CN115087465A - 肽-纳米颗粒缀合物 - Google Patents

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Abstract

本文描述了一种包括多价纳米颗粒核心的纳米颗粒系统，所述多价纳米颗粒核心包含与其缀合的多个β‑发夹肽。还包括药物组合物和制备所述纳米颗粒系统的方法。进一步包括免疫治疗方法，所述方法包括将所述纳米颗粒系统施用于需要其的受试者，例如人类癌症患者。

Description

肽-纳米颗粒缀合物
相关申请的交叉引用
本申请是2019年10月29日提交的PCT/US2019/058463的延续部分，并要求2019年10月29日提交的美国临时申请62/927,293的优先权，其全部内容通过引用并入本文。
技术领域
本公开涉及用于递送治疗性β-发夹肽的组合物和方法。
背景技术
由于它们对靶材料的高亲和力和选择性，抗体已成功地用作包括免疫治疗在内的许多应用的结合配体。然而，热力学稳定性低和制造成本高是蛋白质的固有缺点，一直是其常规应用的障碍。此外，含有许多表面官能团(例如胺、羧基、羟基和巯基基团)的蛋白质通常与位点特异性化学反应不相容，这限制了它们在先进的纳米生物技术应用中的使用。解决这些问题的一种潜在方法是实现具有小分子和蛋白质的有用特性的肽。肽设计策略的进步，例如文库筛选和基于结构的分子设计，促进了在靶标结合方面优于蛋白质的人工肽的开发。此外，肽可以通过具有成本效益的化学方法，即固相肽合成(一次缀合一个氨基酸)来合成，从而能够轻松、精确地调整氨基酸组成和大分子拓扑结构。
虽然肽是有前景的蛋白质替代品，但短肽的靶标结合亲和力通常低于蛋白质。此外，肽在与其蛋白质环境分离时通常不会保持先天折叠结构，这会显著影响其物理化学性质。
需要用于递送β-发夹肽的新组合物和方法。
发明内容
在一方面，纳米颗粒系统包括多价纳米颗粒核心，其包含与之缀合的多个β-发夹肽。
在另一方面，药物组合物包含所述纳米颗粒系统和药学上可接受的赋形剂。
在另一方面，一种制备纳米颗粒系统的方法包括，在足以将多个β-发夹肽缀合至多价纳米颗粒核心并提供纳米颗粒系统的条件下，使包含多个反应性端基的多价纳米颗粒核心与包含一种或多种β-发夹肽的组合物接触。
在另一方面，免疫治疗方法包括将所述纳米颗粒系统施用于有需要的受试者。
附图说明
图1显示了作为PD-1/PD-L1拮抗剂的多价树状大分子-肽缀合物的开发过程的示意图。
图2显示了PD-1、工程化PD-1的结构和靶向PD-L1的不同肽结构。SEQ ID NO:1是βH1-wt序列，SEQ ID NO:2是βH1-突变体序列，SEQ ID NO:3是βH2-wt序列，和SEQ ID NO:4是βH2-wt序列。结合表面被突出显示(带状)。
图3显示了βH2_mt肽、G7 PAMAM树状大分子和PD-1/PD-L1界面之间的大小比较，表明树状大分子表面容纳了多个肽，这些肽被足够的空间距离分开以进行结合。
图4显示了G7-βH2_mt(A)、G7-βH2_wt(B)、G7-βH1_mt(C)和完全乙酰化的树状大分子(D)与固定化的PD-L1蛋白结合的SPR传感图。
图5显示了使用90％(A)、80％(B)和60％(C)乙酰化的树状大分子将G7-βH2_mt缀合物与PD-L1结合的SPR传感图。
图6显示了G7-βH2_mt缀合物与PDL1的浓度依赖性结合动力学，其具有定量测量的结合动力学(ka：结合速率常数；kd：解离速率常数；KD：平衡解离常数)。曲线A-D分别代表45、90、180、270nM。
图7显示了aPD-L1抗体与PDL1的浓度依赖性结合动力学，其具有定量测量的结合动力学(ka：结合速率常数；kd：解离速率常数；KD：平衡解离常数)。曲线A-D分别代表25、50、100、200nM。
图8显示了游离βH2_mt肽与PDL1的浓度依赖性结合动力学，其具有定量测量的结合动力学(ka：结合速率常数；kd：解离速率常数；KD：平衡解离常数)。曲线A-D分别代表17、25、33、42μM。
图9显示了G7-βH2_mt缀合物(A)、βH2_mt肽(B)和完全乙酰化的树状大分子(C)的CD谱。
图10显示了G7-βH2_mt缀合物的FTIR光谱及其傅里叶自解卷积分析，其中标记了β-折叠和β-转角。插图：βH2_mt肽(上)和完全乙酰化的树状大分子(下)的FTIR光谱。
图11显示了减少肽折叠的熵代价的已占体积效应的示意图。
图12显示了初始延伸的βH2_mt在与G5 PAMAM树状大分子缀合时βH2_mt的折叠行为的MD模拟结果(βH2_mt在带中，原子在G5中)。
图13显示了初始折叠的βH2_mt在与G5 PAMAM树状大分子缀合时βH2_mt的折叠行为的MD模拟结果(βH2_mt在带中，原子在G5中)。
图14显示了fβH2_mt与PD-L1的结合。
图15显示了G7-βH2_mt(A)、aPD-L1(B)、βH2_mt(C)和完全乙酰化的树状大分子(D)针对fβH2_mt/PD-L1复合物的竞争测定。
图16是G7-βH2_mt缀合物与多个PD-L1蛋白结合的图示。
图17显示了用G7-βH2_mt处理1小时的786-O细胞的荧光显微图像(来自罗丹明的荧光，左；明场图像，右)，比例尺：50μm。
图18显示了用G7-βH2_mt处理1小时的MCF-7细胞的荧光显微图像(来自罗丹明的荧光，左；明场图像，右)，比例尺：50μm。
图19显示了免疫检查点阻断导致Jurkat T细胞分泌白细胞介素2(IL-2)增加的示意图。
图20显示了与786-O和MCF-7细胞共培养的Jurkat T细胞在用不同的组处理后的IL-2分泌。
图21显示了免疫检查点阻断导致癌细胞化疗耐药性降低的示意图。
图22显示了多柔比星(DOX)处理后的癌细胞活力，证明了癌细胞在与不同组一起温育时的化疗耐药性。
图23显示了富含β-折叠的蛋白质-蛋白质相互作用界面。
图24显示了从蛋白质环境中分离的肽的折叠结构变化。
图25显示了通过Trpzip-DPC系统稳定β-发夹的示意图。
图26显示了pL1和pL1TZ的肽序列和分子结构。
图27显示了pL1的CD光谱。
图28显示了pL1TZ的CD光谱。
图29显示了G4-pL1TZ。
图30显示了已占体积效应的示意图。
图31显示了PD-L1与pL1(左)、pL1TZ(中)和G7-pL1TZ(右)结合的浓度依赖性SPR传感图。
图32显示了用pL1、pL1TZ和G7-pL1TZ处理1小时的786-O和MCF-7细胞的荧光显微图像(来自罗丹明的荧光，左；明场图像，右)。
图33显示了接种有4T1细胞系并经游离IgG、游离aPD-L1、G7-PMAM树状大分子-Cy-5、G7-PMAM树状大分子-pPD1-肽-Cy-5或游离pPD1肽处理的雌性Balb/c小鼠中肿瘤体积随时间的变化。
图34显示了接种有4T1细胞系并经游离IgG、游离aPD-L1、G7-PMAM树状大分子-Cy-5、G7-PMAM树状大分子-pPD1-肽-Cy-5或游离pPD1肽处理的雌性Balb/c小鼠中体重随时间的变化。
图35显示了图33和34的小鼠的肿瘤生物发光。
通过以下详细描述、附图和所附权利要求，本领域技术人员将领会和理解上述的和其他特征。
具体实施方式
本文描述了一种用于从蛋白质表面分离的β-发夹肽(表面β-发夹肽，SβP)的新的工程化方法。本文描述了肽-纳米颗粒缀合物，其通过将SβP缀合到纳米颗粒骨架(scaffold)上而在构象上稳定它们，这另外使肽表现出多价结合效应。例如，树状大分子-肽缀合物(DPC)允许以对肽结构，特别是β-发夹肽的最小修饰来稳定肽结构。β-发夹肽可以通过共价交联来稳定。然而，化学修饰通常会使肽制备过程复杂化，进而经常导致合成产量显著下降。引入链间非共价结合是另一种常用的策略；然而，它需要大量的氨基酸取代，这可能会影响肽的物理化学性质。本文所述的纳米颗粒(例如DPC)平台提供了一种有效拮抗和靶向富含β-折叠的蛋白质表面的新方法。
在蛋白质表面使用肽段是开发蛋白质官能度的有效方法。特别是，β-发夹肽是有前景的，因为二级结构涉及无数蛋白质相互作用。基于构象相似性，发夹结构还具有作为靶向富含β-折叠的蛋白质表面(例如，PD-1/PD-L1界面)的拮抗剂平台的潜力，其中宽而平坦的几何形状通常对于小分子药物是不可成药的(图23)。因为这种表面在蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)中无处不在，并且在蛋白质聚集相关疾病的进展中发挥着关键作用，因此由富含β-折叠的表面介导的PPI调控一直是药物研究中一个重要且具有挑战性的问题。然而，当从蛋白质环境中分离时，肽构象很容易不稳定(图24)，这极大地影响了它们的靶标结合效力。血浆循环时间短和易被蛋白酶消化是肽的其他缺点，这限制了它们的广泛应用。
本文所述的纳米颗粒系统的优点包括使用具有高水溶性、生物相容性、可修饰的表面基团和多价的纳米颗粒载体。
在实施方案中，纳米颗粒系统包括多价纳米颗粒核心，其包含与之缀合的多个β-发夹肽。所述多个β-发夹肽可包括缀合至相同纳米颗粒核心的多个相同的β-发夹肽或不同的β-发夹肽。在具体的实施方案中，所述多价纳米颗粒核心包含超支化聚合物、树状大分子(dendrimer)、树枝化基元(dendron)、混合纳米颗粒或胶束。例如，所述多价纳米颗粒核心的直径可以为3至150nm。
如本文所用，超支化聚合物是多价颗粒，其在支化和结构方面是多分散的和不规则的。相反，树状大分子具有非常规则的、径向对称的代(generation)结构。树状大分子是单分散的球形聚合物，其与超支化聚合物相比，通常以多步合成的方式制备。树状大分子结构的特征在于代表对称中心的多功能核心、重复单元(代)的各种明确的径向对称层和端基。
超支化聚合物包括聚酯、聚酯酰胺、聚醚、聚酰胺、聚乙烯亚胺、聚甘油、聚乙交酯、聚丙交酯、聚丙交酯-共-乙交酯、聚酒石酸酯和多糖。超支化聚酯包括Perstorp AB的
Figure BDA0003624602240000061
超支化聚酯酰胺包括DSM BV荷兰的
Figure BDA0003624602240000062
聚甘油由Hyperpolymers GmbH生产，以及超支化聚乙烯亚胺包括BASF AG的
Figure BDA0003624602240000063
超支化聚合物还包括聚己内酯和共聚物，例如聚(D,L-丙交酯-共-乙交酯)，和Degussa AG从Dynapo；
Figure BDA0003624602240000064
和
Figure BDA0003624602240000065
产品系列生产的聚酯化合物。
超支化聚合物例如超支化聚甘油的制备在本领域中是众所周知的。例如，进行缩水甘油的受控阴离子开环多支化聚合反应以形成超支化聚甘油。然后使超支化聚甘油与琥珀酸酐在吡啶中反应，以通过酯键提供羧酸端基。一旦确认了超支化聚甘油上的官能团含量，即可通过以下方案将羟基进一步官能化：在pH 8.5的DMSO或DMF中，超支化聚甘油-OH+N-(对-马来酰亚胺基苯基)异氰酸酯(PMPI，10倍摩尔过量)，以获得超支化聚甘油-马来酰亚胺。因此，超支化聚甘油同时具有羧基和马来酰亚胺官能团，它们可以与相应的交联剂和化学基团反应，或者可以进一步衍生化以适合可用的特定官能团。
两亲性超支化聚合物可以形成胶束状结构。所述超支化聚合物可以是“不完美”的分子，因为它可能包括线性部分，并且可能具有无规或不对称支化的特征。可以对超支化聚合物进行选择性修饰，以在表面上实现多种官能性，以及将其与官能性组件连接，例如连接碳链以加入疏水性，和连接伯胺基团以提供亲水性和活化以进行后续修饰。
超支化聚合物的优点包括较小的单元尺寸(直径通常小于60nm)和相对简单的合成程序。可能的缺点包括宽的尺寸分布，以及控制特定官能性的表面修饰的可能的困难。
本文所用的术语“树状大分子”包括但不限于具有内部核心、规则地连接至该内部(initiator)核心并从其延伸的重复单元的内部层(或“代”)和连接至最外面的代的端基的外部表面的分子结构，其中每一层具有一个或多个支化点。树状大分子具有规则的树状或“放射星光状(starburst)”分子结构。例如，纳米颗粒树状大分子的直径通常为3至10nm。
每个连续的树状大分子代可以与前一代共价结合。核心结构的反应性基团的数量决定了n-方向性，并限定了可以被附着以形成下一代的结构的数量。
树状结构中的支化数量取决于单体结构嵌段(包括核心)的支化价。例如，如果所述核心是伯胺，则胺氮将是二价的，从而产生1-2个支化基序。
示例性树状大分子是烷基化树状大分子，如聚(酰胺-胺)(PAMAM)、聚(乙烯亚胺)(PEI)、聚丙烯亚胺(PPI)、二氨基丁烷胺聚丙烯亚胺四胺(DAB-Am4)、聚丙基胺(POPAM)、聚赖氨酸、聚酯、蝶烯(iptycene)、脂肪族聚(醚)、芳族聚醚树状大分子或包含一种或多种前述物质的组合。
所述树状大分子可以具有羧基、胺基和羟基末端，并且可以是任何一代，包括但不限于1代树状大分子(G1)、2代树状大分子(G2)、3代树状大分子(G3)、4代树状大分子(G4)、5代树状大分子(G5)、6代树状大分子(G6)、7代树状大分子(G7)、8代树状大分子(G8)、9代树状大分子(G9)或10代树状大分子(G10)。
所述PAMAM树状大分子含有内部酰胺键，其可以增强它们的生物降解性，从而提高有关人类治疗应用的耐受性。所述表面包括极性的高反应性伯胺基团。氨基官能的PAMAM树状大分子的表面是阳离子的，并且可以通过与带负电荷的分子的离子相互作用或使用许多众所周知的伯胺共价官能化试剂进行衍生化。
当使用PAMAM树状大分子时，通常使用0至7代PAMAM树状大分子。例如，混合纳米颗粒可以由以下形成：0代PAMAM树状大分子(G0)；1代PAMAM树状大分子(G1)；2代PAMAM树状大分子(G2)；3代PAMAM树状大分子(G3)；4代PAMAM树状大分子(G4)；5代PAMAM树状大分子(G5)；6代PAMAM树状大分子(G6)或7代PAMAM树状大分子(G7)。PAMAM可从多种来源商购获得，包括Sigma-Aldrich(Cat.号597309)。
二氨基丁烷胺聚丙烯亚胺四胺(DAB Am 4)是一种具有1,4-二氨基丁烷核心(4-碳核心)和4个表面伯氨基团的聚合物。当由DAB-AM 4树状大分子形成混合纳米颗粒时，通常使用0至7代DAB-AM 4树状大分子。例如，混合纳米颗粒可以由以下形成：0代DAB-AM 4树状大分子(G0)；1代DAB-AM 4树状大分子(G1)；2代DAB-AM 4树状大分子(G2)；3代DAB-AM 4树状大分子(G3)；4代DAB-AM 4树状大分子(G4)；5代DAB-AM 4树状大分子(G5)；6代DAB-AM 4树状大分子(G6)或7代DAB-AM 4树状大分子(G7)。DAB-AM 4可从多种来源商购获得，包括Sigma-Aldrich(Cat.号460699)。
所述多价纳米颗粒可以由一种或多种不同的树状大分子形成。树状大分子复合物的每个树状大分子可以具有与其他树状大分子相似或不同的化学性质(例如，第一个树状大分子可以是PAMAM树状大分子，而第二个树状大分子可以是POPAM树状大分子)。
树枝化基元是在焦点处具有多个端基和单一反应功能的单分散楔形树状大分子部分。例如，树枝化基元可以接枝到一个表面、另一个树枝化基元或一个大分子上。双MPA(双二羟甲基丙酸)树枝化基元可从Sigma-Aldrich获得。
如本文所用，“胶束”是指两亲性分子在水性介质中的聚集体，其具有内部核心和外部表面，其中所述两亲性分子主要根据其形成核心的疏水部分和形成外部表面的亲水部分取向。多种单克隆抗体、肽、蛋白质和小分子可以共价结合到胶束的亲水性头部基团上，并用多个缀合的ICI覆盖纳米颗粒，从而具有更强的结合动力学。胶束通常与形成其的两亲性分子或离子处于动态平衡，所述两亲性分子或离子在溶液中以非聚集形式存在。已知许多两亲性化合物和两亲性药物化合物在超过一定浓度(称为临界胶束浓度或CMC)的水性介质中自发形成胶束，所述两亲性化合物包括特别是去污剂、表面活性剂、两亲性聚合物、脂质聚合物(例如PEG-脂质)、胆汁盐、单链磷脂和其他单链两亲物。胶束的两亲性(例如脂质)组分不形成双层相、非双层中间相、各向同性液相或固态非晶型或结晶相。胶束的概念以及形成胶束的方法和条件是本领域技术人员众所周知的。胶束可与脂质颗粒共存于溶液中。
示例性的胶束包括在美国专利号9,212,258中描述的那些，所述专利因其公开了包含两亲性树枝化基元-线团(dendron-coil)的胶束而以引用的方式并入本文。每个两亲性树枝化基元-线团包括非肽基疏水性核心形成嵌段、聚酯树枝化基元和聚乙二醇(PEG)部分。包含两亲性树枝化基元-线团的胶束也被称为“多价树枝化基元缀合物”和“基于树枝化基元的纳米胶束(DNM)”。
胶束的疏水性核心形成嵌段是非肽基，即，疏水性核心形成嵌段不是肽。在一些实施方案中，胶束包含单一类型的两亲性树枝化基元-线团(即，所述胶束中的两亲性树枝化基元-线团都具有相同的三个组分)。在一些实施方案中，胶束包含多于一种类型的两亲性树枝化基元-线团(即，所述胶束中的两亲性树枝化基元-线团的三个组分不同)。
在一些实施方案中，所述两亲性树枝化基元-线团的非肽基疏水性核心形成嵌段包括聚己内酯(PCL)、聚(乳酸)(PLA)、聚(乙醇酸)(PGA)或聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)。在一些实施方案中，所述非肽基疏水性核心形成嵌段是PCL。在一些实施方案中，所述PCL是聚(ε-己内酯)。在一些实施方案中，所述非肽基疏水性核心形成嵌段是PLA。在一些实施方案中，所述非肽基疏水性核心形成嵌段是PGA。在一些实施方案中，所述非肽基疏水性核心形成嵌段是PLGA。所述非肽基疏水性核心形成嵌段具有的分子量包括但不限于约0.5kDa至约20kDa的分子量。在一些实施方案中，所述非肽基疏水性核心形成嵌段是分子量为约3.5kDa的聚(ε-己内酯)。在一些实施方案中，所述非肽基疏水性核心形成嵌段是分子量为14kDa的聚(ε-己内酯)。
在一些实施方案中，所述两亲性树枝化基元-线团的聚酯树枝化基元包括但不限于具有乙炔或羧酸酯核心的3代至5代，即3代(G3)、4代(G4)或5代(G5)聚酯树枝化基元。在一些实施方案中，所述聚酯树枝化基元为G3树枝化基元。在一些实施方案中，所述聚酯树枝化基元为G5树枝化基元。在一些实施方案中，所述聚酯树枝化基元具有乙炔核心。在一些实施方案中，所述聚酯树枝化基元为3代聚酯-8-羟基-1-乙炔双MPA树枝化基元。在一些实施方案中，所述聚酯树枝化基元具有羧酸酯核心。
在一些实施方案中，所述两亲性树枝化基元-线团的PEG部分是甲氧基PEG(mPEG)部分、末端为氨基的PEG(PEG-NH2)部分、乙酰化的PEG(PEG-Ac)部分、羧化的PEG(PEG-COOH)部分、末端为硫醇的PEG(PEG-SH)部分、N-羟基琥珀酰亚胺-PEG(PEG-NHS)部分、NH2-PEG-NH2部分或NH2-PEG-COOH部分。在一些实施方案中，所述PEG部分具有的分子量包括但不限于约0.2kDa至约5kDa的分子量。在一些实施方案中，所述PEG部分是mPEG部分。在一些实施方案中，所述PEG部分是分子量为约2kDa的mPEG部分。在一些实施方案中，所述PEG部分是分子量为约5kDa的mPEG部分。
在一个实施方案中，将聚酯树枝化基元用线性疏水性聚合物共价修饰以帮助促进链缠结和分子内相互作用，这有助于核-壳型胶束的自组装并使得疏水性药物分子能够被装载在胶束内。当在体内施用胶束时，PEG部分形成具有不结垢性质的亲水性冠部(corona)，并提供增加的循环半衰期。
生物学上重要的性质，例如生物降解性、循环半衰期、可靶向性、药代动力学和药物释放，可以通过改变两亲性树枝化基元-线团的三个组分(也称为三个聚合物嵌段)来控制。此外，所述共聚物结构是柔性的，并且易于通过改变每种组分的分子量来操作以微调亲水亲脂平衡(HLB)。例如，多种实施方案采用PCL、聚酯树枝化基元和PEG，其分子量分别为0.5-20kDa、G3-G5(约0.9-3.5kDa)和0.2-5kDa。因此，HLB(20MH/(MH+ML)，其中MH是亲水性嵌段的质量，而ML是亲脂性嵌段的质量)在2.22至19.94之间大范围变化。
当树枝化基元在两亲性树枝化基元-线团代中与疏水性线性聚合物(例如聚己内酯(PCL)、聚(乳酸)(PLA)、聚(乙醇酸)(PGA)和聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA))共聚时，锥形的两亲性树枝化基元-线团进而具有有利的结构属性，因为它们形成了自组装的胶束，所述胶束在热力学上是有利的，并且具有高度堆积的PEG表面层，以增加血液循环时间。形成胶束的热力学稳定性以及易于调节的独特结构。
所述纳米载体系统包括超支化聚合物和其他生物相容性纳米颗粒的混合物。例如，这样的混合纳米颗粒包括树状大分子-脂质体、树状大分子-PEG-PLA、树状大分子-外来体(exosome)混合物，其结合了树状大分子(直径为2-10nm)和较大的纳米颗粒(50-200nm)的独特优点。
示例性的混合纳米颗粒(也称为纳米混合物)包括在美国专利号9,168,225中描述的那些，所述专利因其公开了混合纳米颗粒而通过引用的方式并入本文。在该实施方案中，混合纳米颗粒是其中纳米核心被包围或封装在基质或壳中的颗粒。换句话说，较小颗粒在较大颗粒中。在某些实施方案中，所述混合纳米颗粒在脂质体内部包含纳米核心。在其他实施方案中，所述纳米核心被聚合物基质或壳(例如，聚合物纳米颗粒)包围。
所述纳米核心的最大直径优选为1nm至50nm。更优选地，所述纳米核心的最大直径为1至40nm，最优选其最大直径为3至20nm。可以通过动态光散射和/或扫描电子显微镜分析纳米核心以确定颗粒的尺寸。纳米核心可以具有任何形状和形态。纳米核心的实例包括纳米粉末、纳米簇、纳米晶体、纳米球、纳米纤维和纳米管。鉴于其纳米级尺寸，纳米核心骨架易于被排出。因此，所采用的纳米核心骨架不必是可生物降解的，但是在特定的实施方案中，所述纳米核心骨架是生物相容的，即对细胞无毒。如果在体外将它们添加到细胞中会导致小于或等于30％、20％、10％、5％或1％的细胞死亡，并且在体内不会引起炎症或其他此类不想要的不良影响，则骨架是“生物相容的”。
示例性的聚合物骨架包括但不限于，聚酰胺、多糖、聚酸酐、聚-L-赖氨酸、聚丙烯酰胺、聚甲基丙烯酸酯、多肽、聚环氧乙烷、聚乙烯亚胺(PEI)或树状大分子，所述树状大分子例如聚(酰胺胺)(PAMAM)和PAMAM(乙二胺-EDA)树状大分子或其修饰形式，所述修饰形式例如所述聚合物的羟基化、乙酰化或羧化形式。其他示例性聚合物骨架描述于例如WO98/46270(PCT/US98/07171)或WO98/47002(PCT/US98/06963)中。所述多价聚合物骨架分子可具有选自线性、支化、叉状或星形的构型。
在一些实施方案中，所述多价聚合物骨架分子的至少一部分可以是疏水的。在一些实施方案中，所述多价聚合物骨架分子的至少一部分可以是亲水的。在另一个实施方案中，所述多价聚合物骨架分子的一部分可以是疏水的，并且该分子的不同部分可以是亲水的。在特定的实施方案中，所述多价聚合物骨架分子是阳离子的。在其他的实施方案中，所述多价聚合物骨架分子是电中性的。在其他的实施方案中，所述多价聚合物骨架分子是阴离子的。本领域技术人员将认识到，可以选择多种起始材料以获得表现出所需性质的多价聚合物骨架分子。
在一个实施方案中，所述壳是由磷脂组成的脂质体，所述磷脂例如卵磷脂酰胆碱、卵磷脂酰乙醇胺、大豆磷脂酰胆碱、卵磷脂、鞘磷脂、合成磷脂酰胆碱、溶血磷脂酰胆碱、磷脂酰甘油、磷脂酸、磷脂酰乙醇胺或磷脂酰丝氨酸，其中所述磷脂可以用长循环剂或冷冻保护剂进行修饰。在另一个实施方案中，所述壳是由聚合物组成的聚合物纳米颗粒，所述聚合物选自聚(γ-L-谷氨酰基谷氨酰胺)、聚(γ-L-天冬氨酰基谷氨酰胺)、聚-L-乳酸、聚(乳酸-共-乙醇酸)、聚氰基丙烯酸烷基酯、聚酸酐、聚羟基酸、聚丙基延胡索酸酯、聚酰胺、聚缩醛、聚醚、聚酯、聚(原酸酯)、聚氰基丙烯酸酯、[N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺]共聚物、聚乙烯醇、聚氨酯、聚磷腈、聚丙烯酸酯、聚脲，聚胺、聚ε-己内酯及其共聚物的组，其中所述聚合物被修饰或衍生化以增强蛋白水解抗性、改善循环半衰期、降低抗原性、降低免疫原性、降低毒性、改善溶解度或改善热稳定性或机械稳定性。在特定的实施方案中，所述壳是可生物降解的。在某些实施方案中，所述多价聚合物骨架是阳离子的，并且由聚酰胺、多糖、聚酸酐、聚-L-赖氨酸、聚丙烯酰胺、聚甲基丙烯酸酯、多肽、聚环氧乙烷、聚乙烯亚胺、聚(酰胺胺)(PAMAM)或PAMAM(乙二胺-EDA)组成。
另一种混合纳米颗粒是如美国申请序列号16/011,922中所述的树状大分子-外来体混合物。树状大分子-外来体混合物是装载有一种或多种纳米颗粒树状大分子的外来体。如本文所用，外来体是指具有从多种细胞分泌的膜结构的小囊泡。外来体的直径为约25至约150nm。外来体可以表达标志物，例如VLA-4、CD162、CXCR4、CD9、CD63、CD81或其组合。在一个实施方案中，所述外来体衍生自从受试者(例如人类受试者)分离的干细胞或肿瘤细胞。
在一个实施方案中，所述外来体衍生自从受试者(例如人类受试者)分离的干细胞或肿瘤细胞。
干细胞包括胚胎干细胞或成人干细胞，优选成人干细胞。所述成人干细胞可以是但不限于间充质干细胞、人类组织来源的间充质基质细胞(间充质基质细胞)、人类组织来源的间充质干细胞、多能干细胞或羊膜上皮细胞，优选间充质干细胞。所述间充质干细胞可以源自但不限于脐带、脐带血、骨髓、脂肪、肌肉、神经、皮肤、羊膜、胎盘等。
在一个实施方案中，所述干细胞是间充质干细胞。间充质干细胞(MSC)可以特异性地靶向在癌性区域中常见的炎性区域，即MSC肿瘤归巢。
在另一个实施方案中，所述外来体是从肿瘤细胞分离的。肿瘤细胞活跃地产生、释放和利用外来体来促进肿瘤的生长。
外来体可通过从受试者分离肿瘤或干细胞、使所述肿瘤或干细胞扩增以提供扩增的细胞群、培养所述扩增的细胞群、并分离从所述扩增的肿瘤或干细胞分泌的外来体来产生。可以从分离的外来体中除去内部组分，以提供所谓的空壳(ghost)外来体，其实质上是用于装载例如纳米颗粒树状大分子的组分的空容器。除上述特征外，源自患者的外来体还可以为患者提供非免疫原性的纳米载体壳，从而为个性化医疗提供了一种选择。
为了允许免疫检查点抑制剂的缀合，一方面，通过与烷基环氧化物反应来修饰多价纳米颗粒，其中环氧化物的R基团具有1至30个碳原子。在一些实施方案中，所述烷基环氧化物与多价纳米颗粒上存在的氨基反应以形成烷基化的多价纳米颗粒。
存在于多价纳米颗粒上的胺基使用偶联接头为多种基于胺的缀合反应提供反应位点，所述偶联接头包括但不限于：二环己基碳化二亚胺、二异丙基碳化二亚胺、N-(3-二甲基氨基丙基)-N'-乙基碳化二亚胺、1,1'-羰基二咪唑、N-琥珀酰亚胺基S-乙酰基硫代乙酸酯、N-琥珀酰亚胺基-S-乙酰基硫代丙酸酯、2-巯基乙胺、磺基琥珀酰亚胺基4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸酯、琥珀酰亚胺基碘乙酸酯、琥珀酰亚胺基3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯。在一些实施方案中，反应性酯用于通过酯键连接多价纳米颗粒和其他化合物。反应性酯的实例包括但不限于N-羟基琥珀酰亚胺酯、N-羟基磺基琥珀酰亚胺酯、N-γ-马来酰亚胺基丁酰基-氧磺基琥珀酰亚胺酯、硝基苯基酯、四氟苯基酯、五氟苯基酯、硫代吡啶基酯、硫代硝基苯基酯。优选地，所述反应性酯基团是N-羟基琥珀酰亚胺酯。
本文所述的纳米颗粒包含β-发夹肽，例如对检查点抑制剂受体具有高亲和力的β-发夹肽。
示例性的β-发夹肽包括肿瘤靶向肽，例如结合细胞表面受体的肽、靶向细胞内受体的肽和与细胞外基质相互作用的肽。例如，结合细胞表面受体的肿瘤靶向肽包括结合整联蛋白(例如具有RGD结合基序的αvβ3整联蛋白和在结肠、肝、卵巢、胰腺和鳞状癌细胞表面上表达的αvβ6整联蛋白)的肽。肿瘤靶向肽的其他靶标包括氨肽酶N、肽转运蛋白1、表皮生长因子受体、前列腺特异性膜抗原、粘蛋白1、尿激酶纤溶酶原激活剂受体、胃释放肽受体、生长抑素受体、胆囊收缩素受体、神经降压素受体、转铁蛋白受体、血管内皮生长因子受体、胰岛素、肝配蛋白受体等。结合细胞内受体的肿瘤靶向肽包括结合BCR/ABL(一种导致慢性粒细胞性白血病(CML)的慢性期的致病性融合蛋白)、细胞周期蛋白A、CDK、线粒体等的肽。靶向细胞外基质的肽包括结合纤连蛋白、成纤维细胞生长因子、基质金属蛋白酶、前列腺特异性抗原、组织蛋白酶等的肽。
细胞穿透肽包括R8、TAT、Transportan和Xentry。
β-发夹肽，如ZAβ3，可用于治疗蛋白质折叠疾病，如阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿病、克雅氏病、囊性纤维化、戈谢病和许多其他退行性和神经退行性病症。
免疫检查点抑制剂β-发夹肽可以通过鉴定与免疫检查点受体表面以高亲和力相互作用的免疫检查点抑制剂配体肽(例如，表面肽)来鉴定。例如，本文已鉴定出以高亲和力与PD-L1相互作用的表面β-发夹PD-1肽。如本文所用，高亲和力是指KD为0.1-1000nM。此类肽可具有5至50个氨基酸的长度，并且不对应于整个免疫检查点抑制剂。
示例性的β-发夹PD-1肽包括：
SEQ ID NO:1：TYLCGAISLAPKLQIKESLRA(βH1-wt序列)
SEQ ID NO:2：TYVCGVISLAPRIQIKESLRA(βH1-突变体序列)
SEQ ID NO:3：VLNWYRMSPSNQTDRKAA(βH2-wt序列)
SEQ ID NO:4：HVVWHRESPSGQTDTKAA(βH2-wt序列)
在一个方面，β-发夹肽包含色氨酸拉链。SEQ ID NO：4的色氨酸拉链类似物是SEQID NO：5。
SEQ ID NO:5：HKVWHWESPSGQWDTWAA(Trp-ZipβH2突变体序列)
如本文所用，色氨酸拉链是包含四个色氨酸残基的β-发夹肽，所述四个色氨酸残基位于相同的肽表面上，它们聚集并稳定β-发夹肽。
trpzip策略(例如，肽折叠结构的稳定化)，除了与纳米颗粒缀合之外，进一步由于纳米颗粒(例如树状大分子)表面上肽的折叠结构的稳定性而提高了β-发夹肽的结合动力学。肽和纳米颗粒表面之间的分子间力，包括氢键、范德华力、偶极相互作用，也有助于稳定肽的折叠结构，从而改善整体结合动力学。
除β-发夹肽外，多价纳米颗粒核心上的大量端基可以用于多种分子的缀合。该多价纳米颗粒核心可以与一种或多种治疗剂、预防剂或诊断剂关联，例如复合或缀合。诊断剂包括成像剂。
一方面，所述治疗剂是化疗剂。化疗剂包括但不限于以下类别：烷基化剂、抗代谢药、蒽环类药、植物生物碱、拓扑异构酶抑制剂、单克隆抗体和其他抗肿瘤剂。除了上述化疗药物，即多柔比星、紫杉醇外，其他合适的化疗药物还包括酪氨酸激酶抑制剂甲磺酸伊马替尼
Figure BDA0003624602240000161
或
Figure BDA0003624602240000162
顺铂、卡铂、奥沙利铂、甲氯乙胺(mechloethamine)、环磷酰胺、苯丁酸氮芥、硫唑嘌呤、巯基嘌呤、嘧啶、长春新碱、长春花碱、长春瑞滨、长春地辛、鬼臼毒素(L01CB)、依托泊苷、多西他赛、拓扑异构酶抑制剂(L01CB和L01XX)伊立替康、托泊替康、安吖啶、依托泊苷、依托泊苷磷酸酯、替尼泊苷、放线菌素D、氯尼达明、以及单克隆抗体(例如曲妥珠单抗
Figure BDA0003624602240000163
西妥昔单抗、贝伐单抗和利妥昔单抗
Figure BDA0003624602240000164
等。
治疗剂的其他实例包括但不限于抗微生物剂、镇痛剂、抗炎剂及其他。可以将通常用于治疗感染的抗生素(例如万古霉素)掺入颗粒中，所述感染包括由耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)引起的感染。所述颗粒任选地包括环孢菌素，一种作为免疫抑制剂的亲脂性药物，广泛用于同种异体器官移植后，以降低患者免疫系统的活性和器官排斥的风险(由诺华公司以商标名称
Figure BDA0003624602240000165
和
Figure BDA0003624602240000166
销售)。包含环孢菌素的颗粒也可以用于局部用乳剂中以治疗干燥性角膜结膜炎。在这方面，可以设计具有掺入此类药物的多官能表面结构域的颗粒，以将等剂量的各种药物直接递送至癌细胞，从而潜在地使通常递送至患者的量最小化，并使对其他组织的附带损害最小化。
治疗剂还包括治疗性核酸，例如基因沉默剂、基因调节剂、反义剂、肽核酸剂、核酶剂、RNA剂和DNA剂。核酸治疗剂包括能够减少或抑制靶基因或序列表达的单链或双链RNA或DNA，特别是RNA，例如三链体寡核苷酸、核酶、适体、包括siRNA(短干扰RNA)和shRNA(短发夹RNA)的小干扰RNA、反义RNA、微小RNA(miRNA)或其一部分，或其类似物或模拟物。抑制性核酸可以通过例如介导降解或抑制与干扰RNA序列互补的mRNA的翻译而起作用。
诊断剂是能够对组织或疾病进行检测或成像的试剂。诊断剂的实例包括但不限于放射性标记、荧光团和染料。
成像剂是指附着在本发明的无规共聚物上的用于对受试者的肿瘤、器官或组织进行成像的标记。成像剂的实例包括但不限于放射性核素、荧光团(例如荧光素、若丹明、异硫氰酸酯(TRITC、FITC)、德克萨斯红、Cy2、Cy3、Cy5、APC和
Figure BDA0003624602240000171
(Invitrogen,Carlsbad,Calif.)系列荧光团)、抗体、钆、金、纳米材料、辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、其衍生物及其混合物。
放射性标记是指表现出放射性的核素。“核素”是指通过其原子序数、原子质量和能态而特定的原子类型，例如碳14(14C)。“放射性”是指由放射性物质发射的辐射，包括α粒子、β粒子、核子、电子、正电子、中微子和伽马射线。
预防剂的施用可以在疾病或病症的特征性症状表现出来之前发生，使得疾病或病症被预防或替代地在其进展上被延缓。
治疗性分子、诊断剂和预防剂可以通过化学缀合、物理包封和/或静电相互作用方法与多价纳米颗粒核心组合。
还包括包含本文所述的纳米颗粒系统的药物组合物。药物组合物可以进一步包含如上所述的治疗剂、预防剂或诊断剂。
如本文所用，“药物组合物”是指治疗有效量的纳米颗粒以及药学上可接受的赋形剂，例如稀释剂、防腐剂、增溶剂、乳化剂和佐剂。如本文所用，“药学上可接受的赋形剂”是本领域技术人员众所周知的。
用于口服施用的片剂和胶囊剂可以是单位剂型，并且可以含有常规的赋形剂，例如结合剂，例如糖浆、阿拉伯胶、明胶、山梨糖醇、黄芪胶或聚乙烯吡咯烷酮；填充剂，例如乳糖、糖、玉米淀粉、磷酸钙、山梨糖醇或甘氨酸；压片润滑剂，例如硬脂酸镁、滑石粉、聚乙二醇或二氧化硅；崩解剂，例如马铃薯淀粉，或可接受的润湿剂，例如十二烷基硫酸钠。可以根据常规制药实践中众所周知的方法将所述片剂包衣。口服液体制剂可以是例如水性或油性悬浮剂、溶液剂、乳剂、糖浆剂或酏剂的形式，或者可以作为干燥产品存在，在使用前用水或其他合适的媒介物对其进行重构。这样的液体制剂可以含有常规的添加剂，例如悬浮剂，例如山梨糖醇、糖浆、甲基纤维素、葡萄糖浆、明胶氢化的食用脂肪；乳化剂，例如卵磷脂、脱水山梨糖醇单油酸酯或阿拉伯胶；非水性媒介物(可能包括食用油)，例如杏仁油、分馏椰子油、油性酯(如甘油、丙二醇或乙醇)；防腐剂，例如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯或山梨酸，以及(如果需要的话)常规的调味剂或着色剂。
为了局部施用于皮肤，可以将药物制成乳膏剂(cream)、洗剂(lotion)或软膏剂(ointment)。可以用于药物的乳膏剂或软膏剂制剂是本领域公知的常规制剂。局部施用包括透皮制剂，例如贴剂。
为了局部施用于眼睛，可以将抑制剂在合适的无菌水性或非水性媒介物中制成溶液或悬浮液。还可以包括添加剂，例如缓冲剂，例如焦亚硫酸钠或乙二胺四乙酸二钠；防腐剂，包括杀细菌剂和杀真菌剂，例如乙酸苯汞或硝酸苯汞、苯扎氯铵或氯已定，以及增稠剂，例如羟丙甲纤维素。
活性成分也可以在无菌介质中以无菌的可注射的水性或油性悬浮液的形式肠胃外(皮下、或静脉内、或肌肉内、皮下(intrasternally)或通过输注技术)施用。根据所用的媒介物和浓度，药物可以被悬浮或溶解在媒介物中。有利地，诸如局部麻醉剂、防腐剂和缓冲剂之类的佐剂可以溶解在媒介物中。
药物组合物可以方便地以单位剂型存在，并且可以通过药学领域公知的任何方法制备。术语“单位剂量”是指足以有效治疗指定的活性或状况的活性成分的预定量。制备每种类型的药物组合物包括使活性化合物与载体和一种或多种任选的辅料成分结合的步骤。通常，通过将活性化合物与液体或固体载体均匀且紧密地结合在一起来，然后(如果需要的话)将产品成型为所需的单位剂型来制备制剂。
在一方面，一种制备纳米颗粒系统的方法包括，在足以将多种免疫检查点抑制剂缀合至多价纳米颗粒核心并提供纳米颗粒系统的条件下，使包含多个反应性端基的多价纳米颗粒核心与包含免疫检查点抑制剂的组合物接触。示例性的端基包括偶联接头和反应性环氧化物，例如二环己基碳化二亚胺、二异丙基碳化二亚胺、N-(3-二甲基氨基丙基)-N'-乙基碳化二亚胺、1,1'-羰基二咪唑、N-琥珀酰亚胺基S-乙酰基硫代乙酸酯、N-琥珀酰亚胺基-S-乙酰基硫代丙酸酯、2-巯基乙胺、磺基琥珀酰亚胺基4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸酯、琥珀酰亚胺基碘乙酸酯、琥珀酰亚胺基3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯、N-羟基琥珀酰亚胺酯、N-羟基磺基琥珀酰亚胺酯、N-γ-马来酰亚胺基丁酰基-氧磺基琥珀酰亚胺酯、硝基苯基酯、四氟苯基酯、五氟苯基酯、硫代吡啶基酯、硫代硝基苯基酯，以及包含前述至少一项的组合。
在一个实施方案中，所述多价纳米颗粒核心包含两种或更多种不同类型的反应性端基，以增强所述核心的反应性和/或特异性。
在另一个实施方案中，所述免疫治疗方法包括向受试者(例如人类受试者)施用本文所述的纳米颗粒系统。示例性的人类受试者包括癌症患者和患有免疫病症(例如多发性硬化症和类风湿性关节炎)的患者。所述纳米颗粒可以通过与T细胞、癌细胞和/或抗原呈递细胞相互作用来靶向免疫系统。
当β-发夹肽是免疫检查点抑制剂肽时，本文所述的组合物和方法适用于所有癌症，包括实体瘤癌症，例如乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、肺癌和脑癌，以及液体癌如白血病和淋巴瘤。
本文所述的方法可以进一步与另外的癌症疗法例如放疗、化疗、手术及其组合相结合。
通过以下非限制性实施例进一步说明本发明。
实施例
实施例1：PD-1/PD-L1肽抑制剂复合物的合成与分析
材料和方法
肽合成。Fmoc-氨基酸和偶联试剂购自Anaspec(美国)和Novabiochem(德国)，而通用化学品从Sigma-Aldrich(美国)获得。Rink Amid MBHA树脂LL(Novabiochem,德国)用作肽合成的骨架。使用具有标准Fmoc保护基团的标准氨基酸合成序列。肽从树脂上的最终去保护和裂解涉及用裂解混合物(cocktail)(三氟乙酸(TFA):苯甲硫醚:乙二硫醇(EDT)比例为95:2.5:2.5)处理结合树脂的肽2小时，然后用叔丁基甲基醚沉淀。使用反相HPLC(水/乙腈和0.1％TFA的流动相)纯化肽。肽分子量通过基质辅助激光解吸/电离飞行时间(MALDI-TOF)质谱(AXIMATM,Shimadzu,日本)以α-氰基-4-羟基肉桂酸(CHCA)作为基质进行量化。肽浓度通过紫外-可见(UV-Vis)分光光度法在水/乙腈(1:1)中使用色氨酸(5500M-1cm-1)和酪氨酸(1280M-1cm-1)在280nm处的摩尔消光系数进行量化。
树状大分子-肽缀合物(DPC)的制备。溶解在1mL甲醇中的G7 PAMAM树状大分子(10mg)(Dendritech,美国)通过添加相当于树状大分子表面上胺基数量的60、80和90％的乙酸酐以及超过树状大分子600摩尔的三乙胺(TEA)进行乙酰化。反应在剧烈搅拌下在室温下进行24小时。使用VivaspinTM Turbo 15(MWCO 10,000，Sartorius，德国)以4,000r.p.m.的速度持续15分钟并用ddH2O洗涤10次(离心过滤)来去除多余的试剂。然后使用N-羟基琥珀酰亚胺罗丹明(NHS-RHO)对乙酰化的树状大分子进行荧光标记，以更好地量化和可视化纳米颗粒。将树状大分子溶解在二甲亚砜(DMSO)中，将树状大分子数量的10当量的溶解在DMSO中的NHS-RHO以逐滴方式加入，然后在室温下反应24小时。通过离心过滤除去过量的试剂。然后将NHS-RHO标记的树状大分子与肽缀合。将树状大分子溶解在磷酸盐缓冲盐水(PBS,pH 7.4)中，然后将溶解在PBS中的1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺(EDC)和NHS添加到树状大分子溶液中。然后将溶液在室温下剧烈搅拌1小时。之后，加入溶解在PBS中的肽，然后在室温下反应24小时。通过离心过滤除去过量的肽和试剂。
表面等离子体共振(SPR)。使用BIAcoreTMX(Pharmacia Biosensor AB,Uppsala,瑞典)进行SPR分析。简而言之，将PD-L1蛋白(R&D systems)通过EDC/NHS化学固定在传感器芯片(CM5传感器芯片，GE Healthcare)的羧化葡聚糖包被的金膜表面上。以20μL/min的流速注入30μL样品溶液。让样品溶液流入两个通道(通道1用于参考，通道2为PD-L1)，通过从通道1的信号中减去通道2的信号获得最终的SPR传感图。
圆二色性(CD)光谱学。CD光谱是使用Aviv 420型圆二色光谱仪(Aviv，美国)获得的。使用1mm光程长度的石英比色皿从260至190nm分析样品。
衰减全反射-傅里叶变换红外(ATR-FTIR)光谱。将溶解在H2O中的样品在ZnSe ATR棱镜上干燥。FTIR光谱在Bruker Equinox 55/S FTIR光谱仪上获得。
分子动力学(MD)模拟研究。使用具有0.01ps-1阻尼常数和2fs时间步长的朗之万动力学，在P＝1bar和T＝300K的NPT系综中使用NAMD和CHARMM力场(CHARMM通用力场和CHARMM36)来模拟系统。在存在周期性边界条件的情况下，通过PME方法计算长程静电相互作用。通过VMD分析氢键数量，截断距离为
Figure BDA0003624602240000212
角度为60°。
荧光偏振(FP)测定。PBS中的FP测定用于PD-L1结合和竞争测定(λex＝480nm；λem＝535nm)。荧光各向异性测量在室温下在384孔板中使用
Figure BDA0003624602240000211
M1000 Pro酶标仪(Tecan)进行。温育30分钟后，将fβH2_mt/PD-L1复合物用于FP竞争测定，并与竞争者一起滴定。
细胞培养。人肾细胞癌(RCC)细胞系786-O和乳腺癌细胞系MCF-7分别用作高表达和低表达PD-L1的癌细胞模型。人类T淋巴细胞系Jurkat在本研究中用作表达PD-1的代表性免疫细胞。786-O和Jurkat T细胞在RPMI培养基中培养，而MCF-7细胞在DMEM培养基中生长。所有细胞培养基均添加了1％(v/v)青霉素/链霉素(P/S)和10％(v/v)胎牛血清(FBS)。细胞在37℃下在含有5％CO2的潮湿环境中温育。
蛋白质印迹。通过将细胞与RIPA缓冲液(150mM NaCl、1％NP-40、1％脱氧胆酸钠、0.1％SDS、50mM Tris–HCl(pH 7.5)、2mM EDTA、蛋白酶抑制剂混合物II)一起温育来制备来自786-O和MCF-7细胞的总蛋白裂解物。通过BCA测定(PierceTMBCA蛋白质测定试剂盒)对裂解物的蛋白质含量进行定量。将25μg蛋白质在4-16％梯度丙烯酰胺凝胶上分离，并在湿转移条件下转移到PVDF膜上。在4℃下用针对PD-L1的一抗(多克隆抗人PD-L1，AF156，R&DSystems)和针对β-肌动蛋白的一抗(单克隆抗β-肌动蛋白，MAB8929，R&D Systems)对印迹进行过夜探测，然后在室温下与适当的二抗温育1小时。使用化学发光试剂ClarityTMWestern ECL底物(Bio-Rad)检测印迹上的蛋白质，并使用SyngeneTM G:Box F3(Syngene,Frederick,MD)成像。
T细胞细胞因子产生的评估。通过使用ELISA评估T细胞分泌的白细胞介素2(IL-2)的量，以在癌症-免疫细胞共培养系统中研究Jurkat T细胞的活性。将癌细胞在96孔板(5,000个细胞/孔)中温育48小时。将癌细胞和T细胞用干扰素-γ(IFNγ,10ng/mL)和植物血凝素(PHA,1μg/mL)/佛波醇十四烷酸乙酸酯(PMA,50ng/mL)预处理30小时，以分别激活PD-L1和PD-1表达。然后用ICI处理癌细胞6小时，随后与Jurkat T以1:4的比例共培养。温育48小时后收集细胞培养上清液并评估IL-2。
化学敏感性测定。通过测量免疫检查点抑制剂与化疗药物多柔比星的协同细胞毒性作用进行化学敏感性测定。将癌细胞接种在96孔板(5,000个细胞/孔)中并温育48小时。如前所述，用IFNγ和PHA/PMA对癌细胞和Jurkat T细胞进行预处理。然后用钙黄绿素AM(1.5μM)对癌细胞进行染色，然后用ICIS处理2小时。在多柔比星(5μM)处理之前，将细胞以1:4的比例再共培养24小时。根据荧光强度的变化，分析了多柔比星处理(2小时)后每种ICI对癌细胞存活的影响。
结果：
为了开发PD-1/PD-L1肽抑制剂复合物，通过三种协同方法的组合鉴定和改造来自PD-1表面的β-发夹肽(图1)。首先，我们使用非天然PD-1胞外域的氨基酸组成进行了优化，以表现出高PD-L1亲和力。其次，这些肽以多价方式与树状大分子表面缀合，从而能够与肿瘤细胞上的多种PD-L1蛋白进行协同、强烈的相互作用。第三，由于已占体积效应和树状大分子-肽的相互作用，树状大分子表面上的缀合有助于肽折叠成它们的天然结构β-发夹。
考虑到这些工程化方法的潜在协同效应，我们因此假设这种DPC策略将使所述肽在与PD-L1竞争性相互作用中优于天然PD-1，从而恢复抗肿瘤免疫。
为了开发靶向PD-L1的DPC，基于工程化的PD-1胞外域序列合成了β-发夹肽(βH1_mt和βH2_mt，图2)，并将其附着在第七代(G7)聚(酰胺胺)(PAMAM)树状大分子的表面。鉴于G7 PAMAM树状大分子的表面积比PD-1/PD-L1界面的表面积大约大10倍(图3)，在缀合之前，90％的树状大分子胺基被乙酰化以控制附着肽的数量。然后使用表面等离子体共振(SPR)分析所得的DPC，记为G7-βH1_mt和G7-βH2_mt，以测量它们的结合动力学。如图4所示，G7-βH2_mt对固定化的PD-L1蛋白的亲和力高于G7-βH1_mt，而完全乙酰化的树状大分子没有显示出结合反应。此外，G7-βH2_mt的PD-L1亲和力也高于野生型βH2-树状大分子缀合物对照(G7-βH2_wt)，这表明工程化PD-1序列(βH2_mt)导致更高的亲和力。因此，我们选择βH2_mt肽作为PDL1靶向配体并将它们缀合到具有不同乙酰化程度的树状大分子表面以确定有效肽效价。可以预期作为多价结合相互作用的结果的结合强度将与配体分子的数量成比例。然而，对于具有更多数量的βH2_mt肽的DPC(即由80％和60％乙酰化的树状大分子制备的DPC)，观察到较低的PD-L1亲和力(图5)。这些意想不到的结果可能归因于这样一个事实，即配体之间优化的空间距离在实现更强的结合方面起着关键作用，而不是仅仅增加配体的数量，这在其他地方也观察到。这些结果共同表明，由90％乙酰化的树状大分子制备的G7-βH2_mt可能比其对应物G7-βH1_mt和G7-βH2_wt更有效地拮抗PD-1/PD-L1相互作用。
接下来，我们比较了G7-βH2_mt与抗PD-L1(aPD-L1)抗体和游离βH2_mt肽的PD-L1结合动力学。SPR分析显示，G7-βH2_mt显示出比βH2_mt高五个数量级的PD-L1亲和力(KD为2.75×10-9与1.19×10-4)，这与整个aPD-L1抗体的PD-L1亲和力(KD为2.09×10-9)相当，如图6-8所示。值得注意的是，与游离肽相比，G7-βH2_mt的解离速率常数(kd)降低了约180倍，尽管每个树状大分子只有30个肽(数据未示出)。这种结合的非线性增强是多价结合效应的特征，即多价对象比其单价对应物具有更高的与靶标分子重新结合的机会(统计学重新结合机制)。有趣的是，已知在多价结合效应中起次要作用的结合速率常数(ka)也呈非线性增加(2.52×105与1.07×103)。这一结果表明，除了多价结合之外，其他因素也有助于显著增强G7-βH2_mt的PD-L1结合。
为了阐明G7-βH2_mt的提高的结合动力学背后的机制，我们研究了肽的折叠结构变化，这显著影响了它们与树状大分子缀合后的靶标亲和力和选择性[20]。图9显示了G7-βH2_mt的圆二色性(CD)谱(红线)，其中观察到一定程度的肽折叠(约220nm处的负信号)，这与由于α-螺旋结构而以222nm为中心的典型宽负CD带不同。相比之下，游离的βH2_mt显示出几乎去折叠的无规卷曲结构(黑线)，如在大约200nm处的强负CD带所示。请注意，树状大分子的CD谱(红色和灰色线)省略了218nm以下的信号，因为树状大分子骨架中的大量酰胺键吸收了远紫外(UV)光。将浓度为1μM的树状大分子用于最大限度地减少大分子对低波长光的吸收，但仍能获得足够强的信号，用于在通常表征肽的二级结构的190-230nm范围内进行数据解释。
然后我们使用衰减全反射-傅里叶变换红外(ATR-FTIR)来研究肽的折叠行为。如图10所示，FTIR光谱证实在βH2_mt肽中存在无规卷曲和β-折叠(1640cm-1附近的宽带)，以及微量β-转角结构(1670和1690cm-1附近的弱吸收)。相比之下，G7-βH2_mt的FTIR光谱显示了β-发夹结构的特征，即链间振动耦合在1634cm-1处具有可分辨吸收，以及β-转角构象在1668和1683cm-1处具有可分辨吸收。因此，两种结构分析共同表明βH2_mt的发夹结构被树状大分子缀合稳定。这些结果与几项理论研究一致，表明表面束缚通过已占体积效应使生物分子结构稳定(图11)，即在底物存在的情况下，要展开的肽的构象自由度受到限制，从而降低了折叠的熵代价。
为了支持实验结果，我们还使用单个βH2_mt肽-五代(G5)PAMAM树状大分子缀合物进行了分子动力学(MD)模拟。请注意，为了高效的计算时间，使用G5 PAMAM树状大分子而不是更大的G7。比较最初(1)延伸和(2)折叠的βH2_mt在树状大分子表面上的肽行为，持续500ns(图12和13)。与在溶液中表现出折叠和延伸构象的游离βH2_mt相反，最初延伸的肽弯曲成折叠结构并且最初折叠的βH2_mt在树状大分子表面上稳定地保持折叠构象。有趣的是，肽与树状大分子表面产生多种分子间力，包括氢键、静电相互作用和范德华相互作用，同时保持发夹结构(数据未示出)。通常，已知与表面形成这种分子相互作用会降低蛋白质的结构稳定性。然而，βH2_mt是一个分离的肽片段，最初暴露于整个PD-1蛋白结构中的多种分子相互作用(数据未示出)。除了上述减少的熵代价之外，这些分子相互作用似乎有助于进一步稳定树状大分子表面上处于折叠构象的肽分子。稳定β-发夹的最佳方法是肽中两条链的共价交联。然而，化学修饰通常会使肽制备过程复杂化，进而导致合成产量显著下降。引入链间非共价结合是另一种常用的策略；然而，它需要大量的氨基酸取代，这可能会影响肽的物理化学性质。相反，我们的DPC策略允许在对肽结构进行最小修饰的情况下稳定肽的发夹结构。结合树状纳米颗粒赋予的多价结合优势，这种独特的DPC平台提供了一种有效拮抗和靶向富含β-折叠的蛋白质表面的新方法。
接下来，我们研究了使用G7-βH2_mt作为PD-1/PD-L1抑制剂的可能性。为了进行荧光偏振(FP)竞争测定，合成了荧光素缀合的βH2_mt(fβH2_mt)肽并用于构建与PD-L1蛋白的靶复合物(图14)。在竞争实验中(fβH2_mt，10nM；PD-L1，2μM)，复合物完整性不受添加βH2_mt肽和完全乙酰化的树状大分子的影响，而G7-βH2_mt导致fβH2_mt从PD-L1发生剂量依赖性置换(图15)。有趣的是，尽管PD-L1亲和力稍低，但DPC显示出比aPDL1抗体更有效的竞争力，这可归因于允许在DPC表面上容纳多个靶蛋白的多价配体展示(图16)。
为了进一步检查它们的效率，然后在体外测试了DPC。如图17和18所示，使用荧光显微镜观察到了G7-βH2_mt与786-O细胞(PD-L1过表达细胞系)的强细胞相互作用，而DPC与MCF-7细胞(PD-L1表达水平低)的相互作用显著减少，表明G7-βH2_mt具有高PD-L1选择性。然后通过测量Jurkat T细胞与癌细胞共培养后分泌的细胞因子(白细胞介素2、IL-2)的量来评估体外PD-1/PD-L1抑制作用，如别处所述(图19)。众所周知，阻断PD-1/PD-L1结合可激活T细胞并促进其细胞因子的产生。图20显示，G7-βH2_mt有效抑制786-O/Jurkat T细胞相互作用，导致与未经处理的癌细胞相比，T细胞分泌的IL-2增加1.52倍(p<0.001)，这甚至比仅显示1.34倍增强(p＝0.011)的aPD-L1抗体更为明显。这可归因于G7-βH2_mt的多价结合效应。请注意，游离肽和完全乙酰化的树状大分子均未诱导明显的IL-2产生。
为了证实PD-1/PD-L1抑制作用，我们还测试了DPC处理是否会影响癌细胞的化疗耐药性，在许多临床和临床前研究中，已证明免疫检查点阻断可以降低这种抗性。使用肿瘤(786-O或MCF-7)和Jurkat T细胞的共培养模型来研究多柔比星(DOX)和G7-βH2_mt的协同细胞毒性作用(图21)。将用不同的PD-L1拮抗剂处理的癌细胞与T细胞共培养，然后进行DOX处理以诱导细胞死亡。如图22所示，与仅用多柔比星处理的细胞相比，用G7-βH2_mt阻断PD-L1分子显著降低了786-O细胞的化疗耐药性，表现为细胞活力降低了8.4±3.8％(p＝0.022)。G7-βH2_mt比诱导细胞活力降低7.2±3.7％的aPD-L1抗体略微更有效(p＝0.030)。考虑到游离肽对化疗耐药性的影响很小(减少1.8±2.0％；p＝0.334)，而完全乙酰化的G7树状大分子对癌细胞没有细胞毒性作用，这一结果提供了另一层证据，即多价G7-βH2_mt有效阻断了PD-1/PDL1免疫检查点。表达低水平PD-L1的MCF-7细胞也表现出类似的趋势，尽管差异不如高表达PD-L1的786-O细胞显著。
总之，我们已经证明，DPC方法能够使从蛋白质表面分离的β-发夹肽在纳米级树状大分子上多聚化和构象稳定，从而表现出显著增强的靶标亲和力。增强的结合动力学转化为体外效率的显著提高，其中DPC表现出比游离肽显著更强的PD-1/PD-L1抑制作用，并且与aPD-L1抗体具有相当的效率水平。使用抗体的PD-L1抑制已在临床上被证明可有效治疗多种癌症类型，例如非小肺癌、膀胱癌和默克尔细胞皮肤癌。然而，目前批准的基于单克隆抗体的拮抗剂由于成本高且缺乏模块化而存在局限性。我们的策略有可能解决这些问题，因为树状大分子-肽系统提供了一种平台技术，其不仅可以适应免疫疗法，还可以适应其他抗肿瘤药物。此外，许多蛋白质表面上的多种β-发夹肽可以与这种DPC方法兼容，增加了其在各种生物医学应用中的潜力。这项研究提供了一种新的工程化的肽-纳米颗粒平台，用于有效调节蛋白质相互作用以应对各种疾病，包括用于癌症治疗的免疫检查点阻断。
实施例2：Trpzip DPC
当β-发夹被Trpzip稳定时，Trp残基位于相同的肽表面上(图25)。因此，肽在适当方向上的表面附着防止了Trp簇的暴露，从而最大限度地减少了它们在靶标结合中的非特异性贡献。为了开发Trpzip-DPC混合系统，考虑到PD-1/PD-L1复合物结构和树状大分子缀合过程，pL1的一级结构被修饰(SEQ ID NO：4)以提供SEQ ID NO：5(图26)。因为埋藏在PD-1核心中的氨基酸残基与PD-L1结合无关，我们用Trp残基取代其中的一些(精氨酸、天冬氨酸和亮氨酸)以引入Trpzip结构。其中一个核心残基缬氨酸另外被用于树状大分子缀合的赖氨酸取代，这决定了肽方向性以暴露PD-L1结合表面并使Trp簇面向纳米颗粒表面(pL1TZ)。作为纳米颗粒骨架，我们选择了树状大分子。
如图27所示，发现pL1以无规卷曲结构存在，在200nm附近具有强负带。在另一方面，pL1TZ的CD光谱由200nm处的负带、215nm处的弱肩部(β-折叠)和228nm处的弱正带(显示色氨酸残基之间相互作用的激子耦合带)组成，这显示了部分稳定的β-发夹结构与Trpzip形成(图28)。有趣的是，二级结构在附着到树状大分子表面时更进一步稳定，这通过在200和230nm处显著增加的CD信号得到证实(图29)。基于先前研究中的发现，我们将这种表面辅助的发夹稳定归因于已占体积效应：表面的存在限制了无序结构的构象空间，从而降低了展开状态的熵(图30)。表面等离子体共振(SPR)分析显示，与游离肽相比，稳定化和多聚化的PD-L1结合肽表现出高度增加的PD-L1结合亲和力(图31)。此外，DPC还显示出显著增强的PD-L1选择性，隐藏了肽/树状大分子界面空间中的色氨酸残基(图32)。
实施例3：树状大分子-肽缀合物提高了体外治疗效果
肽pPD1具有结合小鼠PD-L1的序列IYLCGAISLHPKAKIEESPGA(SEQ ID NO:6)。该肽通过其半胱氨酸(C)基团通过SMCC化学与树状大分子缀合。
从Charles River获得雌性Balb/c小鼠(4-6周龄)。动物程序和维护均根据威斯康星大学的机构指南进行。通过皮下注射将4T1细胞系接种到每只小鼠的背侧，并使用卡尺测量肿瘤体积。当肿瘤体积达到约250mm3时，将小鼠随机分组并开始治疗。通过尾静脉注射施用100μL试剂，进行3-4次。图33和34提供了随时间变化的肿瘤体积和体重。使用IVIS光谱成像系统(Perkin Elmer)检查小鼠的肿瘤生物发光。在图35的数据中，误差条代表平均值的标准误差。
除非本文另外指出或与上下文明显矛盾，否则上下文中(特别是在所附权利要求的上下文中)所使用的术语“一个/一种(a)”和“一个/一种(an)”以及“该/所述(the)”和类似的指代应被解释为涵盖单数和复数。本文使用的术语第一、第二等并不意味着表示任何特定的顺序，而仅仅是为了方便表示多个，例如层。除非另有说明，否则术语“包含”、“具有”、“包括”和“含有”应被解释为开放式术语(即，意思是“包括但不限于”)。除非另有说明，否则数值范围的列举仅旨在用作分别指代落入该范围内的每个单独值的简写方法，并且每个单独值都被并入本说明书中，就如同在本文中单独列举一样。所有范围的端点都包含在该范围内并且可以独立组合。除非本文另外指出或与上下文明显矛盾，否则本文描述的所有方法可以以合适的顺序执行。除非另外要求，否则所使用的任何示例和所有示例或示例性语言(例如“诸如”)仅旨在更好地说明本发明，并且不对本发明的范围构成限制。本说明书中的任何语言都不应被解释为表示任何未要求保护的要素对于如本文所使用的本发明的实施是必不可少的。
虽然已经参考示例性实施方案描述了本发明，但是本领域技术人员将理解，可以进行各种改变，并且可以在不脱离本发明范围的情况下用等同物代替其要素。另外，在不脱离本发明的实质范围的情况下，可以做出许多修改以使特定情况或材料适应本发明的教导。因此，意图是本发明不限于作为预期用于实现本发明的最佳方式而公开的特定实施方案，而是本发明将包括落入所附权利要求的范围内的所有实施方案。除非本文另外指出或与上下文明显矛盾，否则本发明涵盖上述元素在其所有可能的变化中的任何组合。
SEQUENCE LISTING
<110> 威斯康星校友研究基金会
<120> 肽-纳米颗粒缀合物
<130> WIS0054US2 (P200080US02)
<150> US 62/927293
<151> 2019-10-29
<160> 5
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 注释βH1- wt序列
<400> 1
Thr Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu Ala Pro Lys Leu Gln Ile Lys
1 5 10 15
Glu Ser Leu Arg Ala
20
<210> 2
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 注释βH1- 突变体序列
<400> 2
Thr Tyr Val Cys Gly Val Ile Ser Leu Ala Pro Arg Ile Gln Ile Lys
1 5 10 15
Glu Ser Leu Arg Ala
20
<210> 3
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 注释βH2- wt序列，和
<400> 3
Val Leu Asn Trp Tyr Arg Met Ser Pro Ser Asn Gln Thr Asp Arg Lys
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Ala Ala
<210> 4
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 注释βH2突变体序列
<400> 4
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Ala Ala
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Trp-Zip βH2突变体序列
<400> 5
His Lys Val Trp His Trp Glu Ser Pro Ser Gly Gln Trp Asp Thr Trp
1 5 10 15
Ala Ala

Claims (31)

1.一种纳米颗粒系统，其包含
多价纳米颗粒核心，所述多价纳米颗粒核心包含与其缀合的多个β-发夹肽。
2.根据权利要求1所述的纳米颗粒系统，其中所述多价纳米颗粒核心包含超支化聚合物、树状大分子、树枝化基元、混合纳米颗粒或胶束。
3.根据权利要求2所述的纳米颗粒系统，其中所述胶束包含两亲性树枝化基元-线团。
4.根据权利要求2所述的纳米颗粒系统，其中所述混合纳米颗粒包含树状大分子-外来体混合物。
5.根据权利要求2所述的纳米颗粒系统，其中所述混合纳米颗粒包含多价聚合物骨架纳米颗粒核心，其具有与其共价连接的β-发夹肽；以及包封所述聚合物骨架纳米颗粒核心的外壳，其中所述外壳包括脂质体或聚合物壳。
6.根据权利要求2所述的纳米颗粒系统，其中所述树状大分子是聚(酰胺-胺)(PAMAM)树状大分子、聚酯树状大分子、聚丙烯亚胺(PPI)树状大分子、二氨基丁烷胺聚丙烯亚胺四胺(DAB-Am 4)树状大分子、聚丙基胺(POPAM)树状大分子、聚赖氨酸树状大分子、聚酯树状大分子、蝶烯树状大分子、脂肪族聚(醚)树状大分子、芳族聚醚树状大分子或其组合。
7.根据权利要求2所述的纳米颗粒系统，其中所述树状大分子是PAMAM树状大分子。
8.根据权利要求1所述的纳米颗粒系统，其中所述β-发夹肽包括肿瘤靶向肽、细胞穿透肽、对检查点抑制剂受体具有高亲和力的β-发夹肽或用于治疗蛋白质折叠疾病的肽。
9.根据权利要求1所述的纳米颗粒系统，其中所述β-发夹肽包含Trpzip肽。
10.根据权利要求1所述的纳米颗粒系统，其中β-发夹肽是一种免疫检查点抑制剂β-发夹肽，如PD-1的表面肽，其以高亲和力与PD-L1结合。
11.根据权利要求1所述的纳米颗粒系统，其中所述纳米颗粒系统进一步与治疗剂、预防剂或诊断剂关联。
12.根据权利要求11所述的纳米颗粒系统，其中所述治疗剂是化疗剂或治疗性核酸。
13.根据权利要求11所述的纳米颗粒系统，其中所述诊断剂是成像剂。
14.一种药物组合物，其包含如权利要求1-13的任一项所述的纳米颗粒系统和药学上可接受的赋形剂。
15.根据权利要求17所述的药物组合物，其进一步包含治疗剂、预防剂或诊断剂。
16.一种制备纳米颗粒系统的方法，所述方法包括：
在足以将多个β-发夹肽缀合至多价纳米颗粒核心并提供所述纳米颗粒系统的条件下，使包含多个反应性端基的多价纳米颗粒核心与包含一种或多种β-发夹肽的组合物接触。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述反应性端基包括二环己基碳化二亚胺、二异丙基碳化二亚胺、N-(3-二甲基氨基丙基)-N'-乙基碳化二亚胺、1,1'-羰基二咪唑、N-琥珀酰亚胺基S-乙酰基硫代乙酸酯、N-琥珀酰亚胺基-S-乙酰基硫代丙酸酯、2-巯基乙胺、磺基琥珀酰亚胺基4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸酯、琥珀酰亚胺基碘乙酸酯、琥珀酰亚胺基3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯、N-羟基琥珀酰亚胺酯、N-羟基磺基琥珀酰亚胺酯、N-γ-马来酰亚胺基丁酰基-氧磺基琥珀酰亚胺酯、硝基苯基酯、四氟苯基酯、五氟苯基酯、硫代吡啶基酯、硫代硝基苯基酯，以及包含前述至少一项的组合。
18.根据权利要求16所述的方法，其中所述多价纳米颗粒核心包含两个或更多个不同的反应性端基。
19.根据权利要求16所述的方法，其进一步包括使包含多个反应性端基的多价纳米颗粒核心与治疗剂、预防剂或诊断剂接触。
20.根据权利要求16所述的方法，其中所述多价纳米颗粒核心包含超支化聚合物、树状大分子、树枝化基元、混合纳米颗粒或胶束。
21.根据权利要求20所述的方法，其中所述胶束包含两亲性树枝化基元-线团。
22.根据权利要求20所述的方法，其中所述混合纳米颗粒包含树状大分子-外来体混合物。
23.根据权利要求20所述的方法，其中所述混合纳米颗粒包含多价聚合物骨架纳米颗粒核心，其具有与其共价连接的免疫检查点抑制剂；以及包封所述聚合物骨架纳米颗粒核心的外壳，其中所述外壳包括脂质体或聚合物壳。
24.根据权利要求20所述的方法，其中所述树状大分子是聚(酰胺-胺)(PAMAM)树状大分子、聚酯树状大分子、聚丙烯亚胺(PPI)树状大分子、二氨基丁烷胺聚丙烯亚胺四胺(DAB-Am 4)树状大分子、聚丙基胺(POPAM)树状大分子、聚赖氨酸树状大分子、聚酯树状大分子、蝶烯树状大分子、脂肪族聚(醚)树状大分子、芳族聚醚树状大分子或包含一种或多种前述物质的组合。
25.根据权利要求20所述的方法，其中所述树状大分子是PAMAM树状大分子。
26.根据权利要求16所述的方法，其中所述β-发夹肽包括肿瘤靶向肽、细胞穿透肽、对检查点抑制剂受体具有高亲和力的β-发夹肽或用于治疗蛋白质折叠疾病的肽。
27.根据权利要求16所述的方法，其中所述β-发夹肽是一种免疫检查点抑制剂β-发夹肽，如PD-1的表面肽，其以高亲和力与PD-L1结合。
28.根据权利要求16所述的方法，其中所述β-发夹肽包含Trpzip肽。
29.一种免疫治疗方法，所述方法包括向有需要的受试者施用权利要求1-13的任一项所述的纳米颗粒系统。
30.根据权利要求29所述的免疫治疗方法，其中所述受试者是人类癌症患者或患有免疫病症的人类患者。
31.根据权利要求29所述的免疫治疗方法，其进一步包括施用放疗、化疗、外科手术或包含前述至少一种的组合。
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