CN103463619B - 骨形成蛋白4在抑制癌症中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及骨形成蛋白4在抑制癌症中的应用。具体地，外源骨形成蛋白（BMPs）具有诱导肝癌干细胞分化的作用，BMP4可使肝癌细胞系的CD133蛋白表达下调，促进肝癌细胞系CD133+肝癌干细胞分化；BMP4还能够抑制肝癌细胞系的体外增殖和自我更新，抑制免疫缺陷小鼠的成瘤能力。本发明还提供了BMP4诱导肝癌干细胞分化的作用机制。

Description

骨形成蛋白4在抑制癌症中的应用

技术领域

本发明属于生物制药领域，具体地，本发明涉及骨形成蛋白4在抑制癌症中的应用。

背景技术

肝细胞癌(hepatocellularcarcinoma,HCC)是世界范围内第五大高发肿瘤，也是第三大的肿瘤致死病因。随着对肿瘤研究不断进展，手术治疗、放射治疗和化学治疗都成功使肿瘤瘤体缩小，但是肝癌术后复发和转移仍然十分普遍，常常导致肝癌患者的最终死亡。近年来，针对肿瘤易于复发与转移的特性，研究者发现了肿瘤干细胞（CancerStemCells,CSCs），并认为肿瘤干细胞的发生和发展对肝癌发挥了重要作用。

肿瘤干细胞（CSCs）是一群存在于肿瘤细胞系或肿瘤组织中为数不多、但具有低分化、高耐药性和高抗放射治疗的特性的特殊肿瘤细胞，它们可以在体内或体外成为分化程度更高的肿瘤细胞，对其进行分选和分离，并接种于免疫缺陷小鼠体内后，CSCs可以形成与其来源肿瘤细胞分化层级一致的肿瘤组织。虽然临床治疗可以杀死大部分的肿瘤细胞，但治疗过程中CSCs的残存，经常导致肿瘤的复发甚至转移。CSCs在体外除具有干细胞的基本特征（自我更新和分化潜能），还具有如下特征：（1）CSCs可以通过特定细胞表面标志物来分离；（2）多数CSCs可以在悬浮培养条件下形成球形克隆，或称肿瘤球（tumorspheres）；（3）CSCs对化疗药物和放射线具有很强的耐受性。大多数的肿瘤的进展都与癌干细胞有关。在肝癌研究中，多种细胞标志物都被认为能够有效富集肝癌干细胞群，包括EpCAM、CD133、OV6、CD90和SP细胞。跨膜蛋白CD133可以作为肝癌CSCs的一种表面标志物，CD133⁺的肝癌CSCs在体外具有更高的克隆形成能力，并且在免疫缺陷小鼠体内更容易形成肿瘤。

CD133是prominin-1基因编码的蛋白，基因定位于染色体4p15.32，编码含865个氨基酸的蛋白，其相对分子质量120kD，是一种5次跨膜糖蛋白。CD133的mRNA在许多正常组织细胞中表达，但CD133蛋白的表达仅限于未分化细胞中，如内皮祖细胞、造血干细胞、胎儿脑干细胞与前列腺上皮干细胞等。在肿瘤研究中，CD133主要用于标记肿瘤细胞中CSC群，100个CD133⁺脑肿瘤CSCs在裸鼠体内6个月即可形成肿瘤，而10万个CD133^-肿瘤细胞在相同时间内未在裸鼠体内形成肿瘤。

但迄今为止，研究者对CD133⁺肝癌CSC的分化及其调控机制并不十分清楚。因此本领域迫切需要开发能够影响肝癌干细胞分化的药物。

发明内容

本发明的目的就是提供一种诱导肝癌干细胞分化的药物及其应用。

在本发明的第一方面，提供了一种骨形成蛋白4即BMP4蛋白的用途，所述用途为选自下组的一种或多种的用途：

(a)用于制备治疗肝癌的药物；

(b)用于制备促进肝癌干细胞的分化的组合物；

(c)用于制备抑制肝癌体外增殖和/或自我更新的组合物；

(d)用于制备抑制肝癌的成瘤能力的组合物；

(e)用于制备提高肝癌细胞对抗肿瘤剂敏感性的组合物；

(f)用于制备降低肝癌细胞耐药性的组合物。

在另一优选例中，所述的治疗是分化治疗肝癌。

在另一优选例中，所述的组合物为药物组合物。

在另一优选例中，所述的肝癌干细胞是人或非人哺乳动物的肝癌干细胞。

在另一优选例中，所述的非人哺乳动物包括灵长目动物、啮齿动物（如小鼠、大鼠）等。

在另一优选例中，所述的BMP4蛋白包括人或非人哺乳动物的BMP4蛋白、或其具有相同诱导肝癌干细胞分化功能的同源蛋白、突变蛋白或衍生蛋白。

在本发明的第二方面，提供了一种骨形成蛋白4即BMP4蛋白的用途，所述的用途为选自下组的一种或多种用途：

(a)用于制备治疗癌症的药物；

(b)用于制备促进癌症干细胞的分化的组合物；

(c)用于制备抑制癌症的体外增殖和/或自我更新的组合物；

(d)用于制备抑制癌症的成瘤能力的组合物；

(e)用于制备提高癌症细胞对抗肿瘤剂的敏感性的组合物；

(f)用于制备降低癌症细胞的耐药性的组合物。

在另一优选例中，所述的癌症是实体瘤，或所述的癌症细胞来源于实体瘤。

在另一优选例中，所述的癌症包括肝癌、肺癌、胃癌；更佳地，为肝癌。

在本发明的第三方面，提供了一种体外非治疗性的诱导肝癌干细胞分化的方法，所述方法包括步骤(I)：在添加BMP4蛋白的条件下，培养肝癌干细胞，从而诱导肝癌干细胞的分化。

在另一优选例中，将肝癌干细胞与含BMP4蛋白的溶液进行接触或混合，然后进行培养。

在另一优选例中，培养体系中BMP4蛋白的浓度≥30ng/ml，较佳地≥50ng/ml，更佳地≥100ng/ml。

在另一优选例中，所述的BMP4蛋白为BMP4单体、或BMP4同二聚体，或BMP4异二聚体、或BMP4的融合蛋白（保留BMP4活性），较佳地为BMP4同二聚体。

在另一优选例中，所述方法还包括步骤：在步骤（I）之前、之中或之后，在培养体系中添加额外的抗肿瘤剂。

在另一优选例中，所述的抗肿瘤剂包括化疗药、肿瘤抗体等。

在另一优选例中，所述的抗肿瘤剂包括（但并不限于）：阿霉素、长春新碱、紫杉醇、顺铂、卡铂、5-FU、或其组合。

在本发明的第四方面，提供了一种提高肿瘤细胞对抗肿瘤剂的敏感性或降低肿瘤细胞的耐药性的方法，所述方法包括步骤(I)：在添加BMP4蛋白的条件下，培养肿瘤细胞，从而提高肿瘤细胞对抗肿瘤剂的敏感性或降低肿瘤细胞的耐药性。

在另一优选例中，所述的肿瘤细胞包括选自下组癌症的肿瘤细胞：肝癌、肺癌、胃癌，更佳地为肝癌。

在本发明的第五方面，提供了一种缓释药物组合物，所述的药物组合物包括药学上可接受的载体和作为活性成分的BMP4蛋白，且组合物为缓释剂型。

在另一优选例中，所述组合物包括缓释颗粒以及吸附于缓释颗粒的BMP4蛋白。

在另一优选例中，所述的缓释颗粒由生物可降解材料（如聚乳酸，聚丙烯酸）制成。

在另一优选例中，所述的缓释药物组合物为注射剂。

在另一优选例中，所述的缓释药物组合物的给药方式为局部给药或瘤内给药。

在另一优选例中，所述的BMP4蛋白包括BMP4单体、或BMP4同二聚体，或BMP4异二聚体、或BMP4的融合蛋白（保留BMP4活性）。

在另一优选例中，所述的BMP4蛋白单体是由Genbank数据库中登录号为NM_001202.3、NM_130850.2、或NM_130851.2所示的核苷酸序列编码的。

在另一优选例中，所述的缓释药物组合物还包括额外的抗肿瘤剂。

在另一优选例中，所述的抗肿瘤剂包括化疗药、肿瘤抗体等。

在另一优选例中，所述的抗肿瘤剂包括（但并不限于）：阿霉素、长春新碱、紫杉醇、顺铂、卡铂、5-FU或其组合。

在本发明的第六方面，提供了一种用于治疗肿瘤的药盒，所述药盒包括：

（a）第一治疗剂，所述第一治疗剂是含BMP4作为活性的药物制剂；

（b）第二治疗剂，所述第二治疗剂是抗肿瘤剂，所述的抗肿瘤剂含有不同于BMP4的活性成分；和

（c）使用说明书。

在本发明的第七方面，提供了一种治疗肿瘤或诱导肿瘤细胞分化的方法，包括步骤：给需要的对象施用BMP4蛋白或第五方面所述的缓释药物组合物。

在另一优选例中，所述的癌症是实体瘤；较佳地，所述的癌症包括肝癌、肺癌、胃癌；更佳地为肝癌。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

下列附图用于说明本发明的具体实施方案，而不用于限定由权利要求书所界定的本发明范围。

图1显示CD133是PLC/PRF/5细胞系的CSC表面标志物；其中，图1A显示不同肝癌细胞系中CD133+细胞率；图1B显示PLC/PRF/5细胞中，CD133+细胞％约为52％，通过流式分选后得到的CD133+/CD133-肝癌细胞群的分选纯度达到90％以上；图1C显示，PLC/PRF/5CD133+细胞群肿瘤球形成的数目和大小均大于CD133-细胞群；图1D显示，多种干细胞相关基因在PLC/PRF/5CD133+细胞群中表达上调。

图2显示，高浓度外源性BMP4处理肝癌细胞后其CD133+细胞比例下降；其中，图2A显示采用流式细胞分析法分析PLC/PRF/5（PLC）和Huh7细胞中CD133+细胞率，结果显示高浓度外源性BMP4处理6天后两种细胞系中的CD133+细胞率分别有原来的约52.1％下降至32.9％，和约73.0％下降至47.5％。

图3显示，外源性BMP4可以降低肝细胞癌细胞中CD133蛋白表达；其中，图3A显示用0-100ng/ml不同浓度的外源性BMP4处理PLC/PRF/5CD133+/CD133-细胞中CD133蛋白的表达情况；图3B显示50ng/mlBMP4处理不同时间后PLC/PRF/5细胞中CD133蛋白的表达情况；图3C显示采用WesternBlot法分析50ng/mlBMP4处理6天后，Huh7细胞中CD133蛋白表达情况。

图4显示，外源性高浓度BMP4抑制PLC/PRF/5细胞增殖但不引起凋亡，其中，图4A显示BrdU-ELISA法检测0-100ng/ml不同浓度BMP4处理3天对PLC/PRF/5细胞增殖能力的影响；图4B显示AnnexinV/7-AAD双标法检测50ng/mlBMP4处理后PLC/PRF/5细胞凋亡率的变化。

图5显示，高浓度外源性BMP4诱导肝癌CSCs的分化，其中，图5A显示通过Real-timePCR检测分别在CDM悬浮培养或在50ng/mlBMP4处理单层贴壁3天的PLC/PRF/5CD133+/-肝癌细胞干性相关基因表达情况；图5B显示WesternBlot检测显示BMP4处理在CD133+PLC/PRF/5细胞中呈时间依赖性上调CK8/18蛋白并下调CK19蛋白表达；图5C显示免疫细胞化学检测CD133+PLC/PRF/5细胞中CK8/18和CK19在BMP4处理前后表达的变化。

图6显示BMP4处理对Huh7和MHCC-97L细胞CK8/18和CK19蛋白表达的影响；其中，图6A显示BMP4处理Huh7细胞0~6天后CK8/18和CK19蛋白的表达；图6B显示BMP4处理6天后MHCC-97L细胞CK8/18和CK19蛋白的表达。

图7显示高浓度外源性BMP4处理抑制肝CSCs自我更新；图7A和图7B显示将分选得到的CD133+/-PLC/PRF/5细胞用BMP4预处理6天后，在24孔细胞培养板中进行软琼脂克隆形成实验并计算克隆形成率（colonyformationefficiency，CFE）(n=3)；图7C显示将分选得到的CD133+PLC/PRF/5细胞用BMP4预处理6天后，种入超低黏附板中观察肿瘤球形成情况，培养液为无血清CDM。

图8显示BMP4抑制CD133+肝癌CSCs在体内的成瘤能力，其中，图8A和图8B显示，CD133+/-PLC/PRF/5（PLC）和MHCC-97L（97L）细胞在裸鼠体内肝原位注射形成移植瘤的重量；图8C显示，PLC/PRF/5与MHCC-97LCD133+/-细胞与BMP4包被beads共同注射时的成瘤性。

图9显示CD133+/-肝癌细胞与BMP4包被beads共同接种的成瘤性；其中，图9A为PLC/PRF/5（PLC）肝癌细胞；图9B为MHCC-97L（97L）肝癌细胞。

图10显示BMP4提高了肝癌CSCs的化疗药物敏感性；其中，图10A和图10B显示，CD133+/-PLC/PRF/5细胞经过BMP4预处理后，经MTT试验检测计算每种细胞对阿霉素（Doxorubicin）和长春新碱（Vincristine）的IC50值；图10C显示BMP4处理降低了PLC/PRF/5细胞中ABCG2蛋白的表达；图10D显示BMP4处理降低了MHCC-97L细胞中ABCG2蛋白的表达；图10E显示流式细胞术检测分析BMP4处理前后MHCC-97L细胞中SP细胞比例。

图11显示BMP受体在肝癌细胞中的表达和激活；其中，图11A显示PLC/PRF/5和Huh7细胞用50ng/mlBMP4处理0-90min，WesternBlot结果显示BMPRIa、BMPRIb和SMAD4在这些细胞中持续表达，并且SMAD1出现BMP4浓度依赖性磷酸化激活；图11B显示，WesternBlot分析BMPRIa、BMPRIb在BMP4处理3天后的SMMC-7721细胞中的表达和激活情况；图11C显示BMPR1a在CD133+/CD133-肝癌细胞表达的WesternBlot检测；图11D显示，WesternBlot分析SMAD4siRNA干扰片段在PLC/PRF/5细胞中的干扰效率；图11E显示SMAD4干扰阻断了BMP4在PLC/PRF/5细胞中的促分化作用。

图12显示BMP受体在人原发性肝癌组织中的蛋白表达，免疫组化法检测BMPRIa和BMPRIb蛋白在236例人原发性肝癌组织样品中的表达。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，首次在众多的生长因子中，意外地发现，外源性骨形成蛋白（BMPs）具有诱导肝癌干细胞分化的作用，具体地，外源性BMP4处理可使肝癌细胞系PLC/PRF/5和Huh7细胞中CD133蛋白表达下调，这种下调作用具有时间依赖性和浓度依赖性；BMP4能够促进PLC/PRF/5、Huh7和MHCC-97L细胞系中CD133+肝癌干细胞分化，并且肝系上皮细胞特异性标志物的表达呈时间依赖性增多；抑制PLC/PRF/5细胞体外增殖，抑制其CD133+肝癌干细胞的自我更新以及在免疫缺陷小鼠体内的成瘤能力；BMP4通过下调ABCG2蛋白表达等途径增强PLC/PRF/5和MHCC-97LCD133+肿瘤干细胞对化疗药物的敏感性；BMP4激活CD133+肿瘤干细胞中的BMP经典信号通路，干扰经典通路关键分子SMAD4，使BMP4失去促CD133蛋白表达下降作用。在此基础上完成了本发明。

术语

BMP4

如本文所用，术语“BMP4”，“BMP4蛋白，”“Bonemorphogeneticprotein4”“骨形成蛋白4”或“成骨蛋白4”可以互换使用。BMP4是一种广泛分布于哺乳动物细胞中的生长因子，属于TGF-β家族。BMP4可以是Genbank登录号为NP_001193.2、NP_570911.2、或NP_570912.2所示的任一氨基酸序列；所述的BMP4蛋白也可以是由Genbank数据库中登录号为NM_001202.3、NM_130850.2、或NM_130851.2所示的核苷酸序列编码的。

该所述的BMP4蛋白为BMP4单体、或BMP4同二聚体，或BMP4异二聚体、或BMP4的融合蛋白（保留BMP4活性），较佳地为BMP4同二聚体。

该术语还包括BMP4在药学上可接受的盐、水合物或溶剂合物。如本文所用，术语“药学上可接受的盐”指BMP4与酸或碱所形成的适合用作药物的盐。药学上可接受的盐包括无机盐和有机盐。优选的盐是BMP4与酸形成的盐。适合形成盐的酸包括但并不限于：盐酸、氢溴酸、氢氟酸、硫酸、硝酸、磷酸等无机酸，甲酸、乙酸、丙酸、草酸、丙二酸、琥珀酸、富马酸、马来酸、乳酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、苦味酸、甲磺酸、苯甲磺酸，苯磺酸等有机酸；以及天冬氨酸、谷氨酸等酸性氨基酸。

制备方法

本领域的普通技术人员可以使用常规的方法，如生物合成或全化学合成法制备BMP4。在一个优选例中，生物合成BMP4的步骤如下：

1)提供编码BMP4的核酸序列；

2)将1)的核酸序列插入到合适的表达载体，获得重组表达载体；

3)将2)的重组表达载体导入合适的宿主细胞；

4)在适合表达的条件下培养转化宿主细胞；

5)收集上清液，并纯化BMP4。

根据BMP4的核苷酸序列，本技术领域人员可方便地用各种已知方法制得所述的编码核酸。这些方法例如但不限于：PCR，DNA人工合成等，具体的方法可参见J.萨姆布鲁克，《分子克隆实验指南》。作为本发明的一种实施方式，可通过分段合成核苷酸序列再进行重叠延伸PCR的方法来构建所述核酸序列。编码BMP4的核苷酸序列可以与表达调控序列操作性相连。所述的“操作性相连”或“可操作地连于”指这样一种状况，即线性DNA序列的某些部分能够调节或控制同一线性DNA序列其它部分的活性。例如，如果启动子控制序列的转录，那么它就是可操作地连于编码序列。

表达载体可采用市售的例如但不限于：pIRES、pDR，pUC18等可用于真核细胞系统表达的载体。本领域技术人员可以根据宿主细胞来选择合适的表达载体。根据已知空载表达载体的酶切图谱，本领域技术人员可按照常规方法通过限制性酶剪切与拼接，将BMP4的编码序列插入合适的限制性位点，制得重组表达载体。

宿主细胞优选的是真核细胞，例如但不限于CHO，COS细胞，293细胞，RSF细胞等。作为优选方式，所述的细胞是CHO细胞，其可良好地表达BMP4蛋白。将所述编码序列导入宿主细胞可采用本领域的多种已知技术，例如但不限于：磷酸钙沉淀，原生质体融合，脂质体转染，电穿孔，微注射，反转录法，噬菌体转导法，碱金属离子法。有关宿主细胞的培养和表达可参见OlanderRMDevBiolStand1996;86:338。可通过离心去除悬浮液中的细胞和残渣，收集清液。可通过琼脂糖凝胶电泳技术进行鉴定。

可将上述制备获得的BMP4纯化为基本均一的性质，例如在SDS-PAGE电泳上呈单一条带。例如，当所述蛋白为分泌表达时，可以采用商品化的超滤膜来分离所述蛋白，例如Millipore、Pellicon等公司产品，首先将表达上清浓缩。浓缩液可采用凝胶层析的方法进一步加以纯化，或采用离子交换层析的方法纯化。例如阴离子交换层析(DEAE等)或阳离子交换层析。凝胶基质可为琼脂糖、葡聚糖、聚酰胺等常用于蛋白纯化的基质。Q-或SP-基团是较为理想的离子交换基团。最后，还可用羟基磷灰石吸附层析，金属螯合层析，疏水相互作用层析和反相高效液相色谱(RP-HPLC)等方法对上述纯化产物进一步精制纯化。上述所有纯化步骤可利用不同的组合，最终使蛋白纯度达到基本均一。

可利用含有所述BMP4蛋白的特异性抗体、受体或配体的亲和层析柱进行蛋白纯化。根据所使用的亲和柱的特性，可利用常规的方法，如高盐缓冲液、改变pH等方法洗脱结合在亲和柱上的融合性多肽。可选择地，所述蛋白的氨基端或羧基端还可含有一个或多个多肽片段，作为蛋白标签。任何合适的标签都可以用于本发明。例如，所述的标签可以是FLAG，HA，HA1，c-Myc，6-His或8-His等。这些标签可用于对BMP4蛋白进行纯化。

此外，BMP4蛋白还可以从例如Sigma公司等公司购得。

BMP4的用途

本发明还提供了BMP4用途，它被用于制备治疗肝癌的药物；用于制备促进肝癌干细胞的分化的组合物；用于制备抑制肝癌体外增殖和/或自我更新的组合物；)用于制备抑制肝癌的成瘤能力的组合物；用于制备提高肝癌细胞对抗肿瘤剂敏感性的组合物；用于制备降低肝癌细胞耐药性的组合物。在另一优选例中，所述的BMP4蛋白包括人或非人哺乳动物的BMP4蛋白、或其具有相同诱导肝癌干细胞分化功能的同源蛋白、突变蛋白或衍生蛋白。

药物组合物和施用方法

本发明提供了能诱导肝癌干细胞分化的药物组合物，包括药学上可接受的载体和有效量的作为活性成分的BMP4蛋白，且组合物为缓释剂型。所述组合物包括缓释颗粒以及吸附于缓释颗粒的BMP4蛋白。所述的缓释颗粒由生物可降解材料（如聚乳酸，聚丙烯酸）制成。所述的缓释药物组合物为注射剂。给药方式为局部给药或瘤内给药。

所述的缓释药物组合物，还包括额外的抗肿瘤剂。所述的抗肿瘤剂包括化疗药、肿瘤抗体等。在另一优选例中，所述的抗肿瘤剂包括（但并不限于）：阿霉素、长春新碱、紫杉醇、顺铂、卡铂、5-FU或其组合。

如本文所用，术语“有效量”或“有效剂量”是指可对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的量。如本文所用，“药学上可接受的”的成分是适用于人和/或哺乳动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)的，即具有合理的效益/风险比的物质。

“药学上可以接受的载体”指的是：一种或多种相容性固体或液体填料或凝胶物质，它们适合于人或动物使用，而且必须有足够的纯度和足够低的毒性。“相容性”在此指的是组合物中各组份能和药物中的活性成分以及它们之间相互掺和，而不明显降低药效。

药学上可以接受的载体部分例子有纤维素及其衍生物(如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素钠、纤维素乙酸酯等)、明胶、滑石、固体润滑剂(如硬脂酸、硬脂酸镁)、硫酸钙、植物油(如豆油、芝麻油、花生油、橄榄油等)、多元醇(如丙二醇、甘油、甘露醇、山梨醇等)、乳化剂(如吐温)、润湿剂(如十二烷基硫酸钠)、着色剂、调味剂、稳定剂、抗氧化剂、防腐剂、无热原水等。

本发明化合物或药物组合物的施用方式没有特别限制，代表性的施用方式包括(但并不限于)：局部给药，瘤旁，瘤内，腹膜内、或静脉内等。

组合物中活性化合物或化合物的释放可以延迟的方式在消化道内的某一部分中释放。可采用的包埋组分的实例是聚合物质和蜡类物质。必要时，活性化合物也可与上述赋形剂中的一种或多种形成微胶囊形式。

除了活性化合物外，液体剂型可包含本领域中常规采用的惰性稀释剂，如水或其它溶剂，增溶剂和乳化剂，例知，乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、丙二醇、1,3-丁二醇、二甲基甲酰胺以及油，特别是棉籽油、花生油、玉米胚油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油或这些物质的混合物等。

除了这些惰性稀释剂外，组合物也可包含助剂，如润湿剂、乳化剂和悬浮剂、甜味剂和香料。

除了活性化合物外，悬浮液可包含悬浮剂，例如，乙氧基化异十八烷醇、聚氧乙烯山梨醇和脱水山梨醇酯、微晶纤维素、甲醇铝和琼脂或这些物质的混合物等。

一种优选的剂型是注射剂。用于肠胃外注射的组合物可包含生理上可接受的无菌含水或无水溶液、分散液、悬浮液或乳液，和用于重新溶解成无菌的可注射溶液或分散液的无菌粉末。适宜的含水和非水载体、稀释剂、溶剂或赋形剂包括水、乙醇、多元醇及其适宜的混合物。

一种优选的剂型是缓释剂型。用于本发明的缓释剂没有特别选择，可以是本领域采用的各类缓释剂或材料，尤其是生物可降解材料（如PLA等）。

药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物优选被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约1微克/千克体重-约5毫克/千克体重。此外，BMP4还可与其他治疗剂（如抗肿瘤剂）一起使用（包括之前、之中或之后使用）。

使用药物组合物时，是将安全有效量的药物施用于哺乳动物，其中该安全有效量通常至少约10微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约8毫克/千克体重，较佳地该剂量是约10微克/千克体重-约1毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。

药盒及其应用

本发明提供一种药盒，所述药盒包括：（a）第一治疗剂，所述第一治疗剂是含BMP4作为活性的药物制剂；（b）第二治疗剂，所述第二治疗剂是抗肿瘤剂，所述的抗肿瘤剂含有不同于BMP4的活性成分；和（c）使用说明书。

所述的含BMP4作为活性的药物制剂为将BMP4在溶剂中溶解获得，所述的溶剂包括水，醇类（甲醇和乙醇），乙酸乙酯，丙酮，氯仿，二氯甲烷，正己烷或石油醚等有机溶剂。

所述的抗肿瘤剂优选为含有阿霉素和/或长春新碱的制剂，将阿霉素和/或长春新碱在溶剂中溶解获得，所述的溶剂包括水，醇类（甲醇和乙醇），乙酸乙酯，丙酮，氯仿，二氯甲烷，正己烷或石油醚等有机溶剂，优选乙酸乙酯和丙酮等中等极性溶剂。

所述的含有BMP4的制剂选自针剂、片剂、胶囊、或栓剂等，优选针剂。

所述的含有阿霉素和/或长春新碱的制剂选自针剂、片剂、胶囊、或栓剂等，优选针剂。

所述含有BMP4的制剂可以是含有BMP4的单元剂型，所述含有阿霉素和/或长春新碱的制剂可以是含有阿霉素和/或长春新碱的单元剂型。

如本文所用，术语“单元剂型”是指为了服用方便，将组合物制备成单次使用所需的剂型，包括但不限于各种液体剂、固体剂(如片剂)、胶囊剂、缓释剂、靶向剂。

本发明提供的药盒通过下述步骤制备得到：将含有BMP4的制剂和含有阿霉素和/或长春新碱的制剂，以及说明书一起放置，形成药盒。

本发明提供的药盒用于治疗肿瘤，所述的肿瘤包括肝癌，肺癌，胃癌等；优选肝癌。

本发明的主要优点包括：

(1)外源BMP4可使肝癌细胞系中CD133蛋白表达下调，这种下调作用具有时间依赖性和浓度依赖性；

(2)BMP4促进肝癌干细胞分化，抑制PLC/PRF/5细胞体外增殖，抑制肝癌干细胞的自我更新;

(3)BMP4抑制免疫缺陷小鼠体的成瘤能力；

(4)BMP4通过下调ABCG2蛋白表达等途径增强PLC/PRF/5和MHCC-97LCD133+肿瘤干细胞对化疗药物的敏感性；

(5)BMP4激活CD133+肿瘤干细胞中的BMP经典信号通路，干扰经典通路关键分子SMAD4，使BMP4失去促CD133蛋白表达下降作用。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实验材料

1.蛋白电泳及免疫印迹实验材料

分子生物学级Trisbase，丙烯酰胺及N,N-亚甲双丙烯酰胺均购Sigma-Aldrich公司；细胞裂解用T-PER组织蛋白抽提试剂购自Pierce公司；蛋白酶抑制剂Cocktail购自Roche公司；BCA蛋白定量试剂盒购自Sigma-Aldrich公司。

5×蛋白上样缓冲液、20×DTT还原剂和PageRuler^TM预染蛋白质分子量Marker购自Fermentas公司。脱脂奶粉购自SantaCruz公司。

本研究所用抗体信息详见表1；

化学发光显色剂SuperSignalWestFemtoChemiluminescentSubstrate购自Pierce公司；X-光医用胶片购自Kodak公司。

表1

2.定量PCR实验材料

使用常规方法设计并合成定量PCR的引物。总RNA抽提试剂TRIzolReagent购自Invitrogen公司；逆转录用PrimeScript^TMRTreagentKit(PerfectRealTime)和定量PCR扩增用SYBRPremixExTaq^TMSolutions均购自日本TaKaRa公司。

3.免疫组化（IHC）分析材料

TritonX-100和Tween20试剂购自Sigma-Aldrich公司。所用抗体信息见表2。

表2

SuperBlocking封闭液购自Pierce公司；即用型二抗EnViSionHRPkit和DAB+显色剂购自DAKO公司。

4.细胞免疫荧光染色

所用抗体信息见表3。

表3

4.siRNA片段细胞转染材料

使用常规方法设计RNA干扰片段，RNA干扰片段合成自上海GenePharma公司，或购自Invitrogen公司；无特别说明的其余常规分析纯化学试剂均购自国药集团化学试剂有限公司或Sigma-Aldrich公司分析纯以上级产品。

5.肝癌组织微阵列材料

236对肝癌组织及癌旁组织标本和采自浙江大学医学院附属第一医院、启东肝癌防治研究所和广西肿瘤防治医院；12例肝硬化组织由浙江大学医学院附属第一医院提供；10例正常肝组织来自意外交通事故死亡者(无肝炎、肝癌病史)。

样本经4％中性缓冲福尔马林固定和石蜡包埋制成供体蜡块，之后在供体蜡块中选择位点取样，嵌入已完成打孔的微阵列蜡块。微阵列蜡块上每个组织芯直径约为1.5mm，排列齐整，基本无移位脱点。236例肝癌患者在2002年4月至2010年2月间接受肝癌切除手术，经病理检查证实为肝细胞肝癌。此236例肝癌患者中男性47例，女性8例，平均年龄52岁（31-74岁），术前均未行化疗、栓塞及放射治疗。所有样本和患者数据收集的过程均签署了患者知情同意书。

6.实验动物材料

所用常规市售的Balb/c裸小鼠，所有动物实验均在SPF级实验动物室进行。

7.细胞系

人肝癌细胞系PLC/PRF/5细胞购自美国种质保藏中心（ATCC）；Huh7细胞购自日本生物资源中心细胞库（RikenBRCCellBank）；SMMC-7721购自中科院上海细胞生化研究所细胞库；人转移潜能肝细胞系MHCC-97购自复旦大学附属中山医院肝癌研究所。

实验方法

1.细胞培养

所有细胞系均在37℃，5％CO₂和饱和湿度条件下培养，培养基为含有10％胎牛血清（Hyclone）、100IU/ml青霉素和100μg/ml链霉素的高糖DMEM（Sigma-Aldrich）。细胞培养器皿为BD公司的FalconTM聚苯乙烯材质平皿和多孔培养板。

为了进行肿瘤干细胞体外分化研究，将消化得到的肿瘤细胞单细胞悬液接种在6孔细胞培养板上单层培养，培养液是添加了生长因子的特定无血清培养基（serum-freechemicallydefinedmedium,CDM）。CDM由Neurobasal培养基和DMEM/F12培养基1：1混合而成，并添加了0.5×N2添加剂,0.5×B27添加剂，0.1％牛血清白蛋白，2mM谷氨酰胺和0.1mM2-巯基乙醇，添加的生长因子包括10ng/mlBMP4（Sigma-Aldrich），10ng/ml碱性生长因子（basicfibroblastgrowthfactor,bFGF）（Millipore），10ng/ml上皮生长因子（Epithelialgrowthfactor,EGF）（Millipore），20ng/ml肝细胞生长因子（hepatocytegrowthfactor，HGF）（Millipore）,20ng/ml转化生长因子α（TGFα）和10-7mol/L地塞米松（Sigma-Aldrich）。所有未提及的添加剂均购自invitrogen公司。进行BMP4处理时，将不同量的BMP4加入CDM中配制成文中提示终浓度的工作液。

2.流式细胞仪分析

培养的细胞胰蛋白酶消化后，制备成单细胞悬液；按每10⁷个细胞加入10μlCD133-PE抗体，同时加入适量的FcRblockingreagent和7-AAD，混匀后，4℃孵育10min。加入1-2ml细胞分析缓冲液洗涤，于800rpm离心5min，洗掉上清，加入适量的细胞分析缓冲液重悬细胞，然后于流式细胞仪上分析相关抗原的表达，同型配对的抗体作为阴性对照。

3.磁式分选细胞

采用EasySepPESelectionKit法：用胰蛋白酶消化细胞，转移至离心管中，800rpm离心5min，收集细胞沉淀；用细胞分选缓冲液洗涤一次，800rpm离心5min，倒掉上清。用细胞分选缓冲液重悬细胞至浓度2×10⁸cells/ml左右，加入人特异性FcRblockingantibody至终浓度100μl/ml，混匀，加入PE偶联的抗体至终浓度0.3-3.0μg/ml，混匀，室温孵育15min。充分混匀EasySepMagneticNanoparticles，加入细胞中至终浓度50μl/ml，混匀，室温孵育10min，将离心管插入EasySepMagnet磁铁块中，静置5min，倒转插有离心管EasySepMagnet磁铁块，将未吸附细胞导入另一收集管中，2-3秒后正置磁铁块，取出离心管，加入2.5ml细胞分选缓冲液，轻轻吹打2-3次，再把离心管放回磁铁块中，静置5min；重复上两步步骤，取出离心管，用细胞分选缓冲液重悬吸附的细胞，分别获得CD133-PE标记的阳性细胞和未标记的CD133阴性细胞。

4.流式细胞仪分选细胞

用胰蛋白酶离散细胞，轻轻吹打为单细胞悬液并行细胞计数，800rpm离心5min后弃掉上清；1mlMACSbuffer重悬细胞，取1ml细胞悬液加入5mlFalcon分选管中，残余细胞吸入另外一只5mlFalcon管中用作对照，离心弃上清，分选管MACSbuffer重悬细胞107/μl，不足107仍加MACSbuffer100μl，对照管加入MACSbuffer100μl；按照107细胞/100μl的比例加入10μlFcRBlocking（BD）抗体10μl以及10μlCD133-PE抗体，轻柔混匀，4℃避光孵育15min；同时设立PE-mouseIgG1同型对照管，100μl细胞加入20μl同型对照抗体。孵育完毕后，添加1-2ml细胞分选缓冲液轻柔吹匀，800rpm离心5min，吸弃上清；分选管2ml细胞分选缓冲液重悬，对照管400μl重悬，流式细胞仪上机检测。

5.SP细胞检测

用胰蛋白酶把细胞从培养皿上消化下来，用PBS清洗一次，用含10mMHEPES和2％FBS的DMEM培液重悬细胞，并调整细胞悬液浓度至1×10⁶cells/ml，置于离心管中。用5μg/mlHoechst33342标记细胞，取1ml含荧光染料的细胞悬液置于另一离心管并加入10μMFTC作为阴性对照。将离心管置于37℃水浴中孵育90min，每隔10min摇晃离心管一次，保证细胞始终处于悬浮状态。孵育结束后，用低温离心机在4℃，1500rpm的条件下离心15min收集细胞，用预冷的含2μg/mlPI的HBSS重悬细胞。然后在流式细胞仪上分析或分选侧群细胞，用351nm的紫外激光激发Hoechst的荧光，用450DF20（Hoechstblue）和675ALP（Hoechstred）滤片收集荧光信号。

6.增殖实验

细胞增殖实验采用BrdU–ELISA试剂盒进行检测，实验所用试剂购自Roche公司。将细胞经胰蛋白酶消化后吹打为均匀的单细胞悬液，调整细胞密度为3000细胞/100μl,将细胞种入96孔板中，每孔100μl细胞悬液。待细胞贴壁完全后，加入含不同终浓度BMP4的CDM培养液，37℃孵箱中继续培养，在0、1、2、3天分别收集检测结果。用BrdU掺入试验检测时，首先每孔中将10μlBrdU工作液标记，再加入100μl培养液，继续培养2h；吸去培养上清，并在每孔中加入200μl固定液（FixDenat），室温中孵育30min；弃去固定液后，每孔中加入100μlPOD标记的BrdU抗体，然后室温继续孵育90min；去除标记液，每孔加入200μlPBS漂洗液，漂洗3次；去除漂洗液后，每孔加入100μl反应底物，室温反应10min，然后每孔加入25μl1MH2SO4中止反应，振荡1min后，必须在5min内酶标仪检测结果（检测波长450nm，参考波长690nm）。

7.AnnexinV/7-AAD检测凋亡

取50ng/mlBMP4处理3天后的细胞，胰蛋白酶消化成单细胞悬液，CDM处理组为对照。细胞经过PBS清洗两遍，以1×106cell/ml的细胞密度重悬于1×bindingbuffer（由蒸馏水稀释10×bindingbuffer储存液得到），取100μl细胞悬液用于标记，加入5μl7-AAD和5μlAnnexinV室温孵育15min，7-AAD和AnnexinV均购自BDBiosciences公司。同时设空白组、单加7-AAD组和单加AnnexinV组作为对照。孵育时间到后，加入400μl的1×bindingbuffer，上机检测。

8.软琼脂克隆形成实验

将2×DMEM培养基与1.2％琼脂等比例混合合成含有0.6％琼脂的DMEM培养基，吸取适量加入到24孔细胞培养板以确保覆盖整个底部，待凝固后成为琼脂固相底层。将2×DMEM培养基，1.2％琼脂和超纯水以2：1：1的比例混合制备0.3％琼脂培养基。将分选的细胞计数后，与0.3％琼脂培养基混合，按1000cells/well的密度接种于制备后的细胞板中培养，隔天换液。2到3周后，在显微镜下对形成的克隆进行计数，并对典型视野拍照。

9.肿瘤细胞球形成（Sphereformation）实验

首先通过胰蛋白酶消化制备单细胞悬液，然后这些单个的肿瘤细胞被种入多孔超低黏附板（Costar）中，培养液为CDM无血清培养液。细胞隔天半量换液，约1w后可以观察到有肿瘤球形成。当肿瘤球需要传代时，首先通过温和离心收集肿瘤球，然后通过0.05％胰蛋白酶（Invitrogen）消化为单细胞，再进行下一代的肿瘤细胞球形成。

10.SDS-PAGE电泳和蛋白印迹（Westernblot）分析

细胞裂解和蛋白电泳：用冰预冷的PBS洗涤培养细胞，收集后将其悬在含有蛋白酶抑制剂cocktail的RIPAbuffer中裂解，裂解过程在冰浴上进行30min。4℃条件下12,000rpm离心10min后收集上清，然后采用BCA法蛋白定量。定量后的样品与5×蛋白上样缓冲液混合并在95-100℃水浴中变性5min。蛋白电泳在SDS-PAGE及甲醇缓冲体系中进行，样品按30-60μg/lane上样，80-120V恒压电泳。

Westernblot：蛋白电泳结束后，采用湿转法将蛋白转移到硝酸纤维素膜（NC）上。转膜条件：220mA恒流湿转法30min。结束后将膜在PBST(0.1％Tween20)中漂洗一次，浸入5％脱脂奶粉封闭液中，室温封闭1h。然后将膜浸入用封闭液稀释的适当浓度的一抗，4℃孵育过夜。次日以PBST洗膜三次，每次10min。之后与封闭液稀释的过氧化物酶偶联二抗进行反应，室温孵育1h后，再以PBST洗膜三次。目标蛋白条带的发光显影利用SuperSignalWestFemto化学发光底物完成。所有Westernblot均以β-actin作为内参。

11.实时定量PCR检测

细胞总RNA提取：按照厂家说明书程序，取1mlTrizol加入细胞培养皿（含5-10×106cells）中，用移液器反复吹打充分裂解细胞。将均质化的细胞裂解液全部移至1.5ml离心管，室温静置5min。加0.2ml氯仿/1mlTrizol，盖好离心管盖剧烈震荡15s，室温静置2-3min。4℃条件下以12,000rpm转速离心15min。小心吸取上清至另一干净的离心管，加入0.5ml异丙醇，室温静置10min后，12,000rpm的转速4℃离心10min，弃上清。用1ml75％的乙醇洗涤RNA沉淀后，7,500rpm离心5min，弃上清。空气干燥沉淀后，DEPC水溶解。RNA定量并1％琼脂糖凝胶电泳鉴定。

逆转录：用PrimeScript^TMRTreagentKit(PerfectRealTime)，在200μl微量离心管中配置混合液：5×PrimeScriptBuffer(forRealTime)2μl；PrimeScriptRTEnzymeMixI0.5μl；OligodTPrimer(50μM)0.5μl；Random6mers(100μM)0.5μl；totalRNA500ng；DEPC水补足10μl。37℃反应15min，85℃处理5s，然后冰浴冷却。

定量PCR：将逆转录得到的cDNA反应液1：50稀释备用。PCR反应在20μl体系中进行：2μlcDNA稀释液（相当于50ng起始RNA量）；上下游引物各0.4μl；2×SYBRPremixExTaq^TMSolutions10μl；灭菌蒸馏水7.2μl。PCR反应在ABI7300定量PCR仪上进行，反应条件为两步法PCR扩增标准程序：第一步95℃，30s，1个循环；第二步95℃，5s，60℃，31s，40个循环。反应测得的基因表达水平使用内源性甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）基因作为参照标化。

12.siRNA干扰实验

siRNA干扰片段采用逆向转染的方法导入目标细胞中。转染前将40pmolRNAi片段和2μlLipofectamine2000分别溶于100μlOpti-MEM，轻轻摇匀，静置5min；然后将Lipofectamine2000稀释液加入到RNAi片段稀释液中，再静置20min；在静置期间将贴壁细胞消化悬于无抗生素的DMEM培养基中，使细胞浓度约为1×105cells/ml；待RNAi-Lipofectamine2000复合物形成后，将混合液吸至12孔板中；然后将1ml细胞悬液加入已含有RNAi-Lipofectamine2000溶液的孔中混匀；转染后细胞置于37℃，5％CO₂和饱和湿度条件下培养24-48h再进行基因敲减的验证和功能实验。

13.免疫细胞化学分析

细胞接种在包被有多聚赖氨酸的灭菌载玻片上培养24h；培养结束后去除培养基，在PBS中轻柔浸洗载玻片；用4％中性多聚甲醛在室温下固定20min，然后用SuperBlocking封闭液封闭细胞30min。切片在4℃条件下与一抗反应过夜；次日在PBS中洗涤三次共15min；加二抗（即用型EnViSionSystemkit,mouse/rabbit），室温孵育1h，然后DABkit显色；然后采用苏木素复染，漂洗风干后中性树胶封片，染色结果在正置光学显微镜下观察。

14.小鼠肝原位接种试验

取生长状态良好的细胞，胰酶消化成为单细胞悬液并调整细胞浓度，用无血清DMEM和Matrigel按1：1（v/v）比例配成混合液40μl悬浮细胞，置于冰上；28只裸鼠分为实验组和对照组，每组14只，戊巴比妥钠腹腔麻醉，剑状突下横行切开小鼠腹腔，用两支医用棉签轻轻拖出，显露肝脏；在左肝叶实质内注入细胞，拔针后用干棉签压迫止血；缝合腹腔，3天观察一次，接种细胞后6w无痛苦牺牲裸鼠，采集肝和肺，并对荷瘤肝脏称重，肝肺做常规病理学检查，常规石蜡切片、苏木素/伊红(HE)染色。

15.免疫荧光染色

细胞接种在包被有多聚赖氨酸的灭菌载玻片上培养24h；培养结束后去除培养基，在PBS中轻柔浸洗载玻片；用4％中性多聚甲醛在室温下固定20min。以1:5的比例稀释FcRblockingreagent，将其滴加到制备好的诅咒切片上，室温封闭30min；将一抗与切片在4℃条件下孵育过夜；次日在PBS中洗涤三次共15min；加二抗（荧光素标记），室温孵育1h，置于荧光显微镜下观察。

16.药物敏感性实验

将BMP4处理后的CD133+和CD133-肝癌细胞亚群接种于96孔细胞培养板中，接种细胞密度为3000cells/100μl，培养过夜贴壁后，加入含有各种不同浓度阿霉素（Doxorubicin）和长春新碱（Vincristine）的新培养液，继续培养48h。每孔加入浓度为0.5mg/ml的MTT溶液，37℃孵箱中继续反应4h后，加入100μlDMSO振荡溶解结晶沉淀，于570nm处测定吸光值（参考波长为630nm），并计算不同浓度药物时细胞的生长抑制率，从而得到每个细胞亚群对每种药物的IC50值。

17.统计学分析

实验获得数据采用SPSS13.0软件进行整理和统计分析。计量数据以平均值±标准差的形式表示，采用Student’st-test分析其统计学意义；分类数据采用Chi-square检验。统计检验得到的概率p<0.05认为具有统计学意义。

实施例1

外源性高浓度BMP4可诱导肝癌细胞CD133蛋白表达下调

哺乳动物肝脏发育过程中受到多种生长因子调控，为了从大量的生长因子中筛选到能够诱导肝CSCs分化的生长因子，发明人在本实施例中首先通过流式细胞法，分析检测不同肝癌细胞系中CD133蛋白表达阳性率（图1A），从中选取具有较高阳性率的PLC/PRF/5细胞系作为筛选细胞，并通过流式分选得到了分选纯度大于95％的CD133+/-肝癌细胞群（图1B）。

发明人对分选得到的CD133+肝癌细胞进行检测，结果发现：PLC/PRF/5细胞系中的CD133+细胞群较CD133-细胞群具有更高的非贴壁生长能力和自我更新能力，并且其干性相关基因的表达水平也高于CD133-细胞群，因此CD133+细胞能够代表PLC/PRF/5细胞中的CSC群（图1C，图1D）。

在分选得到的PLC/PRF/5CD133+肝癌细胞培养液中分别添加能够影响肝脏发育的多种生长因子（包括EGF、bFGF、HGF和BMP4）共同培养，3天后观察其CD133蛋白表达阳性率的变化。

结果表明，BMP4处理组的CD133+细胞群细胞阳性率下降，BMP4处理6天后，Huh7和PLC/PRF/5细胞系中的CD133+细胞率均下降了约40％，表现为前者有正常情况下的73.0％下降为47.5％，后者由52.1％下降到了32.9％（图2）。

实施例2

BMP4诱导肝癌细胞CD133蛋白表达下降具有浓度依赖和时间依赖性

为了进一步观察BMP4对肝癌细胞特别是肝癌CD133+CSCs的作用，在本实施例中，发明人使用0-100ng/ml范围内不同浓度的BMP4，对PLC/PRF/5细胞进行处理。

WesternBlot结果表明，30ng/ml以上浓度的BMP4处理6天，可以有效的诱导CD133+肝癌细胞群的CD133蛋白表达下降，并且这种表达下调在100ng/mlBMP4处理组表现最强，但在BMP4浓度达到50ng/ml时已经可以引起足够明显的作用（图3A）。发明人选择50ng/ml的BMP4浓度开展后续实验。与此同时，不同浓度的外源性BMP4均未在PLC/PRF/5细胞CD133-细胞群中引起CD133蛋白表达发生变化。

为了阐述BMP4处理时间对肝癌细胞CD133表达的影响，使用相同浓度的BMP4处理PLC/PRF/5细胞不同的时间。

WesternBlot结果显示，BMP4处理3天时，PLC/PRF/5细胞的CD133蛋白表达开始出现下降，并且这种下降作用在处理6天时表现更强。Huh7细胞中也观察到相似结果（图3B，图3C）。

以上结果表明，BMP4诱导的肝癌细胞CD133蛋白表达下降作用具有浓度依赖性和时间依赖性，并且这种作用主要针对其CD133+肝癌细胞群，经过BMP4处理后，两种肝癌细胞中的CD133+细胞分化为了CD133-细胞。

实施例3

外源性BMP4对肝癌细胞增殖和死亡的影响

本实施例通过BrdU掺入实验，分别检测加入0-100ng/ml的外源BMP4对PLC/PRF/5CD133+/CD133-细胞增殖的影响。

结果显示，10ng/ml和20ng/mlBMP4能够促进PLC/PRF/5细胞的增殖，但50ng/ml和100ng/mlBMP4能够对CD133+肝癌细胞增殖产生一定的抑制作用，BMP4在CD133-肝癌细胞中的作用与在CD133+细胞组类似（图4A）。

为了观察BMP4对肝癌细胞凋亡的影响，通过AnnexinV/7-AAD双标记法，检测BMP4处理3天后PLC/PRF/5细胞的凋亡率。

结果显示：BMP4处理未能对肝癌细胞的凋亡产生显著影响（图4B）。

实施例4

BMP4诱导CD133+肝癌CSCs向肝系细胞分化

将肿瘤细胞悬浮培养所形成的肿瘤细胞球（cellsphere）中富集了CSCs，而这些肿瘤细胞球的大小和数量则反映了其来源细胞群的自我更新能力。在本实施例中，将分选得到的CD133+/CD133-PLC/PRF/5细胞在无血清培养液（CDM）中悬浮培养帮助分选细胞维持干性，或将分选细胞贴壁培养并添加外源性BMP4以促使干细胞分化。在CDM中培养一段时间后，CD133+肝癌细胞可以形成肿瘤细胞球，表明它们在体外培养中维持了其自我更新的能力。

发明人通过Real-timePCR检测法分析了多种干性相关基因的表达，结果表明：BMP4处理后，PLC/PRF/5CD133+细胞的Oct4、Tert、Notch1、beta-catenin和Ep300的表达水平均发生了下降，然而这些基因的表达在CD133-细胞组并未受到影响或仅仅轻微下降，表明BMP4处理使了CD133+细胞干性减弱（图5A）。

进一步分析肝脏细胞标志物在BMP4处理前后的表达，细胞角蛋白19（Cytokeratin19，CK19）蛋白是一种肝脏胆管上皮细胞特异性标志物，且CK19的表达与肝癌恶性程度紧密相关。细胞角蛋白8/18（Cytokeratin8/18,CK8/18）是肝上皮细胞特异性标志物。

WesternBlot结果显示，CD133+肝癌细胞中CK19蛋白的表达随着BMP4处理时间的延长逐渐降低；BMP4处理能够诱导CD133+肝癌CSCs中CK8/18蛋白的表达呈时间依赖性增强（图5B，图5C）；与此同时，CD133-细胞组的CK19蛋白表达在BMP4处理前后未受显著影响，但是CK8/18蛋白的表达在BMP4处理6天后显著增强。免疫荧光染色结果显示，BMP4处理后，PLC/PRF/5CD133+肝癌细胞中的CK19蛋白阳性细胞减少而CK8/18蛋白阳性细胞增多；类似的结果在另外两种肝癌细胞系Huh7和MHCC-97L细胞中同样可以被检测到（图6）。

以上结果表明，BMP4能够诱导CD133+PLC/PRF/5细胞发生分化，并表达更多的肝系细胞标志物。

实施例5

BMP4处理抑制肝CSCs自我更新

自我更新是肿瘤干细胞的一个基本特征，为了评估BMP4处理前后细胞自我更新能力的改变，发明人比较了这些细胞在非贴壁生长时的克隆形成能力。

软琼脂克隆形成实验结果（图7）显示，经过BMP4处理后的PLC/PRF/5CD133+细胞的克隆形成效率（colonyformationefficiency，CFE）低于持续培养在CDM中的CD133+细胞，但是经过BMP4处理的CD133-肝癌细胞的CFE并未发生显著变化。

进一步检测CD133+细胞经过BMP4处理前后的肿瘤球形成能力的改变。结果表明，持续培养在CDM中的CD133+细胞所形成的肿瘤球多于经过BMP4处理的CD133+细胞，同时所形成的肿瘤球也更大。

上述结果表明，BMP4处理可以抑制肝CSCs自我更新；CD133+肝癌CSCs经BMP4诱导分化后自我更新能力受损。

实施例6

肝癌CSCs分化后体内成瘤能力下降

本实施例利用免疫缺陷小鼠移植瘤动物模型，对经过或未经过BMP4处理的CD133+/CD133-肝癌细胞的体内成瘤能力进行分析。使用新分选的PLC/PRF/5CD133+细胞和CD133-细胞进行裸鼠肝原位注射，并在注射细胞的同时注入BMP4浸润的聚丙烯酸颗粒（polyacrylicbeads），该聚丙烯酸颗粒能够持续释放BMP4约一周时间，以PBS浸润的聚丙烯酸颗粒作为溶剂对照。

结果显示（图8，图9），6只接种了CD133+PLC/PRF/5细胞与对照beads的裸鼠中有5只小鼠肝脏内形成了肿瘤，然而共同接种了可以缓释BMP4蛋白的聚丙烯酰胺颗粒（BMP4包被beads）的CD133+肝癌细胞组，未形成肉眼可见的肿瘤结节；接种了对照组beads的CD133-PLC/PRF/5细胞形成的肝脏肿瘤结节数少于CD133+细胞组（3/6只），并且形成的肿瘤体积也小于CD133+细胞组，但是接受了BMP4包被beads共注射组的CD133-细胞成瘤性未受到明显影响（2/6只）；在含有低比例CD133+细胞的MHCC-97L细胞系中，也获得了相似的结果。

以上结果表明，BMP4在体内具有抗肿瘤的作用。

实施例7

肝癌CSCs经BMP4诱导分化后的耐药性下降

CSC对多种化学治疗药物都具有耐受性。在本实施例中，使用阿霉素和长春新碱这两种不同的药物来评估BMP4处理和未处理肝癌细胞的耐药性。

结果如图10A，图10B所示，CD133+PLC/PRF/5细胞对阿霉素和长春新碱两种药物的耐受性显著高于CD133-细胞，而BMP4处理能够稳定地增强CD133+细胞对两种化疗药物的敏感性。

肝癌CSCs对化疗药物的耐受性主要由于ABC转运超家族蛋白表达上调，因此发明人进一步分析PLC/PRF/5细胞中ABCG2蛋白的表达。WesternBlot结果表明，BMP4诱导细胞分化后，PLC/PRF/5细胞中的ABCG2蛋白表达下降（图10C）。

肝癌中，ABCG2蛋白的表达和功能状态与细胞系中侧群细胞（sidepopulation,SP）比例密切相关，这一小群SP细胞具有外排Hoechst33342的能力。然而，发明人在PLC/PRF/5细胞中未能检测到SP细胞群，于是又检测含有一定SP细胞比例的MHCC-97L细胞。

结果显示，BMP4处理能够下调分选或者未分选的MHCC-97L细胞中ABCG2蛋白的表达（图10D）。与PLC/PRF/5细胞中的结果一致，BMP4处理增强了分选MHCC-97L总细胞对阿霉素和长春新碱的敏感性。如图10E所示，BMP4诱导后，MHCC-97L细胞中的SP细胞比例由原来的5.1％下降到2.3％，表明BMP4的促分化作用并不局限于肝癌中的CD133+细胞群。

实施例8

BMP经典信号通路在肝CSCs分化过程中被激活

为了研究经典BMP信号通路在BMP4诱导的细胞分化过程中的作用，发明人在本实施例中检测了BMP信号通路在肝癌细胞中的活化情况。

WesternBlot结果（图11，图12）显示，几乎在所有检测的肝癌细胞系中均发现了BMP4受体BMPRIa和BMPRIb蛋白的表达。免疫组化检测结果显示，在人原发性肝癌组织中，BMPRIa蛋白阳性表达比例约为70％（165/236），BMPRIb蛋白阳性表达比例约为57％（134/236）。但是，BMPRIa蛋白在PLC/PRF/5、MHCC-97L和SMMC-7721CD133+/-细胞中表达没有明显差异。因此，肝癌细胞经过BMP4处理之后，细胞中BMP/SMAD经典信号通路持续激活，信号通路中的中间分子pSMAD1/5/8和SMAD4蛋白都高水平表达；并且，BMP4能够时间依赖性激活肝癌细胞中的SMAD1/5/8磷酸化，BMP4处理后的SMMC-7721细胞中SMAD6蛋白高表达。

在多数情况下，BMP信号转导必须依赖于磷酸化SMAD1/5/8-SMAD4异源多聚体的形成。发明人合成了特异性敲低SMAD4蛋白的siRNA寡核苷酸片段，并且通过WesternBlot法验证了这些片段的干扰效率。结果如图11所示，BMP4的下调CD133蛋白表达作用可以被SMAD4蛋白干扰所阻断，表明BMP4的促分化作用是该信号转导通路激活的结果。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (8)

1.一种骨形成蛋白4即BMP4蛋白的用途，其特征在于，所述用途为选自下组的一种或多种的用途：

(a)用于制备治疗肝癌的药物；

(b)用于制备促进肝癌干细胞的分化的组合物；

(c)用于制备抑制肝癌体外增殖和/或自我更新的组合物；

(d)用于制备抑制肝癌的成瘤能力的组合物；

(e)用于制备提高肝癌细胞对抗肿瘤剂敏感性的组合物；

(f)用于制备降低肝癌细胞耐药性的组合物，

其中，所述的肝癌为CD133+肝癌；且所述BMP4蛋白的浓度≥50ng/ml。

2.一种体外非治疗性的诱导肝癌干细胞分化的方法，其特征在于，所述方法包括步骤(I)：在添加BMP4蛋白的条件下，培养肝癌干细胞，从而诱导肝癌干细胞的分化，其中所述BMP4蛋白的浓度≥50ng/ml。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，还包括步骤：在步骤(I)之前、之中、或之后，在培养体系中添加额外的抗肿瘤剂。

4.一种提高肿瘤细胞对抗肿瘤剂的敏感性或降低肿瘤细胞的耐药性的方法，其特征在于，所述方法包括步骤(I)：在添加BMP4蛋白的条件下，培养肿瘤细胞，从而提高肿瘤细胞对抗肿瘤剂的敏感性或降低肿瘤细胞的耐药性，其中所述BMP4蛋白的浓度≥50ng/ml，其中所述的肿瘤细胞为CD133+的肝癌细胞或肝癌干细胞。

5.一种缓释药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物包括药学上可接受的载体和作为活性成分的BMP4蛋白，且组合物为缓释剂型，其中所述BMP4蛋白的浓度≥50ng/ml。

6.如权利要求5所述的缓释药物组合物，其特征在于，所述的BMP4蛋白包括BMP4单体、或BMP4同二聚体，或BMP4异二聚体、或保留BMP4活性的BMP4融合蛋白。

7.如权利要求5所述的缓释药物组合物，其特征在于，还包括额外的抗肿瘤剂。

8.一种用于治疗肿瘤的药盒，其特征在于，所述药盒包括：

(a)第一治疗剂，所述第一治疗剂是含BMP4作为活性的药物制剂；

(b)第二治疗剂，所述第二治疗剂是抗肿瘤剂，所述的抗肿瘤剂含有不同于BMP4的活性成分；和

(c)使用说明书；

其中所述BMP4蛋白的浓度≥50ng/ml。