CN102596188A

CN102596188A - 增加肝脏增殖的方法

Info

Publication number: CN102596188A
Application number: CN2010800371232A
Authority: CN
Inventors: 西斯·J·卡尔普; 马丁·狄伯; 杜芮
Original assignee: Beth Israel Hospital Association
Current assignee: Beth Israel Deaconess Medical Center Inc
Priority date: 2009-07-14
Filing date: 2010-07-09
Publication date: 2012-07-18
Also published as: CA2805033A1; EP2453882A1; JP2012533545A; WO2011008640A1; US20150335647A1; US20120208172A1; US20140171440A1

Abstract

本发明是针对肝脏在损伤、切除或移植后使用肝脏中的骨形态发生蛋白(BMP)信号传导途径的拮抗剂增强肝脏修复的方法。

Description

增加肝脏增殖的方法

相关申请

本申请要求于2009年7月14日提交的美国临时申请号61/225,388的权益。将上述申请的全部传授内容通过引用结合在此。

政府支持

本发明全部地或部分地由来自国家糖尿病和消化及肾脏疾病研究所(National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases)的资助金K08支持。政府对本发明具有一定的权利。

背景技术

再生医学领域已经在努力改善在肝脏损伤或切除手术之后患有肝衰竭或不充足的肝脏质量的病人的存活率。在很少临床案例中当对具有这些情形的病人进行治疗时成功与失败之间的分隔线是明显的：损伤后的成功的肝脏恢复通常随之带来完全的健康恢复，然而失败的恢复导致需要肝脏移植或死亡。在肝脏再生或修复方面甚至微小增加的改进对改变从死亡到健康的完全恢复的结果都可能是充足的。

在患有急性肝衰竭的病人中，增强修复的能力可以将不可恢复的肝脏的情况转换成受影响的肝脏可以完全恢复健康的情况。在美国每年患有泰

(扑热息痛)过量、急性病毒性肝炎或其他的有传染性的起因、代谢紊乱或毒性刺激的群体包括两万(20000)病人(Hoofnagle等人，1995)。遭受这些疾病痛苦的病人通常是年轻的并且具有很少其他的医学症状，从而如果受影响的肝脏可以被诱导恢复或再生，很可能产生完全恢复。

经受肝脏手术的病人群体可能经历小肝综合征。当使用完整的器官、分割的器官或肝脏供体时这发生在癌症切除术或移植之后。在许多这种情形中，该剩余的肝脏质量不足以支撑生命。此小肝综合征显示为移植体功能异常并且可能导致死亡(Tucker和Heaton，2005)。

由于难以预测切除术后的肝脏质量，患有肝癌的病人通常不是对于肝脏切除术的候选人。每年全球诊断出患有肝癌的病人多于五十万(500000)(Parkin等人，2002)，几乎他们的80％在诊断的时候被确定为不可切除的(Zhu等人，2006)。然而如果进行了切除术，这些病人很可能将发展成高胆红素血症(即，黄疸病)并且最终发展成肝衰竭。由于对于癌症病人其他的选择是非常有限的，对于更多的患有否则不可切除的肝癌的病人，用于增强或增加肝脏再生或修复的潜在治疗将会大大地增加肝脏切除术的可能性。开发将使更多的这些病人是可切除的药物疗法在肝癌的治疗中具有深远的影响。

在活供体肝脏移植过程中一个关键性的考虑因素是剩余的供体肝脏的大小连同被移植到接受者的移植体的大小。在成人向儿童的肝脏捐赠中，供体手术是一种左侧段切除术，已知该手术是一种安全的手术。相比之下，在成人向成人的活供体肝脏移植过程中，由于该剩余肝脏可能不足以支撑生命，一种完全右或左叶切除术的必要的使用对该供体造成了极大的风险(Pomposelli等人，2006)。因此通过允许使用更小尺寸的移植体来增强肝脏再生将会引起成人向成人的活供体肝脏移植的革命。

尽管肝脏移植作为一种用于肝衰竭的疗法的巨大成就以及在肝脏内环境稳定中涉及的分子途径的科学知识，一种用于增强肝脏修复和再生的药物治疗和方法仍然非常需要开发。

发明内容

本发明阐明了支持肝脏修复和再生的过程的生化反应并且在各种临床背景下对于各种各样病人群体提供了用于增强肝细胞增殖、增加肝脏再生并且预防和治疗肝脏损伤的方法。

本发明基于一种发现，即：骨形态发生蛋白(BMP)信号传导途径是肝细胞增殖的一种活性抑制剂并且使用该途径的一种拮抗剂的治疗导致了肝细胞增殖的增强以及在体内的肝脏损伤之后增强的肝脏再生。

在一个第一方面，本发明提供了通过将肝细胞与有效量的骨形态发生蛋白(BMP)信号传导途径的一种拮抗剂接触来增加肝细胞增殖的方法。在一个实施方案中，该骨形态发生蛋白BMP信号传导途径的拮抗剂抑制或下调了一种组成上有活性的BMP信号传导途径。例如，该BMP信号传导途径是一种BMP2或BMP4-介导的信号传导途径。在又一个实施方案中，该BMP信号传导途径的拮抗剂抑制了I型BMP受体信号转导。在一个实施方案中，该BMP信号传导途径的拮抗剂通过结合到该I型受体上抑制了I型BMP受体信号转导。在另一个实施方案中，该I型受体包括ALK2、ALK3或ALK6。在另一个实施方案中，该BMP信号传导途径的拮抗剂抑制了SMAD 1、5或8的磷酸化。在一个实施方案中，该BMP信号传导途径的拮抗剂抑制了BMP2或BMP4结合到一个BMP受体上或一种II型BMP受体与一种I型BMP受体的相互作用。在另一个实施方案中，该BMP信号传导途径的拮抗剂是一种化学试剂。该化学试剂可以是dorsomorphin、LDN193189或它们的类似物。

在一个第二方面中，本发明是针对在对其有需要的哺乳动物受试者中在肝脏的部分损失或损伤之后通过对该受试者给予有效量的骨形态发生蛋白(BMP)信号传导途径的一种拮抗剂来增加肝脏再生的方法。在一个实施方案中，对肝脏的部分损失或损伤是由一种外科或移植操作(例如肝脏切除术)引起的。在另一个实施方案中，有需要的受试者遭受了在切除性肝脏手术后的肝脏功能不全的痛苦。在一个实施方案中，有需要的受试者是一种哺乳动物，例如人类。例如，有需要的受试者是一种肝脏移植受体或移植供体。

在又一个实施方案中，该骨形态发生蛋白BMP信号传导途径的拮抗剂抑制或下调了一种组成上有活性的BMP信号传导途径。在一个实施方案中，该BMP信号传导途径是一种BMP2或BMP4-介导的信号传导途径。在一个实施方案中，该BMP信号传导途径的拮抗剂抑制了I型BMP受体信号转导。在一个实施方案中，该BMP信号传导途径的拮抗剂通过结合到该I型受体上抑制了该I型BMP受体的信号转导。在另一个实施方案中，该I型BMP受体包括ALK2、ALK3或ALK6。在一个实施方案中，该BMP信号传导途径的拮抗剂抑制了SMAD 1、5或8的磷酸化。在又一个实施方案中，该BMP信号传导途径的拮抗剂抑制了BMP2或BMP4结合到一个BMP受体上或一种II型BMP受体与一种I型BMP受体的相互作用。该BMP信号传导途径的拮抗剂是一种化学试剂。化学试剂可以包括，但不限于，dorsomorphin、LDN193189或它们的类似物。

在另一方面，本发明包括预防或治疗受试者体内的肝脏损伤的方法，通过给予有效量的该骨形态发生蛋白(BMP)信号传导途径的拮抗剂，这些受试者将会受益。如上面所描述的，该骨形态发生蛋白BMP信号传导途径的拮抗剂抑制或下调了一种组成上有活性的BMP信号传导途径。该肝脏损伤可以由一种肝毒性化学试剂引起。该肝毒性化学试剂可以包括扑热息痛。在一个实施方案中，该肝脏损伤可以由一种肝脏疾病引起，该肝脏疾病包括，例如肝炎病毒感染、自身免疫性肝炎、肝硬化、急性或慢性肝衰竭、或癌症。

在又一个方面，本发明提供了在对其有需要的受试者体内通过对该受试者给予有效量的该骨形态发生蛋白(BMP)信号传导途径的拮抗剂来增强肝脏再生的方法，其中该拮抗剂抑制了肝脏中的SMAD 1、5或8的BMP2或BMP4-介导的磷酸化。在一个实施方案中，在肝脏的部分损失或损伤之前，将该拮抗剂给予该受试者。

在又一个方面，本发明涉及通过将肝细胞与有效量的dorsomorphin或LDN193189接触来增加肝细胞增殖的一种方法，dorsomorphin或LDN193189抑制了肝细胞中的SMAD 1、5或8的BMP2或BMP4-介导的磷酸化。

在过去，确定肝脏如何应答损伤的基本因素是困难的。尽管在肝脏内环境稳定中牵涉了众多的分子途径，对于在切除术后具有肝脏损伤或不充足的肝脏质量的病人而言没有有效的疗法，尤其通过增强肝脏再生和修复。如在此所描述的一种信号转导途径，该途径的功能在于通过在组成上抑制肝细胞增殖来负控制肝脏的生长，将帮助解决肝脏如何感知其大小并且调节其生长的基础的谜题，并且能够提供一种使用潜在疗法的独特的机会。更重要的是，这样一种信号传导途径可以充当一种对于潜在试剂有用的靶标，从而导致了对于在切除术后具有肝脏损伤或不充足的肝脏质量的病人的一种有效疗法的成功开发。

附图说明

图1描述了在小鼠中骨形态发生蛋白4(BMP4)的表达水平，如在三分之二(“2/3”)肝切除术后通过实时聚合酶链式反应(RT-PCR)所定量的。显示了相比于对照物(即，甘油醛3-磷酸脱氢酶(GAPDH))的BMP4的相对表达水平(对于12-24小时时间点P＜0.05)。

图2描述了在0小时和36小时时间点处在小鼠中相对于对照物(GAPDH)BMP4的RT-PCR产物的有效量。

图3描述了ALK3蛋白质、一种对于BMP2和BMP4配体的I型BMP受体在小鼠的肝脏中的表达类型(PV：门静脉，HN：肝细胞细胞核)，如通过免疫组织化学使用针对ALK3蛋白质的一种单克隆抗体所显示的。

图4描述了在暴露于Cre重组酶的被loxP位点侧翼的BMP4转基因小鼠的肝脏中的BMP4蛋白表达的蛋白质印迹分析(即，“BMP4缺乏”)，如相对于在野生型肝脏中的BMP4蛋白表达。

图5描述了在对BMP4缺乏小鼠和野生型同窝出生的幼仔2/3肝切除后的KI67增殖指数(P＜0.05)。

图6描述了在对用dorsomorphin(10mg/kg)或盐水(作为对照)处理过的八周龄的小鼠2/3肝切除后的BrdU增殖指数。

图7描述了作为该总体重的百分比的剩余的肝脏，如在肝切除术后36小时和48小时处所测量的。

图8描述了dorsomorphin类似物的一个示意性图示。

具体实施方式

发明详细说明

现在已经发现骨形态发生蛋白(BMP)信号传导途径在哺乳动物的肝脏中在组成上是活性的，并且发现当该BMP信号传导途径是活性时，该途径的功能是阻止或抑制肝脏中的肝细胞增殖。已经发现该BMP信号传导途径的一种拮抗剂(例如一种BMP信号传导的药物抑制剂)的给药在肝脏损伤后能够增强肝细胞增殖并且增加肝脏修复和再生。

骨形态发生蛋白(BMP)是蛋白质家族的一员，最初通过它们在体内促使软骨和骨形成的能力对它们进行鉴定和表征(Reddi，A.H.(1992)Curr，Opin.Cell Biol.4，850-855)。迄今为止已经对超过二十个BMP进行了鉴定和报道，它们通过两个不同的丝氨酸-苏氨酸激酶受体被识别：I型以及II型BMP受体。至少三种不同的I型丝氨酸-苏氨酸激酶受体以及至少三种不同的II型丝氨酸-苏氨酸激酶受体已经被鉴定。这三种经鉴定的I型BMP受体是活化素受体样激酶-2(ALK2)(也被称为活化素受体I)，ALK3(也被称为BMPR-IA)，以及ALK6(也被称为BMPR-IB)并且这些其他的三种经鉴定的II型BMP受体包括BMPRII、ActRIIa以及ActRIIb。

I型和II型BMP受体都能够将细胞外的BMP信号转导到目标细胞的细胞质中，这些目标细胞在它们的细胞膜上表达这些受体。已知二聚体的BMP配体有助于I型和II型受体的组合以形成一种异源二聚体并且这些受体的此异二聚作用允许II型受体来对该I型受体进行磷酸化。当被磷酸化时，该I型BMP受体被显示以对BMP应答的SMAD效应物进行磷酸化，例如SMAD1、SMAD5以及SMAD8。这些效应物的磷酸化以与SMAD4的复合物反过来导致了这些效应物的核易位。在该靶细胞的细胞核中，磷酸化的SMAD上调了一组对这些BMP信号(包括，但不限于Id-1)应答的基因的表达。这些BMP通过II型BMP受体也能够诱导不依赖于SMAD的信号，该II型BMP受体基于与BMP的结合能够独立地激活该丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)p38介导的应答。

所有的BMP在它们的羧基末端部分中包含特有的七个高度保守的半胱氨酸并且，因此属于转化生长因子-β(TGF-β)超家族，例如TGF-β、活化素、抑制素以及苗勒氏抑制物质(Massague，J.(1990)Annu.Rev.Cell Biol.6，597-641)。在这些BMP之中，BMP2、BMP3、BMP4、BMP5、BMP6以及BMP7已经成为研究的焦点。存在着这些BMP的几个代表性成员。BMP2和BMP4通过具有大约90％的氨基酸一致性彼此是密切相关的。然而，它们的序列与BMP3、BMP5、BMP6以及BMP7的那些不同的。第二组(BMP5、BMP6以及BMP7)相互显示大约80％氨基酸一致性，从而留下BMP3以及其他的作为此蛋白质家族的第三组。

已知这些BMP用于结合I型和II型BMP受体两者。例如，BMP2对I型和II型BMP受体两者都展现了高度特异性(Keller，S.et al.(2004)NatureStructural and Molecular Biology，11：481-488)。尽管，II型受体利用在BMP2或BMP4与BMP6或BMP7之间显著不同。对BMP2或BMP4相对于BMP6或BMP7而言观察到对BMPRII的较大的依赖性，然而ActRIIa对通过BMP6或BMP7比BMP2或BMP4的信号是更加关键性的(Lavery，K.et al.，(2008)J.Biol.Chem.283：20948-20958)。对于这些I型受体而言还观察到显著性差异。ALK3和ALK6被BMP2和BMP4更频繁地利用，然而ALK2对于BMP6或BMP7是优选的I型受体(Lavery，K.et al.，(2008)J.Biol.Chem.283：20948-20958；Ro et al.，(2004)Oncogen，23：3024-3032)。

本发明涉及使用该BMP信号传导途径的一种拮抗剂通过抑制BMP信号来增强肝细胞增殖的方法。本发明涉及使用该BMP信号传导途径的一种拮抗剂通过抑制BMP信号来增强哺乳动物的肝脏再生的方法。本发明涉及使用该BMP信号传导途径的一种拮抗剂通过抑制BMP信号来增强肝脏修复的方法。本发明涉及通过给予有效量的在肝脏中骨形态发生蛋白(BMP)信号传导途径的一种拮抗剂，在对其有需要的受试者中预防并且治疗肝脏损伤的方法。

如在此使用的，一种“肝脏损伤”包括，但不限于，肝切除术、肝脏切除术、肝脏移植、或由外科移除一部分肝脏引起的其他的身体创伤或状况。与急性肝脏机能不全相关的肝脏损伤可以由肝细胞癌切除术、肝脏移植、或由外科移除一部分肝脏引起的其他的急性身体创伤或状况引起。在此使用的一种“肝脏损伤”还包括，但不限于，通过凋亡、坏死或由一种肝毒性试剂或化合物引起的其他的身体状况肝组织损伤或损坏，或肝组织细胞或组织的损失。与急性肝脏功能不全相关的肝脏损伤还可能是由于一种或多种药物试剂的配药过量(例如，扑热息痛/对乙酰氨基酚)或摄食中毒量的一种或多种肝毒性化学试剂。可替代地，如在此使用的一种“肝脏损伤”还包括，但不限于，通过凋亡、坏死或由一种肝脏疾病引起的其他身体状况组织损伤或损坏，或肝组织细胞或组织的损失，该肝脏疾病包括，但不限于，甲型肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎、其他的肝炎病毒感染、自身免疫性肝炎、肝硬化、胆汁性肝硬化、急性肝衰竭、急性肝脏毒性、慢性肝衰竭、急性肝脏感染、肝脏癌症、血铜蓝蛋白缺乏症、吉耳伯特综合征、雷氏综合征、Alagille综合征、血色素沉着症、苯丙酮尿症以及其他的氨基酸代谢病、血友病以及其他的凝血因子缺乏病、家族性血胆固醇过多以及其他的脂类代谢紊乱、尿素循环障碍、果糖血症、糖原病、酪氨酸血症、半乳糖血症、蛋白质和碳水化合物代谢缺乏病、有机酸尿症、线粒体疾病、过氧化物酶体以及溶酶体失调、蛋白质合成异常、肝细胞转运蛋白缺陷症、糖基化缺陷症、急性化学毒性、胆管炎、α-1-抗胰蛋白酶缺陷症、胆道闭锁、肝脏的囊性病、脂肪肝、半乳糖血症、胆结石、卟啉症、原发性硬化性胆管炎、肉样瘤病、酪氨酸血症、或1型糖原贮积病。

如此处所使用的，术语“受试者”指的是一种哺乳动物，该哺乳动物包括，但不限于，人类、灵长类、家养的哺乳动物、或实验室哺乳动物。一种“受试者”优选地是人类，但也可以是需要使用一种BMP信号的拮抗剂的治疗的一种动物，例如：伴侣动物，例如狗、猫等，农场动物例如牛、猪、马等以及实验室动物例如大鼠、小鼠、豚鼠等。

如此处所使用的，术语“治疗”和“预防”指的是预防、阻塞、阻止、抑制、减少、减弱、缓解或逆转肝脏损伤的任何或所有的状况、效应或原因、连同与肝脏损伤相关的症状或疾病；增大状况、症状或效应的消失与其复发之间的时间；稳定与肝脏损伤相关的一种不良症状；或减少、减慢或稳定一种状况相关的肝脏损伤的进展。

如此处所使用的，术语“移植”指的是对一种或多种取自或衍生自另一个或该受试者自身的肝脏的部分的肝组织或细胞进行移植。

如此处所使用的，术语“切除术”指的是切除一个器官或其他结构的一部分或全部。例如，肝脏切除术指的是一部分肝脏的外科移除并且通常是为了移除肝脏的患病的部分而进行，例如位于肝脏的切除部分的肝脏肿瘤。

如此处所使用的，术语“拮抗剂”指的是对抗该BMP信号传导途径的生理效应的一种化学试剂、药物试剂、一种药物、一种化合物、一种小分子、一种蛋白质、一种肽或一种抗体。例如，一种化学试剂能够对抗一种或多种BMP受体相关的应答，这些应答通常通过一种或多种BMP结合到一种或多种BMP受体来诱导。

如此处所使用的，术语“蛋白质”指的是任何长度的氨基酸的一种聚合物的形式，这些氨基酸可以包括天然发生的或合成的氨基酸以及编码的和非编码的氨基酸、肽、酯肽、具有环、二环、酯环(depsicyclic)或酯二环(depsibicyclic)肽骨架的多肽、单链蛋白质、连同多聚体、以及完整的蛋白质分子的任何片段或部分。

如此处所使用的，“肽”是意味着由氨基酸、氨基酸类似物用化学方法束缚在一起组成的任何分子。一般而言，这些氨基酸通过酰胺连接(CONH)用化学方法束缚在一起；然而，这些氨基酸可以通过本领域中已知的其他化学键被束缚在一起。例如，这些氨基酸可以通过胺连接被束缚。如此处所使用的肽包括氨基酸的低聚物、氨基酸类似物、或小的和大的肽，包括多肽。

如此处所使用的，术语“抗体”指的是一种免疫球蛋白或它的一个片段或衍生物，并且包含包括一个抗原结合位点的任何多肽，不管是否在体外或在体内产生的。该术语包括多克隆的、单克隆的、单特异性的、多特异性的、人源化的、单链的、嵌合体的、合成的、重组体的、杂交的、突变的以及移植的抗体。术语“抗体”还包括抗体片段，例如Fab、F(ab’)₂、Fv、scFv、Fd、dAb，以及保留抗原结合功能的其他抗体片段(即，与一种特异抗原结合的能力)。典型地，这样的片段包括一个抗原结合域(即，包括造成该抗体与该抗原之间的特异性连接的氨基酸的一种抗体分子的一部分)。一个抗原结合域典型地包括一个抗体轻链可变区(V_L)以及一个抗体重链可变区(V_H)，然而，没有必要必须包括两者。

如此处所使用的，术语“类似物”是一种分子，其结构与相应的拮抗剂的结构是相关的，但并不完全相同。一种类似物具有该相应的拮抗剂的一种相似的或类似的化学和生物性质。例如，一种化学的类似物保留了一种相应的拮抗剂的化学性质，而且具有一种或多种化学的修饰。一种多肽类似物保留了一种相应的拮抗剂的生物活性，而且具有来自该多肽拮抗剂的某些生物化学的修饰。这些修饰可以增大例如该拮抗剂的稳定性或半衰期，而没有改变例如到该BMP信号转导途径中包含的一种或多种生物分子上的结合特异性。一种类似物可以包括一种合成的化学试剂或多肽。

如此处所使用的，术语“有效量”指的是一定量的BMP信号的活性拮抗剂，该拮抗剂足以影响肝脏损伤的病程和严重性，从而导致预防、减少、抑制、弱化或缓和肝脏损伤。例如，该BMP拮抗剂的一个有效量是在肝细胞中足以抑制BMP信号的一个量，从而导致预防、减少、抑制、弱化或缓和肝脏损伤。如对本领域的普通技术人员显而易见的是，对于一个给定的有需要的受试者的有效量可以根据治疗的受试者的尺寸、年龄、体重、状况以及应答性而变化。该有效量还将依据给药途径以及有需要的受试者的状况。

如此处所使用的，术语“剂量”指的是在某一时刻将要给药的量，例如BMP信号的拮抗剂的一个特定的和有效的量。

如此处所使用的，术语“调整”或“调节”指的是一种变化，例如减少或增加。例如，该变化可以指的是一种生物活性。令人希望地，该变化是生物活性的至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％的增加亦或减少，相对于一个参比活性或相对于对照物活性，例如一种或多种SMAD、一种或多种BMP或一种或多种BMP受体的生物活性。

根据本发明，BMP信号的一种拮抗剂的给药能够通过抑制一种或多种BMP受体来增强肝细胞增殖。这一种或多种BMP受体的抑制可以通过结合到一种或多种I型BMP受体或一种或多种II型BMP受体上而实现。这一种或多种BMP受体的抑制可以通过同时结合到一种或多种I型BMP受体或一种或多种II型BMP受体上而实现。本发明的拮抗剂能够特定地抑制一种I型BMP受体，包括，但不限于，ALK2、ALK3以及ALK6。该I型BMP受体包括，但不限于，活化素受体样激酶-2(ALK2)(也被称为活化素受体-I)、ALK3(也被称为BMPR-IA)以及ALK6(也被称为BMPR-IB)。该II型BMP受体包括，但不限于，BMPRII、Act RIIa以及ActRIIb。I型和II型BMP受体将细胞外BMP信号转导到这些目标细胞的细胞质中。BMP配体能够促进这些I型和II型受体的组合以形成一种异源二聚体并且这些受体的异二聚作用允许II型受体来磷酸化该I型受体。当被激活(“被磷酸化”)时，该I型BMP受体使BMP应答的SMAD效应物(例如SMAD1、SMAD5以及SMAD8)磷酸化。然而当该I型BMP受体不被磷酸化时，一种BMP与该II型BMP受体的特定的结合通过激活这些细胞内的效应物(包括，但不限于，丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)p38)诱导不依赖于SMAD的信号。

该BMP途径的拮抗剂通过直接地结合到一种或多种BMP(特别地，BMP2、BMP3、BMP4、BMP5、BMP6以及BMP7)上能够抑制BMP信号。该BMP途径的拮抗剂通过直接地结合到BMP2或BMP4上能够抑制BMP信号。该BMP信号途径的拮抗剂通过抑制BMP2或BMP4与一种BMP受体的相互作用能够抑制BMP信号。

因为二聚体的BMP配体能够促进这些I型和II型受体的组合以形成一种异源二聚体并且这些受体的异二聚作用允许II型受体来磷酸化该I型受体，该BMP信号的拮抗剂通过阻止一种或多种BMP与这些I型和II型受体的结合相互作用能够抑制一种II型BMP受体与一种I型BMP受体的相互作用。该BMP信号的拮抗剂也可以通过该II型受体阻碍该I型受体的磷酸化来抑制一种II型BMP受体与一种I型BMP受体的相互作用。

该BMP信号的拮抗剂也可以通过特定地结合到BMP2或BMP4或通过结合到一种BMP2或BMP4特异性BMP受体上来抑制一种BMP2或BMP4介导的信号传导途径。该BMP信号传导途径的拮抗剂抑制一种或多种BMP的活性。优选地，BMP信号的拮抗剂通过直接结合到一种或多种BMP上来抑制一种或多种BMP的活性。

本发明包括使用一种抑制一种或多种I型受体的试剂的方法。BMP信号的拮抗剂可以通过一种I型BMP受体抑制一种或多种SMAD的磷酸化来抑制BMP信号。该I型受体使一种或多种受体调节的SMAD(R-SMAD)磷酸化，包括但不限于，SMAD1、SMAD2、SMAD3、SMAD4、SMAD5、SMAD8以及SMAD9。优选地，本发明的拮抗剂抑制一种或多种SMAD的磷酸化，包括但不限于，SMAD1、SMAD5或SMAD8。

BMP信号的拮抗剂可以是一种药物试剂、一种化学试剂、一种蛋白质、一种肽或一种抗体。优选地，该BMP信号的拮抗剂是一种直接结合到一种或多种BMP受体上的化学试剂。在WO 2008/033408中描述了适合的拮抗剂的实例，其全部传授内容通过引用结合在此。本发明中使用的化学试剂包括，但不限于，dorsomorphin、LDN193189或它们的一种类似物或衍生物。在本发明中考虑了通过在WO 2008/033408中传授的这些方法鉴定的并且对它们抑制BMP信号途径的能力评估了的任何BMP特定的抑制剂化合物或化学试剂。将WO 2008/033408的全部传授内容通过引用结合在此。

Dorsomorphin是一种抑制剂AMP激酶信号传导途径(Zhou et al.，(2001)J.Clin.Invest.108：1167-1174)。Dorsomorphin在斑马鱼胚胎中还显示出反作用于BMP信号并且在斑马鱼胚胎中有效地促进了背部化(WO 2008/033408)。在斑马鱼中，dorsomorphin显示出抑制在体外由BMP4或BMP6诱导的成骨性分化，比用头发生素、BMP信号的一种天然抑制剂处理所看到的更有效的一种抑制作用(WO 2008/033408)。Dorsomorphin已经被描述用于通过选择性地抑制I型BMP受体(即ALK2、ALK3以及ALK6)来抑制BMP2、BMP4、BMP6、BMP7以及BMP9的活性(WO 2008/033408)，并且阻碍BMP介导的SMAD 1、SMAD 5以及SMAD 8的磷酸化，在不影响MAPK p38的活化的情况下(Yu etal.，(2007)Nature Chemical Biology，4：33-41)。Dorsomorphin包含如下面在结构式I中所示的化学结构：

结构式I.

由Zhou等人(Zhou et al.(2001)J.Clin.Invest.108：1167-1174)以及Yu等人(Yu et al.(2007)Nature Chemical Biology，4：33-41)对dorsomorphin、6-[4-(2-哌啶-1-基-乙氧基)-苯基)]-3-吡啶-4-基-吡唑[1，5-a]-嘧啶的生物功能和结构进行了详细的描述，其全部传授内容通过引用结合在此。

LDN193189是吡唑[1，5-a]-嘧啶的一种衍生物，它在悬垂的苯环3-位或4-位上包含一个胺。在图8中显示了并且在WO 2008/033408中也描述了dorsomorphin的一些药学上可接受的类似物，其全部传授内容通过引用结合在此。合成LDN193189及其类似物的方法、包括它们的分子结构由Cuny等人详细描述(Cuny et al.，Bioorganic&Medicinal Chemistry Letters，18：4388-4392(2008))，其全部传授内容通过引用结合在此。还理解的是本领域的普通技术人员可以通过使用本领域中已知的方法容易地制备这些类似物。

一种化学试剂对肝脏再生的生物学影响，该化学试剂调整BMP信号，例如dorsomorphin或LDN193189连同其他潜在的拮抗剂候选物的潜在的类似物，可以通过确定该试剂对SMAD 1、SMAD 5或SMAD 8的磷酸化的影响来进行评估。BMP介导的SMAD磷酸化可以通过，例如使用抗磷酸化-SMAD 1、SMAD 5或SMAD 8的免疫印迹分析来确定(CELL

)。可替代地，BMP介导的SMAD磷酸化可以通过使用渗透性的肝细胞的免疫沉淀反应和酶联免疫吸附测定法(ELISA)来确定。通过，例如，使用冰冷的甲醇的甲醇处理10-15分钟来沉淀肝细胞蛋白质。通过引入0.25％至2％的戊二醛并且用一种胺(例如赖氨酸、乙二胺或phynylenediamine)对其进行淬火，使肝细胞蛋白质与例如戊二醛进行交联。在WO 2008/033408中对磷酸化测定的详细的方案进行了描述，其全部传授内容通过引用结合在此。如在此使用的，SMAD的增强的磷酸化的检测表明该试剂激活BMP信号，然而SMAD的减弱的磷酸化的检测表明该试剂抑制BMP信号。

可替代地，一种调节BMP信号的化学试剂对肝脏再生的潜在影响可以通过使用如在此描述的5-溴代-2-脱氧尿嘧啶核甙(BrdU)标记或Ki-67标记测量肝细胞增殖来确定。

BMP信号的这些拮抗剂可以以药学上可接受的盐形式存在。药学上可接受的盐形式包括药学上可接受的酸性的/阴离子的或碱性的/阳离子的盐。药学上可接受的酸性的/阴离子的盐包括，乙酸盐、苯磺酸盐、苯甲酸盐、重碳酸盐、酒石酸氢盐、溴化物、依地酸钙、右旋樟脑磺酸盐、碳酸盐、氯化物、柠檬酸盐、二氢氯化物、依地酸盐、乙二磺酸盐、丙酸酯月桂硫酸盐、乙磺酸盐、富马酸盐、葡庚糖酸盐(glyceptate)、葡萄糖酸盐、谷氨酸盐、对羟乙酰氨基苯胂酸盐、己基间苯二酚盐、氢溴化物、盐酸盐、羟萘甲酸盐、碘化物、羟乙磺酸盐、乳酸盐、乳糖醛酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、丙二酸盐、扁桃酸盐、甲磺酸盐、甲基硫酸盐、粘酸盐、萘磺酸盐、硝酸盐、扑酸盐、泛酸盐、磷酸盐/二磷酸盐、聚半乳糖醛酸盐、水杨酸盐、硬脂酸盐、碱式乙酸盐、琥珀酸盐、硫酸盐、硫酸氢盐、鞣酸盐、酒石酸盐、茶氯酸盐、甲苯磺酸盐、以及三乙基碘盐。药学上可接受的碱性的/阳离子的盐包括，钠、钾、钙、镁、二乙醇胺、N-甲基-D-葡糖胺、L-赖氨酸、L-精氨酸、铵盐、乙醇胺、哌嗪以及三乙醇胺盐。

该BMP拮抗剂在肝脏损伤之前、之中或之后被给予有需要的受试者。该BMP拮抗剂在肝脏损伤之前被给药。该BMP拮抗剂在肝脏损伤进行过程中的任何时间被给药。该BMP拮抗剂在肝脏损伤之后被给药。该BMP拮抗剂在多个间隔处以多次给药的方式被给药。该BMP拮抗剂可以在肝脏损伤开始之前在1、2、3、4、5、6、12、24和/或48小时的时间处被给药。该BMP拮抗剂可以在肝脏损伤开始的1、2、3、4、5、6、12、24和/或48小时的时间处和/或在这些时间之内被给药。该BMP拮抗剂可以在肝脏损伤之后24、36、48、60、72或96小时的时间处和/或在这些时间之内被给药。该BMP拮抗剂可以在肝脏损伤开始之后3、4、5、6、7、8、9或10天的时间处和/或在这些时间之内被给药。可替代地，该BMP拮抗剂可以在肝脏损伤之后的0小时与48小时之间、1天与3天之间、2天与4天之间、3天与7天之间、5天与8天之间或7天与10天之间被给药。该BMP拮抗剂可以在这些时间周期中被给药一次，或可替代地，两次、三次、四次、五次、六次、七次、八次或甚至更多次(在这些时间周期内)。在一个实施方案中，在这些时间周期之后用BMP信号的一种拮抗剂的治疗结束；可替代地，治疗可以在该时间周期结束后继续，例如一直到在肝脏损伤开始之后的1、2、3、4、5或6月。

BMP信号的一种拮抗剂可以通过任何合适的路径以一个有效量给予一个有需要的受试者。例如，有效量的BMP信号的拮抗剂可以由静脉内给药。有效量的BMP信号的拮抗剂可以通过口服被给药。BMP信号的拮抗剂可以通过局部引入到肝脏(例如通过肝脏导管插入术)被给药。BMP信号的拮抗剂可以通过输液进入门静脉或到门静脉的其他支流(例如脾静脉、肠系膜上静脉以及幽门静脉)被局部给药。可替代地，BMP信号的拮抗剂可以通过注射被局部给药到肝脏组织。“通过注射被给药到肝脏组织”意思是被输送到肝脏的内表面或外表面。在局部给药或注射中，该BMP拮抗剂的输送点可以与肝脏充分接近以致该BMP拮抗剂在肝脏中可以扩散并且与至少一种或多种具有激活的BMP信号途径的肝细胞接触。优选地，在肝脏中，该BMP拮抗剂可以扩散并且与至少多数(50％或更多)的能够增殖的肝细胞接触。该BMP拮抗剂能以一种持续释放的配制品的方式被给药到受试者，或可以通过一种泵或一种可植入的装置被输送，或通过一种载体(例如下面讨论的聚合物)。

该BMP信号的拮抗剂可以与一种可接受的药物载体结合作为药物组合物的一部分而被给药到受试者。根据选择的给药模式该药物组合物的配方将会变化。合适的药物载体可以包括一些不与该BMP拮抗剂相互作用的惰性成分。这些载体应该是生物相容的，也就是在该给药位点处非毒性的、非炎症性的、非免疫性的并且没有其他不希望的反应。药学上可接受的载体的实例包括，例如盐水、可商购的惰性凝胶剂、或添加了白蛋白、甲基纤维素或一种胶原基质的液体。进一步的实例包括无菌水、生理盐水、抑菌盐水(包含0.9％mg/ml苯甲醇的盐水)、磷酸盐缓冲盐水、汉克斯氏溶液(Hank’s solution)、林格氏乳酸盐溶液(Ringer′s-lactate)等等。可采用多种标准药物配制技术，如以上在Remington′s Pharmaceutical Sciences中描述的那些技术(Remington′sPharmaceutical Sciences.XVIII，Mack出版公司，伊斯顿，宾夕法尼亚州(1990))。

BMP信号的这些拮抗剂能以一种持续释放的配制品被给药。聚合物通常被用于形成持续释放的配制品。这些聚合物的实例包括聚α-羟基酯，例如聚乳酸/聚乙醇酸均聚物和共聚物、聚磷腈(PPHOS)、聚酸酐以及聚(富马酸丁二醇酯)。聚乳酸/聚乙醇酸(PLGA)均聚物和共聚物作为持续释放的运载体在本领域中是熟知的。熟练的技术人员通过改变聚乳酸与聚乙醇酸比例以及该聚合物的分子量可以调节释放的速率(参见Anderson等人(1997)Adv.DrugDeliv.Rev.28：5，全部传授内容通过引用结合在此)。将聚乙二醇结合到该聚合物中作为一种用于形成微颗粒载体的共混物允许该活性成分的释放曲线的进一步改变(参见Cleek等人，J.Control Release 48：259(1997)，全部传授内容通过引用结合在此)。陶瓷(例如磷酸钙以及羟基磷灰石)也可以被结合到该配制品中以改善机械特性。

通过以下实例来对本发明进行示例性说明，而不是旨在以任何方式进行限制。

实例1

I.实验步骤

本发明基于一种发现，即：骨形态发生蛋白(BMP)信号传导途径是肝细胞增殖的一种有活性的抑制剂并且使用该途径的一种拮抗剂的治疗导致了肝细胞增殖的增强以及在体内的肝脏损伤之后增强的肝脏再生。

A.用于肝部分切除术的实验步骤

使用动物来检测损伤后在肝脏质量的回复中BMP信号的各种成员的作用。对小鼠进行三分之二(“2/3”)或大量的百分之八十(80％)肝切除。手术在至少八周龄的成年小鼠上进行。为了手术，用向腹腔内注射的100mg/kg氯胺酮和10mg/kg甲苯噻嗪对小鼠进行麻醉。在该受试者没有变得失去知觉的情况下，以相似的方式注射额外的25mg/kg氯胺酮和2.5mg/kg甲苯噻嗪。重复此步骤直到该受试者失去知觉。使用一把剪刀将毛发从手术部位去除并且使用无菌技术以及聚乙烯吡咯酮碘(betadyne)对该皮肤进行消毒。用70％酒精对该洗涤的区域进行冲洗。为了避免体温过低，该动物没有必要被弄湿。在朝向脐大约一公分的剑状软骨的层次上用一把无菌的剪刀做开一个切口。使用一把剪刀进入该腹膜并且切除该剑状软骨的尖端。对于2/3的肝切除，通过在以前准备好的面积上的右侧面上的温和压力通过该切口将肝脏由腹部取出。在该肝脏的由腹部取出的部分周围放置一种4-0结扎线结并且打结。然后切除远离于该结的该肝脏的前面部分。以角质层下的方式4-0脯氨酸被用于封闭该绷带并且4-0尼龙被用于封闭该皮肤。对于80％的肝切除，使用一个更大的切口并且用一种4-0结扎线结结扎这些单独的圆形突出部，从而仅仅留下该有尾状附属物。然后切除远离于该结的该肝脏的这些前面部分。以角质层下的方式4-0脯氨酸被用于封闭该绷带并且4-0尼龙被用于封闭该皮肤。

B.受试者的基因分型以及选择

通过去除大约2mm尾部在两周龄用于基因分型的小鼠上进行尾部活体解剖。消毒设备被用于所有的步骤。用70％酒精擦拭该尾部的远侧部分并且使用剪刀剪断该尾部的远侧部分。对该切口应用强大的压力至少30秒。在将该小鼠返回到笼子之前记录出血终止的确认。在出血发生的情形中，一滴液体被应用于切掉尾末端。雄性成年小鼠被用于这些实验中，每个时间点用五个动物。近交的小鼠品系被用来降低实验的可变性。

C.在肝脏中BMP mRNA和蛋白质的表达水平的确定

在肝部分切除之后在肝脏中BMP mRNA和蛋白质的表达被显著地降低。首先，通过测定mRNA的表达水平确定内源基因表达(例如目标BMP4基因的表达水平)。使用例如聚合酶链式反应(PCR)、连接酶链式反应(LCR)、或杂交分析(如RNA杂交、斑点印迹以及RNA酶保护作用)对基因表达的水平进行测定。特别地，利用定量的实时聚合酶链式反应(RT-PCR)来定量肝切除术之后BMP4mRNA的水平。使用直接标记或间接标记的检测试剂对蛋白质或mRNA的水平进行检测，例如荧光标记或放射性标记的核酸、放射性标记或酶法标记的抗体等。在授予Gelfand的美国专利号5,210,015、授予Livak等人的美国专利号5,538,848以及授予Haaland的美国专利号5,863,736，连同Heid，C.A.等人，Genome Research，6：986-994(1996)；Gibson，U.E.M等人，Genome Research 6：995-1001(1996)；Holland，P.M.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：7276-7280，(1991)；以及Livak，K.J.等人，PCR Methods andApplications 357-362(1995)中描述了用于检测蛋白质和mRNA的水平的方法。这些参考文献的全部传授内容通过引用结合在此。

D.在肝脏中表现有条件的BMP4缺失的一种转基因小鼠的创建

BMP4的完全缺失已经被熟知为是胚胎致命的。因此，采用了用于BMP的肝脏特异性有条件的基因缺失(“敲除”)的一种策略。一般地，在该敲除系统中，该靶基因的改变基于该动物暴露到一种促进靶基因改变的物质上而发生，例如在该靶基因位点处促进重组的一种酶的引入(例如在cre-flox系统中的Cre)。在本发明中，在白蛋白以及α-胎儿球蛋白启动子(Alfp-Cre)的控制下通过一种AAV-8-MUP-cre(Ho等人，2008)亦或表达Cre-重组酶的一种转基因小鼠提供了一种被loxP位点侧翼的BMP4小鼠并且释放了cre-重组酶。作为一种研究技术，使用病毒载体来研究肝脏具有很大的实用性。不幸地，由于给药中的困难、炎症或肝脏毒性，慢病毒以及腺病毒具有有限的实用性(Mahasreshti等人，2003)。为了克服此问题，开发并且采用了具有一个小鼠尿蛋白启动子(AAV-8-MUP)的一种腺病毒伴随病毒8，该病毒感染了肝脏，具有很小损坏并且对损伤后的修复没有影响。

E.Ki-67的抗体标记

为了检测BMP4信号损失的功能后果，采用Ki-67标记指示物以在缺乏的BMP小鼠中相对于野生型确定肝细胞增殖。如以上描述的8-10周龄的成年雄性小鼠经历了2/3肝切除并且在2/3肝切除之后在不同的时间点(例如0、24、48、72、96、120、144、168以及192小时)处检测肝细胞增殖。作为对于增殖的一种细胞标志物，Ki-67蛋白质与细胞增殖以及分裂是强相关的。在间期时，该Ki-67蛋白质(抗原)在该细胞核内被唯一地检测到，然而在有丝分裂时大多数蛋白质集中到该染色体上。在该细胞周期(G₁、S、G₂以及有丝分裂)的所有活动期中对Ki-67蛋白质进行检测，但是完全没有静息细胞(G₀)。因此，Ki-67作为用于确定给定的细胞群体的生长部分的一种优秀的标志物起作用。Ki-67阳性细胞的部分(Ki-67标记指数)与细胞分裂和生长的过程是相关的。在这些从该小鼠提取的肝细胞中采用单克隆抗体(MIB-1)以检测该Ki-67抗原。如通过Suzuki等人描述的进行了包括免疫染色的Ki-67抗原标记指数(Suzuki et al.(1992)J.Clin.Gastroenterol.15：317-20)，其全部的传授内容通过引用结合在此。进行了多种对照物实验，包括Alfp-Cre/BMP4^f/f以及Alfp-Cre⁺BMP4^+/f小鼠，以及接受AAV-8-MUP绿色荧光蛋白(GFP)对照物病毒的小鼠。

F.5-溴代-2-脱氧尿嘧啶核甙(BrdU)标记以及免疫组织化学

肝脏和肝细胞是从如以上描述的小鼠中提取的并且在具有10％FBS的传统的DMEM中在T型烧瓶中生长。使用胰蛋白酶/EDTA溶液对细胞进行分离，并且在24孔板或容器载玻片中在1mL的适当介质中或，可替代地，在聚赖氨酸包覆的盖玻片(在PBS中0.05％-0.1％，使用150K-300K mol.wt过夜)中将这些细胞转移到具有12mm盖玻片的壳管瓶中。在37℃下对细胞进行孵育两小时以允许回收。添加BrdU到每个壳管瓶中至最终浓度为10μM并且在37℃下孵育两小时。从这些介质壳管瓶中抽吸出介质并且在PBS中冲洗这些盖玻片三次。添加1mL卡若氏固定剂(Carnoy’s fixative)(3份甲醇∶1份冰醋酸)到每个壳管瓶中并且抽吸出该固定剂。立即添加额外的1mL卡若氏固定剂。这些壳管瓶被固定在-20℃下20分钟。从这些壳管瓶中抽吸出该固定剂并且在PBS中冲洗这些盖玻片三次。通过在水中将0.2mL的2M HCl添加到每个壳管瓶并且通过在37℃下孵育1小时使细胞变性。从这些酸壳管瓶中抽吸出酸并且在pH 8.5的硼酸盐缓冲剂中通过冲洗三次中和这些盖玻片。在PBS+0.05％吐温20[PBS/T20]中对这些壳管瓶冲洗三次并且存储在2℃-8℃下。

免疫染色

在本领域中如通常熟知的进行了免疫染色。特定地，通过将0.2mL的PBS/T20/2％标准山羊血清添加到每个壳管瓶中并且在37℃下孵育10分钟到30分钟阻塞这些细胞。抽吸出溶液并且添加稀释在PBS/T20/2％标准山羊血清(Millipore^TM目录号MAB3424、MAB4072)中的0.2mL抗BrdU单克隆抗体。在37℃下对这些壳管瓶孵育30分钟(BrdU储备溶液：10mM溶解在PBS中、0.2μm经过滤器灭菌的并且存储在-20℃下)。在培养液中将BrdU储备溶液稀释1/100以产生一种100μM的溶液(10X)。将该10×的溶液添加到每个小瓶中至最终浓度为10μM。在PBS/T20中对这些小瓶冲洗三次，并且添加0.2mL的山羊抗小鼠的FITC(Millipore^TM目录号AP124F)。在黑暗中在37℃下对这些小瓶孵育30分钟并且在PBS/T20中冲洗3次。使用用于荧光的固定介质(Millipore^TM目录号5013)，将盖玻片从这些小瓶中移除，浸泡在去离子水中并且被封固在玻璃载玻片上。使用荧光显微镜对盖玻片进行评价。

II.结果

A.通过该成年人的肝脏组成性地表达了BMP4，并且BMP4作为关于肝脏再生的抑制物起作用并且使用多种方法移除此抑制作用增强了肝脏再生。

一种大规模的遗传筛选鉴定的骨形态发生蛋白信号在损伤后的肝脏修复过程中被高度地抑制。这包括拮抗剂的诱导作用以及拮抗剂的抑制作用。这些分子作为潜在靶标起作用以理解在肝脏再生中一种新的范例，在该范例中增殖的抑制剂的拮抗作用对损伤后的正常的肝脏修复是必需的。因为BMP是分泌的信号分子并且因此潜在地能够被操纵，这是一种特别有吸引力的治疗目标。

在图1中显示了在肝切除术后用于BMP4的实时PCR。截止肝切除术之后的18个小时，相对于该未受损伤的肝脏，该水平下降到25％。BMP4蛋白水平以相似的方式降低，并且在肝切除术之后36小时显著地下降(图2)。对于BMP2RNA获得了相似的结果。

B.在肝脏中BMP4受体的表达

为了确定对于BMP的受体存在于肝脏中，对ALK2和ALK3(被BMP4利用的两个受体)进行了免疫组织化学。如上面所描述的，ALK2主要被BMP6和BMP7利用，然而ALK3主要被BMP2和BMP4利用。如在图3中显示的，ALK3表达在靠近门静脉的肝脏中(红色染色法)。对于ALK2获得了相似的结果。

C.在小鼠肝脏中BMP4的有条件的基因缺失的创建

BMP4的完全缺失已经被熟知为是胚胎致命的。因此，采用了用于BMP的肝脏特异性有条件的基因缺失(“敲除”)的一种策略。特别地，具有cre-重组酶的一种被loxP位点侧翼的BMP4小鼠，该cre-重组酶在白蛋白和α-胎儿球蛋白促进子(Alfp-Cre)的控制下通过一种AAV-8-MUP(Ho等人，2008)亦或通过表达Cre-重组酶的一种转基因小鼠释放。为了证实在肝脏中BMP4的有效的有条件的缺失，在重组后进行了对于BMP4蛋白的蛋白质印迹分析。如图4中所描述的，通过cre-重组酶在被loxP位点侧翼的小鼠中观察到BMP4蛋白的急剧降低的水平(图4)。

D.通过BMP4的损失增强了肝脏再生

接下来，通过使用Ki-67标记指示物检测了BMP4信号的损失的功能上的后果。如以上描述的8-10周龄的成年雄性小鼠经历了2/3肝切除并且在2/3肝切除之后在不同的时间点(例如0、24、48、72、96、120、144、168以及192小时)处检测肝细胞增殖。如在图5中所显示的，如相对于如通过Ki-67标记(图5)测量的对照物，在该转基因小鼠中BMP4的肝脏特异性缺失导致48小时下肝细胞增殖的大于两倍的量(p＜0.05)。进行了具有相似结果的多种对照物实验，包括Alfp-Cre/BMP4^f/f以及Alfp-Cre⁺BMP4^+/f小鼠，以及接受AAV-8-MUP绿色荧光蛋白(GFP)对照物病毒的小鼠(不是所有显示的数据)。因此，肝脏中的BMP4的损失通过释放用于肝脏再生的一种组成块显著地增强肝脏再生。

E.在肝脏损伤后用于正常的肝脏修复的BMP4表达的减少

为了证实BMP4信号的减少或抑制对于肝脏损伤后正常的肝脏修复是一个必要条件，维持肝切除术后的BMP4表达水平是必要的。为了实现此目的，开发了一种AAV-8-MUP-BMP4。当在肝切除术过程中并且在肝切除术(P＜0.05)之后表达BMP4病毒时，相对于运载体(盐水)或AAV-8-MUP-GFP对照物病毒观察到肝细胞增殖70％的减少。

为了证实BMP4的肝脏特异性损失没有产生将影响肝脏再生的系统作用，将该BMP4病毒(即，AAV-8-MUP-BMP4)注射到肝脏特异性缺乏BMP4的小鼠中。如所预料的，肝脏中的BMP4的表达将肝细胞增殖回复到该野生型小鼠中所看到的这些较低的、正常的水平。

这些结果强有力地证实了BMP信号的减少对于肝脏切除术后正常的肝细胞增殖是必要的。此外，这些结果对BMP信号的程度控制着肝脏切除术后肝细胞增殖的速度提供了强有力的证据。这些结果与观察结果也是一致的，即如在图5中所显示的抑制途径的释放对于损伤后的肝脏更新是一个关键性机制。因为BMP4是一种分泌的信号分子，它作为一种用于治疗靶标的优秀的候选物起作用。

F.在肝部分切除后通过药理学抑制BMP信号来增强肝脏再生

为了提供用于这些以上讨论的发现的临床相关性，用BMP信号的一种拮抗剂对八周龄的小鼠进行注射。在2/3肝切除之前、之中以及之后注射dorsomorphin 48小时。特别地，在肝切除术之前24小时和12小时、在肝切除术时以及在肝切除术之后12、24以及36小时多次注射dorsomorphin。在图6中，在2/3肝切除之后36小时和48小时测量了BrdU结合。如在图6中所证实的，dorsomorphin的给药导致了肝细胞增殖的显著增加。对于达到60天的dorsomorphin给药没有产生全身的毒性。特别地，这对骨髓、生长或白细胞计数没有影响。

实例2

I.在肝切除术和泰诺过量之后评价肝脏再生的一般方法

将采用三种实验的技术来检测这些遗传学的或药理学的介入的作用：2/3肝切除术、大量的肝切除术或泰诺过量。对于2/3肝切除术，如以上描述的以及其他人(Otu等人，2007)描述的将进行包括该胆囊的左侧和中间的圆形突出部的去除。对于大量的肝切除术(80％)，该右侧的圆形突出部也将会被切除。对于泰诺过量，300mg/kg将通过静脉内灌注被给药。

为了分析这些2/3肝切除的动物，在肝切除术之后的6、12、24、36、48以及72小时、以及7天时将收获肝脏。在动物处死之前2小时将注射BrdU并且BrdU结合连同Ki-67标记将被用于确定肝细胞增殖。在处死的时候将会分析肝脏重量并且将会确定肝脏/体重比例以评估再生的速度。RNA和蛋白质样品将会被收集用于实时PCR分析以及蛋白质印迹法。一般而言，将会评估肝脏切除术之后增殖的开始是被延时或被加速。还将确定再生的步伐在它开始之后是否被改变以及用于该最终肝脏尺寸的设定点是否被改变。组织学也将被检测以在肝脏中寻找脂肪累积、空泡形成、坏死、或构造变化。为了进一步评估肝细胞健康和功能，在基线处以及在这些处死的动物中将检测包括AST、ALT以及胆红素的肝脏功能检验。为了评估程序性细胞死亡(凋亡)的潜在水平或应答于肝脏损伤的坏死，末端脱氧核苷酸转移酶dUTP切口末端标记法(TUNEL)将会被进行以分析DNA碎裂。如以上所讨论的，尽可能使用同窝出生的幼仔作为对照物，在所有的实验中将采用8-10周龄的雄性小鼠。对于存活实验，将产生卡普兰-迈耶存活曲线。基于功率计算将22个实验小鼠与22个对照物小鼠进行比较。

实例3

I.用来确定哪些BMP配体和受体影响损伤后的肝脏修复并且解释它们的分子作用机制的体内研究

A.在肝脏特异性缺乏BMP的小鼠中确定在损伤后增强的肝脏修复的机制

上面描述了具有野生型小鼠的对照物、具有该病毒的野生型小鼠、接受一种对照物AAV-8-MUP-EGFP病毒的转基因的被loxP位点侧翼的小鼠以及接受一种AAV-8-MUP-BMP病毒的实验的转基因的被loxP位点侧翼的小鼠。在图5中描述了在肝脏特异性缺乏BMP4的小鼠中在肝切除术后该增强的肝细胞增殖的时间标记。

为了进一步确定在肝脏特异性缺乏BMP4的小鼠中在损伤后增强的肝脏修复的更加特异的机制并且为了评价BMP4抑制增殖的机制，将会进行以下的研究。

很可能对于作为多种拮抗剂存在的BMP表达存在一个反馈环。为了确定是否存在对于BMP信号的一个反馈环，通过使用RT-PCR以及蛋白质印迹法将要确定的是在不存在BMP4下该BMP途径(例如BMP2、BMP6或BMP7)、I型BMP受体(例如ALK2、ALK3、ALK6)以及拮抗剂(例如头发生素和Cer样1)的其他组分如何随时间改变。

BMP4很可能增大细胞周期蛋白的表达并且作为这些蛋白质的一种上游效应物。为了评价BMP4的损失如何影响细胞周期的进展，细胞周期蛋白A和D将会通过例如RT-PCR和蛋白质印迹法被研究。

尽管有可能c-jun和c-EBP-α不是BMP4的转录目标，它对证实该关系将是重要的。为了检测BMP4的损失如何影响正调控途径的转录调控，c-jun和c-EBP-α的表达将通过例如RT-PCR和蛋白质印迹法被确定。

很有可能细胞因子以及生长因子不是BMP4的靶标。为了确定BMP4是否调控肝细胞增殖的其他的刺激物、细胞因子IL-6和生长因子的表达，表皮生长因子和肝细胞生长因子将通过例如RT-PCR和蛋白质印迹法被检测。通过RT-PCR或RNA印迹分析还将检测是否BMP4信号转录地调控这些反向调控的蛋白质p21和p53。

通过使用蛋白质印迹法还将检测包括SMAD 1、5以及8的BMP信号的细胞内介质的定位和它们的磷酸化状态。

Tob1可以作为BMP4的一种转录靶标起作用。在ErbB2.1(Tob1)(一种与BMP信号相互作用的抗增殖的分子)的转导物的变化将确定是否BMP信号调节了Tob1表达。

B.确定在损伤之后是否BMP2的肝脏特异性移除增强了肝脏修复

因为BMP2的传统的敲除是胚胎致命的，与上面描述的用于BMP4的策略相似将会采用一种策略使用“被loxP位点侧翼的”BMP2(BMP2^f/f)小鼠。使用一种病毒性或转基因的方法以两种单独的方法可以在该BMP2^f/f中进行BMP2的失活。该AAV-8-MUP-Cre是优选的因为重组只在该小鼠的注射中发生，并且不是在出生之前。可以用该病毒实现的时间特异性意味着该动物更少的暴露于低BMP2水平，这些水平可能使分析复杂化。用于该基于病毒的方法的对照物将与用于BMP4并且基于BMP2^f/f和一种eGFP病毒的那些是相似的以排除该被loxP位点侧翼的但非重组的等位基因或该病毒本身影响该小鼠的可能性。

在单独的PCR分析中将会进行成功的基因缺失的确认以寻找重组事件。通过本领域中的一位普通技术人员按常规进行了这些分析。蛋白质印迹分析作为一个附加的对照物将被进行以确保与图4中显示的分析相似的BMP2的缺失。

为了确定在没有肝脏切除术的情况下该条件性缺乏的小鼠是否具有一个基因型。肝脏重量将确定BMP2是否调节肝脏尺寸。对于任何可能的对肝脏以及骨髓的影响，肝脏功能测试和血细胞计数将被确定。由于SMAD介导BMP信号，并且SMAD4通过铁调素(hepcidin)表达已经显示出在铁代谢中具有一种作用(Wang等人，2005)，如在Yu等人中所描述的将对这些小鼠的铁、转铁蛋白以及铁蛋白的水平进行附加的研究(Yu et al.(2007)Nature ChemicalBiology，4：33-41)，其全部传授内容通过引用结合在此。

用以上描述的对照物通过用AAV-8-Cre感染被loxP位点侧翼的BMP2小鼠将产生肝脏特异性缺乏BMP2的小鼠。在2/3肝脏切除之后将会在6小时与7天之间对这些小鼠进行肝细胞增殖的检测。为了确定该作用机制，使用实时PCR和蛋白质印迹法将对缺乏BMP2的小鼠进行与该缺乏BMP4的小鼠的相似分析。为了进一步确定BMP2的缺失在肝脏切除术之后是否导致增强的肝细胞增殖，使用缺乏BMP2的小鼠BrdU结合和Ki-67染色法也被进行。在BMP2与BMP4小鼠之间增殖的任何差异将指向BMP2对BMP4的特异的功能，从而表明该途径的不同成员如何造成不同的功能。

C.确定ALK2/ALK3的肝脏特异性移除在损伤后是否增强肝脏修复

ALK3的移除在肝脏切除术之后是否增加了肝细胞增殖并且导致肝脏质量的更快速的恢复，这将在肝脏特异性缺乏Alk3的小鼠中被确定。其目标在于表征ALK3、一种BMP受体的损失在损伤之后对肝脏修复的影响。在鉴定一种高特异性的药物拮抗剂中，确定这些BMP受体中的哪一个正在介导该相关的信号是关键性的。如上面所描述的将产生一种“被loxP位点侧翼的”ALK3(AIk3^f/f)小鼠。为了确定该缺乏条件的小鼠在没有肝脏切除的情况下是否具有一个基因型，这些小鼠的一种广泛的调查将被进行以确定铁、转铁蛋白、铁蛋白、血细胞比容的水平以及贫血或异常红色细胞形态学的证据。

与BMP4相似，ALK3的失活可以以两种不同的方式进行：病毒的方法以及转基因的方法。用于该基于病毒的方法的对照物将使用具有一种eGFP病毒的ALK3^f/f以排除该被loxP位点侧翼的但非重组的等位基因具有可能使该分析复杂化的系统影响的可能性，或该病毒本身影响再生的可能性。

使用PCR分析基因缺失将被验证以寻找重组事件和蛋白质印迹以确保蛋白质去除。通过用AAV-8-MUP-Cre感染产生的肝脏特异性缺乏Alk3的小鼠将与接受AAV-8-MUP-GFP对照物病毒的被loxP位点侧翼的Alk3小鼠进行比较。在2/3肝脏切除之后将会在6小时与7天之间将对这些小鼠进行2/3肝脏切除之后肝细胞增殖的检测。为了确定该作用机制，使用实时PCR和蛋白质印迹法将进行与该缺乏BMP4小鼠的相似分析。如果该肝脏质量仍然与7天之后的对照物不同，这将表明Alk3可能被包括在肝脏尺寸的更长期的调整中。

类似地，使用已采用的相似的方法将采用肝脏特异性Alk2单敲除连同Alk2/AIk3双敲除(“缺乏”)小鼠以确定这些组分在肝脏再生中的这些特异的分子机制。

实例4

I 确定一种抑制BMP信号的药物或化学试剂在肝部分切除术之后是否可以改善肝细胞增殖、在损伤后增强肝脏修复，并且在大量肝切除或扑热息痛(泰

)过量给药之后改善了存活。

A.确定一种抑制BMP信号的药物或化学试剂在损伤之后(2/3肝切除)是否可以增强肝脏修复

C57B6小鼠将经历一系列配量方案，使用dorsomorphin或LDN193189，BMP信号的选择性抑制剂。也将采用在WO 2008/033408中描述的其他的化合物或通过在WO 2008/033408中描述的方法鉴定的化合物。首先，将产生用于这些化合物的肝脏的一种剂量响应曲线。由于BMP信号的抑制对影响Id-1和铁调素的表达是已知的，实时PCR和蛋白质印迹法作为一种独立的输出将被进行以评估该药物阻塞的效率。为了确定是否存在这些化合物的系统性影响，还将检测肝脏功能测试、铁、铁蛋白水平。这些适当的剂量将被确定为最低的剂量，该剂量在2/3肝切除(“肝部分切除”)后产生了肝细胞增殖的最大的增强。一旦这个被确定，小鼠在用dorsomorphin或LDN193189给药后将经历2/3肝切除。肝脏将会在6、24、36、48、72、96以及168小时处被收获。将单独用盐水处理对照物小鼠。Dorsomorphin影响肝细胞增殖的机制通过如上面描述的BrdU结合以及Ki-67标记分析将被评价。类似地，如上面描述的还将进行实时PCR和蛋白质印迹法以确定BMP表达的水平。

B.确定dorsomorphin或LDN193189是否在大量肝切除后增强存活(80％肝切除)

使用如所描述的多种给药方案，C57/B6小鼠如上面描述的将经历80％肝切除。将用dorsomorphin或LDN193189给药的小鼠与作为一种对照物的接受盐水的小鼠进行比较。将产生卡普兰-迈耶曲线。在48小时和96小时处在存活者中将收获肝脏，然后在7天时用于评估肝细胞健康的组织学以及评价肝细胞增殖的BrdU结合。TUNEL标记将被用于评价凋亡的水平。基于先前的观察在没有干涉的情况下30％的存活率是预期的。功率计算表明22个对照物小鼠和22个接受药物将是足够的。

C.确定dorsomorphin或LDN193189是否在扑热息痛(泰

)配药过量后增强存活

在接受dorsomorphin或LDN193189之后将以300mg/kg扑热息痛(泰

)对小鼠进行给药。在实验动物中该剂量将被调整以产生70％的死亡率。接受盐水的对照物动物将作为对照物起作用。采用至少22个对照物小鼠和22个实验小鼠。将产生用于存活率的剂量响应曲线。在48小时和96小时处将进行组织学，并且在7天时再次评估肝细胞健康并且通过BrdU分析将评价肝细胞增殖。使用TUNEL染色法将对凋亡进行评价。

尽管很有可能的是增强肝细胞增殖能够使存活率的平衡倾斜，来自扑热息痛(泰)肝细胞坏死可以使这些肝细胞不能对增殖性刺激物应答。在人类中，肝细胞在扑热息痛(泰

)毒性之后增殖，但在没有用于该小鼠的生命支撑的情况下，这可能是不可行的。

在此引用的所有专利、公开申请以及参考文献的传授的内容都通过引用以其全部内容结合在此。

虽然通过参考其实例性的实施方案本发明已经进行了具体的展示和说明，本领域普通技术人员应当理解的是在不偏离由所附权利要求所包括的本发明的范围下其中可以在形式和细节方面进行多种改变。

Claims

1.一种骨形态发生蛋白(BMP)信号传导途径的拮抗剂，用于在肝脏的治疗中使用。

2.根据权利要求1所述的一种拮抗剂，用于在治疗肝脏损伤或疾病中使用。

3.根据权利要求1或权利要求2所述的一种拮抗剂，用于其中描述的用途；其中所述治疗是预防性治疗。

4.如在任何以上权利要求中描述的一种拮抗剂，用于其中描述的用途；其中该拮抗剂增加了肝细胞的增殖。

5.如在任何以上权利要求中描述的一种拮抗剂，用于其中描述的用途；其中该拮抗剂抑制或下调了一种组成上有活性的BMP信号传导途径。

6.如在权利要求5中描述的一种拮抗剂，用于其中描述的用途；其中所述BMP信号传导途径是一种BMP2或BMP4-介导的信号传导途径。

7.如在权利要求5中描述的一种拮抗剂，用于其中描述的用途；其中所述BMP信号传导途径的所述拮抗剂抑制了I型BMP受体信号传导。

8.如在权利要求7中描述的一种拮抗剂，用于其中描述的用途；其中所述BMP信号传导途径的所述拮抗剂通过结合到所述I型受体上抑制了I型BMP受体信号传导。

9.如在权利要求7或8中描述的一种拮抗剂，用于其中描述的用途；其中所述I型BMP受体是ALK2、ALK3或ALK6。

10.如在权利要求9中描述的一种拮抗剂，用于其中描述的用途；其中所述I型BMP受体是ALK2或ALK3。

11.如在权利要求5中描述的一种拮抗剂，用于其中描述的用途；其中所述BMP信号传导途径的所述拮抗剂抑制了smad-1、5或8的磷酸化。

12.如在权利要求5中描述的一种拮抗剂，用于其中描述的用途；其中所述BMP信号传导途径的所述拮抗剂抑制了BMP2或BMP4结合到一种BMP受体上或一种II型BMP受体与一种I型BMP受体的相互作用。

13.如在任何以上权利要求中描述的一种拮抗剂，用于其中描述的用途；其中该拮抗剂是一种化学试剂。

14.如在权利要求13中描述的一种拮抗剂，用于其中描述的用途；其中该化学试剂是dorsomorphin、LDN193189或任何上述物质的一种类似物。

15.如权利要求1至14中任何一项所描述的一种拮抗剂，用于在肝脏再生中的使用。

16.如权利要求1至14中任何一项所描述的一种拮抗剂，用于在对肝脏的部分损失或损伤的治疗中。

17.如在权利要求16中描述的一种拮抗剂，用于其中描述的用途；其中所述损失或损伤由一种外科或移植操作引起。

18.如在权利要求17中描述的一种拮抗剂，用于其中描述的用途；其中所述外科操作是肝脏切除术。

19.如在权利要求17中描述的一种拮抗剂，用于其中描述的用途；其中该损失或损伤是肝脏功能不全。

20.根据权利要求16至19中任何一项所述的一种拮抗剂，用于其中描述的用途；其中所述治疗先于所述损伤。

21.如在任何以上权利要求中描述的一种拮抗剂，用于其中描述的用途；其中所述用途是关于一种哺乳动物的治疗。

22.如在任何以上权利要求中描述的一种拮抗剂，用于其中描述的用途；其中所述用途是关于人类的治疗。

23.如权利要求1至22中任何一项所描述的一种拮抗剂，用于其中描述的用途；其中所述用途是关于肝脏移植供体的治疗。

24.如权利要求1至22中任何一项所描述的一种拮抗剂，用于其中描述的用途；其中所述用途是关于肝脏移植接受者的治疗。

25.如权利要求2或它的任何从属权利要求所述的一种拮抗剂，用于其中描述的用途；其中所述肝脏损伤由一种肝毒性化学试剂引起。

26.如在权利要求25中描述的一种拮抗剂，用于其中描述的用途；其中所述肝毒性化学试剂是扑热息痛。

27.如在任何以上权利要求中所描述的一种拮抗剂，用于由一种肝脏疾病引起的肝脏损伤的治疗中，该肝脏疾病选自下组，该组由以下各项组成：甲型肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎、其他的肝炎病毒感染、自身免疫性肝炎、肝硬化、胆汁性肝硬化、急性肝衰竭、慢性肝衰竭、急性肝衰竭、急性肝脏感染、癌症、血铜蓝蛋白缺乏症、吉耳伯特综合征、雷氏综合征、Alagille综合征、血色素沉着症、苯丙酮尿症以及其他的氨基酸代谢病、血友病以及其他的凝血因子缺乏病、家族性血胆固醇过多以及其他的脂类代谢紊乱、尿素循环障碍、果糖血症、糖原病、酪氨酸血症、半乳糖血症、蛋白质和碳水化合物代谢缺乏病、有机酸尿症、线粒体疾病、过氧化物酶体以及溶酶体失调、蛋白质合成异常、肝细胞转运蛋白缺陷症、糖基化缺陷症、急性化学毒性、胆管炎、α-1-抗胰蛋白酶缺陷症、胆道闭锁、肝脏的囊性病、脂肪肝、半乳糖血症、胆结石、卟啉症、原发性硬化性胆管炎、肉样瘤病、酪氨酸血症以及1型糖原贮积病。

28.一种在人类或动物体外部进行的方法，该方法包括对肝脏、对肝脏的一部分、或对肝细胞给予一种拮抗剂；其中所述拮抗剂是如任何以上的权利要求中描述的一种拮抗剂。

29.一种包括肝脏、肝脏的一部分或肝细胞的组合物，所述组合物进一步包括一种拮抗剂；其中所述拮抗剂是如任何以上权利要求中所描述的一种拮抗剂并且其中所述肝脏、肝脏的一部分或肝细胞不是位于该人类或动物体内。

30.根据权利要求29所述的一种组合物；用在移植中。