CN111856039A - 一种测定全血降钙素原的免疫比浊方法学试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种测定全血降钙素原的免疫比浊方法学试剂盒，其包括R1试剂和R2试剂和降钙素原校准品，R1试剂包括缓冲液、表面活性剂、稳定剂、增敏剂和防腐剂，R2试剂包括标记有降钙素原抗体的乳胶微球颗粒、缓冲液、防腐剂和稳定剂，降钙素原校准品包括降钙素原蛋白、防腐剂、缓冲液和稳定剂。本发明的测定全血降钙素原的免疫比浊方法学试剂盒，能直接将全血样本加入到试剂盒中进行降钙素原的定量检测，不需要将全血样本离心处理，分离出血清或血浆，既能够降低设备成本，又能提高检测的效率，而且本发明的试剂对全血样本中红细胞的抗干扰效果显著，检测的精度高，与采用血清或血浆进行检测的方案相比，检测值偏差小于10％。
Description
技术领域
本发明涉及医学检验技术领域，具体涉及一种测定全血降钙素原的免疫比浊方法学试剂盒。
背景技术
降钙素原(PCT)是由116个氨基酸组成的激素原，分子量大约为12.7kDa。健康人血中仅含有少量的PCT。当严重细菌、真菌、寄生虫感染以及脓毒症和多脏器功能衰竭时它在血浆中的水平升高，自身免疫、过敏和病毒感染时 PCT不会升高，局部有限的细菌感染、轻微的感染和慢性炎症不会导致其升高。PCT反映了全身炎症反应的活跃程度，PCT水平的升高出现在严重休克、全身性炎症反应综合征(SIRS)和多器官功能紊乱综合征(MODS)。PCT(降钙素原)是诊断和动态监控严重细菌性感染的一个高特异、高灵敏的检测指标，优于现有辅助诊断感染类疾病的其他指标如白细胞分类计数和CRP等。 PCT对于感染性急、危重症的快速诊断、动态监测和治疗方案的制定预后判别等，有非常重要的应用价值。
检测PCT的实验室方法有很多，不仅可以定性，亦可以定量。常用的方法有胶乳增强免疫比浊法、放射免疫学分析法、双抗夹心免疫化学发光法 (ILMA)、胶体金比色法、透射免疫浊度法。胶乳增强免疫比浊法是将抗体定向偶联在胶乳表面，待检验的血液样本中的降钙素原与试剂中的抗体特异性结合，形成抗原抗体免疫复合物，使乳胶微球的交联度发生改变，从而使反应体系的浊度发生变化，胶乳试剂可以特异的增大该浊度变化，增大试剂的灵敏度，该浊度变化的高低与样本中降钙素原的含量成正相关。配套仪器能够通过6点定标曲线来计算样本中降钙素原(PCT)的含量。
胶乳增强免疫比浊技术在近几年有了很大的提升发展，从最开始的低灵敏度项目一直发展到现在的高敏乳胶增强比浊试剂，很多技术细节都在成熟，体外诊断试剂的性能高度依赖于生物原材料，目前国内做抗原、抗体的水平都在不断的向国际水平靠近，有些原料的制作水平已经超过国际水平。
现有技术中，采用胶乳增强免疫比浊法检测降钙素原(PCT)，其缺点在于无法对全血样本直接进行降钙素原的检测，需要先进行离心处理，在全血样本中分离出血清或者分离成血浆，因而需要购置相应的离心设备，并消耗一定的离心处理时间，成本更高，且效率低，因而需要对其进行改进。
发明内容
本发明的目的在于针对背景技术中所述的现有技术中无法对全血样本直接进行降钙素原检测，需要分离出血清或血浆，导致设备成本高，检测效率低等问题，提供一种能够解决前述问题的测定全血降钙素原的免疫比浊方法学试剂盒。
为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：一种测定全血降钙素原的免疫比浊方法学试剂盒，其包括R1试剂和R2试剂和降钙素原校准品，R1试剂包括缓冲液、表面活性剂、稳定剂和防腐剂，R2试剂包括标记有降钙素原抗体的乳胶微球颗粒、缓冲液、防腐剂和稳定剂，降钙素原校准品包括降钙素原蛋白、防腐剂、缓冲液和稳定剂。
进一步的方案是，所述的R1试剂中，缓冲液为2-(N-吗啉)乙磺酸(简称为MES缓冲液)和4-羟乙基哌嗪乙磺酸(简称为HEPES缓冲液)，表面活性剂为吐温-20、吐温-80、brij35中的一种或几种，稳定剂为牛血清蛋白 (BSA)、无机盐、金属络合剂、表面活性剂、抗氧化剂中的一种或者几种，防腐剂为抗菌肽、甲基氯异噻唑啉酮、甲基异噻唑啉酮或者多聚赖氨酸中的一种或者几种。
进一步的方案是，所述的R2试剂中，乳胶微球颗粒的粒径为200-400nm 之间；降钙素原抗体为兔多克隆抗体和鼠单克隆抗体中的一种或者两种；缓冲液为2-(N-吗啉)乙磺酸或者4-羟乙基哌嗪乙磺酸中的一种或者两种；稳定剂为海藻糖、蔗糖或者甘油中的一种或者几种；防腐剂为抗菌肽、甲基氯异噻唑啉酮、甲基异噻唑啉酮或者多聚赖氨酸中的一种或者几种。
进一步的方案是，所述的降钙素原校准品中，缓冲液的PH在7.5-8.5 之间，稳定剂中包含有牛血清蛋白(BSA)，防腐剂为具有广谱防腐的防腐剂。
进一步的方案是，所述的R1试剂中还包括增敏剂，增敏剂为聚乙二醇 6000。
本发明的测定全血降钙素原的免疫比浊方法学试剂盒，能直接将全血样本加入到试剂盒中进行降钙素原的定量检测，不需要将全血样本离心处理，分离出血清或血浆，既能够降低设备成本，又能提高检测的效率，检测时间缩短为原来的一半，而且本发明的试剂对全血样本中红细胞的抗干扰效果显著，检测的精度高，与采用血清或血浆进行检测的方案相比，检测值偏差小于10％。
附图说明
图1为本发明实施例1中两组数据的相关性示意图。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
一种测定全血降钙素原的免疫比浊方法学试剂盒，其包括R1试剂和R2 试剂和降钙素原校准品。
R1试剂中缓冲液为MES缓冲液，表面活性剂为brij35，稳定剂为牛血清蛋白(BSA)，防腐剂为甲基氯异噻唑啉酮，增敏剂为聚乙二醇6000。
R2试剂中标记有降钙素原抗体的乳胶微球颗粒为，缓冲液为MES缓冲液，防腐剂为甲基氯异噻唑啉酮。
降钙素原校准品中，降钙素原蛋白为经过溯源的高浓度降钙素原蛋白，防腐剂为甲基氯异噻唑啉酮，缓冲液为HEPES缓冲液，稳定剂为牛血清BSA。
一、试剂R1的制备：
1、将PH＝5.2的500mM的MES缓冲液加入到去离子水中定容至浓度为 50mM；
2、取1L步骤1的溶液，加入0.2％的brij35表面活性剂；
3、在步骤2的溶液中加入0.01％甲基氯异噻唑啉酮作为防腐剂；
4、在步骤3的溶液中加入0.5％的聚乙二醇6000作为增敏剂；
5、在步骤4的溶液中加入0.5％的牛血清蛋白作为稳定剂
6、对以上物料进行搅拌溶解过夜(约16小时)后保存。
二、试剂R2的制备
1、在250ml烧杯配制下列的溶液：
2、把以上混悬液置磁力搅拌器上，室温下搅拌1.5h；
3、将以上混悬液转移至离心管中，用100ml去离子水洗烧杯，一并转移至3个离心管(100ml)中；
4、设定离心机转速为15000rpm，温度为4℃，离心时间为30min，离心结束后，弃上清液，并在每个离心管内加入35ml去离子水重悬乳胶微球；离心之后的沉淀中只剩下活化的乳胶微球，开始加入烧杯中的MES缓冲液 (pH6.0)和NHS/EDC ester成分都去除掉了；
5、设定离心机转速为15000rpm，温度为4℃，离心时间为30min，离心结束后，弃上清液，用50ml浓度为50mM的PB缓冲液(pH7.2)重悬乳胶微球；
6、将乳胶微球悬液转移至250ml烧杯中，将烧杯置超声仪上，用2号探头(中探头)，冰浴超声，超声功率设定为200W，以间歇的方式超声，超声 3s，间歇10s，共超声60次；(不能出现泡沫)；
7、配制抗体混合液(用来偶联乳胶微球)，其浓度为1.5mg/ml；包括：
抗体(1611026，5mg/ml)30ml；
50mM PB缓冲液(pH7.2)20ml；
8、将超声后的乳胶微球置于磁力搅拌器上，快速搅拌，将抗体混合液迅速加入烧杯中，室温搅拌16h；
9、将烧杯放在超声仪上，选用6mm号超声探头(中探头)，冰浴超声，超声功率设定为200W，以间歇的方式超声，超声3s，间歇10s，共超声80 次；
10、超声后的溶液加入100ml封闭缓冲液(pH7.2)封闭3h，封闭缓冲液的配方为含有0.5％牛血清白蛋白的50mM的Tris-HCl缓冲液；
11、设定离心机转速为15000rpm，温度为4℃，离心时间为30min，弃上清液，沉淀用100ml灭菌水重悬；离心结束后，前面加入的PB缓冲液和封闭缓冲液已经去除掉了，沉淀中只剩下偶联抗体的乳胶微球；
12、设定离心机转速为15000rpm，温度为4℃，离心时间为30min，最后的离心沉淀用100ml的R2缓冲液重悬；其中R2缓冲液包括缓冲液、防腐剂和稳定剂，缓冲液为MES缓冲液50mM，防腐剂为0.01％甲基氯异噻唑啉酮，稳定剂为1％的蔗糖。
13、将烧杯置超声仪上，选用2号探头(中探头)，冰浴超声，超声功率设定为200W，以间歇的方式超声，超声3s，间歇10s，共超声80次；
14、目测单分散，将超声好的乳胶微球按照1:4稀释(100ml乳胶微球 +400ml R2缓冲液),将稀释后的混悬液的储存温度设定为4℃。
三、降钙素原校准品的制备：
1、将PH＝7.2的500mM的HEPES缓冲液加入到去离子水中定容至浓度为 50mM；
2、加入经过溯源的高浓度降钙素原蛋白；
3、在步骤2的溶液中加入0.01％甲基氯异噻唑啉酮作为防腐剂；
4、在步骤3的溶液中加入0.5％的胎牛血清作为稳定剂；
5、对以上物料进行搅拌溶解过夜后保存。
四、样本检测
1、准备新鲜的PCT的全血临床样本二十支每支10ml分别进行编号依次为1-20号；
2、编号后把每支10ml的全血临床样本平均分到两支离心管中，每支5ml，再分成两组，分别编号为A1、A2…A20；B1、B2…B20；
3、A组采用传统的离心机以5000rpm的转速，离心20min，得到血清；
4、B组用本发明的试剂对全血样本进行处理，具体做法为把全血样本加入到试剂盒中，先涡旋震荡均匀；
5、用PCT测定试剂盒，采用胶乳增强免疫比浊法，在日立7020全自动生化分析仪上对A组和B组两组血清，进行定值测定；
6、日立7020生化仪设定参数为R1：180μl；R2:60μl；样本：20μl；
读光点：22-34
7、试剂1和试剂2配套降钙素原校准品进行定标后测定结果如下：
如图1所示，上面通过20对全血临床样本，采用传统的试剂盒检测与采用本发明的方案进行检测获得的数值的对比，可以看出，采用本发明的试剂盒检测数值偏差都小于10％，而有16组检测结果的数值偏差小于3％，通过上述的实验可以看出，本发明的试剂盒检测精度高，对全血样本中红细胞的抗干扰效果显著，能够直接采用全血样本进行检测，极大的缩短检测时间，提高检测效率，同时，不需要将全血样本制成血清，降低了设备成本，简化了操作。
虽然上述只记载了一种实施方式，但是，前面记载的几种缓冲液、表面活性剂、稳定剂和防腐剂都能用于本发明的方案的实施，本领域技术人员能够根据上述的实施例得出替换的方案，这些方案同样属于本发明的保护范围。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
Claims (5)
1.一种测定全血降钙素原的免疫比浊方法学试剂盒，其特征在于：其包括R1试剂和R2试剂和降钙素原校准品，R1试剂包括缓冲液、表面活性剂、稳定剂、增敏剂和防腐剂，R2试剂包括标记有降钙素原抗体的乳胶微球颗粒、缓冲液、防腐剂和稳定剂，降钙素原校准品包括降钙素原蛋白、防腐剂、缓冲液和稳定剂。
2.根据权利要求1所述的测定全血降钙素原的免疫比浊方法学试剂盒，其特征在于：所述的R1试剂中，缓冲液为2-(N-吗啉)乙磺酸和4-羟乙基哌嗪乙磺酸中的一种或两种，表面活性剂为吐温-20、吐温-80、brij35中的一种或几种，稳定剂为牛血清蛋白(BSA)、无机盐、金属络合剂、表面活性剂、抗氧化剂中的一种或者几种，防腐剂为抗菌肽、甲基氯异噻唑啉酮、甲基异噻唑啉酮或者多聚赖氨酸中的一种或者几种。
3.根据权利要求1所述的测定全血降钙素原的免疫比浊方法学试剂盒，其特征在于：所述的R2试剂中，乳胶微球颗粒的粒径为200-400nm之间；降钙素原抗体为兔多克隆抗体和鼠单克隆抗体中的一种或者两种；缓冲液为2-(N-吗啉)乙磺酸或者4-羟乙基哌嗪乙磺酸中的一种或者两种；稳定剂为海藻糖、蔗糖或者甘油中的一种或者几种；防腐剂为抗菌肽、甲基氯异噻唑啉酮、甲基异噻唑啉酮或者多聚赖氨酸中的一种或者几种。
4.根据权利要求1所述的测定全血降钙素原的免疫比浊方法学试剂盒，其特征在于：所述的降钙素原校准品中，缓冲液的PH在7.5-8.5之间，稳定剂中包含有牛血清蛋白(BSA)，防腐剂为具有广谱防腐的防腐剂。
5.根据权利要求1所述的测定全血降钙素原的免疫比浊方法学试剂盒，其特征在于：所述的R1试剂中还包括增敏剂，增敏剂为聚乙二醇6000。
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