CN111596072A - 一种基于胶乳增强免疫比浊法测定pth的试剂盒及其制备使用方法 - Google Patents

一种基于胶乳增强免疫比浊法测定pth的试剂盒及其制备使用方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种基于胶乳增强免疫比浊法测定PTH的试剂盒，包括反应缓冲液和PTH胶乳试剂；反应缓冲液包括缓冲液、无机盐、增浊剂、表面活性剂等，pH 7.3‑7.7；PTH胶乳试剂包括至少两种通过PTH单抗与胶乳微球偶联而成的胶乳试剂组成液，每种胶乳试剂组成液分别包括胶乳保存液以及PTH单抗标记的胶乳微球；胶乳保存液包括缓冲液、无机盐、表面活性剂、稳定剂、防腐剂，pH 7.4‑7.7。本发明还提供了一种基于胶乳增强免疫比浊法测定PTH的试剂盒的制备使用方法。本发明试剂盒可使用全自动生化分析仪检测，操作简便、检测速度快、精密度高、重复性好、检测结果不受操作影响，并且价格上具有优势。

Description

一种基于胶乳增强免疫比浊法测定PTH的试剂盒及其制备使 用方法
技术领域
本发明涉及生物检测试剂制备领域，尤其涉及一种基于胶乳增强免疫比浊法测定PTH的试剂盒及其制备使用方法。
背景技术
甲状旁腺激素(hyperparathyroidism，PTH)，由甲状旁腺主细胞分泌而来。PTH分子是一条由84个氨基酸组成的肽，分子量为9000，其生物活性决定于N端的第1-27个氨基酸残基。在甲状旁腺主细胞内先合成一个含有115个氨基酸的前PTH原(prepro-甲状旁腺激素)，以后脱掉N端二十五肽，生成九十肽的PTH原(pro-甲状旁腺激素)，再脱去6个氨基酸，变成甲状旁腺激素。
在甲状旁腺主细胞内，部分甲状旁腺激素分子可以在第33位与第40位氨基酸残基之间裂解，形成两个片断，可与甲状旁腺激素一同进入血中。正常人血浆PTH浓度为10-50ng/L，半衰期为20-30min。甲状旁腺激素主要在肝水解灭活，代谢产物经肾排出体外。
近年，有学者从鳞状上皮癌伴发高血钙的患者癌组织中分离出一种在化学结构上类似甲状旁腺激素的肽，称为PTH相关(parathyroid hormone related peptide,甲状旁腺激素rp)，并进一步研究并发现，正常组织，如皮肤、乳腺以及胎儿甲状旁腺中，也存在这种肽。甲状旁腺激素rp与甲状旁腺激素从来源上是同族的，尤其两者的N端1-13位氨基酸残其完全相同，甲状旁腺激素rp也具有甲状旁腺激素活性。
甲状旁腺激素的生理作用主要是升高血钙、降低血磷，调节钙离子水平。通常，血浆钙离子水平与血浆甲状旁腺激PTH水平成反比。测定PTH对鉴别高钙血症和低钙血症上具有一定的价值，同时对甲状旁腺疾病的诊断及血液透析的监测都有重要意义。
检测PTH的方法主要基于抗原抗体反应。现有领域内，已有公司注册了PTH测定试剂盒(免疫荧光干式定量法)，为境内第二类医疗器械，国内无其他厂家上市。进口的则有酶联免疫法的测定试剂，也由一些公司代理注册。然而，我们发现，目前市场上却没有基于胶乳增强免疫比浊法测定的PTH试剂盒。相对于“免疫荧光干式定量法”PTH测定试剂盒以及“酶联免疫法”PTH测定试剂盒而言，基于胶乳增强免疫比浊法测定的PTH试剂盒，可以使用全自动生化分析仪检测PTH，操作简便、检测速度快、精密度高、重复性好、检测结果不受操作影响，并且价格上会有很大的优势。
据此，目前急需一种基于胶乳增强免疫比浊法测定PTH的试剂盒及其制备使用方法。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供一种基于胶乳增强免疫比浊法测定PTH的试剂盒及其制备使用方法，该试剂盒可使用全自动生化分析仪检测PTH，操作简便、检测速度快、精密度高、重复性好、检测结果不受操作影响，并且价格上会有很大的优势。
本发明采用以下技术方案解决上述技术问题：
一种基于胶乳增强免疫比浊法测定PTH的试剂盒，包括反应缓冲液和PTH胶乳试剂；
所述反应缓冲液包括的成分及相应含量为：缓冲液1-4g/L，无机盐15-20g/L，增浊剂20-30g/L，表面活性剂1-3mL/L，稳定剂30-40g/L，防腐剂0.7-1.7mL/L，溶剂为纯化水，pH7.3-7.7；
所述PTH胶乳试剂包括至少两种通过PTH单抗与胶乳微球偶联而成的胶乳试剂组成液，每种胶乳试剂组成液分别包括胶乳保存液以及保存在所述胶乳保存液中、且终浓度为1.0-1.5mg/mL的相应PTH单抗标记的胶乳微球；所述胶乳保存液包括的成分及相应含量为：缓冲液10-15g/L，无机盐6-12g/L，表面活性剂2-4mL/L，稳定剂30-80g/L，防腐剂0.6-1.6mL/L，溶剂为纯化水，pH 7.4-7.7；
其中，在所述PTH胶乳试剂中，每种通过PTH单抗与胶乳微球偶联而成的胶乳试剂组成液之间的混合比例为1:1。
作为本发明的优选方式之一，在所述反应缓冲液中：
所述缓冲液为三羟甲基氨基甲烷缓冲液、甘氨酸缓冲液、2-(N-吗啡啉)乙磺酸缓冲液、3-(N-吗啉基)-2-羟基丙磺酸缓冲液中的一种；
所述无机盐为氯化钠、氯化镁、氯化钾、氯化锌、氯化钙中的一种或多种；
所述增浊剂为聚乙二醇1000、聚乙二醇2000、聚乙二醇6000、聚乙二醇8000中的一种或多种；
所述表面活性剂为吐温-20、吐温-80、曲拉通X-100中的一种或多种；
所述稳定剂为BSA和蔗糖中的一种或多种；
所述防腐剂为Proclin300和硫柳汞中的一种。
作为本发明的优选方式之一，所述反应缓冲液的pH为7.5。
作为本发明的优选方式之一，在所述胶乳保存液中：
所述缓冲液为三羟甲基氨基甲烷缓冲液、甘氨酸缓冲液、2-(N-吗啡啉)乙磺酸缓冲液、3-(N-吗啉基)-2-羟基丙磺酸缓冲液中的一种；
所述无机盐为氯化钠、氯化镁、氯化钾、氯化锌、氯化钙中的一种或多种；
所述表面活性剂为吐温-20、吐温-80、曲拉通X-100中的一种或多种；
所述稳定剂为BSA、蔗糖、甘露醇中的一种或多种；
所述防腐剂为Proclin300和硫柳汞中的一种或多种。
作为本发明的优选方式之一，所述胶乳保存液的pH为7.6。
作为本发明的优选方式之一，所述PTH单抗标记的胶乳微球中使用的胶乳微球粒径范围为150-250nm。
一种上述基于胶乳增强免疫比浊法测定PTH的试剂盒的制备方法，包括如下步骤：
(1)配制反应缓冲液：
按照反应缓冲液的组分含量，将各组分物质于同一容器中混合，混合均匀后，制得反应缓冲液；
(2)配制PTH胶乳试剂：
①取固含量为10％的胶乳微球，并加至清洗缓冲液中；离心、去上清后用活化缓冲液对胶乳微球沉淀物重悬超声，并加入活化剂活化；再次离心，用偶联缓冲液对胶乳微球沉淀物重悬超声，制得活化胶乳微球；
②取至少两种PTH单抗，各自与制得的活化胶乳微球按照特定比例混匀，并进行一定时间的偶联，制取偶联后的胶乳微球；
③向上述偶联后的胶乳微球中加入封闭缓冲液进行封闭；封闭结束后，再次离心、去上清，并加入胶乳保存液重悬超声，制取各自的胶乳试剂组成液；然后，将制取的各胶乳试剂组成液混合，即得所需的PTH胶乳试剂。
作为本发明的优选方式之一，在所述步骤①中，所述清洗缓冲液与活化缓冲液采用磷酸盐缓冲液；所述偶联缓冲液采用磷酸盐缓冲液；所述活化剂采用EDAC/NHS，所述胶乳微球与活化剂的v/w比为：1：(10-20)。
作为本发明的优选方式之一，在所述步骤②中，所述活化胶乳微球与各PTH单抗抗体的v/w比均分别为1:(5-6)，偶联时间为2h；
在所述步骤③中，所述封闭缓冲液采用BSA、甘氨酸中的一种或多种，封闭时间1h。
一种上述基于胶乳增强免疫比浊法测定PTH的试剂盒的使用方法，包括如下具体步骤：
(1)吸取20μL样本，加入240μL反应缓冲液，37℃孵育5min；
(2)再加入60μLPTH胶乳试剂，并置37℃孵育；
(3)37℃孵育30s后读取吸光值A1；再孵育4.5min，读取吸光值A2；最后，计算ΔA，△A＝A2-A1，根据ΔA测算样本中PTH含量。
作为本发明的优选方式之一，本发明中采用的各种PTH单抗抗体均来源于本领域可直接购买得到的常规PTH单抗抗体。
本发明采用上述试剂盒用于检测人血清中PTH的含量，其反应原理为：样本中的PTH蛋白与试剂中特异性的胶乳PTH蛋白抗体结合发生抗原抗体反应；在特定波长下检测其吸光度，其变化程度与样本中的PTH含量成正比。
本发明相比现有技术的优点在于：
(1)本发明试剂盒利用胶乳增强免疫比浊法测定PTH，不仅操作简单、检测速度快，而且选择性好、特异性佳、精密度高、重复性与一致性好；并且，本发明可在全自动生化分析仪上使用，成本低廉，且自动化高，可节省检测时间，便于临床应用；
(2)通过本发明方法制备出的试剂盒，可以同时提高检测的灵敏度和特异性，使得试剂盒的线性范围更宽，准确度更高，更好满足临床的需求；
(3)在胶乳增强免疫比浊法应用中，若采用多抗进行标记可以有效提高试剂灵敏度，但会造成特异性不强，使检测结果准确度下降；若采用一株单抗对胶乳进行标记，可以使特异性提高，但灵敏度又会受到影响；针对上述问题，本发明试剂盒中，选择采用至少两株特异性较强的PTH单抗对胶乳进行分别标记，然后混合在一起，可以在保持灵敏度情况下，特异性也较强。
附图说明
图1是实施例6中本发明试剂盒的拟合曲线图。
具体实施方式
下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例1
本实施例的一种基于胶乳增强免疫比浊法测定PTH的试剂盒，包括反应缓冲液和PTH胶乳试剂。
所述反应缓冲液包括的成分及相应含量为：三羟甲基氨基甲烷缓冲液1g/L，氯化镁或氯化钾15g/L，聚乙二醇1000或聚乙二醇2000 20g/L，吐温-801mL/L，BSA 30g/L，硫柳汞0.7mL/L，溶剂为纯化水，pH 7.3。
所述PTH胶乳试剂包括至少两种通过PTH单抗与胶乳微球偶联而成的胶乳试剂组成液，每种胶乳试剂组成液分别包括胶乳保存液以及保存在胶乳保存液中、且终浓度为1.0mg/mL的相应PTH单抗标记的胶乳微球。其中，胶乳保存液包括的成分及相应含量为：三羟甲基氨基甲烷缓冲液10g/L，氯化镁或氯化钾6g/L，吐温-80 2mL/L，甘露醇30g/L，硫柳汞0.6mL/L，溶剂为纯化水，pH 7.4。
进一步地，在PTH胶乳试剂中，每种通过PTH单抗与胶乳微球偶联而成的胶乳试剂组成液之间的混合比例为1:1。
进一步地，在PTH胶乳试剂中，使用的胶乳微球粒径范围为150nm。
实施例2
本实施例的一种基于胶乳增强免疫比浊法测定PTH的试剂盒，包括反应缓冲液和PTH胶乳试剂。
所述反应缓冲液包括的成分及相应含量为：2-(N-吗啡啉)乙磺酸缓冲液或3-(N-吗啉基)-2-羟基丙磺酸缓冲液4g/L，氯化锌或氯化钙20g/L，聚乙二醇600030g/L，曲拉通X-100 3mL/L，蔗糖40g/L，Proclin300 1.7mL/L，溶剂为纯化水，pH 7.7。
所述PTH胶乳试剂包括至少两种通过PTH单抗与胶乳微球偶联而成的胶乳试剂组成液，每种胶乳试剂组成液分别包括胶乳保存液以及保存在胶乳保存液中、且终浓度为1.5mg/mL的相应PTH单抗标记的胶乳微球。其中，胶乳保存液包括的成分及相应含量为：甘氨酸缓冲液或2-(N-吗啡啉)乙磺酸缓冲液15g/L，氯化锌或氯化钙12g/L，曲拉通X-1004mL/L，BSA 80g/L，Proclin300 1.6mL/L，溶剂为纯化水，pH 7.7。
进一步地，在PTH胶乳试剂中，每种通过PTH单抗与胶乳微球偶联而成的胶乳试剂组成液之间的混合比例为1:1。
进一步地，在PTH胶乳试剂中，使用的胶乳微球粒径范围为250nm。
实施例3
本实施例的一种基于胶乳增强免疫比浊法测定PTH的试剂盒，包括反应缓冲液和PTH胶乳试剂。
所述反应缓冲液包括的成分及相应含量为：甘氨酸缓冲液2.5g/L，氯化钠15.5g/L，聚乙二醇8000 24g/L，吐温-20 2mL/L，蔗糖35g/L，Proclin300 1.2mL/L，溶剂为纯化水，pH 7.5。
所述PTH胶乳试剂包括至少两种通过PTH单抗与胶乳微球偶联而成的胶乳试剂组成液，每种胶乳试剂组成液分别包括胶乳保存液以及保存在胶乳保存液中、且终浓度为1.25mg/mL的相应PTH单抗标记的胶乳微球。其中，胶乳保存液包括的成分及相应含量为：MOPSO缓冲液12.5g/L，氯化钠9g/L，吐温-20 3mL/L，BSA 35g/L，蔗糖35g/L，Proclin3001.2mL/L，溶剂为纯化水，pH 7.6。
进一步地，在PTH胶乳试剂中，每种通过PTH单抗与胶乳微球偶联而成的胶乳试剂组成液之间的混合比例为1:1。
进一步地，在PTH胶乳试剂中，使用的胶乳微球粒径范围为200nm。
实施例4
本实施例的一种上述实施例1-3中基于胶乳增强免疫比浊法测定PTH的试剂盒的制备方法，包括如下步骤：
(1)配制反应缓冲液：
按照反应缓冲液的组分含量，将各组分物质于同一容器中混合，混合均匀后，制得反应缓冲液；
(2)配制PTH胶乳试剂：
清洗：取固含量为10％的胶乳微粒0.5mL，并加至3.0mL的清洗缓冲液中；20000r/min下离心30min，去上清；用3.0mL活化缓冲液对胶乳微粒沉淀物重悬超声。该步骤中，清洗缓冲液和活化缓冲液采用磷酸盐缓冲液。
活化：量取一定量的活化剂加入到上述清洗好的胶乳微粒中，混匀，对胶乳微粒进行活化；再次离心，用偶联缓冲液对胶乳微球沉淀物重悬超声，制得活化胶乳微球。该步骤中，偶联缓冲液采用磷酸盐缓冲液；活化剂采用2％EDAC0.1mL与4％NHS 0.2mL，活化时间0.5h；相应胶乳微球与活化剂的比例为1：(10-20)(重量比)，优选为1:15。
偶联：取至少两株经筛选好的特异性强的PTH单抗各自与活化好的胶乳微粒进行偶联，制取偶联后的胶乳微球。该步骤中，活化好的胶乳微粒与各PTH单抗抗体的v/w比均分别为1:(5-6)，优选为1:5.5，偶联时间为2h。
封闭：偶联时间结束后开始离心，20000r/min下离心30min，去上清；取5.0mL的封闭缓冲液对胶乳微粒沉淀物重悬超声，然后进行封闭，时间为1h。该步骤中，封闭缓冲液采用BSA、甘氨酸中的一种或多种，优选为1％BSA。
定溶：封闭结束后开始离心，20000r/min下离心30min，去上清；加入40mL的胶乳保存液对胶乳微粒进行重悬超声，然后定溶，制取各自的胶乳试剂组成液；最后，将制取的各胶乳试剂组成液按照1：1比例混合，即得所需的PTH胶乳试剂。
实施例5
本实施例的一种上述实施例1-3中基于胶乳增强免疫比浊法测定PTH的试剂盒的的使用方法。
检测仪器：日立7180；
温度：37℃；
比色杯：1cm；
分析方法：两点终点法；
测光点：19-34；
主副波长：546/0；
样本量/反应缓冲液/PTH胶乳试剂：20uL/240uL/60uL；
反应方向：(+)。
使用步骤：参见表1。
表1本发明试剂盒的使用步骤
Figure BDA0002535682750000091
校准方式为样条函数Spline。采用多点校准模式，用纯化水为零点，建立工作曲线。
计算方法：以校准品浓度对相应△A拟合校准曲线，样本浓度值通过校准曲线得出。
实施例6
本实施例用以评价上述实施例1-3中基于胶乳增强免疫比浊法测定PTH的试剂盒：
(1)线性相关性验证
线性相关系数：在[10.0ng/mL-2000.0ng/mL]范围内用接近线性区间下限的低值标本稀释接近线性区间上限的高值标本，混合成至少5个不同浓度(Xi)的标本，每个标本重复测定3次，分别计算测定结果的均值(yi)，见表2。以稀释浓度(Xi)为自变量，以测定结果均值(yi)为因变量求出线性回归方程。按公式(1)计算线性回归的相关系数r，所得结果应满足线性相关系数r≥0.9900。
Figure BDA0002535682750000101
表2本发明试剂盒的线性相关性比对值
Figure BDA0002535682750000102
图1是本发明试剂盒的拟合曲线图，如图1所示，本试剂盒的直线拟合曲线为：y＝1.0098x+1.355，R2＝1.0；R2>0.99，满足临床要求。
(2)精密度、重复性验证
重复性：在重复条件下，取(100.0±30.0)ng/mL和(400.0±60.0)ng/mL浓度的样本(质控品、校准品或其他定值样本)，用同一批号试剂重复测定10次，分别计算测定值的平均值和标准差，按公式(2)计算批内变异系数(CV)，所得结果CV应≤8.0％。
Figure BDA0002535682750000103
式中，SD为标准差，计算公式为：
Figure BDA0002535682750000104
dn为同水平各次所测值的偏差，计算公式为
Figure BDA0002535682750000111
xn为同水平各次所测值；
Figure BDA0002535682750000112
为平均值，计算公式为
Figure BDA0002535682750000113
结果如表3所示。
表3本发明试剂盒的重复性检测结果总结表
Figure BDA0002535682750000114
由检测结果可以看出，低值样本的CV为3.2％，高值样本的CV为1.4％，均小于8％，满足临床要求。
(3)准确度验证
取高、低两个水平的质控品，用同一批号试剂重复测定3次，测试结果记为(xi)，按公式(3)求出相对偏差(Bi)，3次结果均应符合测定值与质控品靶值相对偏差≤15.0％；如果3次结果中有2次符合要求，1次不符合要求，应重新连续测试20次，并分别按照公式(3)计算相对偏差(Bi)，当大于等于19次结果符合要求，准确度被验证，即符合测定值与质控品靶值相对偏差≤15.0％的要求。
Figure BDA0002535682750000121
式中：xi为测定结果；
T为靶值。
结果如表4所示。
表4本发明试剂盒的准确度检测结果总结表
Figure BDA0002535682750000122
从检测结果可以看出，低值质控的相对偏差为1.7％，高值质控的相对偏差为1.9％，均小于15％，故满足临床要求。
综上所述，本发明提供一种基于胶乳增强免疫比浊法测定PTH的试剂盒及其制备使用方法，能有效的提升PTH检测试剂的灵敏度与特异性。本发明采用了创新的用至少两珠特异性强的单抗通过标记胶乳微粒偶联然后混合在一起的技术来制备检测PTH的试剂盒，实现了上全自动生化仪，自动检测，并有效提高试剂的灵敏度与特异性，具有极高的应用价值与广阔的市场前景。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种基于胶乳增强免疫比浊法测定PTH的试剂盒，其特征在于，包括反应缓冲液和PTH胶乳试剂；
所述反应缓冲液包括的成分及相应含量为：缓冲液1-4g/L，无机盐15-20g/L，增浊剂20-30g/L，表面活性剂1-3mL/L，稳定剂30-40g/L，防腐剂0.7-1.7mL/L，溶剂为纯化水，pH7.3-7.7；
所述PTH胶乳试剂包括至少两种通过PTH单抗与胶乳微球偶联而成的胶乳试剂组成液，每种胶乳试剂组成液分别包括胶乳保存液以及保存在所述胶乳保存液中、且终浓度为1.0-1.5mg/mL的相应PTH单抗标记的胶乳微球；所述胶乳保存液包括的成分及相应含量为：缓冲液10-15g/L，无机盐6-12g/L，表面活性剂2-4mL/L，稳定剂30-80g/L，防腐剂0.6-1.6mL/L，溶剂为纯化水，pH 7.4-7.7；
其中，在所述PTH胶乳试剂中，每种通过PTH单抗与胶乳微球偶联而成的胶乳试剂组成液之间的混合比例为1:1。
2.根据权利要求1所述的基于胶乳增强免疫比浊法测定PTH的试剂盒，其特征在于，在所述反应缓冲液中：
所述缓冲液为三羟甲基氨基甲烷缓冲液、甘氨酸缓冲液、2-(N-吗啡啉)乙磺酸缓冲液、3-(N-吗啉基)-2-羟基丙磺酸缓冲液中的一种；
所述无机盐为氯化钠、氯化镁、氯化钾、氯化锌、氯化钙中的一种或多种；
所述增浊剂为聚乙二醇1000、聚乙二醇2000、聚乙二醇6000、聚乙二醇8000中的一种或多种；
所述表面活性剂为吐温-20、吐温-80、曲拉通X-100中的一种或多种；
所述稳定剂为BSA和蔗糖中的一种或多种；
所述防腐剂为Proclin300和硫柳汞中的一种。
3.根据权利要求1所述的基于胶乳增强免疫比浊法测定PTH的试剂盒，其特征在于，所述反应缓冲液的pH为7.5。
4.根据权利要求1所述的基于胶乳增强免疫比浊法测定PTH的试剂盒法，其特征在于，在所述胶乳保存液中：
所述缓冲液为三羟甲基氨基甲烷缓冲液、甘氨酸缓冲液、2-(N-吗啡啉)乙磺酸缓冲液、3-(N-吗啉基)-2-羟基丙磺酸缓冲液中的一种；
所述无机盐为氯化钠、氯化镁、氯化钾、氯化锌、氯化钙中的一种或多种；
所述表面活性剂为吐温-20、吐温-80、曲拉通X-100中的一种或多种；
所述稳定剂为BSA、蔗糖、甘露醇中的一种或多种；
所述防腐剂为Proclin300和硫柳汞中的一种或多种。
5.根据权利要求1所述的基于胶乳增强免疫比浊法测定PTH的试剂盒，其特征在于，所述胶乳保存液的pH为7.6。
6.根据权利要求1所述的基于胶乳增强免疫比浊法测定PTH的试剂盒，其特征在于，所述PTH单抗标记的胶乳微球中使用的胶乳微球粒径范围为150-250nm。
7.一种如权利要求1-6任一所述的基于胶乳增强免疫比浊法测定PTH的试剂盒的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)配制反应缓冲液：
按照反应缓冲液的组分含量，将各组分物质于同一容器中混合，混合均匀后，制得反应缓冲液；
(2)配制PTH胶乳试剂：
①取固含量为10％的胶乳微球，并加至清洗缓冲液中；离心、去上清后用活化缓冲液对胶乳微球沉淀物重悬超声，并加入活化剂活化；再次离心，用偶联缓冲液对胶乳微球沉淀物重悬超声，制得活化胶乳微球；
②取至少两种PTH单抗，各自与制得的活化胶乳微球按照特定比例混匀，并进行一定时间的偶联，制取偶联后的胶乳微球；
③向上述偶联后的胶乳微球中加入封闭缓冲液进行封闭；封闭结束后，再次离心、去上清，并加入胶乳保存液重悬超声，制取各自的胶乳试剂组成液；然后，将制取的各胶乳试剂组成液混合，即得所需的PTH胶乳试剂。
8.根据权利要求7所述的基于胶乳增强免疫比浊法测定PTH的试剂盒的制备方法，其特征在于，在所述步骤①中，所述清洗缓冲液与活化缓冲液采用磷酸盐缓冲液；所述偶联缓冲液采用磷酸盐缓冲液；所述活化剂采用EDAC/NHS，所述胶乳微球与活化剂的v/w比为：1：(10-20)。
9.根据权利要求7所述的基于胶乳增强免疫比浊法测定PTH的试剂盒的制备方法，其特征在于，在所述步骤②中，所述活化胶乳微球与各PTH单抗抗体的v/w比均分别为1:(5-6)，偶联时间为2h；
在所述步骤③中，所述封闭缓冲液采用BSA、甘氨酸中的一种或多种，封闭时间1h。
10.一种如权利要求1-6任一所述的基于胶乳增强免疫比浊法测定PTH的试剂盒的使用方法，其特征在于，包括如下具体步骤：
(1)吸取20μL样本，加入240μL反应缓冲液，37℃孵育5min；
(2)再加入60μLPTH胶乳试剂，并置37℃孵育；
(3)37℃孵育30s后读取吸光值A1；再孵育4.5min，读取吸光值A2；最后，计算ΔA，△A＝A2-A1，根据ΔA测算样本中PTH含量。
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