CN103343127B - 乳腺癌细胞mda-mb-231的核酸适体lxl-2及其应用 - Google Patents
乳腺癌细胞mda-mb-231的核酸适体lxl-2及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN103343127B CN103343127B CN201310314432.5A CN201310314432A CN103343127B CN 103343127 B CN103343127 B CN 103343127B CN 201310314432 A CN201310314432 A CN 201310314432A CN 103343127 B CN103343127 B CN 103343127B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- aptamer
- lxl
- breast cancer
- cancer cell
- breast
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
乳腺癌细胞MDA-MB-231的核酸适体LXL-2及其应用，涉及乳腺癌细胞。所述乳腺癌细胞MDA-MB-231的核酸适体LXL-2在0℃，0.157M/L Na+，0.005M/L Mg2+条件下具有独特的茎环结构。所述乳腺癌细胞MDA-MB-231的核酸适体LXL-2在制备乳腺癌诊断试剂、治疗乳腺癌药物、乳腺癌的肿瘤标志物等中，以及在研究乳腺癌与正常组织的差异性、乳腺肿瘤组织切片成像、乳腺肿瘤相关的活体成像、乳腺癌的靶向治疗等中的应用。
Description
技术领域
本发明涉及乳腺癌细胞，尤其是涉及乳腺癌细胞MDA-MB-231的核酸适体LXL-2及其应用。
背景技术
乳腺癌是女性最常见的癌症，主要包括导管癌和小叶癌。2011年美国CA（A Cancer Journalfor Clinicians）公布的最新统计数据显示，美国2011年预计将有230480例女性患乳腺癌，占女性新发恶性肿瘤的30%，居女性恶性肿瘤发病率第一位，并且死亡人数将达39520例。更为严重的是全球的乳腺癌发病率正在逐年增长。乳腺癌的诊断方法主要包括乳腺钼靶X线摄影、乳腺彩色多谱勒超声检查、乳腺导管内视镜检查、乳腺导管灌洗、CT和磁共振。但是这些检测方法主要是基于形态学标准，依然缺乏与乳腺癌相关的特异性标志。乳腺癌的治疗主要包括手术切除、化疗以及放疗或者几者综合治疗等方式。但是传统化疗、放疗的方式由于缺乏肿瘤细胞的靶向性导致非常严重的副作用。近年来发展的单克隆抗体虽然具有较高的特异性和亲和力，但是抗体本身所具有的一些缺陷，如免疫原性、不稳定性、批次间的差异性等使其在临床上的实际应用中具有一定的局限性。因此，找到乳腺肿瘤细胞的特异性靶标，在肿瘤的诊断和治疗中都具有重要意义。近些年发展的核酸适体探针，尤其是细胞靶向的核酸适体，能够特异性识别包括全血样品的复杂样品中的癌细胞，将给肿瘤的早期特异性快速诊断和靶向治疗带来新的希望和解决途径。
核酸适体（Tuerk,C.;Gold,L.,Systematic evolution of ligands by exponential enrichment:RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase.Science 1990,249(4968),505-510;Ellington,A.D.;Szostak,J.W.,In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands.Nature 1990,346(6287),818-822）是指从人工合成的单链DNA/RNA文库中筛选得到的能够高亲和性和高特异性地与靶标分子结合的单链寡核苷酸。核酸适体借助氢键、范德华力、疏水作用等分子间作用力形成特殊的三维结构，如发夹、假结、凸环、G-四聚体等，从而特异地识别靶物质并影响其生物活性。核酸适体本身特有的生化特性使其在生物医学应用领域具有诸多优势，如靶分子范围广、亲和力与特异性强、合成修饰方便快速、良好的生物兼容性、无毒、体外稳定性好等。核酸适体可以通过配体指数富集系统进化技术(systematic evolution of ligands byexponential enrichment，SELEX)（Sefah,K.;Shangguan,D.;Xiong,X.;O′Donoghue,M.B.;Tan,W.,Development of DNA aptamers using Cell-SELEX.Nat.Protocols 2010,5(6),1169-1185）筛选获得，其基本原理是在体外人工化学合成一个寡核苷酸文库，包括RNA、ssDNA或修饰的RNA和ssDNA，通过寡核苷酸文库与目标分子的相互作用，结合PCR技术指数级放大与靶分子特异结合的寡核苷酸，经过几轮或数十轮筛选过程，获得高亲和力和高特异性的核酸适体。
发明内容
本发明的第一目的在于提供具有高特异性和高亲和力的乳腺癌细胞MDA-MB-231的核酸适体LXL-2。
本发明的第二目的在于提供乳腺癌细胞MDA-MB-231的核酸适体LXL-2在与乳腺癌相关方面的应用。
所述乳腺癌细胞MDA-MB-231的核酸适体命名为LXL-2，其序列如下：
gaattcagtc ggacagcgca attgtggttc ttaccctatc ccttgtgttt ggcgttcgtt 60
gcgatggacg aatatcgtct ccc 83
所述乳腺癌细胞MDA-MB-231的核酸适体LXL-2在0℃，0.157M/L Na+，0.005M/L Mg2+条件下具有独特的茎环结构，其茎环结构如下：
所述乳腺癌细胞MDA-MB-231的核酸适体LXL-2的应用如下：
1）所述乳腺癌细胞MDA-MB-231的核酸适体LXL-2在制备乳腺癌诊断试剂中的应用。
2）所述乳腺癌细胞MDA-MB-231的核酸适体LXL-2在制备治疗乳腺癌药物中的应用。
3）所述乳腺癌细胞MDA-MB-231的核酸适体LXL-2在研究乳腺癌与正常组织的差异性中的应用。
4）所述乳腺癌细胞MDA-MB-231的核酸适体LXL-2在制备乳腺癌的肿瘤标志物中的应用。
5）所述乳腺癌细胞MDA-MB-231的核酸适体LXL-2在乳腺肿瘤组织切片成像中的应用。
6）所述乳腺癌细胞MDA-MB-231的核酸适体LXL-2在乳腺肿瘤相关的活体成像中的应用。
7）所述乳腺癌细胞MDA-MB-231的核酸适体LXL-2在乳腺癌的靶向治疗中的应用。
本发明的优点在于：
首先，利用与乳腺癌细胞MDA-MB-231相对应的正常乳腺上皮细胞MCF-10A作为反筛细胞，筛选除去DNA随机寡核苷酸库中的乳腺癌细胞与正常乳腺上皮细胞共同分子的结合部分，保证筛选得到的核酸适配体可以识别乳腺癌细胞MDA-MB-231。
其次，基于细胞的筛选方法保证了细胞表面所表达的生物大分子更加接近于生物体内的分子构象。
而且，筛选获得的核酸适体无毒性，分子量小，渗透性好，易于合成与标记。通过SELEX方法筛选获得的核酸适体只特异性识别乳腺癌细胞MDA-MB-231，对其他乳腺癌细胞、正常乳腺上皮细胞、其他肿瘤细胞等不具有或者具有较弱的识别功能。
上述优点使得所述核酸适体在生物医学检测、肿瘤生物标志物发现以及靶向治疗方面将有重要的潜在应用价值。
附图说明
图1为流式细胞仪测定所得核酸适体LXL-2对乳腺癌细胞MDA-MB-231的解离常数，解离常数Kd=15±4nM。在图1中，横坐标为DNA浓度（nmol/L），纵坐标为平均荧光强度。
图2为流式细胞仪测定所得核酸适体LXL-2对乳腺癌细胞MDA-MB-231的偏移。在图2中，横坐标为荧光强度，纵坐标为细胞个数，实线为初始DNA随机寡核苷酸库，虚线为LXL-2。
图3为流式细胞仪测定所得核酸适体LXL-2对正常乳腺上皮细胞MCF-10A的偏移。在图3中，横坐标为荧光强度，纵坐标为细胞个数，实线为初始DNA随机寡核苷酸库，虚线为LXL-2。
图4为流式细胞仪测定所得核酸适体LXL-2对乳腺癌细胞MCF-7的偏移。在图4中，横坐标为荧光强度，纵坐标为细胞个数，实线为初始DNA随机寡核苷酸库，虚线为LXL-2。
图5为流式细胞仪测定所得核酸适体LXL-2对乳腺癌细胞MDA-MB-453的偏移。在图5中，横坐标为荧光强度，纵坐标为细胞个数，实线为初始DNA随机寡核苷酸库，虚线为LXL-2。
图6为流式细胞仪测定所得核酸适体LXL-2对乳腺癌细胞T47D的偏移。在图6中，横坐标为荧光强度，纵坐标为细胞个数，实线为初始DNA随机寡核苷酸库，虚线为LXL-2。
图7为流式细胞仪测定所得核酸适体LXL-2对肝癌细胞HepG2的偏移。在图7中，横坐标为荧光强度，纵坐标为细胞个数，实线为初始DNA随机寡核苷酸库，虚线为LXL-2。
图8为流式细胞仪测定所得核酸适体LXL-2对肝癌细胞QGY-7703的偏移。在图8中，横坐标为荧光强度，纵坐标为细胞个数，实线为初始DNA随机寡核苷酸库，虚线为LXL-2。
图9为流式细胞仪测定所得核酸适体LXL-2对正常肝细胞QSG-7701的偏移。在图9中，横坐标为荧光强度，纵坐标为细胞个数，实线为初始DNA随机寡核苷酸库，虚线为LXL-2。
图10为流式细胞仪测定所得核酸适体LXL-2对宫颈癌细胞HeLa的偏移。在图10中，横坐标为荧光强度，纵坐标为细胞个数，实线为初始DNA随机寡核苷酸库，虚线为LXL-2。
具体实施方式
实施例1以流式分析法检测所得单链DNA与乳腺癌细胞MDA-MB-231的结合能力
首先合成FAM标记的单链DNA。
使用0nmol/L，5nmol/L，10nmol/L，25nmol/L，50nmol/L，100nmol/L，150nmol/L，200nmol/L浓度梯度的单链DNA与靶细胞MDA-MB-231来测定解离常数（Kd）。用200μl结合缓冲液配置上述各浓度的DNA溶液，95℃加热5min，冰上放置10min。与10万个MDA-MB-231细胞在冰上孵育30min。使用结合缓冲液洗涤细胞3次，而后把细胞重悬在250μL结合缓冲液中。设置DNA随机寡核苷酸库作对照。
使用BD公司的FACSAria流式细胞仪对细胞进行荧光测定，而后用sigma plot软件作图，计算出所得核酸适体LXL-2的解离常数为15nmol/L（参见图1）。
实施例2以流式分析法检测所得核酸适体与乳腺癌细胞MDA-MB-231结合的特异性
1）将合成好的0.5nmol单链FAM-DNA核酸溶于200ul结合缓冲液（12mmol/L PBS，5mmol/LMgCl2）中，进行热处理：95℃加热5min，在冰上放置10min；
2）将处理好的单链DNA核酸与10万个种于24孔板24h的细胞进行孵育，在冰上孵育30min。
3）孵育好后，缓冲溶液洗两次，再将细胞刮下来溶于200μL缓冲溶液，使用BD公司的FACSAria流式细胞仪对细胞进行荧光测定（参见图2～10）。
Claims (1)
1.乳腺癌细胞MDA-MB-231的核酸适体LXL-2，其特征在于其序列如下：
gaattcagtc ggacagcgca attgtggttc ttaccctatc ccttgtgttt ggcgttcgtt 60
gcgatggacg aatatcgtct ccc 83
在0℃，0.157mol/L Na+，0.005mol/L Mg2+条件下其茎环结构如下：
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201310314432.5A CN103343127B (zh) | 2013-07-24 | 2013-07-24 | 乳腺癌细胞mda-mb-231的核酸适体lxl-2及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201310314432.5A CN103343127B (zh) | 2013-07-24 | 2013-07-24 | 乳腺癌细胞mda-mb-231的核酸适体lxl-2及其应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN103343127A CN103343127A (zh) | 2013-10-09 |
| CN103343127B true CN103343127B (zh) | 2015-06-03 |
Family
ID=49277954
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201310314432.5A Active CN103343127B (zh) | 2013-07-24 | 2013-07-24 | 乳腺癌细胞mda-mb-231的核酸适体lxl-2及其应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN103343127B (zh) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN109576273A (zh) * | 2018-07-03 | 2019-04-05 | 广西医科大学 | 一套基于CRISPR/Cas9的肿瘤标志分子核酸适配体及应用 |
| CN108866064B (zh) * | 2018-07-10 | 2022-05-06 | 中国医科大学 | 一种靶向转移性人乳腺癌细胞的核酸适配体及其应用 |
| BR102021018527A2 (pt) * | 2021-09-17 | 2023-03-28 | Fundação Oswaldo Cruz | Aptâmero de ácido nucleico, composição, uso de um aptâmero, kit diagnóstico, método para detectar ou diagnosticar um tumor, e, método para tratamento de câncer |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102621125A (zh) * | 2012-03-24 | 2012-08-01 | 南京师范大学 | 一种基于拉曼光谱检测人乳腺癌细胞mcf-7的细胞探针复合物及其制备方法 |
| CN102827845A (zh) * | 2012-09-24 | 2012-12-19 | 厦门大学 | 上皮细胞粘附分子的核酸适体及其制备方法 |
-
2013
- 2013-07-24 CN CN201310314432.5A patent/CN103343127B/zh active Active
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102621125A (zh) * | 2012-03-24 | 2012-08-01 | 南京师范大学 | 一种基于拉曼光谱检测人乳腺癌细胞mcf-7的细胞探针复合物及其制备方法 |
| CN102827845A (zh) * | 2012-09-24 | 2012-12-19 | 厦门大学 | 上皮细胞粘附分子的核酸适体及其制备方法 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| RNA Aptamer Blockade of Osteopontin Inhibits Growth and Metastasis of MDA-MB231 Breast Cancer Cells;Zhiyong Mi 等;《Molecular Therapy》;20090131;第17卷(第1期);全文 * |
| 人乳腺癌细胞MDA-MB-231核酸适体筛选;李西兰 等;《中国化学会第28届学术年会第3分会场摘要集》;20120413;摘要 * |
| 核酸适体在生物医学中的应用;吴崔晨 等;《化学进展》;20100831;第22卷(第8期);全文 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN103343127A (zh) | 2013-10-09 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN102827845B (zh) | 上皮细胞粘附分子的核酸适体及其制备方法 | |
| Li et al. | In vitro selection of DNA aptamers for metastatic breast cancer cell recognition and tissue imaging | |
| Chandola et al. | Application of aptamers in diagnostics, drug-delivery and imaging | |
| Liu et al. | An aptamer-based probe for molecular subtyping of breast cancer | |
| Somasunderam et al. | Combinatorial selection of DNA thioaptamers targeted to the HA binding domain of human CD44 | |
| Tian et al. | Nanoparticle counting by microscopic digital detection: selective quantitative analysis of exosomes via surface-anchored nucleic acid amplification | |
| Mi et al. | In vivo selection against human colorectal cancer xenografts identifies an aptamer that targets RNA helicase protein DHX9 | |
| CN102498211B (zh) | 特异结合胰腺癌细胞或组织的核酸适体及其用途 | |
| Yuan et al. | Metastatic cancer cell and tissue-specific fluorescence imaging using a new DNA aptamer developed by Cell-SELEX | |
| Liu et al. | Differentiating breast cancer molecular subtypes using a DNA aptamer selected against MCF-7 cells | |
| CN103642810A (zh) | 一种核酸适配体及其筛选方法、在检测前列腺癌细胞株中的应用 | |
| Zhang et al. | Molecular recognition and in-vitro-targeted inhibition of renal cell carcinoma using a DNA aptamer | |
| Xue et al. | Detection of survivin expression in cervical cancer cells using molecular beacon imaging: new strategy for the diagnosis of cervical cancer | |
| Zhang et al. | A cell-based single-stranded DNA aptamer specifically targets gastric cancer | |
| Ding et al. | Diagnostic applications of gastric carcinoma cell aptamers in vitro and in vivo | |
| Wu et al. | DNA aptamers from whole-cell SELEX as new diagnostic agents against glioblastoma multiforme cells | |
| Almasi et al. | Development of a single stranded DNA aptamer as a molecular probe for lncap cells using cell-selex | |
| CN104711263A (zh) | 一种用于靶向人鼻咽癌细胞的核酸适配体序列及应用 | |
| CN103060327A (zh) | 肿瘤细胞识别探针、检测方法及应用 | |
| CN103343127B (zh) | 乳腺癌细胞mda-mb-231的核酸适体lxl-2及其应用 | |
| WO2019149115A1 (zh) | 核酸适配体在识别并结合碱性磷酸酶异源二聚体或肿瘤检测中的应用 | |
| CN103333896B (zh) | 乳腺癌细胞mda-mb-231的核酸适体lxl-1及其应用 | |
| CN103343128B (zh) | 乳腺癌细胞mda-mb-231的核酸适体lxl-3及其应用 | |
| Campos-Fernández et al. | The use of aptamers in prostate cancer: A systematic review of theranostic applications | |
| Zhang et al. | In vitro selection of aptamer S1 against MCF-7 human breast cancer cells |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant |