CN114395582A - 一种烟草瞬时表达方法及其检测方法 - Google Patents

一种烟草瞬时表达方法及其检测方法 Download PDF

Info

Publication number
CN114395582A
CN114395582A CN202210122423.5A CN202210122423A CN114395582A CN 114395582 A CN114395582 A CN 114395582A CN 202210122423 A CN202210122423 A CN 202210122423A CN 114395582 A CN114395582 A CN 114395582A
Authority
CN
China
Prior art keywords
tobacco
expression
transient expression
agrobacterium
protein
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202210122423.5A
Other languages
English (en)
Inventor
张增林
郭永峰
王跃驹
吴荣荣
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Qingzhou Tobacco Research Institute of China National Tobacco Corp of Institute of Tobacco Research of CAAS
Original Assignee
Qingzhou Tobacco Research Institute of China National Tobacco Corp of Institute of Tobacco Research of CAAS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Qingzhou Tobacco Research Institute of China National Tobacco Corp of Institute of Tobacco Research of CAAS filed Critical Qingzhou Tobacco Research Institute of China National Tobacco Corp of Institute of Tobacco Research of CAAS
Priority to CN202210122423.5A priority Critical patent/CN114395582A/zh
Publication of CN114395582A publication Critical patent/CN114395582A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
    • C12N15/8202—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation by biological means, e.g. cell mediated or natural vector
    • C12N15/8205—Agrobacterium mediated transformation
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明属于植物分子生物技术和基因工程领域，涉及一种烟草瞬时表达方法及其检测方法，本发明提供了一种烟草瞬时表达方法及其检测方法，包括以下步骤：(1)用雌二醇喷洒烟草叶片；(2)保持叶片湿度；(3)采用农杆菌介导的真空侵染方法进行瞬时侵染；(4)培养植物。本发明建立一种更加高效的烟草瞬时表达方法，将诱导过量表达avrPtoB‑C的烟草作为瞬时表达材料底盘，瞬时表达效率提高3倍以上，并且蛋白表达最高点的时间前移，该方法缩短了瞬时表达纯化蛋白所用时间，因此，该方法整体效率均有大幅提高，为烟草瞬时表达体系生产药用蛋白产业化提供了一种技术储备。

Description

一种烟草瞬时表达方法及其检测方法
技术领域
本发明属于植物分子生物技术和基因工程领域，涉及一种烟草瞬时表达方法及其检测方法。
背景技术
瞬时表达技术是指基因不整合到植物基因组中而外源蛋白可以在植物中短时间内表达的一种技术，如果表达量足够高，将药用蛋白编码基因在烟草叶片中瞬时表达翻译成有功能的药用蛋白，就可以用于生物制药；但现在的烟草瞬时表达技术所表达的蛋白量仅可供实验室水平应用，还无法满足利用该技术大量生产药用蛋白的水平；严重限制了该技术在生物制药行业的应用，也阻碍了该技术作为生物制药手段的产业化推广。
发明内容
为解决上述困难，本发明提供了一种烟草瞬时表达方法及其检测方法，包括以下步骤：
(1)用雌二醇喷洒烟草叶片；
(2)保持叶片湿度；
(3)采用农杆菌介导的真空侵染方法进行瞬时侵染；
(4)培养植物。
优选地，所述烟草叶片含有可编码avrPtoB-C蛋白的基因SEQ:NO:1；
优选地，步骤(2)中，需保持叶片湿度24小时，所述烟草叶片为水培；所述烟草叶片选用生长20天的本氏烟草或生长40天的载培烟草；
优选地，步骤(1)中雌二醇浓度为10μM；
优选地，步骤(4)中，先避光培养24小时，再进行正常培养；
优选地，步骤(3)中，存在以下过程：
(3-1)培养农杆菌；
(3-2)离心收集菌体；
(3-3)用渗透液悬浮菌体；
(3-4)准备含有农杆菌的侵染液，将烟草倒置入侵染液，放入干燥器并抽真空；
优选地，步骤(3-1)中，采用28℃200rpm摇菌培养30小时，步骤(3-3)中，用渗透液悬浮菌体至OD值为1.0，步骤(3-4)中，所述抽真空条件为12psi抽真空1分30秒后放气，重复2-3次；
优选地，所述可编码avrPtoB-C蛋白的基因SEQ:NO:1构建在质粒PER8上，其基因为SEQ:NO:2；
本发明还提供一种烟草瞬时表达的检测方法，包括上述烟草瞬时表达方法外，还包括所述农杆菌为含有pJL-TRBO-GFP载体的农杆菌GV3101，过程中喷洒发光物质底物，并使用多功能酶标仪检测蛋白表达情况；
优选地，农杆菌的培养基采用LB培养基，含10mM MES；20μM乙酰丁香酮；50mg/L利福平；50mg/L卡那霉素，步骤(3-3)中，所述渗透液含10mM MES；150μM乙酰丁香酮；10mMMgCl2。
利用农杆菌介导的植物瞬时表达技术过程中存在细菌与植物间的互作效应；AvrPtoB是病原菌分泌的一种调节因子蛋白，该蛋白C段(308-553位，avrPtoB-C)能够一直寄主植物的PCD反应；实验表明诱导过量表达avrPtoB-C的转基因烟草叶片明显更容易被农杆菌侵染；因此，利用这种特性，本发明建立一种更加高效的烟草瞬时表达方法，将诱导过量表达avrPtoB-C的烟草作为瞬时表达材料底盘，与对照相比，瞬时表达效率提高3倍以上(表达量)，并且蛋白表达最高点的时间前移(对照烟草在5天为蛋白表达最高峰，而诱导过量表达avrPtoB-C材料第3天为蛋白表达最高峰)，该方法缩短了瞬时表达纯化蛋白所用时间；因此，该方法整体效率(蛋白表达量，表达耗时)均有大幅提高，为烟草瞬时表达体系生产药用蛋白产业化提供了一种技术储备。
附图说明
图1为烟草材料水培培养拍摄图；
图2为烟草材料处理前拍摄图；
图3为用雌二醇喷洒后拍摄图；
图4为农杆菌真空侵染拍摄图；
图5为侵染结束后拍摄图；
图6为无侵染烟草与侵染烟草(含avrPtoB-C基因SEQ:NO:1)2天后对比拍摄图；
图7为正常烟草(不含avrPtoB-C基因SEQ:NO:1)侵染5天后与无侵染烟草对比拍摄图；
图8为正常烟草(不含avrPtoB-C基因SEQ:NO:1)侵染3天与重组烟草(含avrPtoB-C基因SEQ:NO:1)侵染3天的对比拍摄图。
具体实施方式
下面结合具体实施例和附图对本发明做进一步的阐述，但实施例不限制本发明的保护范围。
实施例1：烟草(含avrPtoB-C基因SEQ:NO:1)瞬时表达实验
首先，用10μM雌二醇(estradiol,EST)喷洒水培的含avrPtoB-C基因(SEQ:NO:1，选用质粒PER8SEQ:NO:2构建重组基因)烟草叶片(如图1-3所示)，其具体步骤为：用DMSO配置10mM雌二醇母液，用水稀释1000倍雌二醇母液制成10μM雌二醇工作液200mL备用；从水培架上取转诱导表达avrPtoB-C基因(SEQ:NO:1，选用质粒PER8 SEQ:NO:2构建重组基因)材料；用喷壶喷洒10μM雌二醇；塑料盖子盖好处理后的材料，保持24小时；
其次，采用农杆菌介导的真空侵染方法进行瞬时侵染(如图3-4所示)，其具体步骤为：28℃200rpm摇500mL含有pJL-TRBO-GFP载体的农杆菌GV3101；(培养基：LB液体培养基；10mM MES；20μM乙酰丁香酮；50mg/L利福平；50mg/L卡那霉素)，30小时后，将农杆菌5000rpm离心10分钟收集菌体；用500mL左右渗透液悬浮菌体至OD值为1.0左右；(渗透液配方：10mMMES；150μM乙酰丁香酮；10mM MgCl2，水补齐所用体积)；将配好的侵染液(含有农杆菌)放在1L的烧杯中；将烟草倒置入烧杯，将其放入干燥器(连有真空泵)；12psi抽真空1分30s,放气，重复2-3次；清水洗净烟草叶片的侵染液，放置水培架，避光24小时；开灯后，16小时光照，8小时黑暗，持续培养。
实施例2：烟草(含avrPtoB-C基因SEQ:NO:1)瞬时表达检测实验
本实施例在实施例1的基础上，增加如下步骤：及时补充喷洒发光物质底物，并在不同时间点检测蛋白表达情况。
实施例3：对照组1——正常烟草(不含avrPtoB-C基因SEQ:NO:1)瞬时表达检测实验
本实施例与实施例2的区别在于，所用的烟草为正常烟草，即不含avrPtoB-C基因SEQ:NO:1。
此组作为对照组实验，并在侵染后第三天与同时段实施例2进行对比(如图8)。
实施例4：无侵染烟草瞬时表达检测实验
本实施例与实施例3的区别在于：无农杆菌介导的真空侵染方法进行瞬时侵染过程，并与进行侵染后第2天的实施例2进行对比(如图6)，且与进行侵染后第5天的实施例3进行对比(如图7)。
综上结果表明，将诱导过量表达avrPtoB-C(SEQ:NO:1)基因的烟草作为瞬时表达材料底盘，与对照组相比，瞬时表达效率可提高3倍以上(表达量)，并且蛋白表达最高点的时间前移，即当对照烟草(无avrPtoB-C基因)在5天为蛋白表达最高峰，而诱导过量表达材料(含avrPtoB-C基因烟草)第3天即为蛋白表达最高峰(如图8)，该方法缩短了瞬时表达纯化蛋白所用时间，因此，该方法整体效率(蛋白表达量，表达耗时)均有大幅提高，为烟草瞬时表达体系生产药用蛋白产业化提供了一种技术储备。
SEQ:NO:1
avrPtoB-C
ATGCAGCGCCTCCCTATCCCCCTCGATATAGGCAGCGCGTTGCAGAATGTGGGAATTAACCCAAGTATCGACTTGGGGGAAAGCCTTGTGCAACATCCCCTGCTGAATTTGAATGTAGCGTTGAATCGCATGCTGGGGCTGCGTCCCAGCGCTGAAAGAGCGCCTCGTCCAGCCGTCCCCGTGGCTCCCGCGACCGCCTCCAGGCGACCGGATGGTACGCGTGCAACACGATTGCGGGTGATGCCGGAGCGGGAGGATTACGAAAATAATGTGGCTTATGGAGTGCGCTTGCTTAACCTGAACCCGGGGGTGGGGGTAAGGCAGGCTGTTGCGGCCTTTGTAACCGACCGGGCTGAGCGGCCAGCAGTGGTGGCTAATATCCGGGCAGCCCTGGACCCTATCGCGTCACAATTCAGTCAGCTGCGCACAATTTCGAAGGCCGATGCTGAATCTGAAGAGCTGGGTTTTAAGGATGCGGCAGATCATCACACGGATGACGTGACGCACTGTCTTTTTGGCGGAGAATTGTCGCTGAGTAATCCGGATCAGCAGGTGATCGGTTTGGCGGGTAATCCGACGGACACGTCGCAGCCTTACAGCCAAGAGGGAAATAAGGACCTGGCGTTCATGGATATGAAAAAACTTGCCCAATTCCTCGCAGGCAAGCCTGAGCATCCGATGACCAGAGAAACGCTTAACGCCGAAAATATCGCCAAGTATGCTTTTAGAATAGTCCCCTGA
SEQ:NO:2
PER8载体
gtttacccgccaatatatcctgtcaaacactgatagtttaaactgaaggcgggaaacgacaatctgatccaagctcaagctaagcttgcatgcctgcaggatatcgtggatccaagcttgccacgtgccgccacgtgccgccacgtgccgccacgtgcctctagaggatccatctccactgacgtaagggatgacgcacaatcccactatccttcgcaagacccttcctctatataaggaagttcatttcatttggagaggacacgctgggatccccaattccgggcggaatgaaagcgttaacggccaggcaacaagaggtgtttgatctcatccgtgatcacatcagccagacaggtatgccgccgacgcgtgcggaaatcgcgcagcgtttggggttccgttccccaaacgcggctgaagaacatctgaaggcgctggcacgcaaaggcgttattgaaattgtttccggcgcatcacgcgggattcgtctgttgcaggaagaggaagaagggttgccgctggtaggtcgtgtggctgccggtgaaccgtcgagcgcccccccgaccgatgtcagcctgggggacgagctccacttagacggcgaggacgtggcgatggcgcatgccgacgcgctagacgatttcgatctggacatgttgggggacggggattccccgggtccgggatttaccccccacgactccgccccctacggcgctctggatatggccgacttcgagtttgagcagatgtttaccgatgcccttggaattgacgagtacggtggggatccgtctgctggagacatgagagctgccaacctttggccaagcccgctcatgatcaaacgctctaagaagaacagcctggccttgtccctgacggccgaccagatggtcagtgccttgttggatgctgagccccccatactctattccgagtatgatcctaccagacccttcagtgaagcttcgatgatgggcttactgaccaacctggcagacagggagctggttcacatgatcaactgggcgaagagggtgccaggctttgtggatttgaccctccatgatcaggtccaccttctagaatgtgcctggctagagatcctgatgattggtctcgtctggcgctccatggagcacccagtgaagctactgtttgctcctaacttgctcttggacaggaaccagggaaaatgtgtagagggcatggtggagatcttcgacatgctgctggctacatcatctcggttccgcatgatgaatctgcagggagaggagtttgtgtgcctcaaatctattattttgcttaattctggagtgtacacatttctgtccagcaccctgaagtctctggaagagaaggaccatatccaccgagtcctggacaagatcacagacactttgatccacctgatggccaaggcaggcctgaccctgcagcagcagcaccagcggctggcccagctcctcctcatcctctcccacatcaggcacatgagtaacaaaggcatggagcatctgtacagcatgaagtgcaagaacgtggtgcccctctatgacctgctgctggagatgctggacgcccaccgcctacatgcgcccactagccgtggaggggcatccgtggaggagacggaccaaagccacttggccactgcgggctctacttcatcgcattccttgcaaaagtattacatcacgggggaggcagagggtttccctgccacagtctgagagctccctggcgaattcccagagatgttagctgaaatcatcactaatcagataccaaaatattcaaatggaaatatcaaaaagcttctgtttcatcaaaaatgactcgacctaactgagtaagctagcttgttcgagtattatggcattgggaaaactgtttttcttgtaccatttgttgtgcttgtaatttactgtgttttttattcggttttcgctatcgaactgtgaaatggaaatggatggagaagagttaatgaatgatatggtccttttgttcattctcaaattaatattatttgttttttctcttatttgttgtgtgttgaatttgaaattataagagatatgcaaacattttgttttgagtaaaaatgtgtcaaatcgtggcctctaatgaccgaagttaatatgaggagtaaaacatcccaaacaagcttggaaactgaaggcgggaaacgacaatctgatcatgagcggagaattaagggagtcacgttatgacccccgccgatgacgcgggacaagccgttttacgtttggaactgacagaaccgcaacgattgaaggagccactcagccgcgggtttctggagtttaatgagctaagcacatacgtcagaaaccattattgcgcgttcaaaagtcgcctaaggtcactatcagctagcaaatatttcttgtcaaaaatgctccactgacgttccataaattcccctcggtatccaattagagtctcatattcactctcaatccaaataatctgcaccggatcccctagaatgaaaaagcctgaactcaccgcgacgtctgtcgagaagtttctgatcgaaaagttcgacagcgtctccgacctgatgcagctctcggagggcgaagaatctcgtgctttcagcttcgatgtaggagggcgtggatatgtcctgcgggtaaatagctgcgccgatggtttctacaaagatcgttatgtttatcggcactttgcatcggccgcgctcccgattccggaagtgcttgacattggggaattcagcgagagcctgacctattgcatctcccgccgtgcacagggtgtcacgttgcaagacctgcctgaaaccgaactgcccgctgttctgcagccggtcgcggaggccatggatgcgatcgctgcggccgatcttagccagacgagcgggttcggcccattcggaccgcaaggaatcggtcaatacactacatggcgtgatttcatatgcgcgattgctgatccccatgtgtatcactggcaaactgtgatggacgacaccgtcagtgcgtccgtcgcgcaggctctcgatgagctgatgctttgggccgaggactgccccgaagtccggcacctcgtgcacgcggatttcggctccaacaatgtcctgacggacaatggccgcataacagcggtcattgactggagcgaggcgatgttcggggattcccaatacgaggtcgccaacatcttcttctggaggccgtggttggcttgtatggagcagcagacgcgctacttcgagcggaggcatccggagcttgcaggatcgccgcggctccgggcgtatatgctccgcattggtcttgaccaactctatcagagcttggttgacggcaatttcgatgatgcagcttgggcgcagggtcgatgcgacgcaatcgtccgatccggagccgggactgtcgggcgtacacaaatcgcccgcagaagcgcggccgtctggaccgatggctgtgtagaagtactcgccgatagtggaaaccgacgccccagcactcgtccgagggcaaaggaatagcgatcgttcaaacatttggcaataaagtttcttaagattgaatcctgttgccggtcttgcgatgattatcatataatttctgttgaattacgttaagcatgtaataattaacatgtaatgcatgacgttatttatgagatgggtttttatgattagagtcccgcaattatacatttaatacgcgatagaaaacaaaatatagcgcgcaaactaggataaattatcgcgcgcggtgtcatctatgttactagatcggggaattgatcccccctcgacagcttgcatgccagcttgggctgcaggtcgaggctaaaaaactaatcgcattatcatcccctcgacgtactgtacatataaccactggttttatatacagcagtactgtacatataaccactggttttatatacagcagtcgacgtactgtacatataaccactggttttatatacagcagtactgtacatataaccactggttttatatacagcagtcgaggtaagattagatatggatatgtatatggatatgtatatggtggtaatgccatgtaatatgctcgactctaggatcttcgcaagacccttcctctatataaggaagttcatttcatttggagaggacacgctgaagctagtcgactctagcctcgaggcgcgccgggcccatacgcgttaattaactagtcgatccaggcctcccagctttcgtccgtatcatcggtttcgacaacgttcgtcaagttcaatgcatcagtttcattgcccacacaccagaatcctactaagtttgagtattatggcattggaaaagctgttttcttctatcatttgttctgcttgtaatttactgtgttctttcagtttttgttttcggacatcaaaatgcaaatggatggataagagttaataaatgatatggtccttttgttcattctcaaattattattatctgttgtttttactttaatgggttgaatttaagtaagaaaggaactaacagtgtgatattaaggtgcaatgttagacatataaaacagtctttcacctctctttggttatgtcttgaattggtttgtttcttcacttatctgtgtaatcaagtttactatgagtctatgatcaagtaattatgcaatcaagttaagtacagtataggctttttgtgtcgagggggtaccgagtcgaggaattcactggccgtcgttttacaacgtcgtgactgggaaaaccctggcgttacccaacttaatcgccttgcagcacatccccctttcgccagctggcgtaatagcgaagaggcccgcaccgatcgcccttcccaacagttgcgcagcctgaatggcgggtaccgagctcgaattcaattcggcgttaattcagtacattaaaaacgtccgcaatgtgttattaagttgtctaagcgtcaatttgtttacaccacaatatatcctgccaccagccagccaacagctccccgaccggcagctcggcacaaaatcaccactcgatacaggcagcccatcagtccgggacggcgtcagcgggagagccgttgtaaggcggcagactttgctcatgttaccgatgctattcggaagaacggcaactaagctgccgggtttgaaacacggatgatctcgcggagggtagcatgttgattgtaacgatgacagagcgttgctgcctgtgatcaattcgggcacgaacccagtggacataagcctcgttcggttcgtaagctgtaatgcaagtagcgtaactgccgtcacgcaactggtccagaaccttgaccgaacgcagcggtggtaacggcgcagtggcggttttcatggcttcttgttatgacatgtttttttggggtacagtctatgcctcgggcatccaagcagcaagcgcgttacgccgtgggtcgatgtttgatgttatggagcagcaacgatgttacgcagcagggcagtcgccctaaaacaaagttaaacatcatgggggaagcggtgatcgccgaagtatcgactcaactatcagaggtagttggcgtcatcgagcgccatctcgaaccgacgttgctggccgtacatttgtacggctccgcagtggatggcggcctgaagccacacagtgatattgatttgctggttacggtgaccgtaaggcttgatgaaacaacgcggcgagctttgatcaacgaccttttggaaacttcggcttcccctggagagagcgagattctccgcgctgtagaagtcaccattgttgtgcacgacgacatcattccgtggcgttatccagctaagcgcgaactgcaatttggagaatggcagcgcaatgacattcttgcaggtatcttcgagccagccacgatcgacattgatctggctatcttgctgacaaaagcaagagaacatagcgttgccttggtaggtccagcggcggaggaactctttgatccggttcctgaacaggatctatttgaggcgctaaatgaaaccttaacgctatggaactcgccgcccgactgggctggcgatgagcgaaatgtagtgcttacgttgtcccgcatttggtacagcgcagtaaccggcaaaatcgcgccgaaggatgtcgctgccgactgggcaatggagcgcctgccggcccagtatcagcccgtcatacttgaagctagacaggcttatcttggacaagaagaagatcgcttggcctcgcgcgcagatcagttggaagaatttgtccactacgtgaaaggcgagatcaccaaggtagtcggcaaataatgtctagctagaaattcgttcaagccgacgccgcttcgccggcgttaactcaagcgattagatgcactaagcacataattgctcacagccaaactatcaggtcaagtctgcttttattatttttaagcgtgcataataagccctacacaaattgggagatatatcatgcatgaccaaaatcccttaacgtgagttttcgttccactgagcgtcagaccccgtagaaaagatcaaaggatcttcttgagatcctttttttctgcgcgtaatctgctgcttgcaaacaaaaaaaccaccgctaccagcggtggtttgtttgccggatcaagagctaccaactctttttccgaaggtaactggcttcagcagagcgcagataccaaatactgtccttctagtgtagccgtagttaggccaccacttcaagaactctgtagcaccgcctacatacctcgctctgctaatcctgttaccagtggctgctgccagtggcgataagtcgtgtcttaccgggttggactcaagacgatagttaccggataaggcgcagcggtcgggctgaacggggggttcgtgcacacagcccagcttggagcgaacgacctacaccgaactgagatacctacagcgtgagctatgagaaagcgccacgcttcccgaagggagaaaggcggacaggtatccggtaagcggcagggtcggaacaggagagcgcacgagggagcttccagggggaaacgcctggtatctttatagtcctgtcgggtttcgccacctctgacttgagcgtcgatttttgtgatgctcgtcaggggggcggagcctatggaaaaacgccagcaacgcggcctttttacggttcctggccttttgctggccttttgctcacatgttctttcctgcgttatcccctgattctgtggataaccgtattaccgcctttgagtgagctgataccgctcgccgcagccgaacgaccgagcgcagcgagtcagtgagcgaggaagcggaagagcgcctgatgcggtattttctccttacgcatctgtgcggtatttcacaccgcatatggtgcactctcagtacaatctgctctgatgccgcatagttaagccagtatacactccgctatcgctacgtgactgggtcatggctgcgccccgacacccgccaacacccgctgacgcgccctgacgggcttgtctgctcccggcatccgcttacagacaagctgtgaccgtctccgggagctgcatgtgtcagaggttttcaccgtcatcaccgaaacgcgcgaggcagggtgccttgatgtgggcgccggcggtcgagtggcgacggcgcggcttgtccgcgccctggtagattgcctggccgtaggccagccatttttgagcggccagcggccgcgataggccgacgcgaagcggcggggcgtagggagcgcagcgaccgaagggtaggcgctttttgcagctcttcggctgtgcgctggccagacagttatgcacaggccaggcgggttttaagagttttaataagttttaaagagttttaggcggaaaaatcgccttttttctcttttatatcagtcacttacatgtgtgaccggttcccaatgtacggctttgggttcccaatgtacgggttccggttcccaatgtacggctttgggttcccaatgtacgtgctatccacaggaaagagaccttttcgacctttttcccctgctagggcaatttgccctagcatctgctccgtacattaggaaccggcggatgcttcgccctcgatcaggttgcggtagcgcatgactaggatcgggccagcctgccccgcctcctccttcaaatcgtactccggcaggtcatttgacccgatcagcttgcgcacggtgaaacagaacttcttgaactctccggcgctgccactgcgttcgtagatcgtcttgaacaaccatctggcttctgccttgcctgcggcgcggcgtgccaggcggtagagaaaacggccgatgccgggatcgatcaaaaagtaatcggggtgaaccgtcagcacgtccgggttcttgccttctgtgatctcgcggtacatccaatcagctagctcgatctcgatgtactccggccgcccggtttcgctctttacgatcttgtagcggctaatcaaggcttcaccctcggataccgtcaccaggcggccgttcttggccttcttcgtacgctgcatggcaacgtgcgtggtgtttaaccgaatgcaggtttctaccaggtcgtctttctgctttccgccatcggctcgccggcagaacttgagtacgtccgcaacgtgtggacggaacacgcggccgggcttgtctcccttcccttcccggtatcggttcatggattcggttagatgggaaaccgccatcagtaccaggtcgtaatcccacacactggccatgccggccggccctgcggaaacctctacgtgcccgtctggaagctcgtagcggatcacctcgccagctcgtcggtcacgcttcgacagacggaaaacggccacgtccatgatgctgcgactatcgcgggtgcccacgtcatagagcatcggaacgaaaaaatctggttgctcgtcgcccttgggcggcttcctaatcgacggcgcaccggctgccggcggttgccgggattctttgcggattcgatcagcggccgcttgccacgattcaccggggcgtgcttctgcctcgatgcgttgccgctgggcggcctgcgcggccttcaacttctccaccaggtcatcacccagcgccgcgccgatttgtaccgggccggatggtttgcgaccgtcacgccgattcctcgggcttgggggttccagtgccattgcagggccggcagacaacccagccgcttacgcctggccaaccgcccgttcctccacacatggggcattccacggcgtcggtgcctggttgttcttgattttccatgccgcctcctttagccgctaaaattcatctactcatttattcatttgctcatttactctggtagctgcgcgatgtattcagatagcagctcggtaatggtcttgccttggcgtaccgcgtacatcttcagcttggtgtgatcctccgccggcaactgaaagttgacccgcttcatggctggcgtgtctgccaggctggccaacgttgcagccttgctgctgcgtgcgctcggacggccggcacttagcgtgtttgtgcttttgctcattttctctttacctcattaactcaaatgagttttgatttaatttcagcggccagcgcctggacctcgcgggcagcgtcgccctcgggttctgattcaagaacggttgtgccggcggcggcagtgcctgggtagctcacgcgctgcgtgatacgggactcaagaatgggcagctcgtacccggccagcgcctcggcaacctcaccgccgatgcgcgtgcctttgatcgcccgcgacacgacaaaggccgcttgtagccttccatccgtgacctcaatgcgctgcttaaccagctccaccaggtcggcggtggcccatatgtcgtaagggcttggctgcaccggaatcagcacgaagtcggctgccttgatcgcggacacagccaagtccgccgcctggggcgctccgtcgatcactacgaagtcgcgccggccgatggccttcacgtcgcggtcaatcgtcgggcggtcgatgccgacaacggttagcggttgatcttcccgcacggccgcccaatcgcgggcactgccctggggatcggaatcgactaacagaacatcggccccggcgagttgcagggcgcgggctagatgggttgcgatggtcgtcttgcctgacccgcctttctggttaagtacagcgataaccttcatgcgttccccttgcgtatttgtttatttactcatcgcatcatatacgcagcgaccgcatgacgcaagctgttttactcaaatacacatcacctttttagacggcggcgctcggtttcttcagcggccaagctggccggccaggccgccagcttggcatcagacaaaccggccaggatttcatgcagccgcacggttgagacgtgcgcgggcggctcgaacacgtacccggccgcgatcatctccgcctcgatctcttcggtaatgaaaaacggttcgtcctggccgtcctggtgcggtttcatgcttgttcctcttggcgttcattctcggcggccgccagggcgtcggcctcggtcaatgcgtcctcacggaaggcaccgcgccgcctggcctcggtgggcgtcacttcctcgctgcgctcaagtgcgcggtacagggtcgagcgatgcacgccaagcagtgcagccgcctctttcacggtgcggccttcctggtcgatcagctcgcgggcgtgcgcgatctgtgccggggtgagggtagggcgggggccaaacttcacgcctcgggccttggcggcctcgcgcccgctccgggtgcggtcgatgattagggaacgctcgaactcggcaatgccggcgaacacggtcaacaccatgcggccggccggcgtggtggtgtcggcccacggctctgccaggctacgcaggcccgcgccggcctcctggatgcgctcggcaatgtccagtaggtcgcgggtgctgcgggccaggcggtctagcctggtcactgtcacaacgtcgccagggcgtaggtggtcaagcatcctggccagctccgggcggtcgcgcctggtgccggtgatcttctcggaaaacagcttggtgcagccggccgcgtgcagttcggcccgttggttggtcaagtcctggtcgtcggtgctgacgcgggcatagcccagcaggccagcggcggcgctcttgttcatggcgtaatgtctccggttctagtcgcaagtattctactttatgcgactaaaacacgcgacaagaaaacgccaggaaaagggcagggcggcagcctgtcgcgtaacttaggacttgtgcgacatgtcgttttcagaagacggctgcactgaacgtcagaagccgactgcactatagcagcggaggggttggatcaaagtactttgatcccgaggggaaccctgtggttggcatgcacatacaaatggacgaacggataaaccttttcacgcccttttaaatatccgttattctaataaacgctcttttctcttag

Claims (10)

1.一种烟草瞬时表达方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)用雌二醇喷洒烟草叶片；
(2)保持叶片湿度；
(3)采用农杆菌介导的真空侵染方法进行瞬时侵染；
(4)培养植物。
2.根据权利要求1所述的一种烟草瞬时表达方法，其特征在于：所述烟草叶片含有可编码avrPtoB-C蛋白的基因SEQ:NO:1。
3.小时，所述烟草叶片为水培；所述烟草叶片选用生长20天的本氏烟草或生长40天的载培烟草。
4.根据权利要求1或2所述的一种烟草瞬时表达方法，其特征在于：步骤(1)中雌二醇浓度为10μM。
5.根据权利要求1或2所述的一种烟草瞬时表达方法，其特征在于：步骤(4)中，开灯后，16小时光照，8小时黑暗，持续培养。
6.根据权利要求1或2所述的一种烟草瞬时表达方法，其特征在于：步骤(3)中，存在以下过程：
(3-1)培养农杆菌；
(3-2)离心收集菌体；
(3-3)用渗透液悬浮菌体；
(3-4)准备含有农杆菌的侵染液，将烟草倒置入侵染液，放入干燥器并抽真空。
7.根据权利要求1或2所所述的一种烟草瞬时表达方法，其特征在于：步骤(3-1)中，采用28℃200rpm摇菌培养30小时，步骤(3-3)中，用渗透液悬浮菌体至OD值为1.0，步骤(3-4)中，所述抽真空条件为12psi抽真空1分30秒后放气，重复2-3次。
8.根据权利要求1或2所述的一种烟草瞬时表达方法，其特征在于：所述可编码avrPtoB-C蛋白的基因SEQ:NO:1构建在质粒per8上，其基因为SEQ:NO:2。
9.一种烟草瞬时表达的检测方法，其特征在于：包含权利要求1或2所述的一种烟草瞬时表达方法，所述农杆菌为含有pJL-TRBO-GFP载体的农杆菌GV3101，过程中喷洒发光物质底物，并使用多功能酶标仪检测蛋白表达情况。
10.根据权利要求9所述的一种烟草瞬时表达的检测方法，其特征在于：步骤(3-1)中，农杆菌的培养基采用LB培养基，含10mM MES；20μM乙酰丁香酮；50mg/L利福平；50mg/L卡那霉素，步骤(3-3)中，所述渗透液含10mM MES；150μM乙酰丁香酮；10mM MgCl2。
CN202210122423.5A 2022-02-09 2022-02-09 一种烟草瞬时表达方法及其检测方法 Pending CN114395582A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210122423.5A CN114395582A (zh) 2022-02-09 2022-02-09 一种烟草瞬时表达方法及其检测方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210122423.5A CN114395582A (zh) 2022-02-09 2022-02-09 一种烟草瞬时表达方法及其检测方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN114395582A true CN114395582A (zh) 2022-04-26

Family

ID=81232699

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202210122423.5A Pending CN114395582A (zh) 2022-02-09 2022-02-09 一种烟草瞬时表达方法及其检测方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN114395582A (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115478076A (zh) * 2021-09-28 2022-12-16 昆明理工大学 一种提高栽培烟草云87外源蛋白瞬时表达的方法及应用

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20060035230A1 (en) * 2002-08-16 2006-02-16 Martin Gregory B Bacterial effector proteins which inhibit programmed cell death
CN1745171A (zh) * 2002-12-03 2006-03-08 财团法人名古屋产业科学研究所 病原菌应答性启动子
US20080307539A1 (en) * 2005-12-16 2008-12-11 Plant Bioscience Limited Methods, Means and Compositions for Enhancing Agrobacterium-Mediated Plant Cell Transformation Efficiency
CN108690850A (zh) * 2018-04-28 2018-10-23 西北农林科技大学 一种农杆菌介导的草莓叶片瞬时基因表达方法及其应用
CN112189051A (zh) * 2018-03-16 2021-01-05 康奈尔大学 用工程化细菌泛素连接酶模拟物进行的广谱蛋白质组编辑

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20060035230A1 (en) * 2002-08-16 2006-02-16 Martin Gregory B Bacterial effector proteins which inhibit programmed cell death
CN1745171A (zh) * 2002-12-03 2006-03-08 财团法人名古屋产业科学研究所 病原菌应答性启动子
US20080307539A1 (en) * 2005-12-16 2008-12-11 Plant Bioscience Limited Methods, Means and Compositions for Enhancing Agrobacterium-Mediated Plant Cell Transformation Efficiency
CN112189051A (zh) * 2018-03-16 2021-01-05 康奈尔大学 用工程化细菌泛素连接酶模拟物进行的广谱蛋白质组编辑
CN108690850A (zh) * 2018-04-28 2018-10-23 西北农林科技大学 一种农杆菌介导的草莓叶片瞬时基因表达方法及其应用

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
J. F. BUYEL 等: ""The impact of Pseudomonas syringae type III effectors on transient protein expression in tobacco"", 《PLANT BIOLOGY》, pages 2 - 3 *
KENICHI TSUD 等: ""An efficient Agrobacterium-mediated transient transformation of Arabidopsis"", 《THE PLANT JOURNAL》, vol. 69, pages 713 - 719 *
王婷婷: ""有关AvrPtoB在植物免疫中的作用的研究"", 《科技信息》, pages 1 - 2 *
王晓峰 等: "《分子生物技术与植物保护生物学》", vol. 1, 西北农林科技大学出版社, pages: 243 - 65 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115478076A (zh) * 2021-09-28 2022-12-16 昆明理工大学 一种提高栽培烟草云87外源蛋白瞬时表达的方法及应用

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP4343430B2 (ja) 植物及び植物の部分からポリペプチドを回収するための方法
CN111171125B (zh) 蛋白质IbCAF1在调控植物耐盐抗旱性中的应用
CN113831397B (zh) 一种原花青素物质调控因子NtMYB330及其表达载体、转化体、试剂盒与方法
CN110734482A (zh) 一种岷江百合WRKY转录因子基因LrWRKY4及应用
CN114395582A (zh) 一种烟草瞬时表达方法及其检测方法
CN115466749A (zh) 一种银杏bZIP类转录因子GbbZIP08在促进植物类黄酮合成中的应用方法
CN105218650B (zh) 一种与植物抗逆性相关蛋白Prp1及其编码基因与应用
CN109810985A (zh) 一种岷江百合Lr4CL-1基因及其应用
CN103981194B (zh) 一种烟草镉转运基因NtHMA2及其克隆方法与应用
CN107574169A (zh) 一种苹果MdNRT2,4‑1基因及其制备方法和应用
CN111549056A (zh) 来源于新疆野苹果的与植物抗水分胁迫相关蛋白及编码基因的应用
CN102533809B (zh) 枣树谷胱甘肽过氧化物酶基因
CN112391406B (zh) 促进草莓生长的方法及其所用生物材料
CN101736010B (zh) 一种来源于不结球白菜的抗逆nac转录因子基因
CN109486805B (zh) 一种福建金线莲的苯丙氨酸解氨酶及其编码基因、重组载体、重组工程菌及应用
CN106554399A (zh) 大豆GmABC蛋白及其编码基因和应用
CN108148849B (zh) 一种苹果MdPHR1基因及其制备方法和应用
CN107805641B (zh) 烟草14-3-3c基因的植物表达载体及其应用
CN113046362A (zh) 提高镉抗性镉含量减轻镉胁迫dna损伤的基因及其用途
CN107164373B (zh) 大豆低温诱导人工合成启动子sp5及应用
CN105463016B (zh) 一种诱导转基因花生发状根生物反应器产白藜芦醇的方法
CN104099347A (zh) 一种来源于扭脱甲基杆菌的重金属结合蛋白基因及其抗重金属应用
CN108410888A (zh) 一种苹果MdCEPR1基因及其制备方法和应用
CN103937811B (zh) 牡丹PsSVP基因及其应用
CN104099348B (zh) 一种来源于耐高温菌的重金属结合蛋白基因及其抗重金属应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination