CN110221081A - 视黄醇结合蛋白胶乳试剂r2及其制备方法和试剂盒 - Google Patents

视黄醇结合蛋白胶乳试剂r2及其制备方法和试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种视黄醇结合蛋白胶乳试剂R2，为pH为7.0～8.0的缓冲体系，包含有：视黄醇结合蛋白单克隆抗体包被的羧基化聚苯乙烯胶乳溶液：400～600mL/L和恢复液，恢复液包含稳定剂、表面活性剂和电解质，稳定剂为5～10g/L，表面活性剂为2～5g/L，电解质为5～15g/L；恢复液中各组分的含量是指占整个缓冲体系的含量。胶乳溶液由羧基化聚苯乙烯胶乳微球经EDC活化后偶联视黄醇结合蛋白单克隆抗体，并由PAMAM维持偶联效率，最后经封闭剂封闭反应得到。还提供上述视黄醇结合蛋白胶乳试剂R2的具体制备方法及视黄醇结合蛋白胶乳试剂盒。本发明的视黄醇结合蛋白胶乳试剂R2，偶联效率高且分散性好，检测灵敏度高、准确性好。本发明的制备方法，生产效率提高且成本降低。

Description

视黄醇结合蛋白胶乳试剂R2及其制备方法和试剂盒
技术领域
本发明属于视黄醇结合蛋白胶乳试剂合成技术领域，尤指一种视黄醇结合蛋白胶乳试剂R2及其制备方法和应用视黄醇结合蛋白胶乳试剂R2的试剂盒。
背景技术
视黄醇结合蛋白是由肝脏合成的维生素转运蛋白，属于Lipocalin蛋白超家族成员，广泛分布于血液、脑脊液、尿液及其他体液中。视黄醇结合蛋白的测定有利于发现早期的肾小管以及肾近曲小管的损害程度，且能作为肝功能早期损害和监护治疗指标。
视黄醇结合蛋白检测试剂盒用于体外检测人血清中视黄醇结合蛋白的含量，包括试剂R1和试剂R2。试剂R1主要包括缓冲液，聚乙二醇、乙二胺四乙酸二钠等。缓冲液通常为磷酸盐缓冲液和Tris缓冲液。目前检测视黄醇结合蛋白的方法主要有酶联免疫法、放射免疫测定法、胶乳免疫比浊法等。其中胶乳免疫比浊法采用视黄醇结合蛋白胶乳试剂R2，因其具有较高的灵敏度、良好的特异性、较宽的线性范围受到了广泛的关注。
但目前市场上大部分制备视黄醇结合蛋白胶乳试剂R2的胶乳免疫比浊法为一步法或两步法。两步法在制备的过程中，需要对缓冲体系进行两次离心分离和分散，导致操作繁琐，且对于生产人员的操作要求较高，不仅影响生产效率，导致生产成本高，且质量无法统一，质量稳定性欠佳；同时制备的胶乳试剂通常存在偶联效率低，容易聚沉，检测灵敏度、准确性均欠佳的缺点，故而越来越多的生产企业倾向于一步法制备胶乳试剂。然而，一步法虽然在一定程度上较少了离心分离和分散的步骤，但依然需要在最后对缓冲体系进行离心吹打，且仍然存在生产效率低，生产成本高，且质量稳定性欠佳，制备的胶乳试剂通常存在偶联效率低，容易聚沉，检测灵敏度、准确性均欠佳的缺点。
因此，有必要研发新的视黄醇结合蛋白胶乳试剂R2及其制备方法，以克服现有技术中的上述技术缺陷。
发明内容
本发明的第一个目的是提供一种视黄醇结合蛋白胶乳试剂R2，其偶联效率高，分散性好，可有效避免聚沉，且检测灵敏度高，准确性好。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种视黄醇结合蛋白胶乳试剂R2，所述视黄醇结合蛋白胶乳试剂R2为pH为7.0～8.0的缓冲体系，所述缓冲体系包含有：视黄醇结合蛋白单克隆抗体包被的羧基化聚苯乙烯胶乳溶液和恢复液，所述胶乳溶液在整个缓冲体系中的含量为400～600mL/L，其中：
所述恢复液包含稳定剂、表面活性剂和电解质，所述稳定剂的含量为5～10g/L，表面活性剂的含量为2～5g/L，电解质的含量为5～15g/L；所述恢复液中各组分的含量是指占整个缓冲体系的含量；
所述胶乳溶液为pH为5.0～6.0的缓冲溶液，包括：粒径为50～200nm的羧基化聚苯乙烯胶乳微球、活化用的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC)、偶联加速用的聚酰胺-胺树枝状高分子(PAMAM)和封闭剂；所述羧基化聚苯乙烯胶乳微球的含量为10～15g/L，所述EDC的含量为0.5～1g/L，所述PAMAM的含量为1～4g/L，所述封闭剂的含量为2.5～5g/L；所述胶乳溶液中各组分的含量是指占整个胶乳溶液的含量；
所述胶乳溶液由羧基化聚苯乙烯胶乳微球经EDC活化后偶联视黄醇结合蛋白单克隆抗体，并由PAMAM维持偶联效率，最后经封闭剂封闭反应得到。
优选地，所述恢复液在整个缓冲体系中的含量为400～600mL/L。
优选地，所述恢复液，还包括防腐剂，所述防腐剂在所述缓冲体系中的浓度为0.5～5g/L。
优选地，所述恢复液还包括表面活性剂PAMAM，以提高胶乳的分散稳定性，从而减少试剂R2的聚沉，使得试剂R2在检测视黄醇结合蛋白的过程中，抗体与检测样本中的抗原反应的几率进一步增加，因此进一步提高检测灵敏度和准确性。
进一步优选地，作为表面活性剂的PAMAM在所述缓冲体系中的浓度为0.5～5g/L。
优选地，所述视黄醇结合蛋白单克隆抗体在所述缓冲体系中的浓度为0.2～0.5g/L。
优选地，所述封闭剂可以选自牛血清蛋白(BSA)溶液、CE210和CE510中的一种或几种。
所述的CE210和CE510购买自生产商SR Life Sciences。
所述表面活性剂可以选自聚氧乙烯月桂醚和PAMAM溶液中的一种或两种；
本领域技术人员很容易理解，所述稳定剂可以选自BSA溶液、氯化胆碱、d-甘露糖醇中的一种或几种；优选为BSA溶液。
所述电解质可以选自氯化钠、氯化钾、硫酸钠中的一种或几种；优选为氯化钠。
所述防腐剂可以选自叠氮钠、proclin300中的一种或两种；优选为叠氮钠。
所述缓冲体系可以为磷酸盐缓冲体系、Tris缓冲体系中的一种或两种；优选为磷酸盐缓冲体系。
所述缓冲溶液为磷酸盐缓冲溶液、Tris缓冲液中的一种或两种；优选为磷酸盐缓冲溶液。
本发明的第二个目的在于提供一种制备上述的视黄醇结合蛋白胶乳试剂R2的方法，包括如下制备步骤：
(1)、将配方量的羧基化聚苯乙烯胶乳微球缓慢滴加分散在缓冲溶液中，加入配方量的EDC溶液，搅拌活化，同时滴加配方量的PAMAM溶液，得到初始液；
(2)、往步骤(1)制备的初始液中加入视黄醇结合蛋白单克隆抗体进行偶联反应，反应结束后加入配方量的封闭剂进行封闭反应，并超声分散，得到视黄醇结合蛋白单克隆抗体包被的羧基化聚苯乙烯胶乳溶液；
(3)、将适量的恢复液加入到步骤(2)的胶乳溶液中，并调节pH至7.0～8.0，即得视黄醇结合蛋白胶乳试剂R2。
优选地，所述羧基化聚苯乙烯胶乳微球的粒径为50～200nm。
优选地，所述EDC溶液中的EDC的浓度为10～20g/L。
本发明中，所述的活化时间、偶联反应时间、封闭反应时间均为本领域的常规时间。
在一些优选实施例中，所述步骤(1)中，所述活化的时间为10～20分钟；所述步骤(2)中，所述偶联反应的时间为1～2小时，所述封闭反应的时间为0.5～1.5小时。
在上述优选时间范围内，制备得到本发明的试剂R2性能最佳。
需要说明的是，本发明中，所述的室温通常为15～25℃。调节pH采用盐酸或氢氧化钠溶液。通常采用0.1mol/L的HCl或0.1mol/L的NaOH调节试剂R2的pH。
根据本发明，所述PAMAM溶液中PAMAM的质量浓度为50～150g/L。
根据本发明的优选实施例，所述PAMAM溶液中PAMAM的质量浓度为100g/L。
本发明中，所述磷酸盐缓冲溶液的浓度为50～220mmol/L，优选为100～150mmol/L。
本发明的第三个目的在于提供一种视黄醇结合蛋白试剂盒，所述视黄醇结合蛋白试剂盒包括试剂R1，及上述任一项的视黄醇结合蛋白胶乳试剂R2。
根据本发明，所述试剂R1与试剂R2的体积比为2～4:1，优选为3:1。
根据本发明，所述视黄醇结合蛋白试剂盒中的试剂R1为含5g/L聚乙二醇、2.5g/L的NaCl、1g/L的乙二胺四乙酸二钠的磷酸盐缓冲液，pH为7.0～8.0。
根据本发明，所述试剂盒的检测范围为：5～210mg/L，优选为18～200mg/L。
本发明取得的积极进步效果在于：
(1)、本发明的视黄醇结合蛋白胶乳试剂R2，加入的聚酰胺-胺树枝状高分子PAMAM溶液可有效降低EDC水解失活的速度，从而提高活化和偶联效率；同时，PAMAM作为一种优良的纳米级表面活性剂，能够提高视黄醇结合蛋白单克隆抗体在偶联体系中的分散性，视黄醇结合蛋白单克隆抗体以树枝状PAMAM高分子为模板与胶乳微球偶联，生成的偶联化合物呈树枝结构向外围溶液分散，避免了胶乳试剂的聚沉，分散性好；所制得的试剂R2在检测视黄醇结合蛋白的过程中，试剂R2中的抗体与检测样本中的抗原反应的几率增加，偶联率高，因此检测灵敏度高，准确性好。
(2)、本发明的视黄醇结合蛋白胶乳试剂R2的制备方法，胶乳包被的过程无需离心、过滤、再分散等更换缓冲液以及吹打胶乳试剂的步骤，极大地简化了操作步骤，降低了生产成本，对于生产人员的操作要求降低，质量稳定性更好，且偶联率高，有效避免了胶乳试剂的聚沉，分散性好，因此检测灵敏度高、准确性好。
(3)、本发明的视黄醇结合蛋白试剂盒，包括本发明的胶乳试剂R2，具有检测简单而快速、质量稳定性好，检测灵敏度高、准确性好、抗干扰能力强以及操作便捷的优点。
附图说明
图1、采用不同方法制备的视黄醇结合蛋白检测试剂R2应用于检测试剂盒，用于检测不同浓度的视黄醇结合蛋白的吸光度曲线。其中：
曲线A、B、C分别表示实施例1-3制备的视黄醇结合蛋白检测试剂R2的吸光度曲线。曲线D、E、F分别表示对比例1-3制备的视黄醇结合蛋白检测试剂R2的吸光度曲线。曲线G、H、I分别表示对比例4-6制备的视黄醇结合蛋白检测试剂R2的吸光度曲线。
横坐标(浓度,mg/L)，纵坐标(吸光度)。
图2、采用不同方法制备的视黄醇结合蛋白检测试剂R2在37℃下放置不同时间的粒径对比曲线。其中，横坐标(时间，h),纵坐标(粒径，nm)。
具体实施方式
以下实施例中，采用的部分原料如下：
视黄醇结合蛋白抗体：单克隆抗体。视黄醇结合蛋白标准液：购自西门子公司。
羧基化聚苯乙烯胶乳微球：直径为50-200nm，购自Bangs Laboratories Inc.公司
聚酰胺-胺树枝状高分子溶液(PAMAM溶液)购自sigma公司，PAMAM溶液中的PAMAM的含量100g/L。
其他原料也均为市售。
以下实施例中涉及的溶液均为水溶液。
以下通过具体实施例，阐述本发明的优选技术方案。
实施例1、视黄醇结合蛋白胶乳试剂R2的制备
本实施例中，视黄醇结合蛋白胶乳试剂R2的制备具体包括如下步骤：
(1)、取25mg粒径为90nm的羧基化聚苯乙烯胶乳微球置于反应杯中，向反应杯中缓慢滴加1.6mL浓度为100mmol/L，pH为6.0的磷酸盐缓冲溶液；
(2)、向反应杯中加入新鲜配制的0.1mL浓度为10g/L的EDC溶液进行搅拌活化15分钟，活化搅拌过程中同时滴加入0.04mLPAMAM溶液；
(3)、向反应杯中加入1.25mg视黄醇结合蛋白单克隆抗体，室温反应1.5h；
(4)、向反应杯中加入0.1mL浓度为100g/L的牛血清蛋白溶液，室温反应1.5h；
(5)、将步骤(4)反应后所得溶液超声，超声条件：200W，4℃，2sx10次，间隔4s，得到经超声分散的溶液；
(6)、往步骤(5)经超声分散的溶液中加入2mL恢复液，并调节试剂的最终pH为7.4，磷酸盐缓冲体系的最终总体积约为4mL。
所述步骤(6)中，所述恢复液的组成和含量分别为：浓度为220mmol/L的磷酸盐缓冲溶液，浓度为20g/L的氯化钠溶液，浓度为1g/L的PAMAM溶液，浓度为10g/L的聚氧乙烯月桂醚溶液，浓度为15g/L的牛血清白蛋白溶液，浓度为3g/L的叠氮钠。
所述恢复液加入试剂体系后，恢复液中各组分占整个磷酸盐缓冲体系的含量为：氯化钠10g/L，PAMAM溶液0.5g/L，聚氧乙烯月桂醚5g/L，牛血清白蛋白7.5g/L，叠氮钠1.5g/L。所述磷酸盐缓冲体系的磷酸盐浓度为150mmol/L。
实施例2、视黄醇结合蛋白胶乳试剂R2的制备
本实施例中，视黄醇结合蛋白胶乳的制备具体包括如下步骤：
(1)、取25mg粒径为200nm的羧基化聚苯乙烯胶乳微球置于反应杯中，向反应杯中缓慢滴加1.6mL浓度为50mmol/L，pH为5.0的磷酸盐缓冲溶液；
(2)、向反应杯中加入新鲜配制的0.1mL浓度为10g/L的EDC溶液进行搅拌活化20分钟，活化搅拌过程中同时滴加入0.02mL PAMAM溶液；
(3)、向反应杯中加入1.25mg视黄醇结合蛋白单克隆抗体，室温反应1h；
(4)、向反应杯中加入0.1mL浓度为75g/L的牛血清蛋白BSA溶液，室温反应0.5h；
(5)、将步骤(4)反应后所得溶液超声，超声条件：200W，4℃，2s x 10次，间隔4s，得到经超声分散的胶乳溶液；
(6)、往步骤(5)的胶乳溶液中加入2mL恢复液，并调节试剂的最终pH为7.0，。磷酸盐缓冲体系的最终总体积约为4mL。
所述步骤(6)中，所述恢复液的组成和含量分别为：浓度为220mmol/L的磷酸盐缓冲溶液，浓度为30g/L的氯化钠溶液，浓度为10g/L的PAMAM溶液，浓度为4g/L的聚氧乙烯月桂醚溶液，浓度为20g/L的牛血清白蛋白溶液，浓度为1g/L的叠氮钠。
所述恢复液加入试剂体系后，恢复液中各组分占整个磷酸盐缓冲体系的含量为：氯化钠15g/L，PAMAM溶液5g/L，聚氧乙烯月桂醚2g/L，牛血清白蛋白10g/L，叠氮钠0.5g/L。所述磷酸盐缓冲体系的磷酸盐浓度为130mmol/L。
实施例3、视黄醇结合蛋白胶乳试剂R2的制备
本实施例中，视黄醇结合蛋白胶乳的制备具体包括如下步骤：
(1)、取25mg粒径为50nm的羧基化聚苯乙烯胶乳微球置于反应杯中，向反应杯中缓慢滴加1.6mL浓度为100mmol/L，pH为6.0的磷酸盐缓冲溶液；
(2)、向反应杯中加入新鲜配制的0.1mL浓度为20g/L的EDC溶液进行搅拌活化10分钟，活化搅拌过程中同时滴加入0.08mL PAMAM溶液；
(3)、向反应杯中加入1.25mg视黄醇结合蛋白单克隆抗体，室温反应2h；
(4)、向反应杯中加入0.1mL浓度为50g/L的牛血清蛋白溶液，室温反应1.5h；
(5)、将步骤(4)反应后所得溶液超声，超声条件：200W，4℃，2s x 10次，间隔4s，得到经超声分散的胶乳溶液；
(6)、往步骤(5)的胶乳溶液中加入2mL恢复液，并调节试剂的最终pH为8.0，磷酸盐缓冲体系的最终总体积约为4mL。
所述步骤(6)中，所述恢复液的组成和含量分别为：浓度为160mmol/L的磷酸盐缓冲溶液，浓度为10g/L的氯化钠溶液，浓度为4g/L的PAMAM溶液，浓度为6g/L的聚氧乙烯月桂醚溶液，浓度为10g/L的牛血清白蛋白溶液，浓度为10g/L的叠氮钠。
所述恢复液加入试剂体系后，恢复液中各组分占整个磷酸盐缓冲体系的含量为：氯化钠5g/L，PAMAM溶液2g/L，聚氧乙烯月桂醚3g/L，牛血清白蛋白5g/L，叠氮钠5g/L。所述磷酸盐缓冲体系的磷酸盐浓度为120mmol/L。
对比例1-3、视黄醇结合蛋白胶乳试剂R2的制备
对比例1-3采用0步法不加PAMAM溶液包被视黄醇结合蛋白胶乳试剂，分别对应与实施例1-3作对比。对比例1-3中羧基化聚苯乙烯胶乳微的粒径分别与实施例1-3对应。
对比例1-3的基本步骤与实施例1-3相同，区别在于，在步骤(2)的搅拌活化过程中不加入PAMAM溶液进行偶联，以及在恢复液中不含有作为表面活性剂的PAMAM溶液。
以下对比例4-6采用常规1步法制备视黄醇结合蛋白胶乳试剂，分别对应与实施例1-3作对比。对比例4-6中羧基化聚苯乙烯胶乳微的粒径分别与实施例1-3对应。
对比例4、常规一步法包被视黄醇结合蛋白胶乳试剂R2的制备
本对比例4与实施例1对比，基本参数参考实施例1，具体制备方法如下：
(1)、取25mg粒径为90nm的羧基化聚苯乙烯胶乳微球置于反应杯中，向反应杯中缓慢滴加1.6mL浓度为100mmol/L，pH为6.0的磷酸盐缓冲溶液；
(2)、向反应杯中加入新鲜配制的0.1mL浓度为10g/L的EDC溶液进行搅拌活化15分钟；
(3)、向反应杯中加入1.25mg视黄醇结合蛋白单克隆抗体，室温反应1.5h；
(4)、向反应杯中加入0.1mL浓度为100g/L的牛血清蛋白溶液，室温反应1.5h；
(5)、将步骤(4)反应后所得溶液离心洗涤并吹打两次，得到离心沉淀；
(6)、将步骤(5)所得离心沉淀加入4mL恢复液，吹打后进行超声分散，超声条件：200W，4℃，2s x 10次，间隔4s；调节试剂的最终pH为7.4。
所述步骤(6)中，所述恢复液的组成和含量分别为：浓度为150mmol/L的磷酸盐缓冲溶液，浓度为10g/L的氯化钠溶液，浓度为5g/L的聚氧乙烯月桂醚溶液，浓度为7.5g/L的牛血清白蛋白溶液，浓度为1.5g/L的叠氮钠。
所述恢复液加入试剂体系后，恢复液中各组分占整个磷酸盐缓冲体系的含量为：磷酸盐缓冲溶液150mmol/L，氯化钠10g/L，聚氧乙烯月桂醚5g/L，牛血清白蛋白7.5g/L，叠氮钠1.5g/L。
对比例5、常规一步法包被视黄醇结合蛋白胶乳试剂的制备
本对比例5与实施例2对比，基本参数参考实施例2，具体制备方法如下：
(1)、取25mg粒径为200nm的羧基化聚苯乙烯胶乳微球置于反应杯中，向反应杯中缓慢滴加1.6mL浓度为50mmol/L，pH为5.0的磷酸盐缓冲溶液；
(2)、向反应杯中加入新鲜配制的0.1mL浓度为10g/L的EDC溶液进行搅拌活化20分钟；
(3)、向反应杯中加入1.25mg视黄醇结合蛋白单克隆抗体，室温反应1h；
(4)、向反应杯中加入0.1mL浓度为75g/L的牛血清蛋白BSA溶液，室温反应0.5h；
(5)、将步骤(4)反应后所得溶液离心洗涤并吹打两次，得到离心沉淀；
(6)、将步骤(5)所得离心沉淀加入4mL恢复液，吹打后进行超声分散，超声条件：200W，4℃，2s x 10次，间隔4s；调节试剂的最终pH为7.0。
所述步骤(6)中，所述恢复液的组成和含量分别为：浓度为130mmol/L的磷酸盐缓冲溶液，浓度为15g/L的氯化钠溶液，浓度为4g/L的聚氧乙烯月桂醚溶液，浓度为10g/L的牛血清白蛋白溶液，浓度为0.5g/L的叠氮钠。
所述恢复液加入试剂体系后，恢复液中各组分占整个磷酸盐缓冲体系的含量为：磷酸盐缓冲溶液130mmol/L，氯化钠15g/L，聚氧乙烯月桂醚2g/L，牛血清白蛋白10g/L，叠氮钠0.5g/L。
对比例6、常规一步法包被视黄醇结合蛋白胶乳试剂的制备
本对比例6与实施例3对比，基本参数参考实施例3，具体制备方法如下：
(1)、取25mg粒径为50nm的羧基化聚苯乙烯胶乳微球置于反应杯中，向反应杯中缓慢滴加1.6mL浓度为100mmol/L，pH为6.0的磷酸盐缓冲溶液；
(2)、向反应杯中加入新鲜配制的0.1mL浓度为20g/L的EDC溶液进行搅拌活化10分钟；
(3)、向反应杯中加入1.25mg视黄醇结合蛋白单克隆抗体，室温反应2h；
(4)、向反应杯中加入0.1mL浓度为50g/L的牛血清蛋白溶液，室温反应1.5h；
(5)、将步骤(4)反应后所得溶液离心洗涤并吹打两次，得到离心沉淀；
(6)、将步骤(5)所得离心沉淀加入4mL恢复液，吹打后进行超声分散，超声条件：200W，4℃，2s x 10次，间隔4s；调节试剂的最终pH为8.0。
所述步骤(6)中，所述恢复液的组成和含量分别为：浓度为120mmol/L的磷酸盐缓冲溶液，浓度为5g/L的氯化钠溶液，浓度为3g/L的聚氧乙烯月桂醚溶液，浓度为5g/L的牛血清白蛋白溶液，浓度为5g/L的叠氮钠。
所述恢复液加入试剂体系后，恢复液中各组分占整个磷酸盐缓冲体系的含量为：磷酸盐缓冲溶液120mmol/L，氯化钠5g/L，聚氧乙烯月桂醚3g/L，牛血清白蛋白5g/L，叠氮钠5g/L。
实施例4、视黄醇结合蛋白的测定
本实施例涉及的检测仪器包括:东芝40全自动生化分析仪(TBA-40FR)，粒度分析仪(ZatasizerNano)。检测参数如表1所示，表1中，R1表示视黄醇结合蛋白检测试剂盒的试剂R1，R2表示视黄醇结合蛋白检测试剂盒的试剂R2，S表示含视黄醇结合蛋白的溶液或视黄醇结合蛋白样本。
表1 视黄醇结合蛋白的测定参数
收取医院高浓度临床视黄醇结合蛋白样本，稀释成8个浓度，分别用实施例1-3，和对比例1-6的方法制备的胶乳试剂作为试剂R2进行测试，记录每个浓度点下的吸光度，结果如表2所示。不同方法包被胶乳试剂R2对抗原的反应曲线如图1所示。
表2、采用不同胶乳试剂R2进行视黄醇结合蛋白测试结果
表2和图1可知：相同的羧基化聚苯乙烯胶乳微球粒径条件下，实施例1的胶乳试剂的吸光度远高于对比例1的吸光度，实施例2的胶乳试剂的吸光度远高于对比例2的吸光度，实施例3的胶乳试剂的吸光度远高于对比例3的吸光度，说明不加PAMAM的0步法胶乳试剂与抗原反应能力较差，在样本浓度值在145mg/L以上时，吸光度几乎只有0步法加PAMAM制备的胶乳试剂的一半，根本无法达到线性高值。而在采用EDC溶液进行活化的过程中加入PAMAM溶液偶联加速用后，采用0步法可以制备出吸光度高的胶乳试剂R2，说明PAMAM的加入确实能够提高视黄醇结合蛋白抗体胶乳包被的偶联效率，使得实施例1-3制备的胶乳试剂中的抗体与检测样本中的抗原反应的几率增加，从而检测灵敏度高，准确性好。
实施例1的吸光度略高于对比例4，实施例2的吸光度略高于对比例5，实施例3的吸光度略高于对比例6，即0步法加入PAMAM溶液制备的胶乳试剂R2中抗体与样本中抗原的反应高于1步法的水平，说明PAMAM的加入确实提高了视黄醇结合蛋白抗体胶乳包被的偶联效率，且胶乳包被的过程无需离心、过滤等更换缓冲液以及吹打胶乳试剂的步骤，极大地简化了操作步骤，降低了生产成本。
同时，实施例2采用较大粒径的羧基化聚苯乙烯胶乳微球，在视黄醇结合蛋白低浓度范围内(例如表2中的5～50mg/L)，吸光度略高于实施例1制备的试剂R2的吸光度，说明大粒径的胶乳微球在视黄醇结合蛋白低浓度范围时有利于提高试剂的灵敏度。
实施例3采用较小粒径的羧基化聚苯乙烯胶乳微球，视黄醇结合蛋白高浓度范围内(例如表2中的145～210mg/L)，吸光度略高于实施例1实施例1制备的试剂R2的吸光度，说明小粒径的胶乳微球在视黄醇结合蛋白高浓度范围时有利于提高试剂的灵敏度。
使用时可根据实际粒径选择合适的浓度范围以进一步提高试剂R2的检测灵敏度。
由表2的结果可知，所述试剂R2的检测范围为：5～210mg/L，因此，采用所述试剂R2的试剂盒的检测范围为5～210mg/L。
实施例5、0步法添加PAMAM对试剂分散性的影响
实施例1-3、对比例1-6制备的胶乳试剂分别在37℃放置不同时间，然后测试胶乳试剂的粒径，结果如表3所示。不同方法包被的胶乳试剂R2在37℃下放置不同时间的粒径对比曲线如图2所示。
表3 不同包被方法制备的胶乳试剂的粒径对比
由表3和图2可知：在37℃下，0步法加PAMAM制成的胶乳试剂粒径范围较集中，稳定性好，明显优于不加PAMAM试剂的0步法及1步法，说明PAMAM能有效提高0步法制备的胶乳试剂的分散性，可有效避免胶乳试剂的聚沉。
实施例6、视黄醇结合蛋白检测试剂盒性能评价
视黄醇结合蛋白检测试剂盒包括试剂R1和试剂R2，其中：
试剂R1：含5g/L聚乙二醇、2.5g/LNaCl、1g/L乙二胺四乙酸二钠的磷酸盐缓冲液，pH为7.0-8.0。
试剂R2：实施例1制备的视黄醇结合蛋白胶乳试剂R2。
(1)、外观评估
在自然光线下目视检查，视黄醇结合蛋白胶乳试剂R1为无色澄清溶液，视黄醇结合蛋白胶乳试剂R2为乳白色溶液。
(2)、空白吸光度评估
以蒸馏水为空白样本进行检测，测试后所得试剂的空白吸光度为0.63。
(3)、线性范围评估
用0.9％NaCl溶液将浓度接近线性范围上限的高值浓度的视黄醇结合蛋白抗体样本稀释成至少5个浓度，其中低值浓度的样本接近线性范围的下限。本实施例中，稀释成浓度的预期值分别为0、18、36、72、144和200mg/L。对每一浓度的样本重复测试3次，取测试的平均值。测试结果如表4所示。
表4 线性范围评估结果
从表4的数据可知，本发明的视黄醇结合蛋白检测试剂盒的最高检测范围可达200mg/L。经计算，线性回归相关系数R2≥0.99，说明本发明的视黄醇结合蛋白检测试剂盒的检测范围至少为18～200mg/L，因此检测范围宽，且灵敏度高。
(4)、重复性评估
使用两个视黄醇结合蛋白抗原浓度不同的人血清样本：样本1和样本2进行重复性评估，每个样本测20次，评估视黄醇结合蛋白检测试剂盒的重复性。结果如表5所示。
表5 重复性评估结果
参数 样本1 样本2
最小值(mg/L) 40.4 69.5
最大值(mg/L) 41.7 70.9
平均值(mg/L) 41.19 70.54
标准差(S) 0.326 0.365
变异系数(CV) 0.79％ 0.52％
从表5的结果可知，两个浓度的样本经本发明的视黄醇结合蛋白检测试剂盒检测后，CV分别为0.79％和0.52％，远小于标准(YY/T_1584-2018视黄醇结合蛋白测定试剂盒(免疫比浊法))规定的CV≤10％的要求。说明本发明的视黄醇结合蛋白检测试剂盒的批内重复性很好。
(5)、准确度评估
取人血清样本，等体积分成3份，在其中两份中加入不同浓度相同体积的视黄醇结合蛋白标准液，制备成待回收的分析样本1和分析样本2；在另一份中加入同样体积的蒸馏水，制备成基础样本。以上三个样本各重复测试3次，得到回收浓度，并计算回收率。
回收率＝[回收浓度/加入浓度]×100％
结果如表6所示：
表6 准确度评估结果
两分析样本的平均回收率为(99％+101％)/2＝100％，计算每个样本的回收率与平均回收率的差值：
分析样本1：99％-100％＝-1％。
分析样本2：101％-100％＝1％。
两分析样本回收率与平均回收率的差值小于±10％，说明本发明的视黄醇结合蛋白检测试剂盒的检测准确度高。
(6)、干扰性能评估
在相同的人血清样本中分别加入不同含量的干扰物质：血红蛋白、胆红素、甘油三酯和维生素C，然后通过实施例6的试剂盒检测样本中视黄醇结合蛋白的含量。试验结果如表7所示。其中：
回收率＝[加入干扰物质后的含量测定值/加入干扰物质前的含量测定值]×100％。
表7 干扰性能评估结果
由表7的数据可知，干扰物质：血红蛋白、胆红素、甘油三酯以及维生素C的加入量不超过表7所列的含量范围时，视黄醇结合蛋白的回收率在96.7％～103.7％之间，说明干扰物质对检测结果无显著干扰，本发明的试剂R2制备的试剂盒具有优异的干扰性能。
综合上述实验结果可知，采用本发明的试剂R2的试剂盒具有检测简单而快速、灵敏度高、准确性好、抗干扰能力强以及操作便捷的优点。试剂R2的生产简单，质量优异。

Claims (10)

1.一种视黄醇结合蛋白胶乳试剂R2，其特征在于，所述视黄醇结合蛋白胶乳试剂R2为pH为7.0～8.0的缓冲体系，所述缓冲体系包含有：视黄醇结合蛋白单克隆抗体包被的羧基化聚苯乙烯胶乳溶液和恢复液，所述胶乳溶液在整个磷酸盐缓冲体系中的含量为400～600mL/L，其中：
所述恢复液包含稳定剂、表面活性剂和电解质，所述稳定剂的含量为5～10g/L，表面活性剂的含量为2～5g/L，电解质的含量为5～15g/L；所述恢复液中各组分的含量是指占整个缓冲体系的含量；
所述胶乳溶液为pH为5.0～6.0的缓冲溶液，包括：粒径为50～200nm的羧基化聚苯乙烯胶乳微球、活化用的EDC、偶联加速用的PAMAM和封闭剂；所述羧基化聚苯乙烯胶乳微球的含量为10～15g/L，所述EDC的含量为0.5～1g/L，所述PAMAM的含量为1～4g/L，所述封闭剂的含量为2.5～5g/L；所述胶乳溶液中各组分的含量是指占整个胶乳溶液的含量；
所述胶乳溶液由羧基化聚苯乙烯胶乳微球经EDC活化后偶联视黄醇结合蛋白单克隆抗体，并由PAMAM维持偶联效率，最后经封闭剂封闭反应得到。
2.根据权利要求1所述的视黄醇结合蛋白胶乳试剂R2，其特征在于，所述恢复液，还包括防腐剂，所述防腐剂在所述缓冲体系中的浓度为0.5～5g/L。
3.根据权利要求1所述的视黄醇结合蛋白胶乳试剂R2，其特征在于，所述恢复液还包括表面活性剂PAMAM，以提高胶乳的分散稳定性，作为表面活性剂的PAMAM在所述缓冲体系中的浓度为0.5～5g/L。
4.根据权利要求1所述的视黄醇结合蛋白胶乳试剂R2，其特征在于，所述视黄醇结合蛋白单克隆抗体在所述缓冲体系中的浓度为0.2～0.5g/L。
5.根据权利要求1所述的视黄醇结合蛋白胶乳试剂R2，其特征在于，
所述封闭剂选自BSA溶液、CE210和CE510中的一种或几种；
所述表面活性剂选自聚氧乙烯月桂醚和PAMAM溶液中的一种或两种；
所述稳定剂选自BSA溶液、氯化胆碱、d-甘露糖醇中的一种或几种；
所述电解质选自氯化钠、氯化钾、硫酸钠中的一种或几种；
所述防腐剂选自叠氮钠、proclin300中的一种或两种；
所述缓冲体系为磷酸盐缓冲体系、Tris缓冲体系中的一种或两种。
6.一种制备权利要求1～5中任一项所述的视黄醇结合蛋白胶乳试剂R2的方法，其特征在于，包括如下制备步骤：
(1)、将配方量的羧基化聚苯乙烯胶乳微球缓慢滴加分散在缓冲溶液中，加入配方量的EDC溶液，搅拌活化，同时滴加配方量的PAMAM溶液，得到初始液；
(2)、往步骤(1)制备的初始液中加入视黄醇结合蛋白单克隆抗体进行偶联反应，反应结束后加入配方量的封闭剂进行封闭反应，并超声分散，得到视黄醇结合蛋白单克隆抗体包被的羧基化聚苯乙烯胶乳溶液；
(3)、将适量的恢复液加入到步骤(2)的胶乳溶液中，并调节pH至7.0～8.0，即得视黄醇结合蛋白胶乳试剂R2。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述羧基化聚苯乙烯胶乳微球的粒径为50～200nm。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述EDC溶液中的EDC的浓度为10～20g/L。
9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，所述活化的时间为10～20分钟；所述步骤(2)中，所述偶联反应的时间为1～2小时，所述封闭反应的时间为0.5～1.5小时。
10.一种视黄醇结合蛋白试剂盒，其特征在于，所述视黄醇结合蛋白试剂盒包括试剂R1，及权利要求1～5任一项所述的视黄醇结合蛋白胶乳试剂R2。
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