個々のナノ粒子の分離を補助する安定剤の能力は、より短い分散時間によって示され得る。あるいは、安定剤は、液体培地、好ましくは水性培地中の分散されたナノプレックスの安定性を促進するために使用され得る。
本願の第３の態様は、本明細書に記載されるキメラ分子と、薬学的に許容される担体とを含む組成物に関する。
本願の方法によれば、キメラ分子は、投与のために好適な薬学的組成物に組み込むことができる。本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される担体」という用語は、薬学的投与と適合する任意のおよびすべての溶媒、分散培地、コーティング、抗菌および抗真菌化合物、等張および吸収遅延化合物等を含むことが意図される。
本態様において記載されるキメラ分子は、本願の前述の態様に従って行われる。
薬学的組成物は、一般に、組換えまたは実質的に精製されたキメラ分子、および対象への投与に好適な形態の薬学的に許容される担体を伴う。薬学的に許容される担体は、投与される特定の組成物、ならびに組成物を投与するために使用される特定の方法によって部分的に決定される。したがって、タンパク質組成物を投与するための医薬組成物の多種多様な好適な製剤が存在する。例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ １８ｔｈ ｅｄ．（１９９０）を参照のこと。薬学的組成物は、一般に、無菌で実質的に等張性であり、米国食品医薬品局のすべての良好な製造慣行（ＧＭＰ）規制に完全に準拠して製剤化される。
本明細書で使用される場合、薬学的に許容される担体という用語は、例えば、任意のタイプの非毒性、不活性固体、半固体または液体充填剤、希釈剤、封入材料または製剤補助剤を含む。参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｅｄ．ｂｙ Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，１９９５は、薬学的組成物の製剤化に使用される様々な担体およびその調製のための既知の技術を開示している。薬学的に許容される担体として機能することができる材料のいくつかの例としては、限定されないが、ラクトース、グルコース、およびスクロース等の糖；トウモロコシデンプンおよびジャガイモデンプン等のデンプン；カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロース、および酢酸セルロース等のセルロースおよびその誘導体；粉末トラガカント；麦芽；ゼラチン；タルク；カカオバターおよび坐剤ワックス等の賦形剤；ピーナッツ油、綿実油、紅花油、ゴマ油、オリーブ油、トウモロコシ油および大豆油等の油；プロピレングリコール等のグリコール；オレイン酸エチルおよびラウリン酸エチル等のエステル；寒天；ＴＷＥＥＮ（商標）８０等の洗剤；水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウム等の緩衝剤；アルギン酸；パイロジェンフリー水；等張生理食塩水；リンガー溶液；エチルアルコール；およびリン酸緩衝溶液、ならびにラウリル硫酸ナトリウムおよびステアリン酸マグネシウム等の他の非毒性適合性潤滑剤が挙げられる。着色剤、放出剤、コーティング剤、甘味剤、香味剤および香料剤、防腐剤、および／または抗酸化剤もまた、製剤者の判断に従って組成物中に存在することができる。
本願の化合物は、経口、非経口、例えば、皮下、静脈内、筋肉内、腹腔内、鼻腔内滴下によって、または鼻、のど、および気管支等の粘膜への適用によって投与することができる。それらは、単独で、または好適な薬学的担体と共に投与され得、錠剤、カプセル、粉末、溶液、懸濁液、またはエマルション等の固体形態または液体形態であり得る。
本願の組成物は、例えば、不活性希釈剤と共に、または同化可能な食用担体と共に経口投与されてもよく、またはそれらは、硬質もしくは軟質シェルカプセルに封入されてもよく、錠剤に圧縮されてもよく、またはそれらは、食事の食物と直接組み込まれてもよい。経口治療投与のために、これらの組成物には、賦形剤が組み込まれ、錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、懸濁液、シロップ等の形態で使用され得る。このような組成物および調製物は、少なくとも０．１％の活性化合物を含有するべきである。これらの組成物中の組成物の割合は、もちろん変化してもよく、好都合には、単位の重量の約２％～約６０％であり得る。経口投与単位が約１～２５０ｍｇの活性化合物を含有するように、本願による好ましい組成物が調製される。
錠剤、カプセル等はまた、トラガカントガム、アカシア、トウモロコシデンプン、またはゼラチン等の結合剤、リン酸二カルシウム等の賦形剤、トウモロコシデンプン、ジャガイモデンプン、アルギン酸等の崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム等の潤滑剤、およびスクロース、ラクトース、またはサッカリン等の甘味剤を含んでもよい。投薬単位形態がカプセルである場合、上記の種類の材料に加えて、脂肪油等の液体担体を含有してもよい。
これらの組成物は、非経口投与することもできる。本組成物の溶液または懸濁液は、ヒドロキシプロピルセルロース等の界面活性剤と好適に混合した水中で調製することができる。分散体はまた、油中のグリセロール、液体ポリエチレングリコール、およびそれらの混合物中で調製することができる。例示的な油は、石油、動物、植物、または合成由来の油、例えば、ピーナッツ油、大豆油、または鉱物油である。一般に、水、食塩水、デキストロース水溶液および関連糖溶液、ならびにプロピレングリコールまたはポリエチレングリコール等のグリコールは、特に注射用溶液のための好ましい液体担体である。通常の保存および使用のための条件下では、これらの調製物は、微生物の増殖を防ぐための防腐剤を含有する。
注射液のために適した薬学的形態は、無菌水溶液、または無菌注射液もしくは分散液の即時調製のための分散液および無菌粉末を含む。すべての場合、剤型は無菌である必要があり、易注射性が存在する程度まで流体でなくてはならない。これは、製造および保存条件下で安定でなければならず、また、細菌および真菌等の微生物の汚染作用から保護されなければならない。担体は、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコール）、それらの好適な混合物、および植物油を含有する溶媒または分散媒であってもよい。
本願の組成物はまた、エアゾール形態で気道に直接投与されてもよい。エアゾールとしての使用のために、溶液または懸濁液中の本願の組成物は、従来のアジュバントと共に、好適な推進剤、例えば、プロパン、ブタン、またはイソブタン等の炭化水素推進剤と共に加圧エアゾール容器にパッケージングされてもよい。本願の材料はまた、吸入器または噴霧器等の非加圧形態で投与されてもよい。
本願の組成物は、いくつかの実施形態において、任意に、全不活性生物、ペプチド、タンパク質、糖タンパク質、炭水化物、またはそれらの組み合わせの形態で、抗炎症剤、抗糖尿病剤、脂質低下剤（ｈｐｙｏｌｉｐｉｄｅｍｉｃ ａｇｅｎｔｓ）、化学療法剤、抗ウイルス剤、抗生物質、代謝剤、小分子阻害剤、プロテインキナーゼ阻害剤、アジュバント、アポトーシス剤、増殖剤、有機栄養標的指向剤、免疫学的薬剤、ウイルス、細菌、真菌および寄生生物等の病原体由来の抗原の非限定的な群から選択される第２の薬剤または薬学的組成物、上記のカテゴリに該当し、公開文献に見い出され得るヒト使用のために承認されている薬理学的または免疫学的薬剤の任意の例、任意の他の生物活性成分、またはこれらの任意の組み合わせをさらに含有する。
いくつかの実施形態において、第２の薬剤または薬学的組成物は、抗炎症剤、抗糖尿病剤、脂質低下剤（ｈｐｙｏｌｉｐｉｄｅｍｉｃ ａｇｅｎｔｓ）、化学療法剤、抗ウイルス剤、抗生物質、代謝剤、小分子阻害剤、プロテインキナーゼ阻害剤、アジュバント、アポトーシス剤、増殖剤、有機栄養標的指向剤の非限定的な群から選択される。
Ｅ３ユビキチンリガーゼおよびその機能ドメインの重要性は、それらが調節する正常な細胞プロセスの数によって強調され、機能喪失または不適切な標的指向化に関連する付随する疾患の根底にある。Ａｒｄｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，“Ｅ３ Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ Ｌｉｇａｓｅｓ．Ｅｓｓａｙｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ．”４１：１５－３０（２００５）を参照のこと。これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本願の第４の態様は、疾患を治療する方法に関する。方法は、疾患を有する対象を選択することと、本明細書に記載の組成物を対象に投与して、該対象に、疾患に罹患していない対象と比較して、基質の増加した発現レベルを与えることとを含む。
本態様において記載されるキメラ分子は、本願の前述の態様に従って行われる。
本明細書で使用される場合、「対象」という用語は、ヒト等の哺乳動物を指すが、家畜（例えば、イヌ、ネコ等）、農場動物（例えば、ウシ、ヒツジ、ブタ、ウマ等）または実験動物（例えば、サル、ラット、マウス、ウサギ、モルモット等）等の別の動物であり得る。用語「患者」は、疾患または状態に罹患しているか、または罹患している疑いのある「対象」を指す。
この方法は、対象に組成物を投与することを含み得、疾患は測定可能な表現型を保有する。疾患の表現型は、いくつかの実施形態において、疾患に罹患していない対象からの表現型と比較して、基質の発現レベルの増加を伴う。この点において、本願の医薬組成物に含まれるキメラ分子は、疾患に罹患していない対象からの表現型と比較して、１つ以上の基質の発現レベルの表現型増加を特徴とする疾患からの症状を治療または緩和するのに有効である。
本願の文脈で治療または予防することができる疾患の非限定的な例としては、癌、転移性癌、固形癌、浸潤性癌、播種性癌、乳癌、肺癌、ＮＳＣＬＣ癌、肝臓癌、前立腺癌、脳癌、膵臓癌、リンパ癌、卵巣癌、子宮内膜癌、子宮頸癌、および当該技術分野で既知の他の固形癌、血液細胞悪性腫瘍、リンパ腫、白血病、骨髄腫、脳卒中、虚血、心筋梗塞（ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ）、うっ血性心不全、脳卒中、虚血、末梢血管疾患、アルコール性肝疾患、肝硬変、パーキンソン病、アルツハイマー病、糖尿病、癌、関節炎、ＡＬＳ、病原性疾患、特発性疾患、ウイルス性疾患、細菌性疾患、プリオン性疾患、真菌性疾患、寄生生物性疾患、関節炎、創傷治癒、免疫不全、炎症性疾患、再生不良性貧血、貧血、遺伝性障害、先天性障害、１型糖尿病、２型糖尿病、妊娠糖尿病、高血糖症、代謝症候群、リポジストロフィー症候群、脂質異常症、インスリン抵抗性、レプチン抵抗性、アテローム性動脈硬化症、血管疾患、高コレステロール血症、高トリグリセリド血症、非アルコール性脂肪性肝疾患、敗血症性ショック、多臓器機能不全症候群、関節リウマチ、外傷、脳卒中、心筋梗塞（ｈｅａｒｔ ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ）、全身性自己免疫疾患、慢性肝炎、体重過多、および／または肥満、またはこれらの任意の組み合わせが挙げられる。
いくつかの実施形態において、疾患は、癌、転移性癌、脳卒中、虚血、末梢血管疾患、アルコール性肝疾患、肝炎、肝硬変、パーキンソン病、アルツハイマー病、嚢胞性線維症糖尿病、ＡＬＳ、病原性疾患、特発性疾患、ウイルス性疾患、細菌性疾患、プリオン性疾患、真菌性疾患、寄生生物性疾患、関節炎、創傷治癒、免疫不全、炎症性疾患、再生不良性貧血、貧血、遺伝性障害、先天性障害、１型糖尿病、２型糖尿病、妊娠糖尿病、高血糖症、代謝症候群、リポジストロフィー症候群、脂質異常症、インスリン抵抗性、レプチン抵抗性、アテローム性動脈硬化症、血管疾患、高コレステロール血症、高トリグリセリド血症、非アルコール性脂肪性肝疾患、体重過多または肥満、およびそれらの任意の組み合わせである。
治療のためにインビボで使用される場合、組成物は、有効量、すなわち、所望の治療効果を有する量で対象に投与される。用量および投薬量レジメンは、対象における疾患の程度、使用される特定のペプチドの特徴、例えば、その治療指標、対象、および対象の病歴に依存する。有効量は、医師および臨床医によく知られている方法によって、前臨床試験および臨床試験中に決定することができる。これらの方法において有用な有効量のペプチドは、薬学的化合物を投与するための多くの周知の方法のいずれかによってそれを必要とする哺乳動物に投与され得る。
組成物の投薬量、毒性、および治療有効性は、例えば、ＬＤ５０（集団の５０％に対する致死的な用量）およびＥＤ５０（集団の５０％における治療的に有効な用量）を決定するための、細胞培養または実験動物における標準的な薬学的手順によって決定され得る。毒性効果と治療効果との間の用量比率は、治療指標であり、ＬＤ５０／ＥＤ５０の比率として表すことができる。高い治療指標を示す化合物が望ましい場合がある。毒性の副作用を示す組成物が使用され得るが、感染していない細胞への潜在的な損傷を最小限に抑え、それによって副作用を低減するために、このような組成物を罹患した組織の部位に標的指向させる送達システムを設計するための注意が必要である。
いくつかの実施形態において、本願の組成物は、経口的に、非経口的に、皮下に、静脈内に、筋肉内に、腹腔内に、鼻腔内滴下により、移植により、腔内もしくは膀胱内滴下により、眼内に、動脈内に、病変内に、経皮的に、または粘膜への適用により投与される。
本願の第５の態様は、基質サイレンシングのための方法に関する。この方法は、サイレンシングさせる基質を選択することと、本明細書に記載のキメラ分子を提供することと、基質－分子複合体の形成を可能にするのに有効な条件下で基質をキメラ分子と接触させることとを含み、この複合体は、サイレンシングさせる基質の分解を媒介する。
本態様において記載されるキメラ分子は、本願の前述の態様に従って行われる。
本願の第６の態様は、疾患に対する治療有効性について薬剤をスクリーニングする方法に関する。本方法は、疾患状態を媒介する生体分子を提供することと、（ｉ）Ｅ３ユビキチンリガーゼ（Ｅ３）モチーフを含む分解ドメインと、（ｉｉ）上記分解ドメインを生体分子へと特異的に方向付けることができる標的指向ドメインであって、上記分解ドメインに対して異種である、標的指向ドメインと、（ｉｉｉ）上記分解ドメインを上記標的指向ドメインに結合させるリンカーとを含む試験剤を提供することと、試験剤が生体分子の分解を促進するのに有効な条件下で、生体分子を試験剤と接触させることと、接触の結果としての生体分子のレベルを決定することと、上記決定に基づいて、生体分子のレベルを低下させる試験剤を、疾患に対する治療有効性の候補であるとして同定することとを含む。
本態様において記載されるキメラ分子は、本願の前述の態様に従って行われる。
本明細書で使用される場合、「参照レベル」または「対照レベル」という用語は、比較目的で関心がある場合があるバイオマーカー（または生体分子、リガンド、基質等）の量または濃度を指す。いくつかの実施形態において、参照レベルは、健康な対象の対照集団またはタンパク質もしくは基質の異常発現を保有する疾患集団から採取された少なくとも１つのバイオマーカーのレベルの平均として発現される少なくとも１つのバイオマーカーのレベルであってもよい。別の実施形態において、参照レベルは、より早い時期、すなわち、本アッセイの前の同じ対象における少なくとも１つのバイオマーカーのレベルであってもよい。さらに別の実施形態において、参照レベルは、治療レジメンを受ける前の対象における少なくとも１つのバイオマーカーのレベルであり得る。
本明細書で使用される場合、「試料」という用語は、限定されないが、血液（または血漿もしくは血清等の血液の画分）、リンパ液、粘液、涙液、唾液、痰、尿、精液、便、ＣＳＦ、腹水、または全血等の身体組織または体液を含み得、体内組織の生検試料を含む。試料は、対象からの試料から増殖させた微生物のインビトロ培養も含み得る。試料は、任意の対象、例えば、疾患または疾患を特徴とする状態を有するか、または有する疑いのある対象／患者から得ることができる。
本明細書で使用される場合、「スクリーニング」という用語は、キメラ分子または組成物が、本明細書に記載される標的病理学的状態、すなわち、特定の疾患における欠損によって特徴付けられる疾患または状態を予防または減速させる（減少させる）能力または特徴を有するかどうかを決定することを意味する。
本明細書で使用される場合、キメラ分子または組成物の「有効量」または「治療有効量」という用語は、所望の治療および／または予防効果を達成するのに十分な量、例えば、治療されている疾患に関連する症状の予防または軽減をもたらす量である。対象に投与される化合物の量は、疾患の種類および重症度、ならびに一般的な健康状態、年齢、性別、体重、および薬物に対する耐性等の個体の特徴に依存する。これはまた、疾患の程度、重症度、または段階にも依存する。当業者は、これらおよび他の要因に応じて適切な用量を決定することができる。
本明細書で使用される「酵素結合免疫吸着アッセイ」（ＥＬＩＳＡ）という用語は、検出可能なシグナルを産生する酵素反応を介して目的の抗原の検出が達成される抗体ベースのアッセイを含む。ＥＬＩＳＡは、競合形式または非競合形式で実行することができる。ＥＬＩＳＡはまた、抗原を捕捉するための１つの抗体、および捕捉された抗体－抗原複合体を検出するための酵素または他の検出可能な標識で標識された１つの抗体である、抗原に対する２つの抗体が使用される２部位または「サンドイッチ」アッセイも含む。典型的な２部位ＥＬＩＳＡにおいて、抗原は、非標識抗体および酵素結合抗体が高親和性で結合することができる少なくとも１つのエピトープを有する。したがって、抗原は、親和性捕捉され、酵素結合抗体を使用して検出することができる。選択される典型的な酵素としては、アルカリホスファターゼまたは西洋ワサビペルオキシダーゼが挙げられ、これらの両方は、適切な基質と接触すると検出可能な産物を生成する。
本明細書で使用される場合、「エピトープ」という用語は、抗体に特異的に結合することができるタンパク質決定基を含む。エピトープは、通常、アミノ酸または糖側鎖等の分子の化学的に活性な表面基からなり、通常、特定の三次元構造特性、ならびに特定の電荷特性を有する。コンフォメーションエピトープおよび非コンフォメーションエピトープは、前者への結合が変性溶媒の存在下で失われるが、後者への結合が失われないという点で区別される。典型的には、エピトープは、１つ以上の標的指向ドメインによって認識され得る基質を形成する決定基領域である。
エピトープを保有する標的指向ドメインまたは基質についてスクリーニングするために、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｅｄ Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｄａｖｉｄ Ｌａｎｅ（１９８８）に記載されるもの等の日常的な交差ブロッキングアッセイを実行することができる。このアッセイを使用して、標的指向ドメインが、異なる標的指向ドメイン、抗体、抗体フラグメント等と同じ基質の部位またはエピトープに結合するかどうかを決定することができる。代替的または追加的に、エピトープマッピングは、当該技術分野で既知の方法によって実行することができる。例えば、抗体配列は、接触残基を同定するために、例えば、アラニンスキャニングによって変異誘発することができる。異なる方法では、基質の異なる領域に対応するペプチドは、試験標的指向ドメインとの競合アッセイ、または試験抗体および標的指向ドメインまたは特徴付けられたエピトープを有する抗体との競合アッセイにおいて使用することができる。
本明細書で使用される場合、「超可変領域」という用語は、抗原結合の原因である抗体のアミノ酸残基を指す。超可変領域は、一般に、「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」由来のアミノ酸残基、例えば、ＶＬ中の約２４～３４（Ｌ１）、５０～５６（Ｌ２）および８９～９７（Ｌ３）残基の周り、ならびにＶＨ中の約３１～３５Ｂ（Ｈ１）、５０～６５（Ｈ２）および９５～１０２（Ｈ３）残基の周り（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ．（１９９１）、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）、および／または「超可変ループ」由来のそれらの残基（例えば、ＶＬにおける残基２６～３２（Ｌ１）、５０～５２（Ｌ２）および９１～９６（Ｌ３）、ならびにＶＨにおける２６～３２（Ｈ１）、５２Ａ～５５（Ｈ２）および９６～１０１（Ｈ３））（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ，“Ｃａｎｏｎｉｃａｌ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ Ｒｅｇｉｏｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ，”Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１－１７（１９８７））を含む。
本明細書で使用される場合、「単離された」または「精製された」ポリペプチド、ペプチド、分子、またはキメラ分子という用語は、薬剤が由来する細胞もしくは組織源からの細胞材料または他の汚染ポリペプチドを実質的に含まないか、または化学合成されたときに化学前駆体または他の化学物質を実質的に含まない。例えば、キメラ分子は、そのような分子の意図される機能、診断または治療用途と干渉する材料を含まない。このような干渉物質は、キメラ分子、酵素、ホルモン、ならびに他のタンパク質性および非タンパク質性溶質に包含される物質以外のタンパク質またはフラグメントを含み得る。
一実施形態において、同定は、疾患に罹患していない対象における標準生体分子レベルに関して行われる。同定は、いくつかの実施形態において、接触がない生体分子レベルに関してもまた行われ得る。この点において、対照レベルを用いて、試料中の生体分子のレベルと比較することができる。いくつかの実施形態において、対照レベルは、疾患に罹患していない対象由来の生体分子のレベルである。基質レベルに影響を及ぼす疾患または状態を有すると疑われる対象から得られる試料中の生体分子の過剰存在は、健康な対象から得られる試料と比較して、試験される対象における生体分子関連の疾患または状態を示す。
ある特定の基質生体分子の過剰存在の程度によって、対象が疾患に罹患しているか、または疾患を発症する可能性があるかが示されることが知られている、無数の疾患が存在する。例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ａｎｄｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，“Ｄｉｓｃｏｖｅｒｉｎｇ Ｒｏｂｕｓｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ ｆｏｒ Ｄｉｓｅａｓｅ ｆｒｏｍ Ｒｅｌａｔｉｖｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｒｅｖｅｒｓａｌｓ ｉｎ ２－Ｄ ＤＩＧＥ Ｄａｔａ，”Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ ７：１１９７－１２０７（２００７）を参照のこと。対照対象と比較して生体分子が増加する状態の例としては、上述の疾患が挙げられる。
したがって、本願のキメラ分子および組成物は、治療を必要とする対象に投与される。Ｅ３モチーフをコードするＥ３遺伝子産物等のＥ３ユビキチンリガーゼは、上述され、本明細書に開示されるキメラ分子の有効性を決定するための本スクリーニング方法において使用することができる。いくつかの実施形態において、好適なインビトロアッセイまたはインビボアッセイを実施して、本願のキメラ分子および組成物の効果、ならびに投与が治療のために適応されるかどうかを決定する。治療における使用のための組成物は、限定されないが、ラット、マウス、ニワトリ、ウシ、サル、ウサギ等を含む好適な動物モデル系において、ヒト対象における試験の前に試験することができる。同様に、インビボ試験のために、当該技術分野で既知の動物モデル系のいずれも、ヒト対象への投与の前に使用することができる。
細胞、臓器、または組織を組成物と接触させるための当業者に既知の任意の方法が用いられ得る。インビボ方法は、典型的には、哺乳動物、好適には、上記のもの等のヒトへのキメラ分子または組成物の投与を含む。治療のためにインビボで使用される場合、キメラ分子または組成物は、本明細書に記載されるように、対象に有効量で投与される。結果は、本明細書に記載の方法の開始時に示される経験的変数に従って確認することができる。
インビトロ方法は、典型的には、試料または抽出物に対する、上記のもの等のキメラ分子または組成物の効果をアッセイすることを含む。いくつかの実施形態において、キメラ分子の有効性は、基質分解に対する影響、すなわち、キメラ分子および組成物が試料中の表現型変化をもたらす能力を評価することによって決定することができる。そのような方法には、限定されないが、免疫組織化学、免疫蛍光、ＥＬＩＳＰＯＴ、ＥＬＩＳＡ、またはＲＩＡが含まれる。種々の有用な免疫検出方法の工程は、例えば、Ｎａｋａｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｅｎｚｙｍｅ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ：Ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓ ａｎｄ Ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１：Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２７．１－２７．２０（１９８６）などの科学文献に記載され、これらの各々は参照によりその全体が本明細書に組み込まれ、具体的には免疫検出方法に関するその教示のために組み込まれる。
イムノアッセイは、それらの最も単純かつ直接的な意味において、抗体と抗原との間の結合を伴う結合アッセイである。多くの種類および形式のイムノアッセイが既知であり、全てが開示されたバイオマーカーの検出に適している。イムノアッセイの例は、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、酵素結合免疫スポットアッセイ（ＥＬＩＳＰＯＴ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、ラジオイムノ沈殿アッセイ（ＲＩＰＡ）、免疫ビーズ捕捉アッセイ、ウェスタンブロッティング、ドットブロッティング、ゲルシフトアッセイ、フローサイトメトリー、免疫組織化学、蛍光顕微鏡、タンパク質アレイ、多重ビーズアレイ、磁気捕捉、インビボイメージング、蛍光共鳴エネルギー伝達（ＦＲＥＴ）、および光退色後の蛍光回復／局在化（ＦＲＡＰ／ＦＬＡＰ）である。
一般に、イムノアッセイは、目的となる分子（開示される生体分子）を含有する疑いのある試料を、目的となる分子に対する抗体と接触させるか、場合によっては、免疫複合体の形成を可能にするのに有効な条件下で、目的となる分子に対する抗体（開示される生体分子に対する抗体等）を、抗体によって結合することができる分子と接触させることを含む。この点において、当業者は、所与の試料中の特定の生体分子の存在およびまたはレベルを評価することができる。続いて、本願のキメラ分子組成物をアッセイに添加する。その後、本明細書に記載のイムノアッセイを使用して、治療後の表現型効果を決定するために、生体分子のレベル、すなわち、その存在またはレベルを評価することができる。
イムノアッセイは、試料中の目的となる生体分子の量を検出または定量するための方法を含み得、この方法は、一般に、結合プロセス中に形成される任意の免疫複合体の検出または定量を伴う。一般に、免疫複合体形成の検出は当該技術分野で周知であり、多数のアプローチの適用によって達成され得る。これらの方法は、概して、任意の放射性、蛍光性、生物学的もしくは酵素的タグ、または任意の他の既知の標識等の標識またはマーカーの検出に基づく。例えば、各々は参照によりその全体が本明細書に組み込まれ、具体的には免疫検出方法および標識に関する教示のために組み込まれる、米国特許第３，８１７，８３７号、同第３，８５０，７５２号、同第３，９３９，３５０号、同第３，９９６，３４５号、同第４，２７７，４３７号、同第４，２７５，１４９号、および同第４，３６６，２４１号を参照されたい。
本願の治療方法は、上述のように、標的指向ドメインに結合したユビキチン領域を保有する。いくつかの実施形態において、標的指向ドメインは、上述の細胞内生体分子に結合する。同様に、本願の治療方法は、標的指向ドメインと基質との間の結合の立体破壊を防止するのに十分な長さのポリペプチドリンカーを使用する。いくつかの実施形態において、生体分子は上述の疾患と関連付けられる。
一実施形態において、この方法は複数の試験剤を用いて行われる。
本願の第７の態様は、疾患バイオマーカーについてスクリーニングする方法に関する。本方法は、１つ以上のリガンドを発現する疾患細胞の試料を提供することと、（ｉ）Ｅ３ユビキチンリガーゼ（Ｅ３）モチーフを含む分解ドメインと、（ｉｉ）上記分解ドメインを１つ以上のリガンドへと特異的に方向付けることができる標的指向ドメインであって、上記分解ドメインに対して異種である、標的指向ドメインと、（ｉｉｉ）上記分解ドメインを上記標的指向ドメインに結合させるリンカーとを含む複数のキメラ分子を提供することと、疾患細胞がキメラ分子の非存在下で増殖することに失敗するのに有効な条件下で、試料を複数のキメラ分子と接触させることと、キメラ分子のうちのどれが疾患細胞の増殖を可能にするかを決定することと、決定に基づいて、キメラ分子に結合しかつ疾患細胞の増殖を可能にするリガンドを、疾患のバイオマーカーとして同定することとを含む。
本態様において記載されるキメラ分子は、本願の前述の態様に従って行われる。
本明細書で使用される場合、「バイオマーカー」または「生体分子」または「分子」という用語は、対照対象または対照対象集団から採取された同等の試料と比較して、疾患を有する患者から採取された試料中に示差的に存在するポリペプチド（特定の発現レベルのもの）を指す。
本明細書で使用される場合、「リガンド」または「基質」という用語は、タンパク質、分子、キメラ分子、リガンド（二量体）、基質（二量体）、第２の基質、第２のリガンド、標的ドメイン、領域、部分、およびそれらのフラグメント、ユビキチンまたはＥ３モチーフ領域、ドメイン、またはそれらの部分、生体分子、バイオマーカー等に結合し、それらと一過性または安定な複合体を形成し、生物学的目的、例えば、酵素反応のプロセスで酵素と相互作用する基質を供給することができる物質を指す。リガンドはまた、イオン結合、水素結合、およびファンデルワールス力等の分子間力によって標的タンパク質上の部位に結合するシグナル誘発分子を含む。いくつかの実施形態において、基質はリガンドに結合する、および／またはリガンドは基質に結合する。
すべての疾患ではないにしても、多くは複雑で多因子である。例えば、神経変性を考慮する場合、実質的な神経細胞損失は、病理学的提示の前に生じる。神経変性疾患を治療するためのこのような薬物のスクリーニングおよび開発は、症状を改善する補助療法によってさらに妨害される。したがって、標的検出は、事前の治療投与によって曖昧にされ、これは、次いで、疾患の進行を遅くし、治療レジメンをさらに混乱させ得る。このようにして、本願は、表現型スクリーニング分析を用いることによる疾患バイオマーカーの解明のための新しい発明的スクリーニング方法を提供する。例えば、Ｐｒｕｓｓ，Ｒ．Ｍ．，“Ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ Ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ Ｄｉｓｅａｓｅｓ：Ａ Ｐａｔｈｗａｙ ｔｏ Ｄｉｓｃｏｖｅｒ Ｎｏｖｅｌ Ｄｒｕｇ Ｃａｎｄｉｄａｔｅｓ ａｎｄ Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｔａｒｇｅｔｓ ｏｒ Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ．”ＣＮＳ＆Ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ－Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔｓ，９，６９３－７００（２０１０）を参照のこと。これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
表現型スクリーニングは、疾患に罹患している患者からの適切な試料、例えば、細胞のクラス、細胞抽出物、ニューロン、組織等を使用し、試料を本明細書に記載の１つ以上のキメラ分子に供することを伴う。その後、試料は、疾患細胞の生存率、増殖、細胞プロセスおよび／または表現型特徴、例えば、収縮、膜電位の喪失、形態変化等についてスクリーニングされる。画像解析ソフトウェアを使用すると、細胞体または他のオブジェクトが結果を経験的に評価することができる。スクリーニングからのヒットは、生存経路を刺激すること、栄養因子を模倣すること、またはデスシグナル伝達を阻害することによって細胞生存を維持することができる。次いで、標的指向性二次アッセイにおけるより高いコンテンツスクリーニングおよびプロファイリングを使用して、有望なヒットの標的および作用機序を特定することができる。
バイオマーカースクリーニング分析を実行することができる疾患状態の例としては、上記の疾患が挙げられる。いくつかの実施形態において、疾患バイオマーカーについてスクリーニングする方法は複数の分子を含み、分子は上述のＥ３モチーフを保有する。いくつかの実施形態において、バイオマーカースクリーニング方法は、上述の標的指向ドメインを保有する分子を含む。本願のスクリーニング方法は、標的指向ドメインと生体分子および／またはリガンドとの間の結合の立体破壊を防止するのに十分な長さのポリペプチドリンカーを使用する。
キメラ分子が治療指標を提供すると決定されると、バイオマーカーは、標的指向ドメイン領域（またはキメラ分子全体）を使用して単離され、試料からバイオマーカーを免疫沈降させ、これは、その後、当該技術分野で周知の方法を使用して同定される。バイオマーカー単離および精製方法には、限定されないが、例えば、サイズ排除または親和性ベースのカラム樹脂を使用したＨＰＬＣまたはＦＰＬＣクロマトグラフィーが含まれる。例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．１９８９，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓを参照されたい。
本願のポリペプチドの活性フラグメント、誘導体、または変異体は、例えば、ポリペプチドの特性、二次構造、および生物学的活性に最小限の影響を与えるアミノ酸の欠失または付加によって認識され得る。例えば、ポリペプチドは、タンパク質の細胞下または細胞外局在化を翻訳と同時にまたは翻訳後に方向付けるタンパク質のＮ末端のシグナル（またはリーダー）配列に連結され得る。
次いで、バイオマーカーは、当該技術分野で既知の技法を使用して解明され得る。いくつかの実施形態において、バイオマーカーの同一性の決定は、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ、質量分析、質量スペクトロスコピー、タンパク質配列決定、抗体相互作用、ウェスタンブロット、イムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ、クロマトグラフィー技術、逆プロテオミクス、免疫沈降、ラジオイムノアッセイ、および免疫蛍光、またはこれらの任意の組み合わせを使用して行われる。
タンパク質の研究および同定のための好適な質量分析技術としては、レーザー脱離イオン化質量分析およびエレクトロスプレーイオン化質量分析が挙げられる。レーザー脱離イオン化（ＬＤＩ）質量分析（ＭＳ）のカテゴリ内では、マトリックス補助ＬＤＩ（ＭＡＬＤＩ）と表面補助ＬＤＩ（ＳＥＬＤＩ）飛行時間（ＴＯＦ）ＭＳの両方が用いられ得る。ＳＥＬＤＩ ＴＯＦ－ＭＳは、アトモル感度の分析、低豊富タンパク質（ｐｇ－ｎｇ／ｍｌ）の定量化、および高度に再現可能な結果を提供するため、本方法における使用のために特に適している。
本明細書に記載の方法は、例えば、過剰発現基質、生体分子、またはバイオマーカーを伴う疾患または病気の症状を呈する対象を治療するために、例えば臨床環境において好都合に使用することができる、少なくとも１つの試薬、例えば、本明細書に記載のキメラ分子または組成物を含む予めパッケージングされたキットを利用することによって実行することができる。さらに、本願のキメラ分子を発現させることができる任意の細胞型または組織は、本明細書に記載のキットにおける使用のために好適である。
本願の別の態様において、本願のキメラ分子および組成物を使用するためのキットまたは試薬システム。このようなキットは、本明細書に開示される方法に従ってアッセイを行うために必要な特定の要素を含む試薬の組み合わせを含有する。試薬システムは、試薬の適合性が、試験デバイス構成において、またはより典型的には、試験キットとして、すなわち、必要な試薬を保持する１つ以上の容器、デバイス等のパッケージングされた組み合わせを可能にする組成物または混合物として、市販のパッケージングされた形態で提示され、好ましくは、アッセイの実施のための書面による説明書を含む。このキットは、アッセイの任意の構成に適合され得、本明細書に記載の様々なアッセイ形式のいずれかを実行するための組成物を含み得る。
開示される方法に有用な試薬は、溶液中に貯蔵することができるか、または凍結乾燥することができる。凍結乾燥されると、試薬の一部または全ては、溶解後に容易に使用するために、マイクロタイタープレートウェルに容易に貯蔵することができる。当該技術分野で既知の試薬を凍結乾燥させるための任意の方法が、開示される方法に有用な乾燥試薬を調製するために好適であることが企図される。
また、本願の範囲内には、本願のキメラ分子／組成物および第２の薬剤、ならびに使用説明書を含むキットがある。キットは、例えば、限定されないが、血清、血漿、リンパ液、嚢胞性流体、尿、便、脳脊髄液、腹水（ａｃｉｔｉｃ ｆｌｕｉｄ）、または血液を含む任意の体液、および体内組織の生検試料を含む、生物学的試料中、基質の存在を検出するのに有用である。例えば、キットは、生体試料中の基質に結合することができる標的指向ドメインに連結されたＥ３モチーフユビキチン領域から構成される１つ以上のキメラ分子を含むことができる。
以下の実施例は、本願の実施形態を例証するために提供されるが、それらはその範囲を限定することを決して意図するものではない。
以下の実施例は、本願の例示的な実施形態を実証するために含まれる。当業者には、以下の実施例に開示される技法は、本願の実施において良好に機能するために発明者によって発見された技法を表し、したがって、その実施のための好ましいモードを構成すると見なすことができることが理解されるべきである。しかし、当業者は、本願に照らして、本願の技術思想および範囲から逸脱することなく、開示され、依然として同様のまたは類似の結果を得る特定の実施形態において多くの変更が行われ得ることを理解すべきである。
実験方法
プラスミド。本研究で使用されるすべてのプラスミドが、表１に提供される。
（表１）本研究で使用した細菌株（Ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｓｔｒａｉｎ）、細胞株（ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ）、およびプラスミド
Figure 2024059823000039
Figure 2024059823000040
Figure 2024059823000041
Figure 2024059823000042
Figure 2024059823000043
Figure 2024059823000044
Figure 2024059823000045
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＤＨ５αを、すべてのプラスミドの構築および増殖に使用した。ＰｃＤＮＡ３－ＥＧＦＰを構築するために、５’Ｋｏｚａｋ配列を導入したプライマーを使用してＥＧＦＰをＰＣＲ増幅し、得られたＰＣＲ産物をｐｃＤＮＡ３にライゲーションした。５’Ｋｏｚａｋ配列を導入したプライマーによるオーバーラップエクステンションＰＣＲを使用したＥＲＫ２およびＥＧＦＰの遺伝子アセンブリ、続いて、ｐＣＤＨ１へのライゲーションによって、プラスミドｐＣＤＨ１－ＥＲＫ２－ＥＧＦＰを作製した。５’Ｋｏｚａｋ配列および３’ＳＶ４０ ＮＬＳ配列を付加したプライマーを用いたＥＧＦＰのＰＣＲ増幅、次いでｐｃＤＮＡ３中へのＰＣＲ産物のライゲーションによって、プラスミドｐｃＤＮＡ３－ＥＧＦＰ－ＮＬＳを作製した。５’Ｋｏｚａｋ配列によるＳＨＰ２のＰＣＲ増幅、続いてｐｃＤＮＡ３－ＥＧＦＰへのライゲーションによって、プラスミドｐｃＤＮＡ３－ＳＨＰ２－ＥＧＦＰを作製した。プラスミドｍＥＧＦＰ－ＨＲａｓＧ１２ＶからのＥＧＦＰ－ＨＲａｓＧ１２ＶのＰＣＲ増幅、その後、ｐＣＤＨ１へのＰＣＲ産物のライゲーションによって、プラスミドｐｃＤＮＡ３－ＥＧＦＰ－ＨＲａｓＧ１２Ｖを生成した。
Figure 2024059823000046
ＧＦＰ指向性ｕＡｂの作製のために、上流Ｋｏｚａｋ、６×Ｈｉｓ、およびＦＬＡＧ配列を導入したプライマーを使用したｐＨＦＴ２－ＧＳ２からのＧＳ２のＰＣＲ増幅（Ｋｏｉｄｅ ｅｔ ａｌ．，“Ｔｅａｃｈｉｎｇ ａｎ Ｏｌｄ Ｓｃａｆｆｏｌｄ Ｎｅｗ Ｔｒｉｃｋｓ：Ｍｏｎｏｂｏｄｉｅｓ Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ Ｕｓｉｎｇ Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ Ｓｕｒｆａｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ＦＮ３ Ｓｃａｆｆｏｌｄ，”Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４１５（２）：３９３－４０５（２０１２）、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）、続いてｐｃＤＮＡ３へのライゲーションによって、プラスミドｐｃＤＮＡ３－ＨＦ－ＧＳ２を構築し、ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩ制限部位が、Ｎ末端融合物を生成するためにＧＳ２の上流で利用可能であるようにした。Ｃ末端融合物については、上流Ｋｏｚａｋ配列ならびに下流ＮｈｅＩおよびＳｂｆＩ制限部位を導入したプライマーを用いてＧＳ２をＰＣＲ増幅することによって、続いて、ｐｃＤＮＡ３へのライゲーションを行って、プラスミドｐｃＤＮＡ３－ＧＳ２－ＦＨを作製した。ＡｖｒＰｔｏＢ、ＩｐａＨ９．８、ＮｌｅＧ２－３、ＮｌｅＧ５－１、ＮｌｅＬ、ＳｌｒＰ、ＳｏｐＡ、ＳＰＯＰ、ＳｓｐＨ１、ＳｓｐＨ２、およびＸｏｐＬをコードする遺伝子を、ＮｈｅＩおよびＳｂｆＩ部位を導入するプライマーでＰＣＲ増幅し、その後、得られたＰＣＲ産物をｐｃＤＮＡ３－ＧＳ２－ＦＨ中にライゲーションした。ＬｅｇＡＵ１３、ＬｅｇＵ１、およびＳｉｄＣをコードする遺伝子を、ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩ部位を導入するプライマーでＰＣＲ増幅し、その後、得られたＰＣＲ産物をｐｃＤＮＡ３－ＨＦ－ＧＳ２中にライゲーションした。プラスミドｐｃＤＮＡ３－ＧＳ２－ＣＨＩＰは、上流ＨｉｎｄＩＩＩおよびＫｏｚａｋ配列ならびに下流ＮｈｅＩ部位を導入したプライマーを使用してｐＨＦＴ２－ＧＳ２からＧＳ２をＰＣＲ増幅し、続いてｓｃＦｖＲ４の代わりにｐｃＤＮＡ３－Ｒ４－ＣＨＩＰΔＴＰＲ中にライゲーションすることによって作製した。プラスミドｐｃＤＮＡ３－ＶＨＬ－ＧＳ２およびｐｃＤＮＡ３－βＴｒＣＰ－ＧＳ２は、ＨｉｎｄＩＩおよびＸｈｏＩ（ＶＨＬ）またはＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩ（βＴｒＣＰ）部位を導入したプライマーを用いてＶＨＬおよびβＴｒＣＰをコードする遺伝子をＰＣＲ増幅し、その後、得られたＰＣＲ産物を、ＮＳｌｍｂの代わりにｐｃＤＮＡ３－ＮＳｌｍｂ－ＧＳ２中にライゲーションすることによって作製した。プラスミドｐｃＤＮＡ３－ＧＳ２－ＩｐａＨ９．８Ｃ３３７Ａ、ｐｃＤＮＡ３－ＧＳ２－ＩｐａＨ０７２２、ｐｃＤＮＡ３－ＧＳ２－ＩｐａＨ１．４、ｐｃＤＮＡ３－ＧＳ２－ＩｐａＨ２．５、ｐｃＤＮＡ３－ＧＳ２－ＩｐａＨ４．５、およびｐｃＤＮＡ３－ＧＳ２－ＩｐａＨ７．８は、ｐｃＤＮＡ３－ＧＳ２－ＩｐａＨ９．８の部位特異的変異誘発によって作製した。以下の遺伝子を購入した：ＳｓｐＨ１（Ｔｗｉｓｔ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＩｐａＨ９．８（Ｔｗｉｓｔ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＶＨＬ（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ、Ｏｈｕ２３２９７Ｄ）、ＬｕｂＸ（Ｔｗｉｓｔ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＬｅｇＵ１（ＩＤＴ）およびＬｅｇＡＵ１３（ＩＤＴ）。他の全ては、実験室在庫中の既存のプラスミドまたはゲノムＤＮＡから増幅した。
プラスミドｐＥＴ２４ｄ－ＧＳ２－ＩｐａＨ９．８およびｐＥＴ２４ｄ－ＩｐａＨ９．８ΔＬＲＲは、ＮｃｏＩおよびＮｏｔＩ（ＧＳ２－ＩｐａＨ９．８）またはＮｈｅＩおよびＮｏｔＩ（ＩｐａＨ９．８ΔＬＲＲ）部位を導入したプライマーを用いて、全長ＧＳ２－ＩｐａＨ９．８および切断型ＩｐａＨ９．８ΔＬＲＲをそれぞれＰＣＲ増幅し、その後、得られたＰＣＲ産物をｐＥＴ２４ｄ（＋）にライゲーションすることによって作製した。プラスミドｐＥＴ２８ａ－ＧＳ２は、上流ＮｃｏＩ部位ならびに下流ＦＬＡＧ、６×Ｈｉｓ、およびＨｉｎｄＩＩＩ配列を導入したプライマーを使用してｐＨＦＴ２－ＧＳ２からＧＳ２をＰＣＲ増幅し、その後、得られたＰＣＲ産物をｐＥＴ２８ａ（＋）にライゲーションすることによって作製した。プラスミドｐＴｒｉＥｘ－３－ＧＳ２－ＩｐａＨ９．８Ｃ３３７Ａは、ＥｃｏＲＶおよびＨｉｎｄＩＩＩ部位を導入したプライマーを用いてｐｃＤＮＡ３－ＧＳ２－ＩｐａＨ９．８Ｃ３３７ＡからＧＳ２－ＩｐａＨ９．８Ｃ３３７ＡをＰＣＲ増幅し、その後、得られたＰＣＲ産物をｐＴｒｉＥｘ－３にライゲーションすることによって作製した。プラスミドｐＥＴ２８ａ－ＥＧＦＰは、Ｃ末端６×Ｈｉｓタグを付加するプライマーを用いてＧＦＰをＰＣＲ増幅し、その後、得られたＰＣＲ産物をｐＥＴ２８ａ（＋）中にライゲーションすることによって作製した。すべてのプラスミドを、コーネルバイオテクノロジーリソースセンター（ＢＲＣ）でのＤＮＡ配列決定によって検証した。
細胞株、培養およびトランスフェクション。本研究で使用されるすべての細胞株が、表１に提供される。簡潔に述べると、ＨＥＫ２９３ＴおよびＨｅＬａ細胞はＡＴＣＣから得、ＨｅＬａ Ｈ２Ｂ－ＥＧＦＰ細胞はＥｌｅｎａ Ｎｉｇｇにより恵与され、ＭＣＦ１０Ａ ｒｔＴＡ細胞はＭａｔｔｈｅｗ Ｐａｓｚｅｋにより恵与された。ＨＥＫ２９３Ｔ、ＨｅＬａ、およびＨｅＬａ Ｈ２Ｂ－ＥＧＦＰ細胞は、１０％ＦｅｔａｌＣｌｏｎｅＩ（ＶＷＲ）および１％ペニシリンストレプトマイシン－アンフォテリシンＢ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）が補充された４．５ｇ／ＬグルコースおよびＬ－グルタミン（ＶＷＲ）を有するＤＭＥＭ中で培養し、ＭＣＦ－１０ａ細胞は、５％ウマ血清（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、２０ｎｇ／ｍＬ ＥＧＦ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、０．５ｍｇ／ｍＬヒドロコルチゾン（Ｓｉｇｍａ）、１００ｎｇ／ｍＬコレラ毒素（Ｓｉｇｍａ）、１０μｇ／ｍＬインスリン（Ｓｉｇｍａ）、および１％ペニシリンストレプトマイシン－アンフォテリシン Ｂ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）が補充されたＤＭＥＭ／Ｆ １２培地（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）中で培養した。全ての細胞を、３７℃、５％ＣＯ２、および９０％の相対湿度（ＲＨ）で維持した。
ＰｉｇｇｙＢａｃトランスポザーゼの高活性バージョンの発現プラスミドであるＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｖ（Ｌｏｎｚａ）およびＨｙＰＢａｓｅを使用して、安定したＭＣＦ１０Ａ ｒｔＴＡ細胞株を生成した。ＭＣＦ１０ Ａ ｒｔＴＡ細胞の転位を行って、以下の安定した株を生成した：ＭＣＦ１０Ａ ＥＧＦＰ－ＨＲａｓＧ１２Ｖ、ＭＣＦ１０Ａ ＥＧＦＰ－ＨＲａｓＧ１２Ｖ：ＧＳ２－ＩｐａＨ９．８、ＭＣＦ１０Ａ ＥＧＦＰ－ＨＲａｓＧ１２Ｖ：ＧＳ２－ＩｐａＨ９．８Ｃ３３７Ａ、およびＭＣＦ１０Ａ ＧＳ２－ＩｐａＨ９．８。２００μｇ／ｍＬのハイグロマイシンＢ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用して、安定した細胞株を選択した。
ＥＧＦＰ、ＥＧＦＰ－ＨＲａｓＧ１２Ｖ、ＥＲＫ２－ＥＧＦＰ、ｄ２ＥＧＦＰを発現する安定したＨＥＫ２９３Ｔ細胞株をレンチウイルス形質転換によって作製した。具体的には、ｐＬＶ ＩＲＥＳ ｅＧＦＰ、ｐｃＤＨ１ ｅＧＦＰ－ＨＲａｓＧ１２Ｖ、ｐｃＤＨ １ＥＲＫ２－ＥＧＦＰ、またはｐＨＩＶ－ｄ２ＥＧＦＰを、ｐｓＰＡＸ２およびｐＭＤ２．Ｇと共にＨＥＫ２９３Ｔ細胞にリン酸カルシウムトランスフェクトによってトランスフェクトした。培地を約１６時間後に置き換え、続いてウイルス産生を可能にするために４８時間のインキュベーションを行った。ウイルス上清を除去し、ポリブレン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を８μｇ／ｍＬの最終濃度まで添加し、続いて、２，０００ｒｐｍで５分間遠心分離することによって細胞デブリを除去した。得られた上清を細胞培地で１：６で希釈し、安定した組み込みのために、事前にプレーティングされたＨＥＫ２９３Ｔ細胞に添加した。ＨＥＫ２９３Ｔ ＥＧＦおよびＨＥＫ２９３Ｔ ＥＲＫ２－ＥＧＦＰ細胞株を蛍光活性化細胞選別（ＢＤ ＦＡＣＳＡｒｉａ）によって選択した。ＨＥＫ２９３Ｔ ＥＧＦＰ－ＨＲａｓＧ１２Ｖ細胞株を、１μｇ／ｍＬのピューロマイシン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を使用して選択した。
ウェスタンブロット分析。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を１０，０００細胞／ｃｍ２で播種し、上述のようにトランスフェクトした後、ＲＩＰＡ溶解緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）で溶解した。ＭＣＦ１０Ａ細胞を２０，０００細胞／ｃｍ２で播種し、０．２μｇ／ｍＬのドキシサイクリンで２４時間誘導した後、細胞溶解緩衝液で溶解した。溶解物を任意のｋＤのポリアクリルアミドゲル（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）上で分離し、ＰＶＤＦ膜に移した。α－ＨＩＳ－ＨＲＰ（Ａｂｃａｍ）、α－ＧＦＰ（Ｋｒａｃｋｅｌｅｒ）およびα－ＧＡＰＤＨ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）抗体を１：５，０００で、ＴＢＳＴ＋１％ミルクに希釈し、室温で１時間インキュベートした。ＨＲＰ結合（Ｐｒｏｍｅｇａ）を有する二次抗体ヤギ抗マウスＩｇＧを１：２，５００で希釈し、必要に応じて使用した。
フローサイトメトリー分析。細胞を１２ウェルプレートに１０，０００細胞／ｃｍ２で播いた。播種から１６～２４時間後、ＤＮＡ：ｊｅｔＰｒｉｍｅ（Ｐｏｌｙｐｌｕｓ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）比１：２で１μｇの総ＤＮＡを細胞に一過性にトランスフェクトした。細胞に０．０５μｇの標的、０．２５μｇのユビキボディまたは対照をトランスフェクトし、空のｐｃＤＮＡ３ベクターでバランスを取った。トランスフェクションの４～６時間後に培養培地を交換した。次いで、トランスフェクションの２４時間後に、細胞を回収し、ＦＡＣＳ ＣａｌｉｂｕｒまたはＦＡＣＳＡｒｉａ融合物（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して分析するためにリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中に再懸濁した。ＦｌｏｗＪｏ Ｖｅｒｓｉｏｎ １０を使用して、１０，０００の事象から決定された幾何平均蛍光によって試料を分析した。
顕微鏡検査。細胞を、ポリ－Ｌ－リジン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）で前処理したガラス底１２ウェルプレート上に１０，０００細胞／ｃｍ２で播種した。播種から１６～２４時間後、ＤＮＡ：ｊｅｔＰｒｉｍｅ（Ｐｏｌｙｐｌｕｓ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）比１：２で１μｇの総ＤＮＡを細胞にトランスフェクトした。細胞に０．０５μｇの標的、０．２５μｇのユビキボディまたは対照をトランスフェクトし、空のｐｃＤＮＡ３ベクターでバランスを取った。トランスフェクションの４～６時間後に培養培地を交換した。次いで、トランスフェクションの２４時間後に、細胞を４％パラホルムアルデヒドで固定した。ＥＧＦＲ－ＥＧＦＰ試料について、ＰＢＳ中の５％正常ヤギ血清で２時間細胞をブロックした。抗ＥＧＦＲ抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ ＃４２６７）をＰＢＳ中の５％正常ヤギ血清中で１：２００に希釈し、４℃で一晩インキュベートした。細胞をＰＢＳで３回洗浄し、次いで、ＰＢＳ中の５％正常ヤギ血清中で１：２００に希釈された抗ウサギ－ＡＦ６４７と共に室温で１時間インキュベートした。細胞をＰＢＳで３回洗浄した。細胞核を、ＰＢＳ中で１：１０，０００で希釈したＨｏｅｓｃｈｔで１０分間染色し、次いでＰＢＳ中で３回洗浄した。４０倍水中浸漬対物レンズを用いて、試料を反転Ｚｅｉｓｓ ＬＳＭ８８焦点／マルチフォトン顕微鏡（ｉ８８０）上で撮像した。画像をＦＩＪＩで分析した。
タンパク質発現および精製。精製タンパク質は、所望のタンパク質をコードするｐＥＴ２８ａベースのプラスミドを含有する大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞、またはｐＴｒｉＥｘ－３ベースのプラスミドを含有するＲｏｓｅｔｔａ（ＤＥ３）細胞を、ルリア－ベルタニ（ＬＢ）培地２００ｍＬ中で３７℃で増殖させることによって得た。培養密度（Ａｂｓ６００）が０．６～０．８に達したとき、発現を０．１ｍＭのＩＰＴＧで誘導し、３０℃で６時間成長を続けさせた。培養物を４℃で３０分間、４，０００×ｇで遠心分離することによって回収した。細胞ペレットを－２０℃で一晩保存した。解凍したペレットを１０ｍＬ平衡緩衝液（２５ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．４、５００ｍＭのＮａＣｌおよび２０ｍＭのイミダゾール）中に再懸濁し、高圧ホモジナイザー（Ａｖｅｓｔｉｎ Ｅｍｕｌｓｉ－Ｆｌｅｘ Ｃ５）で溶解した。不溶性画分を、４℃で３０分間、１２，０００×ｇで遠心分離することによって除去した。Ｈｉｓタグ付きタンパク質を、５００μＬのＨｉｓＰｕｒ Ｎｉ－ＮＴＡ樹脂（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用して重力流によって精製した。可溶性画分を樹脂に通し、その後、樹脂を３ｍＬの洗浄緩衝液（２５ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．４、５００ｍＭのＮａＣｌ、および５０ｍＭのイミダゾール）で洗浄した。タンパク質を１．５ｍＬの溶出緩衝液（２５ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．４、５００ｍＭのＮａＣｌ、および２５０ｍＭのイミダゾール）で溶出した。精製画分を脱塩し、濃縮した（Ｐｉｅｒｃｅ ＰＥＳタンパク質濃縮器）。
ＥＬＩＳＡ。９６ウェル酵素イムノアッセイプレートを、０．０５ＭのＮａＣＯ３緩衝液（ｐＨ ９．６）中、１０μｇ／ｍＬのＥＧＦＰ １００μＬで、４℃で一晩コーティングした。次いで、プレートをウェル当たり２００μＬのＰＢＳＴ（１×ＰＢＳ＋０．１％ Ｔｗｅｅｎ ２０）で３回洗浄し、ウェル当たり２５０μＬの３％ミルクを含むＰＢＳで、室温で３時間ブロックし、ゆっくりと混合した。プレートをさらに３回洗浄し、ウェル当たり６０μＬのブロッキング緩衝液中の精製タンパク質の連続希釈物の添加を行った。プレートを室温でインキュベートし、１時間ゆっくりと混合した。プレートを３回洗浄して、結合していないタンパク質を除去し、次いで、ＰＢＳＴ＋１％ミルク中で１：１０，０００に希釈された西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合抗ＦＬＡＧ（ＤＤＤＹＫ）抗体（５０μＬ／ウェル）とともに１時間インキュベートした。プレートを３回洗浄してから、５０μＬ／ウェルのワンステップウルトラＴＭＢ（３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を添加した。反応物をゆっくりと混合しながらインキュベートし、次いで、５０μＬ／ウェルの３ＮＨ２ＳＯ４でクエンチした。次いで、クエンチしたプレートを４５０ｎｍで読み取った。
カチオン性ポリペプチドの合成および特徴付け。Ｎ４（ＴＥＰ）ポリアミンを、Ｕｃｈｉｄａおよび共同研究者らの修正された手順に従って、最近記載された本群の研究者として合成した（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，“Ｐｏｌｙａｍｉｎｅ－Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｓｔｏｉｃｈｉｏｍｅｔｒｉｃ Ａｓｓｅｍｂｌｙ ｏｆ Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎｓ ｆｏｒ Ｅｎｈａｎｃｅｄ ｍＲＮＡ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，”Ａｎｇｅｗ Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．５６（４４）：１３７０９－１２（２０１７）、これは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。Ｕｃｈｉｄａ ｅｔ ａｌ．，“Ｍｏｄｕｌａｔｅｄ Ｐｒｏｔｏｎａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｉｄｅ Ｃｈａｉｎ Ａｍｉｎｏｅｔｈｙｌｅｎｅ Ｒｅｐｅａｔｓ ｉｎ Ｎ－Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｄ Ｐｏｌｙａｓｐａｒｔａｍｉｄｅｓ Ｐｒｏｍｏｔｅｓ ｍＲＮＡ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ，”Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１３６（３５）：１２３９６－４０５（２０１４）、これは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。簡潔に述べると、Ｎ－メチル－２－ピロリドン（ＮＭＰ）（Ｓｉｇｍａ）（２ｍＬ）中のポリ（β－ベンジル－Ｌ－アスパラギン酸塩）の冷却溶液に、ＮＭＰで２倍に希釈した５０当量のテトラエチレンペンタミン（Ｓｉｇｍａ）を撹拌しながら滴下した。０℃で２時間撹拌した後、ｐＨを冷却６Ｎ ＨＣｌを撹拌しながら滴下添加して１に調節した。得られた溶液を、再生セルロース膜バッグ（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、１ｋＤａ ＭＷＣＯ）から０．０１Ｎ ＨＣｌに対して、続いて蒸留水に対して透析し、凍結乾燥させて白色の粉末を得た。本研究で使用したポリアミンを、２５℃でＢｒｕｋｅｒ Ａｖａｎｃｅ ４００ＭＨｚ ＮＭＲ分光計を用いて、重水素酸化物中の１Ｈ ＮＭＲスペクトル（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｉｓｏｔｏｐｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）によって特徴付けた。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）δ４．７２（ｓ，１Ｈ），３．６４－３．３９（ｍ，９Ｈ），３．３７－３．０５（ｍ，５Ｈ），３．００－２．６２（ｍ，４Ｈ）。
インビトロ転写によるｍＲＮＡの調製。ｕＡｂをコードするｃＤＮＡは、ＧＦＰフラグメントをＸｂａＩおよびＮｏｔＩ部位に置き換えることによってｐＧＥＭ４Ｚ／ＧＦＰ／Ａ６４にクローニングした。加えて、ヒトα－グロビン３’ＵＴＲ配列を、ＮｏｔＩおよびＥｃｏＲＩを使用してｃＤＮＡとポリＡテールとの間に配置してｍＲＮＡ翻訳を改善した。ＳｐｅＩによる直線化、続いてＨｉＳｃｒｉｂｅ（商標）Ｔ７高収率ＲＮＡ合成キット（ＮＥＢ）によるインビトロ転写（ＩＶＴ）により、６４ヌクレオチドのベクター由来配列、コード配列、α－グロビン３’ＵＴＲ、および６４Ａ残基を含有する転写産物を得た。典型的な２０μｌ反応において、以下のヌクレオチドを調製した：ＡＴＰ（１０ｍＭ）、プソイド－ＵＴＰ（１０ｍＭ）、メチル－ＣＴＰ（１０ｍＭ）、ＧＴＰ（２ｍＭ）、抗逆方向Ｃａｐ類似体（８ｍＭ，ＮＥＢ）。ＲＮＡをＲＮｅａｓｙ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）によって精製した。１％アガロースゲルに供することによってＲＮＡの品質を確認した。濃度は、Ａｂｓ２６０によって決定した。
ナノプレックストランスフェクション。ポリアミンを１０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）中に溶解させた。９６ウェルプレートの各ウェルについて、５μｌのＯｐｔｉＭＥＭ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）中で希釈した２００ｎｇ ｍＲＮＡを、５μｌのＰＡＢＰを含有するＯｐｔｉＭＥＭ（ｍＲＮＡ：ＰＡＢＰ重量比＝１：５）と室温で１０分間混合した。その後、５μＬのＯｐｔｉＭＥＭ含有ポリアミンを添加し、室温で１５分間インキュベートした後、ＨＥＫ２９３Ｔにトランスフェクションし、ｄ２ＥＧＦＰを安定的に発現させた。ポリアミンを調整して、トランスフェクションのための５０対１（Ｎ／Ｐ）比を達成した。ＥＧＦＰ発現を、トランスフェクション後の異なる時点でＢＤ ＦＡＣＳＣｅｌｅｓｔａ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）によって測定した。
動物実験。マウスの管理および実験手順は、確立された施設ガイドラインおよびＭＩＴ学科（ＭＩＴ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ）の比較医学部門から承認されたプロトコルに従って、病原体のない条件下で実施した。Ｃ５７ＢＬ／６－Ｔｇ（ＵＢＣ－ＧＦＰ）３０Ｓｃｈａ／ＪマウスをＪａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから購入した。８～１０週齢のマウスに、２５μｌの体積のＯｐｔｉＭＥＭ中、Ｎ４（ＴＥＰ）ポリアミンとともにパッケージングされた５μｇのｍＲＮＡおよび２５μｇのＰＡＢＰを、麻酔下で耳に皮下注射した。蛍光撮像は、軽量標本箱（Ｘｅｎｏｇｅｎ）に取り付けられたＣＣＤカメラを用いて行った。曝露時間は１秒であった。シグナルのイメージングおよび定量化は、Ｌｉｖｉｎｇ Ｉｍａｇｅ取得および分析ソフトウェア（Ｘｅｎｏｇｅｎ）によって制御された。
実施例１－操作されたＩｐａＨ９．８は、哺乳動物細胞においてＧＦＰを潜在的にサイレンシングする。
非天然標的のサイレンシングのために病原性細菌由来のＥ３ユビキチンリガーゼ模倣物を再設計することができるかどうかを決定するために、これまでの細菌において見出されたＥ３の主要クラスを表す１４種の候補酵素のパネルに焦点を当てた（以下、表２）。Ｍａｃｕｌｉｎｓ ｅｔ ａｌ．，“Ｂａｃｔｅｒｉａ－Ｈｏｓｔ Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ：Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ Ｌｉｇａｓｅｓ ａｓ Ｗｅａｐｏｎｓ ｏｆ Ｉｎｖａｓｉｏｎ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．２６（４）：４９９－５１０（２０１６）およびＬｉｎ ｅｔ ａｌ．，“Ｅｘｐｌｏｉｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｈｏｓｔ Ｃｅｌｌ Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ Ｍａｃｈｉｎｅｒｙ ｂｙ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｅｆｆｅｃｔｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，”Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ．１３０（１２）：１９８５－９６（２０１７）、これは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
（表２）本研究で評価した細菌性Ｅ３ユビキチンリガーゼ
Figure 2024059823000047
１表２に列挙される参照文献は、各Ｅ３ユビキチンリガーゼの触媒ドメインの明確な証明または注釈を提供する。
表２中の略語：ＮＥＬ、新規Ｅ３リガーゼ；ＨＥＣＴ、Ｅ６ＡＰ Ｃ末端に相同；ＳＣＦ、Ｓｋｐ１／Ｃｄｃ５３またはＣｕｌｌｅｎ－１／Ｆボックスタンパク質；ＳＰＯＰ、スペックル型ＰＯＺタンパク質；ＶＨＬ、フォンヒッペル・リンダウ（ｖｏｎ Ｈｉｐｐｅｌ－Ｌｉｎｄａｕ）；ＥＣＶ、Ｅｌｏｎｇｉｎ Ｂ／Ｃ、Ｃｕｌｌｅｎ－２、ＶＨＬ
Figure 2024059823000048
Figure 2024059823000049
このパネルには、ＨＥＣＴ型、ＲＩＮＧ型またはＵボックス（ＲＩＮＧ／Ｕボックス）型、およびＦボックスドメイン等の真核生物Ｅ３に類似した折り畳みを有するＥ３模倣物、ならびに新規のＥ３リガーゼ（ＮＥＬ）、ＸＬボックス含有、およびＳｉｄＣ等の任意の他の真核生物Ｅ３とは異なる折り畳みを有する非従来的なＥ３が含まれた。一般に、ｕＡｂは、各Ｅ３模倣物から天然基質結合ドメインを除去することと、それをヒトＣＨＩＰに基づいて以前に設計されたｕＡｂと同様の合成結合タンパク質（図１Ａ）で置き換えることによって操作された。Ｐｏｒｔｎｏｆｆ ｅｔ ａｌ．，“Ｕｂｉｑｕｉｂｏｄｉｅｓ，Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｅ３ Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ Ｌｉｇａｓｅｓ Ｅｎｄｏｗｅｄ Ｗｉｔｈ Ｕｎｎａｔｕｒａｌ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｆｏｒ Ｔａｒｇｅｔｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ，”Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８９（１１）：７８４４－５５（２０１４）、これは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。例えば、Ｓ．フレックスネリＩｐａＨ９．８は、ＮＦ－κＢ必須調節物質（ＮＥＭＯ）等の天然基質タンパク質への結合および特異性を媒介する８つの２０残基のロイシンリッチ反復（ＬＲＲ）を有するＮ末端ドメイン（Ａｓｈｉｄａ ｅｔ ａｌ．，“Ａ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｅ３ Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ Ｌｉｇａｓｅ ＩｐａＨ９．８ Ｔａｒｇｅｔｓ ＮＥＭＯ／ＩＫＫｇａｍｍａ ｔｏ Ｄａｍｐｅｎ ｔｈｅ Ｈｏｓｔ ＮＦ－ＫａｐＰａｂ－Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ，”Ｎａｔ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１２（１）：６６－７３，ｓｕｐ．ｐｐ．１－９（２０１０）、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）およびグアニル酸結合タンパク質（ＧＢＰ）（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，“Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｏｆ ＧＢＰｓ ｂｙ ａ Ｓｈｉｇｅｌｌａ Ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｔｏ Ｓｕｐｐｒｅｓｓ Ｈｏｓｔ Ｄｅｆｅｎｃｅ，”Ｎａｔｕｒｅ ５５１（７６８０）：３７８－８３（２０１７）、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）からなり、一方、Ｃ末端ドメインは新規のＥ３ユビキチンリガーゼアーキテクチャを採用する。Ｚｈｕ ｅｔ ａｌ．，“Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ａ Ｓｈｉｇｅｌｌａ Ｅｆｆｅｃｔｏｒ Ｒｅｖｅａｌｓ ａ Ｎｅｗ Ｃｌａｓｓ ｏｆ Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ Ｌｉｇａｓｅｓ，”Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５（１２）：１３０２－０８（２００８）およびＳｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，“Ａ Ｐａｔｈｏｇｅｎ Ｔｙｐｅ ＩＩＩ Ｅｆｆｅｃｔｏｒ Ｗｉｔｈ ａ Ｎｏｖｅｌ Ｅ３ Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ Ｌｉｇａｓｅ Ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ，”ＰＬｏＳ Ｐａｔｈｏｇｅｎｓ ９（１）：ｅ１００３１２１（２０１３）、これらは、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。したがって、ＩｐａＨ９．８のＮ末端ＬＲＲドメインを、ＧＦＰにナノモルの親和性（Ｋｄ＝３１ｎＭ）で結合するＦＮ３モノボディであるＧＳ２に置き換えた。Ｋｏｉｄｅ ｅｔ ａｌ．，“Ｔｅａｃｈｉｎｇ ａｎ Ｏｌｄ Ｓｃａｆｆｏｌｄ Ｎｅｗ Ｔｒｉｃｋｓ：Ｍｏｎｏｂｏｄｉｅｓ Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ Ｕｓｉｎｇ Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ Ｓｕｒｆａｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ＦＮ３ Ｓｃａｆｆｏｌｄ，”Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４１５（２）：３９３－４０５（２０１２）、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。これらの酵素の天然基質認識機能をＧＳ２モノボディと交換することにより、ＧＦＰを標的とし、そのプロテアソーム分解を促進すると仮定した合成Ｅ３リガーゼを作製した。この仮説を試験するために、異なるＧＳ２－Ｅ３キメラを哺乳動物細胞において増強ＧＦＰ（ＥＧＦＰ）と共に一過性に共発現させ、蛍光活性をフローサイトメトリー分析によってモニタリングした。これまでに、ＥＧＦＰの最も顕著な枯渇は、ＧＳ２－ＩｐａＨ９．８で達成され、これは、ＥＧＦＰの蛍光をほぼバックグラウンドレベルに低下させた（図１Ｂおよび図６Ａ～６Ｂ）。ここで試験した条件下で、他の全てのｕＡｂは比較的弱いサイレンシング活性を示した。ＧＳ２－ＮｌｅＧ５－１、ＧＳ２－ＳｓｐＨ１、ＳｉｄＣ－ＧＳ２、およびＧＳ２－ＳｏｐＡがこれらの中で最も活性であり、ＥＧＦＰ蛍光を約２０～４０％低減させた（図１Ｂおよび図６Ａ～６Ｂ）。
この堅牢なサイレンシング活動に照らして、ＧＳ２－ＩｐａＨ９．８に注目を向けた。このキメラを発現する細胞において、ＥＧＦＰの除去は効率的であり、最大９０％の蛍光活性を除去し（図２Ａおよび２Ｂ）、細胞溶解物中に検出可能なＥＧＦＰタンパク質はなかった（図２Ｃ）。重要なことに、ＩｐａＨ９．８の触媒システイン（Ｒｏｈｄｅ ｅｔ ａｌ．，“Ｔｙｐｅ ＩＩＩ Ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ Ｅｆｆｅｃｔｏｒｓ ｏｆ ｔｈｅ ＩｐａＨ Ｆａｍｉｌｙ ａｒｅ Ｅ３ Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ Ｌｉｇａｓｅｓ，”Ｃｅｌｌ Ｈｏｓｔ Ｍｉｃｒｏｂｅ １（１）：７７－８３（２００７）、これは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）をアラニンに変異させ（ＧＳ２－ＩｐａＨ９．８Ｃ３３７Ａ）たとき、およびＡｂｌＳＨ２ドメインに特異的である非同種のＦＮ３モノボディＡＳ１５（Ｋｏｉｄｅ ｅｔ ａｌ．，“Ｈｉｇｈ－Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｓｉｎｇｌｅ－Ｄｏｍａｉｎ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｗｉｔｈ ａ Ｂｉｎａｒｙ－Ｃｏｄｅ Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ，”Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０４（１６）：６６３２－３７（２００７）、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）でＧＳ２を置換したときに、サイレンシング活性が完全に無効にされ（図２Ａ～２Ｃ）、これは、標的分解が両方のｕＡｂドメインの協同作用に依存していたことを示した。ＧＳ２－ＩｐａＨ９．８Ｃ３３７Ａの場合、哺乳動物細胞における発現およびインビトロでのＥＧＦＰ結合活性はアラニン置換の影響を受けず（図７Ａ～７Ｂ）、サイレンシング活性の喪失が、触媒不活性化に起因していたことを確認した。また、切断されていない全長ＩｐａＨ９．８へのＧＳ２の直接融合が、測定可能なサイレンシング活性をもたらさなかったことから、ＬＲＲドメインの除去はノックダウン活性に不可欠であったことに留意するべきである。興味深いことに、Ｓ．フレックスネリ株のゲノム配列は、いくつかのＩｐａＨファミリーメンバー、すなわち、ＩｐａＨ１．４、ＩｐａＨ２．５、ＩｐａＨ４．５、ＩｐａＨ７．８、およびＩｐａＨ９．８が、２２０－ｋｂの毒性プラスミドｐＷＲ１００上にコードされている一方で、７つの追加のｉｐａＨ同族遺伝子が染色体上に存在することを示す。Ｍａｃｕｌｉｎｓ ｅｔ ａｌ．，“Ｂａｃｔｅｒｉａ－Ｈｏｓｔ Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ：Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ Ｌｉｇａｓｅｓ ａｓ Ｗｅａｐｏｎｓ ｏｆ Ｉｎｖａｓｉｏｎ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．２６（４）：４９９－５１０（２０１６）、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。これらのファミリーメンバーが、ｕＡｂの文脈におけるＥＧＦＰの分解についてＩｐａＨ９．８と同様に優れていたかどうかを判断するために、ＧＳ２と、ｐＷＲ１００にコードされたＩｐａＨファミリーメンバーの各々に由来する、ならびに染色体にコードされた1メンバー、ＩｐａＨ０７２２に由来する触媒ドメインとの間でキメラを生成した。培養細胞において異所的に発現させた場合、全てのＩｐａＨベースのｕＡｂは、哺乳動物細胞において効率的な（約９０％以上）ＥＧＦＰノックダウンが可能であった（図２Ｄ）。この結果は、異なる触媒ドメインによって共有される高い相同性を考慮すると、必ずしも驚くべきものではなかった。実際、異なるＩｐａＨファミリーメンバーは、ＩｐａＨ９．８と全体では約７０％しか類似していなかったが、触媒ドメインでは、はるかに類似しており（＞９９％）、１～３個のアミノ酸置換だけ、ならびにＩｐａＨ１．４およびＩｐａＨ４．５の場合、わずかなＣ末端の切断だけであった（表２）。
本発明の操作細菌リガーゼの効力をベンチマークするために、ＧＳ２－ＩｐａＨ９．８によって触媒されるＧＦＰサイレンシング活性を、標的タンパク質分解のために以前に再構成された真核Ｅ３機構に基づく他の合成リガーゼのものと比較した。Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ．，“Ｈａｒｎｅｓｓｉｎｇ ｔｈｅ Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎａｔｉｏｎ Ｍａｃｈｉｎｅｒｙ ｔｏ Ｔａｒｇｅｔ ｔｈｅ Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，”Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ ６（３）：７５１－５６（２０００）；Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，“Ｅｘｐｌｏｒｉｎｇ ｔｈｅ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｃｏｍｐｌｅｘｉｔｙ ｏｆ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｂｙ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｋｎｏｃｋｏｕｔ，”Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １００（２４）：１４１２７－３２（２００３）；Ｈａｔａｋｅｙａｍａ ｅｔ ａｌ．，“Ｔａｒｇｅｔｅｄ Ｄｅｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃ－Ｍｙｃ ｂｙ ａｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ Ｌｉｇａｓｅ Ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｓ Ｃｅｌｌ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｕｍｏｒ Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ，”Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６５（１７）：７８７４－７９（２００５）；Ｍａ ｅｔ ａｌ．，“Ｔａｒｇｅｔｅｄ Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｏｆ ＫＲＡＳ ｂｙ ａｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ Ｌｉｇａｓｅ Ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｓ Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ ａｎｄ Ｉｎ Ｖｉｖｏ，”Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ．１２（３）：２８６－９４（２０１３）；Ｋｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，“Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ａ Ｓｉｎｇｌｅ Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ Ｌｉｇａｓｅ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｏｆ ａｌｌ Ａｃｔｉｖａｔｅｄ ＥｒｂＢ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｔｙｒｏｓｉｎｅ Ｋｉｎａｓｅｓ，”Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ３３（８）：９８６－９５（２０１４）；Ｃａｕｓｓｉｎｕｓ ｅｔ ａｌ．，“Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｆｕｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｋｎｏｃｋｏｕｔ Ｍｅｄｉａｔｅｄ ｂｙ Ａｎｔｉ－ＧＦＰ Ｎａｎｏｂｏｄｙ，”Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９（１）：１１７－２１（２０１１）；Ｆｕｌｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，“Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ Ｆｏｒ Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ Ｔｈｒｏｕｇｈ ｔｈｅ Ａｆｆｉｎｉｔｙ－Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍｉｓｓｉｌｅ Ｓｙｓｔｅｍ，”Ｏｐｅｎ Ｂｉｏｌ．７（５）：１７００６６（２０１７）；Ｆｕｌｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，“Ａｎ Ａｆｆｉｎｉｔｙ－Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍｉｓｓｉｌｅ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ Ｔａｒｇｅｔｅｄ Ｐｒｏｔｅｏｌｙｓｉｓ，”Ｏｐｅｎ Ｂｉｏｌ ６（１０）：１６０２５５（２０１６）；Ｓｈｉｎ ｅｔ ａｌ．，“Ｎａｎｏｂｏｄｙ－Ｔａｒｇｅｔｅｄ Ｅ３－Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ Ｌｉｇａｓｅ Ｃｏｍｐｌｅｘ Ｄｅｇｒａｄｅｓ Ｎｕｃｌｅａｒ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，”Ｓｃｉ．Ｒｅｐ．５：１４２６９（２０１５）；ａｎｄ Ｋａｎｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，“Ｓｃｕｌｐｔｉｎｇ Ｉｏｎ Ｃｈａｎｎｅｌ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ Ｌｉｇａｓｅｓ，”Ｅｌｉｆｅ ６：ｅ２９７４４（２０１７）、これらは、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。具体的には、ヒト由来のいくつかの真核生物Ｅ３ユビキチンリガーゼの天然基質結合ドメイン（Ｈｓｃ７０相互作用タンパク質（ＣＨＩＰ）、スペックル型ＰＯＺタンパク質（ＳＰＯＰ）、βトランスデューシング（Ｔｒａｎｓｄｕｃｉｎｇ）リピート含有タンパク質（βＴｒＣＰ）、およびフォンヒッペル・リンダウタンパク質（ＶＨＬ）のカルボキシル末端を含む）、ならびにキイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）過剰肢（Ｓｌｍｂ）タンパク質を、ＧＳ２モノボディで置き換え、ＧＳ２－ＩｐａＨ９．８に類似した合成リガーゼのパネルを得た。得られたＧＦＰ特異的ｕＡｂのパネルが哺乳動物細胞においてＥＧＦＰと一過性に共発現したとき、全てが、ある程度ＥＧＦＰレベルを低下させることができたが、ここで試験した条件下では、それぞれのサイレンシング活性は比較的非効率的であり（約２５～４５％）（図１Ｃおよび図６Ａ～６Ｂ）、未融合ＧＦＰレベルを低下させることにおいて同様に無効であったＳｌｍｂ－ナノボディキメラを用いた以前の結果を連想させる。Ｃａｕｓｓｉｎｕｓ ｅｔ ａｌ．，“Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｆｕｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｋｎｏｃｋｏｕｔ Ｍｅｄｉａｔｅｄ ｂｙ Ａｎｔｉ－ＧＦＰ Ｎａｎｏｂｏｄｙ，”Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９（１）：１１７－２１（２０１１）、これは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。Ｓｌｍｂ－ＧＳ２についてここで観察された弱いＥＧＦＰノックダウンは、実際には、Ｓｌｍｂと、未融合ＧＦＰの分解を促進することができなかったＧＦＰ特異的ＶＨＨナノボディｃＡｂＧＦＰ４との間のキメラで得られた以前の結果と比較して改善された。Ｃａｕｓｓｉｎｕｓ ｅｔ ａｌ．，“Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｆｕｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｋｎｏｃｋｏｕｔ Ｍｅｄｉａｔｅｄ ｂｙ Ａｎｔｉ－ＧＦＰ Ｎａｎｏｂｏｄｙ，”Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９（１）：１１７－２１（２０１１）、これは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。しかし、Ｓｌｍｂ－ｃＡｂＧＦＰ４融合物は、より大きなＧＦＰ融合タンパク質に関連する蛍光を排除し、本明細書に報告されるデータが必ずしもｕＡｂ機能障害を示すとは限らないが、代わりに、基質選好性／適合性またはユビキチン装飾の程度の違いを反映し得ることを示唆することに留意されたい。それにもかかわらず、真核生物Ｅ３を伴う操作キメラのいずれもが、細胞蛍光の９０～９５％を再現可能に分解したＧＳ２－ＩｐａＨ９．８の有効性および頑健性を示さなかった。
実施例２－広範囲の基質タンパク質が、ＧＳ２－ＩｐａＨ９．８によって分解される。
基質適合性の問題をより深く探究するために、様々な範囲の基質を分解するＧＳ２－ＩｐａＨ９．８の能力を試験した。多数のＧＦＰ由来蛍光タンパク質（ＦＰ）が、長年にわたって開発および最適化され、生物学的イメージングのための新しいツールの多様なコレクションを提供している。Ｔｓｉｅｎ，Ｒ．Ｙ．，“Ｔｈｅ Ｇｒｅｅｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ，”Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６７：５０９－４４（１９９８）ａｎｄ Ｓｈａｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，“Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｃｈｏｏｓｉｎｇ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，”Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２（１２）：９０５－０９（２００５）、これは、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。異なるＦＰ標的がどの程度分解され得るかを決定するために、ＧＳ２－ＩｐａＨ９．８を、エメラルド、ビーナス、およびセルリアンの単量体バージョン、ならびに強化シアン蛍光タンパク質（ＥＣＦＰ）とともに哺乳動物細胞において一過性に共発現させた。ＦＰの各々に関連する細胞蛍光活性のおよそ６５～８５％がＧＳ２－ＩｐａＨ９．８によって除去されたが、構造的に無関係なｍＣｈｅｒｒｙタンパク質はＧＳ２－ＩｐａＨ９．８によって標的とされず、ＧＦＰの折り畳みに対するＧＳ２の特異性を与えたことが予想された（図８Ａ）。興味深いことに、急速な折り畳みおよび堅牢に安定なＥＧＦＰの変異体であるスーパーフォルダＧＦＰ（ｓｆＧＦＰ）の蛍光活性は、ｓｆＧＦＰがプロテアソーム分解に耐性であるという最近の発見と一致して、ＧＳ２－ＩｐａＨ９．８の影響を受けなかった。Ｋｈｍｅｌｉｎｓｋｉｉ ｅｔ ａｌ．，“Ｉｎｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｐｒｏｔｅａｓｏｍａｌ Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｏｆ Ｇｒｅｅｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｃｏｎｔｅｘｔ ｏｆ Ｔａｎｄｅｍ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｔｉｍｅｒｓ，”Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ ２７（２）：３６０－７０（２０１６）、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
異なるＦＰを分解するＧＳ２－ＩｐａＨ９．８の能力による後押しを受けて、次に、構造的に多様な、ＦＰタグ付き基質タンパク質を分解するＧＳ２－ＩｐａＨ９．８の能力を評価した。ＧＳ２－ＩｐａＨ９．８は、それらの分子量（２７～１７９ｋＤａ）および細胞下局在（すなわち、細胞質、核、膜結合、および膜貫通）に関して変化した１５種の独自の標的タンパク質をうまく分解した（図３Ａおよび図８Ｂ）。例えば、ＧＳ２－ＩｐａＨ９．８は、フローサイトメトリー分析によって決定されるように、細胞質タンパク質α－アクチニン、α－シヌクレイン（α－ｓｙｎ）、細胞外シグナル制御キナーゼ２（ＥＲＫ２）、局所接着キナーゼ（ＦＡＫ）、Ｆ－トラクチン、パキシリン（ＰＸＮ）、およびビンキュリン（ＶＣＬ）を含むＦＰ融合物に関連する蛍光活性の８０～９２％の分解を誘発した（図３Ａおよび図８Ｂ）。同様に、ヒストンＨ２Ｂ、およびＳＶ４０ＬａｒｇｅＴ抗原に由来する核局在化シグナル（ＮＬＳ）を伴う、核標的ＦＰ融合物；発癌性Ｇ１２Ｖ変異を有するＨａｒｖｅｙラット肉腫ウイルス癌遺伝子ホモログ（ＨＲａｓＧ１２Ｖ）、Ｓｒｃ相同２ドメイン含有ホスファターゼ２（ＳＨＰ２）、およびＨＲａｓに由来するファルネシル配列を伴う、膜結合ＦＰ融合物；ならびに上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、トリ赤血球性白血病ウイルス癌遺伝子ホモログ２（ＥｒｂＢ２）、およびムチン１（ＭＵＣ１）を伴う、膜貫通ＦＰ融合物についても同様に堅牢なサイレンシングが観察された（図３Ａおよび図８Ｂ）。代表的な基質タンパク質α－アクチニン－ｍＥｍｅｒａｌｄ、ＥＧＦＰ－ＮＬＳ、ファルネシル－ｍＥｍｅｒａｌｄ、およびＥＧＦＲ－ｍＥｍｅｒａｌｄの顕微鏡分析により、各融合物の予想細胞下局在化が確認され、フローサイトメトリー分析によって測定された効率的な分解活性が裏付けられた（図３Ｂ）。膜貫通タンパク質ＥＧＦＲ－ｍＥｍｅｒａｌｄを、ＥＧＦＲの細胞外ドメインに特異的な抗体でイムノラベリングすることによって検査した。重要なことに、α－ＥＧＦＲシグナルは、ＧＦＰ消失と同時に減少し（図３Ｂ）、膜貫通タンパク質全体の分解が達成されたことを示す。まとめると、これらの結果により、いくつかの異なる細胞下位置にまたがる広範囲の基質をサイレンシングすることができる堅牢なプロテオーム編集ツールとしてのＧＳ２－ＩｐａＨ９．８が確証される。
実施例３－ＧＳ２－ＩｐａＨ９．８媒介性プロテオーム編集は、フレキシブルであり、モジュラー性である。
ＵＡｂの魅力的な特徴は、それらの高度なモジュラーアーキテクチャであり、Ｅ３触媒ドメインおよび合成結合タンパク質ドメインは、活性および特異性を再プログラムするために交換することができる。実際、上記の結果は、異なる細菌および真核Ｅ３ドメインをキメラ化して機能性ｕＡｂを形成することができる容易さを明らかにした。ＩｐａＨ９．８ベースのｕＡｂにおける合成結合タンパク質ドメインの互換性を調査するために、ＧＳ２をまず、ＦＮ３モノボディＧＳ５（Ｋｄ＝６２ｎＭ）（Ｋｏｉｄｅ ｅｔ ａｌ．，“Ｔｅａｃｈｉｎｇ ａｎ Ｏｌｄ Ｓｃａｆｆｏｌｄ Ｎｅｗ Ｔｒｉｃｋｓ：Ｍｏｎｏｂｏｄｉｅｓ Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ Ｕｓｉｎｇ Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ Ｓｕｒｆａｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ＦＮ３ Ｓｃａｆｆｏｌｄ，”Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４１５（２）：３９３－４０５（２０１２）、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）またはｃＡｂＧＦＰ４（Ｋｄ＝０．３２ｎＭ）（Ｓａｅｒｅｎｓ ｅｔ ａｌ．，“Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＶＨＨ Ｆｒａｍｅｗｏｒｋ ｔｏ Ｇｒａｆｔ Ｎｏｎ－Ｃａｎｏｎｉｃａｌ Ａｎｔｉｇｅｎ－Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｌｏｏｐｓ ｏｆ Ｃａｍｅｌ Ｓｉｎｇｌｅ－Ｄｏｍａｉｎ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，”Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３５２（３）：５９７－６０７（２００５）、これは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）等の他の高親和性ＧＦＰ結合タンパク質と置き換えた。これらの構築物について、ＧＳ２モノボディに見られるものに匹敵する効率的なＥＧＦＰサイレンシング活性が観察された（図９Ａ）。興味深いことに、より低い親和性（約２００～５００ｎＭ）のＦＮ３モノボディの導入（Ｋｏｉｄｅ ｅｔ ａｌ．，“Ｔｅａｃｈｉｎｇ ａｎ Ｏｌｄ Ｓｃａｆｆｏｌｄ Ｎｅｗ Ｔｒｉｃｋｓ：Ｍｏｎｏｂｏｄｉｅｓ Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ Ｕｓｉｎｇ Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ Ｓｕｒｆａｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ＦＮ３ Ｓｃａｆｆｏｌｄ，”Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４１５（２）：３９３－４０５（２０１２）、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）は、効率的ではないＥＧＦＰ排除をもたらし（図９Ａ）、サイレンシング活性が標的タンパク質に対する親和性の関数であり得ることを示唆している。しかし、空間配置および表面相補性は、ユビキチン化のためのリジン部位を優先するため（Ｂｕｅｔｏｗ ｅｔ ａｌ．，“Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｉｎｓｉｇｈｔｓ ｉｎｔｏ ｔｈｅ Ｃａｔａｌｙｓｉｓ ａｎｄ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｅ３ Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ Ｌｉｇａｓｅｓ，”Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１７（１０）：６２６－４２（２０１６）、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）、これらの所見のための同様に合理的な説明としては、様々なＦＮ３ドメインは、基質がユビキチン化される様式に影響を及ぼすように、ＧＦＰに関してｕＡｂを差異的に指向させ得るというものである。
次に、ＩｐａＨ９．８触媒ドメインと２つの異なるＦＮ３モノボディとの適合性を調査した：ＳＨＰ２のＳｒｃ相同２（ＳＨ２）ドメインに特異的なＮＳａ５（Ｓｈａ ｅｔ ａｌ．，“Ｄｉｓｓｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ＢＣＲ－ＡＢＬ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｎｅｔｗｏｒｋ Ｕｓｉｎｇ Ｈｉｇｈｌｙ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｍｏｎｏｂｏｄｙ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｔｏ ｔｈｅ ＳＨＰ２ ＳＨ２ Ｄｏｍａｉｎｓ，”Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １１０（３７）：１４９２４－２９（２０１３）、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）および、それぞれＨＲａｓ、ＫＲａｓ、およびそれらのＧ１２Ｖ変異体に特異的なＲａｓＩｎＩＩ（Ｃｅｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，“ＲａｓＩｎｓ：Ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ Ｅｎｃｏｄｅｄ Ｉｎｔｒａｂｏｄｉｅｓ ｏｆ Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｒａｓ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，”Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４２９（４）：５６２－５７３（２０１７）、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。得られたＮＳａ５－ＩｐａＨ９．８およびＲａｓＩｎＩＩ－ＩｐａＨ９．８キメラを、フローサイトメトリー分析によって、ＳＨＰ２－ＥＧＦＰおよびＥＧＦＰ－ＨＲａｓＧ１２Ｖをそれぞれサイレンシングする能力について試験した。どちらも強力なサイレンシング活性を示し、ＧＦＰ指向性ＧＳ２－ＩｐａＨ９．８とほぼ同等の効率でそれらのＥＧＦＰタグ標的を分解した（図４Ａおよび４Ｂ）。興味深いことに、ＲａｓＩｎＩＩ－ＩｐａＨ９．８は、野生型ＲａｓアイソフォームよりもＧ１２Ｖ変異体に対するその選択性に沿って、ＥＧＦＰ－ＫＲａｓＧ１２Ｃおよび他のＫＲａｓ変異体（例えば、Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２Ｄ）をＥＧＦＰ－ＫＲａｓ（図４Ｃ）よりも効率的に分解し（参照により全体が本明細書に組み込まれる、Ｃｅｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，“ＲａｓＩｎｓ：Ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ Ｅｎｃｏｄｅｄ Ｉｎｔｒａｂｏｄｉｅｓ ｏｆ Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｒａｓ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，”Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４２９（４）：５６２－５７３（２０１７））、それにより、Ｒａｓの変異体選択的サイレンシングのための潜在的な経路が提供される。まとめて、これらの結果は、ＩｐａＨ９．８に対する顕著な柔軟性を明らかにし、一過性かつ安定的にトランスフェクトされた細胞株における多様な標的タンパク質の「全てに適合する」分解性物質（ｄｅｇｒａｄｅｒ）としてのその使用を可能にする。
上記の全ての実験において、ＧＳ２－ＩｐａＨ９．８およびその対応する標的を一過性に発現させたときに、効率的なノックダウンが達成された。しかしながら、実験的な時間尺度、正確な発現プロファイルの必要性、または不応性哺乳動物細胞株の使用のために、一過性発現は必ずしも選択肢ではない。したがって、ＧＳ２－ＩｐａＨ９．８媒介サイレンシングのフレキシビリティを実証するために、分解活性を、安定的に組み込まれた導入遺伝子として発現された標的タンパク質に対して評価した。具体的には、ＥＧＦＰを安定して共発現させた細胞においてＧＳ２－ＩｐａＨ９．８を一過性に発現させた場合、蛍光活性の低下は、ＥＧＦＰを一過性に発現させた場合に観察されたものと実質的に同一であった（図９Ｂ）。ＥＲＫ２－ＥＧＦＰ、Ｈ２Ｂ－ＥＧＦＰ、およびＥＧＦＰ－ＨＲａｓＧ１２Ｖについても、それらの発現様式にかかわらず、堅牢な分解が観察された（図９Ｂ）。ｕＡｂおよび標的の両方が安定した導入遺伝子として発現し、それによってトランスフェクションの必要性を完全に排除したとき、強力なサイレンシング活性は、ＧＳ２－ＩｐａＨ９．８について再び観察されたが、その不活性ＧＳ２－ＩｐａＨ９．８Ｃ３３７Ａ対応物については観察されなかった（図９Ｃ）。
実施例４－ＧＳ２－ＩｐａＨ９．８をコードするｍＲＮＡの送達は、マウスにおけるプロテオーム編集を可能にする。
治療の観点から、ｕＡｂ等のタンパク質ベースの技術に直面する最大の課題の１つは、細胞内送達である。Ｏｓｈｅｒｏｖｉｃｈ，Ｌ．，“Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ Ｆｒｏｍ Ｗｉｔｈｉｎ，”Ｓｃｉｅｎｃｅ－Ｂｕｓｉｎｅｓｓ Ｅｘｃｈａｎｇｅ ７：１０－１１（２０１４）、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。本群の研究者らは、ポリＡテール、ＰＡＢＰ、および生体適合性カチオン性ポリペプチド（図５Ａ）を含有する合成ｍＲＮＡからなる共アセンブルしたナノプレックスが、インビトロおよびマウスにおけるｍＲＮＡ発現を大幅に向上させたことを以前に示した。Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，“Ｐｏｌｙａｍｉｎｅ－Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｓｔｏｉｃｈｉｏｍｅｔｒｉｃ Ａｓｓｅｍｂｌｙ ｏｆ Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎｓ ｆｏｒ Ｅｎｈａｎｃｅｄ ｍＲＮＡ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，”Ａｎｇｅｗ Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．５６（４４）：１３７０９－１２（２０１７）、これは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。ここで、ＧＳ２－ＩｐａＨ９．８ ｍＲＮＡ／ＰＡＢＰナノプレックスの哺乳動物細胞への送達は、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞における同じポリアミンによるｍＲＮＡトランスフェクション単独と比較して有意に大きなｕＡｂ発現をもたらし、それによって強力なタンパク質分解をもたらすと仮定した。この仮説を試験するために、ＧＳ２－ＩｐａＨ９．８ｍＲＮＡ／ＰＡＢＰナノプレックス送達を、まず、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞において安定導入遺伝子として発現された不安定化ＧＦＰ変異体であるｄ２ＥＧＦＰの分解を定量化することによってインビトロで評価した。予想通り、カチオン性ナノプレックスが活性標的特異的ＧＳ２－ＩｐａＨ９．８ ｍＲＮＡおよびＰＡＢＰを含有した場合にのみ、堅牢なｄ２ＥＧＦＰ分解が達成された（図５Ｂ）。触媒不活性ＧＳ２－ＩｐａＨ９．８Ｃ３３７Ａ ｍＲＮＡ／ＰＡＢＰナノプレックス、非特異的ＡＳ１５－ＩｐａＨ９．８ナノプレックス、およびＰＡＢＰなしで送達された裸のＧＳ２－ＩｐａＨ ９．８ ｍＲＮＡを含む全ての他の対照は、ほとんどまたは全くサイレンシング活性を示さなかった（図５Ｂ）。処理後２４時間で、ＧＳ２－ＩｐａＨ９．８ ｍＲＮＡ／ＰＡＢＰナノプレックスを受けたＨＥＫ２９３Ｔｄ２ＥＧＦＰ細胞は、蛍光活性の８５％の減少を示し、これは、上述のＤＮＡトランスフェクション後に達成されたノックダウン活性と直接的に同等であった。
これらの結果による後押しを受けて、次に、インビボでのｕＡｂナノプレックス媒介送達およびサイレンシング活性を評価した。全ての組織においてＥＧＦＰを構成的に発現するトランスジェニックＵＢＩ－ＧＦＰ／ＢＬ６マウス（Ｓｃｈａｅｆｅｒ ｅｔ ａｌ．，“Ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｎｔｉｇｅｎ－Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ＣＤ８＋ Ｔ－Ｃｅｌｌ／ Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ Ｃｅｌｌ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ Ｉｎ Ｖｉｖｏ，”Ｃｅｌｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２１４（２）：１１０－２２（２００１）、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）の耳内に、ＧＳ２－ＩｐａＨ９．８ｍＲＮＡ／ＰＡＢＰナノプレックスの皮下注射を与えた。このマウス系統は、ＥＧＦＰを普遍的に発現するが、蛍光は、毛で覆われた領域においては吸収され、検出されないことに留意されたい。注射後２４時間における蛍光撮像は、ＧＳ２－ＩｐａＨ９．８ ｍＲＮＡ／ＰＡＢＰナノプレックス注射を受けた左耳のＥＧＦＰ蛍光が、耳蛍光の７０％の低下で強力に除去されたことを明らかにした（図５Ｃおよび５Ｄ）。対照的に、触媒不活性ＧＳ２－ＩｐａＨ９．８Ｃ３３７Ａまたは非特異的ＡＳ１５－ＩｐａＨ９．８ナノプレックス注射のいずれかを受けた右耳の蛍光は影響を受けなかった（図５Ｃおよび５Ｄ）。重要なことに、これらの結果は、癌および他のヒト疾患における異常発現タンパク質を翻訳後にサイレンシングするための実行可能な戦略として、ｕＡｂの治療的送達のステージを設定した。
実施例５－実施例１～４の考察
ユビキボディは、体細胞内の、そうでなければ安定しているタンパク質の選択的除去を可能にする比較的新しいプロテオーム編集モダリティであり（Ｐｏｒｔｎｏｆｆ ｅｔ ａｌ．，“Ｕｂｉｑｕｉｂｏｄｉｅｓ，Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｅ３ Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ Ｌｉｇａｓｅｓ Ｅｎｄｏｗｅｄ Ｗｉｔｈ Ｕｎｎａｔｕｒａｌ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｆｏｒ Ｔａｒｇｅｔｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ，”Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８９（１１）：７８４４－５５（２０１４）、これは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）、基礎研究、薬物の発見、および治療における潜在的な用途を有する。本研究では、細菌性Ｅ３ユビキチンリガーゼを特徴とする新しいクラスのｕＡｂを作製し、それによって、ｕＡｂの開発のための、これまで利用されていないユビキチン化活性源への扉を開いた。具体的には、宿主細胞Ｅ３リガーゼを模倣してユビキチン化経路を利用する、発展しているクラスのエフェクタータンパク質に属する１４種の細菌性Ｅ３リガーゼを評価した。Ｍａｃｕｌｉｎｓ ｅｔ ａｌ．，“Ｂａｃｔｅｒｉａ－Ｈｏｓｔ Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ：Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ Ｌｉｇａｓｅｓ ａｓ Ｗｅａｐｏｎｓ ｏｆ Ｉｎｖａｓｉｏｎ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．２６（４）：４９９－５１０（２０１６）およびＬｉｎ ｅｔ ａｌ．，“Ｅｘｐｌｏｉｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｈｏｓｔ Ｃｅｌｌ Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ Ｍａｃｈｉｎｅｒｙ ｂｙ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｅｆｆｅｃｔｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，”Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ．１３０（１２）：１９８５－９６（２０１７）、これらは、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。これらの中で最も顕著なのは、Ｓ．フレックスネリ由来のＩｐａＨ９．８であり、これは、遺伝子融合合成結合ドメインを介して標的基質に向けられたときに、タンパク質のターンオーバーの顕著な触媒であることが証明された。このサイレンシング活性は、基質の細胞下局在（すなわち、細胞質、核、形質膜）または発現様式（すなわち、一過性対安定）とは独立していることが見出された。同等に機能した他のＥ３リガーゼは、Ｓ．フレックスネリのｐＷＲ１００毒性プラスミド上または染色体上のいずれかに見られるＩｐａＨ９．８のホモログのみであった。Ｍａｃｕｌｉｎｓ ｅｔ ａｌ．，“Ｂａｃｔｅｒｉａ－Ｈｏｓｔ Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ：Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ Ｌｉｇａｓｅｓ ａｓ Ｗｅａｐｏｎｓ ｏｆ Ｉｎｖａｓｉｏｎ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．２６（４）：４９９－５１０（２０１６）、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。これらの酵素のＮ末端触媒ＮＥＬドメインは、顕著な相同性（９９～１００％）を共有し、これは、ｕＡｂの文脈におけるそれらの類似の性能を説明する。したがって、次に機能する最良の細菌性Ｅ３ユビキチンリガーゼは、Ｓ．ティフィムリウムＳｓｐＨ１であり、これもまた、ＮＥＬドメイン内のＩｐａＨ９．８全体に対する３８％の同一性および４２％の同一性を有するＮＥＬ型酵素である。Ｎｏｒｋｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ Ｓｐｅｃｉｅｓ－Ｓｐａｎｎｉｎｇ Ｆａｍｉｌｙ ｏｆ ＬＰＸ－Ｍｏｔｉｆ Ｈａｒｂｏｕｒｉｎｇ Ｅｆｆｅｃｔｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，”Ｃｅｌｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２０（１１）：ｅ１２９４５（２０１８）、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。また、ここで試験した条件下で、ＥＧＦＰレベルを６０％未満に低下させることができた哺乳動物Ｅ３ユビキチンリガーゼはなかったことにも注目されたい。その理由は完全には明確ではないが、これらの異なるＥ３リガーゼについて以前にｕＡｂフォーマットで報告された成功したノックダウン結果を考えると（Ｐｏｒｔｎｏｆｆ ｅｔ ａｌ．，“Ｕｂｉｑｕｉｂｏｄｉｅｓ，Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｅ３ Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ Ｌｉｇａｓｅｓ Ｅｎｄｏｗｅｄ Ｗｉｔｈ Ｕｎｎａｔｕｒａｌ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｆｏｒ Ｔａｒｇｅｔｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ，”Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８９（１１）：７８４４－５５（２０１４）；Ｃａｕｓｓｉｎｕｓ ｅｔ ａｌ．，“Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｆｕｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｋｎｏｃｋｏｕｔ Ｍｅｄｉａｔｅｄ ｂｙ Ａｎｔｉ－ＧＦＰ Ｎａｎｏｂｏｄｙ，”Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９（１）：１１７－２１（２０１１）；Ｆｕｌｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，“Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ Ｆｏｒ Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ Ｔｈｒｏｕｇｈ ｔｈｅ Ａｆｆｉｎｉｔｙ－Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍｉｓｓｉｌｅ Ｓｙｓｔｅｍ，”Ｏｐｅｎ Ｂｉｏｌ．７（５）：１７００６６（２０１７）；Ｆｕｌｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，“Ａｎ Ａｆｆｉｎｉｔｙ－Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍｉｓｓｉｌｅ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ Ｔａｒｇｅｔｅｄ Ｐｒｏｔｅｏｌｙｓｉｓ，”Ｏｐｅｎ Ｂｉｏｌ ６（１０）：１６０２５５（２０１６）；Ｓｈｉｎ ｅｔ ａｌ．，“Ｎａｎｏｂｏｄｙ－Ｔａｒｇｅｔｅｄ Ｅ３－Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ Ｌｉｇａｓｅ Ｃｏｍｐｌｅｘ Ｄｅｇｒａｄｅｓ Ｎｕｃｌｅａｒ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，”Ｓｃｉ．Ｒｅｐ．５：１４２６９（２０１５）、およびＫａｎｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，“Ｓｃｕｌｐｔｉｎｇ Ｉｏｎ Ｃｈａｎｎｅｌ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ Ｌｉｇａｓｅｓ，”Ｅｌｉｆｅ ６：ｅ２９７４４（２０１７）、それらの全てが参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる）、ＥＧＦＰが、これらの操作されたキメラにとっての不良な基質を意味し得ることが疑われる。
ここでの作業は、主にＦＰおよびＦＰタグ付き基質のサイレンシングに焦点を当てたが、ＨＲａｓを含む疾患関連標的を強力に分解したＩｐａＨ９．８ベースのｕＡｂが設計され、これは、ＫＲａｓおよびＮＲａｓと共に、癌において最も一般的に変異した癌タンパク質、ならびにＲａｓ／ＭＡＰＫシグナル伝達経路の調節因子であるＳＨＰ２を含む。重要なことに、これらの臨床的に重要な標的を他の全てのＦＰ融合物と一緒に枯渇させる能力は、ｕＡｂ技術の驚くべきモジュラリティを強調する役割を果たす。Ｅ３ユビキチンリガーゼの天然基質結合ドメインを単純に交換することで、異なる基質タンパク質に対する特異性を有するオーダーメイドｕＡｂを生成することができる。興味深いことに、シゲラは、感染中に宿主防御を破壊するための同様の戦略を進化させ、それによって、プラスミドおよび染色体にコードされたＩｐａＨタンパク質は、ＮＦ－κＢ関連タンパク質のプロテアソーム分解を媒介することによって宿主の炎症応答を抑制する上で重要な役割を果たす。Ａｓｈｉｄａ ｅｔ ａｌ．，“Ａ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｅ３ Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ Ｌｉｇａｓｅ ＩｐａＨ９．８ Ｔａｒｇｅｔｓ ＮＥＭＯ／ＩＫＫｇａｍｍａ ｔｏ Ｄａｍｐｅｎ ｔｈｅ Ｈｏｓｔ ＮＦ－ＫａｐＰａｂ－Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ，”Ｎａｔ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１２（１）：６６－７３，ｓｕｐ．ｐｐ．１－９（２０１０）ａｎｄ Ａｓｈｉｄａ ｅｔ ａｌ．，“Ｓｈｉｇｅｌｌａ ＩｐａＨ Ｆａｍｉｌｙ Ｅｆｆｅｃｔｏｒｓ ａｓ ａ Ｖｅｒｓａｔｉｌｅ Ｍｏｄｅｌ ｆｏｒ Ｓｔｕｄｙｉｎｇ Ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ Ｂａｃｔｅｒｉａ，”Ｆｒｏｎｔ Ｃｅｌｌ Ｉｎｆｅｃｔ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５：１００（２０１５）、これは、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。具体的には、約５０％の類似性のみを共有する異なるＬＲＲドメインを用いることによって（Ｎｏｒｋｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，“Ｔｈｅ Ｓｐｅｃｉｅｓ－Ｓｐａｎｎｉｎｇ Ｆａｍｉｌｙ ｏｆ ＬＰＸ－Ｍｏｔｉｆ Ｈａｒｂｏｒｉｎｇ Ｅｆｆｅｃｔｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，”Ｃｅｌｌ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ．ｅ１２９４５（２０１８）、これは、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる）、シゲラは、実質的に同一の触媒ＮＥＬドメインを、宿主タンパク質のアレイに再方向付けすることができる（例えば、ＩｐａＨ９．８についてはＮＥＭＯ、Ｕ２ＡＦ５３；ＩｐａＨ７．８についてはグロムリン；ＩｐａＨ４．５についてはｐ６５；ＩｐａＨ２．５およびＩｐａＨ１．４についてはＨＯＩＰ；ＩｐａＨ０７２２についてはＴＲＡＦ２）。Ｍａｃｕｌｉｎｓ ｅｔ ａｌ．，“Ｂａｃｔｅｒｉａ－Ｈｏｓｔ Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ：Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ Ｌｉｇａｓｅｓ ａｓ Ｗｅａｐｏｎｓ ｏｆ Ｉｎｖａｓｉｏｎ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．２６（４）：４９９－５１０（２０１６）；Ｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，“Ｅｘｐｌｏｉｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｈｏｓｔ Ｃｅｌｌ Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ Ｍａｃｈｉｎｅｒｙ ｂｙ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｅｆｆｅｃｔｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，”Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ．１３０（１２）：１９８５－９６（２０１７）；およびＡｓｈｉｄａ ｅｔ ａｌ．，“Ｓｈｉｇｅｌｌａ ＩｐａＨ Ｆａｍｉｌｙ Ｅｆｆｅｃｔｏｒｓ ａｓ ａ Ｖｅｒｓａｔｉｌｅ Ｍｏｄｅｌ ｆｏｒ Ｓｔｕｄｙｉｎｇ Ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ Ｂａｃｔｅｒｉａ，”Ｆｒｏｎｔ Ｃｅｌｌ Ｉｎｆｅｃｔ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５：１００（２０１５）、これらの全ては参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。これらの構造的に多様な基質をユビキチン化するために必要な固有の立体構造上のフレキシビリティは、カスタマイズ可能な標的分解に対するＮＥＬモチーフの顕著な能力を説明するために役立つと考えられる。また、ここでの作業は、以前に確認されたＥ３ユビキチンリガーゼを活用したが、新規のＥ３リガーゼを同定するためのＧＳ２ベースのｕＡｂを作製するために類似のスワッピング戦略を使用することができることも注目されるべきである。このようなアプローチは、Ｅ３リガーゼの体系的な同定を可能にし得るものであり、ヒトゲノムが６００を超える推定Ｅ３リガーゼをコードすること（Ｍｅｔｚｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，“ＨＥＣＴ ａｎｄ ＲＩＮＧ Ｆｉｎｇｅｒ Ｆａｍｉｌｉｅｓ ｏｆ Ｅ３ Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ Ｌｉｇａｓｅｓ ａｔ ａ Ｇｌａｎｃｅ，”Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ．１２５（Ｐｔ ３）：５３１－３７（２０１２）、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）、および細菌ゲノムが他の数百個をコードする可能性が高く、これらの多くがユビキチン転移の触媒として検証されるべきものとして残っていることを考慮すると、これは重要な目標である。
薬剤開発の観点から、遺伝子産物の薬理学的制御は、従来、小分子が密接に結合している明確に定義された疎水性ポケットを有する酵素および受容体を標的とする小分子阻害剤を使用して達成されてきた。残念ながら、ヒトプロテオームの大部分（約８０～８５％）は、薬理学的に阻害され得ず、したがって「新薬の開発につながらない」と見なされている転写因子、骨格タンパク質、および非酵素タンパク質等の扱いにくい標的から構成される。Ｃｒｅｗｓ，Ｃ．Ｍ．，“Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｕｎｄｒｕｇｇａｂｌｅ Ｐｒｏｔｅｏｍｅ：Ｔｈｅ Ｓｍａｌｌ Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｏｆ Ｍｙ Ｄｒｅａｍｓ，”Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．１７（６）：５５１－５５（２０１０）ａｎｄ Ａｒｋｉｎ ｅｔ ａｌ．，“Ｓｍａｌｌ－Ｍｏｌｅｃｕｌｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ－Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ：Ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｎｇ Ｔｏｗａｒｄｓ Ｔｈｅ Ｄｒｅａｍ，”Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ．３（４）：３０１－１７（２００４）に記載され、これは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。代替として、ＤＮＡまたはＲＮＡレベルでタンパク質をサイレンシングするためのいくつかの技術、例えば、ＣＲＩＳＰＲ、ＲＮＡｉ、ＴＡＬＥＮ、およびＺＦＮが現在利用可能であり、第１のＲＮＡｉ療法であるパチスランは、遺伝性トランスサイレチンアミロイドーシスについて２０１８年に承認を得ている。Ａｄａｍｓ ｅｔ ａｌ．，“Ｐａｔｉｓｉｒａｎ，Ａｎ ＲＮＡｉ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ，Ｆｏｒ Ｈｅｒｅｄｉｔａｒｙ Ｔｒａｎｓｔｈｙｒｅｔｉｎ Ａｍｙｌｏｉｄｏｓｉｓ，”Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３７９（１）：１１－２１（２０１８）、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。それにもかかわらず、タンパク質サイレンシングに対する時間的および翻訳後制御を提供するｕＡｂおよび関連するＰＲＯＴＡＣ技術等の新しい適応可能な技術は、特に、不可逆性、時間的制御の欠如、およびオフターゲット効果等の核酸標的指向化ベースのアプローチに関連するいくつかの制限を克服する可能性があるため、望ましい。Ｄｅｌｅａｖｅｙ ｅｔ ａｌ．，“Ｄｅｓｉｇｎｉｎｇ Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｆｏｒ Ｔａｒｇｅｔｅｄ Ｇｅｎｅ Ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ，”Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ＆Ｂｉｏｌｏｇｙ １９（８）：９３７－５４（２０１２）；Ｇａｊ ｅｔ ａｌ．，“ＴＡＬＥＮ，ａｎｄ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ－Ｂａｓｅｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｏｍｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，”Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３１（７）：３９７－４０５（２０１３）；Ｆｕ ｅｔ ａｌ．，“Ｈｉｇｈ－Ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ Ｏｆｆ－Ｔａｒｇｅｔ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ Ｎｕｃｌｅａｓｅｓ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｃｅｌｌｓ，”Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３１（９）：８２２－２６（２０１３）、およびＦｅｄｏｒｏｖ ｅｔ ａｌ．，“Ｏｆｆ－Ｔａｒｇｅｔ Ｅｆｆｅｃｔｓ ｂｙ ｓｉＲＮＡ Ｃａｎ Ｉｎｄｕｃｅ Ｔｏｘｉｃ Ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ，”ＲＮＡ １２（７）：１１８８－９６（２００６）、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。原則として、ｕＡｂおよびＰＲＯＴＡＣの両方は、タンパク質の機能にかかわらず、現在新薬の開発につながっていないプロテオームを含むタンパク質を分解することができる。さらに、従来の「占有ベース」の治療薬とは異なり、ｕＡｂおよびＰＲＯＴＡＣは触媒的に作用し、それらが構築される標的結合抗体模倣物および小分子阻害剤よりもそれぞれ実質的に強力になる。
ｕＡｂの主な利点は、合成結合タンパク質の大規模な既存のレパートリー、ならびにヒトプロテオームに対してタンパク質結合剤を新たに生成および検証するための系統的なゲノムワイドな取り組みを活用する、それらの組換えモジュラー設計に起因して、それらが様々な細胞内標的にヒットするように迅速に適合することができることである。Ｃｏｌｗｉｌｌ ｅｔ ａｔ．，“Ａ Ｒｏａｄｍａｐ ｔｏ Ｇｅｎｅｒａｔｅ Ｒｅｎｅｗａｂｌｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｂｉｎｄｅｒｓ ｔｏ ｔｈｅ Ｈｕｍａｎ Ｐｒｏｔｅｏｍｅ，”Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ８（７）：５５１－５８（２０１１）、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。標的に対して高い特異性および親和性で結合する抗体模倣物を得ることは、同じ特性を有する小分子を得るよりも容易であるべきであるため、カスタム設計されたＰＲＯＴＡＣを作製することは、はるかに困難な作業である可能性が高い。Ｏｓｈｅｒｏｖｉｃｈ，Ｌ．，“Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ Ｆｒｏｍ Ｗｉｔｈｉｎ，”Ｓｃｉｅｎｃｅ－Ｂｕｓｉｎｅｓｓ Ｅｘｃｈａｎｇｅ ７：１０－１１（２０１４）、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。それにもかかわらず、ＰＲＯＴＡＣは、細胞に入る確率が高い小分子に基づくため、治療アプローチとして非常に有望である。実際、印象的な前臨床インビトロデータおよびインビボデータは、２０１３年にＡｒｖｉｎａｓ、２０１６年にＣ４ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓが設立されたことによって証明されるように、臨床的に実行可能なＰＲＯＴＡＣの開発を進ませている。しかしながら、ＰＲＯＴＡＣの経口バイオアベイラビリティ、薬物動態学、ならびに吸収、分布、代謝、排泄および毒性（ＡＤＭＥＴ）特性を改善するためには、従来の薬学的アプローチが必要であることが指摘されるべきである。Ｎｅｋｌｅｓａ ｅｔ ａｌ．，“Ｔａｒｇｅｔｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｂｙ ＰＲＯＴＡＣｓ，”Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．１７：４１３８－１４４（２０１７）およびＤｅｓｈａｉｅｓ，Ｒ．Ｊ．，“Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｍｅ Ｔｉｍｅ ｆｏｒ ＰＲＯＴＡＣｓ，”Ｎａｔ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．１１（９）：６３４－３５（２０１５）、これは、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。ＰＲＯＴＡＣと比較して、ｕＡｂベースの治療薬の細胞内送達は、比較的大きなサイズおよび生化学的特性のために、ほとんどの球状タンパク質薬物が自発的に形質膜を横切らないため、はるかに大きなハードルである。Ｏｓｈｅｒｏｖｉｃｈ，Ｌ．，“Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ Ｆｒｏｍ Ｗｉｔｈｉｎ，”Ｓｃｉｅｎｃｅ－Ｂｕｓｉｎｅｓｓ Ｅｘｃｈａｎｇｅ ７：１０－１１（２０１４）、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。本明細書で調査される１つの考えられる解決策は、インビボでの治療用遺伝子産物の供給源としてのｍＲＮＡの使用である。近年、その不安定性および免疫原性を含むｍＲＮＡの使用に対する障害は、構造修飾によって大きく克服されている一方で、送達およびタンパク質発現プロファイルに関連する問題は、ナノテクノロジーおよび材料科学の進歩によって対処されている。Ｇｕａｎ ｅｔ ａｌ．，“Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ｉｎ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｍＲＮＡ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ Ｕｓｉｎｇ Ｎｏｎｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒ－Ｂａｓｅｄ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，”Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２４（３）：１３３－４３（２０１７）に記載され、これは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。ここでは、第一種の治療用ｕＡｂ送達戦略を作製するためのこの独自のアプローチが利用され、この方法は、送達のために事前に形成されたタンパク質－ＲＮＡ複合体を安定化するための静電学の最近実証された戦略を伴った。Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，“Ｐｏｌｙａｍｉｎｅ－Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｓｔｏｉｃｈｉｏｍｅｔｒｉｃ Ａｓｓｅｍｂｌｙ ｏｆ Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎｓ ｆｏｒ Ｅｎｈａｎｃｅｄ ｍＲＮＡ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，”Ａｎｇｅｗ Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．５６（４４）：１３７０９－１２（２０１７）に記載され、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。ここで、ＧＦＰ指向性ＧＳ２－ＩｐａＨ９．８キメラをコードする合成ｍＲＮＡをＰＡＢＰと共アセンブルし、アセンブルしたリボヌクレオタンパク質を、カチオン性アミノ化側基を有する構造的に定義されたポリペプチドを使用してナノサイズの複合体にパッケージングした。得られたナノプレックスは、インビトロおよびインビボでＧＦＰの非常に効率的なサイレンシングを達成し、それによって、新しいプロテオーム編集パラダイムを実証し、ｕＡｂベースの治療薬の臨床移行への扉を開く。
好ましい実施形態は、本明細書に詳細に示され、説明されてきたが、様々な修正、追加、置換等が、本願の趣旨から逸脱することなく行われ得ることは、当業者には明白である。したがって、これらは、添付の特許請求の範囲に定義されるように、本願の範囲内にあると見なされる。
配列情報
SEQUENCE LISTING
<110> Cornell University
Massachusetts Institute of Technology
<120> BROAD-SPECTRUM PROTEOME EDITING WITH AN ENGINEERED BACTERIAL
UBIQUITIN LIGASE MIMIC
<150> US 62/644,055
<151> 2018-03-16
<160> 38
<170> PatentIn version 3.5

<210> 1
<211> 553
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> AvrPtoB U-box motif from Pseudomonas syringae
<400> 1
Met Ala Gly Ile Asn Arg Ala Gly Pro Ser Gly Ala Tyr Phe Val Gly
1 5 10 15
His Thr Asp Pro Glu Pro Val Ser Gly Gln Ala His Gly Ser Gly Ser
20 25 30
Gly Ala Ser Ser Ser Asn Ser Pro Gln Val Gln Pro Arg Pro Ser Asn
35 40 45
Thr Pro Pro Ser Asn Ala Pro Ala Pro Pro Pro Thr Gly Arg Glu Arg
50 55 60
Leu Ser Arg Ser Thr Ala Leu Ser Arg Gln Thr Arg Glu Trp Leu Glu
65 70 75 80
Gln Gly Met Pro Thr Ala Glu Asp Ala Ser Val Arg Arg Arg Pro Gln
85 90 95
Val Thr Ala Asp Ala Ala Thr Pro Arg Ala Glu Ala Arg Arg Thr Pro
100 105 110
Glu Ala Thr Ala Asp Ala Ser Ala Pro Arg Arg Gly Ala Val Ala His
115 120 125
Ala Asn Ser Ile Val Gln Gln Leu Val Ser Glu Gly Ala Asp Ile Ser
130 135 140
His Thr Arg Asn Met Leu Arg Asn Ala Met Asn Gly Asp Ala Val Ala
145 150 155 160
Phe Ser Arg Val Glu Gln Asn Ile Phe Arg Gln His Phe Pro Asn Met
165 170 175
Pro Met His Gly Ile Ser Arg Asp Ser Glu Leu Ala Ile Glu Leu Arg
180 185 190
Gly Ala Leu Arg Arg Ala Val His Gln Gln Ala Ala Ser Ala Pro Val
195 200 205
Arg Ser Pro Thr Pro Thr Pro Ala Ser Pro Ala Ala Ser Ser Ser Gly
210 215 220
Ser Ser Gln Arg Ser Leu Phe Gly Arg Phe Ala Arg Leu Met Ala Pro
225 230 235 240
Asn Gln Gly Arg Ser Ser Asn Thr Ala Ala Ser Gln Thr Pro Val Asp
245 250 255
Arg Ser Pro Pro Arg Val Asn Gln Arg Pro Ile Arg Val Asp Arg Ala
260 265 270
Ala Met Arg Asn Arg Gly Asn Asp Glu Ala Asp Ala Ala Leu Arg Gly
275 280 285
Leu Val Gln Gln Gly Val Asn Leu Glu His Leu Arg Thr Ala Leu Glu
290 295 300
Arg His Val Met Gln Arg Leu Pro Ile Pro Leu Asp Ile Gly Ser Ala
305 310 315 320
Leu Gln Asn Val Gly Ile Asn Pro Ser Ile Asp Leu Gly Glu Ser Leu
325 330 335
Val Gln His Pro Leu Leu Asn Leu Asn Val Ala Leu Asn Arg Met Leu
340 345 350
Gly Leu Arg Pro Ser Ala Glu Arg Ala Pro Arg Pro Ala Val Pro Val
355 360 365
Ala Pro Ala Thr Ala Ser Arg Arg Pro Asp Gly Thr Arg Ala Thr Arg
370 375 380
Leu Arg Val Met Pro Glu Arg Glu Asp Tyr Glu Asn Asn Val Ala Tyr
385 390 395 400
Gly Val Arg Leu Leu Asn Leu Asn Pro Gly Val Gly Val Arg Gln Ala
405 410 415
Val Ala Ala Phe Val Thr Asp Arg Ala Glu Arg Pro Ala Val Val Ala
420 425 430
Asn Ile Arg Ala Ala Leu Asp Pro Ile Ala Ser Gln Phe Ser Gln Leu
435 440 445
Arg Thr Ile Ser Lys Ala Asp Ala Glu Ser Glu Glu Leu Gly Phe Lys
450 455 460
Asp Ala Ala Asp His His Thr Asp Asp Val Thr His Cys Leu Phe Gly
465 470 475 480
Gly Glu Leu Ser Leu Ser Asn Pro Asp Gln Gln Val Ile Gly Leu Ala
485 490 495
Gly Asn Pro Thr Asp Thr Ser Gln Pro Tyr Ser Gln Glu Gly Asn Lys
500 505 510
Asp Leu Ala Phe Met Asp Met Lys Lys Leu Ala Gln Phe Leu Ala Gly
515 520 525
Lys Pro Glu His Pro Met Thr Arg Glu Thr Leu Asn Ala Glu Asn Ile
530 535 540
Ala Lys Tyr Ala Phe Arg Ile Val Pro
545 550

<210> 2
<211> 1659
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> AvrPtoB U-box motif from Pseudomonas syringae
<400> 2
atggcgggta tcaatagagc gggaccatcg ggcgcttatt ttgttggcca cacagacccc 60
gagccagtat cggggcaagc acacggatcc ggcagcggcg ccagctcctc gaacagtccg 120
caggttcagc cgcgaccctc gaatactccc ccgtcgaacg cgcccgcacc gccgccaacc 180
ggacgtgaga ggctttcacg atccacggcg ctgtcgcgcc aaaccaggga gtggctggag 240
cagggtatgc ctacagcgga ggatgccagc gtgcgtcgta ggccacaggt gactgccgat 300
gccgcaacgc cgcgtgcaga ggcaagacgc acgccggagg caactgccga tgccagcgca 360
ccgcgtagag gggcggttgc acacgccaac agtatcgttc agcaattggt cagtgagggc 420
gctgatattt cgcatactcg taacatgctc cgcaatgcaa tgaatggcga cgcagtcgct 480
ttttctcgag tagaacagaa catatttcgc cagcatttcc cgaacatgcc catgcatgga 540
atcagccgag attcggaact cgctatcgag ctccgtgggg cgcttcgtcg agcggttcac 600
caacaggcgg cgtcagcgcc agtgaggtcg cccacgccaa caccggccag ccctgcggca 660
tcatcatcgg gcagcagtca gcgttcttta tttggacggt ttgcccgttt gatggcgcca 720
aaccagggac ggtcgtcgaa cactgccgcc tctcagacgc cggtcgacag gagcccgcca 780
cgcgtcaacc aaagacccat acgcgtcgac agggctgcga tgcgtaatcg tggcaatgac 840
gaggcggacg ccgcgctgcg ggggttagta caacaggggg tcaatttaga gcacctgcgc 900
acggcccttg aaagacatgt aatgcagcgc ctccctatcc ccctcgatat aggcagcgcg 960
ttgcagaatg tgggaattaa cccaagtatc gacttggggg aaagccttgt gcaacatccc 1020
ctgctgaatt tgaatgtagc gttgaatcgc atgctggggc tgcgtcccag cgctgaaaga 1080
gcgcctcgtc cagccgtccc cgtggctccc gcgaccgcct ccaggcgacc ggatggtacg 1140
cgtgcaacac gattgcgggt gatgccggag cgggaggatt acgaaaataa tgtggcttat 1200
ggagtgcgct tgcttaacct gaacccgggg gtgggggtaa ggcaggctgt tgcggccttt 1260
gtaaccgacc gggctgagcg gccagcagtg gtggctaata tccgggcagc cctggaccct 1320
atcgcgtcac aattcagtca gctgcgcaca atttcgaagg ccgatgctga atctgaagag 1380
ctgggtttta aggatgcggc agatcatcac acggatgacg tgacgcactg tctttttggc 1440
ggagaattgt cgctgagtaa tccggatcag caggtgatcg gtttggcggg taatccgacg 1500
gacacgtcgc agccttacag ccaagaggga aataaggacc tggcgttcat ggatatgaaa 1560
aaacttgccc aattcctcgc aggcaagcct gagcatccga tgaccagaga aacgcttaac 1620
gccgaaaata tcgccaagta tgcttttaga atagtcccc 1659

<210> 3
<211> 587
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> IpaH0722 novel E3 ligase from Shigella flexneri
<400> 3
Met Lys Pro Ala His Asn Pro Ser Phe Phe Arg Ser Phe Cys Gly Leu
1 5 10 15
Gly Cys Ile Ser Arg Leu Ser Val Glu Glu Gln Asn Ile Thr Asp Tyr
20 25 30
His Arg Ile Trp Asp Asn Trp Ala Lys Glu Gly Ala Ala Thr Glu Asp
35 40 45
Arg Thr Gln Ala Val Arg Leu Leu Lys Ile Cys Leu Ala Phe Gln Glu
50 55 60
Pro Ala Leu Asn Leu Ser Leu Leu Arg Leu Arg Ser Leu Pro Tyr Leu
65 70 75 80
Pro Pro His Ile Gln Glu Leu Asn Ile Ser Ser Asn Glu Leu Arg Ser
85 90 95
Leu Pro Glu Leu Pro Pro Ser Leu Thr Val Leu Lys Ala Ser Asp Asn
100 105 110
Arg Leu Ser Arg Leu Pro Ala Leu Pro Pro His Leu Val Ala Leu Asp
115 120 125
Val Ser Leu Asn Arg Val Leu Thr Cys Leu Pro Ser Leu Pro Ser Ser
130 135 140
Leu Gln Ser Leu Ser Ala Leu Leu Asn Ser Leu Glu Thr Leu Pro Asp
145 150 155 160
Leu Pro Pro Ala Leu Gln Lys Leu Ser Val Gly Asn Asn Gln Leu Thr
165 170 175
Ala Leu Pro Glu Leu Pro Cys Glu Leu Gln Glu Leu Ser Ala Phe Asp
180 185 190
Asn Arg Leu Gln Glu Leu Pro Pro Leu Pro Gln Asn Leu Arg Leu Leu
195 200 205
Asn Val Gly Glu Asn Gln Leu His Arg Leu Pro Glu Leu Pro Gln Arg
210 215 220
Leu Gln Ser Leu Tyr Ile Pro Asn Asn Gln Leu Asn Thr Leu Pro Asp
225 230 235 240
Ser Ile Met Asn Leu His Ile Tyr Ala Asp Val Asn Ile Tyr Asn Asn
245 250 255
Pro Leu Ser Thr Arg Thr Leu Gln Ala Leu Gln Arg Leu Thr Ser Ser
260 265 270
Pro Asp Tyr His Gly Pro Arg Ile Tyr Phe Ser Met Ser Asp Gly Gln
275 280 285
Gln Asn Thr Leu His Arg Pro Leu Ala Asp Ala Val Thr Ala Trp Phe
290 295 300
Pro Glu Asn Lys Gln Ser Asp Val Ser Gln Ile Trp His Ala Phe Glu
305 310 315 320
His Glu Glu His Ala Asn Thr Phe Ser Ala Phe Leu Asp Arg Leu Ser
325 330 335
Asp Thr Val Ser Ala Arg Asn Thr Ser Gly Phe Arg Glu Gln Val Ala
340 345 350
Ala Trp Leu Glu Lys Leu Ser Ala Ser Ala Glu Leu Arg Gln Gln Ser
355 360 365
Phe Ala Val Ala Ala Asp Ala Thr Glu Ser Cys Glu Asp Arg Val Ala
370 375 380
Leu Thr Trp Asn Asn Leu Arg Lys Thr Leu Leu Val His Gln Ala Ser
385 390 395 400
Glu Gly Leu Phe Asp Asn Asp Thr Gly Ala Leu Leu Ser Leu Gly Arg
405 410 415
Glu Met Phe Arg Leu Glu Ile Leu Glu Asp Ile Ala Arg Asp Lys Val
420 425 430
Arg Thr Leu His Phe Val Asp Glu Ile Glu Val Tyr Leu Ala Phe Gln
435 440 445
Thr Met Leu Ala Glu Lys Leu Gln Leu Ser Thr Ala Val Lys Glu Met
450 455 460
Arg Phe Tyr Gly Val Ser Gly Val Thr Ala Asn Asp Leu Arg Thr Ala
465 470 475 480
Glu Ala Met Val Arg Ser Arg Glu Glu Asn Glu Phe Thr Asp Trp Phe
485 490 495
Ser Leu Trp Gly Pro Trp His Ala Val Leu Lys Arg Thr Glu Ala Asp
500 505 510
Arg Trp Ala Leu Ala Glu Glu Gln Lys Tyr Glu Met Leu Glu Asn Glu
515 520 525
Tyr Pro Gln Arg Val Ala Asp Arg Leu Lys Ala Ser Gly Leu Ser Gly
530 535 540
Asp Ala Asp Ala Glu Arg Glu Ala Gly Ala Gln Val Met Arg Glu Thr
545 550 555 560
Glu Gln Gln Ile Tyr Arg Gln Leu Thr Asp Glu Val Leu Ala Leu Arg
565 570 575
Leu Pro Glu Asn Gly Ser Gln Leu His His Ser
580 585

<210> 4
<211> 1764
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> IpaH0722 novel E3 ligase from Shigella flexneri
<400> 4
atgaaacctg cccacaatcc ttcttttttc cgctcctttt gtggtttagg atgtatatcc 60
cgtttatccg tagaagagca aaatatcacg gattatcacc gcatctggga taactgggcc 120
aaggaaggtg ctgcaacaga agaccgaaca caggcagttc gattactgaa aatatgtctg 180
gcttttcaag agccagccct caatttaagt ttactcagat tacgctctct cccatacctg 240
cccccgcaca tacaagaact taacatctct agcaatgagc tacgctctct gccagaactc 300
cctccgtcct taactgtact taaagccagc gataacagac tgagcaggct cccggctctt 360
ccgcctcacc tggtcgctct tgatgtttca cttaacagag ttttaacatg tttgccttct 420
cttccatctt ccttgcagtc actctcagcc cttctcaata gcctggagac gctacctgat 480
cttcccccgg ctctacaaaa actttctgtt ggcaacaacc agcttactgc cttaccagaa 540
ttaccatgtg aactacagga actaagtgct tttgataaca gattacaaga gctaccgccc 600
cttcctcaaa atctgaggct tttaaacgtt ggggaaaacc aactacacag actgcccgaa 660
cttccacaac gtctgcaatc actatatatc cctaacaatc agctgaacac attgccagac 720
agtatcatga atctgcacat ttatgcagat gttaatattt ataacaatcc attgtcgact 780
cgcactctgc aagccctgca aagattaacc tcttcgccgg actaccacgg cccacggatt 840
tacttctcca tgagtgacgg acaacagaat acactccatc gccccctggc tgatgccgtg 900
acagcatggt tcccggaaaa caaacaatct gatgtatcac agatatggca tgcttttgaa 960
catgaagagc atgccaacac cttttccgcg ttccttgacc gcctttccga taccgtctct 1020
gcacgcaata cctccggatt ccgtgaacag gtcgctgcat ggctggaaaa actcagtgcc 1080
tctgcggagc ttcgacagca gtctttcgct gttgctgctg atgccactga gagctgtgag 1140
gaccgtgtcg cgctcacatg gaacaatctc cggaaaaccc tcctggtcca tcaggcatca 1200
gaaggccttt tcgataatga taccggcgct ctgctctccc tgggcaggga aatgttccgc 1260
ctcgaaattc tggaggacat tgcccgggat aaagtcagaa ctctccattt tgtggatgag 1320
atagaagtct acctggcctt ccagaccatg ctcgcagaga aacttcagct ctctactgcc 1380
gtgaaggaaa tgcgtttcta tggcgtgtcg ggagtgacag caaatgacct ccgcactgcc 1440
gaagccatgg tcagaagccg tgaagagaat gaatttacgg actggttctc cctctgggga 1500
ccatggcatg ctgtactgaa gcgtacggaa gctgaccgct gggcgctggc agaagagcag 1560
aaatatgaga tgctggagaa tgagtaccct cagagggtgg ctgaccggct gaaagcatca 1620
ggtctgagcg gtgatgcgga tgcggagagg gaagccggtg cacaggtgat gcgtgagact 1680
gaacagcaga tttaccgtca gctgactgac gaggtactgg ccctgcgatt gcctgaaaac 1740
ggctcacaac tgcaccattc ataa 1764

<210> 5
<211> 575
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> IpaH1.4 novel E3 ligase from Shigella flexneri
<400> 5
Met Ile Lys Ser Thr Asn Ile Gln Ala Ile Gly Ser Gly Ile Met His
1 5 10 15
Gln Ile Asn Asn Ile Tyr Ser Leu Thr Pro Phe Pro Leu Pro Met Glu
20 25 30
Leu Thr Pro Ser Cys Asn Glu Phe Tyr Leu Lys Ala Trp Ser Glu Trp
35 40 45
Glu Lys Asn Gly Thr Pro Gly Glu Gln Arg Asn Ile Ala Phe Asn Arg
50 55 60
Leu Lys Ile Cys Leu Gln Asn Gln Glu Ala Glu Leu Asn Leu Ser Glu
65 70 75 80
Leu Asp Leu Lys Thr Leu Pro Asp Leu Pro Pro Gln Ile Thr Thr Leu
85 90 95
Glu Ile Arg Lys Asn Leu Leu Thr His Leu Pro Asp Leu Pro Pro Met
100 105 110
Leu Lys Val Ile His Ala Gln Phe Asn Gln Leu Glu Ser Leu Pro Ala
115 120 125
Leu Pro Glu Thr Leu Glu Glu Leu Asn Ala Gly Asp Asn Lys Ile Lys
130 135 140
Glu Leu Pro Phe Leu Pro Glu Asn Leu Thr His Leu Arg Val His Asn
145 150 155 160
Asn Arg Leu His Ile Leu Pro Leu Leu Pro Pro Glu Leu Lys Leu Leu
165 170 175
Val Val Ser Gly Asn Arg Leu Asp Ser Ile Pro Pro Phe Pro Asp Lys
180 185 190
Leu Glu Gly Leu Ala Met Ala Asn Asn Phe Ile Glu Gln Leu Pro Glu
195 200 205
Leu Pro Phe Ser Met Asn Arg Ala Val Leu Met Asn Asn Asn Leu Thr
210 215 220
Thr Leu Pro Glu Ser Val Leu Arg Leu Ala Gln Asn Ala Phe Val Asn
225 230 235 240
Val Ala Gly Asn Pro Leu Ser Gly His Thr Met Arg Thr Leu Gln Gln
245 250 255
Ile Thr Thr Gly Pro Asp Tyr Ser Gly Pro Arg Ile Phe Phe Ser Met
260 265 270
Gly Asn Ser Ala Thr Ile Ser Ala Pro Glu His Ser Leu Ala Asp Ala
275 280 285
Val Thr Ala Trp Phe Pro Glu Asn Lys Gln Ser Asp Val Ser Gln Ile
290 295 300
Trp His Ala Phe Glu His Glu Glu His Ala Asn Thr Phe Ser Ala Phe
305 310 315 320
Leu Asp Arg Leu Ser Asp Thr Val Ser Ala Arg Asn Thr Ser Gly Phe
325 330 335
Arg Glu Gln Val Ala Ala Trp Leu Glu Lys Leu Ser Ala Ser Ala Glu
340 345 350
Leu Arg Gln Gln Ser Phe Ala Val Ala Ala Asp Ala Thr Glu Ser Cys
355 360 365
Glu Asp Arg Val Ala Leu Thr Trp Asn Asn Leu Arg Lys Thr Leu Leu
370 375 380
Val His Gln Ala Ser Glu Gly Leu Phe Asp Asn Asp Thr Gly Ala Leu
385 390 395 400
Leu Ser Leu Gly Arg Glu Met Phe Arg Leu Glu Ile Leu Glu Asp Ile
405 410 415
Ala Arg Asp Lys Val Arg Thr Leu His Phe Val Asp Glu Ile Glu Val
420 425 430
Tyr Leu Ala Phe Gln Thr Met Leu Ala Glu Lys Leu Gln Leu Ser Thr
435 440 445
Ala Val Lys Glu Met Arg Phe Tyr Gly Val Ser Gly Val Thr Ala Asn
450 455 460
Asp Leu Arg Thr Ala Glu Ala Met Val Arg Ser Arg Glu Glu Asn Glu
465 470 475 480
Phe Lys Asp Trp Phe Ser Leu Trp Gly Pro Trp His Ala Val Leu Lys
485 490 495
Arg Thr Glu Ala Asp Arg Trp Ala Gln Ala Glu Glu Gln Lys Tyr Glu
500 505 510
Met Leu Glu Asn Glu Tyr Ser Gln Arg Val Ala Asp Arg Leu Lys Ala
515 520 525
Ser Gly Leu Ser Gly Asp Thr Asp Ala Glu Arg Glu Ala Gly Ala Gln
530 535 540
Val Met Arg Glu Thr Glu Gln Gln Ile Tyr Arg Gln Leu Thr Asp Glu
545 550 555 560
Val Leu Ala Leu Arg Leu Ser Glu Asn Gly Ser Asn His Ile Ala
565 570 575

<210> 6
<211> 1728
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> IpaH1.4 novel E3 ligase from Shigella flexneri
<400> 6
atgattaaat caaccaatat acaggcaatc ggttctggta ttatgcatca aataaacaat 60
atatactcgt taactccatt tcctttacct atggaactga ctccatcttg taatgaattt 120
tatttaaaag cctggagtga atgggaaaag aacggtaccc caggcgagca acgcaatatc 180
gccttcaata ggctgaaaat atgtttacaa aatcaagagg cagaattaaa tttatctgag 240
ttagatttaa aaacattacc agatttaccg cctcagataa caacactgga aataagaaaa 300
aacctattaa cacatctccc tgatttacca ccaatgctta aggtaataca tgctcaattt 360
aatcaactgg aaagcttacc tgccttaccc gagacgttag aagagcttaa tgcgggtgat 420
aacaagataa aagaattacc atttcttcct gaaaatctaa ctcatttacg ggttcataat 480
aaccgattgc atattctgcc actattgcca ccggaactaa aattactggt agtttctgga 540
aacagattag acagcattcc cccctttcca gataagcttg aagggctggc tatggctaat 600
aattttatag aacaactacc ggaattacct tttagtatga acagggctgt gctaatgaat 660
aataatctga caacacttcc ggaaagtgtc ctgagattag ctcagaatgc cttcgtaaat 720
gttgcaggta atccactgtc tggccatacc atgcgtacac tacaacaaat aaccaccgga 780
ccagattatt ctggtcctcg aatatttttc tctatgggaa attctgccac aatttccgct 840
ccagaacact ccctggctga tgccgtgaca gcatggttcc cggaaaacaa acaatctgat 900
gtatcacaga tatggcatgc ttttgaacat gaagagcacg ccaacacctt ttccgcgttc 960
cttgaccgcc tttccgatac cgtctctgca cgcaatacct ccggattccg tgaacaggtc 1020
gctgcatggc tggaaaaact cagtgcctct gcggagcttc gacagcagtc tttcgctgtt 1080
gctgctgatg ccactgagag ctgtgaggac cgtgtcgcgc tcacatggaa caatctccgg 1140
aaaaccctcc tggtccatca ggcatcagaa ggccttttcg ataatgatac cggcgctctg 1200
ctctccctgg gcagggaaat gttccgcctc gaaattctgg aggacattgc ccgggataaa 1260
gtcagaactc tccattttgt ggatgagata gaagtctacc tggccttcca gaccatgctc 1320
gcagagaaac ttcagctctc cactgccgtg aaggaaatgc gtttctatgg cgtgtcggga 1380
gtgacagcaa atgacctccg cactgccgaa gccatggtca gaagccgtga agagaatgaa 1440
tttaaggact ggttctccct ctggggacca tggcatgctg tactgaagcg tacggaagct 1500
gaccgctggg cgcaggcaga agagcagaag tatgagatgc tggagaatga gtactctcag 1560
agggtggctg accggctgaa agcatcaggt ctgagcggtg atacggatgc ggagagggaa 1620
gccggtgcac aggtgatgcg tgagactgaa cagcagattt accgtcagtt gactgacgag 1680
gtactggccc tgcgattgtc tgaaaacggc tcaaatcata tcgcataa 1728

<210> 7
<211> 571
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> IpaH2.5 novel E3 ligase from Shigella flexneri
<400> 7
Met Leu Ile Arg Ile Leu Val Ile Met Ile Lys Ser Thr Asn Ile Gln
1 5 10 15
Ala Ile Gly Ser Gly Ile Met His Gln Ile Asn Asn Val Tyr Ser Leu
20 25 30
Thr Pro Leu Ser Leu Pro Met Glu Leu Thr Pro Ser Cys Asn Glu Phe
35 40 45
Tyr Leu Lys Thr Trp Ser Glu Trp Glu Lys Asn Gly Thr Pro Gly Glu
50 55 60
Gln Arg Asn Ile Ala Phe Asn Arg Leu Lys Ile Cys Leu Gln Asn Gln
65 70 75 80
Glu Ala Glu Leu Asn Leu Ser Glu Leu Asp Leu Lys Thr Leu Pro Asp
85 90 95
Leu Pro Pro Gln Ile Thr Thr Leu Glu Ile Arg Lys Asn Leu Leu Thr
100 105 110
His Leu Pro Asp Leu Pro Pro Met Leu Lys Val Ile His Ala Gln Phe
115 120 125
Asn Gln Leu Glu Ser Leu Pro Ala Leu Pro Glu Thr Leu Glu Glu Leu
130 135 140
Asn Ala Gly Asp Asn Lys Ile Lys Glu Leu Pro Phe Leu Pro Glu Asn
145 150 155 160
Leu Thr His Leu Arg Val His Asn Asn Arg Leu His Ile Leu Pro Leu
165 170 175
Leu Pro Pro Glu Leu Lys Leu Leu Val Val Ser Gly Asn Arg Leu Asp
180 185 190
Ser Ile Pro Pro Phe Pro Asp Lys Leu Glu Gly Leu Ala Leu Ala Asn
195 200 205
Asn Phe Ile Glu Gln Leu Pro Glu Leu Pro Phe Ser Met Asn Arg Ala
210 215 220
Val Leu Met Asn Asn Asn Leu Thr Thr Leu Pro Glu Ser Val Leu Arg
225 230 235 240
Leu Ala Gln Asn Ala Phe Val Asn Val Ala Gly Asn Pro Leu Ser Gly
245 250 255
His Thr Met Arg Thr Leu Gln Gln Ile Thr Thr Gly Pro Asp Tyr Ser
260 265 270
Gly Pro Arg Ile Phe Phe Ser Met Gly Asn Ser Ala Thr Ile Ser Ala
275 280 285
Pro Glu His Ser Leu Ala Asp Ala Val Thr Ala Trp Phe Pro Glu Asn
290 295 300
Lys Gln Ser Asp Val Ser Gln Ile Trp His Ala Phe Glu His Glu Glu
305 310 315 320
His Ala Asn Thr Phe Ser Ala Phe Leu Asp Arg Leu Ser Asp Thr Val
325 330 335
Ser Ala Arg Asn Thr Ser Gly Phe Arg Glu Gln Val Ala Ala Trp Leu
340 345 350
Glu Lys Leu Ser Ala Ser Ala Glu Leu Arg Gln Gln Ser Phe Ala Val
355 360 365
Ala Ala Asp Ala Thr Glu Ser Cys Glu Asp Arg Val Ala Leu Thr Trp
370 375 380
Asn Asn Leu Arg Lys Thr Leu Leu Val His Gln Ala Ser Glu Gly Leu
385 390 395 400
Phe Asp Asn Asp Thr Gly Ala Leu Leu Ser Leu Gly Arg Glu Met Phe
405 410 415
Arg Leu Glu Ile Leu Glu Asp Ile Ala Arg Asp Lys Val Arg Thr Leu
420 425 430
His Phe Val Asp Glu Ile Glu Val Tyr Leu Ala Phe Gln Thr Met Leu
435 440 445
Ala Glu Lys Leu Gln Leu Ser Thr Ala Val Lys Glu Met Arg Phe Tyr
450 455 460
Gly Val Ser Gly Val Thr Ala Asn Asp Leu Arg Thr Ala Glu Ala Met
465 470 475 480
Val Arg Ser Arg Glu Glu Asn Glu Phe Thr Asp Trp Phe Ser Leu Trp
485 490 495
Gly Pro Trp His Ala Val Leu Lys Arg Thr Glu Ala Asp Arg Trp Ala
500 505 510
Gln Ala Glu Glu Gln Lys Tyr Glu Met Leu Glu Asn Glu Tyr Ser Gln
515 520 525
Arg Val Ala Asp Arg Leu Lys Ala Ser Gly Leu Ser Gly Asp Ala Asp
530 535 540
Ala Glu Arg Glu Ala Gly Ala Gln Val Met Arg Glu Thr Glu Gln Gln
545 550 555 560
Ile Tyr Arg Gln Leu Thr Asp Glu Val Leu Ala
565 570

<210> 8
<211> 1716
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> IpaH2.5 novel E3 ligase from Shigella flexneri
<400> 8
atgttgataa gaattctagt tataatgatt aaatcaacca atatacaggc aatcggttct 60
ggcattatgc atcaaataaa caatgtatac tcgttaactc cattatcttt acctatggaa 120
ctgactccat cttgtaatga attttattta aaaacctgga gcgaatggga aaagaacggt 180
accccaggcg agcaacgcaa tatcgccttc aataggctga aaatatgttt acaaaatcaa 240
gaggcagaat taaatttatc tgagttagat ttaaaaacat taccagattt accgcctcag 300
ataacaacac tggaaataag aaaaaaccta ttaacacatc tccctgattt accaccaatg 360
cttaaggtaa tacatgctca atttaatcaa ctggaaagct tacctgcctt acccgagacg 420
ttagaagagc ttaatgcggg tgataacaag ataaaagaat taccatttct tcctgaaaat 480
ctaactcatt tacgggttca taataaccga ttgcatattc tgccactatt gccaccggaa 540
ctaaaattac tggtagtttc tggaaacaga ttagacagca ttcccccctt tccagataag 600
cttgaagggc tggctctggc taataatttt atagaacaac taccggaatt accttttagt 660
atgaacaggg ctgtgctaat gaataataat ctgacaacac ttccggaaag tgtcctgaga 720
ttagctcaga atgccttcgt aaatgttgca ggtaatccat tgtctggcca taccatgcgt 780
acactacaac aaataaccac cggaccagat tattctggtc ctcgaatatt tttctctatg 840
ggaaattctg ccacaatttc cgctccagaa cactccctgg ctgatgccgt gacagcatgg 900
ttcccggaaa acaaacaatc tgatgtatca cagatatggc atgcttttga acatgaagag 960
catgccaaca ccttttccgc gttccttgac cgcctttccg ataccgtctc tgcacgcaat 1020
acctccggat tccgtgaaca ggtcgctgca tggctggaaa aactcagtgc ctctgcggag 1080
cttcgacagc agtctttcgc tgttgctgct gatgccactg agagctgtga ggaccgtgtc 1140
gcgctcacat ggaacaatct ccggaaaacc ctcctggtcc atcaggcatc agaaggcctt 1200
ttcgataatg ataccggcgc tctgctctcc ctgggcaggg aaatgttccg cctcgaaatt 1260
ctggaggata ttgcccggga taaagtcaga actctccatt ttgtggatga gatagaagtc 1320
tacctggcct tccagaccat gctcgcagag aaacttcagc tctctactgc cgtgaaggaa 1380
atgcgtttct atggcgtgtc gggagtgaca gcaaatgacc tccgcactgc cgaagccatg 1440
gtcagaagcc gtgaagagaa tgaatttacg gactggttct ccctctgggg accatggcat 1500
gctgtactga agcgtacgga agctgaccgc tgggcgcagg cagaagagca gaagtatgag 1560
atgctggaga atgagtactc tcagagggtg gctgaccggc tgaaagcatc aggtctgagc 1620
ggtgatgcgg atgcggagag ggaagccggt gcacaggtga tgcgtgagac tgaacagcag 1680
atttaccgtc agttgactga cgaggtactg gcctga 1716

<210> 9
<211> 574
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> IpaH4.5 novel E3 ligase from Shigella flexneri
<400> 9
Met Lys Pro Ile Asn Asn His Ser Phe Phe Arg Ser Leu Cys Gly Leu
1 5 10 15
Ser Cys Ile Ser Arg Leu Ser Val Glu Glu Gln Cys Thr Arg Asp Tyr
20 25 30
His Arg Ile Trp Asp Asp Trp Ala Arg Glu Gly Thr Thr Thr Glu Asn
35 40 45
Arg Ile Gln Ala Val Arg Leu Leu Lys Ile Cys Leu Asp Thr Arg Glu
50 55 60
Pro Val Leu Asn Leu Ser Leu Leu Lys Leu Arg Ser Leu Pro Pro Leu
65 70 75 80
Pro Leu His Ile Arg Glu Leu Asn Ile Ser Asn Asn Glu Leu Ile Ser
85 90 95
Leu Pro Glu Asn Ser Pro Leu Leu Thr Glu Leu His Val Asn Gly Asn
100 105 110
Asn Leu Asn Ile Leu Pro Thr Leu Pro Ser Gln Leu Ile Lys Leu Asn
115 120 125
Ile Ser Phe Asn Arg Asn Leu Ser Cys Leu Pro Ser Leu Pro Pro Tyr
130 135 140
Leu Gln Ser Leu Ser Ala Arg Phe Asn Ser Leu Glu Thr Leu Pro Glu
145 150 155 160
Leu Pro Ser Thr Leu Thr Ile Leu Arg Ile Glu Gly Asn Arg Leu Thr
165 170 175
Val Leu Pro Glu Leu Pro His Arg Leu Gln Glu Leu Phe Val Ser Gly
180 185 190
Asn Arg Leu Gln Glu Leu Pro Glu Phe Pro Gln Ser Leu Lys Tyr Leu
195 200 205
Lys Val Gly Glu Asn Gln Leu Arg Arg Leu Ser Arg Leu Pro Gln Glu
210 215 220
Leu Leu Ala Leu Asp Val Ser Asn Asn Leu Leu Thr Ser Leu Pro Glu
225 230 235 240
Asn Ile Ile Thr Leu Pro Ile Cys Thr Asn Val Asn Ile Ser Gly Asn
245 250 255
Pro Leu Ser Thr Arg Val Leu Gln Ser Leu Gln Arg Leu Thr Ser Ser
260 265 270
Pro Asp Tyr His Gly Pro Gln Ile Tyr Phe Ser Met Ser Asp Gly Gln
275 280 285
Gln Asn Thr Leu His Arg Pro Leu Ala Asp Ala Val Thr Ala Trp Phe
290 295 300
Pro Glu Asn Lys Gln Ser Asp Val Ser Gln Ile Trp His Ala Phe Glu
305 310 315 320
His Glu Glu His Ala Asn Thr Phe Ser Ala Phe Leu Asp Arg Leu Ser
325 330 335
Asp Thr Val Ser Ala Arg Asn Thr Ser Gly Phe Arg Glu Gln Val Ala
340 345 350
Ala Trp Leu Glu Lys Leu Ser Ala Ser Ala Glu Leu Arg Gln Gln Ser
355 360 365
Phe Ala Val Ala Ala Asp Ala Thr Glu Ser Cys Glu Asp Arg Val Ala
370 375 380
Leu Thr Trp Asn Asn Leu Arg Lys Thr Leu Leu Val His Gln Ala Ser
385 390 395 400
Glu Gly Leu Phe Asp Asn Asp Thr Gly Ala Leu Leu Ser Leu Gly Arg
405 410 415
Glu Met Phe Arg Leu Glu Ile Leu Glu Asp Ile Ala Arg Asp Lys Val
420 425 430
Arg Thr Leu His Phe Val Asp Glu Ile Glu Val Tyr Leu Ala Phe Gln
435 440 445
Thr Met Leu Ala Glu Lys Leu Gln Leu Ser Thr Ala Val Lys Glu Met
450 455 460
Arg Phe Tyr Gly Val Ser Gly Val Thr Ala Asn Asp Leu Arg Thr Ala
465 470 475 480
Glu Ala Met Val Arg Ser Arg Glu Glu Asn Glu Phe Thr Asp Trp Phe
485 490 495
Ser Leu Trp Gly Pro Trp His Ala Val Leu Lys Arg Thr Glu Ala Asp
500 505 510
Arg Trp Ala Gln Ala Glu Glu Gln Lys Tyr Glu Met Leu Glu Asn Glu
515 520 525
Tyr Ser Gln Arg Val Ala Asp Arg Leu Lys Ala Ser Gly Leu Ser Gly
530 535 540
Asp Ala Asp Ala Gln Arg Glu Ala Gly Ala Gln Val Met Arg Glu Thr
545 550 555 560
Glu Gln Gln Ile Tyr Arg Gln Leu Thr Asp Glu Val Leu Ala
565 570

<210> 10
<211> 1725
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> IpaH4.5 novel E3 ligase from Shigella flexneri
<400> 10
atgaaaccga tcaacaatca ttcttttttt cgttcccttt gtggcttatc atgtatatct 60
cgtttatcgg tagaagaaca gtgtaccaga gattaccacc gcatctggga tgactgggct 120
agggaaggaa caacaacaga aaatcgcatc caggcggttc gattattgaa aatatgtctg 180
gatacccggg agcctgttct caatttaagc ttactgaaac tacgttcttt accaccactc 240
cctttgcata tacgtgaact taatatttcc aacaatgagt taatctccct acctgaaaat 300
tctccgcttt tgacagaact tcatgtaaat ggtaacaact tgaatatact cccgacactt 360
ccatctcaac tgattaagct taatatttca ttcaatcgaa atttgtcatg tctgccatca 420
ttaccaccat atttacaatc actctcggca cgttttaata gtctggagac gttaccagag 480
cttccatcaa cgctaacaat attacgtatt gaaggtaatc gccttactgt cttgcctgaa 540
ttgcctcata gactacaaga actctttgtt tccggcaaca gactacagga actaccagaa 600
tttcctcaga gcttaaaata tttgaaggta ggtgaaaatc aactacgcag attatccaga 660
ttaccgcaag aactattggc tctggatgtt tccaataacc tactaacttc attacccgaa 720
aatataatca cattgcccat ttgtacgaat gttaacattt cagggaatcc attgtcgact 780
cgcgttctgc aatccctgca aagattaacc tcttcgccgg actaccacgg cccgcagatt 840
tacttctcca tgagtgacgg acaacagaat acactccatc gccccctggc tgatgccgtg 900
acagcatggt tcccggaaaa caaacaatct gatgtatcac agatatggca tgcttttgaa 960
catgaagagc atgccaacac cttttccgcg ttccttgacc gcctttccga taccgtctct 1020
gcacgcaata cctccggatt ccgtgaacag gtcgctgcat ggctggaaaa actcagtgcc 1080
tctgcggagc ttcgacagca gtctttcgct gttgctgctg atgccactga gagctgtgag 1140
gaccgtgtcg cgctcacatg gaacaatctc cggaaaaccc tcctggtcca tcaggcatca 1200
gaaggccttt tcgataatga taccggcgct ctgctctccc tgggcaggga aatgttccgc 1260
ctcgaaattc tggaggacat tgcccgggat aaagtcagaa ctctccattt tgtggatgag 1320
atagaagtct acctggcctt ccagaccatg ctcgcagaga aacttcagct ctccactgcc 1380
gtgaaggaaa tgcgtttcta tggcgtgtcg ggagtgacag caaatgacct ccgcactgcc 1440
gaagctatgg tcagaagccg tgaagagaat gaatttacgg actggttctc cctctgggga 1500
ccatggcatg ctgtactgaa gcgtacggaa gctgaccgct gggcgcaggc agaagagcag 1560
aagtatgaga tgctggagaa tgagtactct cagagggtgg ctgaccggct gaaagcatca 1620
ggtctgagcg gtgatgcgga tgcgcagagg gaagccggtg cacaggtgat gcgtgagact 1680
gaacagcaga tttaccgtca gctgactgac gaggtactgg cctga 1725

<210> 11
<211> 565
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> IpaH7.8 novel E3 ligase from Shigella flexneri
<400> 11
Met Phe Ser Val Asn Asn Thr His Ser Ser Val Ser Cys Ser Pro Ser
1 5 10 15
Ile Asn Ser Asn Ser Thr Ser Asn Glu His Tyr Leu Arg Ile Leu Thr
20 25 30
Glu Trp Glu Lys Asn Ser Ser Pro Gly Glu Glu Arg Gly Ile Ala Phe
35 40 45
Asn Arg Leu Ser Gln Cys Phe Gln Asn Gln Glu Ala Val Leu Asn Leu
50 55 60
Ser Asp Leu Asn Leu Thr Ser Leu Pro Glu Leu Pro Lys His Ile Ser
65 70 75 80
Ala Leu Ile Val Glu Asn Asn Lys Leu Thr Ser Leu Pro Lys Leu Pro
85 90 95
Ala Phe Leu Lys Glu Leu Asn Ala Asp Asn Asn Arg Leu Ser Val Ile
100 105 110
Pro Glu Leu Pro Glu Ser Leu Thr Thr Leu Ser Val Arg Ser Asn Gln
115 120 125
Leu Glu Asn Leu Pro Val Leu Pro Asn His Leu Thr Ser Leu Phe Val
130 135 140
Glu Asn Asn Arg Leu Tyr Asn Leu Pro Ala Leu Pro Glu Lys Leu Lys
145 150 155 160
Phe Leu His Val Tyr Tyr Asn Arg Leu Thr Thr Leu Pro Asp Leu Pro
165 170 175
Asp Lys Leu Glu Ile Leu Cys Ala Gln Arg Asn Asn Leu Val Thr Phe
180 185 190
Pro Gln Phe Ser Asp Arg Asn Asn Ile Arg Gln Lys Glu Tyr Tyr Phe
195 200 205
His Phe Asn Gln Ile Thr Thr Leu Pro Glu Ser Phe Ser Gln Leu Asp
210 215 220
Ser Ser Tyr Arg Ile Asn Ile Ser Gly Asn Pro Leu Ser Thr Arg Val
225 230 235 240
Leu Gln Ser Leu Gln Arg Leu Thr Ser Ser Pro Asp Tyr His Gly Pro
245 250 255
Gln Ile Tyr Phe Ser Met Ser Asp Gly Gln Gln Asn Thr Leu His Arg
260 265 270
Pro Leu Ala Asp Ala Val Thr Ala Trp Phe Pro Glu Asn Lys Gln Ser
275 280 285
Asp Val Ser Gln Ile Trp His Ala Phe Glu His Glu Glu His Ala Asn
290 295 300
Thr Phe Ser Ala Phe Leu Asp Arg Leu Ser Asp Thr Val Ser Ala Arg
305 310 315 320
Asn Thr Ser Gly Phe Arg Glu Gln Val Ala Ala Trp Leu Glu Lys Leu
325 330 335
Ser Ala Ser Ala Glu Leu Arg Gln Gln Ser Phe Ala Val Ala Ala Asp
340 345 350
Ala Thr Glu Ser Cys Glu Asp Arg Val Ala Leu Thr Trp Asn Asn Leu
355 360 365
Arg Lys Thr Leu Leu Val His Gln Ala Ser Glu Gly Leu Phe Asp Asn
370 375 380
Asp Thr Gly Ala Leu Leu Ser Leu Gly Arg Glu Met Phe Arg Leu Glu
385 390 395 400
Ile Leu Glu Asp Ile Ala Arg Asp Lys Val Arg Thr Leu His Phe Val
405 410 415
Asp Glu Ile Glu Val Tyr Leu Ala Phe Gln Thr Met Leu Ala Glu Lys
420 425 430
Leu Gln Leu Ser Thr Ala Val Lys Glu Met Arg Phe Tyr Gly Val Ser
435 440 445
Gly Val Thr Ala Asn Asp Leu Arg Thr Ala Glu Ala Met Val Arg Ser
450 455 460
Arg Glu Glu Asn Glu Phe Thr Asp Trp Phe Ser Leu Trp Gly Pro Trp
465 470 475 480
His Ala Val Leu Lys Arg Thr Glu Ala Asp Arg Trp Ala Gln Ala Glu
485 490 495
Glu Gln Lys Tyr Glu Met Leu Glu Asn Glu Tyr Ser Gln Arg Val Ala
500 505 510
Asp Arg Leu Lys Ala Ser Gly Leu Ser Gly Asp Ala Asp Ala Glu Arg
515 520 525
Glu Ala Gly Ala Gln Val Met Arg Glu Thr Glu Gln Gln Ile Tyr Arg
530 535 540
Gln Leu Thr Asp Glu Val Leu Ala Leu Arg Leu Ser Glu Asn Gly Ser
545 550 555 560
Arg Leu His His Ser
565

<210> 12
<211> 1698
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> IpaH7.8 novel E3 ligase from Shigella flexneri
<400> 12
atgttctctg taaataatac acactcatca gtttcttgct ccccctctat taactcaaac 60
tcaaccagta atgaacatta tctgagaatc ctgactgaat gggaaaagaa ctcttctccc 120
ggggaagagc gaggcattgc ttttaacaga ctctcccagt gctttcagaa tcaagaagca 180
gtattaaatt tatcagacct aaatttgacg tctcttcccg aattaccaaa gcatatttct 240
gctttgattg tagaaaataa taaattaaca tcattgccaa agctgcctgc atttcttaaa 300
gaacttaatg ctgataataa caggctttct gtgataccag aacttcctga gtcattaaca 360
actttaagtg ttcgttctaa tcaactggaa aaccttcctg ttttgccaaa ccatttaaca 420
tcattatttg ttgaaaataa caggctatat aacttaccgg ctcttcccga aaaattgaaa 480
tttttacatg tttattataa caggctgaca acattacccg acttaccgga taaactggaa 540
attctctgtg ctcagcgcaa taatctggtt acttttcctc aattttctga tagaaacaat 600
atcagacaaa aggaatatta ttttcatttt aatcagataa ccactcttcc ggagagtttt 660
tcacaattag attcaagtta caggattaat atttcaggga atccattgtc gactcgcgtt 720
ctgcaatccc tgcaaagatt aacctcttcg ccggactacc acggcccaca gatttacttc 780
tccatgagtg acggacaaca gaatacactc catcgccccc tggctgatgc cgtgacagca 840
tggttcccgg aaaacaaaca atctgatgta tcacagatat ggcatgcttt tgaacatgaa 900
gagcatgcca acaccttttc cgcgttcctt gaccgccttt ccgataccgt ctctgcacgc 960
aatacctccg gattccgtga acaggtcgct gcatggctgg aaaaactcag tgcctctgcg 1020
gagcttcgac agcagtcttt cgctgttgct gctgatgcca ctgagagctg tgaggaccgt 1080
gtcgcgctca catggaacaa tctccggaaa accctcctgg tccatcaggc atcagaaggc 1140
cttttcgata atgataccgg cgctctgctc tccctgggca gggaaatgtt ccgcctcgaa 1200
attctggagg acattgcccg ggataaagtc agaactctcc attttgtgga tgagatagaa 1260
gtctacctgg ccttccagac catgctcgca gagaaacttc agctctctac tgccgtgaag 1320
gaaatgcgtt tctatggcgt gtcgggagtg acagcaaatg acctccgcac tgccgaagcc 1380
atggtcagaa gccgtgaaga gaatgaattt acggactggt tctccctctg gggaccatgg 1440
catgctgtac tgaagcgtac ggaagctgac cgctgggcgc aggcagaaga gcagaagtat 1500
gagatgctgg agaatgagta ctctcagagg gtggctgacc ggctgaaagc atcaggtctg 1560
agcggtgatg cggatgcgga gagggaagcc ggtgcacagg tgatgcgtga gactgaacag 1620
cagatttacc gtcagttgac tgacgaggta ctggccctgc gattgtctga aaacggctca 1680
cgactgcacc attcataa 1698

<210> 13
<211> 545
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> IpaH9.8 novel E3 ligase from Shigella flexneri
<400> 13
Met Leu Pro Ile Asn Asn Asn Phe Ser Leu Pro Gln Asn Ser Phe Tyr
1 5 10 15
Asn Thr Ile Ser Gly Thr Tyr Ala Asp Tyr Phe Ser Ala Trp Asp Lys
20 25 30
Trp Glu Lys Gln Ala Leu Pro Gly Glu Glu Arg Asp Glu Ala Val Ser
35 40 45
Arg Leu Lys Glu Cys Leu Ile Asn Asn Ser Asp Glu Leu Arg Leu Asp
50 55 60
Arg Leu Asn Leu Ser Ser Leu Pro Asp Asn Leu Pro Ala Gln Ile Thr
65 70 75 80
Leu Leu Asn Val Ser Tyr Asn Gln Leu Thr Asn Leu Pro Glu Leu Pro
85 90 95
Val Thr Leu Lys Lys Leu Tyr Ser Ala Ser Asn Lys Leu Ser Glu Leu
100 105 110
Pro Val Leu Pro Pro Ala Leu Glu Ser Leu Gln Val Gln His Asn Glu
115 120 125
Leu Glu Asn Leu Pro Ala Leu Pro Asp Ser Leu Leu Thr Met Asn Ile
130 135 140
Ser Tyr Asn Glu Ile Val Ser Leu Pro Ser Leu Pro Gln Ala Leu Lys
145 150 155 160
Asn Leu Arg Ala Thr Arg Asn Phe Leu Thr Glu Leu Pro Ala Phe Ser
165 170 175
Glu Gly Asn Asn Pro Val Val Arg Glu Tyr Phe Phe Asp Arg Asn Gln
180 185 190
Ile Ser His Ile Pro Glu Ser Ile Leu Asn Leu Arg Asn Glu Cys Ser
195 200 205
Ile His Ile Ser Asp Asn Pro Leu Ser Ser His Ala Leu Gln Ala Leu
210 215 220
Gln Arg Leu Thr Ser Ser Pro Asp Tyr His Gly Pro Arg Ile Tyr Phe
225 230 235 240
Ser Met Ser Asp Gly Gln Gln Asn Thr Leu His Arg Pro Leu Ala Asp
245 250 255
Ala Val Thr Ala Trp Phe Pro Glu Asn Lys Gln Ser Asp Val Ser Gln
260 265 270
Ile Trp His Ala Phe Glu His Glu Glu His Ala Asn Thr Phe Ser Ala
275 280 285
Phe Leu Asp Arg Leu Ser Asp Thr Val Ser Ala Arg Asn Thr Ser Gly
290 295 300
Phe Arg Glu Gln Val Ala Ala Trp Leu Glu Lys Leu Ser Ala Ser Ala
305 310 315 320
Glu Leu Arg Gln Gln Ser Phe Ala Val Ala Ala Asp Ala Thr Glu Ser
325 330 335
Cys Glu Asp Arg Val Ala Leu Thr Trp Asn Asn Leu Arg Lys Thr Leu
340 345 350
Leu Val His Gln Ala Ser Glu Gly Leu Phe Asp Asn Asp Thr Gly Ala
355 360 365
Leu Leu Ser Leu Gly Arg Glu Met Phe Arg Leu Glu Ile Leu Glu Asp
370 375 380
Ile Ala Arg Asp Lys Val Arg Thr Leu His Phe Val Asp Glu Ile Glu
385 390 395 400
Val Tyr Leu Ala Phe Gln Thr Met Leu Ala Glu Lys Leu Gln Leu Ser
405 410 415
Thr Ala Val Lys Glu Met Arg Phe Tyr Gly Val Ser Gly Val Thr Ala
420 425 430
Asn Asp Leu Arg Thr Ala Glu Ala Met Val Arg Ser Arg Glu Glu Asn
435 440 445
Glu Phe Thr Asp Trp Phe Ser Leu Trp Gly Pro Trp His Ala Val Leu
450 455 460
Lys Arg Thr Glu Ala Asp Arg Trp Ala Gln Ala Glu Glu Gln Lys Tyr
465 470 475 480
Glu Met Leu Glu Asn Glu Tyr Pro Gln Arg Val Ala Asp Arg Leu Lys
485 490 495
Ala Ser Gly Leu Ser Gly Asp Ala Asp Ala Glu Arg Glu Ala Gly Ala
500 505 510
Gln Val Met Arg Glu Thr Glu Gln Gln Ile Tyr Arg Gln Leu Thr Asp
515 520 525
Glu Val Leu Ala Leu Arg Leu Ser Glu Asn Gly Ser Gln Leu His His
530 535 540
Ser
545

<210> 14
<211> 1638
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> IpaH9.8 novel E3 ligase from Shigella flexneri
<400> 14
atgttaccga taaataataa cttttcattg ccccaaaatt ctttttataa cactatttcc 60
ggtacatatg ctgattactt ttcagcatgg gataaatggg aaaaacaagc gctccccggt 120
gaagagcgtg atgaggctgt ctcccgactt aaagaatgtc ttatcaataa ttccgatgaa 180
cttcgactgg accgtttaaa tctgtcctcg ctacctgaca acttaccagc tcagataacg 240
ctgctcaatg tatcatataa tcaattaact aacctacctg aactgcctgt tacgctaaaa 300
aaattatatt ccgccagcaa taaattatca gaattgcccg tgctacctcc tgcgctggag 360
tcacttcagg tacaacacaa tgagctggaa aacctgccag ctttacccga ttcgttattg 420
actatgaata tcagctataa cgaaatagtc tccttaccat cgctcccaca ggctcttaaa 480
aatctcagag cgacccgtaa tttcctcact gagctaccag cattttctga gggaaataat 540
cccgttgtca gagagtattt ttttgataga aatcagataa gtcatatccc ggaaagcatt 600
cttaatctga ggaatgaatg ttcaatacat attagtgata acccattatc atcccatgct 660
ctgcaagccc tgcaaagatt aacctcttcg ccggactacc acggcccacg gatttacttc 720
tccatgagtg acggacaaca gaatacactc catcgccccc tggctgatgc cgtgacagca 780
tggttcccgg aaaacaaaca atctgatgta tcacagatat ggcatgcttt tgaacatgaa 840
gagcatgcca acaccttttc cgcgttcctt gaccgccttt ccgataccgt ctctgcacgc 900
aatacctccg gattccgtga acaggtcgct gcatggctgg aaaaactcag tgcctctgcg 960
gagcttcgac agcagtcttt cgctgttgct gctgatgcca ctgagagctg tgaggaccgt 1020
gtcgcgctca catggaacaa tctccggaaa accctcctgg tccatcaggc atcagaaggc 1080
cttttcgata atgataccgg cgctctgctc tccctgggca gggaaatgtt ccgcctcgaa 1140
attctggagg atattgcccg ggataaagtc agaactctcc attttgtgga tgagatagaa 1200
gtctacctgg ccttccagac catgctcgca gagaaacttc agctctccac tgccgtgaag 1260
gaaatgcgtt tctatggcgt gtcgggagtg acagcaaatg acctccgcac tgccgaagcc 1320
atggtcagaa gccgtgaaga gaatgaattt acggactggt tctccctctg gggaccatgg 1380
catgctgtac tgaagcgtac ggaagctgac cgctgggcgc aggcagaaga gcagaaatat 1440
gagatgctgg agaatgagta ccctcagagg gtggctgacc ggctgaaagc atcaggtctg 1500
agcggtgatg cggatgcgga gagggaagcc ggtgcacagg tgatgcgtga gactgaacag 1560
cagatttacc gtcagctgac tgacgaggta ctggccctgc gattgtctga aaacggctca 1620
caactgcacc attcataa 1638

<210> 15
<211> 172
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> LegAU13 F-box motif from Legionella pneumophila
<400> 15
Met Lys Lys Asn Phe Phe Ser Asp Leu Pro Glu Glu Thr Ile Val Asn
1 5 10 15
Thr Leu Ser Phe Leu Lys Ala Asn Thr Leu Ala Arg Ile Ala Gln Thr
20 25 30
Cys Gln Phe Phe Asn Arg Leu Ala Asn Asp Lys His Leu Glu Leu His
35 40 45
Gln Leu Arg Gln Gln His Ile Lys Arg Glu Leu Trp Gly Asn Leu Met
50 55 60
Val Ala Ala Arg Ser Asn Asn Leu Glu Glu Val Lys Lys Ile Leu Lys
65 70 75 80
Lys Gly Ile Asp Pro Thr Gln Thr Asn Ser Tyr His Leu Asn Arg Thr
85 90 95
Pro Leu Leu Ala Ala Ile Glu Gly Lys Ala Tyr Gln Thr Ala Asn Tyr
100 105 110
Leu Trp Arg Lys Tyr Thr Phe Asp Pro Asn Phe Lys Asp Asn Tyr Gly
115 120 125
Asp Ser Pro Ile Ser Leu Leu Lys Lys Gln Leu Ala Asn Pro Ala Phe
130 135 140
Lys Asp Lys Glu Lys Lys Gln Ile Arg Ala Leu Ile Arg Gly Met Gln
145 150 155 160
Glu Glu Lys Ile Ala Gln Ser Lys Cys Leu Val Cys
165 170

<210> 16
<211> 519
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> LegAU13 F-box motif from Legionella pneumophila
<400> 16
atgaaaaaga attttttttc tgatcttcct gaggaaacaa ttgtcaatac attgagtttc 60
ttaaaagcaa acacactagc tcgtatagct cagacatgtc aattttttaa tcgcttggct 120
aatgataaac atctggagct gcatcaacta agacaacagc atataaagcg agagctatgg 180
ggaaatctta tggtggcggc aagaagcaat aacctggaag aggtcaaaaa gattctaaaa 240
aaaggaatcg atccaaccca gaccaatagc taccacttaa atagaacgcc tttacttgca 300
gctatcgaag gaaaagcata tcaaactgca aattacctct ggagaaaata cactttcgat 360
cccaatttta aagataacta tggtgattca cctatctctc ttcttaaaaa gcaactggca 420
aatccagcct tcaaggataa ggaaaaaaaa caaatacgcg ccttaattag gggaatgcaa 480
gaagaaaaaa tagcacagag caagtgcctt gtttgttaa 519

<210> 17
<211> 188
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> LegU1 F-box motif from Legionella pneumophila
<400> 17
Met Lys Ala Lys Tyr Asp Pro Thr Lys Pro Gly Leu Gln Lys Leu Pro
1 5 10 15
Pro Glu Ile Lys Val Met Ile Leu Glu Phe Leu Asp Ala Lys Ser Lys
20 25 30
Leu Ala Leu Ser Gln Thr Asn Tyr Gly Trp Arg Asp Leu Ile Leu Asp
35 40 45
Arg Pro Glu Tyr Thr Lys Glu Ile Thr Asn Thr Leu Phe Arg Leu Asp
50 55 60
Lys Lys Arg His Arg Gln Ala Ile Ala Gln Met Met Ser Gly Arg Val
65 70 75 80
Thr Ala Ser Ser Met Ala Lys Leu Phe Glu Glu Leu Leu Cys Phe Ser
85 90 95
Ile Pro Ser Ser Tyr Val Phe Leu Ile Phe Phe Ala Ser Gln Lys Ser
100 105 110
Val Ala Leu Ile Glu Val Leu Thr Val Ile Leu Val Phe Ala Ala Ile
115 120 125
Thr Ser Leu Ala His Asp Leu Val Asp Tyr Phe Ile Glu Ser Asp Thr
130 135 140
Lys Ala Glu Lys Gln His Ala His Arg Arg Ala Phe Gln Phe Phe Ala
145 150 155 160
Gln Pro Ser Gln Ser Ala Ala Gln Gln Asn Leu Glu Glu Glu Asn Leu
165 170 175
Ser Ala Asp Pro Lys Ala Cys Gln Cys Glu Pro Leu
180 185

<210> 18
<211> 567
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> LegU1 F-box motif from Legionella pneumophila
<400> 18
atgaaagcaa aatacgaccc cacaaagcct ggactccaaa agttacctcc tgaaatcaag 60
gtaatgattc ttgagtttct tgatgccaaa tcaaaactag ctctttcaca gacaaattat 120
ggttggcgtg atttaattct agaccggcca gaatatacca aagaaataac gaatacatta 180
tttcgtcttg ataaaaaacg ccatcgtcaa gcaatagcac aaatgatgtc aggaagagtt 240
acagcaagtt ctatggctaa gctatttgaa gaattactat gttttagcat accttcgtcc 300
tatgtgtttt taatcttttt cgcatcgcaa aaatctgtgg cgcttataga agtcttaacc 360
gtaatccttg tgtttgctgc aataacctct ctcgcccatg atctggtgga ttattttatt 420
gaaagtgata caaaagctga gaaacagcat gcacatcgcc gtgcttttca attctttgcc 480
caacccagtc aaagcgctgc acaacaaaac ttggaggaag agaatttaag tgctgatccc 540
aaggcctgcc aatgtgagcc attgtag 567

<210> 19
<211> 240
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> LubX U-box motif from Legionella pneumophila
<400> 19
Met Ala Thr Arg Asn Pro Phe Asp Ile Asp His Lys Ser Lys Tyr Leu
1 5 10 15
Arg Glu Ala Ala Leu Glu Ala Asn Leu Ser His Pro Glu Thr Thr Pro
20 25 30
Thr Met Leu Thr Cys Pro Ile Asp Ser Gly Phe Leu Lys Asp Pro Val
35 40 45
Ile Thr Pro Glu Gly Phe Val Tyr Asn Lys Ser Ser Ile Leu Lys Trp
50 55 60
Leu Glu Thr Lys Lys Glu Asp Pro Gln Ser Arg Lys Pro Leu Thr Ala
65 70 75 80
Lys Asp Leu Gln Pro Phe Pro Glu Leu Leu Ile Ile Val Asn Arg Phe
85 90 95
Val Glu Thr Gln Thr Asn Tyr Glu Lys Leu Lys Asn Arg Leu Val Gln
100 105 110
Asn Ala Arg Val Ala Ala Arg Gln Lys Glu Tyr Thr Glu Ile Pro Asp
115 120 125
Ile Phe Leu Cys Pro Ile Ser Lys Thr Leu Ile Lys Thr Pro Val Ile
130 135 140
Thr Ala Gln Gly Lys Val Tyr Asp Gln Glu Ala Leu Ser Asn Phe Leu
145 150 155 160
Ile Ala Thr Gly Asn Lys Asp Glu Thr Gly Lys Lys Leu Ser Ile Asp
165 170 175
Asp Val Val Val Phe Asp Glu Leu Tyr Gln Gln Ile Lys Val Tyr Asn
180 185 190
Phe Tyr Arg Lys Arg Glu Val Gln Lys Asn Gln Ile Gln Pro Ser Val
195 200 205
Ser Asn Gly Phe Gly Phe Phe Ser Leu Asn Phe Leu Thr Ser Trp Leu
210 215 220
Trp Gly Thr Glu Glu Lys Lys Glu Lys Thr Ser Ser Asp Met Thr Tyr
225 230 235 240

<210> 20
<211> 723
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> LubX U-box motif from Legionella pneumophila
<400> 20
atggcgacgc gaaatccttt tgatattgat cataaaagta aatacttaag agaagcagca 60
ttagaagcca atttatctca tccagaaaca acaccaacaa tgctgacttg ccctattgac 120
agcggatttc taaaagatcc cgtgatcaca cctgaaggtt ttgtttataa taaatcctct 180
attttaaaat ggttagaaac gaaaaaagaa gacccacaaa gccgtaaacc cttaacggct 240
aaagatttgc aaccattccc cgagttattg attatagtca atagatttgt tgagacacaa 300
acgaactatg aaaaattaaa aaacagatta gtgcaaaatg ctcgggttgc tgcacgccaa 360
aaagaataca ctgaaattcc ggatatattt ctttgcccaa taagtaaaac gcttatcaaa 420
acacctgtca ttactgccca agggaaagta tatgatcaag aagcattaag taactttctt 480
atcgcaacgg gtaataaaga tgaaacaggc aaaaaattat ccattgatga tgtagtggtg 540
tttgatgaac tctatcaaca gataaaagtt tataattttt accgcaaacg cgaagtgcaa 600
aaaaatcaaa ttcaaccttc agtaagtaat ggttttggct tttttagctt gaattttctc 660
acctcatggt tatggggaac tgaggagaaa aaagaaaaga catcatctga tatgacgtac 720
taa 723

<210> 21
<211> 191
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> NleG2-3 U-box motif from Enterohemorrhagic Escherichia coli
(EHEC) O157:H7
<400> 21
Met Pro Leu Thr Ser Asp Ile Arg Ser His Ser Phe Asn Leu Gly Val
1 5 10 15
Glu Val Val Arg Ala Arg Ile Val Ala Asn Gly Arg Gly Asp Ile Thr
20 25 30
Val Gly Gly Glu Thr Val Ser Ile Val Tyr Asp Ser Thr Asn Gly Arg
35 40 45
Phe Ser Ser Ser Gly Gly Asn Gly Gly Leu Leu Ser Glu Leu Leu Leu
50 55 60
Leu Gly Phe Asn Ser Gly Pro Arg Ala Leu Gly Glu Arg Met Leu Ser
65 70 75 80
Met Leu Ser Asp Ser Gly Glu Ala Gln Ser Gln Glu Ser Ile Gln Asn
85 90 95
Lys Ile Ser Gln Cys Lys Phe Ser Val Cys Pro Glu Arg Leu Gln Cys
100 105 110
Pro Leu Glu Ala Ile Gln Cys Pro Ile Thr Leu Glu Gln Pro Glu Lys
115 120 125
Gly Ile Phe Val Lys Asn Ser Asp Gly Ser Asp Val Cys Thr Leu Phe
130 135 140
Asp Ala Ala Ala Phe Ser Arg Leu Val Gly Glu Gly Leu Pro His Pro
145 150 155 160
Leu Thr Arg Glu Pro Ile Thr Ala Ser Ile Ile Val Lys His Glu Glu
165 170 175
Cys Ile Tyr Asp Asp Thr Arg Gly Asn Phe Ile Ile Lys Gly Asn
180 185 190

<210> 22
<211> 576
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> NleG2-3 U-box motif from Enterohemorrhagic Escherichia coli
(EHEC) O157:H7
<400> 22
atgccattaa cctcagatat tagatcacat tcatttaatc ttggggtgga ggttgttcgt 60
gcccgaattg tagccaatgg gcgcggagat attacagtcg gtggtgaaac tgtcagtatt 120
gtgtatgatt ctactaatgg gcgcttttca tccagtggcg gtaatggcgg attgctttct 180
gagttattgc ttttgggatt taatagtggt cctcgagccc ttggtgagag aatgctaagt 240
atgctttcgg actcaggtga agcacaatcg caagagagta ttcagaacaa aatatctcaa 300
tgtaagtttt ctgtttgtcc agagagactt cagtgcccgc ttgaggctat tcagtgtcca 360
attacactgg agcagcctga aaaaggtatt tttgtgaaga attcagatgg ttcagatgta 420
tgtactttat ttgatgccgc tgcattttct cgtttggttg gtgaaggctt accccaccca 480
ctgacccggg aaccaataac ggcatcaata attgtaaaac atgaagaatg catttatgac 540
gataccagag gaaacttcat tataaagggt aattga 576

<210> 23
<211> 213
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> NleG5-1 U-box motif from Enterohemorrhagic Escherichia coli
(EHEC) O157:H7
<400> 23
Met Pro Val Asp Leu Thr Pro Tyr Ile Leu Pro Gly Val Ser Phe Leu
1 5 10 15
Ser Asp Ile Pro Gln Glu Thr Leu Ser Glu Ile Arg Asn Gln Thr Ile
20 25 30
Arg Gly Glu Ala Gln Ile Arg Leu Gly Glu Leu Met Val Ser Ile Arg
35 40 45
Pro Met Gln Val Asn Gly Tyr Phe Met Gly Ser Leu Asn Gln Asp Gly
50 55 60
Leu Ser Asn Asp Asn Ile Gln Ile Gly Leu Gln Tyr Ile Glu His Ile
65 70 75 80
Glu Arg Thr Leu Asn His Gly Ser Leu Thr Ser Arg Glu Val Thr Val
85 90 95
Leu Arg Glu Ile Glu Met Leu Glu Asn Met Asp Leu Leu Ser Asn Tyr
100 105 110
Gln Leu Glu Glu Leu Leu Asp Lys Ile Glu Val Cys Ala Phe Asn Val
115 120 125
Glu His Ala Gln Leu Gln Val Pro Glu Ser Leu Arg Thr Cys Pro Val
130 135 140
Thr Leu Cys Glu Pro Glu Asp Gly Val Phe Met Arg Asn Ser Met Asn
145 150 155 160
Ser Asn Val Cys Met Leu Tyr Asp Lys Met Ala Leu Ile His Leu Val
165 170 175
Lys Thr Arg Ala Ala His Pro Leu Ser Arg Glu Ser Ile Ala Val Ser
180 185 190
Met Ile Val Gly Arg Asp Asn Cys Ala Phe Asp Pro Asp Arg Gly Asn
195 200 205
Phe Val Leu Lys Asn
210

<210> 24
<211> 642
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> NleG5-1 U-box motif from Enterohemorrhagic Escherichia coli
(EHEC) O157:H7
<400> 24
atgcctgtag atttaacgcc ttatatttta cctggggtta gttttttgtc tgacattcct 60
caagaaacct tgtctgagat acgtaatcag actattcgtg gagaagctca aataagactg 120
ggtgagttga tggtgtcaat acgacctatg caggtaaatg gatattttat gggaagtctt 180
aaccaggatg gtttatcgaa tgataatatc cagattggcc ttcaatatat agaacatatt 240
gaacgtacac ttaatcatgg tagtttgaca agccgtgaag ttacagtact gcgtgaaatt 300
gagatgctcg aaaatatgga tttgctttct aactaccagt tagaggagtt gttagataaa 360
attgaagtat gtgcatttaa tgtggagcat gcacaattgc aagtgccaga gagcttacga 420
acatgccctg ttacattatg tgaaccagaa gatggggtat ttatgaggaa ttcaatgaat 480
tcaaatgttt gtatgttgta tgataaaatg gcattaatac atcttgttaa aacaagggcg 540
gctcatcctt tgagcaggga atcaatcgca gtttcaatga ttgtaggaag agataattgt 600
gcttttgacc ctgacagagg taacttcgtt ttaaaaaatt aa 642

<210> 25
<211> 782
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> NleL HECT motif from Enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC)
O157:H7
<400> 25
Met Leu Pro Thr Thr Asn Ile Ser Val Asn Ser Gly Val Ile Ser Phe
1 5 10 15
Glu Ser Pro Val Asp Ser Pro Ser Asn Glu Asp Val Glu Val Ala Leu
20 25 30
Glu Lys Trp Cys Ala Glu Gly Glu Phe Ser Glu Asn Arg His Glu Val
35 40 45
Ala Ser Lys Ile Leu Asp Val Ile Ser Thr Asn Gly Glu Thr Leu Ser
50 55 60
Ile Ser Glu Pro Ile Thr Thr Leu Pro Asp Leu Leu Pro Gly Ser Leu
65 70 75 80
Lys Glu Leu Val Leu Asn Gly Cys Thr Glu Leu Lys Ser Ile Asn Cys
85 90 95
Leu Pro Pro Asn Leu Ser Ser Leu Ser Met Val Gly Cys Ser Ser Leu
100 105 110
Glu Val Ile Asn Cys Ser Ile Pro Glu Asn Val Ile Asn Leu Ser Leu
115 120 125
Cys His Cys Ser Ser Leu Lys His Ile Glu Gly Ser Phe Pro Glu Ala
130 135 140
Leu Arg Asn Ser Val Tyr Leu Asn Gly Cys Asn Ser Leu Asn Glu Ser
145 150 155 160
Gln Cys Gln Phe Leu Ala Tyr Asp Val Ser Gln Gly Arg Ala Cys Leu
165 170 175
Ser Lys Ala Glu Leu Thr Ala Asp Leu Ile Trp Leu Ser Ala Asn Arg
180 185 190
Thr Gly Glu Glu Ser Ala Glu Glu Leu Asn Tyr Ser Gly Cys Asp Leu
195 200 205
Ser Gly Leu Ser Leu Val Gly Leu Asn Leu Ser Ser Val Asn Phe Ser
210 215 220
Gly Ala Val Leu Asp Asp Thr Asp Leu Arg Met Ser Asp Leu Ser Gln
225 230 235 240
Ala Val Leu Glu Asn Cys Ser Phe Lys Asn Ser Ile Leu Asn Glu Cys
245 250 255
Asn Phe Cys Tyr Ala Asn Leu Ser Asn Cys Ile Ile Arg Ala Leu Phe
260 265 270
Glu Asn Ser Asn Phe Ser Asn Ser Asn Leu Lys Asn Ala Ser Phe Lys
275 280 285
Gly Ser Ser Tyr Ile Gln Tyr Pro Pro Ile Leu Asn Glu Ala Asp Leu
290 295 300
Thr Gly Ala Ile Ile Ile Pro Gly Met Val Leu Ser Gly Ala Ile Leu
305 310 315 320
Gly Asp Val Lys Glu Leu Phe Ser Glu Lys Ser Asn Thr Ile Asn Leu
325 330 335
Gly Gly Cys Tyr Ile Asp Leu Ser Asp Ile Gln Glu Asn Ile Leu Ser
340 345 350
Val Leu Asp Asn Tyr Thr Lys Ser Asn Lys Ser Ile Leu Leu Thr Met
355 360 365
Asn Thr Ser Asp Asp Lys Tyr Asn His Asp Lys Val Arg Ala Ala Glu
370 375 380
Glu Leu Ile Lys Lys Ile Ser Leu Asp Glu Leu Ala Ala Phe Arg Pro
385 390 395 400
Tyr Val Lys Met Ser Leu Ala Asp Ser Phe Ser Ile His Pro Tyr Leu
405 410 415
Asn Asn Ala Asn Ile Gln Gln Trp Leu Glu Pro Ile Cys Asp Asp Phe
420 425 430
Phe Asp Thr Ile Met Ser Trp Phe Asn Asn Ser Ile Met Met Tyr Met
435 440 445
Glu Asn Gly Ser Leu Leu Gln Ala Gly Met Tyr Phe Glu Arg His Pro
450 455 460
Gly Ala Met Val Ser Tyr Asn Ser Ser Phe Ile Gln Ile Val Met Asn
465 470 475 480
Gly Ser Arg Arg Asp Gly Met Gln Glu Arg Phe Arg Glu Leu Tyr Glu
485 490 495
Val Tyr Leu Lys Asn Glu Lys Val Tyr Pro Val Thr Gln Gln Ser Asp
500 505 510
Phe Gly Leu Cys Asp Gly Ser Gly Lys Pro Asp Trp Asp Asp Asp Ser
515 520 525
Asp Leu Ala Tyr Asn Trp Val Leu Leu Ser Ser Gln Asp Asp Gly Met
530 535 540
Ala Met Met Cys Ser Leu Ser His Met Val Asp Met Leu Ser Pro Asn
545 550 555 560
Thr Ser Thr Asn Trp Met Ser Phe Phe Leu Tyr Lys Asp Gly Glu Val
565 570 575
Gln Asn Thr Phe Gly Tyr Ser Leu Ser Asn Leu Phe Ser Glu Ser Phe
580 585 590
Pro Ile Phe Ser Ile Pro Tyr His Lys Ala Phe Ser Gln Asn Phe Val
595 600 605
Ser Gly Ile Leu Asp Ile Leu Ile Ser Asp Asn Glu Leu Lys Glu Arg
610 615 620
Phe Ile Glu Ala Leu Asn Ser Asn Lys Ser Asp Tyr Lys Met Ile Ala
625 630 635 640
Asp Asp Gln Gln Arg Lys Leu Ala Cys Val Trp Asn Pro Phe Leu Asp
645 650 655
Gly Trp Glu Leu Asn Ala Gln His Val Asp Met Ile Met Gly Ser His
660 665 670
Val Leu Lys Asp Met Pro Leu Arg Lys Gln Ala Glu Ile Leu Phe Cys
675 680 685
Leu Gly Gly Val Phe Cys Lys Tyr Ser Ser Ser Asp Met Phe Gly Thr
690 695 700
Glu Tyr Asp Ser Pro Glu Ile Leu Arg Arg Tyr Ala Asn Gly Leu Ile
705 710 715 720
Glu Gln Ala Tyr Lys Thr Asp Pro Gln Val Phe Gly Ser Val Tyr Tyr
725 730 735
Tyr Asn Asp Ile Leu Asp Arg Leu Gln Gly Arg Asn Asn Val Phe Thr
740 745 750
Cys Thr Ala Val Leu Thr Asp Met Leu Thr Glu His Ala Lys Glu Ser
755 760 765
Phe Pro Glu Ile Phe Ser Leu Tyr Tyr Pro Val Ala Trp Arg
770 775 780

<210> 26
<211> 2349
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> NleL HECT motif from Enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC)
O157:H7
<400> 26
atgctgccca ctacaaatat ctctgtaaat tctggagtaa tatcttttga aagtcctgta 60
gattcaccat ctaacgagga tgttgaagtt gccctcgaaa agtggtgtgc tgagggagaa 120
tttagcgaaa atcgtcatga ggttgcatca aaaatacttg atgttataag tactaatgga 180
gagactttat caatcagtga gccaataaca acattaccag acttgcttcc aggttctctg 240
aaagaactgg ttttgaatgg atgtacagag cttaaatcaa taaactgctt accccccaac 300
ttatcttcat taagtatggt tggatgctca tcattagagg ttataaattg cagcatacct 360
gaaaatgtca ttaatttatc tttatgccat tgtagttctt tgaaacatat agaaggttcc 420
tttcctgagg cactcagaaa ttccgtatat ttaaatggct gtaattcatt aaatgaatcg 480
caatgtcaat tccttgcata tgatgtcagt caaggccgtg cctgcctgag caaagctgag 540
cttactgctg acttaatttg gttgtcagct aaccgaacgg gtgaagagtc tgctgaagaa 600
ttgaattact ctggatgtga cttgtcaggt ctaagtcttg tagggctgaa tttatcatca 660
gtaaattttt ctggagcagt gcttgatgat acagatctca ggatgagtga tttgtctcag 720
gctgtattgg aaaactgttc ttttaaaaac tcgattttga atgaatgtaa tttttgttat 780
gctaatttat ctaattgtat tattagggct ttgtttgaaa actctaattt cagcaattcc 840
aatcttaaaa atgcatcatt taaaggatct tcatatatac aatatcctcc aattttgaac 900
gaggctgatt taacaggagc tattataatt cctggaatgg ttttaagtgg tgctatctta 960
ggtgatgtaa aggagctctt tagtgaaaaa agtaatacca ttaatctagg agggtgttac 1020
atagatctat ctgacataca ggaaaatata ttatctgtgt tggataacta tacaaaatca 1080
aataaatcaa ttttattgac tatgaataca tctgatgata agtataacca tgataaagta 1140
agggccgctg aagaacttat caaaaaaata tctcttgacg aattagcggc gttccggccc 1200
tatgttaaga tgtctttggc tgattcattt agtattcatc cttatttgaa caacgcaaat 1260
atacagcaat ggctcgagcc tatatgtgat gacttttttg atactataat gtcttggttt 1320
aataattcaa taatgatgta tatggagaat ggtagtttat tgcaggcagg gatgtatttt 1380
gagcgacatc caggtgcgat ggtatcttat aatagttcct ttatacaaat tgtaatgaat 1440
ggttcacggc gtgatggaat gcaggaacga tttagggaac tctatgaagt atatttaaaa 1500
aatgaaaaag tttatcctgt cacacagcag agtgattttg gattgtgcga tggctctggg 1560
aagcctgact gggatgatga ttccgatttg gcttataact gggttttgtt atcatcacag 1620
gatgatggta tggcaatgat gtgttctttg agtcatatgg ttgatatgtt atctcctaat 1680
acatcaacta attggatgtc ctttttttta tataaggatg gagaagttca aaatacattt 1740
gggtattcat tgagcaatct tttttctgaa tcatttccaa ttttcagtat tccttatcat 1800
aaagcttttt cccagaattt cgtttctggt attctggata tactcatttc tgataatgaa 1860
ctcaaagaga gatttattga ggcacttaat tccaataaat cagattataa aatgattgct 1920
gatgatcagc aaaggaaact tgcctgtgtc tggaatccct ttcttgatgg ttgggaactg 1980
aacgctcagc atgtagatat gattatgggg agccatgtat tgaaagatat gccactaaga 2040
aaacaggctg aaatattatt ttgtttaggg ggggttttct gtaaatactc atcgagtgat 2100
atgtttggta cagagtatga ttctcctgag attctacgga gatatgcaaa tggattgatt 2160
gaacaagctt ataaaacaga tcctcaggta tttggctcag tttattatta caatgatatt 2220
ttagacaggc tacaaggaag aaataatgtt tttacttgta ccgctgtgct gactgatatg 2280
ctaacggagc atgcaaaaga atcttttcct gaaatatttt cattgtatta tcctgttgcg 2340
tggcgttga 2349

<210> 27
<211> 917
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> SidC unconventional motif from Legionella pneumophila
<400> 27
Met Val Ile Asn Met Val Asp Val Ile Lys Phe Lys Glu Pro Glu Arg
1 5 10 15
Cys Asp Tyr Leu Tyr Val Asp Glu Asn Asn Lys Val His Ile Leu Leu
20 25 30
Pro Ile Val Gly Gly Asp Glu Ile Gly Leu Asp Asn Thr Cys Gln Thr
35 40 45
Ala Val Glu Leu Ile Thr Phe Phe Tyr Gly Ser Ala His Ser Gly Val
50 55 60
Thr Lys Tyr Ser Ala Glu His Gln Leu Ser Glu Tyr Lys Arg Gln Leu
65 70 75 80
Glu Glu Asp Ile Lys Ala Ile Asn Ser Gln Lys Lys Ile Ser Pro His
85 90 95
Ala Tyr Asp Asp Leu Leu Lys Glu Lys Ile Glu Arg Leu Gln Gln Ile
100 105 110
Glu Lys Tyr Ile Glu Leu Ile Gln Val Leu Lys Lys Gln Tyr Asp Glu
115 120 125
Gln Asn Asp Ile Arg Gln Leu Arg Thr Gly Gly Ile Pro Gln Leu Pro
130 135 140
Ser Gly Val Lys Glu Ile Ile Lys Ser Ser Glu Asn Ala Phe Ala Val
145 150 155 160
Arg Leu Ser Pro Tyr Asp Asn Asp Lys Phe Thr Arg Phe Asp Asp Pro
165 170 175
Leu Phe Asn Val Lys Arg Asn Ile Ser Lys Tyr Asp Thr Pro Ser Arg
180 185 190
Gln Ala Pro Ile Pro Ile Tyr Glu Gly Leu Gly Tyr Arg Leu Arg Ser
195 200 205
Thr Leu Phe Pro Glu Asp Lys Thr Pro Thr Pro Ile Asn Lys Lys Ser
210 215 220
Leu Arg Asp Lys Val Lys Ser Thr Val Leu Ser His Tyr Lys Asp Glu
225 230 235 240
Asp Arg Ile Asp Gly Glu Lys Lys Asp Glu Lys Leu Asn Glu Leu Ile
245 250 255
Thr Asn Leu Gln Asn Glu Leu Val Lys Glu Leu Val Lys Ser Asp Pro
260 265 270
Gln Tyr Ser Lys Leu Ser Leu Ser Lys Asp Pro Arg Gly Lys Glu Ile
275 280 285
Asn Tyr Asp Tyr Leu Val Asn Ser Leu Met Leu Val Asp Asn Asp Ser
290 295 300
Glu Ile Gly Asp Trp Ile Asp Thr Ile Leu Asp Ala Thr Val Asp Ser
305 310 315 320
Thr Val Trp Val Ala Gln Ala Ser Ser Pro Phe Tyr Asp Gly Ala Lys
325 330 335
Glu Ile Ser Ser Asp Arg Asp Ala Asp Lys Ile Ser Ile Arg Val Gln
340 345 350
Tyr Leu Leu Ala Glu Ala Asn Ile Tyr Cys Lys Thr Asn Lys Leu Ser
355 360 365
Asp Ala Asn Phe Gly Glu Phe Phe Asp Lys Glu Pro His Ala Thr Glu
370 375 380
Ile Ala Lys Arg Val Lys Glu Gly Phe Thr Gln Gly Ala Asp Ile Glu
385 390 395 400
Pro Ile Ile Tyr Asp Tyr Ile Asn Ser Asn His Ala Glu Leu Gly Leu
405 410 415
Lys Ser Pro Leu Thr Gly Lys Gln Gln Gln Glu Ile Thr Asp Lys Phe
420 425 430
Thr Lys His Tyr Asn Thr Ile Lys Glu Ser Pro His Phe Asp Glu Phe
435 440 445
Phe Val Ala Asp Pro Asp Lys Lys Gly Asn Ile Phe Ser His Gln Gly
450 455 460
Arg Ile Ser Cys His Phe Leu Asp Phe Phe Thr Arg Gln Thr Lys Gly
465 470 475 480
Lys His Pro Leu Gly Asp Leu Ala Ser His Gln Glu Ala Leu Gln Glu
485 490 495
Gly Thr Ser Asn Arg Leu His His Lys Asn Glu Val Val Ala Gln Gly
500 505 510
Tyr Glu Lys Leu Asp Gln Phe Lys Lys Glu Val Val Lys Leu Leu Ala
515 520 525
Glu Asn Lys Pro Lys Glu Leu Leu Asp Tyr Leu Val Ala Thr Ser Pro
530 535 540
Thr Gly Val Pro Asn Tyr Ser Met Leu Ser Lys Glu Thr Gln Asn Tyr
545 550 555 560
Ile Ala Tyr Asn Arg Asn Trp Pro Ala Ile Gln Lys Glu Leu Glu Lys
565 570 575
Ala Thr Ser Ile Pro Glu Ser Gln Lys Gln Asp Leu Ser Arg Leu Leu
580 585 590
Ser Arg Asp Asn Leu Gln His Asp Asn Leu Ser Ala Ile Thr Trp Ser
595 600 605
Lys Tyr Ser Ser Lys Pro Leu Leu Asp Val Glu Leu Asn Lys Ile Ala
610 615 620
Glu Gly Leu Glu Leu Thr Ala Lys Ile Tyr Asn Glu Lys Arg Gly Arg
625 630 635 640
Glu Trp Trp Phe Lys Gly Ser Arg Asn Glu Ala Arg Lys Thr Gln Cys
645 650 655
Glu Glu Leu Gln Arg Val Ser Lys Glu Ile Asn Thr Leu Leu Gln Ser
660 665 670
Glu Ser Leu Thr Lys Ser Gln Val Leu Glu Lys Val Leu Asn Ser Ile
675 680 685
Glu Thr Leu Asp Lys Ile Asp Arg Asp Ile Ser Ala Glu Ser Asn Trp
690 695 700
Phe Gln Ser Thr Leu Gln Lys Glu Val Arg Leu Phe Arg Asp Gln Leu
705 710 715 720
Lys Asp Ile Cys Gln Leu Asp Lys Tyr Ala Phe Lys Ser Thr Lys Leu
725 730 735
Asp Glu Ile Ile Ser Leu Glu Met Glu Glu Gln Phe Gln Lys Ile Gln
740 745 750
Asp Pro Ala Val Gln Gln Ile Val Arg Asp Leu Pro Ser His Cys His
755 760 765
Asn Asp Glu Ala Ile Glu Phe Phe Lys Thr Leu Asn Pro Glu Glu Ala
770 775 780
Ala Lys Val Ala Ser Tyr Leu Ser Leu Glu Tyr Arg Glu Ile Asn Lys
785 790 795 800
Ser Thr Asp Lys Lys Thr Leu Leu Glu Gln Asp Ile Pro Arg Leu Phe
805 810 815
Lys Glu Val Asn Thr Gln Leu Leu Ser Lys Leu Lys Glu Glu Lys Ala
820 825 830
Ile Asp Glu Gln Val His Glu Lys Leu Ser Gln Leu Ala Asp Lys Ile
835 840 845
Ala Pro Glu His Phe Thr Arg Asn Asn Ile Ile Lys Trp Ser Thr Asn
850 855 860
Pro Glu Lys Leu Glu Glu Ser Asn Leu Asn Glu Pro Ile Lys Ser Val
865 870 875 880
Gln Ser Pro Thr Thr Lys Gln Thr Ser Lys Gln Phe Arg Glu Ala Met
885 890 895
Gly Glu Ile Thr Gly Arg Asn Glu Pro Pro Thr Asp Thr Leu Tyr Thr
900 905 910
Gly Ile Ile Lys Lys
915

<210> 28
<211> 2754
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> SidC unconventional motif from Legionella pneumophila
<400> 28
atggtgataa acatggttga cgtaatcaaa ttcaaagagc cggaacgttg tgattatcta 60
tatgttgatg aaaacaacaa agttcatatc cttttaccga ttgtaggagg agatgaaata 120
ggcctggata atacctgtca aacagcagtt gagttgatca catttttcta tggtagtgcg 180
cacagtggtg tgactaaata ttctgctgaa caccaactca gtgaatacaa aaggcaattg 240
gaagaagaca tcaaagccat caatagtcaa aagaaaattt cacctcatgc ttatgacgat 300
ttattaaaag agaaaataga acgcttacag caaattgaaa aatacattga attaattcaa 360
gtactaaaaa aacaatatga tgaacaaaat gatatcaggc aacttcgtac tggagggatt 420
ccgcaattac cctctggggt aaaggaaatc attaaatcct ctgaaaatgc tttcgctgtg 480
agactttctc catatgacaa cgataaattc actcgctttg atgacccttt attcaatgtc 540
aaaagaaaca tctcaaaata tgacacgccc tcaagacaag ctcctattcc aatatacgag 600
ggattaggtt atcgcctgcg ttcaacactg ttcccggaag ataaaacacc aactccaatt 660
aataaaaaat cacttaggga taaagttaaa agcactgttc ttagtcatta taaagatgaa 720
gatagaattg atggagaaaa aaaagatgaa aaattaaacg aactaattac taatcttcaa 780
aacgaacttg taaaagagtt agtaaaaagt gatcctcaat attcgaaact atctttatct 840
aaagatccaa gaggaaaaga aataaattac gattatttag taaatagttt gatgcttgta 900
gataacgact ctgaaattgg tgattggatt gatactattc tcgacgctac agtagattcc 960
actgtctggg tagctcaggc atccagccct ttctatgatg gtgctaaaga aatatcatca 1020
gaccgcgatg cggacaagat atccatcaga gttcagtacc tgttggccga agccaatatt 1080
tactgtaaaa caaacaaatt atcggatgct aactttggag aatttttcga caaagagcct 1140
catgctactg aaattgcgaa aagagtaaag gaaggattta cgcaaggtgc agatatagaa 1200
ccaattatat acgactatat taacagcaac catgccgagc tgggattaaa atctccgtta 1260
accggcaaac aacaacaaga aatcactgat aaatttacaa aacattataa tacgattaaa 1320
gaatctccac attttgatga gttttttgtc gctgatccgg ataaaaaagg caatatcttt 1380
tctcatcaag gcagaatcag ttgtcatttt ctggatttct ttactcgaca aaccaaaggc 1440
aaacatcctc ttggtgatct tgcaagtcat caggaagctc tccaggaagg aacctccaat 1500
cgcttacatc acaagaatga ggtagtagcc caggggtacg aaaaactgga tcaattcaag 1560
aaagaggttg tcaaactgct ggctgagaat aaaccaaaag aattattgga ttatttggtt 1620
gctacctcac ctacaggtgt tccaaattac tccatgcttt cgaaggaaac tcaaaattac 1680
attgcttata atcgtaactg gccagccatt caaaaagagc tggaaaaggc taccagcatc 1740
ccggagagtc aaaaacaaga tctttcaaga ttgctttctc gtgataattt acaacacgat 1800
aatctaagcg caattacctg gtcaaaatat tcctccaagc cattattgga tgtggaatta 1860
aataaaatcg ctgaaggatt agaactcact gcaaaaattt acaatgaaaa gagaggacgc 1920
gaatggtggt ttaaaggttc aagaaatgaa gctcgtaaga cccaatgtga agaattgcaa 1980
agagtatcca aagaaatcaa tactcttctg caaagtgaat ctttaacgaa aagccaggta 2040
cttgaaaagg ttttaaattc tatagaaaca ttagataaaa ttgacagaga catttctgcc 2100
gaatccaatt ggtttcaaag tactctgcaa aaggaagtca ggttatttcg agatcaattg 2160
aaagatattt gccaattgga caagtatgcc tttaaatcaa caaaacttga tgaaatcatc 2220
tctctggaaa tggaagaaca atttcaaaag atacaagatc ctgctgttca acaaattgtc 2280
agggacttgc cttctcattg ccacaatgat gaagcaattg aattctttaa gacattgaac 2340
cctgaagagg cagcaaaagt agctagctat ttaagcctgg aatacaggga aattaataaa 2400
tcaaccgata agaaaactct cctagaacaa gatattccca gactgtttaa agaagtcaat 2460
acgcagttac tctccaaact caaagaagaa aaagctattg atgagcaagt tcatgaaaaa 2520
ctcagtcaac tggctgacaa aattgcccct gagcatttta caagaaataa cattataaaa 2580
tggtctacca accctgaaaa gcttgaggaa tcaaatctta atgagccaat caaatcagtc 2640
caaagcccta ctactaaaca aacatcaaaa caattcaggg aagcgatggg tgaaatcact 2700
ggaagaaatg agcctcctac agacactttg tacacgggaa ttataaagaa atag 2754

<210> 29
<211> 765
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> SlrP novel E3 ligase from Enterohemorrhagic Escherichia coli
("EHEC") O157:H7
<400> 29
Met Phe Asn Ile Thr Asn Ile Gln Ser Thr Ala Arg His Gln Ser Ile
1 5 10 15
Ser Asn Glu Ala Ser Thr Glu Val Pro Leu Lys Glu Glu Ile Trp Asn
20 25 30
Lys Ile Ser Ala Phe Phe Ser Ser Glu His Gln Val Glu Ala Gln Asn
35 40 45
Cys Ile Ala Tyr Leu Cys His Pro Pro Glu Thr Ala Ser Pro Glu Glu
50 55 60
Ile Lys Ser Lys Phe Glu Cys Leu Arg Met Leu Ala Phe Pro Ala Tyr
65 70 75 80
Ala Asp Asn Ile Gln Tyr Ser Arg Gly Gly Ala Asp Gln Tyr Cys Ile
85 90 95
Leu Ser Glu Asn Ser Gln Glu Ile Leu Ser Ile Val Phe Asn Thr Glu
100 105 110
Gly Tyr Thr Val Glu Gly Gly Gly Lys Ser Val Thr Tyr Thr Arg Val
115 120 125
Thr Glu Ser Glu Gln Ala Ser Ser Ala Ser Gly Ser Lys Asp Ala Val
130 135 140
Asn Tyr Glu Leu Ile Trp Ser Glu Trp Val Lys Glu Ala Pro Ala Lys
145 150 155 160
Glu Ala Ala Asn Arg Glu Glu Pro Val Gln Arg Met Arg Asp Cys Leu
165 170 175
Lys Asn Asn Lys Thr Glu Leu Arg Leu Lys Ile Leu Gly Leu Thr Thr
180 185 190
Ile Pro Ala Tyr Ile Pro Glu Gln Ile Thr Thr Leu Ile Leu Asp Asn
195 200 205
Asn Glu Leu Lys Ser Leu Pro Glu Asn Leu Gln Gly Asn Ile Lys Thr
210 215 220
Leu Tyr Ala Asn Ser Asn Gln Leu Thr Ser Ile Pro Ala Thr Leu Pro
225 230 235 240
Asp Thr Ile Gln Glu Met Glu Leu Ser Ile Asn Arg Ile Thr Glu Leu
245 250 255
Pro Glu Arg Leu Pro Ser Ala Leu Gln Ser Leu Asp Leu Phe His Asn
260 265 270
Lys Ile Ser Cys Leu Pro Glu Asn Leu Pro Glu Glu Leu Arg Tyr Leu
275 280 285
Ser Val Tyr Asp Asn Ser Ile Arg Thr Leu Pro Ala His Leu Pro Ser
290 295 300
Glu Ile Thr His Leu Asn Val Gln Ser Asn Ser Leu Thr Ala Leu Pro
305 310 315 320
Glu Thr Leu Pro Pro Gly Leu Lys Thr Leu Glu Ala Gly Glu Asn Ala
325 330 335
Leu Thr Ser Leu Pro Ala Ser Leu Pro Pro Glu Leu Gln Val Leu Asp
340 345 350
Val Ser Lys Asn Gln Ile Thr Val Leu Pro Glu Thr Leu Pro Pro Thr
355 360 365
Ile Thr Thr Leu Asp Val Ser Arg Asn Ala Leu Thr Asn Leu Pro Glu
370 375 380
Asn Leu Pro Ala Ala Leu Gln Ile Met Gln Ala Ser Arg Asn Asn Leu
385 390 395 400
Val Arg Leu Pro Glu Ser Leu Pro His Phe Arg Gly Glu Gly Pro Gln
405 410 415
Pro Thr Arg Ile Ile Val Glu Tyr Asn Pro Phe Ser Glu Arg Thr Ile
420 425 430
Gln Asn Met Gln Arg Leu Met Ser Ser Val Asp Tyr Gln Gly Pro Arg
435 440 445
Val Leu Val Ala Met Gly Asp Phe Ser Ile Val Arg Val Thr Arg Pro
450 455 460
Leu His Gln Ala Val Gln Gly Trp Leu Thr Ser Leu Glu Glu Glu Asp
465 470 475 480
Val Asn Gln Trp Arg Ala Phe Glu Ala Glu Ala Asn Ala Ala Ala Phe
485 490 495
Ser Gly Phe Leu Asp Tyr Leu Gly Asp Thr Gln Asn Thr Arg His Pro
500 505 510
Asp Phe Lys Glu Gln Val Ser Ala Trp Leu Met Arg Leu Ala Glu Asp
515 520 525
Ser Ala Leu Arg Glu Thr Val Phe Ile Ile Ala Met Asn Ala Thr Ile
530 535 540
Ser Cys Glu Asp Arg Val Thr Leu Ala Tyr His Gln Met Gln Glu Ala
545 550 555 560
Thr Leu Val His Asp Ala Glu Arg Gly Ala Phe Asp Ser His Leu Ala
565 570 575
Glu Leu Ile Met Ala Gly Arg Glu Ile Phe Arg Leu Glu Gln Ile Glu
580 585 590
Ser Leu Ala Arg Glu Lys Val Lys Arg Leu Phe Phe Ile Asp Glu Val
595 600 605
Glu Val Phe Leu Gly Phe Gln Asn Gln Leu Arg Glu Ser Leu Ser Leu
610 615 620
Thr Thr Met Thr Arg Asp Met Arg Phe Tyr Asn Val Ser Gly Ile Thr
625 630 635 640
Glu Ser Asp Leu Asp Glu Ala Glu Ile Arg Ile Lys Met Ala Glu Asn
645 650 655
Arg Asp Phe His Lys Trp Phe Ala Leu Trp Gly Pro Trp His Lys Val
660 665 670
Leu Glu Arg Ile Ala Pro Glu Glu Trp Arg Glu Met Met Ala Lys Arg
675 680 685
Asp Glu Cys Ile Glu Thr Asp Glu Tyr Gln Ser Arg Val Asn Ala Glu
690 695 700
Leu Glu Asp Leu Arg Ile Ala Asp Asp Ser Asp Ala Glu Arg Thr Thr
705 710 715 720
Glu Val Gln Met Asp Ala Glu Arg Ala Ile Gly Ile Lys Ile Met Glu
725 730 735
Glu Ile Asn Gln Thr Leu Phe Thr Glu Ile Met Glu Asn Ile Leu Leu
740 745 750
Lys Lys Glu Val Ser Ser Leu Met Ser Ala Tyr Trp Arg
755 760 765

<210> 30
<211> 2298
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> SlrP novel E3 ligase from Enterohemorrhagic Escherichia coli
("EHEC") O157:H7
<400> 30
atgtttaata ttactaatat acaatctacg gcaaggcatc aaagtattag caatgaggcc 60
tcaacagagg tgcctttaaa agaagagata tggaataaaa taagtgcctt tttctcttca 120
gaacatcagg ttgaagcaca aaactgcatc gcttatcttt gtcatccacc tgaaaccgcc 180
tcgccagaag agatcaaaag caagtttgaa tgtttaagga tgttagcttt cccggcgtat 240
gcggataata ttcagtatag tagaggaggg gcagaccaat actgtatttt gagtgaaaat 300
agtcaggaaa ttctgtctat agtttttaat acagagggct ataccgttga gggaggggga 360
aagtcagtca cctatacccg tgtgacagaa agcgagcagg cgagtagcgc ttccggctcc 420
aaagatgctg tgaattatga gttaatctgg tctgagtggg taaaagaggc gccagcgaaa 480
gaggcagcaa atcgtgaaga acccgtacaa cggatgcgtg actgcctgaa aaataataag 540
acggaacttc gtctgaaaat attaggactt accactatac ctgcctatat tcctgagcag 600
ataactactc tgatactcga taacaatgaa ctgaaaagtt tgccggaaaa tttacaggga 660
aatataaaga ccctgtatgc caacagtaat cagctaacca gtatccctgc cacgttaccg 720
gataccatac aggaaatgga gctgagcatt aaccgtatta ctgaattgcc ggaacgtttg 780
ccttcagcgc ttcaatcgct ggatcttttc cataataaaa ttagttgctt acctgaaaat 840
ctacctgagg aacttcggta cctgagcgtt tatgataaca gcataaggac actgccagca 900
catcttccgt cagagattac ccatttgaat gtgcagagta attcgttaac cgctttgcct 960
gaaacattgc cgccgggcct gaagactctg gaggccggcg aaaatgcctt aaccagtctg 1020
cccgcatcgt taccaccaga attacaggtc ctggatgtaa gtaaaaatca gattacggtt 1080
ctgcctgaaa cacttcctcc cacgataaca acgctggatg tttcccgtaa cgcattgact 1140
aatctaccgg aaaacctccc ggcggcatta caaataatgc aggcctctcg caataacctg 1200
gtccgtctcc cggagtcgtt accccatttt cgtggtgaag gacctcaacc tacaagaata 1260
atcgtagaat ataatccttt ttcagaacga acaatacaga atatgcagcg gctaatgtcc 1320
tctgtagatt atcagggacc ccgggtattg gttgccatgg gcgacttttc aattgttcgg 1380
gtaactcgac cactgcatca agctgtccag gggtggctaa ccagtctcga ggaggaagac 1440
gtcaaccaat ggcgggcgtt tgaggcagag gcaaacgcgg cggctttcag cggattcctg 1500
gactatcttg gtgatacgca gaatacccga cacccggatt ttaaggaaca agtctccgcc 1560
tggctaatgc gcctggctga agatagcgca ctaagagaaa ccgtatttat tatagcgatg 1620
aatgcaacga taagctgtga agatcgggtc acactggcat accaccaaat gcaggaagcg 1680
acgttggttc atgatgctga aagaggcgcc tttgatagcc acttagcgga actgattatg 1740
gcggggcgtg aaatctttcg gctggagcaa atagaatcgc tcgccagaga aaaggtaaaa 1800
cggctgtttt ttattgacga agtcgaagta tttctggggt ttcagaatca gttacgagag 1860
tcgctgtcgc tgacaacaat gacccgggat atgcgatttt ataacgtttc gggtatcact 1920
gagtctgacc tggacgaggc ggaaataagg ataaaaatgg ctgaaaatag ggattttcac 1980
aaatggtttg cgctgtgggg gccgtggcat aaagtgctgg agcgcatagc gccagaagag 2040
tggcgtgaaa tgatggctaa aagggatgag tgtattgaaa cggatgagta tcagagccgg 2100
gtcaatgctg aactggaaga tttaagaata gcagacgact ctgacgcaga gcgtactact 2160
gaggtacaga tggatgcaga gcgtgctatt gggataaaaa taatggaaga gatcaatcag 2220
accctcttta ctgagatcat ggagaatata ttgctgaaaa aagaggtgag ctcgctcatg 2280
agcgcctact ggcgatag 2298

<210> 31
<211> 782
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> SopA HECT motif from Salmonella typhimurium
<400> 31
Met Lys Ile Ser Ser Gly Ala Ile Asn Phe Ser Thr Ile Pro Asn Gln
1 5 10 15
Val Lys Lys Leu Ile Thr Ser Ile Arg Glu His Thr Lys Asn Gly Leu
20 25 30
Thr Ser Lys Ile Thr Ser Val Lys Asn Thr His Thr Ser Leu Asn Glu
35 40 45
Lys Phe Lys Thr Gly Lys Asp Ser Pro Ile Glu Phe Ala Leu Pro Gln
50 55 60
Lys Ile Lys Asp Phe Phe Gln Pro Lys Asp Lys Asn Thr Leu Asn Lys
65 70 75 80
Thr Leu Ile Thr Val Lys Asn Ile Lys Asp Thr Asn Asn Ala Gly Lys
85 90 95
Lys Asn Ile Ser Ala Glu Asp Val Ser Lys Met Asn Ala Ala Phe Met
100 105 110
Arg Lys His Ile Ala Asn Gln Thr Cys Asp Tyr Asn Tyr Arg Met Thr
115 120 125
Gly Ala Ala Pro Leu Pro Gly Gly Val Ser Val Ser Ala Asn Asn Arg
130 135 140
Pro Thr Val Ser Glu Gly Arg Thr Pro Pro Val Ser Pro Ser Leu Ser
145 150 155 160
Leu Gln Ala Thr Ser Ser Pro Ser Ser Pro Ala Asp Trp Ala Lys Lys
165 170 175
Leu Thr Asp Ala Val Leu Arg Gln Lys Ala Gly Glu Thr Leu Thr Ala
180 185 190
Ala Asp Arg Asp Phe Ser Asn Ala Asp Phe Arg Asn Ile Thr Phe Ser
195 200 205
Lys Ile Leu Pro Pro Ser Phe Met Glu Arg Asp Gly Asp Ile Ile Lys
210 215 220
Gly Phe Asn Phe Ser Asn Ser Lys Phe Thr Tyr Ser Asp Ile Ser His
225 230 235 240
Leu His Phe Asp Glu Cys Arg Phe Thr Tyr Ser Thr Leu Ser Asp Val
245 250 255
Val Cys Ser Asn Thr Lys Phe Ser Asn Ser Asp Met Asn Glu Val Phe
260 265 270
Leu Gln Tyr Ser Ile Thr Thr Gln Gln Gln Pro Ser Phe Ile Asp Thr
275 280 285
Thr Leu Lys Asn Thr Leu Ile Arg His Lys Ala Asn Leu Ser Gly Val
290 295 300
Ile Leu Asn Glu Pro Asp Asn Ser Ser Pro Pro Ser Val Ser Gly Gly
305 310 315 320
Gly Asn Phe Ile Arg Leu Gly Asp Ile Trp Leu Gln Met Pro Leu Leu
325 330 335
Trp Thr Glu Asn Ala Val Asp Gly Phe Leu Asn His Glu His Asn Asn
340 345 350
Gly Lys Ser Ile Leu Met Thr Ile Asp Ser Leu Pro Asp Lys Tyr Ser
355 360 365
Gln Glu Lys Val Gln Ala Met Glu Asp Leu Val Lys Ser Leu Arg Gly
370 375 380
Gly Arg Leu Thr Glu Ala Cys Ile Arg Pro Val Glu Ser Ser Leu Val
385 390 395 400
Ser Val Leu Ala His Pro Pro Tyr Thr Gln Ser Ala Leu Ile Ser Glu
405 410 415
Trp Leu Gly Pro Val Gln Glu Arg Phe Phe Ala His Gln Cys Gln Thr
420 425 430
Tyr Asn Asp Val Pro Leu Pro Ala Pro Asp Thr Tyr Tyr Gln Gln Arg
435 440 445
Ile Leu Pro Val Leu Leu Asp Ser Phe Asp Arg Asn Ser Ala Ala Met
450 455 460
Thr Thr His Ser Gly Leu Phe Asn Gln Val Ile Leu His Cys Met Thr
465 470 475 480
Gly Val Asp Cys Thr Asp Gly Thr Arg Gln Lys Ala Ala Ala Leu Tyr
485 490 495
Glu Gln Tyr Leu Ala His Pro Ala Val Ser Pro His Ile His Asn Gly
500 505 510
Leu Phe Gly Asn Tyr Asp Gly Ser Pro Asp Trp Thr Thr Arg Ala Ala
515 520 525
Asp Asn Phe Leu Leu Leu Ser Ser Gln Asp Ser Asp Thr Ala Met Met
530 535 540
Leu Ser Thr Asp Thr Leu Leu Thr Met Leu Asn Pro Thr Pro Asp Thr
545 550 555 560
Ala Trp Asp Asn Phe Tyr Leu Leu Arg Ala Gly Glu Asn Val Ser Thr
565 570 575
Ala Gln Ile Ser Pro Val Glu Leu Phe Arg His Asp Phe Pro Val Phe
580 585 590
Leu Ala Ala Phe Asn Gln Gln Ala Thr Gln Arg Arg Phe Gly Glu Leu
595 600 605
Ile Asp Ile Ile Leu Ser Thr Glu Glu His Gly Glu Leu Asn Gln Gln
610 615 620
Phe Leu Ala Ala Thr Asn Gln Lys His Ser Thr Val Lys Leu Ile Asp
625 630 635 640
Asp Ala Ser Val Ser Arg Leu Ala Thr Ile Phe Asp Pro Leu Leu Pro
645 650 655
Glu Gly Lys Leu Ser Pro Ala His Tyr Gln His Ile Leu Ser Ala Tyr
660 665 670
His Leu Thr Asp Ala Thr Pro Gln Lys Gln Ala Glu Thr Leu Phe Cys
675 680 685
Leu Ser Thr Ala Phe Ala Arg Tyr Ser Ser Ser Ala Ile Phe Gly Thr
690 695 700
Glu His Asp Ser Pro Pro Ala Leu Arg Gly Tyr Ala Glu Ala Leu Met
705 710 715 720
Gln Lys Ala Trp Glu Leu Ser Pro Ala Ile Phe Pro Ser Ser Glu Gln
725 730 735
Phe Thr Glu Trp Ser Asp Arg Phe His Gly Leu His Gly Ala Phe Thr
740 745 750
Cys Thr Ser Val Val Ala Asp Ser Met Gln Arg His Ala Arg Lys Tyr
755 760 765
Phe Pro Ser Val Leu Ser Ser Ile Leu Pro Leu Ala Trp Ala
770 775 780

<210> 32
<211> 2349
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> SopA HECT motif from Salmonella typhimurium
<400> 32
atgaagatat catcaggcgc aattaatttt tctactattc ctaaccaggt taaaaaatta 60
attacctcta ttcgtgaaca tacgaaaaac gggctcacct caaaaataac cagtgttaaa 120
aacacgcata catctttaaa tgaaaaattt aaaacaggaa aggactcacc gattgagttc 180
gcgttaccac aaaaaataaa agacttcttt cagccgaaag ataaaaacac cttaaacaaa 240
acattgatta ctgttaaaaa tattaaagat acaaataatg caggcaagaa aaatatttca 300
gcagaagatg tctcaaaaat gaatgcagca ttcatgcgta agcatattgc aaatcaaaca 360
tgtgattata attacagaat gacaggtgcg gccccgctcc ccggtggagt ctctgtatca 420
gccaataaca ggcccacggt ttctgaaggt agaacaccac cagtatcccc ctccctctca 480
cttcaggcta cctcttcccc gtcatcacct gccgactggg ctaagaaact cacggatgca 540
gttttacgac agaaagccgg agaaaccctt acggccgcag atcgcgattt ttcaaacgca 600
gatttccgta atattacatt cagcaaaata ttgcccccca gcttcatgga gcgagacggc 660
gatattatta aggggttcaa cttttcaaat tcaaaattta cttattctga tatatctcat 720
ttacattttg acgaatgccg attcacttat tcgacactga gtgatgtagt ctgcagtaat 780
acgaaattta gtaattcaga catgaatgaa gtgtttttac agtattcaat tactacacaa 840
caacagccct cgtttattga tacaacatta aaaaatacgc ttatacgtca caaagccaac 900
ctctctggcg ttattttaaa tgaaccggat aattcatcac ctccgtcagt gtcagggggc 960
ggaaatttta ttcgtctagg tgatatctgg ctgcaaatgc cactcctttg gactgagaac 1020
gctgtggatg gatttttaaa tcatgagcac aataatggta aaagtattct gatgaccatt 1080
gacagcctgc ccgataaata cagtcaggaa aaagtccagg caatggaaga cctggttaag 1140
tcattgcggg gtggccgctt aacagaggca tgtatccggc cagttgaaag ttcgctggta 1200
agcgtactgg cccacccccc ctatacgcaa agtgcgctta tcagcgagtg gctcgggcct 1260
gttcaggaac gtttttttgc ccaccagtgc cagacctata atgacgttcc cctgccggct 1320
cctgacacat attatcagca gcgcatactg cctgtgttgc tggattcgtt tgacaggaac 1380
agcgccgcca tgaccactca cagcggactc tttaatcagg tgattttaca ctgtatgaca 1440
ggcgtggact gcactgatgg cacccgccag aaagctgcag cgctttatga acagtatctt 1500
gctcacccgg cggtgtctcc ccacatccat aatgggctct tcggcaatta tgatggcagc 1560
ccggactgga caacccgcgc tgcagataat ttcctgctgc tttcctccca agattcagac 1620
acggcgatga tgctctccac tgacacgctg ttaacaatgc taaaccctac tcctgacact 1680
gcatgggaca acttttacct gctgcgagcc ggagagaacg tttccaccgc gcaaatctct 1740
ccggtagagt tattccgtca tgactttccg gtgtttctcg ccgcatttaa tcagcaggcc 1800
acgcagcgac gctttgggga gctgattgat atcatcctca gcactgaaga gcacggggag 1860
ctgaaccagc agtttcttgc cgccacgaac cagaaacatt ccaccgtgaa gttgattgat 1920
gatgcctcag tgtcgcgtct ggccaccatt tttgacccct tgcttcctga aggcaaactc 1980
agcccggcac actaccagca catcctcagt gcttatcacc tgacggacgc caccccacag 2040
aagcaggcgg aaaccctgtt ctgtctcagt accgcattcg cacgctattc ctccagcgcc 2100
attttcggca ctgagcatga ctctccgccg gccctgagag gctatgcgga ggcgctgatg 2160
cagaaagcct gggagctgtc tccggcgata ttcccatcca gcgaacagtt taccgagtgg 2220
tccgaccgtt ttcacggcct ccatggcgcc tttacctgta ccagcgttgt ggcggatagt 2280
atgcaacgtc atgccagaaa atatttcccg agtgttctgt catccatcct gccactggcc 2340
tgggcgtaa 2349

<210> 33
<211> 700
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> SspH1 novel E3 ligase from Salmonella typhimurium
<400> 33
Met Phe Asn Ile Arg Asn Thr Gln Pro Ser Val Ser Met Gln Ala Ile
1 5 10 15
Ala Gly Ala Ala Ala Pro Glu Ala Ser Pro Glu Glu Ile Val Trp Glu
20 25 30
Lys Ile Gln Val Phe Phe Pro Gln Glu Asn Tyr Glu Glu Ala Gln Gln
35 40 45
Cys Leu Ala Glu Leu Cys His Pro Ala Arg Gly Met Leu Pro Asp His
50 55 60
Ile Ser Ser Gln Phe Ala Arg Leu Lys Ala Leu Thr Phe Pro Ala Trp
65 70 75 80
Glu Glu Asn Ile Gln Cys Asn Arg Asp Gly Ile Asn Gln Phe Cys Ile
85 90 95
Leu Asp Ala Gly Ser Lys Glu Ile Leu Ser Ile Thr Leu Asp Asp Ala
100 105 110
Gly Asn Tyr Thr Val Asn Cys Gln Gly Tyr Ser Glu Ala His Asp Phe
115 120 125
Ile Met Asp Thr Glu Pro Gly Glu Glu Cys Thr Glu Phe Ala Glu Gly
130 135 140
Ala Ser Gly Thr Ser Leu Arg Pro Ala Thr Thr Val Ser Gln Lys Ala
145 150 155 160
Ala Glu Tyr Asp Ala Val Trp Ser Lys Trp Glu Arg Asp Ala Pro Ala
165 170 175
Gly Glu Ser Pro Gly Arg Ala Ala Val Val Gln Glu Met Arg Asp Cys
180 185 190
Leu Asn Asn Gly Asn Pro Val Leu Asn Val Gly Ala Ser Gly Leu Thr
195 200 205
Thr Leu Pro Asp Arg Leu Pro Pro His Ile Thr Thr Leu Val Ile Pro
210 215 220
Asp Asn Asn Leu Thr Ser Leu Pro Glu Leu Pro Glu Gly Leu Arg Glu
225 230 235 240
Leu Glu Val Ser Gly Asn Leu Gln Leu Thr Ser Leu Pro Ser Leu Pro
245 250 255
Gln Gly Leu Gln Lys Leu Trp Ala Tyr Asn Asn Trp Leu Ala Ser Leu
260 265 270
Pro Thr Leu Pro Pro Gly Leu Gly Asp Leu Ala Val Ser Asn Asn Gln
275 280 285
Leu Thr Ser Leu Pro Glu Met Pro Pro Ala Leu Arg Glu Leu Arg Val
290 295 300
Ser Gly Asn Asn Leu Thr Ser Leu Pro Ala Leu Pro Ser Gly Leu Gln
305 310 315 320
Lys Leu Trp Ala Tyr Asn Asn Arg Leu Thr Ser Leu Pro Glu Met Ser
325 330 335
Pro Gly Leu Gln Glu Leu Asp Val Ser His Asn Gln Leu Thr Arg Leu
340 345 350
Pro Gln Ser Leu Thr Gly Leu Ser Ser Ala Ala Arg Val Tyr Leu Asp
355 360 365
Gly Asn Pro Leu Ser Val Arg Thr Leu Gln Ala Leu Arg Asp Ile Ile
370 375 380
Gly His Ser Gly Ile Arg Ile His Phe Asp Met Ala Gly Pro Ser Val
385 390 395 400
Pro Arg Glu Ala Arg Ala Leu His Leu Ala Val Ala Asp Trp Leu Thr
405 410 415
Ser Ala Arg Glu Gly Glu Ala Ala Gln Ala Asp Arg Trp Gln Ala Phe
420 425 430
Gly Leu Glu Asp Asn Ala Ala Ala Phe Ser Leu Val Leu Asp Arg Leu
435 440 445
Arg Glu Thr Glu Asn Phe Lys Lys Asp Ala Gly Phe Lys Ala Gln Ile
450 455 460
Ser Ser Trp Leu Thr Gln Leu Ala Glu Asp Ala Ala Leu Arg Ala Lys
465 470 475 480
Thr Phe Ala Met Ala Thr Glu Ala Thr Ser Thr Cys Glu Asp Arg Val
485 490 495
Thr His Ala Leu His Gln Met Asn Asn Val Gln Leu Val His Asn Ala
500 505 510
Glu Lys Gly Glu Tyr Asp Asn Asn Leu Gln Gly Leu Val Ser Thr Gly
515 520 525
Arg Glu Met Phe Arg Leu Ala Thr Leu Glu Gln Ile Ala Arg Glu Lys
530 535 540
Ala Gly Thr Leu Ala Leu Val Asp Asp Val Glu Val Tyr Leu Ala Phe
545 550 555 560
Gln Asn Lys Leu Lys Glu Ser Leu Glu Leu Thr Ser Val Thr Ser Glu
565 570 575
Met Arg Phe Phe Asp Val Ser Gly Val Thr Val Ser Asp Leu Gln Ala
580 585 590
Ala Glu Leu Gln Val Lys Thr Ala Glu Asn Ser Gly Phe Ser Lys Trp
595 600 605
Ile Leu Gln Trp Gly Pro Leu His Ser Val Leu Glu Arg Lys Val Pro
610 615 620
Glu Arg Phe Asn Ala Leu Arg Glu Lys Gln Ile Ser Asp Tyr Glu Asp
625 630 635 640
Thr Tyr Arg Lys Leu Tyr Asp Glu Val Leu Lys Ser Ser Gly Leu Val
645 650 655
Asp Asp Thr Asp Ala Glu Arg Thr Ile Gly Val Ser Ala Met Asp Ser
660 665 670
Ala Lys Lys Glu Phe Leu Asp Gly Leu Arg Ala Leu Val Asp Glu Val
675 680 685
Leu Gly Ser Tyr Leu Thr Ala Arg Trp Arg Leu Asn
690 695 700

<210> 34
<211> 2103
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> SspH1 novel E3 ligase from Salmonella typhimurium
<400> 34
atgtttaata tccgcaatac acaaccttct gtaagtatgc aggctattgc tggtgcagcg 60
gcaccagagg catctccgga agaaattgta tgggaaaaaa ttcaggtttt tttcccgcag 120
gaaaattacg aagaagcgca acagtgtctc gctgaacttt gccatccggc ccggggaatg 180
ttgcctgatc atatcagcag ccagtttgcg cgtttaaaag cgcttacctt ccccgcgtgg 240
gaggagaata ttcagtgtaa cagggatggt ataaatcagt tttgtattct ggatgcaggc 300
agcaaggaga tattgtcaat cactcttgat gatgccggga actataccgt gaattgtcag 360
gggtacagtg aagcacatga cttcatcatg gacacagaac cgggagagga atgcacagaa 420
ttcgcggagg gggcatccgg gacatccctc cgccctgcca caacggtttc acagaaggca 480
gcagagtatg atgctgtctg gtcaaaatgg gaaagggatg caccagcagg agagtcaccc 540
ggccgcgcag cagtggtaca ggaaatgcgt gattgcctga ataacggcaa tccagtgctt 600
aacgtgggag cgtcaggtct taccacctta ccagaccgtt taccaccgca tattacaaca 660
ctggttattc ctgataataa tctgaccagc ctgccggagt tgccggaagg actacgggag 720
ctggaggtct ctggtaacct acaactgacc agcctgccat cgctgccgca gggactacag 780
aagctgtggg cctataataa ttggctggcc agcctgccga cgttgccgcc aggactaggg 840
gatctggcgg tctctaataa ccagctgacc agcctgccgg agatgccgcc agcactacgg 900
gagctgaggg tctctggtaa caacctgacc agcctgccgg cgctgccgtc aggactacag 960
aagctgtggg cctataataa tcggctgacc agcctgccgg agatgtcgcc aggactacag 1020
gagctggatg tctctcataa ccagctgacc cgcctgccgc aaagcctcac gggtctgtct 1080
tcagcggcac gcgtatatct ggacgggaat ccactgtctg tacgcactct gcaggctctg 1140
cgggacatca ttggccattc aggcatcagg atacacttcg atatggcggg gccttccgtc 1200
ccccgggaag cccgggcact gcacctggcg gtcgctgact ggctgacgtc tgcacgggag 1260
ggggaagcgg cccaggcaga cagatggcag gcgttcggac tggaagataa cgccgccgcc 1320
ttcagcctgg tcctggacag actgcgtgag acggaaaact tcaaaaaaga cgcgggcttt 1380
aaggcacaga tatcatcctg gctgacacaa ctggctgaag atgctgcgct gagagcaaaa 1440
acctttgcca tggcaacaga ggcaacatca acctgcgagg accgggtcac acatgccctg 1500
caccagatga ataacgtaca actggtacat aatgcagaaa aaggggaata cgacaacaat 1560
ctccaggggc tggtttccac ggggcgtgag atgttccgcc tggcaacact ggaacagatt 1620
gcccgggaaa aagccggaac actggcttta gtcgatgacg ttgaggtcta tctggcgttc 1680
cagaataagc tgaaggaatc acttgagctg accagcgtga cgtcagaaat gcgtttcttt 1740
gacgtttccg gcgtgacggt ttcagacctt caggctgcgg agcttcaggt gaaaaccgct 1800
gaaaacagcg ggttcagtaa atggatactg cagtgggggc cgttacacag cgtgctggaa 1860
cgcaaagtgc cggaacgctt taacgcgctt cgtgaaaagc aaatatcgga ttatgaagac 1920
acgtaccgga agctgtatga cgaagtgctg aaatcgtccg ggctggtcga cgataccgat 1980
gcagaacgta ctatcggagt aagtgcgatg gatagtgcga aaaaagaatt tctggatggc 2040
ctgcgcgctc ttgtggatga ggtgctgggt agctatctga cagcccggtg gcgtcttaac 2100
taa 2103

<210> 35
<211> 788
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> SspH2 novel E3 ligase from Salmonella typhimurium
<400> 35
Met Pro Phe His Ile Gly Ser Gly Cys Leu Pro Ala Thr Ile Ser Asn
1 5 10 15
Arg Arg Ile Tyr Arg Ile Ala Trp Ser Asp Thr Pro Pro Glu Met Ser
20 25 30
Ser Trp Glu Lys Met Lys Glu Phe Phe Cys Ser Thr His Gln Thr Glu
35 40 45
Ala Leu Glu Cys Ile Trp Thr Ile Cys His Pro Pro Ala Gly Thr Thr
50 55 60
Arg Glu Asp Val Ile Asn Arg Phe Glu Leu Leu Arg Thr Leu Ala Tyr
65 70 75 80
Ala Gly Trp Glu Glu Ser Ile His Ser Gly Gln His Gly Glu Asn Tyr
85 90 95
Phe Cys Ile Leu Asp Glu Asp Ser Gln Glu Ile Leu Ser Val Thr Leu
100 105 110
Asp Asp Ala Gly Asn Tyr Thr Val Asn Cys Gln Gly Tyr Ser Glu Thr
115 120 125
His Arg Leu Thr Leu Asp Thr Ala Gln Gly Glu Glu Gly Thr Gly His
130 135 140
Ala Glu Gly Ala Ser Gly Thr Phe Arg Thr Ser Phe Leu Pro Ala Thr
145 150 155 160
Thr Ala Pro Gln Thr Pro Ala Glu Tyr Asp Ala Val Trp Ser Ala Trp
165 170 175
Arg Arg Ala Ala Pro Ala Glu Glu Ser Arg Gly Arg Ala Ala Val Val
180 185 190
Gln Lys Met Arg Ala Cys Leu Asn Asn Gly Asn Ala Val Leu Asn Val
195 200 205
Gly Glu Ser Gly Leu Thr Thr Leu Pro Asp Cys Leu Pro Ala His Ile
210 215 220
Thr Thr Leu Val Ile Pro Asp Asn Asn Leu Thr Ser Leu Pro Ala Leu
225 230 235 240
Pro Pro Glu Leu Arg Thr Leu Glu Val Ser Gly Asn Gln Leu Thr Ser
245 250 255
Leu Pro Val Leu Pro Pro Gly Leu Leu Glu Leu Ser Ile Phe Ser Asn
260 265 270
Pro Leu Thr His Leu Pro Ala Leu Pro Ser Gly Leu Cys Lys Leu Trp
275 280 285
Ile Phe Gly Asn Gln Leu Thr Ser Leu Pro Val Leu Pro Pro Gly Leu
290 295 300
Gln Glu Leu Ser Val Ser Asp Asn Gln Leu Ala Ser Leu Pro Ala Leu
305 310 315 320
Pro Ser Glu Leu Cys Lys Leu Trp Ala Tyr Asn Asn Gln Leu Thr Ser
325 330 335
Leu Pro Met Leu Pro Ser Gly Leu Gln Glu Leu Ser Val Ser Asp Asn
340 345 350
Gln Leu Ala Ser Leu Pro Thr Leu Pro Ser Glu Leu Tyr Lys Leu Trp
355 360 365
Ala Tyr Asn Asn Arg Leu Thr Ser Leu Pro Ala Leu Pro Ser Gly Leu
370 375 380
Lys Glu Leu Ile Val Ser Gly Asn Arg Leu Thr Ser Leu Pro Val Leu
385 390 395 400
Pro Ser Glu Leu Lys Glu Leu Met Val Ser Gly Asn Arg Leu Thr Ser
405 410 415
Leu Pro Met Leu Pro Ser Gly Leu Leu Ser Leu Ser Val Tyr Arg Asn
420 425 430
Gln Leu Thr Arg Leu Pro Glu Ser Leu Ile His Leu Ser Ser Glu Thr
435 440 445
Thr Val Asn Leu Glu Gly Asn Pro Leu Ser Glu Arg Thr Leu Gln Ala
450 455 460
Leu Arg Glu Ile Thr Ser Ala Pro Gly Tyr Ser Gly Pro Ile Ile Arg
465 470 475 480
Phe Asp Met Ala Gly Ala Ser Ala Pro Arg Glu Thr Arg Ala Leu His
485 490 495
Leu Ala Ala Ala Asp Trp Leu Val Pro Ala Arg Glu Gly Glu Pro Ala
500 505 510
Pro Ala Asp Arg Trp His Met Phe Gly Gln Glu Asp Asn Ala Asp Ala
515 520 525
Phe Ser Leu Phe Leu Asp Arg Leu Ser Glu Thr Glu Asn Phe Ile Lys
530 535 540
Asp Ala Gly Phe Lys Ala Gln Ile Ser Ser Trp Leu Ala Gln Leu Ala
545 550 555 560
Glu Asp Glu Ala Leu Arg Ala Asn Thr Phe Ala Met Ala Thr Glu Ala
565 570 575
Thr Ser Ser Cys Glu Asp Arg Val Thr Phe Phe Leu His Gln Met Lys
580 585 590
Asn Val Gln Leu Val His Asn Ala Glu Lys Gly Gln Tyr Asp Asn Asp
595 600 605
Leu Ala Ala Leu Val Ala Thr Gly Arg Glu Met Phe Arg Leu Gly Lys
610 615 620
Leu Glu Gln Ile Ala Arg Glu Lys Val Arg Thr Leu Ala Leu Val Asp
625 630 635 640
Glu Ile Glu Val Trp Leu Ala Tyr Gln Asn Lys Leu Lys Lys Ser Leu
645 650 655
Gly Leu Thr Ser Val Thr Ser Glu Met Arg Phe Phe Asp Val Ser Gly
660 665 670
Val Thr Val Thr Asp Leu Gln Asp Ala Glu Leu Gln Val Lys Ala Ala
675 680 685
Glu Lys Ser Glu Phe Arg Glu Trp Ile Leu Gln Trp Gly Pro Leu His
690 695 700
Arg Val Leu Glu Arg Lys Ala Pro Glu Arg Val Asn Ala Leu Arg Glu
705 710 715 720
Lys Gln Ile Ser Asp Tyr Glu Glu Thr Tyr Arg Met Leu Ser Asp Thr
725 730 735
Glu Leu Arg Pro Ser Gly Leu Val Gly Asn Thr Asp Ala Glu Arg Thr
740 745 750
Ile Gly Ala Arg Ala Met Glu Ser Ala Lys Lys Thr Phe Leu Asp Gly
755 760 765
Leu Arg Pro Leu Val Glu Glu Met Leu Gly Ser Tyr Leu Asn Val Gln
770 775 780
Trp Arg Arg Asn
785

<210> 36
<211> 2367
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> SspH2 novel E3 ligase from Salmonella typhimurium
<400> 36
atgccctttc atattggaag cggatgtctt cccgccacca tcagtaatcg ccgcatttat 60
cgtattgcct ggtctgatac cccccctgaa atgagttcct gggaaaaaat gaaggaattt 120
ttttgctcaa cgcaccagac tgaagcgctg gagtgcatct ggacgatttg tcacccgccg 180
gccggaacga cgcgggagga tgtgatcaac agatttgaac tgctcaggac gctcgcgtat 240
gccggatggg aggaaagcat tcattccggc cagcacgggg aaaattactt ctgtattctg 300
gatgaagaca gtcaggagat attgtcagtc acccttgatg atgccgggaa ctataccgta 360
aattgccagg ggtacagtga aacacatcgc ctcaccctgg acacagcaca gggtgaggag 420
ggcacaggac acgcggaagg ggcatccggg acattcagga catccttcct ccctgccaca 480
acggctccac agacgccagc agagtatgat gctgtctggt cagcgtggag aagggctgca 540
cccgcagaag agtcacgcgg ccgtgcagca gtggtacaga aaatgcgtgc ctgcctgaat 600
aatggcaatg cagtgcttaa cgtgggagaa tcaggtctta ccaccttgcc agactgttta 660
cccgcgcata ttaccacact ggttattcct gataataatc tgaccagcct gccggcgctg 720
ccgccagaac tgcggacgct ggaggtctct ggtaaccagc tgactagcct gccggtgctg 780
ccgccaggac tactggaact gtcgatcttt agtaacccgc tgacccacct gccggcgctg 840
ccgtcaggac tatgtaagct gtggatcttt ggtaatcaac tgaccagcct gccggtgttg 900
ccgccagggc tacaggagct gtcggtatct gataaccaac tggccagcct gccggcgctg 960
ccgtcagaat tatgtaagct gtgggcctat aataaccagc tgaccagcct gccgatgttg 1020
ccgtcagggc tacaggagct gtcggtatct gataaccaac tggccagcct gccgacgctg 1080
ccgtcagaat tatataagct gtgggcctat aataatcggc tgaccagcct gccggcgttg 1140
ccgtcaggac tgaaggagct gattgtatct ggtaaccggc tgaccagtct gccggtgctg 1200
ccgtcagaac tgaaggagct gatggtatct ggtaaccggc tgaccagcct gccgatgctg 1260
ccgtcaggac tactgtcgct gtcggtctat cgtaaccagc tgacccgcct gccggaaagt 1320
ctcattcatc tgtcttcaga gacaaccgta aatctggaag ggaacccact gtctgaacgt 1380
actttgcagg cgctgcggga gatcaccagc gcgcctggct attcaggccc cataatacga 1440
ttcgatatgg cgggagcctc cgccccccgg gaaactcggg cactgcacct ggcggccgct 1500
gactggctgg tgcctgcccg ggagggggaa ccggctcctg cagacagatg gcatatgttc 1560
ggacaggaag ataacgccga cgcattcagc ctcttcctgg acagactgag tgagacggaa 1620
aacttcataa aggacgcggg gtttaaggca cagatatcgt cctggctggc acaactggct 1680
gaagatgagg cgttaagagc aaacaccttt gctatggcaa cagaggcaac ctcaagctgc 1740
gaggaccggg tcacattttt tttgcaccag atgaagaacg tacagctggt acataatgca 1800
gaaaaagggc aatacgataa cgatctcgcg gcgctggttg ccacggggcg tgagatgttc 1860
cgtctgggaa aactggaaca gattgcccgg gaaaaggtca gaacgctggc tctcgttgat 1920
gaaattgagg tctggctggc gtatcagaat aagctgaaga aatcactcgg gctgaccagc 1980
gtgacgtcag aaatgcgttt ctttgacgta tccggcgtga cggttacaga ccttcaggac 2040
gcggagcttc aggtgaaagc cgctgaaaaa agcgagttca gggagtggat actgcagtgg 2100
gggccgttac acagagtgct ggagcgcaaa gcgccggaac gcgttaacgc gcttcgtgaa 2160
aagcaaatat cggattatga ggaaacgtac cggatgctgt ctgacacaga gctgagaccg 2220
tctgggctgg tcggtaatac cgatgcagag cgcactatcg gagcaagagc gatggagagc 2280
gcgaaaaaga catttttgga tggcctgcga cctcttgtgg aggagatgct ggggagctat 2340
ctgaacgttc agtggcgtcg taactga 2367

<210> 37
<211> 660
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> XopL unconventional motif from Xanthomonas campestris
<400> 37
Met Arg Arg Val Asp Gln Pro Arg Pro Pro Gly Thr Pro Phe Gly Leu
1 5 10 15
Arg Glu Gln Thr Thr Ser Asn Ala Asp Ala Pro Ala Arg Thr Ala Pro
20 25 30
Pro Ala His Pro Ala Pro Glu Arg Pro Thr Gly Met Leu Gly Gly Leu
35 40 45
Thr Arg Tyr Val Pro Gly Asp Arg Ser Gly Arg Pro Pro Ala Met Pro
50 55 60
Ala Ala Ala Glu Thr Ser Arg Arg Pro Thr Thr Ser Ala Arg Pro Leu
65 70 75 80
Pro Tyr Gly Gly Ser Gly Ser Ala Ala Arg Met Asn Glu Ala Ala Gly
85 90 95
His Pro Leu Arg Met Pro Gln Leu Pro Gln Leu Ser Asp Ile Glu Arg
100 105 110
Ala Arg Phe His Ser Val Thr Thr Asp Ser Gln His Leu Arg Pro Val
115 120 125
Arg Pro Arg Met Pro Pro Pro Val Gly Ala Ser Pro Leu Arg Arg Ser
130 135 140
Thr Ala Leu Arg Pro Tyr His Asp Val Leu Ser Gln Trp Gln Arg His
145 150 155 160
Tyr Asn Ala Asp Arg Asn Arg Trp His Ser Ala Trp Arg Gln Ala Asn
165 170 175
Ser Asn Asn Pro Gln Ile Glu Thr Arg Thr Gly Arg Ala Leu Lys Ala
180 185 190
Thr Ala Asp Leu Leu Glu Asp Ala Thr Gln Pro Gly Arg Val Ala Leu
195 200 205
Glu Leu Arg Ser Val Pro Leu Pro Gln Phe Pro Asp Gln Ala Phe Arg
210 215 220
Leu Ser His Leu Gln His Met Thr Ile Asp Ala Ala Gly Leu Met Glu
225 230 235 240
Leu Pro Asp Thr Met Gln Gln Phe Ala Gly Leu Glu Thr Leu Thr Leu
245 250 255
Ala Arg Asn Pro Leu Arg Ala Leu Pro Ala Ser Ile Ala Ser Leu Asn
260 265 270
Arg Leu Arg Glu Leu Ser Ile Arg Ala Cys Pro Glu Leu Thr Glu Leu
275 280 285
Pro Glu Pro Leu Ala Ser Thr Asp Ala Ser Gly Glu His Gln Gly Leu
290 295 300
Val Asn Leu Gln Ser Leu Arg Leu Glu Trp Thr Gly Ile Arg Ser Leu
305 310 315 320
Pro Ala Ser Ile Ala Asn Leu Gln Asn Leu Lys Ser Leu Lys Ile Arg
325 330 335
Asn Ser Pro Leu Ser Ala Leu Gly Pro Ala Ile His His Leu Pro Lys
340 345 350
Leu Glu Glu Leu Asp Leu Arg Gly Cys Thr Ala Leu Arg Asn Tyr Pro
355 360 365
Pro Ile Phe Gly Gly Arg Ala Pro Leu Lys Arg Leu Ile Leu Lys Asp
370 375 380
Cys Ser Asn Leu Leu Thr Leu Pro Leu Asp Ile His Arg Leu Thr Gln
385 390 395 400
Leu Glu Lys Leu Asp Leu Arg Gly Cys Val Asn Leu Ser Arg Leu Pro
405 410 415
Ser Leu Ile Ala Gln Leu Pro Ala Asn Cys Ile Ile Leu Val Pro Pro
420 425 430
His Leu Gln Ala Gln Leu Asp Gln His Arg Pro Val Ala Arg Pro Ala
435 440 445
Glu Pro Gly Arg Thr Gly Pro Thr Thr Pro Ala Leu Ser Pro Ser Ala
450 455 460
Ala Gly Asp Arg Ala Gly Pro Ser Ser Ser Ala Thr Ala Ser Glu Leu
465 470 475 480
Leu Leu Thr Ala Ala Leu Glu Arg Ile Glu Asp Thr Ala Gln Ala Met
485 490 495
Leu Ser Thr Val Ile Asp Glu Glu Arg Asn Pro Phe Leu Glu Gly Ala
500 505 510
Pro Ser Tyr Leu Pro Gly Lys Arg Pro Thr Asp Val Thr Thr Phe Gly
515 520 525
Gln Val Pro Ala Leu Arg Asp Met Leu Ala Glu Ser Arg Asp Leu Glu
530 535 540
Phe Leu Gln Arg Val Ser Asp Met Ala Gly Pro Ser Pro Arg Ile Glu
545 550 555 560
Asp Pro Ser Glu Glu Gly Leu Ala Arg His Tyr Thr Asn Val Ser Asn
565 570 575
Trp Lys Ala Gln Lys Ser Ala His Leu Gly Ile Val Asp His Leu Gly
580 585 590
Gln Phe Val Tyr His Glu Gly Ser Pro Leu Asp Val Ala Thr Leu Ala
595 600 605
Lys Ala Val Gln Met Trp Lys Thr Arg Glu Leu Ile Val His Ala His
610 615 620
Pro Gln Asp Arg Ala Arg Phe Pro Glu Leu Ala Val His Ile Pro Glu
625 630 635 640
Gln Val Ser Asp Asp Ser Asp Ser Glu Gln Gln Thr Ser Pro Glu Pro
645 650 655
Ser Gly His Gln
660

<210> 38
<211> 1983
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> XopL unconventional motif from Xanthomonas campestris
<400> 38
atgcgacgcg tcgatcaacc acgcccgccg ggcacgcctt tcggactgcg ggagcagact 60
acgtccaatg cggatgcgcc cgcgcgcact gccccacccg cacaccccgc gcccgagcgc 120
cctaccggca tgctcggcgg actgaccaga tatgtgcctg gcgatcggtc cgggcgaccg 180
ccagcaatgc ctgccgctgc cgagacctct cgccggccaa ccacctccgc ccgcccgctt 240
ccctacggcg gatccggcag cgccgcgcgg atgaacgagg cggctggaca tcctttgcgg 300
atgccgcaat tgccacagct cagcgacata gaacgcgctc gcttccactc cgtcaccacc 360
gactcgcaac acttgcggcc ggtgcgcccc cgtatgccac cgcccgtggg cgcttcaccc 420
ttacggcgct ccacagcgct gcgcccgtac cacgacgtgc tgtcgcaatg gcaacgccac 480
tacaacgcag atcgcaatcg ctggcacagc gcatggcgcc aggccaacag caacaacccg 540
cagatcgaga ctcgcacagg ccgggcgctg aaggcgacag ccgacctgct ggaggacgca 600
acccaaccgg gccgggtcgc gctggagctg cgctcagttc cgctgccgca atttcccgac 660
caggcattcc gtctttcgca tctgcagcac atgacgatcg acgcggcagg gttgatggag 720
ctcccggaca ccatgcagca atttgcgggc ctggaaacac tcacgctcgc acgcaatccg 780
cttcgcgcgc taccggcatc catcgcaagc ctcaaccgat tacgcgagct ctccatccgc 840
gcctgcccgg aattgacgga acttcccgaa cccctggcaa gcaccgatgc atccggcgag 900
caccagggct tggtcaacct gcagagccta cggctggaat ggaccgggat cagatcgctt 960
ccggcgtcca tcgccaacct gcaaaatctg aaaagcctga agatacgcaa ctcgccgctg 1020
tccgcccttg gcccggccat ccatcacctg ccaaagttgg aggagcttga tttgcggggc 1080
tgtaccgcgc tgcgcaacta tccgccgatt ttcggcggcc gtgcgccact gaagcgactg 1140
attctgaaag actgcagcaa cctgctcacg ctgccactgg acattcaccg cctgacgcag 1200
ctggaaaaac tcgatctgcg aggttgcgtc aacctttcca gactgccctc gttgatcgcc 1260
caattacctg ccaattgcat catcctggtg ccgccgcatc tccaagcgca gctcgaccag 1320
catcgtccag ttgcgcgccc cgccgaacca gggcggaccg gaccgaccac cccagctctc 1380
tcgccctctg ctgccggcga ccgcgccggg ccatcctctt cggcgaccgc cagcgaactg 1440
cttcttaccg ctgcgctcga acgcatcgaa gacaccgcac aggccatgct gagcacggtc 1500
atcgatgaag aaagaaatcc ctttctggaa ggtgctccat cctatctccc aggaaaacgc 1560
cctaccgatg tcaccacctt cggccaagtt ccggcattgc gggacatgct ggcagaaagc 1620
agggatcttg agttcctgca acgggtaagc gacatggcag gcccatcccc cagaatcgaa 1680
gacccgagcg aggaaggcct cgcccgccac tacacgaacg tcagcaactg gaaggcgcag 1740
aagagcgcac acctgggcat cgtcgatcat ctcgggcagt tcgtttatca cgaaggaagc 1800
ccgctcgacg tagcgacatt ggccaaggca gtgcagatgt ggaagacccg tgagctgatc 1860
gtccacgcac acccgcaaga ccgcgcgcgc tttcccgagc tcgctgtgca cattcccgag 1920
caggtcagcg acgactctga tagcgaacag cagacaagcc cggaaccttc aggccatcag 1980
tag 1983
先に述べたように、ｕＡｂの治療的開発のための主要な障壁は、細胞内送達である。Ｏｓｈｅｒｏｖｉｃｈ，Ｌ．，“Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ Ｆｒｏｍ Ｗｉｔｈｉｎ，”Ｓｃｉｅｎｃｅ－Ｂｕｓｉｎｅｓｓ Ｅｘｃｈａｎｇｅ ７：１０－１１（２０１４）、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。細胞透過性のために設計することができるより小さいＰＲＯＴＡＣとは異なり（Ｂｕｃｋｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，“Ｓｍａｌｌ－Ｍｏｌｅｃｕｌｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌｅｖｅｌｓ Ｔｈｒｏｕｇｈ Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ Ｐｒｏｔｅａｓｏｍｅ Ｓｙｓｔｅｍ，”Ａｎｇｅｗ Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．５３（９）：２３１２－３０（２０１４）、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）、ｕＡｂは、細胞膜を効果的に貫通しない比較的嵩高いタンパク質である。この問題を修正するために、バイオインスパイアードｍＲＮＡ送達戦略を実施し、それによって、追加の３’末端ポリアデノシン（「ポリＡ」）テールを伴うＧＳ２－ＩｐａＨをコードするｍＲＮＡは、ｍＲＮＡ安定性を改善しかつ真核細胞内でｍＲＮＡ翻訳を刺激するように働くポリＡ結合タンパク質（「ＰＡＢＰ」）と化学量論的に複合体化された（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，“Ｐｏｌｙａｍｉｎｅ－Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｓｔｏｉｃｈｉｏｍｅｔｒｉｃ Ａｓｓｅｍｂｌｙ ｏｆ Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎｓ ｆｏｒ Ｅｎｈａｎｃｅｄ ｍＲＮＡ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，”Ａｎｇｅｗ Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．５６（４４）：１３７０９－１２（２０１７）、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。得られたリボヌクレオタンパク質（「ＲＮＰ」）をカチオン性ポリペプチドで安定化して、ｍＲＮＡを分解から保護し、細胞によるその取り込みを可能にし、そのエンドソームエスケープを促進した。重要なことに、これらの共アセンブルしたナノプレックスは、ＧＦＰを安定的に発現する培養哺乳動物細胞への導入後、およびＧＦＰを普遍的に発現するトランスジェニックマウスへの投与後に効率的なＧＦＰサイレンシングを引き起こす様式で、ＧＳ２－ＩｐａＨ９．８ｍＲＮＡを送達した。まとめると、本明細書に記載される結果は、ｕＡｂ媒介性プロテオーム編集が、細胞およびマウスにおけるタンパク質の標的分解のための効果的な戦略であることを実証し、それによって、ｕＡｂのステージを、薬物発見のためのツールとして、およびいわゆる「新薬の開発につながらない（ｕｎｄｒｕｇｇａｂｌｅ）」標的を薬理学的にヒットする可能性を有する治療候補として設定する。
[本発明1001]
Ｅ3ユビキチンリガーゼ（Ｅ3）モチーフを含む分解ドメインと、
前記分解ドメインを基質へと特異的に方向付けることができる標的指向ドメインであって、前記分解ドメインに対して異種である、標的指向ドメインと、
前記分解ドメインを前記標的指向ドメインに結合させるリンカーと
を含む、単離されたキメラ分子。
[本発明1002]
前記Ｅ3モチーフが、修飾結合領域を有しない前記Ｅ3モチーフと比較して前記基質への結合を阻害するまたは減少させる修飾結合領域を含む、本発明1001のキメラ分子。
[本発明1003]
前記修飾が、前記結合領域における変異または欠失である、本発明1002のキメラ分子。
[本発明1004]
前記Ｅ3モチーフが、前記基質のタンパク質分解を可能にする、本発明1001のキメラ分子。
[本発明1005]
前記Ｅ3モチーフが、細胞型特異的または組織特異的リガーゼ機能を保有する、本発明1001のキメラ分子。
[本発明1006]
前記リガーゼ機能が、細胞型特異的であり、前記細胞型は、皮膚細胞、筋肉細胞、上皮細胞、内皮細胞、幹細胞、臍帯血管細胞、角膜細胞、心筋細胞、大動脈細胞、角膜上皮細胞、体細胞、線維芽細胞、ケラチノサイト、メラノサイト、脂肪細胞、骨細胞、骨芽細胞、気道細胞、微小血管細胞、乳房細胞、血管細胞、軟骨細胞、胎盤細胞、肝細胞、膠細胞、表皮細胞、角膜輪部幹細胞、歯周幹細胞、骨髄間質細胞、ハイブリドーマ細胞、腎臓細胞、膵島、関節軟骨細胞、神経芽細胞、リンパ球、および赤血球からなる群から選択される、本発明1005のキメラ分子。
[本発明1007]
前記分解ドメインが細菌病原体由来である、本発明1001のキメラ分子。
[本発明1008]
前記細菌病原体が、シゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、バルトネラ（Ｂａｒｔｏｎｅｌｌａ）、ボルデテラ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ）、ボレリア（Ｂｏｒｒｅｌｉａ）、ブルセラ（Ｂｒｕｃｅｌｌａ）、カンピロバクター（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、クラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ）およびクラミドフィラ（Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ）、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、エンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、フランシセラ（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ）、ヘモフィルス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）、ヘリコバクター（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ）、レジオネラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）、レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）、リステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）、マイコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、マイコプラズマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）、ナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、リケッチア（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ）、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、トレポネーマ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ）、ウレアプラズマ（Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ）、ビブリオ（Ｖｉｂｒｉｏ）、ならびにエルシニア（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）からなる群から選択される、本発明1007のキメラ分子。
[本発明1009]
前記分解ドメインが、細菌病原体由来であり、かつシゲラ・フレックスネリ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｆｌｅｘｎｅｒｉ）Ｅ3リガーゼ、ＳｓｐＨ1、ＳｓｐＨ2、ＳｌｒＰ、ＡｖｒＰｔｏＢ、ＬｕｂＸ、ＮｌｅＧ5－1、ＮｌｅＧ2－3、ＬｅｇＵ1、ＬｅｇＡＵ13、ＮＩｅＬ、ＳｏｐＡ、ＳｉｄＣ、ＸｏｐＬ、ＧｏｂＸ、ＶｉｒＦ、ＧＡＬＡ、ＡｎｋＢ、またはＳｉｄＥを含む、本発明1007のキメラ分子。
[本発明1010]
前記分解ドメインが、シゲラＩｐａＨタンパク質である、本発明1001のキメラ分子。
[本発明1011]
前記シゲラＩｐａＨタンパク質が、ＩｐａＨ9．8、ＩｐａＨ1．4、ＩｐａＨ2．5、ＩｐａＨ4．5、ＩｐａＨ7．8、ＩｐａＨ0887、ＩｐａＨ1389、ＩｐａＨ2022、ＩｐａＨ2202、ＩｐａＨ2610、およびＩｐａＨ0722からなる群から選択される、本発明1010のキメラ分子。
[本発明1012]
前記細菌病原体がシゲラ・フレックスネリである場合である、本発明1007のキメラ分子。
[本発明1013]
前記標的指向ドメインが、モノボディ、フィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン（ＦＮ3）抗体、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、組換え抗体、抗体フラグメント、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）2、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｔａｓｃＦｖ、ビス－ｓｃＦｖ、ｓｄＡｂ、ＶＨ、ＶＬ、Ｖｎａｒ、ｓｃＦｖＤ10、ｓｃＦｖ13Ｒ4、ｓｃＦｖＤ10、ヒト化抗体、キメラ抗体、相補性決定領域（ＣＤＲ）、ＩｇＡ抗体、ＩｇＤ抗体、ＩｇＥ抗体、ＩｇＧ抗体、ＩｇＭ抗体、ナノボディ、イントラボディ、ユニボディ、ミニボディ、非抗体タンパク質骨格、アドネクチン、アフィボディおよびそれらの2ヘリックス変異体、アンチカリン、ラクダ科抗体、Ｖ Ｈ Ｈ、ノッチン（ｋｎｏｔｔｉｎ）、ＤＡＲＰｉｎ、またはＳｓｏ7ｄである、本発明1001のキメラ分子。
[本発明1014]
前記標的指向ドメインがモノボディであり、前記モノボディが、以下（括弧内に標的抗原を示す）：
ＧＳ2（ＧＦＰ）、Ｎｓａ5（ＳＨＰ2）、ＲａｓＩｎＩ（ＨＲａｓ／ＫＲａｓ）、およびＲａｓＩｎＩＩ（ＨＲａｓ／ＫＲａｓ）、1Ｄ10（ＣＤＣ34）、1Ｄ7（ＣＯＰＳ5）、1Ｃ4（ＭＡＰ2Ｋ5）、2Ｃ12（ＭＡＰ2Ｋ5）、1Ｅ2（ＳＦ3Ａ1）、1Ｃ2（ＵＳＰ11）、1Ａ9（ＵＳＰ11）、Ｕｂｉ4（ユビキチン）、ＥＩ1．4．1（ＥＧＦＲ）、ＥＩ2．4．6（ＥＧＦＲ）、ＥＩ3．4．3（ＥＧＦＲ）、ＥＩ4．2．1（ＥＧＦＲ）、ＥＩ4．4．2（ＥＧＦＲ）、ＥＩ6．2．6（ＥＧＦＲ）、ＥＩ6．2．10（ＥＧＦＲ）、Ｅ246（ＥＧＦＲ）、Ｃ743（ＣＥＡ）、ＩＩＩａ8．2．6（ＦｃγＩＩａ）、ＩＩＩａ6．2．6（ＦｃγＩＩＩａ）、ｈＡ2．2．1（ｈＡ33）、ｈＡ2．2．2（ｈＡ33）、ｈＡ3．2．1（ｈＡ33）、ｈＡ3．2．3（ｈＡ33）、ｍＡ3．2．1（ｍＡ33）、ｍＡ3．2．2（ｍＡ33）、ｍＡ3．2．3（ｍＡ33）、ｍＡ3．2．4（ｍＡ33）、ｍＡ3．2．5（ｍＡ33）、Ａｌｂ3．2．1（ｈＡｌｂ）、ｍＩ2．2．1（ｍＩｇＧ）、ＨＡ4（ＡｂｌＳＨ2）、ＨＡ10（ＡｂｌＳＨ2）、ＨＡ16（ＡｂｌＳＨ2）、ＨＡ18（ＡｂｌＳＨ2）、159（ｖＥＧＦＲ）、ＭＵＣ16（ＭＳＬＮ）、Ｅ2＃3（ＥＲα／ＥＦ）、Ｅ2＃4（ＥＲα／ＥＦ）、Ｅ2＃5（ＥＲα／ＥＦ）、Ｅ2＃6（ＥＲα／ＥＦ）、Ｅ2＃7（ＥＲα／ＥＦ）、Ｅ2＃8（ＥＲα／ＥＦ）、Ｅ2＃9（ＥＲα／ＥＦ）、Ｅ2＃10（ＥＲα／ＥＦ）、Ｅ2＃11（ＥＲα／ＥＦ）、Ｅ2＃23（ＥＲα／ＥＦ）、Ｅ3＃2（ＥＲα／ＥＦ）、Ｅ3＃6（ＥＲα／ＥＦ）、ＯＨＴ＃31（ＥＲα／ＥＦ）、ＯＨＴ＃32（ＥＲα／ＥＦ）、ＯＨＴ＃33（ＥＲα／ＥＦ）、ＡＢ7－Ａ1（ＥＲα／ＥＦ）、ＡＢ7－Ｂ1（ＥＲα／ＥＦ）、ＭＢＰ－74（ＭＢＰ）、ＭＢＰ－76（ＭＢＰ）、ＭＢＰ－79（ＭＢＰ）、ｈＳＵＭＯ4－33（ｈＳＵＭＯ4）、ｈＳＵＭＯ－39（ｈＳＵＭＯ4）、ｙＳＵＭＯ－53（ｙＳＵＭＯ）、ｙＳＵＭＯ－56（ｙＳＵＭＯ）、ｙＳＵＭＯ－57（ｙＳＵＭＯ）、Ｔ14．25（ＴＮＦα）、Ｔ14．20（ＴＮＦα）、ＦＮｆｎ10－3ＪＣＬ14（ａｖβ3インテグリン）、1Ｃ9（Ｓｒｃ ＳＨ3）、1Ｆ11（Ｓｒｃ ＳＨ3）、1Ｆ10（Ｓｒｃ ＳＨ3）、2Ｇ10（Ｓｒｃ ＳＨ3）、2Ｂ2（Ｓｒｃ ＳＨ3）、1Ｅ3（Ｓｒｃ ＳＨ3）、Ｅ18（ＶＥＧＦＲ2）、Ｅ19（ＶＥＧＦＲ2）、Ｅ26（ＶＥＧＦＲ2）、Ｅ29（ＶＥＧＦＲ2）、ＦＧ4．2（リゾチーム）、ＦＧ4．1（リゾチーム）、2Ｌ4．1（リゾチーム）、ＢＦ4．1（リゾチーム）、ＢＦ4．9（リゾチーム）、ＢＦ4．4（リゾチーム）、ＢＦｓ1ｃ4．01（リゾチーム）、ＢＦｓ1ｃ4．07（リゾチーム）、ＢＦｓ3＿4．02（リゾチーム）、ＢＦｓ3＿4．06（リゾチーム）、ＢＦｓ3＿8．01（リゾチーム）、10Ｃ17Ｃ25（ホスホ－ＩκＢα）、Ｆｎ－Ｎ22（ＳＡＲＳ Ｎ）、Ｆｎ－Ｎ17（ＳＡＲＳ Ｎ）、ＦＮ－Ｎ10（ＳＡＲＳ Ｎ）、ｇＩ2．5．3Ｔ88Ｉ（ヤギＩｇＧ）、ｇＩ2．5．2（ヤギＩｇＧ）、ｇＩ2．5．4（ヤギＩｇＧ）、ｒＩ4．5．4（ウサギＩｇＧ）、ｒＩ4．3．1（ウサギＩｇＧ）、ｒＩ3．6．6（ウサギＩｇＧ）、ｒＩ4．3．4（ウサギＩｇＧ）、ｒＩ3．6．4（ウサギＩｇＧ）、およびｒＩ4．3．3（ウサギＩｇＧ）
からなる群から選択されるフィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン（ＦＮ3）モノボディである、本発明1013のキメラ分子。
[本発明1015]
前記基質が、蛍光タンパク質、ヒストンタンパク質、核局在化シグナル（ＮＬＳ）、Ｈ－Ｒａｓタンパク質、Ｓｒｃ相同2ドメイン含有ホスファターゼ2（ＳＨＰ2）、β－ガラクトシダーゼ、ｇｐＤ、Ｈｓｐ70、ＭＢＰ、ＣＤＣ34、ＣＯＰＳ5、ＭＡＰ2Ｋ5、ＳＦ3Ａ1、ＵＳＰ11、ユビキチン、ＥＧＦＲ、ＣＥＡ、ＦｃγＩＩａ、ＦｃγＩＩＩａ、ｈＡ33、ｍＡ33、ｈＡｌｂ、ｍＩｇＧ、ＡｂｌＳＨ2、ｖＥＧＦＲ、ＭＳＬＮ、ＥＲα／ＥＦ、ｈＳＵＭＯ4、ｙＳＵＭＯ、ＴＮＦα、ａｖβ3インテグリン、ＳｒｃＳＨ3、リゾチーム、ホスホ－ＩκＢα、ＳＡＲＳ Ｎ、ヤギＩｇＧ、ウサギＩｇＧ、翻訳後修飾タンパク質、フィブリン、ハンチンチン、腫瘍形成タンパク質、ｐ53、Ｒｂ、接着タンパク質、受容体、細胞周期タンパク質、チェックポイントタンパク質、ＨＦＥ、ＡＴＰ7Ｂ、プリオンタンパク質、ウイルスタンパク質、細菌タンパク質、寄生生物タンパク質、真菌タンパク質、ＤＮＡ結合タンパク質、代謝タンパク質、調節タンパク質、構造タンパク質、酵素、免疫原性タンパク質、自己免疫原性タンパク質、免疫原、抗原、および病原性タンパク質からなる群から選択される、本発明1001のキメラ分子。
[本発明1016]
前記基質が、緑色蛍光タンパク質、エメラルド蛍光タンパク質、ビーナス蛍光タンパク質、セルリアン蛍光タンパク質、および増強シアン蛍光タンパク質からなる群から選択される蛍光タンパク質である、本発明1001のキメラ分子。
[本発明1017]
前記標的指向ドメインが、非天然基質に結合する、本発明1001のキメラ分子。
[本発明1018]
本発明1001の単離されたキメラ分子をコードするｍＲＮＡを提供することと、
1つ以上のポリアデノシン結合タンパク質（「ＰＡＢＰ」）を提供することと、
前記ｍＲＮＡおよび前記1つ以上のＰＡＢＰからリボヌクレオタンパク質複合体をアセンブルすることと
を含む、リボヌクレオタンパク質を形成する方法。
[本発明1019]
前記ｍＲＮＡが、3’末端ポリアデノシン（ポリＡ）テールを含む、本発明1018の方法。
[本発明1020]
本発明1001のキメラ分子と、
薬学的に許容される担体と
を含む、組成物。
[本発明1021]
抗炎症剤、抗糖尿病剤、脂質低下剤、化学療法剤、抗ウイルス剤、抗生物質、代謝剤、小分子阻害剤、プロテインキナーゼ阻害剤、アジュバント、アポトーシス剤、増殖剤、および臓器親和性標的指向剤、ならびにこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される第2の薬剤をさらに含む、本発明1020の組成物。
[本発明1022]
疾患を有する対象を選択することと、
本発明1020の組成物を前記対象に投与して、前記対象に、前記疾患に罹患していない対象と比較して、前記基質の増加した発現レベルを与えることと
を含む、疾患を治療する方法。
[本発明1023]
前記疾患が、癌、転移性癌、脳卒中、虚血、末梢血管疾患、アルコール性肝疾患、肝炎、肝硬変、パーキンソン病、アルツハイマー病、嚢胞性線維症糖尿病、ＡＬＳ、病原性疾患、特発性疾患、ウイルス性疾患、細菌性疾患、プリオン性疾患、真菌性疾患、寄生生物性疾患、関節炎、創傷治癒、免疫不全、炎症性疾患、再生不良性貧血、貧血、遺伝性障害、先天性障害、1型糖尿病、2型糖尿病、妊娠性糖尿病、高血糖症、代謝症候群、リポジストロフィー症候群、脂質異常症、インスリン抵抗性、レプチン抵抗性、アテローム性動脈硬化症、血管疾患、高コレステロール血症、高トリグリセリド血症、非アルコール性脂肪性肝疾患、体重過多、および肥満からなる群から選択される、本発明1022の方法。
[本発明1024]
前記投与が、経口的に、非経口的に、皮下に、静脈内に、筋肉内に、腹腔内に、鼻腔内滴下により、移植により、腔内もしくは膀胱内滴下により、眼内に、動脈内に、病変内に、経皮的に、または粘膜への適用により行われる、本発明1022の方法。
[本発明1025]
サイレンシングさせる基質を選択することと、
本発明1001のキメラ分子を提供することと、
基質－分子複合体の形成を可能にするのに有効な条件下で、前記基質を前記キメラ分子と接触させることであって、前記複合体が、前記サイレンシングさせる基質の分解を媒介する、接触させることと
を含む、基質サイレンシングのための方法。
[本発明1026]
前記基質が、蛍光タンパク質、ヒストンタンパク質、核局在化シグナル（ＮＬＳ）、Ｈ－Ｒａｓタンパク質、ＳＨＰ2タンパク質、Ｓｒｃ相同2ドメイン含有ホスファターゼ2（ＳＨＰ2）、β－ガラクトシダーゼ、ｇｐＤ、Ｈｓｐ70、ＭＢＰ、ＣＤＣ34、ＣＯＰＳ5、ＭＡＰ2Ｋ5、ＳＦ3Ａ1、ＵＳＰ11、ユビキチン、ＥＧＦＲ、ＣＥＡ、ＦｃγＩＩａ、ＦｃγＩＩＩａ、ｈＡ33、ｍＡ33、ｈＡｌｂ、ｍＩｇＧ、ＡｂｌＳＨ2、ｖＥＧＦＲ、ＭＳＬＮ、ＥＲα／ＥＦ、ｈＳＵＭＯ4、ｙＳＵＭＯ、ＴＮＦα、ａｖβ3インテグリン、ＳｒｃＳＨ3、リゾチーム、ホスホ－ＩκＢα、ＳＡＲＳ Ｎ、ヤギＩｇＧ、ウサギＩｇＧ、翻訳後修飾タンパク質、フィブリン、ハンチンチン、腫瘍形成タンパク質、ｐ53、Ｒｂ、接着タンパク質、受容体、細胞周期タンパク質、チェックポイントタンパク質、ＨＦＥ、ＡＴＰ7Ｂ、プリオンタンパク質、ウイルスタンパク質、細菌タンパク質、寄生生物タンパク質、真菌タンパク質、ＤＮＡ結合タンパク質、代謝タンパク質、調節タンパク質、構造タンパク質、酵素、免疫原性タンパク質、自己免疫原性タンパク質、免疫原、抗原、および病原性タンパク質からなる群から選択される、本発明1025の方法。
[本発明1027]
前記基質が、緑色蛍光タンパク質、エメラルド蛍光タンパク質、ビーナス蛍光タンパク質、セルリアン蛍光タンパク質、および増強シアン蛍光タンパク質からなる群から選択される蛍光タンパク質である、本発明1025の方法。
[本発明1028]
その存在が疾患状態を媒介する生体分子を提供することと、
（ｉ）Ｅ3ユビキチンリガーゼ（Ｅ3）モチーフを含む分解ドメインと、（ｉｉ）前記分解ドメインを前記生体分子へと特異的に方向付けることができる標的指向ドメインであって、前記分解ドメインに対して異種である、標的指向ドメインと、（ｉｉｉ）前記分解ドメインを前記標的指向ドメインに結合させるリンカーとを含む試験剤を提供することと、
前記試験剤が前記生体分子の分解を促進するのに有効な条件下で、前記生体分子を前記試験剤と接触させることと、
前記接触の結果としての前記生体分子のレベルを決定することと、
前記決定に基づいて、前記生体分子のレベルを低下させる前記試験剤を、前記疾患に対する治療有効性の候補であるとして同定することと
を含む、疾患に対する治療有効性について薬剤をスクリーニングする方法。
[本発明1029]
前記同定が、前記疾患に罹患していない対象における標準生体分子レベルに関して行われる、本発明1028の方法。
[本発明1030]
前記同定が、前記接触がない前記生体分子レベルに関して行われる、本発明1028の方法。
[本発明1031]
複数の試験剤を用いて行われる、本発明1028の方法。
[本発明1032]
前記分解ドメインが細菌病原体である、本発明1028の方法。
[本発明1033]
前記細菌病原体が、シゲラ、サルモネラ、バチルス、バルトネラ、ボルデテラ、ボレリア、ブルセラ、カンピロバクター、クラミジアおよびクラミドフィラ、クロストリジウム、コリネバクテリウム、エンテロコッカス、エシェリキア、フランシセラ、ヘモフィルス、ヘリコバクター、レジオネラ、レプトスピラ、リステリア、マイコバクテリウム、マイコプラズマ、ナイセリア、シュードモナス、リケッチア、スタフィロコッカス、ストレプトコッカス、トレポネーマ、ウレアプラズマ、ビブリオ、ならびにエルシニアからなる群から選択される、本発明1032の方法。
[本発明1034]
前記分解ドメインが、細菌病原体由来であり、かつシゲラ・フレックスネリＥ3リガーゼ、ＳｓｐＨ1、ＳｓｐＨ2、ＳｌｒＰ、ＡｖｒＰｔｏＢ、ＬｕｂＸ、ＮｌｅＧ5－1、ＮｌｅＧ2－3、ＬｅｇＵ1、ＬｅｇＡＵ13、ＮＩｅＬ、ＳｏｐＡ、ＳｉｄＣ、ＸｏｐＬ、ＧｏｂＸ、ＶｉｒＦ、ＧＡＬＡ、ＡｎｋＢ、またはＳｉｄＥを含む、本発明1032の方法。
[本発明1035]
前記分解ドメインが、シゲラＩｐａＨタンパク質である、本発明1028の方法。
[本発明1036]
前記シゲラＩｐａＨタンパク質が、ＩｐａＨ9．8、ＩｐａＨ1．4、ＩｐａＨ2．5、ＩｐａＨ4．5、ＩｐａＨ7．8、ＩｐａＨ0887、ＩｐａＨ1389、ＩｐａＨ2022、ＩｐａＨ2202、ＩｐａＨ2610、およびＩｐａＨ0722からなる群から選択される、本発明1035の方法。
[本発明1037]
前記細菌病原体が、シゲラ・フレックスネリである場合である、本発明1032の方法。
[本発明1038]
前記標的指向ドメインが、モノボディ、フィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン（ＦＮ3）、抗体、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、組換え抗体、抗体フラグメント、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）2、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｔａｓｃＦｖ、ビス－ｓｃＦｖ、ｓｄＡｂ、ＶＨ、ＶＬ、Ｖｎａｒ、ｓｃＦｖＤ10、ｓｃＦｖ13Ｒ4、ｓｃＦｖＤ10、ヒト化抗体、キメラ抗体、相補性決定領域（ＣＤＲ）、ＩｇＡ抗体、ＩｇＤ抗体、ＩｇＥ抗体、ＩｇＧ抗体、ＩｇＭ抗体、ナノボディ、イントラボディ、ユニボディ、ミニボディ、非抗体タンパク質骨格、アドネクチン、アフィボディおよびそれらの2ヘリックス変異体、アンチカリン、ラクダ科抗体、Ｖ Ｈ Ｈ、ノッチン、ＤＡＲＰｉｎ、またはＳｓｏ7ｄである、本発明1028の方法。
[本発明1039]
前記標的指向ドメインがモノボディであり、前記モノボディが、以下（括弧内に標的抗原を示す）：
ＧＳ2（ＧＦＰ）、Ｎｓａ5（ＳＨＰ2）、ＲａｓＩｎＩ（ＨＲａｓ／ＫＲａｓ）、およびＲａｓＩｎＩＩ（ＨＲａｓ／ＫＲａｓ）、1Ｄ10（ＣＤＣ34）、1Ｄ7（ＣＯＰＳ5）、1Ｃ4（ＭＡＰ2Ｋ5）、2Ｃ12（ＭＡＰ2Ｋ5）、1Ｅ2（ＳＦ3Ａ1）、1Ｃ2（ＵＳＰ11）、1Ａ9（ＵＳＰ11）、Ｕｂｉ4（ユビキチン）、ＥＩ1．4．1（ＥＧＦＲ）、ＥＩ2．4．6（ＥＧＦＲ）、ＥＩ3．4．3（ＥＧＦＲ）、ＥＩ4．2．1（ＥＧＦＲ）、ＥＩ4．4．2（ＥＧＦＲ）、ＥＩ6．2．6（ＥＧＦＲ）、ＥＩ6．2．10（ＥＧＦＲ）、Ｅ246（ＥＧＦＲ）、Ｃ743（ＣＥＡ）、ＩＩＩａ8．2．6（ＦｃγＩＩａ）、ＩＩＩａ6．2．6（ＦｃγＩＩＩａ）、ｈＡ2．2．1（ｈＡ33）、ｈＡ2．2．2（ｈＡ33）、ｈＡ3．2．1（ｈＡ33）、ｈＡ3．2．3（ｈＡ33）、ｍＡ3．2．1（ｍＡ33）、ｍＡ3．2．2（ｍＡ33）、ｍＡ3．2．3（ｍＡ33）、ｍＡ3．2．4（ｍＡ33）、ｍＡ3．2．5（ｍＡ33）、Ａｌｂ3．2．1（ｈＡｌｂ）、ｍＩ2．2．1（ｍＩｇＧ）、ＨＡ4（ＡｂｌＳＨ2）、ＨＡ10（ＡｂｌＳＨ2）、ＨＡ16（ＡｂｌＳＨ2）、ＨＡ18（ＡｂｌＳＨ2）、159（ｖＥＧＦＲ）、ＭＵＣ16（ＭＳＬＮ）、Ｅ2＃3（ＥＲα／ＥＦ）、Ｅ2＃4（ＥＲα／ＥＦ）、Ｅ2＃5（ＥＲα／ＥＦ）、Ｅ2＃6（ＥＲα／ＥＦ）、Ｅ2＃7（ＥＲα／ＥＦ）、Ｅ2＃8（ＥＲα／ＥＦ）、Ｅ2＃9（ＥＲα／ＥＦ）、Ｅ2＃10（ＥＲα／ＥＦ）、Ｅ2＃11（ＥＲα／ＥＦ）、Ｅ2＃23（ＥＲα／ＥＦ）、Ｅ3＃2（ＥＲα／ＥＦ）、Ｅ3＃6（ＥＲα／ＥＦ）、ＯＨＴ＃31（ＥＲα／ＥＦ）、ＯＨＴ＃32（ＥＲα／ＥＦ）、ＯＨＴ＃33（ＥＲα／ＥＦ）、ＡＢ7－Ａ1（ＥＲα／ＥＦ）、ＡＢ7－Ｂ1（ＥＲα／ＥＦ）、ＭＢＰ－74（ＭＢＰ）、ＭＢＰ－76（ＭＢＰ）、ＭＢＰ－79（ＭＢＰ）、ｈＳＵＭＯ4－33（ｈＳＵＭＯ4）、ｈＳＵＭＯ－39（ｈＳＵＭＯ4）、ｙＳＵＭＯ－53（ｙＳＵＭＯ）、ｙＳＵＭＯ－56（ｙＳＵＭＯ）、ｙＳＵＭＯ－57（ｙＳＵＭＯ）、Ｔ14．25（ＴＮＦα）、Ｔ14．20（ＴＮＦα）、ＦＮｆｎ10－3ＪＣＬ14（ａｖβ3インテグリン）、1Ｃ9（Ｓｒｃ ＳＨ3）、1Ｆ11（Ｓｒｃ ＳＨ3）、1Ｆ10（Ｓｒｃ ＳＨ3）、2Ｇ10（Ｓｒｃ ＳＨ3）、2Ｂ2（Ｓｒｃ ＳＨ3）、1Ｅ3（Ｓｒｃ ＳＨ3）、Ｅ18（ＶＥＧＦＲ2）、Ｅ19（ＶＥＧＦＲ2）、Ｅ26（ＶＥＧＦＲ2）、Ｅ29（ＶＥＧＦＲ2）、ＦＧ4．2（リゾチーム）、ＦＧ4．1（リゾチーム）、2Ｌ4．1（リゾチーム）、ＢＦ4．1（リゾチーム）、ＢＦ4．9（リゾチーム）、ＢＦ4．4（リゾチーム）、ＢＦｓ1ｃ4．01（リゾチーム）、ＢＦｓ1ｃ4．07（リゾチーム）、ＢＦｓ3＿4．02（リゾチーム）、ＢＦｓ3＿4．06（リゾチーム）、ＢＦｓ3＿8．01（リゾチーム）、10Ｃ17Ｃ25（ホスホ－ＩκＢα）、Ｆｎ－Ｎ22（ＳＡＲＳ Ｎ）、Ｆｎ－Ｎ17（ＳＡＲＳ Ｎ）、ＦＮ－Ｎ10（ＳＡＲＳ Ｎ）、ｇＩ2．5．3Ｔ88Ｉ（ヤギＩｇＧ）、ｇＩ2．5．2（ヤギＩｇＧ）、ｇＩ2．5．4（ヤギＩｇＧ）、ｒＩ4．5．4（ウサギＩｇＧ）、ｒＩ4．3．1（ウサギＩｇＧ）、ｒＩ3．6．6（ウサギＩｇＧ）、ｒＩ4．3．4（ウサギＩｇＧ）、ｒＩ3．6．4（ウサギＩｇＧ）、およびｒＩ4．3．3（ウサギＩｇＧ）
からなる群から選択されるフィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン（ＦＮ3）モノボディである、本発明1038の方法。
[本発明1040]
前記基質が、蛍光タンパク質、ヒストンタンパク質、核局在化シグナル（ＮＬＳ）、Ｈ－Ｒａｓタンパク質、ＳＨＰ2タンパク質、Ｓｒｃ相同2ドメイン含有ホスファターゼ2（ＳＨＰ2）、β－ガラクトシダーゼ、ｇｐＤ、Ｈｓｐ70、ＭＢＰ、ＣＤＣ34、ＣＯＰＳ5、ＭＡＰ2Ｋ5、ＳＦ3Ａ1、ＵＳＰ11、ユビキチン、ＥＧＦＲ、ＣＥＡ、ＦｃγＩＩａ、ＦｃγＩＩＩａ、ｈＡ33、ｍＡ33、ｈＡｌｂ、ｍＩｇＧ、ＡｂｌＳＨ2、ｖＥＧＦＲ、ＭＳＬＮ、ＥＲα／ＥＦ、ｈＳＵＭＯ4、ｙＳＵＭＯ、ＴＮＦα、ａｖβ3インテグリン、Ｓｒｃ ＳＨ3、リゾチーム、ホスホ－ＩκＢα、ＳＡＲＳ Ｎ、ヤギＩｇＧ、ウサギＩｇＧ、翻訳後修飾タンパク質、フィブリン、ハンチンチン、腫瘍形成タンパク質、ｐ53、Ｒｂ、接着タンパク質、受容体、細胞周期タンパク質、チェックポイントタンパク質、ＨＦＥ、ＡＴＰ7Ｂ、プリオンタンパク質、ウイルスタンパク質、細菌タンパク質、寄生生物タンパク質、真菌タンパク質、ＤＮＡ結合タンパク質、代謝タンパク質、調節タンパク質、構造タンパク質、酵素、免疫原性タンパク質、自己免疫原性タンパク質、免疫原、抗原、および病原性タンパク質からなる群から選択される、本発明1028の方法。
[本発明1041]
前記基質が、緑色蛍光タンパク質、エメラルド蛍光タンパク質、ビーナス蛍光タンパク質、セルリアン蛍光タンパク質、および増強シアン蛍光タンパク質からなる群から選択される蛍光タンパク質である、本発明1028の方法。
[本発明1042]
前記リンカーが、前記標的指向ドメインと前記生体分子との間の結合の立体破壊を防止するのに十分な長さのポリペプチドリンカーである、本発明1028の方法。
[本発明1043]
前記生体分子が、癌、転移性癌、脳卒中、虚血、末梢血管疾患、アルコール性肝疾患、肝炎、肝硬変、パーキンソン病、アルツハイマー病、嚢胞性線維症糖尿病、ＡＬＳ、病原性疾患、特発性疾患、ウイルス性疾患、細菌性疾患、プリオン性疾患、真菌性疾患、寄生生物性疾患、関節炎、創傷治癒、免疫不全、炎症性疾患、再生不良性貧血、貧血、遺伝性障害、先天性障害、1型糖尿病、2型糖尿病、妊娠性糖尿病、高血糖症、代謝症候群、リポジストロフィー症候群、脂質異常症、インスリン抵抗性、レプチン抵抗性、アテローム性動脈硬化症、血管疾患、高コレステロール血症、高トリグリセリド血症、非アルコール性脂肪性肝疾患、体重過多、または肥満、ならびにこれらの任意の組み合わせに関連する、本発明1028の方法。
[本発明1044]
1つ以上のリガンドを発現する疾患細胞の試料を提供することと、
（ｉ）Ｅ3ユビキチンリガーゼ（Ｅ3）モチーフを含む分解ドメインと、（ｉｉ）前記分解ドメインを前記1つ以上のリガンドへと特異的に方向付けることができる標的指向ドメインであって、前記分解ドメインに対して異種である、標的指向ドメインと、（ｉｉｉ）前記分解ドメインを前記標的指向ドメインに結合させるリンカーとを含む複数のキメラ分子を提供することと、
前記疾患細胞が前記キメラ分子の非存在下で増殖することに失敗するのに有効な条件下で、前記試料を前記複数のキメラ分子と接触させることと、
前記キメラ分子のうちのどれが前記疾患細胞の増殖を可能にするかを決定することと、
前記決定に基づいて、前記キメラ分子に結合しかつ前記疾患細胞の増殖を可能にするリガンドを、前記疾患のバイオマーカーとして同定することと
を含む、疾患バイオマーカーについてスクリーニングする方法。
[本発明1045]
前記疾患が、癌、転移性癌、脳卒中、虚血、末梢血管疾患、アルコール性肝疾患、肝炎、肝硬変、パーキンソン病、アルツハイマー病、嚢胞性線維症糖尿病、ＡＬＳ、病原性疾患、特発性疾患、ウイルス性疾患、細菌性疾患、プリオン性疾患、真菌性疾患、寄生生物性疾患、関節炎、創傷治癒、免疫不全、炎症性疾患、再生不良性貧血、貧血、遺伝性障害、先天性障害、1型糖尿病、2型糖尿病、妊娠性糖尿病、高血糖症、代謝症候群、リポジストロフィー症候群、脂質異常症、インスリン抵抗性、レプチン抵抗性、アテローム性動脈硬化症、血管疾患、高コレステロール血症、高トリグリセリド血症、非アルコール性脂肪性肝疾患、体重過多、および肥満からなる群から選択される、本発明1044の方法。
[本発明1046]
前記分解ドメインが、細菌病原体である、本発明1044の方法。
[本発明1047]
前記細菌病原体が、シゲラ、サルモネラ、バチルス、バルトネラ、ボルデテラ、ボレリア、ブルセラ、カンピロバクター、クラミジアおよびクラミドフィラ、クロストリジウム、コリネバクテリウム、エンテロコッカス、エシェリキア、フランシセラ、ヘモフィルス、ヘリコバクター、レジオネラ、レプトスピラ、リステリア、マイコバクテリウム、マイコプラズマ、ナイセリア、シュードモナス、リケッチア、スタフィロコッカス、ストレプトコッカス、トレポネーマ、ウレアプラズマ、ビブリオ、ならびにエルシニアからなる群から選択される、本発明1046の方法。
[本発明1048]
前記分解ドメインが、細菌病原体由来であり、かつシゲラ・フレックスネリＥ3リガーゼ、ＳｓｐＨ1、ＳｓｐＨ2、ＳｌｒＰ、ＡｖｒＰｔｏＢ、ＬｕｂＸ、ＮｌｅＧ5－1、ＮｌｅＧ2－3、ＬｅｇＵ1、ＬｅｇＡＵ13、ＮＩｅＬ、ＳｏｐＡ、ＳｉｄＣ、ＸｏｐＬ、ＧｏｂＸ、ＶｉｒＦ、ＧＡＬＡ、ＡｎｋＢ、またはＳｉｄＥを含む、本発明1046の方法。
[本発明1049]
前記分解ドメインが、シゲラＩｐａＨタンパク質である、本発明1044の方法。
[本発明1050]
前記シゲラＩｐａＨタンパク質が、ＩｐａＨ9．8、ＩｐａＨ1．4、ＩｐａＨ2．5、ＩｐａＨ4．5、ＩｐａＨ7．8、ＩｐａＨ0887、ＩｐａＨ1389、ＩｐａＨ2022、ＩｐａＨ2202、ＩｐａＨ2610、およびＩｐａＨ0722からなる群から選択される、本発明1049の方法。
[本発明1051]
前記細菌病原体が、シゲラ・フレックスネリである場合である、本発明1046の方法。
[本発明1052]
前記標的指向ドメインが、モノボディ、フィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン（ＦＮ3）、抗体、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、組換え抗体、抗体フラグメント、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）2、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｔａｓｃＦｖ、ビス－ｓｃＦｖ、ｓｄＡｂ、ＶＨ、ＶＬ、Ｖｎａｒ、ｓｃＦｖＤ10、ｓｃＦｖ13Ｒ4、ｓｃＦｖＤ10、ヒト化抗体、キメラ抗体、相補決定領域（ＣＤＲ）、ＩｇＡ抗体、ＩｇＤ抗体、ＩｇＥ抗体、ＩｇＧ抗体、ＩｇＭ抗体、ナノボディ、イントラボディ、ユニボディ、ミニボディ、非抗体タンパク質骨格、アドネクチン、アフィボディおよびそれらの2ヘリックス変異体、アンチカリン、ラクダ科抗体、Ｖ Ｈ Ｈ、ノッチン、ＤＡＲＰｉｎ、またはＳｓｏｄ7ｄである、本発明1044の方法。
[本発明1053]
前記標的指向ドメインがモノボディであり、前記モノボディが、以下（括弧内に標的抗原を示す）：
ＧＳ2（ＧＦＰ）、Ｎｓａ5（ＳＨＰ2）、ＲａｓＩｎＩ（ＨＲａｓ／ＫＲａｓ）、およびＲａｓＩｎＩＩ（ＨＲａｓ／ＫＲａｓ）、1Ｄ10（ＣＤＣ34）、1Ｄ7（ＣＯＰＳ5）、1Ｃ4（ＭＡＰ2Ｋ5）、2Ｃ12（ＭＡＰ2Ｋ5）、1Ｅ2（ＳＦ3Ａ1）、1Ｃ2（ＵＳＰ11）、1Ａ9（ＵＳＰ11）、Ｕｂｉ4（ユビキチン）、ＥＩ1．4．1（ＥＧＦＲ）、ＥＩ2．4．6（ＥＧＦＲ）、ＥＩ3．4．3（ＥＧＦＲ）、ＥＩ4．2．1（ＥＧＦＲ）、ＥＩ4．4．2（ＥＧＦＲ）、ＥＩ6．2．6（ＥＧＦＲ）、ＥＩ6．2．10（ＥＧＦＲ）、Ｅ246（ＥＧＦＲ）、Ｃ743（ＣＥＡ）、ＩＩＩａ8．2．6（ＦｃγＩＩａ）、ＩＩＩａ6．2．6（ＦｃγＩＩＩａ）、ｈＡ2．2．1（ｈＡ33）、ｈＡ2．2．2（ｈＡ33）、ｈＡ3．2．1（ｈＡ33）、ｈＡ3．2．3（ｈＡ33）、ｍＡ3．2．1（ｍＡ33）、ｍＡ3．2．2（ｍＡ33）、ｍＡ3．2．3（ｍＡ33）、ｍＡ3．2．4（ｍＡ33）、ｍＡ3．2．5（ｍＡ33）、Ａｌｂ3．2．1（ｈＡｌｂ）、ｍＩ2．2．1（ｍＩｇＧ）、ＨＡ4（ＡｂｌＳＨ2）、ＨＡ10（ＡｂｌＳＨ2）、ＨＡ16（ＡｂｌＳＨ2）、ＨＡ18（ＡｂｌＳＨ2）、159（ｖＥＧＦＲ）、ＭＵＣ16（ＭＳＬＮ）、Ｅ2＃3（ＥＲα／ＥＦ）、Ｅ2＃4（ＥＲα／ＥＦ）、Ｅ2＃5（ＥＲα／ＥＦ）、Ｅ2＃6（ＥＲα／ＥＦ）、Ｅ2＃7（ＥＲα／ＥＦ）、Ｅ2＃8（ＥＲα／ＥＦ）、Ｅ2＃9（ＥＲα／ＥＦ）、Ｅ2＃10（ＥＲα／ＥＦ）、Ｅ2＃11（ＥＲα／ＥＦ）、Ｅ2＃23（ＥＲα／ＥＦ）、Ｅ3＃2（ＥＲα／ＥＦ）、Ｅ3＃6（ＥＲα／ＥＦ）、ＯＨＴ＃31（ＥＲα／ＥＦ）、ＯＨＴ＃32（ＥＲα／ＥＦ）、ＯＨＴ＃33（ＥＲα／ＥＦ）、ＡＢ7－Ａ1（ＥＲα／ＥＦ）、ＡＢ7－Ｂ1（ＥＲα／ＥＦ）、ＭＢＰ－74（ＭＢＰ）、ＭＢＰ－76（ＭＢＰ）、ＭＢＰ－79（ＭＢＰ）、ｈＳＵＭＯ4－33（ｈＳＵＭＯ4）、ｈＳＵＭＯ－39（ｈＳＵＭＯ4）、ｙＳＵＭＯ－53（ｙＳＵＭＯ）、ｙＳＵＭＯ－56（ｙＳＵＭＯ）、ｙＳＵＭＯ－57（ｙＳＵＭＯ）、Ｔ14．25（ＴＮＦα）、Ｔ14．20（ＴＮＦα）、ＦＮｆｎ10－3ＪＣＬ14（ａｖβ3インテグリン）、1Ｃ9（Ｓｒｃ ＳＨ3）、1Ｆ11（Ｓｒｃ ＳＨ3）、1Ｆ10（Ｓｒｃ ＳＨ3）、2Ｇ10（Ｓｒｃ ＳＨ3）、2Ｂ2（Ｓｒｃ ＳＨ3）、1Ｅ3（Ｓｒｃ ＳＨ3）、Ｅ18（ＶＥＧＦＲ2）、Ｅ19（ＶＥＧＦＲ2）、Ｅ26（ＶＥＧＦＲ2）、Ｅ29（ＶＥＧＦＲ2）、ＦＧ4．2（リゾチーム）、ＦＧ4．1（リゾチーム）、2Ｌ4．1（リゾチーム）、ＢＦ4．1（リゾチーム）、ＢＦ4．9（リゾチーム）、ＢＦ4．4（リゾチーム）、ＢＦｓ1ｃ4．01（リゾチーム）、ＢＦｓ1ｃ4．07（リゾチーム）、ＢＦｓ3＿4．02（リゾチーム）、ＢＦｓ3＿4．06（リゾチーム）、ＢＦｓ3＿8．01（リゾチーム）、10Ｃ17Ｃ25（ホスホ－ＩκＢα）、Ｆｎ－Ｎ22（ＳＡＲＳ Ｎ）、Ｆｎ－Ｎ17（ＳＡＲＳ Ｎ）、ＦＮ－Ｎ10（ＳＡＲＳ Ｎ）、ｇＩ2．5．3Ｔ88Ｉ（ヤギＩｇＧ）、ｇＩ2．5．2（ヤギＩｇＧ）、ｇＩ2．5．4（ヤギＩｇＧ）、ｒＩ4．5．4（ウサギＩｇＧ）、ｒＩ4．3．1（ウサギＩｇＧ）、ｒＩ3．6．6（ウサギＩｇＧ）、ｒＩ4．3．4（ウサギＩｇＧ）、ｒＩ3．6．4（ウサギＩｇＧ）、およびｒＩ4．3．3（ウサギＩｇＧ）
からなる群から選択されるフィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン（ＦＮ3）モノボディである、本発明1050の方法。

Claims (53)

  1. Ｅ３ユビキチンリガーゼ（Ｅ３）モチーフを含む分解ドメインと、
    前記分解ドメインを基質へと特異的に方向付けることができる標的指向ドメインであって、前記分解ドメインに対して異種である、標的指向ドメインと、
    前記分解ドメインを前記標的指向ドメインに結合させるリンカーと
    を含む、単離されたキメラ分子。
  2. 前記Ｅ３モチーフが、修飾結合領域を有しない前記Ｅ３モチーフと比較して前記基質への結合を阻害するまたは減少させる修飾結合領域を含む、請求項１に記載のキメラ分子。
  3. 前記修飾が、前記結合領域における変異または欠失である、請求項２に記載のキメラ分子。
  4. 前記Ｅ３モチーフが、前記基質のタンパク質分解を可能にする、請求項１に記載のキメラ分子。
  5. 前記Ｅ３モチーフが、細胞型特異的または組織特異的リガーゼ機能を保有する、請求項１に記載のキメラ分子。
  6. 前記リガーゼ機能が、細胞型特異的であり、前記細胞型は、皮膚細胞、筋肉細胞、上皮細胞、内皮細胞、幹細胞、臍帯血管細胞、角膜細胞、心筋細胞、大動脈細胞、角膜上皮細胞、体細胞、線維芽細胞、ケラチノサイト、メラノサイト、脂肪細胞、骨細胞、骨芽細胞、気道細胞、微小血管細胞、乳房細胞、血管細胞、軟骨細胞、胎盤細胞、肝細胞、膠細胞、表皮細胞、角膜輪部幹細胞、歯周幹細胞、骨髄間質細胞、ハイブリドーマ細胞、腎臓細胞、膵島、関節軟骨細胞、神経芽細胞、リンパ球、および赤血球からなる群から選択される、請求項５に記載のキメラ分子。
  7. 前記分解ドメインが細菌病原体由来である、請求項１に記載のキメラ分子。
  8. 前記細菌病原体が、シゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、バルトネラ（Ｂａｒｔｏｎｅｌｌａ）、ボルデテラ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ）、ボレリア（Ｂｏｒｒｅｌｉａ）、ブルセラ（Ｂｒｕｃｅｌｌａ）、カンピロバクター（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、クラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ）およびクラミドフィラ（Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ）、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、エンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、フランシセラ（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ）、ヘモフィルス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）、ヘリコバクター（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ）、レジオネラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）、レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）、リステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）、マイコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、マイコプラズマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）、ナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、リケッチア（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ）、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、トレポネーマ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ）、ウレアプラズマ（Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ）、ビブリオ（Ｖｉｂｒｉｏ）、ならびにエルシニア（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）からなる群から選択される、請求項７に記載のキメラ分子。
  9. 前記分解ドメインが、細菌病原体由来であり、かつシゲラ・フレックスネリ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｆｌｅｘｎｅｒｉ）Ｅ３リガーゼ、ＳｓｐＨ１、ＳｓｐＨ２、ＳｌｒＰ、ＡｖｒＰｔｏＢ、ＬｕｂＸ、ＮｌｅＧ５－１、ＮｌｅＧ２－３、ＬｅｇＵ１、ＬｅｇＡＵ１３、ＮＩｅＬ、ＳｏｐＡ、ＳｉｄＣ、ＸｏｐＬ、ＧｏｂＸ、ＶｉｒＦ、ＧＡＬＡ、ＡｎｋＢ、またはＳｉｄＥを含む、請求項７に記載のキメラ分子。
  10. 前記分解ドメインが、シゲラＩｐａＨタンパク質である、請求項１に記載のキメラ分子。
  11. 前記シゲラＩｐａＨタンパク質が、ＩｐａＨ９．８、ＩｐａＨ１．４、ＩｐａＨ２．５、ＩｐａＨ４．５、ＩｐａＨ７．８、ＩｐａＨ０８８７、ＩｐａＨ１３８９、ＩｐａＨ２０２２、ＩｐａＨ２２０２、ＩｐａＨ２６１０、およびＩｐａＨ０７２２からなる群から選択される、請求項１０に記載のキメラ分子。
  12. 前記細菌病原体がシゲラ・フレックスネリである場合である、請求項７に記載のキメラ分子。
  13. 前記標的指向ドメインが、モノボディ、フィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン（ＦＮ３）抗体、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、組換え抗体、抗体フラグメント、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｔａｓｃＦｖ、ビス－ｓｃＦｖ、ｓｄＡｂ、ＶＨ、ＶＬ、Ｖｎａｒ、ｓｃＦｖＤ１０、ｓｃＦｖ１３Ｒ４、ｓｃＦｖＤ１０、ヒト化抗体、キメラ抗体、相補性決定領域（ＣＤＲ）、ＩｇＡ抗体、ＩｇＤ抗体、ＩｇＥ抗体、ＩｇＧ抗体、ＩｇＭ抗体、ナノボディ、イントラボディ、ユニボディ、ミニボディ、非抗体タンパク質骨格、アドネクチン、アフィボディおよびそれらの２ヘリックス変異体、アンチカリン、ラクダ科抗体、ＶＨＨ、ノッチン（ｋｎｏｔｔｉｎ）、ＤＡＲＰｉｎ、またはＳｓｏ７ｄである、請求項１に記載のキメラ分子。
  14. 前記標的指向ドメインがモノボディであり、前記モノボディが、以下（括弧内に標的抗原を示す）：
    ＧＳ２（ＧＦＰ）、Ｎｓａ５（ＳＨＰ２）、ＲａｓＩｎＩ（ＨＲａｓ／ＫＲａｓ）、およびＲａｓＩｎＩＩ（ＨＲａｓ／ＫＲａｓ）、１Ｄ１０（ＣＤＣ３４）、１Ｄ７（ＣＯＰＳ５）、１Ｃ４（ＭＡＰ２Ｋ５）、２Ｃ１２（ＭＡＰ２Ｋ５）、１Ｅ２（ＳＦ３Ａ１）、１Ｃ２（ＵＳＰ１１）、１Ａ９（ＵＳＰ１１）、Ｕｂｉ４（ユビキチン）、ＥＩ１．４．１（ＥＧＦＲ）、ＥＩ２．４．６（ＥＧＦＲ）、ＥＩ３．４．３（ＥＧＦＲ）、ＥＩ４．２．１（ＥＧＦＲ）、ＥＩ４．４．２（ＥＧＦＲ）、ＥＩ６．２．６（ＥＧＦＲ）、ＥＩ６．２．１０（ＥＧＦＲ）、Ｅ２４６（ＥＧＦＲ）、Ｃ７４３（ＣＥＡ）、ＩＩＩａ８．２．６（ＦｃγＩＩａ）、ＩＩＩａ６．２．６（ＦｃγＩＩＩａ）、ｈＡ２．２．１（ｈＡ３３）、ｈＡ２．２．２（ｈＡ３３）、ｈＡ３．２．１（ｈＡ３３）、ｈＡ３．２．３（ｈＡ３３）、ｍＡ３．２．１（ｍＡ３３）、ｍＡ３．２．２（ｍＡ３３）、ｍＡ３．２．３（ｍＡ３３）、ｍＡ３．２．４（ｍＡ３３）、ｍＡ３．２．５（ｍＡ３３）、Ａｌｂ３．２．１（ｈＡｌｂ）、ｍＩ２．２．１（ｍＩｇＧ）、ＨＡ４（ＡｂｌＳＨ２）、ＨＡ１０（ＡｂｌＳＨ２）、ＨＡ１６（ＡｂｌＳＨ２）、ＨＡ１８（ＡｂｌＳＨ２）、１５９（ｖＥＧＦＲ）、ＭＵＣ１６（ＭＳＬＮ）、Ｅ２＃３（ＥＲα／ＥＦ）、Ｅ２＃４（ＥＲα／ＥＦ）、Ｅ２＃５（ＥＲα／ＥＦ）、Ｅ２＃６（ＥＲα／ＥＦ）、Ｅ２＃７（ＥＲα／ＥＦ）、Ｅ２＃８（ＥＲα／ＥＦ）、Ｅ２＃９（ＥＲα／ＥＦ）、Ｅ２＃１０（ＥＲα／ＥＦ）、Ｅ２＃１１（ＥＲα／ＥＦ）、Ｅ２＃２３（ＥＲα／ＥＦ）、Ｅ３＃２（ＥＲα／ＥＦ）、Ｅ３＃６（ＥＲα／ＥＦ）、ＯＨＴ＃３１（ＥＲα／ＥＦ）、ＯＨＴ＃３２（ＥＲα／ＥＦ）、ＯＨＴ＃３３（ＥＲα／ＥＦ）、ＡＢ７－Ａ１（ＥＲα／ＥＦ）、ＡＢ７－Ｂ１（ＥＲα／ＥＦ）、ＭＢＰ－７４（ＭＢＰ）、ＭＢＰ－７６（ＭＢＰ）、ＭＢＰ－７９（ＭＢＰ）、ｈＳＵＭＯ４－３３（ｈＳＵＭＯ４）、ｈＳＵＭＯ－３９（ｈＳＵＭＯ４）、ｙＳＵＭＯ－５３（ｙＳＵＭＯ）、ｙＳＵＭＯ－５６（ｙＳＵＭＯ）、ｙＳＵＭＯ－５７（ｙＳＵＭＯ）、Ｔ１４．２５（ＴＮＦα）、Ｔ１４．２０（ＴＮＦα）、ＦＮｆｎ１０－３ＪＣＬ１４（ａｖβ３インテグリン）、１Ｃ９（Ｓｒｃ ＳＨ３）、１Ｆ１１（Ｓｒｃ ＳＨ３）、１Ｆ１０（Ｓｒｃ ＳＨ３）、２Ｇ１０（Ｓｒｃ ＳＨ３）、２Ｂ２（Ｓｒｃ ＳＨ３）、１Ｅ３（Ｓｒｃ ＳＨ３）、Ｅ１８（ＶＥＧＦＲ２）、Ｅ１９（ＶＥＧＦＲ２）、Ｅ２６（ＶＥＧＦＲ２）、Ｅ２９（ＶＥＧＦＲ２）、ＦＧ４．２（リゾチーム）、ＦＧ４．１（リゾチーム）、２Ｌ４．１（リゾチーム）、ＢＦ４．１（リゾチーム）、ＢＦ４．９（リゾチーム）、ＢＦ４．４（リゾチーム）、ＢＦｓ１ｃ４．０１（リゾチーム）、ＢＦｓ１ｃ４．０７（リゾチーム）、ＢＦｓ３＿４．０２（リゾチーム）、ＢＦｓ３＿４．０６（リゾチーム）、ＢＦｓ３＿８．０１（リゾチーム）、１０Ｃ１７Ｃ２５（ホスホ－ＩκＢα）、Ｆｎ－Ｎ２２（ＳＡＲＳ Ｎ）、Ｆｎ－Ｎ１７（ＳＡＲＳ Ｎ）、ＦＮ－Ｎ１０（ＳＡＲＳ Ｎ）、ｇＩ２．５．３Ｔ８８Ｉ（ヤギＩｇＧ）、ｇＩ２．５．２（ヤギＩｇＧ）、ｇＩ２．５．４（ヤギＩｇＧ）、ｒＩ４．５．４（ウサギＩｇＧ）、ｒＩ４．３．１（ウサギＩｇＧ）、ｒＩ３．６．６（ウサギＩｇＧ）、ｒＩ４．３．４（ウサギＩｇＧ）、ｒＩ３．６．４（ウサギＩｇＧ）、およびｒＩ４．３．３（ウサギＩｇＧ）
    からなる群から選択されるフィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン（ＦＮ３）モノボディである、請求項１３に記載のキメラ分子。
  15. 前記基質が、蛍光タンパク質、ヒストンタンパク質、核局在化シグナル（ＮＬＳ）、Ｈ－Ｒａｓタンパク質、Ｓｒｃ相同２ドメイン含有ホスファターゼ２（ＳＨＰ２）、β－ガラクトシダーゼ、ｇｐＤ、Ｈｓｐ７０、ＭＢＰ、ＣＤＣ３４、ＣＯＰＳ５、ＭＡＰ２Ｋ５、ＳＦ３Ａ１、ＵＳＰ１１、ユビキチン、ＥＧＦＲ、ＣＥＡ、ＦｃγＩＩａ、ＦｃγＩＩＩａ、ｈＡ３３、ｍＡ３３、ｈＡｌｂ、ｍＩｇＧ、ＡｂｌＳＨ２、ｖＥＧＦＲ、ＭＳＬＮ、ＥＲα／ＥＦ、ｈＳＵＭＯ４、ｙＳＵＭＯ、ＴＮＦα、ａｖβ３インテグリン、ＳｒｃＳＨ３、リゾチーム、ホスホ－ＩκＢα、ＳＡＲＳ Ｎ、ヤギＩｇＧ、ウサギＩｇＧ、翻訳後修飾タンパク質、フィブリン、ハンチンチン、腫瘍形成タンパク質、ｐ５３、Ｒｂ、接着タンパク質、受容体、細胞周期タンパク質、チェックポイントタンパク質、ＨＦＥ、ＡＴＰ７Ｂ、プリオンタンパク質、ウイルスタンパク質、細菌タンパク質、寄生生物タンパク質、真菌タンパク質、ＤＮＡ結合タンパク質、代謝タンパク質、調節タンパク質、構造タンパク質、酵素、免疫原性タンパク質、自己免疫原性タンパク質、免疫原、抗原、および病原性タンパク質からなる群から選択される、請求項１に記載のキメラ分子。
  16. 前記基質が、緑色蛍光タンパク質、エメラルド蛍光タンパク質、ビーナス蛍光タンパク質、セルリアン蛍光タンパク質、および増強シアン蛍光タンパク質からなる群から選択される蛍光タンパク質である、請求項１に記載のキメラ分子。
  17. 前記標的指向ドメインが、非天然基質に結合する、請求項１に記載のキメラ分子。
  18. 請求項１に記載の単離されたキメラ分子をコードするｍＲＮＡを提供することと、
    １つ以上のポリアデノシン結合タンパク質（「ＰＡＢＰ」）を提供することと、
    前記ｍＲＮＡおよび前記１つ以上のＰＡＢＰからリボヌクレオタンパク質複合体をアセンブルすることと
    を含む、リボヌクレオタンパク質を形成する方法。
  19. 前記ｍＲＮＡが、３’末端ポリアデノシン（ポリＡ）テールを含む、請求項１８に記載の方法。
  20. 請求項１に記載のキメラ分子と、
    薬学的に許容される担体と
    を含む、組成物。
  21. 抗炎症剤、抗糖尿病剤、脂質低下剤、化学療法剤、抗ウイルス剤、抗生物質、代謝剤、小分子阻害剤、プロテインキナーゼ阻害剤、アジュバント、アポトーシス剤、増殖剤、および臓器親和性標的指向剤、ならびにこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される第２の薬剤をさらに含む、請求項２０に記載の組成物。
  22. 疾患を有する対象を選択することと、
    請求項２０に記載の組成物を前記対象に投与して、前記対象に、前記疾患に罹患していない対象と比較して、前記基質の増加した発現レベルを与えることと
    を含む、疾患を治療する方法。
  23. 前記疾患が、癌、転移性癌、脳卒中、虚血、末梢血管疾患、アルコール性肝疾患、肝炎、肝硬変、パーキンソン病、アルツハイマー病、嚢胞性線維症糖尿病、ＡＬＳ、病原性疾患、特発性疾患、ウイルス性疾患、細菌性疾患、プリオン性疾患、真菌性疾患、寄生生物性疾患、関節炎、創傷治癒、免疫不全、炎症性疾患、再生不良性貧血、貧血、遺伝性障害、先天性障害、１型糖尿病、２型糖尿病、妊娠性糖尿病、高血糖症、代謝症候群、リポジストロフィー症候群、脂質異常症、インスリン抵抗性、レプチン抵抗性、アテローム性動脈硬化症、血管疾患、高コレステロール血症、高トリグリセリド血症、非アルコール性脂肪性肝疾患、体重過多、および肥満からなる群から選択される、請求項２２に記載の方法。
  24. 前記投与が、経口的に、非経口的に、皮下に、静脈内に、筋肉内に、腹腔内に、鼻腔内滴下により、移植により、腔内もしくは膀胱内滴下により、眼内に、動脈内に、病変内に、経皮的に、または粘膜への適用により行われる、請求項２２に記載の方法。
  25. サイレンシングさせる基質を選択することと、
    請求項１に記載のキメラ分子を提供することと、
    基質－分子複合体の形成を可能にするのに有効な条件下で、前記基質を前記キメラ分子と接触させることであって、前記複合体が、前記サイレンシングさせる基質の分解を媒介する、接触させることと
    を含む、基質サイレンシングのための方法。
  26. 前記基質が、蛍光タンパク質、ヒストンタンパク質、核局在化シグナル（ＮＬＳ）、Ｈ－Ｒａｓタンパク質、ＳＨＰ２タンパク質、Ｓｒｃ相同２ドメイン含有ホスファターゼ２（ＳＨＰ２）、β－ガラクトシダーゼ、ｇｐＤ、Ｈｓｐ７０、ＭＢＰ、ＣＤＣ３４、ＣＯＰＳ５、ＭＡＰ２Ｋ５、ＳＦ３Ａ１、ＵＳＰ１１、ユビキチン、ＥＧＦＲ、ＣＥＡ、ＦｃγＩＩａ、ＦｃγＩＩＩａ、ｈＡ３３、ｍＡ３３、ｈＡｌｂ、ｍＩｇＧ、ＡｂｌＳＨ２、ｖＥＧＦＲ、ＭＳＬＮ、ＥＲα／ＥＦ、ｈＳＵＭＯ４、ｙＳＵＭＯ、ＴＮＦα、ａｖβ３インテグリン、ＳｒｃＳＨ３、リゾチーム、ホスホ－ＩκＢα、ＳＡＲＳ Ｎ、ヤギＩｇＧ、ウサギＩｇＧ、翻訳後修飾タンパク質、フィブリン、ハンチンチン、腫瘍形成タンパク質、ｐ５３、Ｒｂ、接着タンパク質、受容体、細胞周期タンパク質、チェックポイントタンパク質、ＨＦＥ、ＡＴＰ７Ｂ、プリオンタンパク質、ウイルスタンパク質、細菌タンパク質、寄生生物タンパク質、真菌タンパク質、ＤＮＡ結合タンパク質、代謝タンパク質、調節タンパク質、構造タンパク質、酵素、免疫原性タンパク質、自己免疫原性タンパク質、免疫原、抗原、および病原性タンパク質からなる群から選択される、請求項２５に記載の方法。
  27. 前記基質が、緑色蛍光タンパク質、エメラルド蛍光タンパク質、ビーナス蛍光タンパク質、セルリアン蛍光タンパク質、および増強シアン蛍光タンパク質からなる群から選択される蛍光タンパク質である、請求項２５に記載の方法。
  28. その存在が疾患状態を媒介する生体分子を提供することと、
    （ｉ）Ｅ３ユビキチンリガーゼ（Ｅ３）モチーフを含む分解ドメインと、（ｉｉ）前記分解ドメインを前記生体分子へと特異的に方向付けることができる標的指向ドメインであって、前記分解ドメインに対して異種である、標的指向ドメインと、（ｉｉｉ）前記分解ドメインを前記標的指向ドメインに結合させるリンカーとを含む試験剤を提供することと、
    前記試験剤が前記生体分子の分解を促進するのに有効な条件下で、前記生体分子を前記試験剤と接触させることと、
    前記接触の結果としての前記生体分子のレベルを決定することと、
    前記決定に基づいて、前記生体分子のレベルを低下させる前記試験剤を、前記疾患に対する治療有効性の候補であるとして同定することと
    を含む、疾患に対する治療有効性について薬剤をスクリーニングする方法。
  29. 前記同定が、前記疾患に罹患していない対象における標準生体分子レベルに関して行われる、請求項２８に記載の方法。
  30. 前記同定が、前記接触がない前記生体分子レベルに関して行われる、請求項２８に記載の方法。
  31. 複数の試験剤を用いて行われる、請求項２８に記載の方法。
  32. 前記分解ドメインが細菌病原体である、請求項２８に記載の方法。
  33. 前記細菌病原体が、シゲラ、サルモネラ、バチルス、バルトネラ、ボルデテラ、ボレリア、ブルセラ、カンピロバクター、クラミジアおよびクラミドフィラ、クロストリジウム、コリネバクテリウム、エンテロコッカス、エシェリキア、フランシセラ、ヘモフィルス、ヘリコバクター、レジオネラ、レプトスピラ、リステリア、マイコバクテリウム、マイコプラズマ、ナイセリア、シュードモナス、リケッチア、スタフィロコッカス、ストレプトコッカス、トレポネーマ、ウレアプラズマ、ビブリオ、ならびにエルシニアからなる群から選択される、請求項３２に記載の方法。
  34. 前記分解ドメインが、細菌病原体由来であり、かつシゲラ・フレックスネリＥ３リガーゼ、ＳｓｐＨ１、ＳｓｐＨ２、ＳｌｒＰ、ＡｖｒＰｔｏＢ、ＬｕｂＸ、ＮｌｅＧ５－１、ＮｌｅＧ２－３、ＬｅｇＵ１、ＬｅｇＡＵ１３、ＮＩｅＬ、ＳｏｐＡ、ＳｉｄＣ、ＸｏｐＬ、ＧｏｂＸ、ＶｉｒＦ、ＧＡＬＡ、ＡｎｋＢ、またはＳｉｄＥを含む、請求項３２に記載の方法。
  35. 前記分解ドメインが、シゲラＩｐａＨタンパク質である、請求項２８に記載の方法。
  36. 前記シゲラＩｐａＨタンパク質が、ＩｐａＨ９．８、ＩｐａＨ１．４、ＩｐａＨ２．５、ＩｐａＨ４．５、ＩｐａＨ７．８、ＩｐａＨ０８８７、ＩｐａＨ１３８９、ＩｐａＨ２０２２、ＩｐａＨ２２０２、ＩｐａＨ２６１０、およびＩｐａＨ０７２２からなる群から選択される、請求項３５に記載の方法。
  37. 前記細菌病原体が、シゲラ・フレックスネリである場合である、請求項３２に記載の方法。
  38. 前記標的指向ドメインが、モノボディ、フィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン（ＦＮ３）、抗体、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、組換え抗体、抗体フラグメント、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｔａｓｃＦｖ、ビス－ｓｃＦｖ、ｓｄＡｂ、ＶＨ、ＶＬ、Ｖｎａｒ、ｓｃＦｖＤ１０、ｓｃＦｖ１３Ｒ４、ｓｃＦｖＤ１０、ヒト化抗体、キメラ抗体、相補性決定領域（ＣＤＲ）、ＩｇＡ抗体、ＩｇＤ抗体、ＩｇＥ抗体、ＩｇＧ抗体、ＩｇＭ抗体、ナノボディ、イントラボディ、ユニボディ、ミニボディ、非抗体タンパク質骨格、アドネクチン、アフィボディおよびそれらの２ヘリックス変異体、アンチカリン、ラクダ科抗体、ＶＨＨ、ノッチン、ＤＡＲＰｉｎ、またはＳｓｏ７ｄである、請求項２８に記載の方法。
  39. 前記標的指向ドメインがモノボディであり、前記モノボディが、以下（括弧内に標的抗原を示す）：
    ＧＳ２（ＧＦＰ）、Ｎｓａ５（ＳＨＰ２）、ＲａｓＩｎＩ（ＨＲａｓ／ＫＲａｓ）、およびＲａｓＩｎＩＩ（ＨＲａｓ／ＫＲａｓ）、１Ｄ１０（ＣＤＣ３４）、１Ｄ７（ＣＯＰＳ５）、１Ｃ４（ＭＡＰ２Ｋ５）、２Ｃ１２（ＭＡＰ２Ｋ５）、１Ｅ２（ＳＦ３Ａ１）、１Ｃ２（ＵＳＰ１１）、１Ａ９（ＵＳＰ１１）、Ｕｂｉ４（ユビキチン）、ＥＩ１．４．１（ＥＧＦＲ）、ＥＩ２．４．６（ＥＧＦＲ）、ＥＩ３．４．３（ＥＧＦＲ）、ＥＩ４．２．１（ＥＧＦＲ）、ＥＩ４．４．２（ＥＧＦＲ）、ＥＩ６．２．６（ＥＧＦＲ）、ＥＩ６．２．１０（ＥＧＦＲ）、Ｅ２４６（ＥＧＦＲ）、Ｃ７４３（ＣＥＡ）、ＩＩＩａ８．２．６（ＦｃγＩＩａ）、ＩＩＩａ６．２．６（ＦｃγＩＩＩａ）、ｈＡ２．２．１（ｈＡ３３）、ｈＡ２．２．２（ｈＡ３３）、ｈＡ３．２．１（ｈＡ３３）、ｈＡ３．２．３（ｈＡ３３）、ｍＡ３．２．１（ｍＡ３３）、ｍＡ３．２．２（ｍＡ３３）、ｍＡ３．２．３（ｍＡ３３）、ｍＡ３．２．４（ｍＡ３３）、ｍＡ３．２．５（ｍＡ３３）、Ａｌｂ３．２．１（ｈＡｌｂ）、ｍＩ２．２．１（ｍＩｇＧ）、ＨＡ４（ＡｂｌＳＨ２）、ＨＡ１０（ＡｂｌＳＨ２）、ＨＡ１６（ＡｂｌＳＨ２）、ＨＡ１８（ＡｂｌＳＨ２）、１５９（ｖＥＧＦＲ）、ＭＵＣ１６（ＭＳＬＮ）、Ｅ２＃３（ＥＲα／ＥＦ）、Ｅ２＃４（ＥＲα／ＥＦ）、Ｅ２＃５（ＥＲα／ＥＦ）、Ｅ２＃６（ＥＲα／ＥＦ）、Ｅ２＃７（ＥＲα／ＥＦ）、Ｅ２＃８（ＥＲα／ＥＦ）、Ｅ２＃９（ＥＲα／ＥＦ）、Ｅ２＃１０（ＥＲα／ＥＦ）、Ｅ２＃１１（ＥＲα／ＥＦ）、Ｅ２＃２３（ＥＲα／ＥＦ）、Ｅ３＃２（ＥＲα／ＥＦ）、Ｅ３＃６（ＥＲα／ＥＦ）、ＯＨＴ＃３１（ＥＲα／ＥＦ）、ＯＨＴ＃３２（ＥＲα／ＥＦ）、ＯＨＴ＃３３（ＥＲα／ＥＦ）、ＡＢ７－Ａ１（ＥＲα／ＥＦ）、ＡＢ７－Ｂ１（ＥＲα／ＥＦ）、ＭＢＰ－７４（ＭＢＰ）、ＭＢＰ－７６（ＭＢＰ）、ＭＢＰ－７９（ＭＢＰ）、ｈＳＵＭＯ４－３３（ｈＳＵＭＯ４）、ｈＳＵＭＯ－３９（ｈＳＵＭＯ４）、ｙＳＵＭＯ－５３（ｙＳＵＭＯ）、ｙＳＵＭＯ－５６（ｙＳＵＭＯ）、ｙＳＵＭＯ－５７（ｙＳＵＭＯ）、Ｔ１４．２５（ＴＮＦα）、Ｔ１４．２０（ＴＮＦα）、ＦＮｆｎ１０－３ＪＣＬ１４（ａｖβ３インテグリン）、１Ｃ９（Ｓｒｃ ＳＨ３）、１Ｆ１１（Ｓｒｃ ＳＨ３）、１Ｆ１０（Ｓｒｃ ＳＨ３）、２Ｇ１０（Ｓｒｃ ＳＨ３）、２Ｂ２（Ｓｒｃ ＳＨ３）、１Ｅ３（Ｓｒｃ ＳＨ３）、Ｅ１８（ＶＥＧＦＲ２）、Ｅ１９（ＶＥＧＦＲ２）、Ｅ２６（ＶＥＧＦＲ２）、Ｅ２９（ＶＥＧＦＲ２）、ＦＧ４．２（リゾチーム）、ＦＧ４．１（リゾチーム）、２Ｌ４．１（リゾチーム）、ＢＦ４．１（リゾチーム）、ＢＦ４．９（リゾチーム）、ＢＦ４．４（リゾチーム）、ＢＦｓ１ｃ４．０１（リゾチーム）、ＢＦｓ１ｃ４．０７（リゾチーム）、ＢＦｓ３＿４．０２（リゾチーム）、ＢＦｓ３＿４．０６（リゾチーム）、ＢＦｓ３＿８．０１（リゾチーム）、１０Ｃ１７Ｃ２５（ホスホ－ＩκＢα）、Ｆｎ－Ｎ２２（ＳＡＲＳ Ｎ）、Ｆｎ－Ｎ１７（ＳＡＲＳ Ｎ）、ＦＮ－Ｎ１０（ＳＡＲＳ Ｎ）、ｇＩ２．５．３Ｔ８８Ｉ（ヤギＩｇＧ）、ｇＩ２．５．２（ヤギＩｇＧ）、ｇＩ２．５．４（ヤギＩｇＧ）、ｒＩ４．５．４（ウサギＩｇＧ）、ｒＩ４．３．１（ウサギＩｇＧ）、ｒＩ３．６．６（ウサギＩｇＧ）、ｒＩ４．３．４（ウサギＩｇＧ）、ｒＩ３．６．４（ウサギＩｇＧ）、およびｒＩ４．３．３（ウサギＩｇＧ）
    からなる群から選択されるフィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン（ＦＮ３）モノボディである、請求項３８に記載の方法。
  40. 前記基質が、蛍光タンパク質、ヒストンタンパク質、核局在化シグナル（ＮＬＳ）、Ｈ－Ｒａｓタンパク質、ＳＨＰ２タンパク質、Ｓｒｃ相同２ドメイン含有ホスファターゼ２（ＳＨＰ２）、β－ガラクトシダーゼ、ｇｐＤ、Ｈｓｐ７０、ＭＢＰ、ＣＤＣ３４、ＣＯＰＳ５、ＭＡＰ２Ｋ５、ＳＦ３Ａ１、ＵＳＰ１１、ユビキチン、ＥＧＦＲ、ＣＥＡ、ＦｃγＩＩａ、ＦｃγＩＩＩａ、ｈＡ３３、ｍＡ３３、ｈＡｌｂ、ｍＩｇＧ、ＡｂｌＳＨ２、ｖＥＧＦＲ、ＭＳＬＮ、ＥＲα／ＥＦ、ｈＳＵＭＯ４、ｙＳＵＭＯ、ＴＮＦα、ａｖβ３インテグリン、Ｓｒｃ ＳＨ３、リゾチーム、ホスホ－ＩκＢα、ＳＡＲＳ Ｎ、ヤギＩｇＧ、ウサギＩｇＧ、翻訳後修飾タンパク質、フィブリン、ハンチンチン、腫瘍形成タンパク質、ｐ５３、Ｒｂ、接着タンパク質、受容体、細胞周期タンパク質、チェックポイントタンパク質、ＨＦＥ、ＡＴＰ７Ｂ、プリオンタンパク質、ウイルスタンパク質、細菌タンパク質、寄生生物タンパク質、真菌タンパク質、ＤＮＡ結合タンパク質、代謝タンパク質、調節タンパク質、構造タンパク質、酵素、免疫原性タンパク質、自己免疫原性タンパク質、免疫原、抗原、および病原性タンパク質からなる群から選択される、請求項２８に記載の方法。
  41. 前記基質が、緑色蛍光タンパク質、エメラルド蛍光タンパク質、ビーナス蛍光タンパク質、セルリアン蛍光タンパク質、および増強シアン蛍光タンパク質からなる群から選択される蛍光タンパク質である、請求項２８に記載の方法。
  42. 前記リンカーが、前記標的指向ドメインと前記生体分子との間の結合の立体破壊を防止するのに十分な長さのポリペプチドリンカーである、請求項２８に記載の方法。
  43. 前記生体分子が、癌、転移性癌、脳卒中、虚血、末梢血管疾患、アルコール性肝疾患、肝炎、肝硬変、パーキンソン病、アルツハイマー病、嚢胞性線維症糖尿病、ＡＬＳ、病原性疾患、特発性疾患、ウイルス性疾患、細菌性疾患、プリオン性疾患、真菌性疾患、寄生生物性疾患、関節炎、創傷治癒、免疫不全、炎症性疾患、再生不良性貧血、貧血、遺伝性障害、先天性障害、１型糖尿病、２型糖尿病、妊娠性糖尿病、高血糖症、代謝症候群、リポジストロフィー症候群、脂質異常症、インスリン抵抗性、レプチン抵抗性、アテローム性動脈硬化症、血管疾患、高コレステロール血症、高トリグリセリド血症、非アルコール性脂肪性肝疾患、体重過多、または肥満、ならびにこれらの任意の組み合わせに関連する、請求項２８に記載の方法。
  44. １つ以上のリガンドを発現する疾患細胞の試料を提供することと、
    （ｉ）Ｅ３ユビキチンリガーゼ（Ｅ３）モチーフを含む分解ドメインと、（ｉｉ）前記分解ドメインを前記１つ以上のリガンドへと特異的に方向付けることができる標的指向ドメインであって、前記分解ドメインに対して異種である、標的指向ドメインと、（ｉｉｉ）前記分解ドメインを前記標的指向ドメインに結合させるリンカーとを含む複数のキメラ分子を提供することと、
    前記疾患細胞が前記キメラ分子の非存在下で増殖することに失敗するのに有効な条件下で、前記試料を前記複数のキメラ分子と接触させることと、
    前記キメラ分子のうちのどれが前記疾患細胞の増殖を可能にするかを決定することと、
    前記決定に基づいて、前記キメラ分子に結合しかつ前記疾患細胞の増殖を可能にするリガンドを、前記疾患のバイオマーカーとして同定することと
    を含む、疾患バイオマーカーについてスクリーニングする方法。
  45. 前記疾患が、癌、転移性癌、脳卒中、虚血、末梢血管疾患、アルコール性肝疾患、肝炎、肝硬変、パーキンソン病、アルツハイマー病、嚢胞性線維症糖尿病、ＡＬＳ、病原性疾患、特発性疾患、ウイルス性疾患、細菌性疾患、プリオン性疾患、真菌性疾患、寄生生物性疾患、関節炎、創傷治癒、免疫不全、炎症性疾患、再生不良性貧血、貧血、遺伝性障害、先天性障害、１型糖尿病、２型糖尿病、妊娠性糖尿病、高血糖症、代謝症候群、リポジストロフィー症候群、脂質異常症、インスリン抵抗性、レプチン抵抗性、アテローム性動脈硬化症、血管疾患、高コレステロール血症、高トリグリセリド血症、非アルコール性脂肪性肝疾患、体重過多、および肥満からなる群から選択される、請求項４４に記載の方法。
  46. 前記分解ドメインが、細菌病原体である、請求項４４に記載の方法。
  47. 前記細菌病原体が、シゲラ、サルモネラ、バチルス、バルトネラ、ボルデテラ、ボレリア、ブルセラ、カンピロバクター、クラミジアおよびクラミドフィラ、クロストリジウム、コリネバクテリウム、エンテロコッカス、エシェリキア、フランシセラ、ヘモフィルス、ヘリコバクター、レジオネラ、レプトスピラ、リステリア、マイコバクテリウム、マイコプラズマ、ナイセリア、シュードモナス、リケッチア、スタフィロコッカス、ストレプトコッカス、トレポネーマ、ウレアプラズマ、ビブリオ、ならびにエルシニアからなる群から選択される、請求項４６に記載の方法。
  48. 前記分解ドメインが、細菌病原体由来であり、かつシゲラ・フレックスネリＥ３リガーゼ、ＳｓｐＨ１、ＳｓｐＨ２、ＳｌｒＰ、ＡｖｒＰｔｏＢ、ＬｕｂＸ、ＮｌｅＧ５－１、ＮｌｅＧ２－３、ＬｅｇＵ１、ＬｅｇＡＵ１３、ＮＩｅＬ、ＳｏｐＡ、ＳｉｄＣ、ＸｏｐＬ、ＧｏｂＸ、ＶｉｒＦ、ＧＡＬＡ、ＡｎｋＢ、またはＳｉｄＥを含む、請求項４６に記載の方法。
  49. 前記分解ドメインが、シゲラＩｐａＨタンパク質である、請求項４４に記載の方法。
  50. 前記シゲラＩｐａＨタンパク質が、ＩｐａＨ９．８、ＩｐａＨ１．４、ＩｐａＨ２．５、ＩｐａＨ４．５、ＩｐａＨ７．８、ＩｐａＨ０８８７、ＩｐａＨ１３８９、ＩｐａＨ２０２２、ＩｐａＨ２２０２、ＩｐａＨ２６１０、およびＩｐａＨ０７２２からなる群から選択される、請求項４９に記載の方法。
  51. 前記細菌病原体が、シゲラ・フレックスネリである場合である、請求項４６に記載の方法。
  52. 前記標的指向ドメインが、モノボディ、フィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン（ＦＮ３）、抗体、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、組換え抗体、抗体フラグメント、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｔａｓｃＦｖ、ビス－ｓｃＦｖ、ｓｄＡｂ、ＶＨ、ＶＬ、Ｖｎａｒ、ｓｃＦｖＤ１０、ｓｃＦｖ１３Ｒ４、ｓｃＦｖＤ１０、ヒト化抗体、キメラ抗体、相補決定領域（ＣＤＲ）、ＩｇＡ抗体、ＩｇＤ抗体、ＩｇＥ抗体、ＩｇＧ抗体、ＩｇＭ抗体、ナノボディ、イントラボディ、ユニボディ、ミニボディ、非抗体タンパク質骨格、アドネクチン、アフィボディおよびそれらの２ヘリックス変異体、アンチカリン、ラクダ科抗体、ＶＨＨ、ノッチン、ＤＡＲＰｉｎ、またはＳｓｏｄ７ｄである、請求項４４に記載の方法。
  53. 前記標的指向ドメインがモノボディであり、前記モノボディが、以下（括弧内に標的抗原を示す）：
    ＧＳ２（ＧＦＰ）、Ｎｓａ５（ＳＨＰ２）、ＲａｓＩｎＩ（ＨＲａｓ／ＫＲａｓ）、およびＲａｓＩｎＩＩ（ＨＲａｓ／ＫＲａｓ）、１Ｄ１０（ＣＤＣ３４）、１Ｄ７（ＣＯＰＳ５）、１Ｃ４（ＭＡＰ２Ｋ５）、２Ｃ１２（ＭＡＰ２Ｋ５）、１Ｅ２（ＳＦ３Ａ１）、１Ｃ２（ＵＳＰ１１）、１Ａ９（ＵＳＰ１１）、Ｕｂｉ４（ユビキチン）、ＥＩ１．４．１（ＥＧＦＲ）、ＥＩ２．４．６（ＥＧＦＲ）、ＥＩ３．４．３（ＥＧＦＲ）、ＥＩ４．２．１（ＥＧＦＲ）、ＥＩ４．４．２（ＥＧＦＲ）、ＥＩ６．２．６（ＥＧＦＲ）、ＥＩ６．２．１０（ＥＧＦＲ）、Ｅ２４６（ＥＧＦＲ）、Ｃ７４３（ＣＥＡ）、ＩＩＩａ８．２．６（ＦｃγＩＩａ）、ＩＩＩａ６．２．６（ＦｃγＩＩＩａ）、ｈＡ２．２．１（ｈＡ３３）、ｈＡ２．２．２（ｈＡ３３）、ｈＡ３．２．１（ｈＡ３３）、ｈＡ３．２．３（ｈＡ３３）、ｍＡ３．２．１（ｍＡ３３）、ｍＡ３．２．２（ｍＡ３３）、ｍＡ３．２．３（ｍＡ３３）、ｍＡ３．２．４（ｍＡ３３）、ｍＡ３．２．５（ｍＡ３３）、Ａｌｂ３．２．１（ｈＡｌｂ）、ｍＩ２．２．１（ｍＩｇＧ）、ＨＡ４（ＡｂｌＳＨ２）、ＨＡ１０（ＡｂｌＳＨ２）、ＨＡ１６（ＡｂｌＳＨ２）、ＨＡ１８（ＡｂｌＳＨ２）、１５９（ｖＥＧＦＲ）、ＭＵＣ１６（ＭＳＬＮ）、Ｅ２＃３（ＥＲα／ＥＦ）、Ｅ２＃４（ＥＲα／ＥＦ）、Ｅ２＃５（ＥＲα／ＥＦ）、Ｅ２＃６（ＥＲα／ＥＦ）、Ｅ２＃７（ＥＲα／ＥＦ）、Ｅ２＃８（ＥＲα／ＥＦ）、Ｅ２＃９（ＥＲα／ＥＦ）、Ｅ２＃１０（ＥＲα／ＥＦ）、Ｅ２＃１１（ＥＲα／ＥＦ）、Ｅ２＃２３（ＥＲα／ＥＦ）、Ｅ３＃２（ＥＲα／ＥＦ）、Ｅ３＃６（ＥＲα／ＥＦ）、ＯＨＴ＃３１（ＥＲα／ＥＦ）、ＯＨＴ＃３２（ＥＲα／ＥＦ）、ＯＨＴ＃３３（ＥＲα／ＥＦ）、ＡＢ７－Ａ１（ＥＲα／ＥＦ）、ＡＢ７－Ｂ１（ＥＲα／ＥＦ）、ＭＢＰ－７４（ＭＢＰ）、ＭＢＰ－７６（ＭＢＰ）、ＭＢＰ－７９（ＭＢＰ）、ｈＳＵＭＯ４－３３（ｈＳＵＭＯ４）、ｈＳＵＭＯ－３９（ｈＳＵＭＯ４）、ｙＳＵＭＯ－５３（ｙＳＵＭＯ）、ｙＳＵＭＯ－５６（ｙＳＵＭＯ）、ｙＳＵＭＯ－５７（ｙＳＵＭＯ）、Ｔ１４．２５（ＴＮＦα）、Ｔ１４．２０（ＴＮＦα）、ＦＮｆｎ１０－３ＪＣＬ１４（ａｖβ３インテグリン）、１Ｃ９（Ｓｒｃ ＳＨ３）、１Ｆ１１（Ｓｒｃ ＳＨ３）、１Ｆ１０（Ｓｒｃ ＳＨ３）、２Ｇ１０（Ｓｒｃ ＳＨ３）、２Ｂ２（Ｓｒｃ ＳＨ３）、１Ｅ３（Ｓｒｃ ＳＨ３）、Ｅ１８（ＶＥＧＦＲ２）、Ｅ１９（ＶＥＧＦＲ２）、Ｅ２６（ＶＥＧＦＲ２）、Ｅ２９（ＶＥＧＦＲ２）、ＦＧ４．２（リゾチーム）、ＦＧ４．１（リゾチーム）、２Ｌ４．１（リゾチーム）、ＢＦ４．１（リゾチーム）、ＢＦ４．９（リゾチーム）、ＢＦ４．４（リゾチーム）、ＢＦｓ１ｃ４．０１（リゾチーム）、ＢＦｓ１ｃ４．０７（リゾチーム）、ＢＦｓ３＿４．０２（リゾチーム）、ＢＦｓ３＿４．０６（リゾチーム）、ＢＦｓ３＿８．０１（リゾチーム）、１０Ｃ１７Ｃ２５（ホスホ－ＩκＢα）、Ｆｎ－Ｎ２２（ＳＡＲＳ Ｎ）、Ｆｎ－Ｎ１７（ＳＡＲＳ Ｎ）、ＦＮ－Ｎ１０（ＳＡＲＳ Ｎ）、ｇＩ２．５．３Ｔ８８Ｉ（ヤギＩｇＧ）、ｇＩ２．５．２（ヤギＩｇＧ）、ｇＩ２．５．４（ヤギＩｇＧ）、ｒＩ４．５．４（ウサギＩｇＧ）、ｒＩ４．３．１（ウサギＩｇＧ）、ｒＩ３．６．６（ウサギＩｇＧ）、ｒＩ４．３．４（ウサギＩｇＧ）、ｒＩ３．６．４（ウサギＩｇＧ）、およびｒＩ４．３．３（ウサギＩｇＧ）
    からなる群から選択されるフィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン（ＦＮ３）モノボディである、請求項５０に記載の方法。
JP2024026317A 2018-03-16 2024-02-26 操作された細菌ユビキチンリガーゼ模倣物を用いる、幅広い範囲にわたるプロテオーム編集 Pending JP2024059823A (ja)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201862644055P 2018-03-16 2018-03-16
US62/644,055 2018-03-16
PCT/US2019/022783 WO2019178604A1 (en) 2018-03-16 2019-03-18 Broad-spectrum proteome editing with an engineered bacterial ubiquitin ligase mimic
JP2020549556A JP2021515582A (ja) 2018-03-16 2019-03-18 操作された細菌ユビキチンリガーゼ模倣物を用いる、幅広い範囲にわたるプロテオーム編集

Related Parent Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2020549556A Division JP2021515582A (ja) 2018-03-16 2019-03-18 操作された細菌ユビキチンリガーゼ模倣物を用いる、幅広い範囲にわたるプロテオーム編集

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JP2024059823A true JP2024059823A (ja) 2024-05-01

Family

ID=67908087

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2020549556A Pending JP2021515582A (ja) 2018-03-16 2019-03-18 操作された細菌ユビキチンリガーゼ模倣物を用いる、幅広い範囲にわたるプロテオーム編集
JP2024026317A Pending JP2024059823A (ja) 2018-03-16 2024-02-26 操作された細菌ユビキチンリガーゼ模倣物を用いる、幅広い範囲にわたるプロテオーム編集

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2020549556A Pending JP2021515582A (ja) 2018-03-16 2019-03-18 操作された細菌ユビキチンリガーゼ模倣物を用いる、幅広い範囲にわたるプロテオーム編集

Country Status (5)

Country Link
US (1) US20210017503A1 (ja)
EP (1) EP3765604A4 (ja)
JP (2) JP2021515582A (ja)
CN (1) CN112189051A (ja)
WO (1) WO2019178604A1 (ja)

Families Citing this family (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115279418A (zh) * 2019-10-21 2022-11-01 川斯勒佰尔公司 信使rna的组合物、方法和用途
EP4114854A1 (en) * 2020-03-05 2023-01-11 UMC Utrecht Holding B.V. Membrane ubiquitin ligases to target protein degradation
AU2021291235A1 (en) * 2020-06-18 2022-12-22 Umc Utrecht Holding B.V. Screening method for effective target - E3 ligase combinations
CN112266404A (zh) * 2020-10-28 2021-01-26 北京大学深圳研究生院 选择性修饰靶标蛋白的基团转移方法及其应用
CN114645052B (zh) * 2021-07-01 2023-05-26 中国医学科学院医学生物学研究所 一种全脑过表达核易位人源α-突触核蛋白转基因鼠的高效构建方法
CN113549621B (zh) * 2021-07-14 2022-07-19 山西大学 一种增强细菌中外源蛋白活性和表达的最小启动子
CN113461790B (zh) * 2021-07-14 2022-09-23 山西大学 一种增强细菌中外源蛋白活性和表达的前导稳定元件
CN114591986A (zh) * 2021-07-29 2022-06-07 苏州科锐迈德生物医药科技有限公司 环状rna分子及其在目标蛋白的靶向降解中的应用
CN114057861B (zh) * 2021-11-22 2023-11-21 深圳湾实验室坪山生物医药研发转化中心 一种靶向UBE2C的bio-PROTAC人工蛋白
CN114395582A (zh) * 2022-02-09 2022-04-26 中国农业科学院烟草研究所(中国烟草总公司青州烟草研究所) 一种烟草瞬时表达方法及其检测方法
WO2023173094A2 (en) * 2022-03-10 2023-09-14 Cornell University Lysine-free ubiquibody variants for long-lived intracellular protein silencing

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP4107836B2 (ja) * 2001-12-07 2008-06-25 独立行政法人科学技術振興機構 タンパク質分解排除酵素とその用途
US7892772B2 (en) * 2007-03-12 2011-02-22 Iti Scotland Limited Targeted ubiquitination of proteins and screening methods using a new class of ubiquitin ligase proteins
MX345300B (es) * 2010-07-30 2017-01-24 Novartis Ag * Moléculas andamio de fibronectina y bibliotecas de las mismas.
US9746475B2 (en) * 2011-03-14 2017-08-29 University Of Southern California Antibody and antibody mimetic for visualization and ablation of endogenous proteins
US20140112922A1 (en) * 2011-03-28 2014-04-24 Cornell University Targeted protein silencing using chimeras between antibodies and ubiquitination enzymes
US8980864B2 (en) * 2013-03-15 2015-03-17 Moderna Therapeutics, Inc. Compositions and methods of altering cholesterol levels
WO2017079723A1 (en) * 2015-11-07 2017-05-11 Board Of Regents, The University Of Texas System Targeting proteins for degradation

Also Published As

Publication number Publication date
WO2019178604A1 (en) 2019-09-19
CN112189051A (zh) 2021-01-05
US20210017503A1 (en) 2021-01-21
JP2021515582A (ja) 2021-06-24
EP3765604A4 (en) 2022-01-05
EP3765604A1 (en) 2021-01-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP2024059823A (ja) 操作された細菌ユビキチンリガーゼ模倣物を用いる、幅広い範囲にわたるプロテオーム編集
US11008372B2 (en) Targeting proteins for degradation
AU2018274932B2 (en) Cancer cell-specific antibody, anticancer drug and cancer testing method
JP6346159B2 (ja) 所定の標的に対して親和性を有するヒトリポカリン２（Ｌｃｎ２、ｈＮＧＡＬ）の突然変異タンパク質
O'Connor et al. Ubiquitin‐Activated Interaction Traps (UBAIT s) identify E3 ligase binding partners
Vasu et al. Novel vertebrate nucleoporins Nup133 and Nup160 play a role in mRNA export
US8591893B2 (en) Paratope and epitope of anti-mortalin antibody
Ludwicki et al. Broad-spectrum proteome editing with an engineered bacterial ubiquitin ligase mimic
Keren-Kaplan et al. RUFY3 and RUFY4 are ARL8 effectors that promote coupling of endolysosomes to dynein-dynactin
EP1560847A2 (en) Acetylated hmgb1 protein
JP6871866B2 (ja) 抗ｒｈｏ ｇｔｐａｓｅコンホーメーションシングルドメイン抗体及びその使用
US20220065850A1 (en) Intrabodies targeting post-translational modifications of native proteins and method for obtaining them
JP2024507867A (ja) ２つのｒｉｎｇドメインを含む融合タンパク質
WO2007066809A1 (ja) タンパク質重合体の重合核となりうるタンパク質又はその重合体が導入された細胞及びその製造法
Yu et al. Harnessing the lysosomal sorting signals of the cation-independent mannose-6-phosphate receptor for targeted degradation of membrane proteins
US20100080799A1 (en) Wstf regulates the dna damage response of h2a.x via novel tyrosine kinase activity
WO2012082069A1 (en) Protein aptamers based on unstructured scaffold proteins
WO2023173094A2 (en) Lysine-free ubiquibody variants for long-lived intracellular protein silencing
CN113528569B (zh) 一种利用isPLA高通量筛选单域抗体的方法及其应用
JP2023550743A (ja) Ｅ２ユビキチン又はユビキチン様コンジュゲートドメインを含む融合タンパク質並びに特定のタンパク質分解のためのドメインの標的化
Zhang Legionella pneumophila Control of Tubular Endoplasmic Reticulum and Translation Initiation during Early Infection
Beghein Nanobody technology: expanding the toolbox for fundamental research
EP4110794A1 (en) Leucine-rich repeat kinase 2 allosteric modulators
WO2023141361A2 (en) Anti-b7-h3 compounds and methods of use
CN115594757A (zh) 抗新型冠状病毒的中和抗体及其制备方法、制剂和用途