CN116735863A - 一种聚乙二醇衍生物修饰的羧基微球的应用方法 - Google Patents
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Abstract
本申请涉及一种聚乙二醇衍生物修饰的羧基微球的应用方法，所述方法包括：将包被蛋白、交联活化剂加入聚乙二醇衍生物修饰的羧基微球中进行交联反应，后超声混合，再加入封闭剂进行封闭反应，后离心、清洗；所述聚乙二醇衍生物修饰的羧基微球由羧基微球的羧基与聚乙二醇衍生物的活性基团发生化学反应生成；所述聚乙二醇衍生物的活性基团为氨基、羧基；所述羧基微球为供体微球或受体微球。本申请通过在供体微球表面修饰聚乙二醇(PEG)分子，再包被链霉亲和素，从而使其稳定、不易沉降，且可以大大减少非特异性结合；通过在受体微球表面修饰聚乙二醇(PEG)分子，再包被抗体，可以提高均相化学发光检测试剂盒中低值检测的灵敏度。
Description
技术领域
本申请涉及生物检测技术领域，尤其涉及一种聚乙二醇衍生物修饰的羧基微球的应用方法。
背景技术
光激化学发光技术起源于上个世纪90年代，因其具有均相、免洗和高通量检测的特点，成为近几年免疫研究的热点，目前已广泛应用于生物医学研究。该技术主要是将两种表面包被抗原载体或抗体的纳米微球，通过特异性反应连接在一起，其中包有酞菁的供体微球在680nm激光的照射下，将周围氧分子转化成单线态氧，并传递到另一种发光微球上，与发光微球上的二甲基噻吩发生化学反应，产生紫外光，紫外光进一步激发填充于受体微球上的铕螯合物产生光子，结合数学模型将检测的光信号转换为目标检测物的浓度。由于均相免洗的特点，不仅可以使反应更加充分，且可以降低反应带来的系统误差。在此基础上，通过引入生物素-亲和素系统(BAS)，在供体微球上包被亲和素，受体微球和生物素上标记抗原载体或抗体，形成供体微球-亲和素-生物素-抗原抗体结合物-受体微球。由于亲和素上可以连接多个生物素，实现多级放大效应，可以使检测结果的灵敏度更高。
虽然均相光激化学发光有着诸多优点，但由于其是均相免疫反应，受样本基质影响较大，在检测时容易引发样本中某些基质对微球产生的非特异性吸附，从而造成检测时的假阳性，而且活性位点可能被非特异性吸附的蛋白占据，导致灵敏性降低等问题。
发明内容
本申请提供了一种聚乙二醇衍生物修饰的羧基微球的应用方法，以解决均相光激化学发光中存在的非特异性干扰的问题。
本申请提供了一种聚乙二醇衍生物修饰的羧基微球的应用方法，所述方法包括：
将包被蛋白、交联活化剂加入聚乙二醇衍生物修饰的羧基微球中进行交联反应，后超声混合，再加入封闭剂进行封闭反应，后离心、清洗；
所述聚乙二醇衍生物修饰的羧基微球由羧基微球的羧基与聚乙二醇衍生物的活性基团发生化学反应生成；
所述聚乙二醇衍生物的活性基团为氨基、羧基；
所述羧基微球为供体微球或受体微球。
本申请中，包被蛋白可以为链霉亲和素SA、抗原载体Ag-BSA、抗体Ab等蛋白，其中供体微球可以包被SA，受体微球可以包被Ag-BSA/Ab。
进一步地，所述交联活化剂的终浓度为0.08～0.12wt％，所述交联活化剂为1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)。
进一步地，所述封闭剂为乙醇胺、牛血清蛋白(BSA)、甘氨酸(Gly)、CE510、酪蛋白、明胶中的一种或多种。
进一步地，所述封闭剂为牛血清蛋白和乙醇胺；所述牛血清蛋白和乙醇胺的体积比为100:(10～15)。
进一步地，所述交联反应的工艺参数包括：反应温度为35～40℃，转速为1000～1500rpm，反应时间为1.5～2.5h。
进一步地，所述封闭反应的工艺参数包括：反应温度为35～40℃，转速为1000～1500rpm，反应时间为0.4～0.6h。
进一步地，所述离心的工艺参数包括：转速为12000～16000rpm，离心时间为10～20min。
进一步地，所述聚乙二醇衍生物的活性基团为氨基和羧基。
进一步地，所述聚乙二醇衍生物修饰的羧基微球的制备方法包括：
将交联活化剂加入带羧基基团的羧基微球中进行活化反应，后离心、弃去上清液，再用偶联缓冲液重悬，后加入带活性基团的聚乙二醇衍生物、表面活性剂进行反应，反应结束后离心、弃去上清液，后用偶联缓冲液清洗，得聚乙二醇衍生物修饰的羧基微球。
进一步地，所述羧基微球为羧基供体微球或羧基受体微球，所述聚乙二醇衍生物的分子量为400-20000。
本申请实施例提供的上述技术方案与现有技术相比具有如下优点：
本申请通过在供体微球表面修饰聚乙二醇(PEG)分子，再包被链霉亲和素，从而使其稳定、不易沉降，且可以大大减少非特异性结合；通过在受体微球表面修饰聚乙二醇(PEG)分子，再包被抗体，可以提高均相化学发光检测试剂盒中低值检测的灵敏度。主要原因是：由于PEG是亲水基团，可以阻断微球和蛋白之间的疏水作用；且PEG为长链聚合物，较大的空间位阻有利于将产生非特异性吸附的物质阻隔在距离微球表面较远的位置；且PEG呈电中性，可以阻断基质与蛋白质之间的静电作用。
附图说明
此处的附图被并入说明书中并构成本说明书的一部分，示出了符合本申请的实施例，并与说明书一起用于解释本申请的原理。
为了更清楚地说明本申请实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，对于本领域普通技术人员而言，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本申请实施例提供的聚乙二醇衍生物修饰的羧基微球的制备原理图；
图2为本申请实施例提供的聚乙二醇衍生物修饰的羧基微球的检测原理图。
具体实施方式
为使本发明实施方式的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施方式中的附图，对本发明实施方式中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施方式是本发明一部分实施方式，而不是全部的实施方式。基于本发明中的实施方式，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方式，都属于本发明保护的范围。因此，以下对在附图中提供的本发明的实施方式的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施方式。
在本发明的描述中，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。
除非另有特别说明，本申请中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等，均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。
实施例1
一种聚乙二醇衍生物修饰的羧基受体微球的应用方法，包括：
(1)取100μL粒径200nm的羧基受体微球(1％固含量，Lisa受体微球，为度生物Cat：67700005)，用200μL 0.05M的pH为5的MES缓冲液清洗2遍；
(2)将0.05M的pH为5的MES缓冲液分别加入1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)中，配制成10mg/ml的交联剂，各取2μL加入羧基受体微球中，后于37℃、1300rpm下搅拌30min，再离心、弃上清液，接着加入200μL 0.05M的pH为7的HEPES缓冲液进行超声重悬，得重悬液；
(3)按照羧基受体球与聚乙二醇衍生物的摩尔比为1：50，向重悬液中加入分子量为2000的聚乙二醇衍生物NH2(CH2CH2O)nCH2COOH，并加入20μg 10mg/mL的EDC、2μL 10％Tween-20，后于37℃、1300rpm下搅拌2h，接着以14000rpm离心12min，后弃上清，再加入等体积的MES偶联液超声清洗，再离心、去上清液，再用MES偶联液重复清洗2遍，得聚乙二醇衍生物修饰的羧基受体微球；
(4)向聚乙二醇衍生物修饰的羧基受体微球中加入50μg包被蛋白E2-Ab(南京欧凯，Cat：R193a3)、20μg 10mg/mL的EDC，于37℃、1300rpm的恒温混匀仪中反应2h，反应结束后超声均匀，再加入10μL 10％的BSA、1.2μL乙醇胺，于37℃、1300rpm的恒温混匀仪中封闭0.5h，封闭结束后，置于离心机中，以14000rpm离心15min，后弃去上清，再加入贮存液TBSB(pH7.4由(0.05M Tris(sigma)+1.5％BSA(Sigma B2064)+0.9％NaCl(国药)+0.2％TW-20(w/v，国药)+0.1％ PC300(v/v，Sigma)配置而成)清洗两遍，并稀释成5mg/mL。
实施例2
将实施例1中分子量2000的聚乙二醇衍生物改为分子量5000的聚乙二醇衍生物，其余与实施例1相同。
实施例3
将实施例1中分子量2000的聚乙二醇衍生物改为分子量10000的聚乙二醇衍生物，其余与实施例1相同。
实施例4
一种聚乙二醇衍生物修饰的羧基供体微球的应用方法，包括：
将实施例1中的包被蛋白E2-Ab(南京欧凯，Cat：R193a3)改为链霉亲和素SA(Sigma，Cat：S4762-10mg)；受体微球改为供体微球(Lisa供体微球，为度生物Cat：67500001)，其余与实施例1相同。
对比例1
一种羧基受体微球的应用方法，包括：
取100μL粒径200nm的羧基受体微球(1％固含量)，用200μL 0.05M的pH为5的MES缓冲液清洗2遍，再加入等体积的MES偶联液超声重悬，再加入50μg包被蛋白E2-Ab(南京欧凯，Cat：R193a3)、20μg 10mg/mL的EDC，于37℃、1300rpm的恒温混匀仪中反应2h，反应结束后超声均匀，再加入10μL 10％的BSA、1.2μL乙醇胺，于37℃、1300rpm的恒温混匀仪中封闭0.5h，封闭结束后，置于离心机中，以14000rpm离心15min，后弃去上清，再加入贮存液清洗两遍，并稀释成5mg/mL。
对比例2
一种羧基供体微球的应用方法，包括：
取100μL粒径200nm的羧基供体微球(1％固含量)，用200μL 0.05M的pH为5的MES缓冲液清洗2遍，再加入等体积的MES偶联液超声重悬，再加入50μg链霉亲和素SA(Sigma，Cat：S4762-10mg)、20μg 10mg/mL的EDC，于37℃、1300rpm的恒温混匀仪中反应2h，反应结束后超声均匀，再加入10μL 10％的BSA、1.2μL乙醇胺，于37℃、1300rpm的恒温混匀仪中封闭0.5h，封闭结束后，置于离心机中，以14000rpm离心15min，后弃去上清，再加入贮存液清洗两遍，并稀释成5mg/mL。
将实施例1～4和对比例1～2所得的羧基微球通过LICA检测仪以680nm检测，结果见表1。
表1不同分子量PEG修饰的羧基受体微球在均相化学发光检测试剂盒的应用
从表1可知，经过PEG修饰的羧基受体微球在均相化学发光试剂盒(雌二醇E2)上可以提高低值检测的灵敏度。
表2分子量2000的PEG修饰羧基供体微球在均相化学发光检测试剂盒的应用
从表2可知，经过分子量2000的PEG修饰的供体微球，可以明显改善检测时因非特异性结合造成的假阳性。
表3羧基微球的液态沉降情况
从表3可知，本申请的羧基微球在低温下能够维持分散状态稳定存在数周。
以上所述仅为本发明的优选实施方式而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种聚乙二醇衍生物修饰的羧基微球的应用方法，其特征在于，所述方法包括：
将包被蛋白、交联活化剂加入聚乙二醇衍生物修饰的羧基微球中进行交联反应，后超声混合，再加入封闭剂进行封闭反应，后离心、清洗；
所述聚乙二醇衍生物修饰的羧基微球由羧基微球的羧基与聚乙二醇衍生物的活性基团发生化学反应生成；
所述聚乙二醇衍生物的活性基团为氨基、羧基；
所述羧基微球为供体微球或受体微球。
2.根据权利要求1所述的应用方法，其特征在于：所述交联活化剂的终浓度为0.08～0.12wt％，所述交联活化剂为1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺。
3.根据权利要求1所述的应用方法，其特征在于，所述封闭剂为乙醇胺、牛血清蛋白、甘氨酸、CE510、酪蛋白、明胶中的一种或多种。
4.根据权利要求3所述的应用方法，其特征在于，所述封闭剂为牛血清蛋白和乙醇胺；所述牛血清蛋白和乙醇胺的体积比为100:(10～15)。
5.根据权利要求1所述的应用方法，其特征在于，所述交联反应的工艺参数包括：反应温度为35～40℃，转速为1000～1500rpm，反应时间为1.5～2.5h。
6.根据权利要求1所述的应用方法，其特征在于，所述封闭反应的工艺参数包括：反应温度为35～40℃，转速为1000～1500rpm，反应时间为0.4～0.6h。
7.根据权利要求1所述的应用方法，其特征在于，所述离心的工艺参数包括：转速为12000～16000rpm，离心时间为10～20min。
8.根据权利要求1所述的应用方法，其特征在于：所述聚乙二醇衍生物的活性基团为氨基和羧基。
9.根据权利要求1所述的应用方法，其特征在于，所述聚乙二醇衍生物修饰的羧基微球的制备方法包括：
将交联活化剂加入带羧基基团的羧基微球中进行活化反应，后离心、弃去上清液，再用偶联缓冲液重悬，后加入带活性基团的聚乙二醇衍生物、表面活性剂进行反应，反应结束后离心、弃去上清液，后用偶联缓冲液清洗，得聚乙二醇衍生物修饰的羧基微球。
10.根据权利要求9所述的应用方法，其特征在于，所述羧基微球为羧基受体微球或羧基供体微球，所述聚乙二醇衍生物的分子量为400-20000。
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