CN103333895B - 一种与人表皮生长因子受体iii型突变体特异性结合的核酸适配子及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种与人表皮生长因子受体III型突变体特异性结合的核酸适配子及其应用。本发明的核酸适配子其核苷酸序列如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5所示的任意一种。本发明的与EGFRvⅢ特异性结合的核酸适配子仅特异性地结合U87Δ细胞系，而不与U87细胞系和HEK293细胞系结合，因此可有效地应用于制备诊断表达EGFRvⅢ的肿瘤细胞的传感器或试剂盒，此外，还可以作为一个携带抗表达EGFRvⅢ的肿瘤细胞药物或siRNA的载体进入表达EGFRvⅢ的肿瘤细胞或组织中，具有靶向的作用，具有广阔的应用前景。

Description

一种与人表皮生长因子受体III型突变体特异性结合的核酸适配子及其应用

技术领域

本发明属于生物医学领域，具体涉及一种与人表皮生长因子受体III型突变体特异性结合的核酸适配子及其应用。

背景技术

近年来，已经对用于癌症诊断和治疗的一些生物标记物进行了研究。其中，癌细胞特异性的膜蛋白被认为是最适当的生物标记，因为它们常以可检测的量脱落到体液中，且体液的临床表现通常优于活检取样的侵入性方法。除此之外，膜蛋白还由于它们在癌组织成像和靶向治疗策略中的潜在用途而备受关注。

同时，生物标记鉴定领域主要依赖于双向电泳（2D-GE）和质谱分析。然而，用这种技术来阐明膜蛋白却有相当多的限制。只有30%的总细胞蛋白来自细胞膜且这当中只有5%可用2D-GE进行检测。因此，作为另一种选择，已经开发出膜蛋白的特异性探针作为鉴定所结合的靶标的工具。

过去的二十年中，具有高亲和力及特异性结合靶标蛋白的核酸探针—适配子（aptamer）领域有了新发展。具体地，为一些疾病的病变细胞相关蛋白开发了适配子，这些适配子是用SELEX（指数富集配基的系统进化）技术分离的，且它们中有许多目前正处于临床试验阶段，这些适配子本身作为治疗的一部分或作为成像或药物递送的工具、（Magalhaes et al.2012）、（Lee et al.2006）、（Gilbert et al.2007）。

除了经典的SELEX技术外，用细胞SELEX（Cell-SELEX）技术可筛选针对活细胞和组织等复杂靶标的适配子（Shangguan et al.2006）。Cell-SELEX技术的优势在于即便是未知的细胞或组织表面标记靶标，也可开发用于疾病细胞的适配子。此外，Cell-SELEX技术比以前的SELEX方法更有优势，因为靶标蛋白处于分离状态下时不能显示它们的原有特性，在筛选过程中，处于生理状态下的靶标蛋白的功能性较好，因此，用Cell-SELEX法首先开发了肌腱蛋白-C的ssDNA适配子（Daniels et al.2003），然后也开发了针对CCRF-CEM细胞（T细胞性急性淋巴细胞性白血病前体细胞）的PTK7（蛋白酪氨酸激酶）适配子以及针对小肺癌细胞的DNA适配子（Chen et al.2008）。用消减SELEX技术筛选了针对HnRNPA1的BC15适配子，可特异识别HnRNP表达的乳腺癌细胞，从而可用于临床诊断（Li et al.2009），

越来越多的研究者用Cell-SELEX技术筛选出来有价值的适配子（Hu et al.2012；Kang etal.2012）、（Zhou et al.2011）、（Bayrac et al.2011）。然而，因为细胞表面蛋白的复杂性，Cell-SELEX技术需要经过优化和特异筛选过程来进行限制性控制。因此，适当的引入阴性筛选过程对Cell-SELEX筛选的成功是至关重要的。

恶性胶质瘤（GBM）是一种常见的神经系统肿瘤，其在成人脑肿瘤中占25%(MontgomeryRB,et al.J Biol Chem.2000)。这是中期生存率低、侵袭性强的恶性肿瘤（Lammering G,et al.Oncogene.2003；Heimberger AB,et al.Clin Cancer Res.2005)。由于颅内肿瘤的特性，手术切除危险性高，肿瘤浸润生长，清除不彻底；而化疗药物进入大脑又受血脑屏障的阻碍，药物进入大脑后，如何定位于肿瘤组织，这是化疗所面临的一个主要问题。据研究，表皮生长因子受体（EGFR）在多数肿瘤中存在高表达，并且存在诸多突变体，而突变体的存在使得肿瘤的致瘤性、侵袭性增强。在35%-65%的恶性胶质瘤中存在人表皮生长因子受体III突变体（EGFRvIII）的过表达（Lo HW.Curr Mol Pharmacol.2010，Tabatabai G， et al.Discov Med.2011），而且正常人不表达EGFRvIII，使得EGFRvIII成为胶质瘤治疗的一个很好的靶标。尽管目前EGFR已经作为一个生物靶标，开发出了大量的EGFR抑制剂用于肿瘤的治疗，然而，鉴于EGFR在正常细胞中也有表达，导致其副作用大，用药时间增长时，出现耐药性，开发新的特异性靶标迫在眉睫。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种与人表皮生长因子受体III型突变体（EGFRvIII）特异性结合的核酸适配子或其化学修饰物。

本发明的与人表皮生长因子受体III型突变体（EGFRvIII）特异性结合的核酸适配子或其化学修饰物，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQID NO:4或SEQ ID NO:5所示的任意一种。

所述的化学修饰物是在上述核酸适配子中包括的至少一个核苷酸的核糖2’位上的羟基被氢原子、氟原子、-O-酰基和氨基中任意一种所取代，以及在3’端或5’端加入FCM、FITC、biotin的任意修饰。

本发明的第二个目的是提供上述与人表皮生长因子受体III型突变体特异性结合的核酸适配子或其化学修饰物在制备诊断过表达人表皮生长因子受体III型突变体的肿瘤细胞的传感器或试剂盒中的应用。

所述的肿瘤细胞，优选为人星型胶质瘤细胞。

本发明的第三个目的是提供上述与人表皮生长因子受体III型突变体特异性结合的核酸适配子或其化学修饰物作为药物递送载体在制备抗过表达人表皮生长因子受体III型突变体的肿瘤细胞的药物中的应用。

所述的肿瘤细胞，优选为人星型胶质瘤细胞。

本发明的第四个目的是提供一种诊断过表达人表皮生长因子受体III型突变体的肿瘤细胞的传感器，其特征在于，所述的传感器上固定有与人表皮生长因子受体III型突变体特异性结合的核酸适配子或其化学修饰物。

本发明的第五个目的是提供一种诊断过表达人表皮生长因子受体III型突变体的肿瘤细胞的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中含有与人表皮生长因子受体III型突变体特异性结合的核酸适配子或其化学修饰物。

本发明的第六个目的是提供一种过表达人表皮生长因子受体III型突变体的肿瘤细胞的特异性的药物递送系统，其特征在于，所述的药物递送系统包含与人表皮生长因子受体III型突变体特异性结合的核酸适配子或其化学修饰物。

本发明首先通过化学合成初始ssDNA文库、用于扩增dsDNA的引物和用于扩增ssDNA亚文库或适配子的引物，再通过Cell-SELEX技术先对初始ssDNA文库进行筛选，以筛选所得的产物为模板，利用扩增ssDNA亚文库和引物通过不对称PCR扩增得到ssDNA亚文库，该ssDNA亚文库用于下一轮的筛选，共进行了14轮的筛选。第14轮筛选所得到的ssDNA亚文库与EGFRvIII的结合达到了饱和，克隆第14轮筛选得到的ssDNA亚文库并测序分析。从中挑选出9个有重复2-3次的序列，通过标记FITC进行荧光筛选出5个序列，即为本发明的与人表皮生长因子受体III型突变体（EGFRvIII）特异性结合的核酸适配子。其核苷酸序列分别是SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示，将其命名为S1、S2、S3、S4、S5。分别通过ELISA法、荧光检测法和流式细胞技术检测出上述适配子S1-S5只和U87Δ细胞系特异性结合且亲和力较强。

本发明的与EGFRvIII特异性结合的核酸适配子仅特异性地结合U87Δ细胞系，而不与U87细胞系和HEK293细胞系结合，因此可有效地应用于制备诊断表达EGFRvIII的肿瘤细胞的传感器或试剂盒，此外，还可以作为一个携带抑制EGFRvIII的肿瘤细胞药物或siRNA的载体进入表达EGFRvIII的肿瘤细胞或组织中，具有靶向的作用，具有广阔的应用前景。

附图说明

图1是本发明的特异性地结合过表达EGFRvIII胶质瘤细胞或组织的适配子的筛选过程的示意图；

图2是根据图1所示的示意图，在Cell-SELEX法第14轮中所筛选的适配子的测序结果；

图3是Cell-SELEX各轮筛选的ssDNA亚文库对U87Δ细胞系和U87细胞系的结合亲和力的ELISA检测结果统计图；

图4是适配子S1对U87细胞系和U87Δ细胞系的结合亲和力的荧光检测结果图，其中A为适配子S1对U87细胞系的结合荧光检测图，B为适配子S1对U87Δ细胞系的结合荧光检测图；

图5是适配子S2对U87细胞系和U87Δ细胞系的结合亲和力的荧光检测结果图，其中A为适配子S2对U87细胞系的结合荧光检测图，B为适配子S2对U87Δ细胞系的结合荧光检测图；

图6是适配子S3对U87细胞系和U87Δ细胞系的结合亲和力的荧光检测结果图，其中A为适配子S3对U87细胞系的结合荧光检测图，B为适配子S3对U87Δ细胞系的结合荧光检测图；

图7是适配子S4对U87细胞系和U87Δ细胞系的结合亲和力的荧光检测结果图，其中A为适配子S4对U87细胞系的结合荧光检测图，B为适配子S4对U87Δ细胞系的结合荧光检测图；

图8是适配子S5对U87细胞系和U87Δ细胞系的结合亲和力的荧光检测结果图，其中A为适配子S5对U87细胞系的结合荧光检测图，B为适配子S5对U87Δ细胞系的结合荧光检测图；

图9是适配子S1-S5对HEK293细胞系的结合亲和力的荧光检测结果图；

图10是激光共聚焦显微镜检测观察适配子S1-S4在U87Δ细胞系中的定位图；

图11是流式细胞技术检测适配子S1-S4对HEK293细胞系的结合亲和力的结果图；

图12是流式细胞技术检测适配子S1-S4对U87Δ细胞系的结合亲和力的结果图；

图13是流式细胞技术检测适配子S1-S4对U87细胞系的结合亲和力的结果图；

图14是ELISA检测适配子S1对U87Δ细胞系的结合亲和力的Kd值；

图15是ELISA检测适配子S2对U87Δ细胞系的结合亲和力的Kd值；

图16是ELISA检测适配子S3对U87Δ细胞系的结合亲和力的Kd值；

图17是ELISA检测适配子S4对U87Δ细胞系的结合亲和力的Kd值；

图18是ELISA检测适配子S5对U87Δ细胞系的结合亲和力的Kd值；

图19是适配子S1-S5的二级结构；

图20是适配子S2和U87Δ细胞系通过Pull-down实验后，S2与U87Δ细胞系特异性结合的靶蛋白westernblot杂交图。

图21是Cell-SELEX筛选过程参数值参考图。

具体实施方式

以下实施例用于进一步说明本发明，但不应理解为对本发明的限制。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

本发明的详细说明中所用的主要术语的定义如下。

本发明使用的术语“核酸适配子”是指以高的亲和力特异性地识别其靶标的小单链寡核苷酸。

本发明使用的术语“样品”是指待分析的可能包括胶质瘤的标记的组合物。样品的实例包括胶质瘤细胞系、胶质瘤组织、血液、血清、血浆、唾液、痰、尿液。

本发明使用的词语“U87Δ细胞”是指稳定过表达EGFRvIII型突变体的U87细胞株。

适配子的核苷酸总数为73-74nt（<100nt）。如果适配子的核苷酸数量少，则适配子的化学合成和大量生产将比较容易且具有成本优势。此外，适配子将容易被化学修饰，在体内高度稳定且毒性低。除此之外，包括在适配子在内的各核苷酸可包括一个或者多个相同或不同的化学修饰，例如可在核糖的2’位进行任何原子或基团的核苷酸取代。

在本发明的一个实例中，如图1所示，通过Cell-SELEX法筛选具有如SEQ ID NO:1-5所列的核酸序列的适配子，然后用ELISA、荧光检测法、流式细胞法来测量所筛选的适配子的亲和力。结果发现，SEQ ID NO:1-5所列的核酸序列的确特异性地结合U87Δ细胞。

本发明的一个实例中，发现SEQ ID NO:1-5核酸序列中除了结合U87Δ细胞之外，基本上不结合U87和HEK293细胞，表明所述适配子特异地结合U87Δ细胞。表明了本发明的适配子可用于检测胶质瘤是否有EGFRvIII的表达，因此可有利地用于恶性胶质瘤的诊断和治疗。具体地，本发明适配子SEQ ID NO：1-5能特异地结合靶蛋白EGFRvIII，这有利于开发EGFRvIII表达的肿瘤药物。

因此，另一个方面，本发明涉及一种诊断胶质瘤的组合物，所述组合物包含上述本发明的核酸适配子。

本发明涉及一种用核酸适配子来定量检测肿瘤细胞表面EGFRvIII的表达。例如，通过将生物素缀合到核酸适配子的末端，使标记了的核酸适配子与固定在酶联板上的来自胶质瘤细胞系的蛋白样品进行反应，然后用链霉亲和素-HRP的二抗与生物素标记的适配子反应，通过显色即可定量检测到肿瘤蛋白样品中EGFRvIII的表达量。

胶质瘤的新的生物标记可通过分析结合到核酸适配子的样品物质而检测。因此，在又一方面，本发明涉及一种用核酸适配子来检测胶质瘤细胞特异的表面生物标记的方法。例如，通过将生物素缀合到核酸适配子的末端，使核酸适配子与来自胶质瘤细胞系的膜提取蛋白样品结合，并用链霉亲和素缀合的磁性颗粒沉淀适配子，然后用质谱法分析适配子，来检测特异性地结合适配子的表面生物标记。

同时，特异性地结合胶质瘤细胞或其组织的核酸适配子可固定在常规的支持物上，如磁珠、颗粒、试纸条，从而提供可用于诊断胶质瘤的检测传感器。因此，本发明的另一个方面涉及一种诊断胶质瘤的传感器，所述传感器上固定有与胶质瘤细胞U87Δ或组织的特异性地结合的核酸适配子。

上述固定支持无包括至少一个实质上是固相支持物，可通过任何常规的化学结合方法将核酸适配子固定到所述的固相支持物上。例如，可通过将生物素缀合到核酸适配子的末端形成缀合物，从而将缀合物固定到支持物的表面上，并将链霉亲和素固定到支持物的表上以诱导固定在支持物表面上的蛋白链霉素和生物素之间的相互作用。

同时，本发明的方法可以以试剂盒的形式提供出来，以增加可携带性。具体地，在另一个方面，本发明涉及一种诊断过表达人表皮生长因子受体Ⅲ型突变体的胶质瘤细胞的试剂盒，所述试剂盒包含与人表皮生长因子受体Ⅲ型突变体的的核酸适配子。如果需要的话，胶质瘤的诊断试剂盒可包括缓冲液和用于进行检测和分析的容器。诊断试剂盒可以是瓶、注射器类似的形式，该试剂盒可本分或全部由塑料、纸等类似物形成。传感器容器可装配有或全部或部分可分离的盖子，硕鼠盖子可以是容器的原始部件或可以是通过机械、粘着或其他方式附着与容器。容器也可以装配有塞子并通过注射针来接触内含物。检测试剂盒可包括外包装，外包装可包括有关组分用途的说明。

另一方面，本发明涉及一种新的能介导其他药物或siRNA或病毒的细胞传递或跨膜转运的载体，如上所述的与过表达人表皮生长因子受体Ⅲ型突变体特异性结合的核酸适配子。例如，将药物与如上所述的与过表达人表皮生长因子受体Ⅲ型突变体特异性结合的核酸适配子通过共价键或者其他介质耦合在一起，加入表达EGFRvIII的肿瘤细胞或组织中，适配子特异识别受体并且被内吞进入胞内，由此将药物或siRNA携带进入细胞，达到一个靶向治疗的目标。或者，也可以将适配子、药物、高分子材料组合在一起，高分子材料包裹药物和与过表达人表皮生长因子受体Ⅲ型突变体特异性结合的核酸适配子的组合体，从而满足通过血脑屏障的需要，进入脑内组织时，与过表达人表皮生长因子受体Ⅲ型突变体特异性结合的核酸适配子和药物的复合物释放出来，适配子识别靶蛋白，从而将药物运抵目标。

因此，可以以本发明的与过表达人表皮生长因子受体Ⅲ型突变体特异性结合的核酸适配子来递送抗癌药物或者siRNA（(Chu et al.2006)、(Zhou et al.2011)、(Zhou&Rossi2008)、）

本发明的与过表达人表皮生长因子受体Ⅲ型突变体特异性结合的核酸适配子可以其药物上可接受的盐的形式用于药物组合物中。此外，本发明的与过表达人表皮生长因子受体Ⅲ型突变体特异性结合的核酸适配子可单独使用或与其他药学活性化合物结合使用。

根据本发明的与过表达人表皮生长因子受体Ⅲ型突变体特异性结合的核酸适配子的特性，结合药学高分子材料，可以开发新的剂型。如，纳米乳、包合物、缓释胶囊、脂质体等形式。开发利于透过血脑屏障的油包水型纳米乳需要水、油、乳化剂和助乳化剂等，其中天然乳化剂包括多糖类如阿拉伯胶、白蛋白、大豆磷脂、卵磷脂和胆固醇等，合成乳化剂分离子型和非离子型两类，常用的非离子型乳化剂如脂肪酸山梨坦（亲油性）、聚山梨酯（亲水性）等，而助乳化剂常可用来调节乳化剂的HLB值，并形成更小的乳滴。常用的助乳化剂有正丁醇、乙二醇、丙二醇、甘油等。开发稳定的包合物，用的材料如β-环糊精、淀粉、纤维素等等，使与过表达人表皮生长因子受体Ⅲ型突变体特异性结合的核酸适配子不易被血液中的核酸酶所降解，使药物达到缓释的作用。

可根据患者的状况和体重、疾病的严重度、药物的类型和给药途径及周期来适用地选择本发明组合物的优选剂量和剂型，达到个体化临床用药的目的。本发明的组合物可通过多种途径给药与哺乳动物，包括小鼠、大鼠等。给药途径为：口服，注射、鞘内或脑血管给药等。

实施例1：

实验一、制备与过表达人表皮生长因子受体III型突变体（EGFRvIII）的胶质瘤细胞系（U87Δ）特异性结合的核酸适配子

1、设计并合成初始ssDNA文库和用于PCR扩增的引物

设计并合成长度为73个碱基的初始ssDNA文库：5’-GCAATGGTACGGTACTTCC(30N)CAAAAGTGCACGCTACTTTGCTAA-3’，初始ssDNA文库两端是固定序列，中间是30个随机序列，N代表A，T，C，G四个随机碱基。

设计并合成用于扩增dsDNA的上游引物F1：5’-GCAATGGTACGGTACTTCC-3’和下游引物R1：5’-TTAGCAAAGTAGCGTGCACTTTTG-3’。

设计并合成用于扩增ssDNA亚文库或适配子的上游引物F1：5’-GCAATGGTACGGTACTTCC-3’和下游引物R2：5’-GCTAAGCGGGTGGGACTTCCTAGTCCCACCCGCTTAGCAAAGTAGCGTGCACTTTTG-3’。

上述初始ssDNA文库和引物均由生物公司合成。

用不对称PCR法，以上游引物F1和下游引物R2扩增出DNA单链，大量扩增切胶回收获得ssDNA亚文库或者适配子。

2、通过Cell-SELEX技术筛选适配子

利用稳定过表达人表皮生长因子受体III型突变体（EGFRvIII）阳性的人星型胶质瘤细胞系（U87Δ）和EGFRvIII阴性的人星型胶质瘤细胞系（U87）分别进行阳性筛选和阴性筛选，具体筛选方法如下：

第一轮筛选为阳性筛选，将3000pmol上述初始ssDNA文库溶解于1mL筛选结合缓冲液（该筛选结合缓冲液配方为：1L PBS缓冲液中含5mmol MgCl₂、0.05g鲑鱼精DNA、1gBSA和4.5g葡萄糖）中，于100℃变性5min后立即置于冰上充分冷却。再将25cm²瓶，细胞数目为2×10⁶个的单层贴壁过夜生长的U87Δ细胞系（如果是阴性筛选则用U87细胞系）用2mL洗涤缓冲液（该洗涤缓冲液配方为：1L PBS缓冲液中含5mmol MgCl₂和4.5g葡萄糖）漂洗2次，每次漂洗1min，再将上述冰上冷却的初始ssDNA文库与漂洗过的U87Δ细胞系（如果是阴性筛选则用U87细胞系）混合，将混合液于37℃孵育60min，使初始ssDNA文库与U87Δ细胞系（如果是阴性筛选则用U87细胞系）充分作用，再用2mL洗涤缓冲液（该洗涤缓冲液配方为：1L PBS缓冲液中含5mmol MgCl₂和4.5g葡萄糖）漂洗细胞3次，每次漂洗1min，再加入1mL洗脱缓冲液（该洗脱缓冲液配方为：1ml PBS缓冲液含0.1mg蛋白酶K）于单层细胞中，37℃作用15min后收集上清，再加少量PBS缓冲液收集上述没有被洗脱的残留的U87Δ细胞系（如果是阴性筛选则用U87细胞系）于1.5mL离心管中，95℃加热5min，13000rpm离心5min后收集上清，合并两次上清，合并后的上清用酚氯仿抽提后，加入1/10体积的3mol/LNaAc（pH5.2）、1/100体积的1mol/L MgCl₂和2倍体积的无水乙醇，-20℃沉淀过夜，所得的沉淀即为第一轮筛选得到的产物。

以第一轮筛选得到的产物为模板，用上游引物F1和下游引物R2通过不对称PCR扩增得到ssDNA亚文库，扩增体系为100μL：10μL10×PCRbuffer，0.2mM dNTPs（终浓度）,1mMeach primer（终浓度）（上游引物F1和下游引物R2），20nM模板（终浓度），2.5U Taq DNApolymerase，扩增条件为：95°C1min，37°C30s，58°C40s，循环数为30cycle，58°C再延伸5min，切胶回收得到ssDNA亚文库，将该ssDNA亚文库用于下一轮筛选。

共进行14轮筛选，前3轮筛选均为阳性筛选，然后阳性筛选和阴性筛选交替进行11轮，筛选步骤和上述一致。每轮筛选得到的ssDNA亚文库用于下一轮的筛选，且ssDNA亚文库的用量逐渐递减（第1轮筛选的初始ssDNA文库的用量为3000pmol，以后每轮筛选的投入量为800pmol、200pmol、150pmol、150pmol、100pmol、80pmol，第8轮到14轮用量均为100pmol）。为了筛选具有高亲和力和高特异性的适配子，用于每轮筛选的U87Δ细胞系和U87细胞系的数量逐渐减少（第1轮细胞数目为2×10⁶个，第2轮细胞数目为1×10⁶个，第3-10轮细胞数目为4×10⁵个，第11-14轮细胞数目为2×10⁵个），孵育的时间逐渐减少（第1-4轮孵育时间分别为60min、40min、40min、40min，第5-14轮孵育时间均为30min）；洗涤次数和时间逐渐增加（第1-4轮洗涤3次，每次时间分别为1min、2min、3min、3min；第5-6轮洗涤4次，每次2min；第7-11轮洗涤5次，每次洗涤2min；第12-14轮洗涤6次，每次洗涤2min），筛选结合缓冲液中的鲑鱼精DNA浓度逐渐增加（第1轮用量为0.05μg/μL，第2-5轮用量为0.1μg/μL，第6-14轮用量为1μg/μL）（如图21所示）。

用ELISA法来定量检测筛选所得ssDNA亚文库中与EGFRvIII特异性结合的适配子的富集效果，结果显示于第14轮达到饱和状态，将第14轮筛选得到的ssDNA亚文库连接到T载体中进行克隆，用Multialign软件对得到的90个克隆进行测序，并分析不同克隆之间的共同序列，从中挑选出9个有重复2-3次的序列，通过标记上FITC进行荧光筛选，得到5个序列，该5个序列即为本发明的与过表达EGFRvIII的胶质瘤细胞系（U87Δ）特异性结合的核酸适配子S1、S2、S3、S4、S5，其序列分别如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQID NO:4和SEQ ID NO:5所示，适配子S1-S5的序列中有碱基T和G的富集。

具体为：

S1：5’-GCAATGGTACGGTACTTCCGTCATCAGCTTGTGATGTGGATGCGAACTGCA AAAGTGCACGCTACTTTGCTAA-3’（如序列表的SEQ ID NO：1所示，与说明书附图中的SEQ ID:43为同一序列）；

S2：5’-GCAATGGTACGGTACTTCCTGAATGTTGTTTTTTCTCTTTTCTATAGTACAAAA GTGCACGCTACTTTGCTAA-3’（如序列表的SEQ ID NO：2所示，与说明书附图中的SEQ ID:32为同一序列）；

S3：5’-GCAATGGTACGGTACTTCCTCTATTCAATGTTTAATTTTGTGATTTGTACAA AAGTGCACGCTACTTTGCTAA-3’（如序列表的SEQ ID NO：3所示，与说明书附图中的SEQ ID:47为同一序列）；

S4：5’-GCAATGGTACGGTACTTCCTTTTGTTGTTTTTTTTCTGTATTTATCGATCAAAA GTGCACGCTACTTTGCTAA-3’（如序列表的SEQ ID NO：4所示，与说明书附图中的SEQ ID:41为同一序列）；

S5:5’-GCAATGGTACGGTACTTCCCACTGGGAGACGCCATGGATCCGAATTCTCTCA AAAGTGCACGCTACTTTGCTAA-3’（如序列表的SEQ ID NO：5所示，与说明书附图中的SEQ ID:15为同一序列）。

以上各适配子的5’端和3’端的划线部分是为PCR扩增和DNA合成而引入的部分。

实验二：Cell-SELEX技术筛选得到的适配子的亲和力定性检测

1、ELISA法测定初始ssDNA文库及Cell-SELEX法的第2、6、8、10、12、14轮筛选得到的ssDNA亚文库对U87细胞系和U87Δ细胞系的亲和力

具体方法为：分别将100μL，密度为10⁵个/mL的U87细胞系和U87Δ细胞系在96孔板中培养过夜后，用生物素标记的100pmol的初始ssDNA文库及100pmol的第2、6、8、10、12、14轮筛选得到的ssDNA亚文库分别与U87细胞系和U87Δ细胞系于37℃孵育40min，U87细胞系作为阴性对照。

结果如图3所示，随着筛选轮数的增加，吸收值也随之增加，而作为阴性对照的U87细胞系的吸收值维持在较低的值。

由此可见，初始ssDNA文库及第2、6、8、10、12、14轮筛选得到的ssDNA亚文库与U87Δ细胞系的结合力较强，而与U87细胞系的结合力较弱。

2、用荧光显微镜观察适配子S1-S5对U87Δ细胞系、U87细胞系、HEK293细胞系的结合力

上游引物F1：5’-GCAATGGTACGGTACTTCC-3’和下游引物R2：5’-GCTAAGCGGGTG GGACTTCCTAGTCCCACCCGCTTAGCAAAGTAGCGTGCACTTTTG-3’

在上游引物F1的5’端标记FITC，以R2作为下游引物，以适配子S1、S2、S3、S4或S5作为模板进行不对称PCR，使得PCR产物呈现1:4的比例，长链带有下游引物的茎环结构，短链即为目的片段，带有5’端标记FITC，切胶回收获得FITC标记的适配子。

将250μL的细胞密度为2×10⁵个/ml的U87Δ细胞系、U87细胞系、HEK293细胞系于48孔板贴壁培养过夜后，用洗涤缓冲液（配方为：每升PBS溶液中含有5mmol的MgCl₂和4.5g的葡萄糖）轻轻漂洗细胞1次，5’端-FITC标记的适配子S1、S2、S3、S4或S5经过100℃变性5min后立即置于冰上充分冷却，取200pmol的上述适配子S1、S2、S3、S4或S5溶于250μL筛选结合缓冲液（配方为：每升PBS溶液中含有5mmol的MgCl₂、0.05g鲑鱼精DNA、1gBSA和4.5g的葡萄糖），再分别与贴壁培养过夜的U87Δ细胞系、U87细胞系、HEK293细胞系混合，37℃孵育40min，再用洗涤缓冲液（配方为：每升PBS溶液中含有5mmol的MgCl₂和4.5g的葡萄糖）漂洗3次，然后用荧光显微镜（Olympus）以400倍的放大率观察荧光。

结果如图4-9所示，适配子S1-S5能够与U87Δ细胞系特异性结合发出荧光，而与U87细胞系不结合从而没有观察到荧光，适配子S1-S5也不与HEK293细胞系结合从而观察不到荧光（图9所示）。

在此次荧光显微镜观察中，本实验发现，适配子S1-S5有些定位于细胞膜表面，而有些定位于细胞核内（有可能是适配子被受体内吞的结果），为了进一步确定适配子的定位，用激光共聚焦显微镜60倍物镜观察，结果显示，适配子S1和S3结合在细胞膜表面，而适配子S2和S4除了结合在细胞膜上，还在细胞核上也观察到较强的绿色荧光（如图10所示），说明适配子S2和S4能被受体内吞进入细胞。

由此可见，适配子S1-S5只与能够表达人表皮生长因子受体III突变体（EGFRvIII）的U87Δ细胞系特异性结合。

实验三、适配子S1-S5的活性检测

1、用流式细胞技术检测适配子S1-S5对U87Δ细胞系、U87细胞系、HEK293细胞系的结合亲和力

将U87Δ细胞系、U87细胞系、HEK293细胞系贴壁培养过夜，消化后取5×10⁵个细胞用PBS缓冲液洗涤1次，重悬后加入终浓度为500nM的5’端标记了FITC的适配子，将所述适配子分别和培养过夜后的U87Δ细胞系、U87细胞系、HEK293细胞系混合后，37℃孵育40min，再用PBS缓冲液洗涤3次，用流式细胞检测仪检测FITC的荧光强度。以初始ssDNA文库作为对照，

如图13所示，所述适配子与U87细胞的结合情况，用5’标记了FITC的初始ssDNA文库（initial library）做对照，适配子S1-S4（S1对应图13中的U87-43，S2对应图13中的U87-32，S3对应图13中的U87-47，S4对应图13中的U87-41）与U87的结合和初始ssDNA文库与U87细胞的结合差不多，曲线几乎没有位移。

如图12所示，所述适配子S1-S4（S1对应图12中的U87Δ-43，S2对应图12中的U87Δ-32，S3对应图12中的U87Δ-47，S4对应图12中的U87Δ-41）与U87Δ细胞的结合比初始ssDNA文库都有所增加，其中适配子S1（SEQ ID43）最为明显。

如图11所示，所述适配子S1-S4几乎不与HEK293结合。

由此可见，适配子S1-S4与U87Δ细胞系具有较高的亲和力。

2、ELISA法测定适配子S1-S5对U87Δ细胞系的解离常数（K_d）

由于荧光检测法和流式细胞技术的检测结果都显示适配子S1-S5和U87Δ细胞系具有较强的亲和力，因此用ELISA法测定适配子对U87Δ细胞系的K_d值，具体方法如下：

将U87Δ细胞系在96孔板中培养过夜后，用4%的多聚甲醛固定15min，再用PBST缓冲液洗涤3次，再用5%的BSA封闭1h，再洗涤3次，用5’端标记了生物素的100pmol的适配子（S1、S2、S3、S4或S5），经过100℃变性5min后立即置于冰上充分冷却后，加入50μl结合缓冲液（该结合缓冲液配方为：1L PBS缓冲液中含5mmol MgCl₂、0.05g鲑鱼精DNA、1gBSA和4.5g葡萄糖），由此梯度稀释(终浓度为1000nM、500nM、250nM、125nM、62.5nM、37.25nM、18.625nM、9.3125nM)，加入到U87Δ细胞系中，37℃孵育1h，再用PBST缓冲液洗涤3次，再向每个孔中加入50μL的0.1%的streptavidin-HRP（购自Sigma，1：1000），孵育30min，再用PBST缓冲液洗涤3次，加入TMB显色液，再加入2M的H₂SO₄终止反应，450nm波长下酶标仪读数。

为了计算K_d值，使用Sigmaplot12.0软件及下述公式来绘制结合U87Δ细胞系的适配子的浓度，并将数据点进行非线性的回归分析。

Y=（B_max-X）/(K_d+X)

其中Y为450nm波长的吸光值，X为适配子的浓度，B_max为结合位点最大值，K_d为解离常数。

结果如图14-18所示，适配子S1-S5对U87Δ细胞系显示出强烈的结合亲和力，适配子S1-S5对U87Δ细胞系的K_d值均小于100nM。

实验四、亲和力最高的适配子S2与U87Δ细胞系进行Pull-down实验

将250pmol的5’端标记了生物素的适配子S2与链霉亲和素磁珠孵育1h，用PBS缓冲液洗涤5次，再加入600μg U87Δ细胞系蛋白提取物（阴性对照是加GAPDH抗体孵育），孵育40min后用PBS洗涤5次，再用50μL2×SDS loading buffer溶解链霉亲和素磁珠-适配子S2-U87Δ细胞系蛋白提取物复合物以进行western blot实验（8%PAGE胶，兔源EGFR抗体，显影）。同时用5’端标记了生物素的初始ssDNA文库代替适配子S2作为阳性对照，其与U87Δ细胞系蛋白提取物孵育。

结果如图20所示，blank泳道代表是将适配子S2与链霉亲和素磁珠孵育1h，与GAPDH抗体孵育后的阴性对照，而S2代表适配子S2与链霉亲和素磁珠孵育1h，与U87Δ细胞系蛋白提取物孵育后的样品，而initial libirary代表初始ssDNA文库与链霉亲和素磁珠孵育1h，与U87Δ细胞系蛋白提取物孵育后的阳性对照。由图20可以看出，与适配子S2相互结合作用的蛋白为EGFRvIII，而GAPDH抗体孵育后无条带，由此可见，适配子S2的靶向结合位点是EGFRvIII。

实验五、用RNA STRUCTURE5.2软件测算适配子的二级结构

如图19所示，适配子S1-S5均含有茎环结构，环状结构扮演了重要的角色。二级结构由软件RNASTRUCTURE5.2预测出来的，且2D结构以及自由能是在37℃下计算所得。

综上所述，本发明的核酸适配子S1-S5仅特异地结合U87Δ细胞，而不结合U87或HEK293细胞，因此可有效地作为诊断及治疗表达EGFRvIII的胶质瘤的组合物。此外，所述适配子不仅仅适合于诊断和治疗胶质瘤，还可以作为一个有效的载体携带其他抗癌药物或者siRNA进入表达EGFRvIII的肿瘤细胞或者组织中，具有靶向治疗作用。

本发明进一步证明了EGFRvIII可以作为一个有效的生物靶标用于肿瘤药物的开发。

尽管参考具体特征详细地描述了本发明，显然对本领域的技术人员来说，这种描述仅仅是优选的实施方式而并不限制本发明的范围。因此，本发明的实质范围将由所附的权利要求书及其等同来限定。

Claims (7)

1.一种与人表皮生长因子受体III型突变体特异性结合的核酸适配子，其特征在于，所述的核酸适配子的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

2.权利要求1所述的与人表皮生长因子受体III型突变体特异性结合的核酸适配子在制备诊断过表达人表皮生长因子受体III型突变体的肿瘤细胞的传感器或试剂盒中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的肿瘤细胞为人星形胶质瘤细胞。

4.权利要求1所述的与人表皮生长因子受体III型突变体特异性结合的核酸适配子作为药物递送载体在制备抗过表达人表皮生长因子受体III型突变体的肿瘤细胞的药物中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的肿瘤细胞为人星形胶质瘤细胞。

6.一种诊断过表达人表皮生长因子受体III型突变体的肿瘤细胞的传感器，其特征在于，所述的传感器固定有权利要求1所述的与人表皮生长因子受体III型突变体特异性结合的核酸适配子。

7.一种诊断过表达人表皮生长因子受体III型突变体的肿瘤细胞的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中含有权利要求1所述的与人表皮生长因子受体III型突变体特异性结合的核酸适配子。