CN112595853A - 基于重组单克隆抗体制备的il-6免疫比浊法检测试剂盒及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于重组单克隆抗体制备的IL‑6免疫比浊法检测试剂盒,包括试剂R1、试剂R2。将制备得到的两种抗IL‑6抗体胶乳微球母液作为本试剂盒R2的一种成分,并在R1按一定比例添加PEG6000,试剂R1由缓冲液、表面活性剂、稳定剂及防腐剂构成,试剂R2由缓冲液、表面活性剂、稳定剂、防腐剂及抗体构成。还公开了一种基于重组单克隆抗体制备的IL‑6免疫比浊法检测试剂盒的制备方法。与同类胶乳增强免疫透射比浊法测定IL‑6的试剂盒相比,本发明试剂盒采用两株抗人IL‑6的单克隆抗体联用的方式,能够分别识别两个抗原表位,较单一使用单克隆抗体试剂盒有更高的灵敏度,较多克隆抗体试剂盒有更好的特异性。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域及免疫学测定分析领域,具体涉及一种基于重组单克隆抗体制备的IL-6免疫比浊法检测试剂盒(An IL-6immunoturbidimetric assay kitbased on recombinant monoclonal antibody)及其制备方法。
背景技术
白细胞介素-6,简称白介素6(IL-6),活化的T细胞和成纤维细胞产生的淋巴因子。能使B细胞前体成为产生抗体的细胞;和集落刺激因子协同,能促进原始骨髓源细胞的生长和分化,增强自然杀伤细胞的裂解功能。IL-6可调节多种细胞的生长与分化,具有调节免疫应答、急性期反白细胞介素-6。是一种多效性细胞因子,能调节多种细胞功能,包括细胞增殖、细胞分化、免疫防御机制及血细胞生成等。IL-6与多种肿瘤发生、发展关系密切,它通过干预细胞的黏附性和活动力、血栓形成、肿瘤特异性抗原的表达及肿瘤细胞的增殖,从而影响肿瘤的进展。它还能调节多种细胞功能,包括细胞增殖、细胞分化、免疫防御机制及血细胞生成等并在机体的抗感染免疫反应中起重要作用。IL-6在多种疾病时有明显改变,其表达失调可引起许多疾病,其临床表现主要为发病时IL-6水平增高。在发生内外伤、外科手术,应激反应,感染,脑死亡,肿瘤产生以及其它情况的急性炎症反应过程中IL-6会快速生成。手术病人的IL-6浓度能够预示是否会有手术并发症的产生。连续检测重症监护病人血清或血浆中IL-6的水平能有效的评估系统性炎症反应综合症(SIRS)的严重程度,脓毒血症以及脓毒血症性休克的预后情况。IL-6的血清浓度水平增高早于PCT和CRP,能作为脓毒血症的早期警告指标。IL-6还在慢性炎症反应(如类风湿关节炎)中扮演着重要角色。
检测IL-6的方法主要酶联免疫检测、化学发光检测和时间分辨荧光层析等方法。其中酶联免疫检测适用于科研研究,操作繁琐,临床难以推广应用。化学发光检测和时间分辨荧光层析成本较高,造成检测提升。
现临床中应用的IL-6的免疫比浊法检测试剂盒多采用胶乳微球标记单克隆抗体的方法,其中运用多克隆抗体存在检测特异度较差的问题。考虑IL-6在体内含量较低,单克隆抗体检测的灵敏度不够,选择两株单抗标记胶乳微球组合标记的方法来提高。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种两株抗IL-6单克隆抗体分别羧基微球进行标记,获得抗IL-6胶乳微球,并混合制备的IL-6免疫比浊检测试剂盒及其制备方法,能够提高IL-6检测技术中检测试剂盒的灵敏度。
为解决上述技术问题,本发明采用的一个技术方案是:提供一种基于重组单克隆抗体制备的IL-6免疫比浊法检测试剂盒,包括试剂R1和试剂R2:
所述试剂R1包括以下组分:
调节pH值至7.50,用纯化水定容;
所述试剂R2包括以下组分:
调节pH值至7.80,用纯化水定容。
在本发明一个较佳实施例中,该试剂盒还包括校准液,所述校准液包括以下组分:
pH值至7.00,用纯化水定容。
进一步的,所述抗IL-6胶乳微球母液的制备方法包括以下步骤:
(1)清洗:取300nm粒径的胶乳微球至离心管中,加入10倍体积的20—50mMMES活化缓冲液(pH5.0—6.0),振荡混匀,20000r/min离心30min,得到胶乳微球液;
(2)重悬:向胶乳微球液中加入同样体积的20—50mMMES活化缓冲液(pH5.0—6.0),用Tip吸头吹打混匀,转移至15ml离心管中,超声混匀,超声参数为:功率60—80W,工作1s间歇1s,总时间2—3min,超声3个循环,得到胶乳微球悬液;
(3)活化:按照微球/EDC等于1mg/(0.1—0.01)mg的比例称取EDC,放入离心管中,取纯水溶解,添加溶解后的EDC至胶乳微球悬液中,振荡30s,放入37℃水浴中振荡25min,然后转移至50ml离心管中,20000r/min离心30min,加入同样体积的20—50mMMES结合缓冲液(pH5.0—6.0),重悬微球备用,步骤同(2),得到胶乳微球重悬液;
(4)结合:取两株抗IL-6单克隆抗体,分别记做抗体IL-6-001和抗体IL-6-002,向抗体IL-6-001和IL-6-002中分别加入胶乳微球重悬液,微球/抗体比例为1mg/5mg.,振荡30s,然后放入37℃水浴中振荡120min进行结合,结合结束后,转移液体至离心管中,20000r/min离心30min,加入同样体积的2%BSA封闭缓冲液,重悬微球备用,步骤同(2),得到抗体IL-6-001胶乳微球悬液和抗体IL-6-002胶乳微球悬液;
(5)封闭:将抗体IL-6-001胶乳微球悬液和抗体IL-6-002胶乳微球悬液分别放入37℃水浴中振荡120min进行封闭,封闭结束后,转移液体至50ml离心管,20000r/min离心30min,加入同样体积的20mM PBS胶储缓冲液,重悬微球备用,步骤同(2),得到抗体IL-6-001胶乳微球封闭液和抗体IL-6-002胶乳微球封闭液;
(6)混合:将抗体IL-6-001胶乳微球封闭液和抗体IL-6-002胶乳微球封闭液按照体积比1:3混合均匀,获得抗IL-6胶乳微球母液。
为解决上述技术问题,本发明采用的另一个技术方案是:提供一种基于重组单克隆抗体制备的IL-6免疫比浊法检测试剂盒的测定方法,包括以下步骤:
分析方法:两点终点法;
反应方向:上升反应;
校准方式:Logit-Log(4P)或SPLINE处理;
测定波长:600nm;
测定温度:37℃;
样本:试剂R1:试剂R2=8:200:40(μL);
测试步骤:吸取8μL样本,加入240μL试剂R1,37℃孵育3-5min,加入60μL试剂R2,1min后读取吸光值A1,5min后读取吸光值A2,计算ΔA;
定标方法:6点定标,采用自动生化分析仪进行检测,设置校准品浓度分别为:0、0.32、0.63、1.25、2.50和5.00ng/mL;
依据定标值根据ΔA测算样本中IL-6含量。
本发明的有益效果体现在:
(1)相比其他方法,本发明试剂盒利用胶乳增强免疫透射比浊法测定IL-6,检测信号倍数放大,提高了检测灵敏度;并且可用于全自动生化分析仪,省时节约;
(2)与同类胶乳增强免疫透射比浊法测定IL-6的试剂盒相比,本发明试剂盒采用两株抗人IL-6的单克隆抗体联用的方式,能够分别识别两个抗原表位,较单一使用单克隆抗体试剂盒有更高的灵敏度,较多克隆抗体试剂盒有更好的特异性;
(3)本发明所述试剂盒使用大粒径的的羧基胶乳微球,提高了线性以及特异性,在抗体标记过程中,采用pH为6.5的缓冲液作为抗体结合缓冲液,提高了抗体的标记效率以及抗体活性,从而提高试剂测试的吸光度值,提升试剂检测线性;
(4)本发明所述试剂盒利用在校准液中添加一定量的甘油和BSA,保证了校准液的稳定性,提升了试剂盒检测的准确度;
(5)所述试剂盒中加入了抗干扰蛋白和表面活性剂,以保证试剂盒的稳定性和精密度。在高稳定性和高精密度情况下相比同类产品具有更高的灵敏度和特异性,提升了IL-6检测的应用价值。
附图说明
图1是本发明所述试剂盒与商品化IL-6检测试剂盒线性关系曲线图;
图2是本发明所述试剂盒线性范围线性回归图。
具体实施方式
下面对本发明的较佳实施例进行详细阐述,以使本发明的优点和特征能更易于被本领域技术人员理解,从而对本发明的保护范围做出更为清楚明确的界定。
实施例1
抗IL-6胶乳微球母液的制备:
1.清洗:取300nm粒径的胶乳微球至50ml离心管中,加入10倍体积的20mMMES活化缓冲液,振荡混匀,20000r/min离心30min。
2.活化:加入同样体积的活化缓冲液用Tip吸头吹打混匀微球,转移至15ml离心管中,超声混匀。超声参数为:功率60W,工作1s间歇1s,总时间2min,超声3个循环备用。
3.结合:称取过1.5倍需求的EDC,放入干净离心管中,取1ml纯水溶解。根据需求添加EDC至超声好的微球悬液中,振荡30s。放入37℃水浴中振荡25min。活化结束后,转移液体至50ml离心管,20000r/min离心30min。加入同样体积的结合缓冲液,重悬微球备用,步骤同(2)。
4.结合:流水下融化抗体IL-6-001和IL-6-002,根据所需量分别吸取抗体至活化好的微球悬液中,振荡30s。放入37℃水浴中振荡120min。结合结束后,转移液体至50ml离心管,20000r/min离心30min。加入同样体积的2%BSA封闭缓冲液,重悬微球备用,步骤同(2)。
5.封闭:将重悬好的微球放入37℃水浴中振荡120min。封闭结束后,转移液体至50ml离心管,20000r/min离心30min。加入同样体积的20mM PBS胶储缓冲液,重悬微球备用,步骤同(2)。
6.混合:将分别标记了抗体IL-6-001和IL-6-002的微球按照体积比1:3混合均匀,获得抗IL-6胶乳微球母液备用。
实施例2
IL-6免疫比浊法试剂盒校准品的制备:
所述IL-6校准品中含有:
实施例3:IL-6免疫比浊法试剂盒的制备:
所述IL-6检测试剂盒包括试剂R1和试剂R2:
(1)试剂R1中含有:
(2)试剂R2中含有:
(3)所述试剂盒的测定方法:
分析方法:两点终点法;
反应方向:上升反应;
校准方式:Logit-Log(4P)或SPLINE处理;
测定波长:600nm;
测定温度:37℃;
样本:试剂R1:试剂R2=8:200:40(μL)
测试步骤:吸取8μL样本,加入240μL试剂R1,37℃孵育3-5min,加入60μL试剂R2,1min后读取吸光值A1,5min后读取吸光值A2,计算ΔA。
定标方法:6点定标,采用日立7180全自动生化分析仪(或其他品牌型号),进行检测,设置校准品浓度分别为:0、0.32、0.63、1.25、2.50和5.00ng/mL。
依据定标值根据ΔA测算样本中IL-6含量。
实施例4
IL-6免疫比浊法试剂盒的评价
(1)线性相关性验证
利用实施例3配方配制试剂,与国家食品药品监督管理总局认可的某上市公司的IL-6检测试剂盒进行对照检测,检测100份临床血清样本,检测结果如下表1,获得了本发明试剂盒与上市某公司在售IL-6检测试剂的相关性曲线(见图1),通过检测结果显示,两试剂盒的线性相关曲线为y=1.3373+1.079X,相关系数R2=0.9982,说明两者较大的相关性,线性关系良好。
表1本发明试剂盒与某上市公司在售IL-6检测试剂盒线性相关性比对值
(2)线性范围验证
使用重组IL-6和生理盐水配制成浓度5.00ng/mL、2.50ng/mL、1.25ng/mL、0.63ng/mL和0ng/mL(生理盐水对照)的测试品,使用本发明试剂盒测定各测试品浓度,以稀释浓度为自变量,以测定结果为因变量求出线性回归方程,计算测定结果的相对偏差。结果显示测定结果与稀释浓度之间的线性回归方程为y=1.0805+0.2868X,见图2。相关系数R2=0.9999,说明线性关系良好,线性范围可达5ng/mL。
表2本发明试剂盒线性范围验证
(3)准确度验证
取具有溯源性高值血清质控和低值血清质控各一份,使用所述试剂盒检测10次,取均值,与质控靶值进行比对。结果表明检测值较靶值相对偏差较小,准确度较高。见表3。
表3所述试剂盒准确度验证结果
(4)精密度验证
取经在售试剂盒检测的临床血清样本高值和低值各一份,使用所述试剂盒对同一份血清样本连续检测10次,计算所述试剂盒的变异系数。精密度检测数据如下表4,检测结果表明所述试剂盒在检测高值和低值样本时的变异系数较小分别为1.8%和3.5%,精密度较好。
表4所述试剂盒精密度验证结果
(5)灵敏度及特异度验证
采用进口间接ELISA法IL-6检测试剂盒检测筛选50份阳性血清50份阴性血清,选择市售采用抗IL-6多克隆抗体制备的免疫比浊法试剂盒、市售采用抗单克隆抗体制备的免疫比浊法试剂盒与所述试剂盒同步检测此100份血清样本,按各试剂盒判定标准设高于参考标准为阳性,低于参考标准为阴性,以进口间接ELISA法检测试剂盒为金标准计算各试剂盒的灵敏度和特异度,结果见表5。结果表明所述试剂盒较市售两款试剂盒有较高的灵敏度及特异度。本发明的突出优点是较单克隆抗体制备试剂盒有更高的灵敏度且较多克隆抗体制备的试剂盒有更高的特异度,从而大大地提高临床检测的准确性满足临床检测的需求。
表5所述试剂盒灵敏度及特异度与市售试剂盒比较
在本说明书的描述中,参考术语“一个实施例”、“示例”、“具体示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中,对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且,描述的具体特征、结构、材料或特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
以上公开的本发明优选实施例只是用于帮助阐述本发明。优选实施例并没有详尽叙述所有的细节,也不限制该发明仅为所述的具体实施方式。显然,根据本说明书的内容,可作很多的修改和变化。本说明书选取并具体描述这些实施例,是为了更好地解释本发明的原理和实际应用,从而使所属技术领域技术人员能很好地理解和利用本发明。本发明仅受权利要求书及其全部范围和等效物的限制。
Claims (4)
3.根据权利要求1或2所述的基于重组单克隆抗体制备的IL-6免疫比浊法检测试剂盒,其特征在于,所述抗IL-6胶乳微球母液的制备方法包括以下步骤:
(1)清洗:取300nm粒径的胶乳微球至离心管中,加入10倍体积的20—50mMMES活化缓冲液(pH5.0—6.0),振荡混匀,20000r/min离心30min,得到胶乳微球液;
(2)重悬:向胶乳微球液中加入同样体积的20—50mMMES活化缓冲液(pH5.0—6.0),用Tip吸头吹打混匀,转移至15ml离心管中,超声混匀,超声参数为:功率60—80W,工作1s间歇1s,总时间2—3min,超声3个循环,得到胶乳微球悬液;
(3)活化:按照微球/EDC等于1mg/(0.1—0.01)mg的比例称取EDC,放入离心管中,取纯水溶解,添加溶解后的EDC至胶乳微球悬液中,振荡30s,放入37℃水浴中振荡25min,然后转移至50ml离心管中,20000r/min离心30min,加入同样体积的20—50mMMES结合缓冲液(pH5.0—6.0),重悬微球备用,步骤同(2),得到胶乳微球重悬液;
(4)结合:取两株抗IL-6单克隆抗体,分别记做抗体IL-6-001和抗体IL-6-002,向抗体IL-6-001和IL-6-002中分别加入胶乳微球重悬液,微球/抗体比例为1mg/5mg.,振荡30s,然后放入37℃水浴中振荡120min进行结合,结合结束后,转移液体至离心管中,20000r/min离心30min,加入同样体积的2%BSA封闭缓冲液,重悬微球备用,步骤同(2),得到抗体IL-6-001胶乳微球悬液和抗体IL-6-002胶乳微球悬液;
(5)封闭:将抗体IL-6-001胶乳微球悬液和抗体IL-6-002胶乳微球悬液分别放入37℃水浴中振荡120min进行封闭,封闭结束后,转移液体至50ml离心管,20000r/min离心30min,加入同样体积的20mM PBS胶储缓冲液,重悬微球备用,步骤同(2),得到抗体IL-6-001胶乳微球封闭液和抗体IL-6-002胶乳微球封闭液;
(6)混合:将抗体IL-6-001胶乳微球封闭液和抗体IL-6-002胶乳微球封闭液按照体积比1:3混合均匀,获得抗IL-6胶乳微球母液。
4.根据权利要求1或2或3所述的基于重组单克隆抗体制备的IL-6免疫比浊法检测试剂盒的测定方法,其特征在于,包括以下步骤:
分析方法:两点终点法;
反应方向:上升反应;
校准方式:Logit-Log(4P)或SPLINE处理;
测定波长:600nm;
测定温度:37℃;
样本:试剂R1:试剂R2=8:200:40(μL);
测试步骤:吸取8μL样本,加入240μL试剂R1,37℃孵育3-5min,加入60μL试剂R2,1min后读取吸光值A1,5min后读取吸光值A2,计算ΔA;
定标方法:6点定标,采用自动生化分析仪进行检测,设置校准品浓度分别为:0、0.32、0.63、1.25、2.50和5.00ng/mL;
依据定标值根据ΔA测算样本中IL-6含量。
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