CN104212800A - 一种与人表皮生长因子受体iii型突变体特异性结合的核酸适配子及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种与人表皮生长因子受体III型突变体特异性结合的核酸适配子及其应用。本发明的核酸适配子其核苷酸序列如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示的任意一种。本发明的与EGFRvⅢ特异性结合的核酸适配子仅特异性地结合U87Δ细胞系，而不与U87细胞系结合，因此可有效地应用于制备诊断表达EGFRvⅢ的肿瘤细胞的传感器或试剂盒，此外，还可以作为一个携带抗表达EGFRvⅢ的肿瘤细胞药物或siRNA的载体进入表达EGFRvⅢ的肿瘤细胞或组织中，具有靶向的作用，具有广阔的应用前景。

Description

一种与人表皮生长因子受体III型突变体特异性结合的核酸适配子及其应用

本发明专利申请是申请日为：2013年05月07日，申请号：201310165292.X，发明名称为：一种与人表皮生长因子受体III型突变体特异性结合的核酸适配子及其应用的分案申请。

技术领域

本发明属于生物医学领域，具体涉及一种与人表皮生长因子受体III型突变体特异性结合的核酸适配子及其应用。

背景技术

指数富集配基的系统进化(systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX)技术是20世纪90年代初研制的一种新的组合化学技术，由美国的Gold和Ellington等受组合化学等的启发，构建的一种新型的体外筛选技术^[1-3]，通过该技术筛选获得的寡核苷酸被称为适配体(aptamer)。它通过在体外合成大容量的随机寡核苷酸文库，结合体外PCR扩增技术，与靶分子经过多轮筛选，获得高亲和力、特异性强的寡核苷酸适配子(aptamer)，其靶分子包括金属离子、药物、氨基酸、碱基类似物、核苷酸和多肽等，其中蛋白质类靶分子最多，包括酶、生长因子、抗体、转录因子、细胞粘附分子和选择素等^[4-5]。这种筛选方法具有简便、快速、经济等特点，与其他组合化学库如随机肽库、抗体库等文库相比，从寡核苷酸文库中筛选出的适配子具有更高的亲和力和特异性，具有良好的应用前景。Cell-SELEX技术是在SELEX技术的基础上发展来的，可以在筛选细胞特定靶分子未知的条件下进行筛选，大大提高了细胞筛选的效率和靶标的范围。与传统的SELEX技术相比，以完整细胞为靶分子的SELEX具有如下一些优点：1)筛选的靶分子范围广，可以使蛋白、肽、完整的细胞和细菌病原体，甚至在临床的病理组织切片也可以直接作为靶分子进行筛选^[6]；2)可以对多个靶分子同时进行筛选，同步并行的筛选方法将大大的提高工作效率，缩短筛选周期^[7]；3)细胞中的蛋白质可以保持其天然的构像，而非孤立的纯化蛋白，因此能够更真实地反应出蛋白的一些特性^[8]；4)消减策略的引进使筛选到的适配体结合特异性更强，通过反向SELEX筛选，可以有效减弱甚至消除既与靶分子结合又与靶分子类似物的结合的寡核苷酸配基，从而筛选出高度特异性结合靶分子的适配体^[9]。

在肿瘤细胞和正常细胞表面及细胞内部存在许多相同的成分和差异分子，以完整细胞为靶分子的SELEX技术可以筛选出能区别两个高度同源但有微小差异的靶组织或完整靶细胞的特异性寡核苷酸配基。筛选获得的适配体不仅可以作肿瘤特异性诊断或导向治疗，而且还可以用于肿瘤特异性标志物的鉴别和钓取^[10]。因此应用Cell-SELEX技术和消减SELEX技术对胶质瘤细胞的靶标筛选和研究对胶质瘤的临床诊断和治疗及肿瘤基础研究有很大的应用价值和前景。

胶质瘤是颅内常见恶性肿瘤，由于肿瘤呈浸润性生长，传统治疗方法包括手术切除、放疔和化疗，其效果极为有限，神经胶质瘤在颅内各种肿瘤中最为多见。神经胶质瘤简称胶质瘤，发生于神经外胚层的肿瘤,可分为两类，一类由间质细胞形成，称为胶质瘤；另一类由实质细胞形成，称神经元肿瘤。由于从病原学与形态学上还不能将这两类肿瘤完全区别，起源于间质细胞的胶质瘤又比起源于实质细胞的神经元肿瘤常见得多，所以将神经元肿瘤包括在胶质瘤中，统称为胶质瘤。各型胶质瘤中，以星形细胞瘤最多，其次为胶质母细胞瘤，其后依次为髓母细胞瘤、室管膜瘤、少枝胶质瘤、松果体瘤、混合性胶质瘤、脉络丛乳头状瘤、未分类胶质瘤及神经元性肿瘤。各型胶质瘤的好发部位不同，如星形细胞瘤成人多见于大脑半球，儿童则多发在小脑；胶质母细胞瘤几乎均发生于大脑半球；髓母细胞瘤发生于小脑蚓部；室管膜瘤多见于第4脑室；少枝胶质瘤大多发生于在脑半球。男性较多见以脑胶质瘤，特别是在多形性胶质母细胞瘤、髓母细胞瘤，男性明显多于女性。各型胶质母细胞瘤多见于中年，室管膜瘤多见于儿童及青年，髓母细胞瘤几乎都发生在儿童。胶质瘤大多缓慢发病，自出现症状至就诊时间一般为数周至数月，少数可达数年。胶质瘤的诊断，根据其生物学特征、年龄、性别、好发部位及临床过程进行分析，在病史及体征基础上，采用电生理、超声波、放射性核素、放射学及核磁共振等辅助检查，定位正确率几乎是100％，定性诊断正确率可在90％以上。星形性胶质瘤在人类肿瘤中是最恶性的脑肿瘤，虽然在美国它的发病率在所有癌症中所占比例仅仅1.35％^[11]，但是自诊断之后仅有12个月的存活期，使得胶质瘤成为了癌症中最有侵略性的一种脑肿瘤^[12]。胶质瘤占所有脑肿瘤的70％，其中多形性胶质母细胞瘤预后极差，其五年存活率不到3％^[12]。传统的治疗方法受到放射治疗的剂量、血脑屏障对药物的不通透性等多种因素的影响，疗效受到明显限制^[13]。

表皮生长因子受体(epidamal growth factor receptor,EGFR)在胶质瘤等多种恶性肿瘤中过表达，并与肿瘤恶性程相关，然而EGFR表达也见于正常组织，并存在多种EGFR突变体，限制了以EGFR为靶标的抗肿瘤治疗。EGFR基因扩增、突变及重排常见于GBM，可促进肿瘤生长、侵袭和治疗抗性。EGFRvⅢ(epidamal growth factor receptor-variantⅢ)是EGFR最常见的突变体，约占人类GBM 50％，为EGFR的胞外区2-7外显子产生框内缺失而形成，胞外段缺失了267个氨基酸而丧失了与配体结合的能力，但其胞内段隔氨酸激酶仍然保持组成性激活，导致内化和降解过程的减弱，产生持续的下游信号传导，致使其瘤性显著增强^[14,15]。这种突变体只在肿瘤细胞中出现，而在正常细胞中不出现，因此是一个很好的肿瘤治疗靶标^[14]。目前针对EGFRvⅢ的靶向治疗研究主要包括开发下游信号传导分子特异性抑制剂、EGFRvⅢ特异性抗体、肿瘤疫苗，EGFRvⅢ特异性核酶等^[16,17]。

寡核苷酸适配子已经有效的应用于临床靶标治疗^[18-20]、检测和诊断等^[21-24]。2005年第一个适配子的药物“Mucagen”已经被FDA批准上市，诸如对核仁蛋白有特殊效果的适配子AS1411应用于临床试验中^[25]，目前核酸适配子在基础研究、临床研究、药物开发中的应用在不断地增多^[26-29]。目前已有很多应用Cell-SELEX方法筛选的适配子应用在临床的例子，如Tang等用Cell-SELEX技术筛选出能识别牛痘病毒感染的A549细胞的核酸适配子，它不仅能识别病毒感染的细胞，而且能识别细胞质膜上的病毒修饰成分，该适配子的成功开发有助于对病毒感染细胞的分子标志的理解^[30]，有学者利用EGFR和其RNA适配子的特异性结合将金纳米粒传递到肿瘤细胞内，为适配子作为运载体的进一步研究提供了证据^[31]，随着SELEX技术的发展，越来越多的针对肿瘤细胞相关蛋白的核酸适配子已被筛选出，并应用于临床肿瘤的诊断中^[32]。寡核苷酸适配子而且在靶分子存在时，发生适应性折叠，与靶分子形成稳定性复合物^[33]。适配子有很多优点：体外筛选易人工合成；靶分子范围广；高亲和力；高特异性；易于修饰；分子量小，稳定性好，易保存运输^[34-39]；应用范围广，小至RNA分子^[40]、细胞因子^[41]，大到细胞^[42]，都能筛选其适配子。SELEX技术发展迅速，出现了组织切片SELEX^[43](tissue slide-based SELEX)、复合靶SELEX^[44](com-plex target SELEX)、基因组SELEX^[45](genomic SELEX)等很多形式，适配子的应用将随着SELEX技术的发展而更加广泛。

¹⁸⁸Re(铼，rhenium)具有非常优良的核性质，分别以79％和20％的几率发射最大能量为2.11MeV和1.97MeV的β射线，同时伴随有十分适于显像的155keVγ射线。其半衰期为16.9h，可防止高的β能量对骨髓等正常组织可能引起的损伤^[46]，并可采用多次给药的方式以提高疗效^[47]。虽然¹⁸⁸Re和⁹⁰Y具有类似的β能量，但是并没有观察到像⁹⁰Y那样沉积在骨髓中引起严重的骨髓抑制现象^[48]。因此¹⁸⁸Re是理想的治疗用放射性核素^[49-52]。目前很多有关¹⁸⁸Re标记的成功应用在临床的例子，如段小艺等^[53]研究了¹⁸⁸Re诱导乳腺癌ER-75-30细胞凋亡及其与bcl-2和bax基因表达的关系，结果表明¹⁸⁸Re能诱导乳腺癌ER-75-30细胞凋亡；边惠洁等^[54]探讨¹⁸⁸Re-β射线内照射对人肝癌细胞HCC的细胞周期阻断及诱导凋亡的作用，结果显示¹⁸⁸Re导致的HCC细胞死亡具有典型的细胞凋亡形态学特征；王明智等^[55]观察了不同辐射剂量¹⁸⁸Re对食管癌ECA109细胞的辐射作用，发现低辐射剂量(0.1～7.0Gy)的¹⁸⁸Re具有细胞生长抑制作用，较高剂量(>8Gy)表现出对ECA109细胞明显灭活效应。¹⁸⁸Re标记的生长抑素类似物可缩小肿瘤体积，延长荷瘤动物生存时间。动物实验表明，荷瘤鼠内或胸膜内注射7.4MBq¹⁸⁸Re直接标记的生长抑素类似物RC-160疗效显著^[56]。小鼠静脉注射11～33MBq另一种生长抑素类似物¹⁸⁸Re-P2045后，肿瘤的生长收到明显的抑制^[57]。又有研究表明利用磁性纳米微粒作为肿瘤治疗药物的载体可将¹⁸⁸Re及标记药物定向引入病灶，提高疗效^[58]。也有很多例子表明瘤内注射¹⁸⁸Re标记的药物在裸鼠荷瘤动物模型上对肿瘤生长有一直作用，如闵小峰等^[59]将¹⁸⁸Re-硫化铼混悬液注射到荷瘤小鼠肉瘤中，约80％～90％放射性积聚于肿瘤内，有效的抑制肿瘤生长，并无明显的副作用，对骨髓无明显的影响；于俊峰等^[60]瘤内注射治疗肝癌的动物实验表明¹⁸⁸Re在肿瘤内滞稳定性良好；¹⁸⁸Re的放射性在肿瘤内的高保持率表明肿瘤内直接注射核素¹⁸⁸Re制剂将是一种很有希望的肝癌治疗方法^[61]。Macugen(Pegaptanibsodium)是目前唯一通过FDA批准在临床使用的适配子药物。此药经过美国Eyetech和Pfizer制药公司15年的研制，于2004年12月获得美国FDA批准上市，选择性拮抗血管内皮生长因子(VEGF)，用于治疗年龄依赖性黄斑变性，对糖尿病视网膜病及视网膜静脉闭塞性有治疗作用^[62]。最近有研究表明，适配子在阿尔茨海默病、脑肿瘤、重症肌无力等中枢神经系统疾病上有很前景的应用。诸多例子表明¹⁸⁸Re药物或者核酸技术及临床应用已经很成熟，适配子在基础研究、疾病诊疗与新药研发等方面具有广阔的应用前景。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种与人表皮生长因子受体III型突变体(EGFRvIII)特异性结合的核酸适配子或其化学修饰物。

本发明的与人表皮生长因子受体III型突变体(EGFRvIII)特异性结合的核酸适配子或其化学修饰物，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4所示的任意一种。

所述的化学修饰物是在上述核酸适配子中包括的至少一个核苷酸的核糖2’位上的羟基被氢原子、氟原子、-O-酰基和氨基中任意一种所取代，以及在3’端或5’端加入FCM、FITC、biotin的任意修饰。

本发明的第二个目的是提供上述与人表皮生长因子受体III型突变体特异性结合的核酸适配子或其化学修饰物在制备诊断过表达人表皮生长因子受体III型突变体的肿瘤细胞的传感器或试剂盒中的应用。

所述的肿瘤细胞，优选为人星型胶质瘤细胞。

本发明的第三个目的是提供上述与人表皮生长因子受体III型突变体特异性结合的核酸适配子或其化学修饰物作为药物递送载体在制备抗过表达人表皮生长因子受体III型突变体的肿瘤细胞的药物中的应用。

所述的肿瘤细胞，优选为人星型胶质瘤细胞。

本发明的第四个目的是提供一种诊断过表达人表皮生长因子受体III型突变体的肿瘤细胞的传感器，其特征在于，所述的传感器上固定有与人表皮生长因子受体III型突变体特异性结合的核酸适配子或其化学修饰物。

本发明的第五个目的是提供一种诊断过表达人表皮生长因子受体III型突变体的肿瘤细胞的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中含有与人表皮生长因子受体III型突变体特异性结合的核酸适配子或其化学修饰物。

本发明的第六个目的是提供一种过表达人表皮生长因子受体III型突变体的肿瘤细胞的特异性的药物递送系统，其特征在于，所述的药物递送系统包含与人表皮生长因子受体III型突变体特异性结合的核酸适配子或其化学修饰物。

本发明首先针对过表达EGFR的U87-EGFRvⅢ细胞，应用Cell-SELEX技术筛选适配子，并对其与细胞的特异性结合进行鉴定，然后发现所筛选的适配子具有一定的特异性，而且结合部位在细胞核外部位，最后我们筛选到了特异性及其他方面比较好的4个适配子U2、U8、U19、U31，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示。经过共聚焦显微镜检测4个适配子U2、U8、U19、U31能与U87Δ细胞系有特异性结合，与U87细胞系没有结合，再经Pull-down实验和免疫印迹法鉴定，这4个适配子U2、U8、U19、U31可特异性结合EGFRvIII蛋白。再通过在荷瘤裸鼠动物模型上对肿瘤生长的抑瘤效果研究说明4个适配子U2、U8、U19、U31具有抑瘤效果。再经放射性¹⁸⁸Re标记检测其生物学分布、代谢性及靶向性说明其和U87Δ细胞系特异性结合且亲和力较强。

本发明的与EGFRvIII特异性结合的核酸适配子仅特异性地结合U87Δ细胞系，而不与U87细胞系结合，因此可有效地应用于制备诊断表达EGFRvIII的肿瘤细胞的传感器或试剂盒，此外，还可以作为一个携带抑制EGFRvIII的肿瘤细胞药物或siRNA的载体进入表达EGFRvIII的肿瘤细胞或组织中，具有靶向的作用，具有广阔的应用前景。

附图说明

图1是本发明的特异性地结合过表达EGFRvIII胶质瘤细胞或组织的适配子的筛选过程的示意图，第四轮引入反筛细胞U87MG，靶细胞结合的文库被加热裂解下来作为PCR扩增的dsDNA；

图2是PCR扩增双链dsDNA和链霉亲和素磁珠分离单链ssDNA目的条带，其中A：PCR扩增双链dsDNA聚丙烯酰胺电泳图，1：pUC18DNA/Mspl/Marker；2：8cycle；3：10cycle；4：12cycle；5：14cycle；6：16cycle；7：18cycle。B：链霉亲和素磁珠分离单链ssDNA尿素变性聚丙烯酰胺凝胶电泳图；1：3μL；2：2μL；3：1μL；4：5μL：5：原库ssDNA；6:Marker.

图3是根据图1所示的示意图，在Cell-SELEX法第11轮中所筛选的适配子的测序结果；

图4筛选过程中文库富集情况，流式细胞仪检测的第3、第5、第11轮文库的富集情况；

图5是Cell-SELEX各轮筛选的ssDNA亚文库对U87Δ细胞系和U87细胞系的结合力流式细胞仪检测结果图；

图6是FITC标记的适配子U2、U8、U19、U31对U87细胞系和U87Δ细胞系的结合特异性及结合位点共聚焦显微镜检测结果图；U2A图.FITC标记的适配子U2和靶细胞U87-EGFRvⅢ结合图；U2B图.FITC标记适配子U2和反筛细胞U87-MG结合图；U8A图.FITC标记适配子U8和靶细胞U87-EGFRvⅢ结合图；U8B图.FITC标记适配子U8和反筛细胞U87-MG结合图；U19A图.FITC标记适配子U19和靶细胞U87-EGFRvⅢ结合图；U19B图.FITC标记适配子U19和反筛细胞U87-MG结合图；U31A图.FITC标记适配子U31和靶细胞U87-EGFRvⅢ结合图；U31B图.FITC标记适配子U31和反筛细胞U87-MG结合图；GNA图.FITC标记原库GN(初始ssDNA文库，以下同)和靶细胞U87-EGFRvⅢ结合图；GNB图.FITC标记原库GN和反筛细胞U87-MG结合图；

图7生物素标记适配子特异性鉴定靶蛋白；1:原库GN钓取的反筛细胞U87MG蛋白；2:原库GN钓取的靶细胞U87-EGFRvⅢ87MG蛋白；3:适配子U2钓取的靶细胞U87-EGFRvⅢ蛋白；4:适配子U8钓取的靶细胞U87-EGFRvⅢ蛋白；5:适配子U2钓取的反筛细胞U87MG蛋白；6:适配子U8钓取的反筛细胞U87MG蛋白；

图8是裸鼠荷瘤模型的建立；A:种植U87-EGFRvⅢ细胞悬浮液前的裸鼠；B:种植U87-EGFRvⅢ细胞悬浮液两周后的裸鼠。

图9是适配子体内给药结束后各组肿瘤组织；A:无任何处理的空白对照组；B:转染试剂Invivo jet-PEI^TM治疗组；C:转染试剂In vivo jet-PEI^TM转染的原库GN治疗组；D:转染试剂Invivo jet-PEI^TM转染的适配子U2治疗组。

图10适配子体内给药前后的肿瘤体积统计结果；A:第一次给药时各组肿瘤体积大小统计，P值大于0.05；B:剥离的肿瘤体积.Blank：无任何处理的空白对照组；Reagent：In vivo jet-PEI^TM转染试剂治疗组；GN：转染试剂In vivo jet-PEI^TM转染的原库GN治疗组；AptU2：转染试剂In vivo jet-PEI^TM转染的适配子U2治疗组.***:与转染试剂In vivo jet-PEI^TM转染的适配子U2治疗组比较P值小于0.001；*：与转染试剂In vivo jet-PEI^TM转染的适配子U2治疗组比较P值小于0.05.

图11是适配子体内给药结束后肿瘤重量的统计结果；Blank:无任何处理的空白对照组；Reagent：转染试剂In vivo jet-PEI^TM治疗组；GN：转染试剂In vivo jet-PEI^TM转染的原库GN治疗组；AptU2：转染试剂In vivo jet-PEI^TM转染的适配子U2治疗组.***:与转染试剂In vivojet-PEI^TM转染的适配子U2治疗组比较P值小于0.001；**：与转染试剂In vivo jet-PEI^TM转染的适配子U2治疗组比较P值小于0.01.

图12是¹⁸⁸Re标记适配子给药后的肿瘤组织体积改变；A:第一次给药时各组肿瘤体积大小统计，P值大于0.05；B:剥离的肿瘤体积.Blank：无任何处理的空白对照组；Radionuclide：瘤内注射游离的核素¹⁸⁸Re对照组；¹⁸⁸Re-GN：瘤内注射¹⁸⁸Re标记的原库GN对照组；¹⁸⁸Re-U2：瘤内注射¹⁸⁸Re标记的适配子U2治疗组.*:与无任何处理的空白对照组比较P值小于0.01；^#：与游离的核素¹⁸⁸Re对照组比较P值小于0.01；^&：与¹⁸⁸Re标记的原库GN对照组比较P值小于0.01.

图13是¹⁸⁸Re标记适配子给药后剥离的肿瘤组织重量(n＝9)；Blank：无任何处理的空白对照组；Radionuclide：瘤内注射游离的核素¹⁸⁸Re对照组；¹⁸⁸Re-GN：瘤内注射¹⁸⁸Re标记的原库GN对照组；¹⁸⁸Re-U2：瘤内注射¹⁸⁸Re标记的适配子U2治疗组.*:与无任何处理的空白对照组比较P值小于0.01；^#：与游离的核素¹⁸⁸Re对照组比较P值小于0.01；^&：与¹⁸⁸Re标记的原库GN对照组比较P值小于0.01.

图14是SPECT显影检测标记率；A:展开剂为丙酮溶液；B:展开剂为生理盐水溶液；C:展开剂为乙醇：氨水：水＝2:1:5的混合溶液；

图15是¹⁸⁸Re标记适配子尾静脉给药的靶向性检测；A:裸鼠尾静脉注射游离核素¹⁸⁸Re；B:裸鼠尾静脉注射¹⁸⁸Re标记的原库GN；C:裸鼠尾静脉注射¹⁸⁸Re标记的适配子U2；

图16是¹⁸⁸Re标记适配子瘤内给药的代谢性检测；A:在裸鼠瘤内注射¹⁸⁸Re标记的原库GN和游离核素¹⁸⁸Re半小时后，体内的SPECT显影情况；B:在裸鼠瘤内注射¹⁸⁸Re标记的原库GN和游离核素¹⁸⁸Re三小时后，体内的SPECT显影情况；

图17是离体器官¹⁸⁸Re的分布情况；A:图上半部分：离体器官实物摆放位置；图下半部分：尾静脉注射¹⁸⁸Re标记的适配子U2在各个离体器官¹⁸⁸Re的SPECT显影情况；B:图上半部分：离体器官实物摆放位置；图下半部分：尾静脉注射游离核素¹⁸⁸Re在各个离体器官¹⁸⁸Re的SPECT显影情况；C:图上半部分：离体器官实物摆放位置；图下半部分：尾静脉注射¹⁸⁸Re标记的原库GN在各个离体器官¹⁸⁸Re的SPECT显影情况.

具体实施方式

以下实施例用于进一步说明本发明，但不应理解为对本发明的限制。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

本发明的详细说明中所用的主要术语的定义如下。

本发明使用的术语“核酸适配子”是指以高的亲和力特异性地识别其靶标的小单链寡核苷酸。

本发明使用的术语“样品”是指待分析的可能包括胶质瘤的标记的组合物。样品的实例包括胶质瘤细胞系、胶质瘤组织、血液、血清、血浆、唾液、痰、尿液。

本发明使用的词语“U87Δ细胞”是指稳定过表达EGFRvIII型突变体的U87细胞株。

适配子的核苷酸总数为<100nt。如果适配子的核苷酸数量少，则适配子的化学合成和大量生产将比较容易且具有成本优势。此外，适配子将容易被化学修饰，在体内高度稳定且毒性低。除此之外，包括在适配子在内的各核苷酸可包括一个或者多个相同或不同的化学修饰，例如可在核糖的2’位进行任何原子或基团的核苷酸取代。

因此，另一个方面，本发明涉及一种诊断胶质瘤的组合物，所述组合物包含上述本发明的核酸适配子。

本发明涉及一种用核酸适配子来定量检测肿瘤细胞表面EGFRvIII的表达。例如，通过将生物素缀合到核酸适配子的末端，使标记了的核酸适配子与固定在酶联板上的来自胶质瘤细胞系的蛋白样品进行反应，然后用链霉亲和素-HRP的二抗与生物素标记的适配子反应，通过显色即可定量检测到肿瘤蛋白样品中EGFRvIII的表达量。

胶质瘤的新的生物标记可通过分析结合到核酸适配子的样品物质而检测。因此，在又一方面，本发明涉及一种用核酸适配子来检测胶质瘤细胞特异的表面生物标记的方法。例如，通过将生物素缀合到核酸适配子的末端，使核酸适配子与来自胶质瘤细胞系的膜提取蛋白样品结合，并用链霉亲和素缀合的磁性颗粒沉淀适配子，然后用质谱法分析适配子，来检测特异性地结合适配子的表面生物标记。

同时，特异性地结合胶质瘤细胞或其组织的核酸适配子可固定在常规的支持物上，如磁珠、颗粒、试纸条，从而提供可用于诊断胶质瘤的检测传感器。因此，本发明的另一个方面涉及一种诊断胶质瘤的传感器，所述传感器上固定有与胶质瘤细胞U87Δ或组织的特异性地结合的核酸适配子。

上述固定支持无包括至少一个实质上是固相支持物，可通过任何常规的化学结合方法将核酸适配子固定到所述的固相支持物上。例如，可通过将生物素缀合到核酸适配子的末端形成缀合物，从而将缀合物固定到支持物的表面上，并将链霉亲和素固定到支持物的表上以诱导固定在支持物表面上的蛋白链霉素和生物素之间的相互作用。

同时，本发明的方法可以以试剂盒的形式提供出来，以增加可携带性。具体地，在另一个方面，本发明涉及一种诊断过表达人表皮生长因子受体Ⅲ型突变体的胶质瘤细胞的试剂盒，所述试剂盒包含与人表皮生长因子受体Ⅲ型突变体的的核酸适配子。如果需要的话，胶质瘤的诊断试剂盒可包括缓冲液和用于进行检测和分析的容器。诊断试剂盒可以是瓶、注射器类似的形式，该试剂盒可本分或全部由塑料、纸等类似物形成。传感器容器可装配有或全部或部分可分离的盖子，硕鼠盖子可以是容器的原始部件或可以是通过机械、粘着或其他方式附着与容器。容器也可以装配有塞子并通过注射针来接触内含物。检测试剂盒可包括外包装，外包装可包括有关组分用途的说明。

另一方面，本发明涉及一种新的能介导其他药物或siRNA或病毒的细胞传递或跨膜转运的载体，如上所述的与过表达人表皮生长因子受体Ⅲ型突变体特异性结合的核酸适配子。例如，将药物与如上所述的与过表达人表皮生长因子受体Ⅲ型突变体特异性结合的核酸适配子通过共价键或者其他介质耦合在一起，加入表达EGFRvIII的肿瘤细胞或组织中，适配子特异识别受体并且被内吞进入胞内，由此将药物或siRNA携带进入细胞，达到一个靶向治疗的目标。或者，也可以将适配子、药物、高分子材料组合在一起，高分子材料包裹药物和与过表达人表皮生长因子受体Ⅲ型突变体特异性结合的核酸适配子的组合体，从而满足通过血脑屏障的需要，进入脑内组织时，与过表达人表皮生长因子受体Ⅲ型突变体特异性结合的核酸适配子和药物的复合物释放出来，适配子识别靶蛋白，从而将药物运抵目标。

因此，可以以本发明的与过表达人表皮生长因子受体Ⅲ型突变体特异性结合的核酸适配子来递送抗癌药物或者siRNA((Chu et al.2006)、(Zhou et al.2011)、(Zhou&Rossi 2008)、)

本发明的与过表达人表皮生长因子受体Ⅲ型突变体特异性结合的核酸适配子可以其药物上可接受的盐的形式用于药物组合物中。此外，本发明的与过表达人表皮生长因子受体Ⅲ型突变体特异性结合的核酸适配子可单独使用或与其他药学活性化合物结合使用。

根据本发明的与过表达人表皮生长因子受体Ⅲ型突变体特异性结合的核酸适配子的特性，结合药学高分子材料，可以开发新的剂型。如，纳米乳、包合物、缓释胶囊、脂质体等形式。开发利于透过血脑屏障的油包水型纳米乳需要水、油、乳化剂和助乳化剂等，其中天然乳化剂包括多糖类如阿拉伯胶、白蛋白、大豆磷脂、卵磷脂和胆固醇等，合成乳化剂分离子型和非离子型两类，常用的非离子型乳化剂如脂肪酸山梨坦(亲油性)、聚山梨酯(亲水性)等，而助乳化剂常可用来调节乳化剂的HLB值，并形成更小的乳滴。常用的助乳化剂有正丁醇、乙二醇、丙二醇、甘油等。开发稳定的包合物，用的材料如β-环糊精、淀粉、纤维素等等，使与过表达人表皮生长因子受体Ⅲ型突变体特异性结合的核酸适配子不易被血液中的核酸酶所降解，使药物达到缓释的作用。

可根据患者的状况和体重、疾病的严重度、药物的类型和给药途径及周期来适用地选择本发明组合物的优选剂量和剂型，达到个体化临床用药的目的。本发明的组合物可通过多种途径给药与哺乳动物，包括小鼠、大鼠等。给药途径为：口服，注射、鞘内或脑血管给药等。

实施例1：

实验一、制备与过表达人表皮生长因子受体III型突变体(EGFRvIII)的胶质瘤细胞系(U87Δ)特异性结合的核酸适配子，筛选过程如图1所示，在11轮测序结果如图3所示。

1、设计并合成初始ssDNA文库和用于PCR扩增的引物

设计并合成长度为76个碱基的ssDNA初始GN库：5'-ATCCAGAGTGACGCAGCA(N40)TGGACACGGTGGCTTAGT-3'，初始ssDNA文库两端是固定序列，中间是40个随机序列，N代表A，T，C，G四个随机碱基。

设计并合成用于扩增出dsDNA双链的引物：

5'-FITC-Pn1：5'-ATCCAGAGTGACGCAGCA-3'；

5’-Biotin-Pn2：5'-ACTAAGCCACCGTGTCCA-3’

上述初始ssDNA文库和引物均由生物公司合成。

用PCR法，以引物5'-FITC-Pn1和引物5’-Biotin-Pn2为引物，以生物公司合成的初始ssDNA文库为模板扩增出dsDNA双链(PCR产物)，大量扩增后，应用链霉亲和素磁珠分离法获得ssDNA亚文库或者适配子，双链与单链的分子量均为76bp，结果如图2所示。

2、链亲和素磁珠分离法制备单链ssDNA

大约按照1ml的步骤1的PCR产物：150ul的链霉亲和素磁珠量的比例，将链霉亲和素磁珠注入柱子中，磁珠上下垫筛板以更好的过滤PCR产物。让磁珠自然状态下沉淀，但不能让磁珠里没有液体溶解；用0.5×D-PBS洗涤5次，此步操作应该用注射管轻轻的吹气赶走柱子中的气泡，尤其是出口处不能有气泡；室温下，将PCR产物循环经过磁珠过滤3次，其中一条带生物素标记的链与链霉亲和素磁珠结合，此步可以人工用注射针管加压，控制速度为1滴/每3秒；0.5ml D-PBS洗涤链霉亲和素磁珠5次，加入0.2M的NaOH 400μl于37℃温箱中自然过滤30-40min，另一条带FITC标记的链被裂解下来，下面接收过滤样品的EP管中用1/10体积40μl的10％乙酸中和；接收完裂解样品之后加1/10体积的3mol/L NaAc(PH5.2)，1/100体积的1mol/L MgCl₂和2倍体积的无水乙醇，于-20℃冰箱沉淀过夜；14,000rpm 4℃离心30min，弃上清，70％乙醇1ml溶解洗涤，于14,000rpm 4℃离心30min，弃液体倒置晾干，溶于少量的三蒸水中，作为下一轮筛选的亚文库(ssDNA文库)；紫外分光光度计测ssDNA浓度，7M尿素8％变性凝胶检测得到的ssDNA。

3、细胞selex筛选适配子

(1)以U87Δ为靶细胞筛选前三轮

a、将步骤2的一定浓度的ssDNA文库溶解于一定量的鲑精DNA和酵母tRNA，各种具体用量见表1，于95℃变性10min后立即置于冰上5min，在冰上冷却时加入500μl的结合缓冲液(1L PBS缓冲液中含5mmol MgCl₂、0.05g鲑鱼精DNA、1g BSA和4.5g葡萄糖)，室温放置30min左右，之后用于筛选(第一轮筛选ssDNA文库用量为1,000pmol，以后每一轮依次为800pmol、200pmol、150pmol递减)，在前三轮的筛选没有引入反筛细胞U87MG细胞；

表1

*第四轮引入U87MG作为反筛细胞

b、约1×10⁶个贴壁生长过夜的U87Δ靶细胞，用洗涤缓冲液(1L PBS缓冲液中含5mmolMgCl₂和4.5g葡萄糖)洗涤3次，每次1min；将已经制备好的ssDNA样品与U87Δ细胞在37℃、5％CO₂培养箱中共孵育60min，使得ssDNA文库与细胞充分作用；

c.回收筛选文库，用洗涤缓冲液洗涤细胞3次，每次1min；用500μl的ddH₂O溶解1μl蛋白酶K的样品与细胞在37℃作用15min，收集所有结合样品与细胞于1.5ml离心管中，95℃加热10min，离心收集上清，即为第一轮筛选得到的产物，用于下一轮筛选扩增dsDNA。

用PCR法，以引物5'-FITC-Pn1和引物5’-Biotin-Pn2为引物，以第一轮筛选得到的产物为模板扩增出dsDNA双链(PCR产物)，再通过链亲和素磁珠分离法从该dsDNA双链(PCR产物)制备单链ssDNA文库(具体步骤参照步骤2和表1)。用于下一轮筛选。

如此进行3轮筛选，得到3轮筛选后的ssDNA文库。

(2)第四轮开始引入反筛细胞U87MG

a.按照步骤(1)中的a、b、c步骤得到经过3轮筛选后的ssDNA文库；

b.用洗涤缓冲液洗涤U87MG细胞3次，每次3min；将步骤(1)中得到的经过3轮筛选后的ssDNA文库与U87MG细胞在37℃、5％CO₂培养箱中共孵育40min左右；洗涤缓冲液洗涤细胞3次，每次3min，小心收集液体，离心收集上清，即为该轮筛选得到的产物，用于下一轮筛选扩增dsDNA。

(3)用PCR法，以引物5'-FITC-Pn1和引物5’-Biotin-Pn2为引物，以步骤步骤(2)中的b得到的该轮筛选得到的产物为模板扩增出dsDNA双链(PCR产物)，再通过链亲和素磁珠分离法从该dsDNA双链(PCR产物)制备带FITC标记的、与靶细胞特异性结合的ssDNA配基(具体步骤参考步骤2和表1)。用于下一轮筛选。

如此重复筛选8轮，连同U87Δ为靶细胞筛选的前三轮，总共筛选了11个循环。

(4)为了更好地得到特异性强、高亲和力的适配子，在逐渐的筛选过程中不断地增加洗涤次数和延长洗涤时间，缩短与细胞孵育时间和减少细胞的密度，具体见表1。

利用链霉亲和素磁珠分离法获得ssDNA亚文库或者适配子，双链与单链的分子量均为76bp，结果如图3所示。

经过11轮筛选后对筛选得到的适配子进行克隆测序，所得到适配子的序列见图3。

如图3所示，筛选得到的适配子有4个，分别为U2(5’-ATCCAGAGTGACGCAGCATTTTGACGCTTTATCCTTTTCTTATGGCGGGATAGTTTCGTGGACACGGTGGCTTAGT-3’，具体序列如SEQ ID NO.1所示)、U8(5’-ATCCAGAGTGACGCAGCATGAATCTTTTCTTTTGGTTTTGATATTTATAGTTGGTGAATGGACACGGTGGCTTAGT-3’，具体序列如SEQ ID NO.2所示)、U19(5’-ATCCAGAGTGACGCAGCATTTGTATCCTATTTTGTTTATGTAATTGTCGTTGATCATGTGGACACGGTGGCTTAGT-3’，具体序列如SEQ ID NO.3所示)、U31(5’-ATCCAGAGTGACGCAGCATTTGTTTAATATGTTTTTTAATTCCCCTTGTGGTGTGTTGTGGACACGGTGGCTTAGT-3’，具体序列如SEQ ID NO.4所示)。

实验二、Cell-SELEX技术筛选得到的适配子富集检测

1、检测Cell-SELEX法的第3、5、11轮筛选得到的ssDNA亚文库对U87Δ细胞系的富集情况

具体方法为：将细胞密度5×10⁵细胞铺在六孔板中，过夜贴壁生长；用1×PBS洗涤靶细胞U87Δ，加入适量的无酶消化液，以覆盖细胞表面为准，放置37℃适宜时间直至细胞完全脱壁，加入2倍体积的1×PBS终止消化，800rpm离心6min，弃上清，PBS重悬细胞；将FITC标记的原库GN、第3轮、第5轮、第11轮筛选的亚文库FITC-ssDNA各200pmol与U87Δ细胞系孵育40min；离心沉淀细胞，弃上清，PBS洗涤细胞3次后，300μl PBS重悬细胞；流式细胞检测仪检测原库GN及次文库与U87Δ细胞系随着筛选轮速增加的富集情况。结果如图4所示，随着筛选轮数的增加，亚文库与U87Δ细胞系具有富集作用。

实验三、适配子U2-U31的活性检测

1、流式细胞技术检测适配子U2-U31对U87Δ细胞系、U87细胞系的结合亲和力

具体方法：将U87Δ细胞系、U87细胞系贴壁培养过夜，消化后取5×10⁵个细胞用PBS缓冲液洗涤1次，重悬后加入终浓度为200pmol的5'端标记FITC的适配子(U2、U8、U19或U31)，将所述适配子分别和培养过夜后的U87Δ细胞系、U87细胞系混合后，37℃孵育40min，再用PBS缓冲液洗涤3次，用流式细胞检测仪检测FITC的荧光强度。以初始ssDNA文库作为对照，结果如图5所示。图5所示适配子与U87细胞的结合情况，用5'标记FITC的初始ssDNA文库(initial library)做对照。从图5可以看出，适配子(U2、U8、U19或U31)与U87MG细胞的结合亲和力，与初始ssDNA文库和和空白对照差不多，曲线几乎没有位移。而适配子(U2、U8、U19或U31)与空白对照和初始ssDNA文库相比，与U87Δ细胞系的结合亲和力，曲线有着明显的位移，由此说明适配子(U2、U8、U19或U31)与U87Δ细胞系的结合亲和力强。

实验四、适配子特异性鉴定

1、共聚焦显微镜检测适配子U2、U8、U19和U31，与U87Δ细胞系、U87细胞系结合的特异性及结合位点检测

具体方法：分别接种合适密度的U87MG和U87Δ细胞于24孔板或共聚焦小皿中贴壁过夜生长；4％多聚甲醛避光固定过夜生长于24孔板的细胞20min(孔内放有圆形的盖玻片，细胞贴壁生长于盖玻片上)；用1×PBS洗涤3次×5min，3％BSA封闭1h后，弃孔内液体，用1×PBS洗涤3次×5min；将150pmol寡核苷酸适配子(U2、U8、U19或U31)溶于一定量的鲑精DNA(终浓度：0.1μg/μl)和酵母tRNA(终浓度：0.1μg/μl)于95℃加热10min，冰上5min，加300μl结合缓冲液(100ml PBS加0.1g BSA、0.45g葡萄糖、500μl 1mol/L的MgCl₂)；将此制备好的FITC适配子(U2、U8、U19或U31)分别与U87MG和U87Δ细胞室温避光孵育40min，并放置于摇床上左右缓慢摇动，使得样品与细胞充分结合；弃孔内液体，用1×PBS洗涤3次×5min，将盖玻片倒扣在滴有10μl DAPI染液的盖玻片上；室温避光放置于铝制饭盒内，在荧光显微镜或共聚焦显微镜下观察适配子与细胞的结合情况，以原库FITC-GN(初始ssDNA文库)为对照适配子。

如图6所示，筛选得到的适配子(U2、U8、U19或U31)与U87Δ细胞系有特异性结合，与U87细胞系没有结合，对照适配子原库FITC-GN与U87Δ细胞系、U87细胞系均没有结合。

实验五、Pull-down实验和免疫印迹法鉴定适配子结合的靶标

具体方法：将靶细胞U87-EGFRvⅢ(U87Δ细胞系)和反筛细胞U87MG传代过夜贴壁生长，隔天观察细胞密度与状态。待细胞密度与状态好时，用蛋白裂解液裂解细胞，并加蛋白酶抑制剂和0.5M EDTA(pH8.0)裂解15min。收集所有样品，4℃16000rpm离心1h，收集上清并进行蛋白定量。生物素磁珠用0.5×PBS洗涤3次×3min×0.6ml；1×PBS洗涤3次×3min×0.6ml，制备生物素样品：适量的结合缓冲液与3’端标记生物素适配子(U2或U8)300pmol一起和磁珠于37℃孵育30min。用1×PBS洗涤磁珠3次×3min×0.6ml，投入600μg蛋白液体(按照每300pmol生物素适配子(U2或U8)与600μg靶蛋白量比例投入)，与上述磁珠于37℃孵育1h；用1×PBS洗涤磁珠5次×1min×0.6ml，弃液体加60μl的1×SDS-PAGE上样缓冲液加热煮沸10min洗脱结合蛋白后，行10％SDS-PAGE凝胶并用抗EGFR抗体进行免疫印迹实验。

结果如图7所示，筛选得到的适配子(U2或U8)可特异性结合EGFRvIII蛋白。

实施例2：

实验1、适配子在裸鼠荷瘤动物模型上的抑制肿瘤生长的作用

具体方法：U87Δ细胞用含10％FBS的DMEM于5％CO₂、37℃培养，4～6周裸鼠饲养于SPF实验屏障环境中。共28只裸鼠，分为空白组、in vivo jet-PEI^TM转染试剂组、原库GN组和适配子U2治疗组4组，每组7只；用改良型RPMI-1640培养液重悬U87Δ细胞，密度为100μl的1640培养液中含1.5×10⁶～2.0×10⁶个；用1ml注射器于4～6周的雄性裸鼠(BALB/c)右侧后臀部皮下注射，每只裸鼠注射100μl；2周后观察肿瘤形成情况，用游标卡尺测量肿瘤体积大小；用in vivo jet-PEI^TM试剂分别转染适配子U2和原库GN(初始ssDNA文库)进行瘤内注射(每隔1天注射1次，67pmol/只，共3次)，以转染试剂in vivo jet-PEI^TM、GN原库作为对照组；1周后处死动物，手术剥离肿瘤组织，对肿瘤组织拍照以作形体大小对比；游标卡尺测量肿瘤组织体积，千分之一电子称称量肿瘤组织的重量；应用SPSS 19.0统计软件对实验数据进行统计学分析。动物模型肿瘤体积和重量实验数据以平均数±标准差 表示。所有计量资料间比较在确定方差齐性之后，各组间数据结果比较用单因素方差分析(One-way ANOVA)。P<0.05认为差异有统计学意义，P>0.05认为没有统计学意义。

结果如图8-11所示，适配子U2对肿瘤的生长有抑制作用，适配子U2治疗组与其他组进行组组间比较，均有统计学差异(P<0.05)。

实验2：¹⁸⁸Re标记适配子在裸鼠荷瘤动物模型上观察适配子抑瘤的作用

具体方法：用¹⁸⁸Re标记适配子U2和原库GN(初始ssDNA文库)进行瘤内注射(每只200pmol，约2μg，每只给药量的标记适配子U2、GN及游离¹⁸⁸Re的¹⁸⁸Re放射性活度均为0.075mCi，标记率70％)，以游离¹⁸⁸Re组、¹⁸⁸Re标记的原库GN组和空白组作为对照组。1周后处死动物，手术剥离肿瘤组织，对肿瘤组织拍照以作形体大小对比。游标卡尺测量肿瘤组织体积，千分之一电子称称量肿瘤组织的重量。SPSS 13.0统计软件对实验数据统计学分析，肿瘤体积和重量数据均以平

均数±标准差表示。各组组间数据比较用单因素方差分析(One-way ANOVA)。P<0.05差异有统计学意义，P>0.05没有统计学意义。

给药结束1周后处死动物，剥离肿瘤组织，打药前的体积及剥离的肿瘤体积和重量数据用均数±标准差表示，并进行统计学分析，结果如图12-13所示。打药前组组间肿瘤体积无统计学差异(P>0.05)，剥离肿瘤组织重量与体积组组间统计学分析结果表明，¹⁸⁸Re标记适配子U2与其它组均有统计学意义(P<0.05)，适配子U2具有抑瘤的作用。

实验3：¹⁸⁸Re标记适配子，SPECT显影检测标记率、靶向性和代谢性

具体方法：

(1)¹⁸⁸Re标记适配子及SPECT显影检测标记率：取浓度20μg/20μl的寡核苷酸适配子U2，0.2M PH＝5.0的醋酸缓冲液10μl，氯化亚锡(SnCl₂浓度为3mg/0.1ml)50μl，抗坏血酸(Vit C浓度为10mg/0.1ml)100μl相混合，得样品。经¹⁸⁸Re淋洗器取淋洗液0.672mCi/0.3ml，与样品混合，然后一起在水浴锅37℃加热1.5h，操作时注意放射性防护；标记后，用纸层析法测量标记率，双层析系统组成：固定相为3MM色谱层析纸，系统一展开剂为丙酮(标记展开点集中在底部)，系统二展开剂为生理盐水(对照，标记展开点集中在底部)，系统三展开剂为乙醇:氨水:水＝2:1:5(标记展开点集中在顶部)，用100％-丙酮展开剂的底部百分比-乙醇:氨水:水展开剂的顶部百分比＝标记率，SPECT显影检测不同展开剂的标记率；

(2)对¹⁸⁸Re标记的适配子纯化，采用C-18Sep-Pak反相柱分析方法：加样前先用10ml无水乙醇、10ml的1mM盐酸及5ml空气清洗Sep-Pak C18反相柱后，将100μl标记好¹⁸⁸Re的适配子U2上样后，以10ml的1mM HCl去除游离的¹⁸⁸ReO₄ ^-，再以10ml无水乙醇与生理盐水(1:1)洗脱出标记的寡核苷酸，检测其放射性计数。计算标记率(74.49％)及纯度。

(3)SPECT显影检测瘤内及尾静脉给¹⁸⁸Re标记适配子的靶向性及代谢性：将成瘤裸鼠固定在老鼠固定器材上；用¹⁸⁸Re标记适配子U2和原库GN，标记适配子放射性活度为0.960mCi/0.5ml，标记率68％和70％；1ml注射器瘤内及尾静脉分别给已经标记好的适配子U2、原库GN和游离¹⁸⁸Re，瘤内注射量200μl，尾静脉注射量300μl；SPECT显影检测尾静脉给药1小时后的靶向性与瘤内给药3小时后的代谢性。

(4)SPECT显影检测¹⁸⁸Re标记适配子后，离体器官¹⁸⁸Re的分布情况

SPECT显影3小时后，处死裸鼠，用手术器材取出裸鼠的左右肺、左右肾、脾脏、肝脏及肿瘤；用酒精洗净各器官表面的血液，滤干表面的液体，按照一定的顺利摆放在湿润的滤纸上；SPECT显影检测各个离体器官¹⁸⁸Re的分布情况。

结果如下：

SPECT显影检测¹⁸⁸Re标记适配子标记率：严格按照放射性核素标记的参考文献标记适配子之后，通过层析法检测标记率，将不同的展开剂系统(丙酮，生理盐水，乙醇:氨水:水三种展开剂)的层析纸在SPECT显影检测核素¹⁸⁸Re标记率。丙酮和生理盐水展开剂系统底部SPECT显影越清晰明显说明标记率越高，乙醇:氨水:水展开剂系统SPECT显影顶部越清晰明显表明标记率越高，结果如图14所示。结果表明展开剂为丙酮(A)溶液、生理盐水(B)的底部SPECT核素显影清晰明显说明标记率高，展开剂为乙醇:氨水:水混合溶液(C)顶部SPECT核素显影清晰明显表明标记率高。

SPECT显影检测¹⁸⁸Re标记适配子瘤内给药的靶向性和代谢性：将¹⁸⁸Re标记的适配子、原库GN和游离的¹⁸⁸Re核素，通过尾静脉给药后，SPECT检测1小时后的靶向性与瘤内给药3小时后的代谢情况，结果如图15和16所示。图15结果表明将¹⁸⁸Re标记的适配子U2尾静脉注射1小时后，在瘤内SPECT显影可检测到放射性核素显影(C)，而¹⁸⁸Re标记的原库GN(B)和游离的核素¹⁸⁸Re(A)均未在瘤内检测到¹⁸⁸Re核素显影，表明¹⁸⁸Re标记的适配子U2对肿瘤具有靶向性；图16结果表明经过瘤内注射的游离核素和¹⁸⁸Re标记的原库GN 0.5小时后，瘤内还可以检测到¹⁸⁸Re核素显影(A)，3小时后瘤内基本检测不到¹⁸⁸Re核素显影(B)，在膀胱处检测到了核素显影(B)，说明了注射的药物代谢了，经过膀胱排泄。

裸鼠尾静脉给¹⁸⁸Re标记的原库GN 3小时候后，处死老鼠，取出左右肺、左右肾、脾脏、肝脏和肿瘤离体器官，按照一定顺序摆放在酒精湿润的滤纸上，SPECT检测¹⁸⁸Re分布情况，结果如图17所示：肿瘤和肝脏的放射性较高，表明放射性适配子U2通过肝脏进行代谢。可以显示¹⁸⁸Re标记的适配子U2可用于肿瘤的放射诊断。结果表明对尾静脉注射¹⁸⁸Re标记的适配子U2(A)、游离的¹⁸⁸Re核素(B)和原库GN(C)3小时后，裸鼠的离体器官SPECT显影检测¹⁸⁸Re体内分布情况；¹⁸⁸Re标记的适配子U2(A)主要在肿瘤内检测到核素显影，游离的¹⁸⁸Re核素(B)和原库GN(C)主要在肝脏检测到核素显影。

尽管参考具体特征详细地描述了本发明，显然对本领域的技术人员来说，这种描述仅仅是优选的实施方式而并不限制本发明的范围。因此，本发明的实质范围将由所附的权利要求书及其等同来限定。

Claims (9)

1.一种与人表皮生长因子受体III型突变体特异性结合的核酸适配子或其化学修饰物，其特征在于，所述的核酸适配子的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

2.根据权利要求1所述的与人表皮生长因子受体III型突变体特异性结合的核酸适配子或其化学修饰物，其特征在于，所述的化学修饰物是在权利要求1所述的核酸适配子中包括的至少一个核苷酸的核糖2’位上的羟基被氢原子、氟原子、-O-酰基和氨基中任意一种所取代，以及在3’端或5’端加入FCM、FITC、biotin的任意修饰。

3.权利要求1所述的与人表皮生长因子受体III型突变体特异性结合的核酸适配子或其化学修饰物在制备诊断过表达人表皮生长因子受体III型突变体的肿瘤细胞的传感器或试剂盒中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的肿瘤细胞为人星型胶质瘤细胞。

5.权利要求1所述的与人表皮生长因子受体III型突变体特异性结合的核酸适配子或其化学修饰物作为药物递送载体在制备抗过表达人表皮生长因子受体III型突变体的肿瘤细胞的药物中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的肿瘤细胞为人星型胶质瘤细胞。

7.一种诊断过表达人表皮生长因子受体III型突变体的肿瘤细胞的传感器，其特征在于，所述的传感器固定有权利要求1所述的与人表皮生长因子受体III型突变体特异性结合的核酸适配子或其化学修饰物。

8.一种诊断过表达人表皮生长因子受体III型突变体的肿瘤细胞的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中含有权利要求1所述的与人表皮生长因子受体III型突变体特异性结合的核酸适配子或其化学修饰物。

9.一种过表达人表皮生长因子受体III型突变体的肿瘤细胞的特异性的药物递送系统，其特征在于，所述的药物递送系统包含权利要求1所述的与人表皮生长因子受体III型突变体特异性结合的核酸适配子或其化学修饰物。