TWI645040B - 登革熱病毒及屈公病毒的濃縮及純化方法 - Google Patents

Abstract

一種登革熱病毒及屈公病毒的濃縮及純化方法包括以下步驟。提供檢體，所述檢體具有登革熱病毒或是屈公病毒。將金屬奈米粒子與第一磁性體結合以形成磁性金屬奈米粒子，且所述磁性金屬奈米粒子表面包括聚醣，其中所述聚醣對於所述登革熱病毒或是所述屈公病毒具有專一性結合。將檢體與磁性金屬奈米粒子混合於溶液中，以使磁性金屬奈米粒子表面上的聚醣專一性結合至檢體中的登革熱病毒或是屈公病毒。提供第二磁性體至溶液中，其中第二磁性體的平均粒子徑大於磁性金屬奈米粒子的平均粒子徑。施加磁力於溶液以吸引磁性金屬奈米粒子以及第二磁性體而得到沉澱物，其中，登革熱病毒或是屈公病毒濃縮於沉澱物中。

Description

登革熱病毒及屈公病毒的濃縮及純化方法

本發明是有關於以一種聚醣固定化磁性金屬奈米粒子進行病毒濃縮之技術。特別是，應用於登革熱病毒以及屈公病毒之濃縮以及純化方法。利用一種含有聚醣固定化磁性金屬奈米粒子與較該粒子的粒子徑還大的磁性粒子形成之磁性體組成物，達到可以不經離心分離即可安全並且高效率將病毒濃縮以及純化之技術。

一般而言，生物細胞之表面會被聚醣所覆蓋，而病毒可以辨識存在於細胞表層之聚醣，利用此特性造成對細胞之感染。高等動植物受到病毒感染時，會産生疾病等感染症狀。此感染症狀於同等動植物種亦會造成傳染。例如流感的流行將危害人類健康，而家畜、農作物或是觀賞用動植物受到微生物感染時，相互傳染亦會造成生産損失。因此感染動植物的病毒之鑑別，對於感染疾病之早期診斷、治療或預防方針的決定是非常重要的。

登革熱病毒（Dengue virus； DENV）是一種單股正鏈核糖核酸（RNA）病毒，屬於黃病毒屬（Flavivirus）。主要製造三種病毒結構蛋白體，分別為包膜（envelope；E）、基質（matrix；M）、衣殼（capsid；C）和7種非結構蛋白（non-structural protein；NS）。依照其包膜蛋白的抗原性差異，登革熱病毒又可分為四種血清型（Serotype）。

登革熱的傳播主要以節肢動物（arthropod-borne）作為媒介，主要發生於熱帶以及亞熱帶國家。每年全世界約有3.9億例登革熱感染，其中9600萬出現臨床症狀。感染登革熱的病患會出現類似感冒的發燒症狀或引起病毒性出血熱（dengue fever），也可能演變至致命的登革熱休克症候群（dengue shock syndrome; DSS）。登革出血熱（dengue hemorrhagic fever; DHF）/登革熱休克症候群（DSS）的特徵為血管通透性急速增加以及有出血傾向。

登革出血熱尤其盛行於東南亞，於東南亞以小孩病例居多，而鄰近的區域如台灣則多為成人病例。根據登革熱的流行病學顯示，於台灣以成人感染居多，且呈現高盛行率以及死亡率。台灣於2002年至2006年間，登革出血熱的平均死亡率為9.5%高於東南亞1%。雖然登革熱未盛行於台灣，但過去數十年中由數種病毒血清型造成南台灣爆發數次大流行。於台灣登革熱的傳播季節主要為夏天開始時至冬天來臨前的階段，並且每年於此時期重覆發生疫情。

在2014年，台灣爆發了登革熱大流行，根據官方紀錄資料，這是自1981年來再次大流行的疫情。根據台灣衛福部疾病管制署（Centers for Disease Control, R.O.C）的統計，登革熱病例數已經達到15,732例，其中主要發生於南台灣的高雄，於2015年登革熱疫情更為嚴重，累計病例有43,784例，其中死亡例為212例。如要能掌控登革熱疫情，需要更高效率以及高效果的病毒監控系統，於實驗室迅速的診斷，迅速通報於中央以及地方防疫單位以強化控制疫情，因此，登革熱的早期檢測診斷為爭取時間以及控制疫情的關鍵。

另外，屈公病（Chikungunya fever）是感染屈公病毒（Chikungunya virus；CHIKV）所引起，不分男女發生於各年齡層。本病自癒性（self-limiting）高，死亡率不高，發病特徵是突然發燒、特徵性皮疹以及喪失行為能力的關節痛以及其他如頭痛、疲倦、噁心、反胃以及如無行為能力的關節痛及結膜炎。屈公病毒分類上屬於披膜病毒科（Togaviridae）、α病毒屬（Alphavirus），其基因體包括一段線型正向單股核糖核酸（RNA）分子，大小約11.8 kb，而病毒分離株顯示其主要由三種不同的分化株構成。

登革熱病毒及屈公病毒皆主要以節肢動物（arthropod-borne）作為傳播媒介，且發病症狀相似。屈公病先後於2005年至2007年間在印度洋島嶼以及於2011年在泰國爆發流行，屈公病亦於2006年至2007年間發生大流行，感染人數超過138萬人。屈公病主要於非洲的南部、東部、西部等區域發生疫情，也於印度洋島嶼和印度、亞洲、泰國等國家發生疫情。紀錄顯示，屈公病於2008年在泰國再次發生，根據病毒株基因鑑別結果其為東中南非型（ECSA strain）。

綜合上述，於低濃度時也能從患者檢體中高感度的檢測出登革熱以及屈公病毒為相當重要的需求技術。本技術發明者長年進行於含有各成分之各類檢體中，各種病毒之濃縮及純化檢測技術的研究。應用此病毒濃縮及純化方法，由特定構造之聚醣與配體化合物相結合之配體複合體，再將其固定於金屬，形成所謂的聚醣固定化金屬奈米粒子，應用病毒與聚醣之結合性，可成功開發出各種病毒的濃縮及純化之檢測技術。

然而，以離心分離進行病毒的濃縮及純化時，需對樣品施加非常大的重力。此時，由於樣品間的重量不平衡等原因，於離心機運轉時，常會有樣品飛散等問題發生。此外，使用離心分離法時，必須於設置有離心機器的實驗室進行，每次離心操作一次即耗時5至90分鐘，要將大量的檢體迅速的進行濃縮、純化並檢測是非常不容易進行的。特別是，檢測地點受限於醫院、檢驗實驗室等，要於疫情發生的疫區、野外進行檢測更是不可能的。

有鑑於此，目前亟需一種可以避免病毒飛散，且不需經過離心分離的登革熱病毒以及屈公病毒的濃縮及純化技術。

本發明提供一種登革熱病毒及屈公病毒的濃縮及純化方法，可安全且高效率的將登革熱病毒以及屈公病毒進行濃縮及純化，其回收效率更高於既有的離心方法。

本發明的登革熱病毒及屈公病毒的濃縮及純化方法包括以下步驟。提供檢體，所述檢體具有登革熱病毒或是屈公病毒。將金屬奈米粒子與第一磁性體結合以形成磁性金屬奈米粒子，且所述磁性金屬奈米粒子表面包括聚醣，其中聚醣對於登革熱病毒或是屈公病毒具有專一性結合。將檢體與磁性金屬奈米粒子混合於溶液中，以使磁性金屬奈米粒子表面上的聚醣專一性結合至檢體上的登革熱病毒或是屈公病毒。提供第二磁性體至溶液中，其中第二磁性體的平均粒子徑大於磁性金屬奈米粒子的平均粒子徑。施加磁力於溶液以吸引磁性金屬奈米粒子以及第二磁性體而得到沉澱物，其中，登革熱病毒或是屈公病毒濃縮於沉澱物中。

在本發明的一實施例中，所述的檢體為血清。

在本發明的一實施例中，所述聚醣包括肝素、硫酸化肝素、擁有硫酸化肝素之雙醣構造、軟骨素、構成軟骨素之雙醣構造或是硫酸化葡聚醣。

在本發明的一實施例中，所述金屬奈米粒子包覆第一磁性體以形成磁性金屬奈米粒子，且聚醣透過連結子化合物鍵結於磁性金屬奈米粒子的表面上，其中所述連結子化合物至少包括氨基與硫原子。

在本發明的一實施例中，所述連結子化合物為選自式（1）至式（4）的其中一種： 式（1） 式（2） 式（3） 式（4）； 在式（1）至式（4）中，m ¹、m ²、m ³、m ⁴、m ⁵各自獨立地為0以上6以下之整數，n ¹及q為1以上6以下的整數，n ²為0以上6以下之整數。

在本發明的一實施例中，所述磁性金屬奈米粒子的平均粒子徑在1 nm以上且在100 nm以下，而所述第二磁性體的平均粒子徑在100 nm以上且在1000μm以下。

在本發明的一實施例中，所述磁性金屬奈米粒子的平均粒子徑小於登革熱病毒或屈公病毒之病毒大小。

在本發明的一實施例中，所述磁性金屬奈米粒子與第二磁性體的重量比為1:1×10 ³〜1：1×10 ¹¹。

在本發明的一實施例中，所述加諸磁力的方法為利用100mT至500mT的磁力強度的磁石於所述溶液加諸磁力3秒至30秒以取得上清液以及沉澱物。

在本發明的一實施例中，所述第一磁性體的材料為選自氧化鐵、磁鐵礦、肥粒鐵或是含有鐵及鈷的氧化物的其中一種，第二磁性體的材料為選自氧化鐵、磁鐵礦、肥粒鐵或是含有鐵及鈷的氧化物的其中一種，且第一磁性體與第二磁性體的材料相同。

在本發明的一實施例中，所述第一磁性體的材料為選自氧化鐵、磁鐵礦、肥粒鐵或是含有鐵及鈷的氧化物的其中一種，第二磁性體的材料為選自氧化鐵、磁鐵礦、肥粒鐵或是含有鐵及鈷的氧化物的其中一種，且第一磁性體與第二磁性體的材料不相同。

在本發明的一實施例中，所述金屬奈米粒子的材料為選自金、銀、銅、鋁、白金、氧化鋁、SrTiO ₃、LaAlO ₃、NdGaO ₃或ZrO ₃的其中一種。

基於上述，本發明的方法將金屬奈米粒子與第一磁性體做結合，並利用金屬奈米粒子表面的聚醣抓取檢體中的登革熱病毒或是屈公病毒。另外，再加入第二磁性體以賦予金屬奈米粒子足夠的磁性，因此，可透過加諸磁力的方式進行病毒的濃縮及純化。藉由本發明的方法，可安全且高效率的將登革熱病毒以及屈公病毒進行濃縮及純化，其回收效率更高於既有的離心方法。

為讓本發明的上述特徵和優點能更明顯易懂，下文特舉實施例，並配合所附圖式作詳細說明如下。

以下將對本發明的實施例進行詳細說明。在本文中，將以「A~B」的範圍表示A以上與B以下。於本文中，所記載以及使用之參考資料包含非專利文獻以及專利文獻之所有內容。 1. 登革熱病毒以及屈公病毒的濃縮及純化方法

圖1為本發明實施例的一種登革熱病毒及屈公病毒的濃縮及純化方法的步驟流程圖。參考圖1的步驟S100，首先提供檢體，所述檢體具有登革熱病毒或是屈公病毒。舉例來說，所述檢體為從患者身上所取得的血清而具有登革熱病毒或是屈公病毒。換言之，本發明的方法是適用於直接從患者的血清中濃縮並純化出登革熱病毒或是屈公病毒，以有效地做出早期診斷。詳細來說，登革熱病毒或屈公病毒具有可以結合特定聚醣(辨識聚醣)之性質，使用病毒可以辨識之特定聚醣，在後續步驟中製備聚醣固定化磁性金屬奈米粒子並將其與檢體接觸後，若檢體中含有登革熱病毒或屈公病毒，則登革熱病毒或屈公病毒將會與上述聚醣固定化磁性金屬奈米粒子中的聚醣形成專一性結合。

在其它實施例中，檢體無特別限制，只要使用時可與後續聚醣固定化磁性金屬奈米粒子接觸者均可。在一些其它實施例中，檢體例如為唾液、鼻粘膜分泌液、血漿、全血血液從人體獲得之體液等。這些體液可直接做為檢體使用，也可添加例如培養基（minimum essential media；MEM）或生理食鹽水等調製之液體使用。也可以將聚醣固定化磁性金屬奈米粒子與所添加水、生理食鹽水或磷酸緩衝液等調製之溶液相混和，使檢體與聚醣固定化磁性金屬奈米粒子接觸。

另外，雖然本發明實施例是以濃縮純化登革熱病毒或是屈公病毒為例，但本發明不限於此。在其它實施例中，濃縮及純化之對象病毒並無任何特定限制，例如可為流感病毒、單純皰疹病毒、性病皰疹病毒、人類免疫缺乏病毒、B型肝炎病毒、C型肝炎病毒、帶狀皰疹病毒（varicella-zoster virus；VZV）、巨細胞病毒（cytomegalovirus；CMV）、成人T細胞白血病病毒（human T-lymphotropic virus 1；HTLV-1）、逆轉錄病毒、錦鯉疱疹病毒（koi herpes virus；KHV）、諾羅病毒（Norovirus）、輪狀病毒（Rotavirus）、登革熱病毒、屈公病毒、茲卡病毒（Zika virus）、豬流行性下痢病毒、豬繁殖及呼吸障害症候群病毒或牛RS病毒（respiratory syncytial virus）等。

接著，參考圖1的步驟S110，將金屬奈米粒子（聚醣固定化金屬奈米粒子）與第一磁性體結合以形成磁性金屬奈米粒子，且磁性金屬奈米粒子表面包括聚醣（可稱之為聚醣固定化磁性金屬奈米粒子）。再來，參考圖1的步驟S120，將檢體與磁性金屬奈米粒子混合於溶液中，以使磁性金屬奈米粒子表面上的聚醣與檢體上的登革熱病毒或是屈公病毒結合。舉例來說，金屬奈米粒子是包覆第一磁性體以形成磁性金屬奈米粒子，且聚醣是透過連結子化合物鍵結於磁性金屬奈米粒子的表面上。

在本發明的實施例中，所述金屬奈米粒子或是聚醣固定化金屬奈米粒子為一種「配體複合體」，其透過連結子化合物之氨基與具還原基末端之聚醣相結合，並且透過硫原子與金屬奈米粒子結合。舉例來說，所述連結子化合物為具有分子內氨基、硫原子、主鏈上具有碳-氮鍵結的碳氫鏈化合物。在其它實施例中，所述連結子化合物至少包括氨基與硫原子。所謂「配體複合體」是由可與任何金屬結合之連結子化合物、可與登革熱病毒或屈公病毒表面的蛋白質等等形成特異的相互作用之聚醣所構成之化合物。上述連結子化合物爲其氨基與具還原基末端之聚醣相形成共價結合之化合物。因此，上述配體複合體必須具有對蛋白質等物質不會發生非特異性之疏水性相互作用之特性。

在本發明的實施例中，由於連結子化合物的分子內具有硫原子，而硫原子可與金屬間形成金屬-硫鍵結（例如Au-S鍵結），因此，配體複合體所含的聚醣可以藉由上述連結子化合物固定於金屬上。此外，連結子化合物的氨基可與具還原基末端之聚醣進行還原胺化反應，因此可將上述聚醣簡易的導入。此聚醣之導入，例如可藉由連結子化合物的氨基（-NH ₂基）與聚醣進行還原胺化反應即可獲得。也就是說，因聚醣中之平衡所產生之醛基（-CHO基）或酮基（-CRO基、R碳氫基）可與上述連結子化合物之氨基反應。因此，藉此反應形成希夫鹼（Schiff base）鹽基，將其繼續還原，則可容易地將聚醣導入於氨基位置。

上述連結子化合物與上述聚醣以莫耳比1：1至50：1的比例混合較爲合適。此外，上述「具還原基末端之聚醣」為氨基位置碳原子未被置換之單糖鏈、寡糖鏈或多糖鏈。亦即，上述「具還原基末端之聚醣」為還原基聚醣。上述具還原基末端之聚醣無論是市售商品或天然物、合成調製品、或是由市售或天然取得多聚醣之分解物均可使用。

此外，具還原基末端的聚醣之具體例爲葡萄糖、硫酸化葡萄糖、半乳糖、甘露醣、麥芽糖、異麥芽糖、乳糖、潘糖、纖維二醣、蜜二糖（melibiose）、甘露寡糖、甲殼低聚醣（chitooligosaccharide）、鼠李糖寡糖（Rhamnose oligosaccharide）、葡萄糖胺、乙醯葡萄糖胺（N-acetyl-glucosamine）、葡萄糖醛酸（glucuronic acid）、肝素、硫酸化肝素、軟骨素、硫酸軟骨素、構成軟骨素之雙醣構造、硫酸角質素（Keratan sulfate）、擁有硫酸化肝素之雙醣構造、硫酸皮膚素（Dermatan sulfate）、硫酸葡聚醣（Dextran sulfate）、褐藻醣膠等等。然而，本發明不限於此。含有上述糖之聚醣皆屬於此範圍，選擇濃縮對象病毒可以辨識之聚醣為佳，能夠將其導入上述連結子化合物均為適宜。

在一些實施例中，所欲濃縮對象病毒為登革熱病毒或是屈公病毒，因此，聚醣較佳為硫酸化葡聚醣。在一些實施例中，所欲濃縮對象病毒為登革熱病毒或是屈公病毒，而聚醣可包括肝素、硫酸化肝素、擁有硫酸化肝素之雙醣構造。在一些實施例中，所欲濃縮對象病毒為登革熱病毒或是屈公病毒，而聚醣可包括軟骨素、構成軟骨素之雙醣構造（硫酸化軟骨素）。

在其它實施例中，當所欲濃縮對象病毒為流感病毒時，聚醣較佳為包括肝素、硫酸化葡聚醣、NeuAcα2－6Ga1β1－4G1cNAc、NueAcα2－6Ga1β1－3G1cNAc、NeuAcα2－3Ga1β1－4G1cNAc、NeuAcα2－3Ga1β1－3G1cNAc。在其它實施例中，當所欲濃縮對象病毒為單純皰疹病毒、性病皰疹病毒、帶狀皰疹病毒（VZV）、巨細胞病毒（CMC）、逆轉錄病毒、錦鯉疱疹病毒（koi herpes virus；KHV）、腺病毒時，聚醣較佳為包括肝素、硫酸化肝素、擁有硫酸化肝素之雙醣構造、軟骨素、構成軟骨素之雙醣構造或是硫酸化葡聚醣。在其它實施例中，當所欲濃縮對象病毒為愛滋病毒（AIDS）或成人T細胞白血病病毒（HTLV-1）時，聚醣較佳為包括肝素、硫酸化肝素、擁有硫酸化肝素之雙醣構造、硫酸化葡聚醣等。在其它實施例中，當所欲濃縮對象病毒為諾羅病毒時，聚醣較佳為包括岩藻醣、N-乙醯葡糖胺（N-Acetylgalactosamine）等。在其它實施例中，當所欲濃縮對象病毒為輪狀病毒時，聚醣較佳為包括乳糖等。若於檢體中含有上述病毒約1000份/毫升（copies/ml），則利用本發明之方法可以不經由離心分離，於短時間內簡便並且安全的進行病毒濃縮及純化，並且提供如RT-PCR（reverse transcription polymerase chain reaction）進行檢測病毒之存在。

在本發明實施例中，所述的連結子化合物為在分子內具有氨基、硫原子、主鏈上有碳-氮鍵結之碳氫鏈構造之化合物即可，但並無特別限定，其它公知之連結子化合物，或者例如由本案發明人到目前為止所開發之連結子化合物皆適用。

上述碳氫鏈可以是主鏈至少含有1個碳-氮鍵結，甚者，亦可以是一部分之碳或是氫被其他原子或取代基所置換者。例如，碳-碳鍵結（C-C鍵結）至少1個被碳-氮鍵結（C-N鍵結）置換之碳氫鏈，其他碳-素鍵結之一部分再被碳-氮鍵結、碳-氧鍵結（C-O鍵結）、醯胺鍵結（CO-NH鍵結）等置換之碳氫鏈亦可。上述氨基用於與聚醣結合，上述硫原子則用於與金屬結合。

上述氨基因易於與聚醣結合，位於上述碳氫鏈之末端位置較合適。上述氨基可以是被修飾之氨基。例如被乙醯基（Acetyl）、甲基（methyl）、甲醯基（formyl）等修飾之氨基或芳香族氨基。當然，未修飾之氨基亦可。其中又以芳香族氨基較合適。還原氨化反應之最適條件為pH3~4之條件下，氨基必須避免被質子化。因此，芳香族之共軛，在pH3~4條件下，非共有電子對存在於氮原子上之芳香族氨基較合適。

關於上述硫原子，上述碳氫鏈存在一部分的碳被硫置換的狀態、以及爲了金屬-硫容易形成結合，上述碳碳氫鏈最好含有二硫化物鍵結（S-S鍵結）或巰基（SH基）。上述碳氫鏈，含有硫原子的碳氫鏈構造為，例如如同下述式（1）至式（4）所表示的化合物，可為具有二硫化物鍵結（S-S鍵結）的五圓環的環狀構造。若為鏈狀構造，無論是直鏈構造或是具有支鏈的分支構造皆可。關於連結子化合物的部分，例如WO2005/077965號公報、美國專利公報7320867B2中所記載的，可使用下述的連結子化合物。

式（1） 在式（1）中，m ¹、m ²、m ³各自獨立地為0以上6以下之整數，n ¹為1以上6以下的整數。

式（2） 式（2）中，m ⁴、m ⁵各自獨立地為0以上6以下之整數，n ¹為1以上6以下的整數。

式（3） 式（3）中，n ¹、q各自獨立地為0以上6以下之整數。

式（4） 式（4）中，n ²為0以上6以下之整數。

上述的化合物中並未特別限定，例如下述化合物較為適合，如式（1）中m ¹、m ²、m ³分別為1，n ¹為1的化合物，式（2）中m ⁴、m ⁵分別為2，n ¹為1的化合物，式（3）中n ¹以及q為0的化合物，式（4）中n ²為4的化合物。

上述連結子化合物可使用例如WO2005/077965號公報，美國專利公報7320867B2等記載的公開的方法製造。例如，上述式（1）、式（2）、式（3）中所示的連結子化合物為具硫辛酸（lipoic acid）及末端具有芳香族氨基作為保護基團之胺化合物進行縮合反應，上述之末端具有芳香族氨基的保護基團脫去後製造而成。上述聚醣固定化金屬奈米粒子，可經由將上述配體複合體與含有上述金屬之溶液混合而製造，可容易的將聚醣固定。

在本實施例中，金屬奈米粒子或聚醣固定化金屬奈米粒子是與第一磁性體結合以形成磁性金屬奈米粒子（聚醣固定化磁性金屬奈米粒子）。在本文中的「第一磁性體」為與聚醣固定化金屬奈米粒子結合的磁性體。

磁性體並無特定的使用限制，可使用既知公開的磁性體。可使用如氧化鐵、磁鐵礦、氧化鉻、鈷、亞鐵鹽、鎳、釓等。其中，由於金屬可於表面容易的析出，故上述的第一磁性體各自以具有氧化鐵、磁鐵礦或肥粒鐵（ferrite）、含有鐵以及鈷的氧化物之特性最為適合。本說明書中的氧化鐵所指為具三價鐵的氧化物。磁鐵礦則為具二價及三價的鐵的氧化物（Fe ²⁺Fe ³⁺ ₂O ₄） 。

所謂「將聚醣固定化金屬奈米粒子與第一磁性體結合形成之構造」為具有聚醣固定化的金屬奈米粒子的金屬與第一磁性體結合後形成的構造。在一些實施例中，所述的金屬奈米粒子是包覆第一磁性體，與其結合後並形成磁性金屬奈米粒子。

然而。上述結合方方式並無特別的限定，例如上述金屬可經由與第一磁性體的表面金屬進行結合或是經由非特異性吸著而析出。如上述的，本文中「聚醣固定化磁性金屬奈米粒子」所指為聚醣固定化的金屬奈米粒子與第一磁性體進行結合後的構造。聚醣固定化金屬奈米粒子之配置方法並無特別限制，例如將欲與配體複合體的硫原子結合的金屬離子與上述的第一磁性體於溶劑/溶液中進行混合，使上述的第一磁性體表面的上述金屬被析出，接著與上述配體複合體混合，經由還原反應後製成。由此，可與配體複合體上的硫原子進行如S-S鍵結等方式的鍵結，例如經由Au-S鍵結等金屬-硫原子鍵結而將上述金屬固定，而配置成聚醣固定化的磁性金屬奈米粒子。

上述金屬奈米粒子之平均粒子徑以1nm以上及100nm以下之膠體狀金屬粒子較爲適合，又以2nm以上50nm以下更合適。平均粒子徑1nm以下之奈米粒子製作困難、而平均粒子徑100nm以上之膠體狀物容易沈降、有不易與登革熱病毒或屈公病毒反應之疑慮。第一磁性體的平均粒徑範圍為，上述聚醣固定化金屬奈米粒子的平均粒子徑之微奈米等級（大於0nm，1μm以下），若為較第二磁性體的平均粒徑小的粒徑大小時並無特別限制，上述聚醣固定化金屬奈米粒子之平均粒徑範圍為1nm以上100nm以下較合適，又以2nm以上50nm以下更合適。而金屬奈米粒子與第一磁性體結合後所形成的磁性金屬奈米粒子之平均粒子徑以1nm以上及100nm以下較爲適合。參考圖2，在本發明實施例的聚醣固定化磁性金奈米粒子的穿透式電子顯微鏡所觀察之圖像，其平均粒徑範圍皆小於100nm。

此外，登革熱病毒或屈公病毒之病毒大小大約在50nm或70nm左右，若使用比登革熱病毒或屈公病毒比大的粒子，則有與登革熱病毒或屈公病毒之結合效率低下的疑慮。因此，較佳是磁性金屬奈米粒子的平均粒子徑為小於登革熱病毒或該屈公病毒之病毒大小。圖3為本發明實施例的聚醣固定化磁性金奈米粒子捕捉病毒時以穿透式電子顯微鏡所觀察之圖像。參考圖3，當聚醣固定化的磁性金屬奈米粒子的平均粒子徑為小於病毒的大小時，其能夠有效捕捉病毒。平均粒子徑之計算方法等將說明如下。

本文中所述之「粒子徑」，粒子以穿透式電子顯微鏡觀察之、所指測量粒子之二次元形狀之最大內接圓之直徑。例如、粒子之二次元形狀為實質的圓形狀時，則測量圓之直徑。實質上為楕圓形狀之場合則測量楕圓之短徑，實質上為正方形狀之場合則測量正方形之邊長，實質上為長方形狀之場合則測量長方形之短邊長。「平均粒子徑」為複數個粒子之上述粒徑之平均値。於本說明書中，平均粒子徑是否為所定之範圍値，是將20個粒子以穿透式電子顯微鏡觀察，測定各粒子之上述粒子徑，再求得20個粒子之上述粒子徑的平均値。

上述金屬奈米粒子為選自金、銀、銅、鋁、白金、氧化鋁、SrTiO ₃、LaAlO ₃、NdGaO ₃或ZrO ₃的其中一種。金屬奈米粒子較佳為金，而當金屬奈米粒子為金奈米粒子時，以取得的容易性來評估，又以金氯化鈉（gold（III）sodium chloride）或其鹽類較適宜，而其中以三氯化金則尤佳。

上述金屬奈米粒子製造方法無特別限制，例如可使用現有公開方法，將三氯化金或其鹽類以甲醇或水等溶劑混合使其溶解，加入檸檬酸等作為還原劑，將還原後之金屬離子（例如金離子）導入金屬（例如金）後製得。

以上述之鹽化金屬酸以及其鹽類作為具體例，例如三氯化金（Gold（III）chloride）。上述配體複合體之構造為在上述連結子化合物之氨基上，導入具還原基末端之聚醣。換言之，上述配體複合體為具有如上述連結子化合物藉由氨基與具還原基末端之聚醣相結合之構造。

上述溶劑使用無特別限制，例如可使用水、甲醇、水以及甲醇的混合溶劑等。此外，上述還原反應所使用的還原劑亦無特別限制。例如可使用硼氫化鈉、檸檬酸以及其鹽類、抗壞血酸以及其鹽類、磷、單寧酸或其鹽類、乙醇、聯氨等。於上述金屬的離子與上述第一磁性體以及上述配體複合體以及上述還原劑混合的溶液中，若為上述金屬與其鹽類混合時，上述溶液中金氯化鈉（gold（III）sodium chloride）以及其鹽類之最終濃度於0.5mM〜30mM較為合適，而又以1mM〜10mM最為合適。

上述還原劑於上述溶液中的最終濃度為金離子的莫耳濃度的3〜20倍較為合適，而又以5〜10倍最為合適。上述配體複合體於上述溶液中的最終濃度為0.1mM〜100mM較為合適，而又以1mM〜10mM最為合適。上述第一磁性體於上述溶液中之最終濃度以鐵（Fe）濃度表示時，以0.5mM〜10mM較為合適，而又以1mM〜5mM最為合適。

上述第一磁性體與蛋白質產生的非特異性交互作用其影響程度可忽視。因此，使用上述配體複合體時，上述聚醣及登革熱病毒或屈公病毒的蛋白質間的交互作用可良好的表現其再現性。上述「聚醣固定化金屬奈米粒子」可經由加諸磁力，去除低分子之鹽類等非磁性成分，使其溶液狀態更加安定。

接著，參考圖1的步驟S130，將第二磁性體混合於上述溶液中，其中第二磁性體的平均粒子徑大於磁性金屬奈米粒子的平均粒子徑。在一些實施例中，步驟S130可以與步驟S120一起進行。在一些其它實施例中，步驟S130是在執行完步驟S120後進行。舉例來說，可將檢體與第二磁性體同時混合至磁性金屬奈米粒子的溶液中，或是先將檢體混合入上述磁性金屬奈米粒子的溶液中，再將第二磁性體加入。在其它實施例中，亦可先加入第二磁性體後再加入檢體。上述磁性金屬奈米粒子與第二磁性體的重量比為1:1×10 ³〜1：1×10 ¹¹時較為適合。第二磁性體並無特定的使用限制，可使用既知公開的磁性體。舉例來說，可使用如氧化鐵、磁鐵礦、氧化鉻、鈷、亞鐵鹽、鎳、釓等。其中，由於金屬可於表面容易的析出，故第二磁性體以具有氧化鐵、磁鐵礦或肥粒鐵、含有鐵以及鈷的氧化物之特性最為適合。第二磁性體與第一磁性體可為不同的磁性體，但使用同一種磁性體較為合適。第二磁性體的平均粒徑範圍為100 nm以上，且為1000μm以下，並且，若較上述聚醣固定化金屬奈米粒子平均粒徑大的粒徑大小時並無特別限制，平均粒徑範圍為100nm以上100μm以下較合適，100nm以上50000nm以下較合適，1000nm以上10000nm以下更為合適。

使用聚醣固定化磁性金屬奈米粒子時，藉由同時使用較聚醣固定化磁性金屬奈米粒子之平均粒子徑大的第二磁性體，可達到相當於使用離心分離時的濃縮及純化效率。上述聚醣固定化磁性金屬奈米粒子雖可容易的與登革熱病毒或屈公病毒結合為一體，但因為磁力小，若僅使用上述聚醣固定化磁性金屬奈米粒子，會造成布朗運動障礙而造成即使加諸外部磁力也無法有效的將登革熱病毒或屈公病毒進行濃縮及純化。因此，使用上述聚醣固定化磁性金屬奈米粒子時同時使用上述第二磁性體，可使聚醣固定化磁性金屬奈米粒子、上述第二磁性體、以及含有檢體的混合物具有克服布朗運動的磁力，因此，藉由外部的磁力加諸，可將登革熱病毒或屈公病毒進行濃縮及純化。

在加入第二磁性體後，如圖1的步驟S140所示，加諸磁力於上述溶液以取得上清液以及沉澱物，其中，登革熱病毒或是屈公病毒濃縮於沉澱物中。關於上述所謂的「加諸磁力」，磁力的加諸方法並無特定限制。例如是將裝有上述混合物的容器之外壁藉由使用公知的電磁石或棒磁石等永久磁石而加諸磁力。關於磁力的強度，以達成與使用離心分離法同等的濃縮及純化效率，以100mT至500 mT的磁力強度較為適合。在一些實施例中，是利用磁石於溶液加諸磁力3秒至30秒以取得上清液以及沉澱物。

加諸磁力於上述混合物時，可藉由觀察聚醣固定化磁性金屬奈米粒子與上述第二磁性體的顏色，以判斷加諸磁力所需要的時間。由於聚醣固定化磁性金屬奈米粒子被第二磁性體吸著後顏色會逐漸變淡，故以此現象為基準判斷即可。藉由磁力的加諸，使與聚醣固定化磁性金屬奈米粒子以及第二磁性體結合的病毒一起沉積而成為沉澱物。

由此沉澱物進行病毒DNA的回收，其回收方法並無特別限定，以既知的公開方法進行即可。例如，上述沉澱物以滅菌水或蒸留水水洗後，進行均勻混合，將含上述沉澱物之滅菌水或蒸留水加熱至100℃、可將上清中之病毒DNA回收。又或是，可加入如十二烷基硫酸鈉的強力肥皂水等物質於上述沉澱物，可使病毒外殼的蛋白質被破壞，可藉由回收其上清液進行病毒DNA回收。

上述混合物為上述聚醣固定化磁性金屬奈米粒子之聚醣與檢體相接觸後結合之檢體接觸性金屬奈米粒子，接著與上述第二磁性體混合所得。藉此若檢體中存在病毒時，病毒會被上述聚醣所辨識並進行結合，接著，由於加入了上述第二磁性體進行混合，因此具有可更迅速的使病毒以及聚醣進行結合之優點。

所謂上述聚醣固定化金屬奈米粒子與檢體相接觸，例如可以是將聚醣固定化金屬奈米粒子添加水、生理食鹽水、或磷酸緩衝液所調製之溶液，與檢體混和而得。混和後，可以用移液器（pipette）進行均勻混合，使病毒與聚醣確實結合，也可縮短病毒與聚醣結合所需時間。此外，上述所謂「辨識」是指病毒表面可以結合分子內糖部位之蛋白質（聚醣辨識部位）可與聚醣結合。上述結合方式可以是氫鍵結、離子鍵結、靜電的相互作用鍵結、凡德瓦力鍵結等。

藉本發明之相關方法進行病毒的濃縮及純化的結果確認時，使用方法並無特別限定，可用既定公知之方法。例如，將回收之病毒以聚合酶連鎖反應（PCR）、即時聚合酶連鎖反應（Real time PCR）、北方墨點法（northern blotting）、免疫層析法（Immunochromatography）、酵素連結免疫吸附分析法（ELISA）等方法確認。其中爲了迅速地將DNA定量，可使用RT-PCR。使用RT-PCR時，可將濃縮及純化前之Ct値（Threshold Cycle）與濃縮後之Ct値相減，依本發明之方法進行濃縮及純化後計算出之相差數值，若與以離心分離方法進行病毒之濃縮及純化時計算出的相差數值相同時，則表示可達成本發明欲解决之問題。 2. 磁性組成物以及濃縮及純化方法

本發明使用的磁性組成物為，具有聚醣固定化的金屬奈米粒子與第一磁性體結合後形成構造的聚醣固定化磁性金屬奈米粒子，並將平均粒子徑大於上述聚醣固定化磁性金屬奈米粒子的第二磁性體與其結合後極為所謂的磁性體組成物，上述聚醣固定化金屬奈米粒子為一種配體複合體，其連結子化合物的氨基為可與具有還原末端的聚醣相結合之構造，上述連結子化合物為具有分子內氨基、硫原子、主鏈上具有碳-氮鍵結的碳氫鏈化合物。

關於上述「聚醣固定化金屬奈米粒子」、「第一磁性體」、「聚醣固定化磁性金屬奈米粒子」、「第二磁性體」如上述說明的內容。上述磁性組成物，經由於檢體混合後，若檢體中存在病毒時，該病毒會被上述聚醣所辨識進行結合。接著，因其含有上述第二磁性體，所以該病毒與聚醣固定化磁性金屬奈米粒子的聚醣進行結合後，藉由加諸磁力於上述磁性組成物，可進行病毒的濃縮及純化。

上述磁性組成物，例如是將依上述的配置方法所配置的聚醣固定化金磁性屬奈米粒子的溶液中加入上述的第二磁性體進行混合後製成。此時，聚醣固定化磁性金屬奈米粒子與第二磁性體的重量比以1:1×10 ³〜1:1×10 ¹¹較適合。進行本發明技術之相關濃縮及純化操作時，最少需要物為本發明中的上述磁性組成體以及磁石。例如:檢體與上述磁性組成體進行混合後，經由加諸磁力於此混合物，可使與病毒結合的上述磁性組成物被沉澱。而由上述沉澱物進行病毒的回收方法則如上述內容。 實施例

以下，將以實例來說明本發明的病毒濃縮及純化方法的具體內容，本發明之使用範圍並不限定於下列實例。 實施例 1: 使用本發明方法進行流感病毒的濃縮及純化

將50mM的鹽化鐵（II）水溶液50μl以及50mM的鹽化鐵（III）水溶液25μl混合攪拌後，加入1M的氨水250μl，以配置成第一磁性體，即含有氧化鐵的磁性奈米粒子的溶液。

接著，將50mM的氯金（III）化鈉（gold（III）sodium chloride）水溶液75μl、5mg的「含有肝素之配體複合體」加入滅菌水後定量為150μl、再將125nM的硼氫化鈉水溶液300μl加入上述含有氧化鐵的磁性奈米粒子的溶液後混合攪拌。被肝素固定後的聚醣固定化磁性金奈米粒子（以下以「肝素固定化磁性金奈米粒子」表示，平均粒子徑33nm）做為配置溶液1。

上述「含有肝素之配體複合體」為肝素水溶液與上述一般式（3）中所示的連結子化合物（n1=0、q=0）之N,N-二甲基乙醯胺（N,N–dimethylacetamide；DMAC）溶液（以下簡稱為「DMAC溶液」），添加醋酸後，使肝素、上述連結子化合物、NaBH ₃CN之莫耳比為1：1：10，將添加醋酸之上述肝素水溶液、添加醋酸之DMAC溶液、NaBH ₃CN混合並於37℃下攪拌3日。

以PBS將A型流感病毒（菌株名稱：A/OKUDA/1957、H2N2）稀釋為0.5HAU/ml之流感病毒稀釋液，取流感病毒稀釋液490μl、加入10μl的上述溶液1中，於室溫（25.5℃）下靜置30分，以此做為溶液2。

接著，取10μl的平均粒子徑2.8μm之磁珠（產品名：Dynabeads M-270） 30mg/mL（以下以Dynabeads M-270表示）加入上述靜置30分配置成的溶液2，以此作為上述的第二磁性體。對照組的部分，不添加上述的第二磁性體，將上述溶液2以下列的配置方式進行試驗。

本發明內容中所指滅菌水為經過高壓滅菌器滅菌後的去離子水。上述Dynabeads M-270為一種肥粒鐵，上述Dynabeads M-270 30mg/mL所指的是，添加Dynabeads M-270的液體中，其Dynabeads M-270 的濃度為30mg/mL。

將磁石（磁束密度:150mT、80×15×3mm）與裝有上述溶液2之容器接觸，以1來回2秒的速度將上述容器進行約30次的上下混合（即30來回、共1分鐘），以加諸磁力於含有肝素固定後的聚醣固定化磁性金奈米粒子、第二磁性體、流感病毒的混合物。最後將上述磁石放置於上述容器底部2分鐘，使上述混合物完全沉降，以分開上清液以及沉澱物。

移除上清液後，加入超純水10μl於該沉澱物，並於100℃下加熱5分後，將上述磁石放置於容器底部的側面處約2分，加諸磁力以取得上清液。未添加上述第二磁性體的試驗對照組，除了於溶液2中不添加第二磁性體之外，其餘部分皆以同於添加第二磁性體時的同樣方法進行，於加諸磁力後，取得上清液以及沉澱物。

此外，未添加上述第二磁性體之對照組之一，將上述溶液2以10,000g進行10分的離心分離，以離心法取代加諸磁力之進行方式，取得上清液以及沉澱物。移除上清液後，加入超純水10μl於該沉澱物，於100℃下加熱5分後，以10,000g進行10分的離心分離，取得其上清液。

將這些上清液2μl添加於表1所示各試劑，並添加表１所示量混合之PCR用試劑20μl以供RT-PCR測定用。所使用RT-PCR裝置為LightCycler（登錄商標型號為350s、Roche製造）。使用螢光色素為SYBR Green，使用引子（Primer）為感染症研究所發行的病原體檢查手冊的「高病原性禽流感（2006年6月改定）」中的TypeA/M基因檢測用引子，分別為TypeA/M30F TTCTAACCGAGGTCGAAACG （20bp、SEQ ID NO: 1）以及TypeA/M264R2 ACAAAGCGTCTACGCTGCAG （20bp、SEQ ID NO: 2） ，使上述A型流感病毒的RNA的M protein增加234bp。

RT-PCR的條件為：反轉譯反應45℃2分鐘、初期熱變性處理設定為95℃1分鐘、PCR cycle數為95℃1秒、60℃1秒、72℃5秒為1循環（cycle）、並進行40 循環（cycle）。

表1中所指10×FBI為緩衝液，最終濃度的欄位中「1X」表示將10×FBI配置成最終濃度欄位的「1X」，意即進行10倍稀釋後使用。另外，SYBR Green的濃度欄位的「1/2000」以及最終濃度的欄位中的「1/20000」表示，將TaKaRa 50513的原液以滅菌水進行2000倍稀釋，將其最終濃度稀釋20000倍後使用。另外，Prime Script、SpeedSTAR皆為PCR用的酵素。

表 1<TABLE border="1" borderColor="#000000" width="85%"><TBODY><tr><td> 試劑 </td><td> 濃度 </td><td> 用量（μl） </td><td> 最終濃度 </td><td> 製造商/品名 </td></tr><tr><td> 滅菌水 </td><td> </td><td> 11.3 </td><td> - </td><td> </td></tr><tr><td> 10×FBI </td><td> </td><td> 2.0 </td><td> 1X </td><td> TaKaRa （附於SpeedSTAR） </td></tr><tr><td> 2.5mM dNTPs </td><td> </td><td> 1.60 </td><td> </td><td> TaKaRa （附於SpeedSTAR） </td></tr><tr><td> M30F引子 </td><td> 10μM </td><td> 0.5 </td><td> 0.25μM </td><td> 日本基因研究所 </td></tr><tr><td> M244R2引子 </td><td> 10μM </td><td> 0.5 </td><td> 0.25μM </td><td> 日本基因研究所 </td></tr><tr><td> Prime Script </td><td> 100 U/μl </td><td> 0.65 </td><td> 65U </td><td> TaKaRa RR037A </td></tr><tr><td> SpeedSTAR </td><td> 5 U/μl </td><td> 0.4 </td><td> 2U </td><td> TaKaRa RR037A </td></tr><tr><td> SYBR Green 1/2000 </td><td> 1/2000 </td><td> 2.0 </td><td> 1/20000 </td><td> TaKaRa 50513 </td></tr><tr><td> 樣品 </td><td> </td><td> 1.0 </td><td> </td><td> </td></tr><tr><td> 總計 </td><td> </td><td> 20.0 </td><td> </td><td> </td></tr></TBODY></TABLE>

進行0.5HAU/ml的A型流感病毒稀釋液的Ct值（表2中以濃縮及純化前的Ct值表示）以及上述上清液的Ct值（表2中以濃縮及純化後的Ct值表示）的測定，並計算其相差數值，此相差數值越大表示濃縮及純化效率越佳。結果如表2所示。

表 2<TABLE border="1" borderColor="#000000" width="85%"><TBODY><tr><td></td><td> 濃縮及純化前的Ct值表示 （1） </td><td> 濃縮及純化後的Ct值表示 （2） </td><td> （1） – （2） </td></tr><tr><td> Dynabeads M-270 </td><td> 24.66 </td><td> 21.59 </td><td> 3.07 </td></tr><tr><td> 第二磁性體不使用/磁石 </td><td> 24.66 </td><td> 22.98 </td><td> 1.68 </td></tr><tr><td> 第二磁性體不使用/離心分離 </td><td> 24.66 </td><td> 21.71 </td><td> 2.95 </td></tr></TBODY></TABLE>

表2中所表示「第二磁性體不使用/磁石」之試驗部分即為未添加上述第二磁性體，並將上述溶液2以磁石進行濃縮及純化之試驗組。而表2中所表示「第二磁性體不使用/離心分離」之試驗部分為未添加上述第二磁性體，並將上述溶液2以離心分離進行濃縮及純化之試驗組。

如表2所示，不使用上述第二磁性體而使用離心分離進行濃縮及純化時，濃縮及純化前的Ct值與濃縮及純化後的Ct值之差為2.95。另外，不使用上述第二磁性體，而僅以磁石進行濃縮及純化時，Ct值之相差數值為1.68。也就是說，未加入第二磁性體時，運用磁石進行濃縮及純化的效率較使用離心分離法時還差。進而，未加入第二磁性體時，加諸磁力於含有肝素之聚醣固定化磁性金奈米粒子以及流感病毒之混合物以取得沉澱物所需要的時間較長，約為30分鐘。相對來說，當使用Dynabeads M-270為第二磁性體時，Ct值之相差數值為3.07。換言之，加入第二磁性體並以磁石進行濃縮及純化時，其濃縮及純化效率與離心分離法相當甚至更佳。 實施例 2: 第二磁性體之探討

接著，進行了可能作為第二磁性體之磁性體之相關探討。進行測試之磁性體如表3所示。0981S2453 TS-3（表3以及下文將簡稱為「TS-3」）為磁鐵礦（magnetite）加入錳（Mn）後配置而成，屬於錳類的肥粒鐵。

關於Dynabeads M-270則如同於實施例1之說明。Dynabeads MyOne 10mg/mL（表3以及下文中簡稱為Dynabeads MyOne）為添加Dynabeads MyOne於含有0.01% 吐溫20（Tween-20）以及0.09% NaN ₃之PBS（pH7.4）時，Dynabeads MyOne的濃度為10mg/mL。Dynabeads MyOne為氧化鐵以及磁鐵礦（magnetite）的混合物。

肥粒鐵（ProMag 3series COOH Surfactant Free；PMC3N）（表3以及下文中簡稱為ProMag 3series）為類似Dynabeads M-270之肥粒鐵，不含有界面活性劑之磁性體。ProMag 3series是將ProMag 3series加入去離子水定量至1.9g/mL之懸濁液。

表 3<TABLE border="1" borderColor="#000000" width="85%"><TBODY><tr><td> 磁性粒子 </td><td> 平均粒子徑（μm） </td><td> 濃縮及純化前的Ct值表示 （1） </td><td> 濃縮及純化後的Ct值表示 （2） </td><td> （1）–（2） </td><td> 濃縮效率 </td></tr><tr><td> TS-3 </td><td> 80 </td><td> 28.52 </td><td> 24.46 </td><td> 4.06 </td><td> 17倍 </td></tr><tr><td> Dynabeads M-270 </td><td> 2.8 </td><td> 28.52 </td><td> 23.30 </td><td> 5.22 </td><td> 37倍 </td></tr><tr><td> Dynabeads My one </td><td> 1.0 </td><td> 28.52 </td><td> 24.51 </td><td> 4.01 </td><td> 16倍 </td></tr><tr><td> ProMag 3series </td><td> 3.1 </td><td> 28.52 </td><td> 25.21 </td><td> 3.31 </td><td> 10倍 </td></tr></TBODY></TABLE>

以PBS將A型流感病毒（A/OKUDA/1957、H2N2）稀釋至0.1HAU/ml作為流感病毒稀釋液，取流感病毒稀釋液490μl、加入10μl實施例1中使用的溶液1，以此做為溶液2’並於室溫（25.5℃）下先將溶液2’（500μl）以移液器進行1次/秒10次的混合，接著再以1次/秒混合約5分，藉由以移液器進行混合，促進聚醣固定化磁性金屬奈米粒子的聚醣與病毒的結合。

接著，將TS-3 20mg加入滅菌水2 ml後之懸濁液取10μl、或Dynabeads M-270 取10μl、或Dynabeads MyOne 取10μl或ProMag 3series 取10μl加入上述溶液2’（500μl）中，並以移液器進行1次/秒10次的混合。接著，將磁石（磁束密度:150mT、80×15×3mm）與加入於裝有上述溶液2’之容器接觸，此溶液2’即為加入表3所示之各別的磁性體的上述溶液2’。接著，以1來回2秒的速度將上述容器進行約30次的上下混合（即30來回、共1分鐘），以加諸磁力於含有肝素固定後的聚醣固定化磁性金奈米粒子、表3所示之磁性體、流感病毒的混合物。最後的1分，將上述磁石放置於上述容器底部，使上述混合物完全沉降，以分開上清液以及沉澱物。

移除上清液後，加入滅菌水10μl於該沉澱物，以移液器進行約10次的混合，於100℃下加熱2分後，以磁石加諸磁力約2分以取得上清液。將這些上清液取2μl，以同於實施例1條件進行RT-PCR，測定0.1HAU/ml的A型流感病毒稀釋液的Ct值（表3中以「濃縮及純化前的Ct值」表示）與上述上清液的Ct值（表3中以「濃縮及純化後的Ct值」表示），並計算其差值。

如表3所示，使用Dynabeads M-270時，上述差值為5.22。也就是說，比較不經過濃縮及純化下將0.1HAU/ml 的A型流感病毒（A/OKUDA/1957、H2N2）稀釋液直接用於RT-PCR測定時，可提早5.22 個循環檢測出病毒，表示濃縮及純化的效率提升了2的5.22次方，意即濃縮及純化的效率提升了37倍。

在後續的比較例1中，為取10μl的肝素固定化金奈米粒子的膠體溶液（平均粒子徑:15nm）與上述流感病毒稀釋液（490μl）混合，以10,000g進行10分的離心分離，取得上清液以及沉澱物。移除上清液後，加入超純水10μl於該沉澱物，於100℃下加熱5分後，以10,000g進行10分的離心分離，取得其上清液。計算上清液的Ct值、以及其與0.1HAU/ml 的A型流感病稀釋液的Ct值之差值（5.37）。由於使用Dynabeads M-270時，上述差值為5.22與比較例1中運用離心分離所得之差值5.37的差異不大，因此，可以得知的是，使用Dynabeads M-270為第二磁性體時，能得到與離心分離法相等的濃縮純化效率。

另外，使用TS-3、Dynabeads MyOne或ProMag 3series 時，濃縮及純化的效率較使用Dynabeads M-270時低。然而，如同表3所示，比較TS-3、Dynabeads MyOne 或ProMag 3series與上述A型流感病毒稀釋液直接用於RT-PCR測定之濃縮及純化效率，其濃縮及純化的效率提升了10倍以上。此結果如後述比較例1所示，與不使用第二磁性體僅使用聚醣固定化磁性金屬奈米粒子進行0.1HAU/ml的A型流感病毒之濃縮及純化相比時，其濃縮及純化效率（如後述表4所記載的2倍以及8倍）更佳。

換言之，使用TS-3、Dynabeads MyOne 或ProMag 3series 進行濃縮及純化時，不僅可以避免使用離心分離法所造成的樣品飛散等危險，與僅使用聚醣固定化磁性金屬奈米粒子的方法相比，使用這些第二磁性體不但可有效的進行濃縮及純化，更可提升濃縮及純化的效率。 比較例 1: 使用粒徑大的聚醣固定化磁性金屬奈米粒子進行流感病毒的濃縮及純化

如實施例1所示，不使用第二磁性體，僅使用聚醣固定化磁性金屬奈米粒子時，僅以加諸磁力進行濃縮及純化，無法達到與使用離心分離法同等的濃縮及純化效率。

因此，探討了不使用第二磁性體，而將使用聚醣固定化磁性金屬奈米粒子的粒子徑提升時，來確認是否可解決濃縮及純化效率不足的問題。使用的聚醣固定化磁性金屬奈米粒子為金氧化鐵磁性複合奈米粒子（Act-nonpareil公司製、Lot No:090711Rv）。上述金氧化鐵磁性複合奈米粒子以平均粒子徑30nm的氧化鐵（Fe ₃O ₄）為核心之奈米粒子，表面以聚乙烯吡咯烷酮（PVP；Polyvinylpyrrolidone、水溶性聚合物）塗覆，並含有Fe ₃O ₄3.62mg/ml、Au 2.24mg/ml。

上述聚醣固定化磁性金屬奈米粒子為將含有金離子、PVP水溶液，經由電子線照射得到的氧化鐵分散液體所合成之物質。上述金氧化鐵磁性複合奈米粒子的平均粒子徑，經由穿透式電子顯微鏡觀察，其長軸為約200nm，短軸為約50nm的不定形粒子。因此，上述金氧化鐵磁性複合奈米粒子的平均粒子徑，為較實施例1中所使用的肝素固定化磁性金奈米粒子（平均粒子徑33nm）大的物質。

加入水使此金氧化鐵磁性複合奈米粒子配置為6mg/ml之液體取250μl，將其與含有肝素之配體複合體（100mg/ml）取245μl混合，以製成肝素固定化氧化鐵磁性金奈米粒子的溶液，以與實施例1同樣的方法配置上述「含有肝素之配體複合體」。

以PBS將A型流感病毒（A/OKUDA/1957、H2N2）稀釋至0.1HAU/ml之流感病毒稀釋液，取流感病毒稀釋液490μl、加入10μl的肝素固定化氧化鐵磁性金奈米粒子的溶液後進行混合，於4℃下攪拌約30分。將裝有此配置溶液的試驗管下方放置磁石（磁束密度:150mT、80×15×3mm），將磁石放置約10秒至30秒以加諸磁力，使肝素固定化氧化鐵磁性金奈米粒子及上述病毒形成的複合體沉澱下來。

將上清液去除後，加入10μl的超純水於上述沉澱複合體，於100℃下加熱約10分後，將上述磁石放置於容器底部約2分以加諸磁力後，取得其上清液。關於對照組的部分，以上述肝素固定化氧化鐵磁性金奈米粒子的溶液以下述做法取代，以肝素固定化金奈米粒子（平均粒子徑15nm）的溶液（10μl）與上述流感病毒稀釋液490μl混合後，進行離心分離（10,000g、10分），分別取得上清液以及沉澱物。

上述所謂肝素固定化金奈米粒子的溶液之配置方法，為將最終濃度為1mM的氯化金（III）水溶液、最終濃度為8.1mM的檸檬酸鈉水合物（Sodium Citrate Hydrate）溶液、最終濃度為200〜2000mg/ml的上述「含有肝素之配體複合體」混合，於100℃下攪拌約10分後配置而成。50mM的鹽化鐵（II）水溶液50μl以及50mM的鹽化鐵（III）水溶液25μl混合攪拌後，加入1M的氨水250μl，以配置成第一磁性體，即含有氧化鐵的磁性奈米粒子的溶液。

接著，將50mM的gold（III）sodium chloride水溶液75μl、5mg的「含有肝素之配體複合體」加入滅菌水後定量為150μl、再將125nM的硼氫化鈉水溶液300μl加入上述含有氧化鐵的磁性奈米粒子的溶液後混合攪拌。被肝素固定後的聚醣固定化磁性金奈米粒子（以下以「肝素固定化磁性金奈米粒子」表示）做為配置溶液1。

取上述各上清液2μl添加於PCR用各試劑，以供RT-PCR測定用。使用試藥為，One Step SYBR Prime Script RT-PCR Kit Ⅱ（製品號碼RR0868A、TAKARABIO株式會社製）。

關於反應所使用之試劑，為將12.5μl的2×One Step SYBR RT-PCR Buffer 4、1μl的 Prime Script 1 Step Enyme Mix2、1μl的PCR 正股引子（10μM）、1μl的PCR 反股引子（10μM）、7.5μl的RNase Free蒸餾水混合後使用。使用的RT-PCR儀器為Thermal Cycler Dice Real Time System（型號TP800、TAKARABIO株式會社製），使用試螢光色素為SYBR Green。

所使用引子（Primer）為TypeA/M基因型的流感（J. Clin Microbiol. 2005 43No.2:589‒95.），以TypeA/MP gene （217‒236） Forward GGACTGCAGCGTAGACGCTT （20bp、SEQ ID NO: 3）以及TypeA/MP gene（382-405） Reverse CATYCTGTTGTATATGAGGCCCAT（24bp、SEQ ID NO: 4）作為測定用引子。將使上述A型流感病毒的RNA的M蛋白延長188bp。RT-PCR的條件為：設定反轉譯反應45℃5分鐘、初期熱變性處理設定為95℃10秒、PCR cycle數為95℃5秒、60℃30秒為1循環（cycle）、進行40 循環（cycle）。

接著，測定上述0.1HAU/ml 的A型流感病毒稀釋液的Ct值（記載於表4「濃縮及純化前的Ct值」）、上述上清液的Ct值（記載於表4「濃縮及純化後的Ct值」），並計算其Ct值之差值，結果如表4所示。

表 4<TABLE border="1" borderColor="#000000" width="85%"><TBODY><tr><td> </td><td> 濃縮及純化前的Ct值表示 （1） </td><td> 濃縮及純化後的Ct值表示 （2） </td><td> （1）–（2） </td><td> 濃縮效率 </td></tr><tr><td> 與磁石接觸10秒 </td><td> 34.83 </td><td> 33.61 </td><td> 1.22 </td><td> 2 </td></tr><tr><td> 與磁石接觸30秒 </td><td> 34.83 </td><td> 31.91 </td><td> 2.92 </td><td> 8 </td></tr><tr><td> 離心分離（肝素固定化金奈米粒子） </td><td> 34.83 </td><td> 29.46 </td><td> 5.37 </td><td> 41 </td></tr></TBODY></TABLE>

於表4中所記載「與磁石接觸10秒」為使用肝素固定化氧化鐵磁性金奈米粒子的溶液，放置上述鋖磁石於試驗管下方約10秒以加諸其磁力，取得上清液後以此上清液進行測定後的結果。而表4中「與磁石接觸30秒」則為使用肝素固定化氧化鐵磁性金奈米粒子的溶液，放置上述鋖磁石於試驗管下方約30秒以加諸其磁力，取得上清液後以此上清液進行測定後結果。另外，「離心分離（肝素固定化金奈米粒子）」為使用以平均粒子徑15nm的肝素固定的金奈米粒子的膠體溶液進行，取得其上清液後以此上清液進行測定後結果。結果顯示，上述差值為5.37。換言之，比較不經過濃縮及純化下將0.1HAU/ml 的A型流感病毒稀釋液直接用於RT-PCR測定時，可提早5.37 循環檢測出病毒，表示濃縮即純化的效率提升了2的5.37次方，意即濃縮及純化的效率提升了41倍。

另外，使用肝素固定化氧化鐵磁性金奈米粒子的膠體溶液時，加諸其磁力約1分內可取得肝素固定化氧化鐵磁性金奈米粒子以及上述病毒的複合體之沉澱物，其與「與磁石接觸10秒」進行時之上述差為1.22，與「與磁石接觸30秒」進行時之上述差為2.92。換言之，比較不經過濃縮及純化下將0.1HAU/ml 的A型流感病毒稀釋液直接用於RT-PCR測定時，分別可提早1.22 cycle、2.92 cycle檢測出病毒，表示濃縮及純化的效率分別提升了2倍、8倍。故以此方式，不使用第二磁性體，藉由將上述聚醣固定化磁性金屬奈米粒子的粒子徑增加的進行方法，仍無法達成與離心分離法同等的濃縮及純化的效率。 實施例 3: 培養登革熱病毒的濃縮 及純化 3-1 以 PCR 進行登革熱病毒檢測時之引子組合以及定量用質體（ Plasmid ）的設計以及配置

取已知登革熱病毒（以下以DENV表示）基因組中的亞型（subtype）1〜4各10株，將總計40株進行cDNA核酸序列配對，進行其相同性檢索。接著，如同論文（Chutinimitkul, S., Payungporn, S., Theamboonlers, A., Poovorawan, Y. （2005） Dengue　typing assay based on real-time PCR using SYBR Green I. J. Virol. Methods, 129, 8-15）中所記載的，以40株中具有高相同性質的片段的核酸序列如下所示的進行引子組合設計，作為PCR的SYB-G法的通用引物（Universal Primer）使用。

正股引子 5’TTAGAGGAGACCCCTCCC （SEQ ID NO: 5）

反股引子 5’TCTCCTCTAACCTCTAGTCC （SEQ ID NO: 6）

另外，定量用的質體中包含5’TTAGAGGAGACCCCTCCC 3’ （SEQ ID NO: 5）至5’TCCAGGCACAGAGCGCCGCAAGATCG 3’ （SEQ ID NO: 7）cDNA的片段，片段長度為201bp，使用pGEM®-T Easy kit （Promega公司製）依照其說明製備質體。此質體含有上述201bp中的DNA序列，使用數種類的引子組合進行PCR，分別產生如序列長度的產物後進行其純度以及質體溶液中的cDNA複製數確認。 3-2 登革熱病毒的培養

將500μl的Vero細胞溶液加入有30mL的MEM（10%FBS,1%APS）培養液的50ml 試驗管中並均勻混合，取此溶液6ml置於經過滅菌後的燒杯中，於37℃下4日、5%CO ₂的條件下進行培養，以抽濾管（aspirator）去除上清液後，以MEM（2%FBS,1%APS）洗淨培養基，加入少量的DENV-1、-2或是-4的溶液，於37℃、30分鐘下靜置培養使病毒感染細胞。接著，加入6ml的MEM（2%FBS,1%APS）培養基，於37℃、5%CO ₂的條件下靜置培養，確認細胞已被破壞之後，以800g、5分離心分離回收取得其培養上清液，再將回收取得之上清液以孔徑0.45μm的過濾器過濾。接著，將取得濾液以42,000rpm、4℃、90分的條件下進行離心分離，取得之沉澱物以PBS溶液洗淨2次後，加入500μl的PBS使其溶解（suspend），以此溶液作為DENV溶液。作為陰性對照組，則不加DENV於Vero細胞的培養上清液，其餘以相同方法製備而成的溶液作為MocK溶液。

圖4為DENV-2（2型）的純化DENV溶液以及MocK溶液的SDS-PAGE結果。左端為分子質量標記M（marker），正中間為經由上述方法進行純化後的DENV-2溶液，右端為Mock溶液，可看到DENV-2的蛋白質亮帶出現，故可以此判斷DENV-2的存在。

另外，如圖5A至圖5D所示，使用上述引子組合以及質體（圖中以PC表示）進行RT-qPCR後，純化得到的DENV-2溶液中具有DENV的RNA，而MocK溶液中（圖5C、圖5D）則無DENV的RNA存在。另外，RT-qPCR的反應條件以及使用酵素等試劑除了實施例1的表1以及引子以外皆相同，使用RT-PCR儀器為Thermal Cycler Direct & Real Time（TAKARABIO製造）。

詳細來說，圖5A及圖5C為RT-qPCR的增幅曲線圖，且分別為將DENV-2的培養液以及Mock溶液作為sample（模型）進行RT-PCR之結果。圖5B及圖5D為溶解曲線圖，且分別為將DENV-2的培養液以及Mock溶液作為sample（模型）進行RT-PCR之結果。如圖5C所示，Mock如同NC（陰性控制組，以蒸餾水取代樣品進行添加）其增幅曲線未見上升，並且其右下方的溶解曲線也未出現波峰。此外，如圖5A所示DENV-2從第26個循環起可見波峰上升，並且於圖5B的溶解曲線也可確認波峰的出現。與PC比較，相對於使用PC時延長了102bp，DENV-2因為基因的部分缺失延長了97bp，並且其GC pair缺少2組，因此其波峰溫度較PC稍微偏低。 3-3 以 DENV 的聚醣固定化金屬奈米粒子（ SGNP ）進行濃縮

以DENV-1的培養液作為DENV使用。聚醣固定化金屬奈米粒子（SGNP）的製備方法與比較例1中記載的肝素固定化金奈米粒子的製備方法相同，差別在於，是以平均分子量2500之硫酸化葡聚醣取代肝素用來固定金屬奈米粒子（DS25－GNP）。在本實施例中，是取26ml的20mM gold（III）sodium chloride （NACALAI TESQUE, Inc.製）、900μl平均分子量2500之硫酸化葡聚醣配製而成的5mM聚醣之配體複合體溶液、3ml的50 mM硼氫化鈉水溶液、並將其混合，將此混合溶液於遮光條件下攪拌製備聚醣固定化金屬奈米粒子的粗膠體溶液（colloid）。

接著，以分子量3500 cut之透析膜（Spectrumlab製）進行透析，以含有超純水及0.05%的Polyoxyethylene Sorbitan Monolaurate（吐溫20；Tween20、Spectrumlab製）的緩衝液進行透析，將透析後溶液予以凍結乾燥，然後以超純水將其溶解，以100,000g、4℃條件下離心30分，將離心後取得溶液予以凍結乾燥，再次以超純水溶解調整其濃度為5mg/ml。以TEM（穿透式電子顯微鏡）觀察其平均粒徑測得為5.0nm以動態光散射儀（DLS）測得為13.5nm。

以實施例1所記載的方法進行病毒的濃縮及純化，即將上述的DS25－GNP溶液10μl、DENV-1病毒培養上清液和經過磷酸緩衝液稀釋1,000,000倍的稀釋液（490μl）混合，進行離心（10,000g、10分鐘）後分別取得其上清液以及沉澱物。接著，以上述3-2的條件進行RT-qPCR測定，其結果如圖6A及圖6B所示。

圖6A至圖6B中，ppt表示經過濃縮及純化後的取得液，sup為上清液，no SGNP則為經過1,000,000倍稀釋的DENV-1的稀釋液。此外，圖6A為增幅曲線，圖6B為溶解曲線，相較之下ppt可於較少的循環數（Ct=20）時看到曲線的上升，溶解曲線的波峰則較圖5A至圖5D中的PC接近（85℃）。此外，雖於85℃附近可見sup以及no SGNP的溶解曲線的波峰，相較於ppt的循環數，其增幅曲線分別為28循環以及25循環較ppt的循環數更多，此外，其ppt的溶解曲線，於低溫側的波峰以及夾雜物較另外兩者少，由上可判定， DENV-1可經由DS25-GNP濃縮及純化。

另外，以含有1%的牛血清之磷酸緩衝液進行DENV-2及 DENV-4的培養上清液的稀釋，接著同上述做法以DS25-GNP進行病毒的濃縮及純化。從RT-qPCR的測定結果，sup以及no SGNP與無法取得同於PC的Tm值，比較其100,000倍以及1,000,000倍的稀釋溶液，ppt的循環數分別為36.8循環以及36.3循環，其與PC的所示Tm值相同，由此可知兩者取得的PCR產物相同。由上述結果顯示，經由DS25-GNP固定化的聚醣，其奈米粒子可捕捉DENV病毒，可經由此方法將DENV病毒濃縮及純化。

再者，將上述的DS25-GNP依實施例1的配置方法，以低分子的硫酸化葡聚醣配取代肝素進行聚醣固定化金屬奈米粒子固定化後與第一磁性體之結合物（以下以DS25-MGNP表示）以含有血清的DENV-2稀釋溶液進行比較。使用DS25-MGNP時，是進行如圖7所示步驟，其濃縮純化液（PPT）、上清液（SUP）、稀釋液（Original Solution）的RT-qPCR測定統整於表5。

詳細來說，參考圖7，是將DENV病毒加入PBS或1%FBS進行稀釋，並對此稀釋液（Original Solution）進行測定。接著，取500μl的稀釋液分別加入SMGNP（DS25-MGNP）以及MMP（第二磁性體）進行混合，將此試驗管放置於磁性支架（Magnetic Stand） 上以取得上清液以及沉澱物。將其上清液（SUP）除去後進行測定，接著加入500μl PBS沖洗磁石粒子，接著再將此試驗管放置於磁性支架（Magnetic Stand）上，去除其上清液，最後加入20μl的0.1%SDS來破壞病毒粒子，並對此含有0.1%SDS的懸浮液進行測定。

表 5<TABLE border="1" borderColor="#000000" width="85%"><TBODY><tr><td> 稀釋 </td><td> SMGNP 或SGNP </td><td> PPT </td><td> SUP </td><td> 稀釋液 </td></tr><tr><td> Ct </td><td> Tm </td><td> Ct </td><td> Tm </td><td> Ct </td><td> Tm </td></tr><tr><td> x10,000 </td><td> SMGNP </td><td> 24.16 </td><td> 83.37 </td><td> 31.16 </td><td> 83.83 </td><td> 29.21 </td><td> 83.86 </td></tr><tr><td> SGNP </td><td> 25.81 </td><td> 83.76 </td><td> 29.59 </td><td> 84.06 </td></tr><tr><td> x100,000 </td><td> SMGNP </td><td> 28.4 </td><td> 84.11 </td><td> 32.1 </td><td> 84.3 </td><td> 31.43 </td><td> 84.13 </td></tr><tr><td> SGNP </td><td> 29.04 </td><td> 83.91 </td><td> 31.44 </td><td> 83.8 </td></tr><tr><td> 控制組 </td><td> PC </td><td> </td><td> 18.25 </td><td> 84.75 </td></tr><tr><td> NC </td><td> </td><td> 32.21 </td><td> 78.19 </td></tr></TBODY></TABLE>

在圖7與表5中，聚醣固定化磁性金屬奈米粒子 （SMGNP）為以低分子的硫酸化葡聚醣進行金屬奈米粒子的固定化後，與第一磁性體進行結合形成的聚醣固定化金屬奈米粒子，MMP為第二磁性體。表5中的SMGNP為如圖7所示，運用磁性支架加諸磁力進行分離，SGNP則是以10,000g離心10分鐘，以將濃縮純化液（PPT）與上清液 （SUP）分離。

將病毒的培養液進行10,000倍以及100,000倍進行稀釋後，兩者的濃縮純化液（PPT）與上清液 （SUP）及稀釋液（Original Solution）相比，濃縮純化液的Ct值皆較小，顯示經由此方法可將病毒完成濃縮及純化。更詳細的比較SMGNP以及SGNP方法之結果，SMGNP的Ct值於10,000倍的稀釋時少了1.65個循環，於100,000倍稀釋時少了0.64個循環。由此結果可見，經由磁性分離方法進行病毒的濃縮及純化時，其濃縮及純化效率能夠與離心分離法相比較，甚至是更佳。 實施例 4: 患者檢體中的登革熱病毒及屈公病毒檢測驗證

於實施例4中，使用臨床檢體以DS25-MGNP進行DENV的濃縮及純化。由於，感染屈公病毒（以下以CHIKV表示）與登革熱病毒有同樣的症狀表現，因此同時以CHIKV的RNA進行檢測。登革熱患者的檢體收集於2015年台南市爆發登革熱疫情的期間，所有的檢體以特定方法進行檢測取得（one-step immune-chromatographic Dengue Duo Dengue NS1 Ag + Ab Combo assay ；SD BIOLINE, Yongin, Korea），此檢測方法可靈敏的同時檢驗NS1 antigen、IgM、IgG的存在。另外，同時也以LightMix dengue virus EC RT-qPCR檢測法進行檢體收集。依照2009年世界衛生組織（World Health Organization）的登革熱病例分類準則，將病人分類為登革熱重症（severe dengue）、登革熱合併警示徵象（dengue with warning signs）、登革熱無警示徵象（dengue without warning signs），[Dengue:Guidelines for diagnosis, treatment, prevention, and control. WHO/HTM/NTD/DEN/20091 （World Health Organization）. 2009.]。 以 Qiagen 方法進行 Total RNA 萃取

相關萃取步驟於台南國立成功大學醫學院附設醫院中進行，從140μl血清檢體中萃取病毒RNA，使用kit為QAIamp viral RNA mini kit （Qiagen, Venlo, Netherlands）或automated extraction system LabTurbo Virus mini Kit，使用系統為LabTurbo 48 Compact System （諾貝爾生物有限公司，台北台灣），最後加入40 µL 的萃取液，萃取得RNA。 從臨床檢體中檢測登革熱病毒及屈公病毒，以 SMGNP 方法提取登革熱病毒及屈公病毒的 RNA

如圖8所示，隨機選取109個檢體，於室溫下取5μl的患者血清加入500μl PBS後均勻混合，加入10μl 的DS25-MGNP （SMGNP）於此溶液後以震盪器混合約5秒，接著將此混合液移置另一個裝有10mg磁石粒子（上述第二磁性體即MMP）的試驗管（tube），接著以震盪器混合約5秒，將此試驗管放置於磁性支架（Magnetic Stand）上，將其上清液除去後，加入500μl PBS沖洗磁石粒子，接著再將此試驗管放置於磁性支架（Magnetic Stand） 上，去除其上清液，最後加入10μl含有0.1%SDS的RNase-free water破壞病毒粒子，將此含有0.1%SDS的懸浮液RT-qPCR檢測，檢測是否有登革熱病毒及屈公病毒的存在。 以 Real-time PCR 進行增幅放大

使用Qiagen kit進行萃取後，取2μl的溶出液作為模版（template）進行RT-PCR放大，實驗於台南國立成功大學醫學院附設醫院進行。於日本鹿兒島大學，取2μl或0.5μl由沉澱回溶RNA溶出液作為模版，以RT-PCR進行登革熱病毒及屈公病毒的放大，DENV所使用的引子（primers）與探針（probe）製備方法同上，CHIKV則依照日本國立感染症研究所（National Institute of Infectious Disease）（CHIKV v1.1） 試驗方法製備，CHIKV使用的引子以及探針如下:

正股引子: 5’GCRCCMTCTKTAACGGACAT3’ （SEQ ID NO: 8）

反股引子: 5’GCCCCCRAAGTCKGAGGAR 3’ （SEQ ID NO: 9）

探針: 5’TACCAGCCTGCACYC （SEQ ID NO: 10）

使用pGEM®-T Easy kit以及上述引子進行質粒（Plasmid）製備，以SL10571株萃取的CHIKV RNA（Chang-Kweng Lim, et al. Chikungunya virus isolated from a returnee to Japan from Sri Lanka: Isolation of two sub-strains with different characteristics. Am. J. Trop. Med. Hyg. 81（5）:865-868. 2009）作為陽性對照組（positive control），於台南國立成功大學醫學院附設醫院進行RT-PCR分析，使用系統以及材料分別為LightCycler 2.0 或LightCycler 480 II device （Roche），加入cDNA於含有PCR grade water的PCR混合試劑中，LightMix dengue virus EC kit 試劑 （包含DENV的引子、以及探針、外部標準（external control））， Roche LightCyclerR FastStart DNA Master HybProbe的mastermix。

PCR進行條件如LightMix dengue virus EC kit所述，擴增子（amplicon）是為DENV 3’端non-coding region （NCR:164-187bp），藉由LightCycler Red-640標記的雜交探針（hybriduzation probes）來偵測，而源自Lambda DNA的extraction control（349 bp），則是以LightCycler Red-690（channel 750）在探針（probe）上進行修飾，並利用螢光共振能量轉移（FRET:Fluorescence Resonance Energy Transfer）原理進行偵測。LightMix dengue virus EC kit提供質體每次反應約10 ¹〜10 ⁶濃度的增殖(copy)，以LightCycler軟體內之Second Derivative Maximum method（Automated（F"max）來測定每個樣品的交叉點（Crossing Point；Cp）之循環數，將所有數據結果進行對數轉換（logarithmic transformation）分析，同時也以軟體測得增殖數/反應（copies/reaction），用以表示每個樣品的病毒含量（viral load）。

測定CHIKV的 TaqMan 方法以及測定DENV的SYB-G方法已經分別建立於鹿兒島大學，以TaqMan方法進行CHIKV測定時，使用One-Step SYBR Prime Script RT-PCR Kit 2（Perfect Real Time, Takara Bio Inc., Otsu, Japan）進行RT-qPCR，添加Tween 20（最終濃度0.05%）於其混合反應液（reaction mixtures），將反應物於45℃下培養5分鐘，接著設定95℃5秒、60℃30秒為1循環、進行45個PCR 循環，使用儀器為Thermal Cycler Dice Real Time System（TAKARABIO株式會社製）。

以SYB-G方法進行DENV測定時，則使用One-Step SYBR Prime Script RT-PCR Kit 2 （Perfect Real Time, Takara Bio Inc., Otsu, Japan）進行RT-qPCR，添加Tween 20（最終濃度0.05%）於其混合反應液（reaction mixtures），將反應物於45℃下培養5分鐘，接著設定95℃5秒、60℃30秒為1循環、進行45個PCR 循環，使用儀器為Thermal Cycler Dice Real Time System（TAKARABIO株式會社製）。

分析2015年台南登革熱大流行時取得的109名患者的檢體，以LightMix® Dengue virus extraction control kit（Roche Diagnostics製造）以及以SMGNP方法結合SYB-G進行RT-qPCR進行檢測，結果顯示其檢測率（detection rate）分別為77%（58/75）及91%（99/109）。將使用LightMix方法檢測DENV，將檢測結果為陰性之檢體再次以SMGNP方法進行檢測時，陰性檢體中42%（14/33）的檢體檢測出DENV。相反的，將使用SMGNP方法檢測為陰性之檢體再以LightMix方法進行檢測時，陰性檢體中20%（2/10）的檢體檢測出DENV。此外，109個檢體中同時感染DENV及CHIKV者為7人（6.3%），7人中又有3人（42.9%）病狀明顯嚴重。由此可知，本發明的方法可有效地濃縮並純化革熱病毒及屈公病毒以利臨床檢測。 應用於產業之可能性

動植物受到病毒感染時，病毒的定量及鑑定為感染診斷以及決定預防分針的必要一環。但是，由於生物體、食品、飲用水、河川水等中所存在的病毒極微量，以現有的技術進行檢測時，常常有無法明確檢測之問題產生。

例如，於感染初期進行檢測時，感染患者所釋出的病毒數不足，即使以既有簡易檢測組（kit）或PCR方法進行檢測，常有因病毒量為檢測方法的檢測極限之下，而無法早期檢測出感染之問題產生。本發明利用病毒的聚醣結合性，使用聚醣固定化磁性金屬奈米粒子以及第二磁性體，可達到不需使用具有病毒飛散危險性之離心方法，即可安全並且高效率的進行病毒的濃縮及純化。

因此，本發明可適用於聚醣、蛋白質的機能分析、超高感度的病毒檢測，生命科學、醫療診斷、生物科技等各領域。此外，本發明亦可應用於家畜疾農產品之病毒感染檢測，預防病毒感染對家畜及農產品造成的經濟損害。綜合上述，本發明適用於醫藥產業、生物科技產業等廣泛領域。

雖然本發明已以實施例揭露如上，然其並非用以限定本發明，任何所屬技術領域中具有通常知識者，在不脫離本發明的精神和範圍內，當可作些許的更動與潤飾，故本發明的保護範圍當視後附的申請專利範圍所界定者為準。

S100、S110、S120、S130、S140‧‧‧步驟

SMGNP‧‧‧聚醣固定化磁性金屬奈米粒子

MMP‧‧‧第二磁性體

M‧‧‧標記

DENV-2 Pure‧‧‧純化登革熱病毒溶液

MOCK Pure‧‧‧不加入登革熱病毒的溶液

DENV/DENV-2‧‧‧登革熱病毒

MOCK‧‧‧不加入登革熱病毒的溶液

PC‧‧‧引子組合以及質體

NC‧‧‧陰性控制組

ppt‧‧‧經過濃縮及純化後的取得液

no SGNP‧‧‧稀釋液

sup/SUP‧‧‧上清液

SMGNP‧‧‧聚醣固定化磁性金屬奈米粒子

MMP‧‧‧第二磁性體

圖1為本發明實施例的一種登革熱病毒及屈公病毒的濃縮及純化方法的步驟流程圖。 圖2為本發明實施例的聚醣固定化磁性金奈米粒子的穿透式電子顯微鏡所觀察之圖像。 圖3為本發明實施例的聚醣固定化磁性金奈米粒子捕捉病毒時以穿透式電子顯微鏡所觀察之圖像。 圖4為純化登革熱病毒溶液以及不加入登革熱病毒的溶液之SDS-PAGE分析結果。 圖5A至圖5D為本發明實施例進行病毒的濃縮純化後以RT-qPCR測定的增幅曲線圖以及溶解曲線圖。 圖6A及圖6B為本發明另一實施例進行病毒的濃縮純化後以RT-qPCR測定的增幅曲線圖以及溶解曲線圖。 圖7為本發明實施例的一種登革熱病毒的濃縮及純化方法的步驟示意圖。 圖8為本發明另一實施例的一種登革熱病毒的濃縮及純化方法的步驟示意圖。

＜110＞ 世錡生命科學有限公司 ＜120＞ 登革熱病毒及屈公病毒的濃縮及純化方法 ＜130＞71894-TW-PA ＜140＞ ＜141＞ ＜150＞ ＜151＞ ＜160＞ 10 ＜210＞ 1 ＜211＞ 20 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ 引子 ＜400＞ 1 ttctaaccga ggtcgaaacg 20 ＜210＞ 2 ＜211＞ 20 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ 引子 ＜400＞ 2 acaaagcgtc tacgctgcag 20 ＜210＞ 3 ＜211＞ 20 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ 引子 ＜400＞ 3 ggactgcagc gtagacgctt 20 ＜210＞ 4 ＜211＞ 24 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ 引子 ＜400＞ 4 catyctgttg tatatgaggc ccat 24 ＜210＞ 5 ＜211＞ 18 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ 引子 ＜400＞ 5 ttagaggaga cccctccc 18 ＜210＞ 6 ＜211＞ 20 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ 引子 ＜400＞ 6 tctcctctaa cctctagtcc 20 ＜210＞ 7 ＜211＞ ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ 26 ＜223＞ 質體 ＜400＞ 7 tccaggcaca gagcgccgca agatcg 26 ＜210＞ 8 ＜211＞ ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ 20 ＜223＞ 引子 ＜400＞ 8 gcrccmtctk taacggacat 20 ＜210＞ 9 ＜211＞ 19 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ 引子 ＜400＞ 9 gcccccraag tckgaggar 19 ＜210＞ 10 ＜211＞ 15 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ 探針 ＜400＞ 10 taccagcctg cacyc 15

Claims (12)

1. 一種登革熱病毒及屈公病毒的濃縮及純化方法，包括：提供檢體，所述檢體同時含有登革熱病毒以及屈公病毒；將金屬奈米粒子與第一磁性體結合以形成磁性金屬奈米粒子，且所述磁性金屬奈米粒子表面包括聚醣，其中所述聚醣對於所述登革熱病毒以及所述屈公病毒具有專一性結合；將所述檢體與所述磁性金屬奈米粒子混合於溶液中，以使所述磁性金屬奈米粒子表面上的所述聚醣專一性結合至所述檢體中的所述登革熱病毒以及所述屈公病毒；提供第二磁性體至所述溶液中，其中所述第二磁性體的平均粒子徑大於所述磁性金屬奈米粒子的平均粒子徑；以及施加磁力於所述溶液以吸引所述磁性金屬奈米粒子以及所述第二磁性體而得到沉澱物，其中，所述登革熱病毒以及所述屈公病毒濃縮於所述沉澱物中。
2. 如申請專利範圍第1項所述的方法，其中所述檢體為血清。
3. 如申請專利範圍第1項所述的方法，其中所述聚醣包括肝素、硫酸化肝素、擁有硫酸化肝素之雙醣構造、軟骨素、構成軟骨素之雙醣構造或是硫酸化葡聚醣。
4. 如申請專利範圍第1項所述的方法，其中所述金屬奈米粒子包覆所述第一磁性體以形成所述磁性金屬奈米粒子，且所述 聚醣透過連結子化合物鍵結於所述磁性金屬奈米粒子的所述表面上，其中所述連結子化合物至少包括氨基與硫原子。
5. 如申請專利範圍第4項所述的方法，其中所述連結子化合物為選自式(1)至式(4)的其中一種： 在式(1)至式(4)中，m¹、m²、m³、m⁴、m⁵各自獨立地為0以上6以下之整數，n¹及q為1以上6以下的整數，n²為0以上6以下之整數。
6. 如申請專利範圍第1項所述的方法，其中所述磁性金屬奈米粒子的平均粒子徑在1nm以上且在100nm以下，而所述第二磁性體的平均粒子徑在100nm以上且在100μm以下。
7. 如申請專利範圍第1項所述的方法，其中所述磁性金屬奈米粒子的平均粒子徑小於所述登革熱病毒以及所述屈公病毒之病毒大小。
8. 如申請專利範圍第1項所述的方法，其中所述磁性金屬奈米粒子與所述第二磁性體的重量比為1：1×10³~1：1×10¹¹。
9. 如申請專利範圍第1項所述的方法，其中所述施加磁力的方法為利用100mT至500mT的磁力強度的磁石於所述溶液施加磁力3秒至30秒以取得上清液以及所述沉澱物。
10. 如申請專利範圍第1項所述的方法，其中所述第一磁性體的材料為選自氧化鐵、磁鐵礦、肥粒鐵或是含有鐵及鈷的氧化物的其中一種，所述第二磁性體的材料為選自氧化鐵、磁鐵礦、肥粒鐵或是含有鐵及鈷的氧化物的其中一種，且所述第一磁性體與所述第二磁性體的材料相同。
11. 如申請專利範圍第1項所述的方法，其中所述第一磁性體的材料為選自氧化鐵、磁鐵礦、肥粒鐵或是含有鐵及鈷的氧化物的其中一種，所述第二磁性體的材料為選自氧化鐵、磁鐵礦、肥粒鐵或是含有鐵及鈷的氧化物的其中一種，且所述第一磁性體與所述第二磁性體的材料不相同。
12. 如申請專利範圍第1項所述的方法，其中所述金屬奈米粒子的材料為選自金、銀、銅、鋁、白金、氧化鋁、SrTiO₃、LaAlO₃、NdGaO₃或ZrO₃的其中一種。