CN112730848A - 一种检测视黄醇结合蛋白的试剂盒及方法 - Google Patents

一种检测视黄醇结合蛋白的试剂盒及方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种检测视黄醇结合蛋白的试剂盒及方法。所述试剂盒包括试剂R1和试剂R2，所述试剂R2中胶乳微球选择的是羧基表面修饰的微球；活化剂包括EDC活化剂和NHS活化剂，所述EDC活化剂和NHS活化剂的体积比为1:1～2。本发明采用单一的小粒径的羧基胶乳微球，同时使用EDC活化剂和NHS活化剂对其进行充分活化，使得羧基胶乳微球疏水吸附能力充分展现出来。这显著提升了试剂盒检测视黄醇结合蛋白的灵敏度，使其可以在使用单一粒径的羧基胶乳微球和多克隆抗体的情况下，就拥有较高的灵敏度，可以直接用于尿液、血浆或血清中视黄醇结合蛋白的检测。

Description

一种检测视黄醇结合蛋白的试剂盒及方法
技术领域
本发明涉及分子检测技术领域，尤其涉及一种检测视黄醇结合蛋白的试剂盒及方法。
背景技术
视黄醇结合蛋白(Retinol-Binding Protein，RBP)是由肝脏合成的小分子量蛋白质，与血浆中的转甲状腺素蛋白结合协助转运，广泛分布于血液、脑脊液、尿液及其他体液中。在转用过程中，未结合部分则通过肾小球自由过滤，其中99.97％被近端肾小管重吸收。当肾小管功能受损时，其尿中视黄醇结合蛋白的浓度升高，因此现有技术常将视黄醇结合蛋白作为肾小管受损的指标之一。RBP由一条183个氨基酸残基组成的多肽链及少部分糖类组成，不含中性糖和氨基己糖。广泛存在于人体血清、脑脊液、尿液及其他体液中。
视黄醇结合蛋白作为肾功能检测的重要指标，血清、血浆和尿液检测都有其重要意义，目前针对视黄醇结合蛋白的检测，常用免疫比浊法，而如何提高免疫比浊的特异性和灵敏度，是现有对视黄醇结合蛋白检测的领域所高度关注的问题。国内厂家免疫比浊法试剂和部分胶乳免疫比浊法试剂因为灵敏度不高，往往只能用于血清检测，而有一部分试剂厂家为了可同时检测血清和尿液，或采用双粒径胶乳微球和双抗体偶联后混合的方式来提高灵敏度，或采用鼠抗人单克隆抗体来提高灵敏度，但这在使得试剂盒价格昂贵同时增加了工艺难度。
发明内容
为了解决现有技术中检测视黄醇结合蛋白的试剂盒价格昂贵，工艺难度高，灵敏度不够的技术问题，本发明提供一种检测视黄醇结合蛋白的试剂盒及方法。
第一方面，本发明提供一种检测视黄醇结合蛋白的试剂盒，包括试剂R1和试剂R2，所述试剂R2中胶乳微球选择的是羧基表面修饰的微球；活化剂包括EDC活化剂和NHS活化剂，所述EDC活化剂和NHS活化剂的体积比为1:1～2。
本发明采用表面羧基化的胶乳微球，其表面含带负电荷的羧基基团与抗体表面的氨基基团结合属于化学结合，形成的复合物更加稳定。在此基础上，本发明进一步改进对羧基化的胶乳微球的活化过程，采用EDC活化剂和NHS活化剂对其进行活化处理，并限定了特定的活化剂比例。该活化剂可以充分活化羧基化的胶乳微球，使其疏水吸附能力充分展现出来。
进一步地，所述胶乳微球的粒径为50～200nm，优选为100nm。本发明的试剂盒仅用一种小粒径的微球即可实现对血清、血浆和尿液患者的检测，在灵敏度提高的同时还节省成本。
进一步地，所述试剂R1包括：Tris 10-50mmol/L、氯化钠20-80g/L、吐温-20 0.1-10g/L和叠氮钠0.1-10g/L，pH为7.0～8.0。
进一步地，所述试剂R2包括：活化液、偶联液、清洗液、封闭液、R2缓冲液、EDC、NHS、多克隆视黄醇结合蛋白抗体和胶乳微球；其中，活化液包括5-20mmol/L MES，pH为5.5-6.5，偶联液包括5-20mmol/L MES，pH为7.0-8.0，清洗液包括5-20mmol/L甘氨酸，pH为7.0-8.0，封闭液包括5-20mmol/L甘氨酸和150-300g/L BSA，pH为7.0-8.0，R2缓冲液包括：150-250mmol/L甘氨酸、25-100g/L蔗糖、25-100g/L甘露醇、25-100g/L海藻糖、25-100g/L甘油、2-10g/L Proclin-300和2-20g/L聚蔗糖，pH为7.5-8.5，多克隆视黄醇结合蛋白抗体为羊抗人抗体、鼠抗人抗体或兔抗人抗体中的一种或多种。
本发明试剂盒中每一种缓冲液都有着特定的pH值，在此情况下，可以得到最理想的检测效果。本发明还在R2缓冲液中使用表面活性剂甘油，可以起到较好的分散作用，防止抗体微球结合物产生聚集发生沉淀。
第二方面，本发明提供一种检测视黄醇结合蛋白的方法，所述方法为使用所述试剂盒进行尿液、血浆或血液中视黄醇结合蛋白的检测。
进一步地，所述方法包括试剂R1和试剂R2的准备；
所述试剂R2的准备包括：活化、偶联、封闭、清洗和老化；
所述活化包括：添加胶乳微球、EDC和NHS，通过活化液定容后搅拌活化10～60min，后离心弃去活化液；
所述胶乳微球和所述EDC的体积比为10:3～4，所述EDC和所述NHS的体积比为1:1～2。
进一步地，所述偶联包括：将活化后得到的沉淀物用偶联液吹打悬浮，超声使得聚集物散开，后添加多克隆视黄醇结合蛋白抗体，在35～37℃的条件下搅拌偶联30～200min。本发明仅使用一种多克隆抗体即可实现和单克隆抗体类似的检测效果，节约大量成本，多克隆抗体可以为羊抗人抗体、鼠抗人抗体、兔抗人抗体或其他动物源抗人抗体。超声目的可以使聚集在一起的微球分散开，充分暴露其疏水基团。
进一步地，在偶联结束后添加封闭液，搅拌封闭10～60min，封闭后离心弃去封闭液。
进一步地，所述清洗为将封闭后的试剂通过清洗液处理、离心弃去清洗液，R2缓冲液处理；
所述老化为将清洗后的试剂置于35～37℃的恒温箱中老化8～30h。
进一步地，所述离心为在8～15℃的条件下以11000～12000rpm离心。
本发明离心温度选择8～15℃，不宜过高也不宜过低。该温度下可以促进离心聚集，若温度过高或过低，即使延长离心时间也没有8～15℃下离心更充分，会造成微球离心不彻底，不仅会造成原料浪费，还会影响偶联效果。
作为一种优选实施例，本发明提供一种检测视黄醇结合蛋白的试剂盒的准备方法，包括：
1、试剂R2的准备
1)活化：胶乳微球含量为配制体积的0.35％-0.45％，添加EDC含量为胶乳微球体积的30％-40％，添加NHS含量为EDC含量的1-2倍，活化液定容至总体积为配制体积的50％，搅拌活化10-60min；
EDC：碳化二亚胺；NHS：N-羟基琥珀酰亚胺；
2)离心：11000-12000rpm，温度8-15℃，弃去活化液。
3)偶联：沉淀物用偶联液吹打使其悬浮，然后超声使其未吹打开的聚集物散开；添加多克隆视黄醇结合蛋白抗体，37℃边搅拌边偶联30-200min；
4)封闭：偶联结束，添加封闭液，边搅拌边封闭10-60min；
5)离心：11000-12000rpm，温度8-15℃，弃去偶联液和封闭液。
6)清洗：沉淀物用清洗液吹打使其悬浮，然后超声使其未吹打开的聚集物散开；
7)离心：11000-12000rpm，温度8-15℃，弃去清洗液。
8)试剂R2：沉淀物用R2缓冲液吹打使其悬浮，然后超声使其未吹打开的聚集物散开；
9)老化：试剂R2放置于37℃恒温箱老化8-30h；至此试剂R2配制完成。
2、试剂R1的制备
Tris含量为10-50mmol/L，氯化钠含量为20-80g/L，吐温-20含量为0.1-10g/L，叠氮钠含量为0.1-10g/L，pH为7.0-8.0。
本发明具备如下有益效果：
1)本发明采用多克隆抗体结合一种小粒径羧基胶乳微球的视黄醇结合蛋白的胶乳免疫比浊检测方法，开发出一种可同时检测血液、血浆以及尿液中的视黄醇结合蛋白检测试剂盒。
本发明选择单一的小粒径的羧基胶乳微球，不仅表面积大，能够结合更多的抗体，而且相比双微球的试剂降低了成本；微球活化过程中添加双活化剂EDC和NHS，两个活化剂按照一定比例结合活化微球的能力提高，能够使羧基胶乳微球的疏水吸附能力充分展现出来，提高偶联效率，减少抗体和微球的浪费，降低成本，同时提高了检测RBP尿液样本的灵敏度和准确度。
本发明中抗体选择多样化，多克隆抗体成本低，种类可以为羊抗人抗体、鼠抗人抗体、兔抗人抗体或其他动物源抗人抗体。
本发明试剂R2缓冲液中的表面活性剂选择甘油，能够提高视黄醇结合蛋白多克隆抗体和胶乳微球结合物在R2缓冲液中的分散性，避免了结合物的聚沉，分散性好，利于试剂的长期保存。
2)本发明所述的试剂盒，与现有技术相比，具有检测灵敏度高、准确度高、特异性强、重复性好、线性范围宽、质量稳定性好、降低了成本，还可同时检测血清、血浆以及尿液中的视黄醇结合蛋白。
附图说明
图1为本发明提供的使用试剂盒检测血清样本中视黄醇结合蛋白的线性范围检测结果；
图2为本发明提供的使用试剂盒检测血浆样本中视黄醇结合蛋白的线性范围检测结果；
图3为本发明提供的使用试剂盒检测尿液样本中视黄醇结合蛋白的线性范围检测结果；
图4为本发明提供的使用试剂盒检测血清样本中视黄醇结合蛋白的相关性检测结果；
图5为本发明提供的使用试剂盒检测血浆样本中视黄醇结合蛋白的相关性检测结果；
图6为本发明提供的使用试剂盒检测尿液样本中视黄醇结合蛋白的相关性检测结果；
图7为本发明提供的改变活化方式后，使用试剂盒检测尿液样本中视黄醇结合蛋白的相关性检测结果。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1
本实施例提供一种用于检测视黄醇结合蛋白的试剂盒，包括试剂R1和试剂R2，该试剂盒的准备流程如下：
1)试剂R2制备前所需溶液的准备
制备活化液：MES含量为15mmol/L，pH为6.0；
制备偶联液：MES含量为15mmol/L，pH为7.5；
制备清洗液：甘氨酸含量为15mmol/L，pH为7.5；
制备封闭液：甘氨酸含量为15mmol/L，BSA含量为250g/L，pH为7.5；
制备R2缓冲液：甘氨酸含量为200mmol/L，蔗糖含量为50g/L，甘露醇含量为50g/L，海藻糖含量为50g/L，甘油含量为50g/L，Proclin-300含量为5g/L，聚蔗糖含量为5g/L，pH为8.0。
2)制备试剂R2
活化：胶乳微球含量为配制体积的0.40％，添加EDC含量为胶乳微球体积的35％，添加NHS含量为EDC含量的1.5倍，活化液定容至总体积为配制体积的50％，搅拌活化30min；离心：12000rpm，温度15℃；
偶联：离心后，弃上清，沉淀物用偶联液吹打使其悬浮，然后超声；添加多克隆视黄醇结合蛋白抗体，37℃边搅拌边偶联120min；
封闭：偶联结束，添加封闭液，边搅拌边封闭30min；离心：12000rpm，温度15℃；
清洗：离心后，弃上清，沉淀物用清洗液吹打使其悬浮，然后超声；离心：12000rpm，温度15℃；试剂R2：离心后，弃上清，沉淀物用R2缓冲液吹打使其悬浮，然后超声；
老化：试剂R2放置于37℃恒温箱老化15h；至此试剂R2配制完成。
2)制备试剂R1
Tris含量为25mmol/L，氯化钠含量为50g/L，吐温-20含量为5g/L，叠氮钠含量为2g/L，pH为7.5。
实施例2
使用实施例1制备完成的试剂盒对RBP血清、血浆以及尿液样品进行测试，具体方法如下：
1、全自动生化分析仪的测定血清、血浆样本参数设置如表1所示：
表1全自动生化分析仪测定血清、血浆样本设置
Figure BDA0002867909300000071
2、全自动生化分析仪的测定尿液样本参数设置如表2所示：
表2全自动生化分析仪的测定尿液样本参数设置
Figure BDA0002867909300000072
Figure BDA0002867909300000081
3、视黄醇结合蛋白试剂盒检测血清、血浆以及尿液中RBP的性能试验结果如下：
1)线性范围
将RBP高值血清、血浆和尿液样本，用生理盐水按照一定比例进行倍比稀释，以此为样本，分别测试试剂盒，每个稀释度测试3次，分别求出测定结果的均值(yi)。以稀释值(xi)为自变量，以测定均值(yi)为因变量求出线性回归方程。
测定血清样本计算结果见表3和图1所示、测定血浆样本计算结果见表4和图2所示、测定尿液样本计算结果见表5和图3所示。
表3血清样本检测结果
稀释倍数 均值 理论值 绝对偏差 相对偏差 稀释值
0.05 8.97 8.53 0.45 5.24％ 8.37
0.1 17.88 16.88 1.00 5.92％ 16.75
0.2 32.65 33.58 -0.93 -2.76％ 33.50
0.4 67.73 66.98 0.74 1.11％ 66.99
0.5 81.95 83.68 -1.73 -2.07％ 83.74
0.6 99.40 100.39 -0.99 -0.99％ 100.49
0.8 134.96 133.79 1.17 0.87％ 133.99
1 167.48 167.19 0.29 0.17％ 167.48
表4血浆样本检测结果
稀释倍数 均值 理论值 绝对偏差 相对偏差 稀释值
0.05 7.76 7.53 0.23 3.04％ 8.29
0.1 15.54 15.90 -0.36 -2.27％ 16.58
0.2 31.65 32.64 -0.99 -3.03％ 33.16
0.4 67.39 66.12 1.27 1.92％ 66.33
0.5 83.62 82.86 0.75 0.91％ 82.91
0.6 98.56 99.60 -1.04 -1.04％ 99.49
0.8 133.96 133.08 0.88 0.66％ 132.65
1 165.82 166.56 -0.74 -0.45％ 165.82
表5尿液样本检测结果
稀释倍数 均值 理论值 绝对偏差 相对偏差 稀释值
0.025 0.23 0.18 0.05 24.94％ 0.26
0.05 0.46 0.44 0.02 3.45％ 0.53
0.1 1.01 0.97 0.04 4.58％ 1.06
0.2 2.08 2.01 0.07 3.58％ 2.11
0.4 4.04 4.09 -0.05 -1.28％ 4.23
0.6 5.90 6.18 -0.28 -4.49％ 6.34
0.8 8.19 8.26 -0.07 -0.87％ 8.46
1 10.57 10.35 0.22 2.16％ 10.57
2)重复性
重复测定同一样本，测试10次，计算其平均值及变异系数(CV)。
测定血清、血浆和尿液样本计算结果见表6所示。
表6血清、血浆及尿液样本重复性检测结果
Figure BDA0002867909300000091
3)相关性
用本发明试剂与已上市同类试剂分别测定50份血清、血浆和尿液的不同浓度的样本，计算两组数据的相关系数(r)。
测定血清、血浆和尿液样本计算结果见图4、图5及图6所示。
实施例3
本实施例提供一种用于检测视黄醇结合蛋白的试剂盒，包括试剂R1和试剂R2，该试剂盒的准备流程如下：
1)试剂R2制备前所需溶液的准备
制备活化液：MES含量为15mmol/L，pH为6.0；
制备偶联液：MES含量为15mmol/L，pH为7.5；
制备清洗液：甘氨酸含量为15mmol/L，pH为7.5；
制备封闭液：甘氨酸含量为15mmol/L，BSA含量为250g/L，pH为7.5；
制备R2缓冲液：甘氨酸含量为200mmol/L，蔗糖含量为50g/L，甘露醇含量为50g/L，海藻糖含量为50g/L，甘油含量为50g/L，Proclin-300含量为5g/L，聚蔗糖含量为5g/L，pH为8.0。
2)制备试剂R2
活化：胶乳微球含量为配制体积的0.40％，添加EDC含量为胶乳微球体积的35％，活化液定容至总体积为配制体积的50％，搅拌活化30min；离心：12000rpm，温度15℃；
偶联：离心后，弃上清，沉淀物用偶联液吹打使其悬浮，然后超声；添加多克隆视黄醇结合蛋白抗体，37℃边搅拌边偶联120min；
封闭：偶联结束，添加封闭液，边搅拌边封闭30min；离心：12000rpm，温度15℃；
清洗：离心后，弃上清，沉淀物用清洗液吹打使其悬浮，然后超声；离心：12000rpm，温度15℃；试剂R2：离心后，弃上清，沉淀物用R2缓冲液吹打使其悬浮，然后超声；
老化：试剂R2放置于37℃恒温箱老化15h；至此试剂R2配制完成。
2)制备试剂R1
Tris含量为25mmol/L，氯化钠含量为50g/L，吐温-20含量为5g/L，叠氮钠含量为2g/L，pH为7.5。
使用实施例3制备完成的试剂盒对RBP血清、血浆和尿液样品进行测试，具体结果如下：
1)线性范围
表7血清样本检测结果
稀释倍数 均值 理论值 绝对偏差 相对偏差 稀释值
0.05 10.97 9.71 1.26 12.97％ 7.92
0.1 19.88 17.50 2.37 13.56％ 15.83
0.2 26.65 33.08 -6.43 -19.44％ 31.67
0.4 69.67 64.25 5.42 8.44％ 63.33
0.5 73.67 79.83 -6.16 -7.71％ 79.17
0.6 100.67 95.41 5.26 5.51％ 95.00
0.8 124.24 126.57 -2.33 -1.84％ 126.67
1 158.33 157.73 0.60 0.38％ 158.33
表8血浆样本检测结果
稀释倍数 均值 理论值 绝对偏差 相对偏差 稀释值
0.05 9.02 9.96 -0.94 -9.44％ 8.17
0.1 15.88 18.00 -2.12 -11.78％ 16.33
0.2 35.65 34.07 1.58 4.64％ 32.67
0.4 62.73 66.22 -3.49 -5.28％ 65.34
0.5 74.06 82.29 -8.23 -10.01％ 81.67
0.6 94.25 98.37 -4.12 -4.19％ 98.01
0.8 135.22 130.52 4.70 3.60％ 130.68
1 163.35 162.67 0.68 0.42％ 163.35
表9尿液样本检测结果
稀释倍数 均值 理论值 绝对偏差 相对偏差 稀释值
0.025 0.20 0.15 0.05 31.32％ 0.26
0.05 0.49 0.42 0.02 16.19％ 0.53
0.1 1.05 0.96 0.04 9.51％ 1.06
0.2 1.90 2.04 -0.12 -6.83％ 2.11
0.4 4.03 4.20 -0.07 -4.05％ 4.23
0.6 6.66 6.36 -0.01 4.62％ 6.34
0.8 8.73 8.52 0.21 2.45％ 8.45
1 10.57 10.68 -0.12 -1.10％ 10.57
2)重复性
表10血清、血浆及尿液样本重复性检测结果
Figure BDA0002867909300000121
3)相关性
测定尿液样本计算结果见图7所示，从以上表格和图中可以看出，实施例3相较于实施例2采用了不同的活化流程，其检测偏差值显著高于实施例2。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.一种检测视黄醇结合蛋白的试剂盒，其特征在于，包括试剂R1和试剂R2，所述试剂R2中胶乳微球选择的是羧基表面修饰的微球；活化剂包括EDC活化剂和NHS活化剂，所述EDC活化剂和NHS活化剂的体积比为1:1～2。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述胶乳微球的粒径为50～200nm，优选为100nm。
3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂R1包括：Tris 10-50mmol/L、氯化钠20-80g/L、吐温-20 0.1-10g/L和叠氮钠0.1-10g/L，pH为7.0～8.0。
4.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂R2包括：活化液、偶联液、清洗液、封闭液、R2缓冲液、EDC、NHS、多克隆视黄醇结合蛋白抗体和胶乳微球；
其中，活化液包括5-20mmol/L MES，pH为5.5-6.5，和/或，偶联液包括5-20mmol/L MES，pH为7.0-8.0，清洗液包括5-20mmol/L甘氨酸，pH为7.0-8.0，和/或，封闭液包括5-20mmol/L甘氨酸和150-300g/L BSA，pH为7.0-8.0，和/或，R2缓冲液包括：150-250mmol/L甘氨酸、25-100g/L蔗糖、25-100g/L甘露醇、25-100g/L海藻糖、25-100g/L甘油、2-10g/L Proclin-300和2-20g/L聚蔗糖，pH为7.5-8.5，和/或，多克隆视黄醇结合蛋白抗体为羊抗人抗体、鼠抗人抗体或兔抗人抗体中的一种或多种。
5.一种检测视黄醇结合蛋白的方法，其特征在于，使用权利要求1-4任一项所述试剂盒进行尿液、血浆或血液中视黄醇结合蛋白的检测。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，包括：试剂R1和试剂R2的准备；
所述试剂R2的准备包括：活化、偶联、封闭、清洗和老化；
所述活化包括：添加胶乳微球、EDC和NHS，通过活化液定容后搅拌活化10～60min，后离心弃去活化液；
所述胶乳微球和所述EDC的体积比为10:3～4，所述EDC和所述NHS的体积比为1:1～2。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述偶联包括：将活化后得到的沉淀物用偶联液吹打悬浮，超声使得聚集物散开，后添加多克隆视黄醇结合蛋白抗体，在35～37℃的条件下搅拌偶联30～200min。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述封闭包括：在偶联结束后添加封闭液，搅拌封闭10～60min，封闭后离心弃去封闭液。
9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，
所述清洗为将封闭后的试剂通过清洗液处理、离心弃去清洗液，R2缓冲液处理；和/或，
所述老化为将清洗后的试剂置于35～37℃的恒温箱中老化8～30h。
10.根据权利要求6-9任一项所述的方法，其特征在于，所述离心为在8～15℃的条件下以11000～12000rpm离心。
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