JP2018512410A - アミロイドβ特異的結合ペプチドならびにアルツハイマー型認知症の治療および診断のためのその使用 - Google Patents

Abstract

本発明は、アミロイドβ特異的結合ペプチドならびにアルツハイマー型認知症の治療および診断のためのその使用に関する。

Description

本発明は、アミロイドβ特異的結合ペプチドならびにアルツハイマー型認知症の治療および診断のためのその使用に関する。

ＷＯ０２／０８１５０５Ａ２（特許文献１）から、名称「Ｄ３」のＤ−鏡像異性体ペプチドが公知である。このペプチドは、モノマー状Ａβ（１−４２）を結合により安定化し、それが毒性のＡβ凝集体に変換されるのを阻害する計画の下に、主にモノマー状のＡβ（１−４２）に対する鏡像ファージディスプレイ選択により同定された。現在分かっていることによると、好ましくは、Ｄ３は、特に毒性のＡβオリゴマーをアミロイド非生成性でＴｈＴ陰性の非毒性の非晶質凝集体に変化させる。動物モデルにおいて、飲料水を用いたＤ３の経口投与によってさえ、処置されたトランスジェニックＡＤマウスが明らかにより少ないプラークを含み、有意に改善された認知能力を有することが達成されている。

しかし、アルツハイマー型認知症（ＡＤ）の原因療法のための承認された医薬は、依然として存在しない。概して、死後のＡＤ患者の脳からプラーク状の、いわゆるβアミロイド−ペプチド（Ａβ）の沈着が見られる。したがって、以前から、Ａβの様々な形態、例えばフィブリルが、ＡＤの発生および進行の原因と見なされている。

この数年来、特に、小型の自由拡散可能なＡβオリゴマーがＡＤの発生および進行の主な原因因子と見なされている。

モノマー状Ａβは、βセクレターゼおよびγ−セクレターゼによる前駆体タンパク質ＡＰＰ（アミロイド前駆体タンパク質）の連続的タンパク質分解により、全生涯にわたり体内で継続的に生成し（ＨａａｓｓおよびＳｅｌｋｏｅ １９９３（非特許文献１））、それ自体は非毒性である。それどころか、モノマー状Ａβが、脳内で生理学的機能、おそらく神経保護機能さえ有するという根拠がますます増えている（ＰｕｚｚｏおよびＡｒａｎｃｉｏ ２０１３（非特許文献２））。

Ａβモノマーは、その濃度（最終的には体内での生成速度および分解速度から明らかになる）に依存して、偶発的に、したがって加齢に伴いますます高くなる確率で自然発生的に、Ａβオリゴマーになって一緒に沈着するかどうか推測されている。いったん生成したＡβオリゴマーは、次にプリオンに類似したメカニズムにより増大し、最終的に疾患につながる可能性があろう。

この考察に基づき、毒性のＡβオリゴマーの生成を阻害するか、もしくは既存のオリゴマーを完全に除去すること、および／またはそのプリオン様の増大を阻害し、そのときにＡβモノマー濃度を減少させないことが、原因療法の目的であるべきであろう。

したがって、アルツハイマー型認知症の治療のために原因的に作用する医薬は存在しない。使用される医薬は、せいぜいいくつかの症状を緩和することができるが、疾患の進行を減速させることができず、ましてや阻止することはできない。

例えば、γセクレターゼ調節物質、Ａβ結合リガンドなどにより、最も多様な方法でＡβモノマーの濃度を低下させるいくつかの物質が確かに存在する。しかし、モノマー状Ａβに関して脳内で生理学的機能、おそらく神経保護機能さえ仮定されているので、アルツハイマー型認知症の作用メカニズムについての最新知識に基づいて、モノマーのＡβ濃度ではなく、ＡβオリゴマーのＡβ濃度を低下させることが、より有望である。

この仮説は、モノマー濃度を低下させる作用物質を用いたヒトにおける臨床試験（第ＩＩ相および第ＩＩＩ相）の、これまでのマイナスの結果によっても検証されている。

ＷＯ０２／０８１５０５Ａ２

ＨａａｓｓおよびＳｅｌｋｏｅ １９９３ ＰｕｚｚｏおよびＡｒａｎｃｉｏ ２０１３

したがって、本発明の課題は、
Ａ）毒性のアミロイドβ（Ａβ）オリゴマーもしくは凝集体の生成の阻害あるいはそれらの無毒化による、アルツハイマー病の原因療法のためのペプチドを提供することである。さらに、望ましくは、
Ｂ）先行技術から公知の鏡像ファージディスプレイ法がそのために改変されることであり、そして望ましくは
Ｃ）本発明によるペプチドの用途が示されることである。

この課題は、主請求項によるペプチド、キットおよび組成物ならびに従属請求項による方法および使用によって解決される。そのための有利な形態は、これに続いて従属する特許請求の範囲からそれぞれ明らかとなる。

異なるＡβ_１−４２種の固定化検査を示す。 単一ファージ−ＥＬＩＳＡを示す。 Ｍｏｓｄ−ペプチド−ＴｈＴ試験によるＡβ_１−４２の凝集調節を示す。 Ｍｏｓｄ−ペプチドによる異なるＡβ_１−４２種の調節を示す。 Ｍｏｓｄ１による異なるＡβ_１−４２種の調節を示す。 ＲＰ−ＨＰＬＣを用いた、Ｍｏｓｄ１による異なるＡβ_１−４２種の調節の定量化を示す。 １０μＭ Ｍｏｓｄ１と共に、およびそれなしでインキュデコイされた１０μＭ Ａβ_１−４２のＴＥＭ取り込みを示す。 ＭＴＴの還元試験：Ａβ_１−４２が誘導する細胞毒性に及ぼすＭｏｓｄ１の影響を示す。 ＡＰＰ発現細胞に及ぼすＭｏｓｄ１の影響を示す。

本発明の課題は、特定のＡβ種と特異的に結合するリガンドまたはペプチドを用いて解決される。とりわけオリゴマー状および／またはフィブリル状Ａβ_１−４２よりもＡβ_１−４２モノマーと特異的に結合するペプチドが提供される。

以下、標的分子およびデコイ（Ｋｏｅｄｅｒ）という用語は、同義的に使用される。

その際、選択性と呼ばれることも多い特異性は、以下を意味する。考慮すべき本発明によるリガンドまたは本発明によるペプチドが、例えば「デコイ」および「競合物質」と称される２つの異なる分子と結合する場合、１：１結合モデルの仮定の下に、各結合ペア、すなわちリガンド−デコイおよびリガンド−競合物質に、解離定数（Ｋ_Ｄ）または結合定数（Ｋ_Ａ＝１／Ｋ_Ｄ）をそれぞれ割り当てることができる。Ｋ_Ａ値が高いほど、それぞれの結合の親和性は大きい。競合物質と比べたデコイへのリガンドの特異性は、デコイへの親和性と競合物質への親和性の可能な限り大きな比（Ｑｕｏｔｉｅｎｔｅｎ）により表される。本発明によるリガンドは、特異性が大きいほど大きい、デコイに対するリガンドのＫ_Ａ値と競合物質に対するリガンドのＫ_Ａ値との比を有する。

この意味で、種Ｂ（競合物質）へのリガンドのＫ_Ａ値に対する種Ａ（デコイ）へのリガンドまたはペプチドのＫ_Ａ値の比が少なくとも１よりも大きい、好ましくは１．２または１．５よりも大きい、好ましくは２、３、４、５、６、７、８、９、とりわけ１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、とりわけ１００よりも大きい場合の相対的特異性が問題であり、その際、種Ａおよび種Ｂとして、例えばモノマー、オリゴマーおよびフィブリルのような異なるＡβ種を採用することができる。

その際、各中間値も採用することができる。数値を丸めると、上述の数値をもたらす。

上記モデルは、それぞれ個別にまたは混合して観察することができる複数の競合物質に、後者が大して洗練されていない場合も、原則的に拡大することができる。

この課題は、とりわけアルツハイマー型認知症の治療のためのアミロイドβ種特異的結合ペプチドにより解決される。その際、多くの場合に選択性とも称される特異性は、本発明によるリガンドまたは本発明によるペプチドが、基本的に異なるＡβ種、例えばＡβモノマーまたはＡβオリゴマーまたはＡβフィブリルと結合することができることを意味する。各結合ペア（例えばリガンドとＡβモノマーおよびリガンドとＡβオリゴマーおよびリガンドとＡβフィブリル）は、１：１結合モデルの仮定の下に、解離定数（Ｋ_Ｄ）または結合定数（Ｋ_Ａ＝１／Ｋ_Ｄ）がそれぞれ割り当てられる。Ｋ_Ａ値が大きいほど、それぞれの結合の親和性は大きい。

競合物質と比べたデコイへのリガンドの特異性は、Ａβモノマーへの親和性と、ＡβオリゴマーまたはＡβフィブリルへの親和性との可能な限り大きな比により表される。

したがって、本発明により特異性を調べるために、リガンドの、Ａβモノマーに対するＫ_Ａ値と、Ａβオリゴマー（またはＡβフィブリル）に対するＫ_Ａ値との比が用いられる。その比が大きいほど特異性は大きい。

その際、特異性または選択性を、種の１つとのリガンドの結合強度から明らかになる親和性と取り違えてはならない。異なるリガンドが同じ標的分子を競合するとき、特異性または選択性が小さいほど大きな結合親和性を有する可能性がある。本発明によると、モノマーまたはオリゴマーまたはフィブリルのような種と特に特異的に結合する、まさにそうしたリガンドを検出するべきである。生体分子は、治療剤および治療薬として適合するべきである。このように得られたリガンドまたはペプチドは、所望の特性を有し、本発明の課題を解決する。

最適化された鏡像ファージディスプレイ選択を利用して、例えばオリゴマー状またはフィブリル状Ａβ（１−４２）よりもモノマー状Ａβ（１−４２）と特異的に結合するペプチドが選択された。

モノマー状Ａβと可能な限り特異的に結合するが、同時にＡβオリゴマーおよび／またはフィブリルには可能な限り非特異的なペプチドをリガンドとして同定するために、モノマーの結合に関して正の選択圧ならびにオリゴマーおよびフィブリルとの結合に関して負の選択圧をもつ鏡像ファージディスプレイが開発され、使用された。

そのうえ、表面材料に高い親和性を示すリガンドの濃縮を回避するために、異なる表面材料の交互の使用ならびに／またはブロッキング試薬の交互の使用および不使用により、どの表面の組合せも２回使用されないよう配慮された。

本発明の枠内で、先行技術による鏡像ファージディスプレイは、不利益にも表面結合リガンドもしくはブロッキング試薬結合リガンドももたらすか、そうでなければ少なくとも、表面と同様にデコイとも結合したリガンドをもたらすことが認識された。

鏡像ファージディスプレイのための方法は、本明細書記載のモノマー特異的結合剤の選択以外に、当然、オリゴマー特異的結合剤の発見またはそれどころかタンパク質ミスフォールディング病の際に発生する他の種に対するリガンドの発見にも利用できることに留意されたい。

本発明による選択方法により、とりわけ所望の特性の１つまたは複数を有するＤ−ペプチドが同定される。

その特性は、とりわけ、Ａβモノマーへの結合特異性、Ａβフィブリルの生成阻害、Ａβの細胞毒性阻害、Ａβオリゴマーの除去、Ａβオリゴマーから非毒性の非アミロイド種への変換である。

凝集したＡβ１−４２種（Ａβ１−４２オリゴマー、フィブリルおよび高分子凝集体）との競合を用いた鏡像ファージディスプレイの最適化により、例えば、Ａβモノマー特異的結合リガンドまたはペプチドが検出される。Ａβオリゴマーをデコイとして使用すると、Ａβモノマーとの競合を用いて、Ａβオリゴマーへの特異的リガンドを検出することができる。

鏡像ファージディスプレイにおいて、例えば、Ｍ１３ファージのｇｐ３タンパク質上で提示され、そのゲノムにコードされたランダム化ペプチド配列の組換え体ライブラリーが、自然発生的なＬ−鏡像異性体の標的分子（例えばＡβ１−４２）の正確な鏡像（Ｄ−鏡像異性体）に対して選択される。上記ペプチド配列は、有利には、Ｍ１３ファージのｇｐ３タンパク質のＮ末端で提示され、そのゲノムにコードされて存在する。

ｇｐ３分子は、遺伝子産物３とも呼ばれ、ファージのエンベロープに存在する、宿主細胞との接触に必要なタンパク質である。

選択されたファージのｐ３遺伝子のＤＮＡ配列は、対応するペプチド配列に関する遺伝情報をｇｐ３分子上に含み、そのＤＮＡ配列を配列決定することができる。配列決定後、ゲノム配列をアミノ酸配列に書き換えることができ、標的分子（例えばＡβ１−４２）の生理学的Ｌ−鏡像異性体形態と結合するＤ−鏡像異性体ペプチドとして合成することができる。

いわゆるパニングラウンド、例えば６回のラウンドを実施することができる。その際、ファージライブラリーを、デコイとも呼ばれる固定された標的分子と接触させ、結合したファージを、１０億倍の他の非結合ファージのバックグラウンドから単離させる。

例えば、Ａβ１−４２のオリゴマー種またはフィブリル種と優先的に結合するファージの量は、まさしくこれらの種が例えば２回目のパニングラウンドから対抗選択物質（Ｇｅｇｅｎｓｅｌｅｋｔａｎｔ）または競合物質として添加されることによって、減少する。Ａβ１−４２オリゴマーおよびＡβ１−４２フィブリルに高い親和性を示すファージを、このようにファージプールから取り除くことができ、その結果、例えばＡβ１−４２モノマーに特異的なファージが濃縮される。Ａβオリゴマー特異的結合リガンドおよびペプチドを検出するために、当然、この方法を似た様式で適合させることができる。

加えて、プラスチック親和性ファージ、ＢＳＡ親和性ファージまたはストレプトアビジン親和性ファージの濃縮を減らすために、本発明によると、好ましくは全てのパニングラウンドで異なる処理をされた表面が使用され、かつ例えば高親和性ストレプトアビジン結合剤であるビオチンを用いたさらなる競合ステップが使用される。連続する選択ラウンドにおいて、選択圧が漸増された。そのために、ビオチン化標的分子（例えばモノマー状Ｄ−鏡像異性体Ａβ１−４２）の濃度を一定に保ったのに対して、２回目の選択ラウンドから、対抗選択物質として機能する非ビオチン化競合物質、例えばＤ−鏡像異性体Ａβ１−４２オリゴマーおよびＡβ１−４２フィブリルを漸増濃度で加えた。

さらに、鏡像ファージディスプレイの各ラウンドで別の基材表面が提供される。例えばこれを、例えばポリスチレン、ポリプロピレンおよびポリカーボネートのような異なるプラスチック種により行うことができる。

例えば、ラウンド１ではＢＳＡでブロッキングされたポリスチレン表面、ラウンド２ではポリプロピレン表面、ラウンド３ではＢＳＡでブロッキングされたポリカーボネート表面、ラウンドではポリスチレン表面、ラウンド５ではＢＳＡでブロッキングされたポリプロピレン表面、およびラウンドＲ６ではポリカーボネート表面というように切り替えることができる。

標的ペプチドを固定化する前に、例えばＴＢＳＴ中の１％ＢＳＡを用いて室温で１時間、例えばラウンド１、３および５だけに、任意選択的にその他のラウンドにも、ブロッキングステップを実施することができる。

異なる基材間の切り替えならびに表面の交互のブロッキングおよび非ブロッキングは、当該表面と比べた標的分子またはデコイへの特異性を増加させる。そのうえ、近縁競合物質との競合以外に、プラスチック表面またはＢＳＡ（ブロッキングステップ）と非特異的に結合するリガンドの減少も起こる。

競合物質および標的分子またはデコイは、同時にライブラリーと接触させる。したがって、この方法は、以下のステップを特徴とする：
ａ）固定化されたデコイを基材上に用意するステップ。
ｂ）デコイとして機能する固定化分子を、分子ライブラリーを含む溶液と接触させるステップ。
ｃ）特異性洗浄ステップとして、上記分子で占有された固定化デコイを少なくとも１つの競合物質と接触させるステップ。
ｄ）上記分子で占有された固定化デコイを競合物質と接触させた後に、相変わらずデコイと結合している分子を分離および増加させるステップ。
ｅ）前記ステップを繰り返すステップであって、各繰り返しの際に異なる基材が使用されるステップ。
ｆ）繰り返しの後に、デコイ上に残された分子の構造を同定するステップ。

異なる基材は、例えば、基材の種類の交換および／または試薬による基材のブロッキングもしくは非ブロッキングにより利用される。

デコイとして、タンパク質、ペプチド、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ｍ−ＲＮＡおよび化学化合物からなる群からの分子が使用される。デコイとして、とりわけ異なるＡβ種が使用される。

デコイが固定化される表面として、例えば、マイクロタイタープレート、磁気粒子、アガロースビーズまたはセファロースビーズからなる群からの構成成分が使用される。

競合物質として、好ましくは、ペプチド、タンパク質、ＲＮＡ、ＤＮＡおよびｍ−ＲＮＡからなる群からの少なくとも１つの構成成分との混合物が使用される。その際、競合物質は、その結合部位が固定化されたデコイの結合部位と類似性を有するデコイ類似分子である。競合物質としてはとりわけ、デコイとして使用されないＡβ種が使用される。

ライブラリーおよび競合物質は、好ましくは、固定化されたデコイと同時に接触させる。

この方法は、特異性洗浄ステップの際に、固定相が競合物質を含む溶液で洗浄されることを特徴とし得る。

この方法は、特異性洗浄ステップの際に、分子ライブラリーを有する溶液が、競合物質を含む溶液により交換されることを特徴とし得る。

この方法は、特異性洗浄ステップの際に、競合物質を有する溶液が、固相に加えられることを特徴とし得る。

特異性洗浄ステップおよび分子ライブラリーの添加は、ほぼ同時に行われる。万一、ファージが、原則的に、デコイおよび競合物質としてのＡβモノマーおよびＡβオリゴマーに親和性を有するならば、両方の標的に相前後せず同時に結合する可能性がある。好都合には、そのことは、デコイおよび競合物質の同時曝露の際も好ましくはデコイと結合するリガンドだけが濃縮される効果をもつ。

競合物質の濃度は、好ましくは選択ラウンド毎に高められる。

したがって、項目ａ）によるデコイは、選択すべき生体分子がそこに結合するはずの化合物である。デコイは、先行技術から公知の方法により第１の表面に固定される。非限定的な例として、タンパク質、ペプチド、ＲＮＡまたはＤＮＡ分子、とりわけＡβモノマーをデコイとして挙げることができる。可能な表面として、例えば、マイクロタイタープレート、磁気粒子、アガロースビーズまたはセファロースビーズを使用することができる。

第２のステップｂ）において、固定化されたデコイを、ランダム化分子ライブラリー−特別に生体分子−と接触させる。これらの生体分子は、デコイとの結合を競合する。ランダム化ライブラリーは、混合物中の非常に多種、例えば１０^１２種、同様に１０^４種または１００種だけの異なる分子の混合物である。そのようなライブラリーは、それぞれ、例えば特定の媒介物と結合して存在し、かつデコイと結合できる、ペプチド、タンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはｍ−ＲＮＡからなることができる。媒介物として、例えば、ファージ、ポリソームまたは細菌表面が想定される。ライブラリーは、人工成分もしくは天然から単離された成分または両者の混合物からなることができる。本発明の意味における人工は、例えば、オリゴヌクレオチド合成から製造された化合物と理解されたい。

本発明によると、生体分子により占有された固定化デコイを、ステップｃ）において競合物質と接触させる。これに関して、ステップｃ）において特異性洗浄ステップが実施され、その際、溶液に競合物質が加えられるか、または固相が、競合物質を含む溶液で洗除されるか、または生体分子のライブラリーを有する溶液が、競合物質を含む溶液により、好ましくは繰り返し取り替えられる。競合物質は、その結合部位が、固定化されたデコイの結合部位と類似性を有するデコイ類似分子である。洗浄ステップにおいて、溶液中に存在する競合物質は、固定化されたデコイとすでに結合したライブラリー分子を競合する。したがって、本来、固定化されたデコイにとって「最良の」ライブラリーメンバーに類似しているが遊離の競合物質の１つとより良く結合する、他ならぬそのライブラリー分子が、固定化されたデコイから再び取り除かれる。その際、結合したライブラリー分子の解離反応の速度は、主に、個別の分子の異なる解離定数（ｋ_ｏｆｆ値）により決定される。小さなｋ_ｏｆｆ値を有するそのような分子は、統計的に見ると、固定化されたデコイと最も長く結合したままであり、したがって、提供された競合物質分子と結合を形成できる統計的確率はよりわずかである。そのようなライブラリー分子は、最終的にデコイと特異的または選択的結合を示す。非限定的な例として、タンパク質、ペプチド、ＤＮＡまたはＲＮＡを競合物質として挙げることができる。競合物質を含む液体は、好ましくは水性であり、ｐＨ緩衝液を含むことができる。

特異性洗浄ステップ用の溶液のさらなる任意の構成成分は、塩、界面活性剤または還元剤である。

ファージを増加させるために、ステップｄ）における分離を、例えば、デコイからのファージの溶出により行う。ファージは、上記ペプチドを含む。

ステップｄ）において、特異性洗浄ステップの後にまだデコイ上に留まっているライブラリー分子を引き続き増加させる際に、結合している生体分子をデコイから分離し、公知の方法により増加させる。このために、例えば、ステップａ）〜ｃ）により得られたファージ粒子を細胞内に導入し、増加させることができる。分離は、例えば、ｐＨ値の変化、加熱または塩濃度の変化、とりわけ上昇により行うことができる。

ステップｅ）では、ステップａ）によるデコイに供給される溶液中の選択された生体分子の濃度が高められる。

好ましくは、ステップａ）〜ｅ）を含む選択ラウンドが３〜６回実施される。しかし、１〜＞１０回または１〜＞２０回の繰り返しも実施することができる。その際、サイクル数が増加した場合に、ステップｃ）において好ましくは行われた競合物質の濃度の上昇も、選択の改善につながる。競合物質の濃度は、初めは例えば１ｎｍｏｌ／ｌであることができる。２倍〜１０倍以上の競合物質の濃度変化を段階的に行うことができる。典型的な最終濃度は、１μｍｏｌ／ｌである。

本発明の意味において、これらは、特定のデコイに対して高められた選択性を有する、デコイに特異的に結合するリガンド分子であり、すなわち、特定のデコイに対して、当該デコイと類似したデコイ分子に対してよりも特異的に結合するが、必ずしもより強くは結合しない。好ましくは、上記リガンドは、特定のデコイのみと結合する。拮抗分子または競合分子の存在下で、この方法により選択されたリガンドまたはペプチドは、好ましくは標的分子と結合するはずである。

特に関連する鏡像ファージディスプレイは、ステップａ）においてＮ−末端ビオチン化Ｄ−鏡像異性体Ａβ_１−４２モノマーを、ステップｂ）で組換えファージライブラリーを、ならびにステップｃ）でデコイとしてのＡβ_１−４２モノマー以外に、競合物質としてＤ−鏡像異性体Ａβ_１−４２オリゴマーおよび／またはＤ−鏡像異性体Ａβ_１−４２フィブリルを提供する。分離ステップとしての溶出は、例えば分離ステップとしてのｐＨ値低下および増加としてのファージ増幅を経て行われる。

この方法により、Ａβモノマーと特異的に結合する２１種のペプチド（Ｍｏｓｄ１〜２１）が開発された。
ａ）「Ｍｏｓｄ１」（遊離Ｎ末端、アミド化Ｃ末端）：ＹＳＹＬＴＳＹＨＭＶＷＲ
ｂ）「Ｍｏｓｄ２」（遊離Ｎ末端、アミド化Ｃ末端）：ＨＴＷＴＴＹＤＹＶＷＲＬ
ｃ）「Ｍｏｓｄ３」（遊離Ｎ末端、アミド化Ｃ末端）：ＧＴＭＬＫＦＳＧＭＮＬＴ
ｄ）「Ｍｏｓｄ４」（遊離Ｎ末端、アミド化Ｃ末端）：ＨＮＷＦＹＷＴＴＥＰＹＤ
ｅ）「Ｍｏｓｄ５」（遊離Ｎ末端、アミド化Ｃ末端）：ＨＮＷＳＷＥＷＷＹＮＰＮ
ｆ）「Ｍｏｓｄ６」（遊離Ｎ末端、アミド化Ｃ末端）：ＳＴＬＨＦＹＴＡＦＬＮＫ
ｇ）「Ｍｏｓｄ７」（遊離Ｎ末端、アミド化Ｃ末端）：ＦＳＨＳＨＨＴＷＦＴＷＮ
ｈ）「Ｍｏｓｄ８」（遊離Ｎ末端、アミド化Ｃ末端）：ＨＦＷＳＷＴＳＬＳＭＴＲ
ｉ）「Ｍｏｓｄ９」（遊離Ｎ末端、アミド化Ｃ末端）：ＨＬＳＷＹＷＥＫＹＬＴＳ
ｊ）「Ｍｏｓｄ１０」（遊離Ｎ末端、アミド化Ｃ末端）：ＨＴＷＴＨＷＦＳＷＮＶＰ
ｋ）「Ｍｏｓｄ１１」（遊離Ｎ末端、アミド化Ｃ末端）：ＬＳＭＮＩＴＴＶＨＲＷＨ
ｌ）「Ｍｏｓｄ１２」（遊離Ｎ末端、アミド化Ｃ末端）：ＶＨＷＤＦＲＱＷＷＱＱＳ
ｍ）「Ｍｏｓｄ１３」（遊離Ｎ末端、アミド化Ｃ末端）：ＹＳＦＨＦＥＭＮＭＧＮＹ
ｎ）「Ｍｏｓｄ１４」（遊離Ｎ末端、アミド化Ｃ末端）：ＥＨＷＤＦＧＱＷＷＱＱＳ
ｏ）「Ｍｏｓｄ１５」（遊離Ｎ末端、アミド化Ｃ末端）：ＧＱＷＤＦＲＱＷＷＱＰＣ
ｐ）「Ｍｏｓｄ１６」（遊離Ｎ末端、アミド化Ｃ末端）：ＤＷＳＳＲＶＹＲＤＰＱＴ
ｑ）「Ｍｏｓｄ１７」（遊離Ｎ末端、アミド化Ｃ末端）：ＥＲＳＱＷＧＨＲＤＰＱＳ
ｒ）「Ｍｏｓｄ１８」（遊離Ｎ末端、アミド化Ｃ末端）：ＤＲＳＫＧＤＨＲＩＴＱＭ
ｓ）「Ｍｏｓｄ１９」（遊離Ｎ末端、アミド化Ｃ末端）：ＤＬＲＦＳＳＬＷＫＬＳＨ
ｔ）「Ｍｏｓｄ２０」（遊離Ｎ末端、アミド化Ｃ末端）：ＶＨＷＤＦＲＱＷＷＱＰＳ
ｕ）「Ｍｏｓｄ２１」（遊離Ｎ末端、アミド化Ｃ末端）：ＦＳＷＳＭＶＭＰＷＰＴＡ

これらの本発明によるペプチドは、配列番号１〜配列番号２１として請求され、ダブルペプチド（Ｄｏｐｐｅｌｐｅｐｔｉｄ）として、でなければ環化して利用することもできる。

配列番号１〜２１によるペプチドは、Ａβモノマーとの特異的結合により、アルツハイマー型認知症に対する潜在的医薬として利用することができる。

Ａβモノマーは、本発明によるペプチド、とりわけ配列番号１のペプチドによって高特異的に結合され、それによってオリゴマーは分解する。

本発明の枠内で、既存のＡβモノマー結合性物質は、不利なことにＡβモノマーの減少を目指すことが認識された。モノマーの保護的特性を維持するためには、モノマーの濃度を減少させるのでなく、モノマーの安定化を引き起こす、アミロイドβモノマーの特異的結合物質を開発することが目的でなければならないと認識された。

本発明によるペプチドは、アミロイドβオリゴマー濃度を減少させ、同時にアミロイドβモノマーを安定化することでこの課題を達成する。Ａβモノマーへの特異性は、ＥＬＩＳＡで示すことができる。

一方で、Ａβモノマーと特異的に結合する本発明の前記のリガンド（またはペプチド）は、Ａβオリゴマーの生成を阻害し、その際にモノマー濃度の減少を導かない。他方で、すでに生成したＡβオリゴマーは、本発明によるモノマー安定化活性成分またはペプチドを用いた処理によって、異なる凝集体種の動的平衡から取り除かれる。それによって、オリゴマーがモノマーに分解されるという有利な効果をもつ。

とりわけオリゴマーの新たな生成が阻害され、同様にすでに生成したオリゴマーも、それも主としてモノマーにされて、また大型の非フィブリル状の非毒性凝集体にもされて、取り除かれる。

この課題は、配列番号１〜２１によるアミノ酸配列ならびに／またはその相同体、断片および部分を含むペプチドによっても解決される。このペプチドは、有利には、アミロイドβモノマーとも同様に結合する。

本発明の一変形形態において、最大で５００μＭ、好ましくは２５０、１００、５０μＭ、特に好ましくは２５、１０、６μＭ、とりわけ４、２、１μＭまたはμＭ未満のＡβモノマーと結合するようなペプチドが使用される。

上記課題は、とりわけ２つ以上の本発明による上記ペプチドからなるポリマーならびに／またはその相同体もしくは断片および部分によっても解決される。ダイマーは、アミロイドβ種とそれぞれ結合する本発明によるペプチドの２つから構成される。その際、同種（例えば、配列番号１のペプチド２つ）または２つの異なる（例えば、配列番号１によるペプチドおよび配列番号２によるペプチドからなるダイマー）、本発明によるペプチドを使用することができる。ポリマーは、さらにより多くの本発明によるペプチドを有する。

ポリマー側でＡβモノマーと結合する、本発明によって本発明によるペプチドから構成されるポリマーは、Ａβモノマーへのその特異性に関して有利には相乗効果を示す。言い換えると、本発明によるポリマーは、そのポリマーを構成する個々のペプチドよりも優れている。本発明の意味における相乗効果は、Ａβモノマーに関してより高い特異性を示す効果である。

本発明のさらなる特に有利な一形態において、ポリマーおよびとりわけダイマーは、動物モデル試験（ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏ）において有利には個々のペプチド単位よりも効率的に作用する。

本発明の一変形形態において、最大５００μＭ、好ましくは２５０、１００、５０μＭ、特に好ましくは２５、１０、１μＭの解離定数（Ｋ_Ｄ値）、特に好ましくは最大５００ｎＭ、２５０、１００、５０、特に好ましくは２５、１０、１ｎＭ、５００ｐＭ、１００、５０、２５、２０、１５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１ｐＭ〜ｐＭ未満の解離定数（Ｋ_Ｄ値）でＡβモノマーと結合するようなペプチドまたはポリマーが使用され、その際、各中間値も採用することができる。

本発明の一形態において、ペプチドの結合親和性は、解離定数（Ｋ_Ｄ値）により定義される。

その際、本発明の有利な一形態において、本発明によるペプチドの解離定数（Ｋ_Ｄ値）は、有利には、低下している。より高い結合親和性ならびに毒性のアミロイドβオリゴマーの分解および／または当該オリゴマー形成の阻止のより高い有効性のような、本発明によるペプチドの改善された特性が、これに関連する。これは、とりわけＡβモノマーの高親和性部位でのより低いＫ_Ｄ値に関係するが、それに限定されるものではない。

断片および部分は、有利には、本発明によるペプチドと類似または同一の効果を示す。

本発明の一変形形態において、本発明による配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０および／または配列番号２１のペプチドならびにその相同体、断片および部分は、本質的に、好ましくは少なくとも５０％、６０％、７５％、８０％、特に好ましくは８５％、９０％、９５％、とりわけ９６％、９７％、９８％、９９％、１００％がＤ−鏡像異性体アミノ酸からなる。

本発明の意味におけるポリマーは、アミロイドβモノマーと結合する、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０個またはそれを超えるペプチドから構成される。

配列番号１〜２１によるペプチドは、本発明の一形態において、遊離Ｃ末端に酸アミド基を備える。本発明によるペプチド、例えば配列番号１〜２１によるペプチドは、そのとき、位置１２の遊離のＣ末端でアミド化されている。このペプチドからのダイマーは位置２４の遊離のＣ末端でアミド化などがされている。

配列番号１〜２１によるペプチドは、本発明のさらなる一形態において遊離のＣ末端で遊離のＮ末端と相互に共有結合しており、その場合には適切に環化されて存在する。閉環は、遊離のＣ末端のカルボキシル基がもはや存在しないという有利な効果をもつ。

有利には、本発明によるペプチドは、直鎖状分子の環化が、例えば縮合反応を経て、例えば最初のアミノ酸と最後のアミノ酸との共有結合により行われている、アミノ酸配列を有する。もちろん、例えば他のアミノ酸が相互に連結されることによる、環化のさらなる可能性が存在する。単なる例として、２番目のアミノ酸と最後のアミノ酸との連結が挙げられる。全ての可能な他の連結も同様に考えられる。

ペプチドの最初のアミノ酸と最後のアミノ酸とが相互に連結される場合、ペプチド鎖（アミノ酸配列）に開放端が存在しないという有利な効果をもつ。

この措置は、環化後に同等でもはや識別不可能なアミノ酸の順序をもたらす直鎖状アミノ酸配列を有する全てのペプチドが、この意味で同一であるという効果をさらにもつ。

例：公知のペプチドＤ３の直鎖状アミノ酸配列は、ｒｐｒｔｒｌｈｔｈｒｎｒである。Ｎ−末端アミノ基とＣ−末端カルボキシル基との間のアミド結合により連結した、対応する環状ペプチド「ｃＤ３」は、環状ペプチドｐｒｔｒｌｈｔｈｒｎｒｒ、ｒｔｒｌｈｔｈｒｎｒｒｐ、ｔｒｌｈｔｈｒｎｒｒｐｒ、ｒｌｈｔｈｒｎｒｒｐｒｔ、ｌｈｔｈｒｎｒｒｐｒｔｒ、ｈｔｈｒｎｒｒｐｒｔｒｌ、ｔｈｒｎｒｒｐｒｔｒｌｈ、ｈｒｎｒｒｐｒｔｒｌｈｔ、ｒｎｒｒｐｒｔｒｌｈｔｈ、ｎｒｒｐｒｔｒｌｈｔｈｒまたはｒｒｐｒｔｒｌｈｔｈｒｎともはや識別することができない。これらの各配列から、ｃＤ３をさらに誘導することもできる。

本発明によって請求される、より高い特異性、任意選択的に親和性および有効性の効果は、さらにまた、環化または他の方法で改変された本発明によるペプチドを誘導することができる結合ペプチド、好ましくはそれどころか各直鎖状結合ペプチドに対しても生じる。

環状ペプチドの製造は、その他の先行技術に含まれ、例えばＤＥ１０２００５０４９５３７Ａ１に記載されているような方法により行うことができる。

有利には、ペプチドの最初のアミノ酸および最後のアミノ酸を介した環化は、しばしば細胞、動物またはヒトにおける、例えばアミノペプチダーゼおよびカルボキシペプチダーゼによるペプチド分解活性に関する作用点であるペプチド鎖の「開放」端がもはや存在しないという効果をもつ。

例えば配列番号１によるＭｏｓｄ１のような、本発明による環化ペプチドを用いることは、これらの本発明による環化ペプチドまたはポリマーが、状況によっては副次効果として容易に分解されなくもなるという有利な効果を追加的にもつ。とはいえ、この効果は決定的ではない。ちなみに、示されたように、この効果も、直鎖状ペプチドの対応する両端が相互に連結される頭尾環化または尾頭環化の場合だけに当てはまる。

本発明のさらなる一形態において、上記ポリマーは、例えばＭｏｓｄ１のような同一のペプチドから、またはいわゆる組合せポリマーとして配列番号１〜２１による上記ペプチドのうち２、３、４、５、６、７、８、９、１０個の各種異なるペプチドの組合せから構成されている。上記ペプチドは、また、部分的に同一でもよい。組合せポリマー中の同一のペプチドの数は、自由に選択可能である。

ポリマーは、例えば化学合成またはペプチド合成により製造することができる。

本発明の一実施態様において、本発明によるペプチドは、相互に共有結合されている。さらなる一実施態様において、モノマーは、相互に共有結合されていない。

ペプチドが頭頭、尾尾または頭尾で相互に直鎖的に連結されている場合、ペプチド単位の共有結合または共有結合的連結は、本発明の意味において、リンカーまたはリンカー基が間に挿入されて、または挿入されずに存在する。

ペプチドが例えばビオチンおよびストレプトアビジン、とりわけストレプトアビジンテトラマーを介して相互に連結している場合、本発明の意味において非共有結合的連結が存在する。

本発明の一変形形態において、ペプチドは、とりわけ上記のように、相互に直鎖で連結してもよい。別の一変形形態において、ペプチドは、相互に分岐して本発明によるポリマーに連結している。

本発明によると、分岐ポリマーは、モノマーが共有結合または非共有結合で相互に連結しているデンドリマーでもよい。

あるいは、ペプチドは、プラットフォーム分子（例えばＰＥＧまたは糖のような）と連結することにより、分岐ポリマーを形成してもよい。

あるいは、これらの選択肢の組合せも可能である。

よって、本発明によるペプチドおよびポリマーは、下記に本発明によるペプチドと称される。

本発明の一変形形態において、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０および／または配列番号２１によるアミノ酸配列を有するペプチドならびに少なくとも５０％の同一性を有するその相同体、断片および部分が対象となる。

「相同配列」または「相同体」は、本発明の意味において、アミノ酸配列が、上記のモノマーのアミノ酸配列の１つと少なくとも５０、５５、６０、６５、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００％の同一性を有することを意味する。用語「同一性」の代わりに、本明細書において用語「相同体」または「相同性」が同義的に使用される。２つの核酸配列またはポリペプチド配列の間の同一性は、アミノ酸について以下のパラメーター：ギャップ挿入ペナルティー：８およびギャップ伸長ペナルティー：２；ならびに核酸について以下のパラメーター：ギャップ挿入ペナルティー：５０およびギャップ伸長ペナルティー：３を設定して、Ｓｍｉｔｈ，Ｔ．Ｆ．およびＷａｔｅｒｍａｎ，Ｍ．Ｓ．（Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２−４８９（１９８１））のアルゴリズムに基づくプログラムＢＥＳＴＦＩＴを使った比較により計算される。好ましくは、２つの核酸配列またはポリペプチド配列の間の同一性は、アミノ酸について以下のパラメーター：ギャップ挿入ペナルティー：８およびギャップ伸長ペナルティー：２；ならびに核酸について以下のパラメーター：ギャップ挿入ペナルティー：５０およびギャップ伸長ペナルティー：３を設定して、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ，Ｓ．Ｂ．およびＷｕｎｓｃｈ，Ｃ．Ｄ．（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３−４５３）のアルゴリズムに基づくプログラムＧＡＰを使った比較により計算されるような、それぞれの合計配列長にわたる核酸配列／ポリペプチド配列の同一性により定義される。

２つのアミノ酸配列が同じアミノ酸配列を有する場合、本発明の意味において、それらは同一である。

相同体は、一変形形態において、上記モノマーの対応するレトロインバース（ｒｅｔｒｏ−ｉｎｖｅｒｓｅ）配列と理解されるべきである。用語「レトロインバース配列」は、本発明によると、鏡像異性体形態のアミノ酸から構成され（インバース：α−Ｃ原子のキラリティーが反転している）、さらに配列順序が元のアミノ酸配列と逆になった（レトロ＝逆方向）アミノ酸配列を表す。

さらなる一変形形態において、本発明によるペプチドは、アミロイドβペプチドの部分と結合する。

さらなる一変形形態において、本発明によるペプチドは、上記配列と最大３つのアミノ酸が異なる配列を有する。

さらに、ペプチドとして、上記の配列を含む配列も使用される。

さらなる一変形形態において、ペプチドは、上記配列の断片を有するか、または上記配列の相同配列を有する。

本発明によると、医薬において使用するための、好ましくはアルツハイマー病を治療するためのペプチドが対象となる。

本発明の一実施態様において、ペプチドは、本質的にＤ−アミノ酸からなる。

本発明の意味において、用語「本質的にＤ−鏡像異性体アミノ酸から」は、本発明によって使用されるべきモノマーの少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、好ましくは７５％、８０％、特に好ましくは８５％、９０％、９５％、とりわけ９６％、９７％、９８％、９９％、１００％がＤ−鏡像異性体アミノ酸から構成されていることを意味する。

さらなる一変形形態では、アミロイドβオリゴマーのフィブリル生成を抑制するための本発明によるペプチドが対象となる。本発明によるペプチドは、Ａβオリゴマーまたはそれから生成したポリマーおよびフィブリルと結合せず、その代わりにＡβモノマーと結合し、平衡によりＡβオリゴマーの減少につながることで、これらを非毒性の化合物に変換することによってこれらを無毒化する。それに応じて、本発明の主題は、また、Ａβオリゴマー、それから生成した凝集体またはフィブリルの無毒化のための方法である。

一実施態様において、本発明の主題は、また、さらなる物質と連結している本発明によるペプチドである。

連結は、本発明の意味において、Ｒｏｅｍｐｐ Ｃｈｅｍｉｅ Ｌｅｘｉｋｏｎ、第９版、第１巻、６５０頁〜、Ｇｅｏｒｇ Ｔｈｉｅｍｅ Ｖｅｒｌａｇ Ｓｔｕｔｔｇａｒｔに定義されているような化学結合、好ましくは主原子価結合、とりわけ共有結合である。

上記物質は、一変形形態において、薬事法（§２または§４（１９）、２０１２年９月現在）によって定義されている薬剤または作用物質である。一代替形態において、作用物質は、医薬有効物質として使用される治療活性物質である。好ましくは、抗炎症剤が使用される。

上記物質は、さらなる一変形形態において、ペプチドの作用を強化する化合物である。

一代替形態において、そのような化合物は、アミノピラゾールおよび／またはアミノピラゾール誘導体である。アミノピラゾール誘導体は、本発明の意味において、３−アミノピラゾール−５−カルボン酸または３−ニトロピラゾール−５−カルボン酸、および複素環のＣＨ基が−ＣＲ−または−Ｎ−または−Ｏ−または−Ｓ−により交換された全ての誘導体、およびそれらから誘導された全てのペプチド性のダイマー、トライマーまたはテトラマー、好ましくはアミノピラゾール−トライマーである。

さらなる一代替形態において、ペプチドの溶解性および／または血液脳関門の通過を改善する化合物が対象となる。

一代替形態において、ペプチドは、本発明によると上記変形形態、実施態様および／または代替形態の少なくとも２つ以上の特徴の任意の各組合せを有する。

本発明の枠内において、遊離のＣ末端、つまりＣ末端カルボキシル基が改変されておらず、対応して負電荷を有する直鎖状結合性ペプチドと比較して、アミド化および／または環化ペプチドがより高い親和性でＡβモノマーと結合することが、さらに認められた。すなわち、遊離のＣ末端、つまりＣ末端カルボキシル基が改変されておらず、対応して負電荷を有する直鎖状ペプチドよりも、改変ペプチドの方が、Ｋ_Ｄ値は低い。

したがって、本発明のさらなる好ましい一形態では、Ｃ末端に負電荷を有さない本発明によって改変されたペプチドの結合親和性は、Ｃ末端に負電荷を有するが、その他の点では同じアミノ酸配列を有する直鎖状ペプチドと比較して、１％、２、３、４、５、６、７、８、９、とりわけ１０％、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、とりわけ１００％、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、とりわけ２００％、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４０、２４１、２４２、２４３、２４４、２４５、２４６、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３、２５４、２５５、２５６、２５７、２５８、２５９、２６０、２６１、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、２６８、２６９、２７０、２７１、２７２、２７３、２７４、２７５、２７６、２７７、２７８、２７９、２８０、２８１、２８２、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９、２９０、２９１、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９７、２９８、２９９、とりわけ３００％、３０１、３０２、３０３、３０４、３０５、３０６、３０７、３０８、３０９、３１０、３１１、３１２、３１３、３１４、３１５、３１６、３１７、３１８、３１９、３２０、３２１、３２２、３２３、３２４、３２５、３２６、３２７、３２８、３２９、３３０、３３１、３３２、３３３、３３４、３３５、３３６、３３７、３３８、３３９、３４０、３４１、３４２、３４３、３４４、３４５、３４６、３４７、３４８、３４９、３５０、３５１、３５２、３５３、３５４、３５５、３５６、３５７、３５８、３５９、３６０、３６１、３６２、３６３、３６４、３６５、３６６、３６７、３６８、３６９、３７０、３７１、３７２、３７３、３７４、３７５、３７６、３７７、３７８、３７９、３８０、３８１、３８２、３８３、３８４、３８５、３８６、３８７、３８８、３８９、３９０、３９１、３９２、３９３、３９４、３９５、３９６、３９７、３９８、３９９、とりわけ４００％、４０１、４０２、４０３、４０４、４０５、４０６、４０７、４０８、４０９、４１０、４１１、４１２、４１３、４１４、４１５、４１６、４１７、４１８、４１９、４２０、４２１、４２２、４２３、４２４、４２５、４２６、４２７、４２８、４２９、４３０、４３１、４３２、４３３、４３４、４３５、４３６、４３７、４３８、４３９、４４０、４４１、４４２、４４３、４４４、４４５、４４６、４４７、４４８、４４９、４５０、４５１、４５２、４５３、４５４、４５５、４５６、４５７、４５８、４５９、４６０、４６１、４６２、４６３、４６４、４６５、４６６、４６７、４６８、４６９、４７０、４７１、４７２、４７３、４７４、４７５、４７６、４７７、４７８、４７９、４８０、４８１、４８２、４８３、４８４、４８５、４８６、４８７、４８８、４８９、４９０、４９１、４９２、４９３、４９４、４９５、４９６、４９７、４９８、４９９、有利にはそれどころか５００％、５０１、５０２、５０３、５０４、５０５、５０６、５０７、５０８、５０９、５１０、５１１、５１２、５１３、５１４、５１５、５１６、５１７、５１８、５１９、５２０、５２１、５２２、５２３、５２４、５２５、５２６、５２７、５２８、５２９、５３０、５３１、５３２、５３３、５３４、５３５、５３６、５３７、５３８、５３９、５４０、５４１、５４２、５４３、５４４、５４５、５４６、５４７、５４８、５４９、５５０、５５１、５５２、５５３、５５４、５５５、５５６、５５７、５５８、５５９、５６０、５６１、５６２、５６３、５６４、５６５、５６６、５６７、５６８、５６９、５７０、５７１、５７２、５７３、５７４、５７５、５７６、５７７、５７８、５７９、５８０、５８１、５８２、５８３、５８４、５８５、５８６、５８７、５８８、５８９、５９０、５９１、５９２、５９３、５９４、５９５、５９６、５９７、５９８、５９９、特に有利には６００％、６０１、６０２、６０３、６０４、６０５、６０６、６０７、６０８、６０９、６１０、６１１、６１２、６１３、６１４、６１５、６１６、６１７、６１８、６１９、６２０、６２１、６２２、６２３、６２４、６２５、６２６、６２７、６２８、６２９、６３０、６３１、６３２、６３３、６３４、６３５、６３６、６３７、６３８、６３９、６４０、６４１、６４２、６４３、６４４、６４５、６４６、６４７、６４８、６４９、６５０、６５１、６５２、６５３、６５４、６５５、６５６、６５７、６５８、６５９、６６０、６６１、６６２、６６３、６６４、６６５、６６６、６６７、６６８、６６９、６７０、６７１、６７２、６７３、６７４、６７５、６７６、６７７、６７８、６７９、６８０、６８１、６８２、６８３、６８４、６８５、６８６、６８７、６８８、６８９、６９０、６９１、６９２、６９３、６９４、６９５、６９６、６９７、６９８、６９９、特に有利には７００％、７０１、７０２、７０３、７０４、７０５、７０６、７０７、７０８、７０９、７１０、７１１、７１２、７１３、７１４、７１５、７１６、７１７、７１８、７１９、７２０、７２１、７２２、７２３、７２４、７２５、７２６、７２７、７２８、７２９、７３０、７３１、７３２、７３３、７３４、７３５、７３６、７３７、７３８、７３９、７４０、７４１、７４２、７４３、７４４、７４５、７４６、７４７、７４８、７４９、７５０、７５１、７５２、７５３、７５４、７５５、７５６、７５７、７５８、７５９、７６０、７６１、７６２、７６３、７６４、７６５、７６６、７６７、７６８、７６９、７７０、７７１、７７２、７７３、７７４、７７５、７７６、７７７、７７８、７７９、７８０、７８１、７８２、７８３、７８４、７８５、７８６、７８７、７８８、７８９、７９０、７９１、７９２、７９３、７９４、７９５、７９６、７９７、７９８、７９９、同様に特に有利には８００％、８０１、８０２、８０３、８０４、８０５、８０６、８０７、８０８、８０９、８１０、８１１、８１２、８１３、８１４、８１５、８１６、８１７、８１８、８１９、８２０、８２１、８２２、８２３、８２４、８２５、８２６、８２７、８２８、８２９、８３０、８３１、８３２、８３３、８３４、８３５、８３６、８３７、８３８、８３９、８４０、８４１、８４２、８４３、８４４、８４５、８４６、８４７、８４８、８４９、８５０、８５１、８５２、８５３、８５４、８５５、８５６、８５７、８５８、８５９、８６０、８６１、８６２、８６３、８６４、８６５、８６６、８６７、８６８、８６９、８７０、８７１、８７２、８７３、８７４、８７５、８７６、８７７、８７８、８７９、８８０、８８１、８８２、８８３、８８４、８８５、８８６、８８７、８８８、８８９、８９０、８９１、８９２、８９３、８９４、８９５、８９６、８９７、８９８、８９９、同様に特に有利には９００％、９０１、９０２、９０３、９０４、９０５、９０６、９０７、９０８、９０９、９１０、９１１、９１２、９１３、９１４、９１５、９１６、９１７、９１８、９１９、９２０、９２１、９２２、９２３、９２４、９２５、９２６、９２７、９２８、９２９、９３０、９３１、９３２、９３３、９３４、９３５、９３６、９３７、９３８、９３９、９４０、９４１、９４２、９４３、９４４、９４５、９４６、９４７、９４８、９４９、９５０、９５１、９５２、９５３、９５４、９５５、９５６、９５７、９５８、９５９、９６０、９６１、９６２、９６３、９６４、９６５、９６６、９６７、９６８、９６９、９７０、９７１、９７２、９７３、９７４、９７５、９７６、９７７、９７８、９７９、９８０、９８１、９８２、９８３、９８４、９８５、９８６、９８７、９８８、９８９、９９０、９９１、９９２、９９３、９９４、９９５、９９６、９９７、９９８、９９９％だけ、またはそれどころか１０００％だけ、またはそれどころか１００００％だけ、またはそれどころか最大１０００００％もしくは１００００００％だけ高められており、その際、各中間値を採用することができる。これは、とりわけＡβモノマーの高親和性部位への親和性の向上に関係する。

これは、対応して低下したＫ_Ｄ値によって示される。アミロイドβモノマーへの改変ペプチド、とりわけ環化ペプチドの結合親和性についての尺度としてのＫ_Ｄ値は、遊離Ｃ末端に負電荷を有する直鎖状結合ペプチドと比較して、１％、２、３、４、５、６、７、８、９、とりわけ１０％、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、とりわけ９９．１、９９．２、９９．３、９９．４、９９．５％、９９．６、９９．７、９９．８、９９．９〜最大９９．９９、またはそれどころか９９．９９９％だけ低下しており、その際、各中間値を採用することができる。

これらのより低いＫ_Ｄ値は、有利には、とりわけＡβ種モノマーの高親和性部位に関連するが、それに限定されるわけではない。

したがって、これらの改変ペプチドは、診断目的のプローブとして、遊離Ｃ末端に負電荷を有する直鎖状結合ペプチドよりもなお効率的に使用することができ、とりわけまた、同一のアミノ酸配列を有するその直鎖状ペプチド対応物よりも効率的に使用することができる。

一方でこれらは、とりわけ治療薬としても、遊離Ｃ末端に負電荷を有する直鎖状結合ペプチドよりも効率的に使用することができ、とりわけ同一のアミノ酸配列を有するその直鎖状ペプチド対応物よりも効率的に使用することができる。

改変ペプチドとＣ末端に負電荷を有するペプチドとの直接的な比較において、本発明によるペプチドは、親和性および有効性に関してより良好な成績を収める。

本発明の枠内において、改変ペプチドは、遊離Ｃ末端に負電荷を有するペプチドと比較して、一方でとりわけ同一のアミノ酸配列を有するそのペプチド対応物と比較して、追加的に、またより高い有効性または効率で、特に毒性のアミロイドβオリゴマーの生成を阻害するか、またはそれらの破壊および／もしくは無毒化を引き起こすことがさらに認識された。この有効性は、とりわけ１％、２、３、４、５、６、７、８、９、とりわけ１０％、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、９９．９だけ、特に有利にはそれどころか１００％だけ高まっている。

試験的に最も簡単な場合に、異なるＡβコンフォーマーを有する試料が、例えば分画される。各画分においては、分画ステップに対応してモノマー、オリゴマー、フィブリルまたはより高度の凝集体のような異なるコンフォーマーが濃縮され、それに続いて正確に決定され得る。

用語「正確に決定される」は、公知の種類および挙動の分子による分画の際の較正ステップを含む。分画の後には、各画分中にはＡβのコンフォーマーの特定の種類、例えばモノマー、オリゴマーまたはフィブリルなどだけが存在する。

例えば、コンフォーマーは、分画ステップとしての密度勾配遠心分離の際に、そのｓ値または沈降係数に応じて分離される。異なるサイズの分子は、同一の流体力学的半径を有し得るが、しかしそれにもかかわらず異なるｓ値を有し、またそれに応じて分離される。既知のｓ値の分子を用いた較正によって、密度勾配遠心分離を用いて得られたＡβコンフォーマーがそのｓ値に応じて正確に決定される。

続いて、得られた画分が活性成分を用いてまたは用いずに処理され、例えばＲＰ−ＨＰＬＣによって決定される。この方法により、活性成分の有効性を決定することができる。

さらなる方法を以下に説明する。作用物質を定量分析するために、いわゆるＱＩＡＤ（ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ ｗｉｔｈ Ａβ ａｇｇｒｅｇａｔｅ ｓｉｚｅ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ）検査を用いることができる。その際、試料中のアミロイドペプチドおよび／またはタンパク質の粒度分布に活性成分が及ぼす影響を定量分析するための方法は、以下のステップを有する。まず、Ａβを制御された条件下で凝集させることにより、それぞれ異なるＡβ凝集体が生成する。特に多くの小型の、特に細胞毒性のＡβオリゴマーが形成されたように条件を選択する。次に、被験物質、例えば本発明による改変ペプチドの１つを試料に添加する。活性成分は試料中の粒度分布を変化させる。この変化は、定量的に確認される。変化は、特定の粒子サイズの特定の毒性の種の減少またはそれどころか完全な除去に関する尺度である。ＱＩＡＤ法によって、特定の粒子サイズのＡβ凝集体の増加または減少が測定される。特定のサイズを有するいくつかのＡβ凝集体が最初は試料中に存在した一方で、これらは、活性成分の影響下で減少し、またはそれどころか完全に除去される。他の粒子サイズは、活性成分の影響下で増加するまたは一定を保つ。Ａβから形成されている粒子は、好ましくは、粒子の流体力学的半径に従って相互に分離される。この方法により、試料から複数の画分が得られるという有利な効果をもつ。当該画分では、粒子は、特定の凝集体サイズを有するアミロイドペプチドおよび／またはアミロイドタンパク質に濃縮されている。この粒子の分離は、密度勾配遠心分離により行うことができる。これらの画分は、例えばピペッティングにより空間的に相互に分離される。最終的に、それぞれの画分中のＡβ濃度は、分画に続いて実施された逆相（ＲＰ−）ＨＰＬＣの間にＡβ種を完全に変性させることによって決定される。凝集体の変性を、例えば、３０％アセトニトリルおよび０．１％トリフルオロ酢酸を用いてカラム温度８０℃で完全に行い、Ｃ８カラムで疎水性に応じて分離することができる。溶出するＡβは、２１５ｎｍにおけるＵＶ吸収を用いて検出される。ピーク面積の積分は、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｃｈｅｍｓｔａｔｉｏｎソフトウェアを用いて行うことができる。そこから生じた値を、予め実施された較正を加味して計算することによって、それぞれの画分中に存在するＡβの濃度を算出することが可能になる。画分毎に、複数回の、例えば６回の相互に独立して実施された実験から、結果として得られた標準偏差と共に、平均値を計算することができる。ＨＰＬＣ分析の利点は、凝集状態および溶媒にかかわらず、非常に高感度（例えば約２０ｎＭまたは１．８ｎｇのＡβ１−４２）の検出および高信頼度の定量を行うことができることである。この方法の決定的な利点は、Ａβオリゴマーの高信頼度の定量も可能にする、密度勾配遠心分離および逆相ＨＰＬＣの結合にある。

アミロイドβ種、とりわけアミロイドβオリゴマーの除去（または生成）の有効性を増加させるという本発明による効果は、これらの方法のうちの１つを用いて行うことができるが、これらの方法に限定されるわけではない。

本発明の特に好ましい一形態において、Ａβモノマーに対する特異性を増加させる効果、およびそれに付随した、Ａβオリゴマー（またはその生成）を排除、無毒化する同時的な有効性は、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよび／またはｉｎ ｖｉｖｏでも生じる。

本発明は、さらにまた、とりわけアルツハイマー病の処置のための、本発明によるペプチドを含む組成物に関する。

さらに、本発明の主題は、本発明によるペプチドを含む組成物、とりわけ存在する毒性のＡβオリゴマーの減少および毒性のＡβオリゴマーの生成阻害のための、本発明によるペプチドを含む組成物である。

本発明による「組成物」は、専門知識に基づき製造される製剤中に本発明によるペプチドを含む、例えばワクチン、医薬（例えば錠剤剤形）、注射液、食品または栄養補助食品でもよい。

本発明は、さらに、本発明によるリガンドまたはペプチドを含むキットにも関する。

そのようなキットでは、容器中に、場合によっては緩衝液または溶液と共に／の中に本発明によるペプチドをパッケージしてもよい。キットの全ての構成成分は、同じ容器中にまたは相互に別々にパッケージしてもよい。さらに、キットにはその使用説明書を含めてもよい。そのようなキットは、例えば、本発明品を、栓および／またはセプタム付きの注射液ボトル中に含むことができる。さらにその中に、例えば使い捨て注射器を含めてもよい。

本発明によるペプチドは、Ａβモノマーとの結合のためのプローブとして役立つことができる。そのような分子プローブは、本発明によるペプチドまたはポリマーおよび任意選択的に色素、蛍光色素、放射性同位体、（ＰＥＴなど）、ガドリニウム（ＭＲＩ）、ならびにプローブのイメージングに適切な代替物質を含み、患者に、例えば静脈内注射することができる。血液脳関門の通過後、プローブは、Ａβモノマーおよび／またはプラークと結合することができる。そのように標識されたＡβモノマーおよび／またはプラークは、例えばＳＰＥＣＴ、ＰＥＴ、ＣＴ、ＭＲＴ、プロトン−ＭＲ分光法などのイメージング方法を用いて視覚化することができる。

さらに本発明は、また、アミロイドβオリゴマーおよび／またはアミロイドβペプチド凝集体および／またはアミロイドβフィブリルを阻害するための本発明によるペプチドの使用に関する。

本発明によるペプチドは、また、毒性のアミロイドβオリゴマーおよび／または凝集体を無毒化するために使用される。とりわけこのペプチドは、アミロイドβモノマーと結合するため、および平衡の移動により、非晶質で非毒性の凝集体を生成させるために使用される。

これらの凝集体は、結合したモノマーからなり得、平衡が移動し、それも主としてオリゴマーから離れるように移動する。非晶質の非毒性の凝集体が生成することによって、毒性の種の減少を達成することができる。図２に示すように、他のペプチドは、ＥＬＩＳＡ試験においてモノマー特異性によりＡβモノマーを安定化する。

Ａβオリゴマーがすでに存在する場合、Ａβモノマーに可能な限り高い特異性を有する物質によりこれらに取り組むことが、処置の目的でなければならないことが認識された。事実上、Ａβモノマーに対する特異性は、Ａβオリゴマーと比べて全然十分な大きさでない可能性があり、対応する比は、いずれにせよ１よりも大きい。

本発明の枠内において、Ａβモノマーは、Ａβオリゴマーの構成要素としてヒトの体内で絶えず生成し、おそらくそれ自体は非毒性であることが認識された。それどころか、モノマーがポジティブな機能を有する可能性が存在する。Ａβモノマーは、その濃度に依存して偶発的に会合する可能性がある。濃度は、体内でのその生成速度および分解速度に依存する。年齢が増加すると共に、体内でＡβモノマー濃度の上昇が起こるので、モノマーがＡβオリゴマーに自然に会合する確率が常に高まっている。そのように生成したＡβオリゴマーは、プリオンに類似して増加し、最終的にアルツハイマー病につながるおそれがある。

アルツハイマー型認知症の予防と治療またはましてや治癒との間の重要な相違は、予防は、おそらく最初のＡβオリゴマーの生成阻害によりすでに達成することができるという事実にあることがさらに認識された。このためには、Ａβモノマーに高特異的であり、同時にＡβオリゴマーに対する親和性および選択性がわずかである、いくつかの、わずかなリガンドで十分である。

多くのモノマーからのＡβオリゴマーの生成は、高次反応であり、したがってＡβモノマー濃度に高度に依存する。したがって、活性なＡβモノマーの濃度の小さな低下が、すでに最初のＡβオリゴマーの生成阻害につながる。これまで開発段階にあったどちらかと言えば予防的な治療の概念および物質は、このメカニズムにおそらく基づいている。

しかし、アルツハイマー型認知症の治療の場合は、完全に変更された状況から出発すべきである。この場合、Ａβオリゴマー、または場合によりプリオン類似のメカニズムで増加する、すでにより大型のポリマーもしくはフィブリルも存在する。しかし、この増加は、より低次の反応であり、まだほとんどＡβモノマー濃度に依存しない。

したがって、Ａβオリゴマーがすでに生成している場合、これらを特に効率的に除去し、かつ／または生成を特に効率的に阻害するかもしくはこれらを無毒化する物質によってこれらに取り組みことが、治療の目的でなければならない。

アルツハイマー型認知症の治療に関するこれらの要求事項は、本発明によるペプチドの提供により満たされる。本発明によるペプチドは、治療の意味で、アミロイドβモノマーと特異的に、適切な低い解離定数で結合する。したがって、さらなる主題は、アルツハイマー病の治療薬としての本発明によるペプチドの使用である。

本発明によるペプチドは、Ａβと、可溶性Ａβモノマーと特に良好に結合する。

チオフラビンＴ試験を用いて、本発明によるペプチド、特に配列番号１〜２１を有するペプチド、とりわけ配列番号１によるペプチドが、Ａβペプチドのフィブリル生成を非常に効率的に抑制することを示すことができる。

さらなる主題は、血液、血液産物および／または器官の処理（ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ）のための方法における本発明によるペプチドの使用であって、血液、血液産物および／または器官がヒトまたは動物の体から取り出され、Ａ（アミロイド）βオリゴマーが取り除かれ、かつ／または無毒化されることを特徴とする使用である。

ペプチドの特異性は、単一ファージ−ＥＬＩＳＡにおける標的分子またはデコイ（例えばＡβモノマー）についての吸収値と競合物質（例えばＡβオリゴマーおよびＡβフィブリル）についての標準化吸収値とのパーセントによる差からもたらされる。

そのとき、吸収値は、それぞれの固定化Ａβ種へのファージの単一クローンの親和性を表す。その場合、特異性は、親和性の強さに依存するのでなく、種間の親和性の差にのみ依存する。標的分子（例えばＡβ_１−４２モノマー）についてのシグナル強度と、いわゆる競合物質（Ａβ_１−４２オリゴマーおよびＡβ_１−４２フィブリル）についてのシグナル強度とのパーセントによる差が大きいほど、それぞれのファージは標的分子と特異的に結合する。用語「競合物質」および「標的分子」または「デコイ」は、下記のように定義される。

上記の特異性の用語の意味において、標準化吸収値のパーセントによる差（標的分子、例えばモノマー状Ａβ_１−４２を用いたとき＝１００％）が、少なくとも４０％、４５％、より良好には５０％、好ましくは７０％よりも良好、とりわけ８０％または９０％よりも良好、特に好ましくは１００％になる場合に、ペプチドは特異的と見なされ、その際、全ての中間値を採用することができる。

基材の切り替えは、第一に標的分子との全般的な特異性を高めるが、「近縁分子」との特異性も高める。基材の切り替えならびにそのブロッキングおよび非ブロッキングを交互に行うことは、非特異的結合（基材（プラスチック表面）、ストレプトアビジンまたはＢＳＡ（ブロッキング試薬）との結合）ファージと比べて標的分子への特異性を高める。

異なる基材の交互の使用により、例えばラウンドＸで基材Ａと結合したファージが、続くラウンドＸ＋１で、それらの好ましい結合パートナーである基材Ａともはや結合できない。それは、これが基材Ｂによって交換されたことにより、基材Ａに結合性のファージが失われるからである。

この最初の大まかな特異化に加えて、例えば標的分子のポリマーとなり得る競合物質の使用によって、標的分子の明確に規定された形態（例えばモノマー）への特異性の増加が生じた。

この方法により、以前に頻繁に発生した、標的分子および基材との非特異的結合または基材との優先的結合を明らかに減少させることができただけでなく、標的分子の明確に規定された構造的モノマーバリアントへの特異性も増加させることができた。

したがって本発明による方法は、有利には、競合物質としてそれぞれ別の種を用いて、デコイとしてのＡβモノマーまたはＡβオリゴマーに対するリガンドを同定するために特に適切である。

例：例えばＥＬＩＳＡ実験のための異なるＡβ_１−４２種について等しい固定化効率を保証することはほとんど不可能であり、そのため、各９６ウェル−マイクロタイタープレートに固定化検査を使用すべきであろう。これは、増幅された単一ファージクローンの代わりに、それぞれの対照反応槽（ウェル）に（Ａβ_１−４２）特異的抗体（例えば６Ｅ１０）を加えることができるということであり得る。その強さが固定化Ａβ_１−４２種と共にまたはそれなしで提供された表面との抗体の結合に依存する、測定された吸光シグナルを、この実験に関連して固定化効率についての尺度として使用することができる。さらなる検査として、ファージ特異的抗体と固定化分子または反応槽表面との可能な交差反応を検討することができる。ファージ特異的抗体は、通常、それぞれ与えられた標的構造（例えば表面、Ａβ_１−４２モノマー、Ａβ_１−４２オリゴマーおよびＡβ_１−４２フィブリル）への単一ファージの結合を定量化するために、単一ファージが試験される調製物に添加される。しかしそのためには、得られたデータの解釈に任意選択的にこれらのいわゆる交差反応を一緒に加えるために、ファージ特異的抗体が、他の可能な標的と、例えばファージ自体の上記潜在的標的構造と非特異的にどれほど強く結合するかが分かっていなければならない。

したがって、得られた値を標準化するための方法を行うべきであろう。その際、単一ファージＥＬＩＳＡにおける単一ファージクローンの全ての吸収値から、交差反応を試験されたファージ−抗体の値をバックグラウンドとして差し引くことができる。これは、相応に、予め固定化された種に対して行われる。これに加えて、固定化Ａβ_１−４２オリゴマーを有する反応槽からの単一ファージクローンのシグナル値から、固定化Ａβ_１−４２オリゴマーを有する反応槽からのファージ−抗体のシグナル値を差し引くことができる。次にＡβ_１−４２モノマーについて同様な手順が行われる。この方法により、まず第一に、単一ファージクローンのシグナルからファージ抗体の可能なバックグラウンドシグナルを引き去ることができる。これに関連して、Ａβ_１−４２特異的６Ｅ１０抗体を用いる対照に基づき、使用された異なるＡβ_１−４２種の固定化効率を測定して比較する。それにより、有利には（図１も参照）、Ａβ_１−４２モノマーと比べて、Ａβ_１−４２オリゴマーとＡβ_１−４２フィブリルとの混合物の効果的な固定化が生じる。したがって、Ａβ_１−４２オリゴマーおよびＡβ_１−４２フィブリルが固定化されている反応槽では、単一ファージクローンに対して可能性がより高い結合パートナーが提供され、結果がゆがめられる。従って、Ａβ_１−４２オリゴマーおよびＡβ_１−４２フィブリルが固定化された反応槽からの６Ｅ１０対照の値を、Ａβ_１−４２モノマーが固定化された反応槽中のＡβ_１−４２の含量に対して標準化した。そこから、使用された各マイクロタイタープレートについて特異的係数がもたらされ、各単一ファージクローンのＡβ_１−４２オリゴマーおよびＡβ_１−４２フィブリルへの結合についての値に当該係数を掛け算した。とりわけ単一ファージクローンの特異性の評価に関する結果の同等の解釈は、そのようにしてのみ可能である（図２参照）。

例
以下に本発明を例および添付の図面に基づいてより詳細に説明するが、本発明をこれによって限定するものではない。

デコイとしてのＡβモノマーの例を用いた競合的鏡像ファージディスプレイ：競合的鏡像ファージディスプレイの目的は、Ａβ_１−４２モノマー特異的結合ペプチドの選択であった。いわゆるパニングラウンドを６回実施したが、その際、１回のパニングラウンドは、ファージライブラリーを固定化標的分子／デコイであるＡβ_１−４２モノマーと接触させる過程に対応する。

他のＡβ_１−４２種、すなわちオリゴマーおよびフィブリルに高い特異性を有するファージの数を減少させるために、２回目のパニングラウンドから競合物質として、他ならぬこれらの種を使用した。

この方法により、Ａβ_１−４２オリゴマーおよびＡβ_１−４２フィブリルに高い親和性を有するファージの数を減少させ、モノマー状Ａβ_１−４２に高い特異性を有するファージの数を同時に富化することができた。

プラスチック結合ファージおよびブロッキング試薬ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）に特異性を有するファージの富化を減少させるというさらなる目的で、ストレプトアビジンをコーティングした、ラウンド毎に入れ替えられる異なる合成樹脂／表面（ポリスチレン／ポリプロピレン／ポリカーボネート）に標的分子を固定化した。

標的分子の固定化前に、ポリスチレン表面を製造業者の説明書にしたがって洗浄した。追加として、次から次のラウンドへと交代に、１×ＴＢＳ／０．１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ−２０／１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ １５０μｌを用いた表面のブロッキングおよび非ブロッキングを、を、標的分子の固定化前に、室温で１時間行った。この方法により、６回のパニングラウンドの間に１回を超えて使用された合成樹脂表面とブロッキングとの組合せは、なかった（表Ｘ参照）。

このステップは、例えば、上述の説明にしたがってＢＳＡなしで実施される後続のパニングラウンドにおいてＢＳＡと結合したファージは、結合パートナーを見つけず、それに対応して洗浄ステップで取り除かれるので、合成樹脂およびＢＳＡとの非特異的結合を減少させるために実施した。

表面の前処理後に、Ｄ−鏡像異性体のＮ−末端ビオチン化Ａβ_１−４２モノマーを１×ＴＢＳ中で濃度６３ｎＭに希釈し、標的分子としてそれぞれの表面に固定化した。Ａβ_１−４２−分子がモノマー状態であることをサイズ排除クロマトグラフィーにより保証した。利用された濃度６３ｎＭは、最も少ない数の遊離ストレプトアビジン結合部位を有する表面に基づき、利用される表面あたりの全てのストレプトアビジン結合部位の１／３の占有率に相当する。６３ｎＭに調整されたモノマー状Ａβ_１−４２の１×ＴＢＳ溶液１００μｌを、ストレプトアビジンでコーティングした表面に加え、室温で５分間インキュデコイした。続いて、表面を１×ＴＢＳ １５０μｌで３回洗浄した。

それに基づいて、最初のパニングラウンドにおいて１×ＴＢＳ ９０μｌを市販されている組換えファージライブラリー１０μｌと共に上記表面に加え、室温で５分間インキュデコイした。上清を取り除き、１×ＴＢＳ／０．１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ−２０中の１０μＭビオチン１００μｌに交換した。このステップは、高親和性ストレプトアビジン結合パートナーであるビオチンによる、まだ遊離のストレプトアビジン結合部位と結合していたファージの競合的排除に役立ち、このステップを室温で５分間実施した。その後に、表面を１×ＴＢＳ／０．１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ−２０で４回洗浄した。

相変わらず結合しているファージをｐＨ処置により分離した。このために、ｐＨ値２．２を有する０．２Ｍグリシン／ＨＣｌ溶液１００μｌを表面に加え、室温で１０分間インキュデコイした。溶出したファージを含む溶液を取り、中和のために、ｐＨ値９．１を有する１Ｍトリス／ＨＣｌ ２５μｌに加え、混合した。

この調製物２０μｌを新しい反応容器に移し、溶出後のファージ力価（いわゆるアウトプット力価）を決定するためにさらに使用した。残りの１０５μｌを、溶出したファージの増幅のために使用した。力価検定だけでなく増幅も、ファージライブラリーの製造業者の説明書にしたがって行った（先行技術）。

溶出して、増幅されていないファージと同様に、増幅されたファージを力価検定した（インプット力価検定）。希釈倍率を考慮して、１ｍＬあたりのプラーク形成単位（ｐｌａｑｕｅ ｆｏｒｍｉｎｇ ｕｎｉｔ＝ｐｆｕ）数を調査した。この数に基づき、各ラウンドについてファージの数を１×ＴＢＳ １００μｌ中にファージ１×１０^１１個に調整した。各後続ラウンドのために、先行ラウンドの増幅されたファージを使用し、適切に希釈した。

全てのラウンドにおける標的分子またはデコイ（モノマー状Ａβ_１−４２）の濃度が安定的に６３ｎＭであった一方で、競合物質をパニングラウンドからパニングラウンドへと漸増する濃度で添加した。競合物質として、Ｄ−鏡像異性体Ａβ_１−４２オリゴマー（サイズ排除クロマトグラフィーにより精製、すなわち他のＡβ_１−４２種と分離された）およびＡβ_１−４２フィブリル（密度勾配遠心分離により精製）を使用した。これらの競合物質はビオチン化しなかった。それは、さもないと表面との結合が可能になるからであった。しかし目的は、競合物質結合ファージを洗浄ステップで洗い流すことにより、競合物質結合ファージを、固定化標的分子と結合したファージと分離することであった。濃度上昇は両方の競合物質種について等しく、以下の通りであった：ラウンド１＝０ｎＭ〜ラウンド２＝１ｎＭ〜ラウンド３＝５ｎＭ〜ラウンド４＝１０ｎＭ〜ラウンド５＝５０ｎＭ〜ラウンド６＝５００ｎＭ。

競合ステップの採用によって、上記のパニングラウンドの経過をラウンド２から以下に適合させた：以前のラウンドからのファージ１×１０^１１個を以後１×ＴＢＳ １００μｌ中ではなく６０μｌ中に希釈した。その直後に、残りの４０μｌに、各ラウンドについて上に示した濃度の５倍のＡβ_１−４２オリゴマーを含む１×ＴＢＳ ２０μｌおよび上記濃度の５倍のＡβ_１−４２フィブリルを含む１×ＴＢＳ ２０μｌを満たした。それぞれ合計体積の５分の１（２０μｌ）だけが競合物質溶液からなり、調製物全体の中の競合物質の濃度が記載された値に適合するので、濃度が合計体積１００μｌに対して計算されたという事実から、上記濃度を５倍にすることが分かる。

５分後にファージおよび競合物質の溶液を取り除いた。１０μＭビオチンを用いた既述の競合ステップおよびパニングラウンドから次のパニングラウンドにかけて同様に回数が増大した洗浄ステップが続いた（ラウンド１＝洗浄ステップ４回〜ラウンド２＝６回〜ラウンド３＝８回〜ラウンド４＝１０回〜ラウンド５＝１２回〜ラウンド６＝１５回）。

表１について：鏡像ファージディスプレイについて以下のパラメーターを設定した。６回のパニングラウンド内で、３つの異なる合成樹脂（ＰＳ＝ポリスチレン、ＰＰ＝ポリプロピレン、ＰＣ＝ポリカーボネート）を交互に表面として使用した。追加的に、最初のラウンドから開始して、２回目のラウンド毎に表面をＢＳＡでブロッキングし、その後、標的分子を固定化した。この方法により、合成樹脂の１つまたはＢＳＡへの特異性を有するファージの富化が減少したはずである。ナイーブなファージライブラリー（ここで、ナイーブとは、ライブラリーを以前に標的分子とまだ接触させていないことを表す）に、最初のパニングラウンドにおいて固定化標的分子（Ａβ_１−４２モノマー）と結合する可能性を持たせた後に、２回目のパニングラウンドから競合ステップを導入した。このステップは、漸増する濃度の競合物質、特にＡβ_１−４２オリゴマーおよびＡβ_１−４２フィブリルの添加からなった。この方法により、異なるＡβ_１−４２種と非特異的に結合するファージが取り除かれ、その結果、最終的に、ａ）合成樹脂表面、ＢＳＡまたはビオチンではなく、Ｄ−鏡像異性体Ａβ_１−４２と特異的に結合し、その際、ｂ）モノマー状Ｄ−鏡像異性体Ａβ_１−４２に特異的な、ファージだけが残存したはずである。ラウンドあたりの洗浄ステップの回数を増加させたことで、洗浄の際の厳密さが高まったことにより、標的分子と非常に弱く結合するファージが取り除かれたはずである。

単一ファージの増幅：パニングラウンドから、標的分子とますます特異的に結合する異なるファージの集合が生じた。これらの集合から単一ファージクローンを増加させ、次にこれらを相互に比較するようにした（ＤＮＡ配列決定および単一ファージ−ＥＬＩＳＡ）。このために、鏡像ファージディスプレイの好ましいラウンド（パニングラウンド３〜６回目）のアウトプット力価プレートから個別に存在するプラーク形成単位を取り出し、増加させた。増加は、組換えファージライブラリーの製造業者のプロトコールにしたがって行った。

単一ファージＥＬＩＳＡ：標的分子および競合物質に対する単一ファージクローンの親和性をＥＬＩＳＡにより検討した。このために、３つの種全てをビオチン化形態で、ポリスチレン表面上でそれに結合したストレプトアビジンにより固定化した。パニングラウンドの間にオリゴマーおよびフィブリルを同じ時間に競合物質として添加したので、これらの両方の種は単一ファージ−ＥＬＩＳＡにおいて同様に混合されて固定化された。Ａβ_１−４２種を鏡像ファージディスプレイの場合と同一の原理で精製し、３２０ｎＭになるように固定化した（Ａβ_１−４２オリゴマーおよびＡβ_１−４２フィブリルの場合、合計濃度が３２０ｎＭで両方の種の１：１混合物を製造し、固定化した）。各クローンおよびプロトコールの後の経過中に言及された各対照に関して、それぞれ２つの反応槽（専門用語、原則的にドイツ語でも「ウェル」：ポリスチレン（または他の合成樹脂）製プレートにそれが９６個）に、Ａβ_１−４２モノマー、Ａβ_１−４２オリゴマー／フィブリルを固定化したか、または両方の調製物のどちらも固定化しなかった。Ａβ_１−４２が固定化されていない反応槽は、ファージまたはファージもしくはＡβ_１−４２の検出のために使用された抗体がプラスチック表面と非特異的に結合するかどうかの証明のために後で使用した。ストレプトアビジンをコーティングしたマイクロタイタープレートを、製造業者によって示されたように予備洗浄した。Ａβ_１−４２モノマーまたはＡβ_１−４２オリゴマーおよびＡβ_１−４２フィブリルを１×ＴＢＳ中でそれぞれ濃度３２０ｎＭに希釈した。固定化のために、反応槽あたり１００μｌを使用し、室温で１５分間インキュデコイした。全プレートを反応槽あたり１×ＴＢＳ １５０μｌで２回洗浄後、１×ＴＢＳ／０．１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ−２０／１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ １５０μｌを用いるブロッキングステップを室温で１時間実施した。その後、反応槽あたり１×ＴＢＳ／０．１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ−２０ １５０μｌを用いて３回の洗浄ステップを行った。増幅された単一ファージクローンを１×ＴＢＳ／１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡと１：１に混合した。抗体６Ｅ１０を１×ＴＢＳ／０．１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ−２０中で１：１０，０００に希釈した。各単一ファージクローン希釈液、ファージ不在の試料（ＬＢ培地：１×ＴＢＳ／１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ＝１：１）および抗体希釈液各１００μｌを、固定化Ａβ_１−４２不在の反応槽２つ、固定化モノマーＡβ_１−４２を有する反応槽２つ、および固定化オリゴマー／フィブリル状Ａβ_１−４２を有する反応槽２つにそれぞれ加え、室温で１時間インキュデコイした。反応槽あたり１×ＴＢＳ／０．１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ−２０ １５０μｌで５回洗浄後、各反応槽に１×ＴＢＳ／０．１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ−２０ ２００μｌを加え、プレートを室温で１時間インキュデコイした。溶液を取り除き、以下のように置き換えた。以前に単一ファージクローン−希釈液またはファージなしの調製物と共にインキュデコイした全ての反応槽に、今度は１×ＴＢＳ／０．１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ−２０中で１：５，０００に希釈したファージ抗体１００μｌを加えた。この抗体に酵素ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ（ｈｏｒｓｅ ｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ＝ＨＲＰ）が結合しており、この酵素は後で基質（ＴＭＢ）の変換に役立つ。この変換の結果、その強さが、抗体とその標的（ファージ）との結合に比例し、それによって、さらにまたファージと固定化された種または表面との結合に比例する発色反応が起こる。同時に、以前に６Ｅ１０抗体希釈液と共にインキュデコイした全ての反応槽に、今度は、マウス由来６Ｅ１０抗体を認識し、それと結合することができる２次抗体を１×ＴＢＳ／０．１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ−２０中に１：１，０００に希釈したもの１００μｌを加えた。この抗体もＨＲＰと結合しており、したがって、１次抗体と固定化標的分子または反応槽の合成樹脂表面との結合を定量化できるようにする。室温で１時間インキュベーション後に、プレートを、反応槽あたり１×ＴＢＳ／０．１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ−２０ １５０μｌで１０回洗浄した。基質３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）の添加によりシグナルの検出を行った。ＴＭＢは、ＨＲＰで変換された場合に、溶液の変色をもたらす。発色反応の強さは、ファージまたは抗体の結合強度の尺度である。そのために、洗浄後に反応槽あたりＴＭＢ溶液５０μｌを満たす。反応槽中の溶液が青緑色になるやいなや、２Ｍ Ｈ_２ＳＯ_４ ５０μｌを添加して発色を停止させる。続いて、４５０ｎｍでの吸収を自動的に読み出す。

Ａβ_１−４２オリゴマーおよびＡβ_１−４２フィブリルに対する親和性について、単一ファージ−ＥＬＩＳＡにおいて得られた値を、まず第一に、Ａβ_１−４２特異的抗体６Ｅ１０を用いた固定化検査の結果（図１参照、固定化検査）に基づき、Ａβ_１−４２モノマーをコーティングした反応槽のＡβ_１−４２の含有量に対して標準化した。続いて、各クローンについて、Ａβ_１−４２モノマーをコーティングした反応槽についてのシグナル強度の値を１００％に設定した。Ａβ_１−４２オリゴマーおよびＡβ_１−４２フィブリルをコーティングした反応槽についてのシグナル強度とＡβ_１−４２モノマーをコーティングした反応槽についての値の差を以下の表２にパーセントで示した。値が高いほど、差は大きく、それだけ一層、Ａβ_１−４２モノマーとの結合が特異的である。本発明による方法により同定された様々なクローン（クローン５．６０〜６．１３５）に、試験されたが選ばれなかった他のクローン（６．２６２〜６．８５）が続く。例えばクローン６．８４は、さらなる実験のために選ばれなかった。それは、確かにＡβ_１−４２モノマーへの特異性があったが、シグナル強度が極めて低かったからである。

本発明による鏡像ファージディスプレイを用いて、Ａβモノマー特異的結合ペプチドをＭｏｓｄ１〜Ｍｏｓｄ２１を用いて調査した。

配列が単離されたそれぞれのファージクローンの番号を、ペプチドの対応するアミノ酸配列の名称および対応する配列番号と共に記載し、アミノ酸配列を１文字コードで同様に表す。

図１について：ＥＬＩＳＡ実験のために、ストレプトアビジンでコーティングした９６ウェルマイクロタイタープレートに、ビオチン化Ｄ−鏡像異性体Ａβ_１−４２モノマーおよびビオチン化Ｄ−鏡像異性体Ａβ_１−４２オリゴマーとビオチン化Ｄ−鏡像異性体Ａβ_１−４２フィブリルとの混合物をそれぞれの濃度３２０ｎＭ中で固定化した。以下の単一ファージ−ＥＬＩＳＡ実験の正確な評価を保証できるように、Ａβ_１−４２特異的抗体（６Ｅ１０）を用いて固定化効率を試験した。４５０ｎｍでの吸収を測定し、Ｙ軸にプロットした。全ての使用されたプレート（Ａ、Ｂ、Ｃ）上に、Ａβ_１−４２モノマーと同様、Ａβ_１−４２オリゴマーとＡβ_１−４２フィブリルとの混合物も固定化した。これは、Ａβ_１−４２が固定化されていないウェルの値と比較した吸収値の増加からわかる。Ａβ_１−４２オリゴマーおよびＡβ_１−４２フィブリルは、Ａβ_１−４２モノマーよりも高い固定化効率を有する。

これは、一方では、異なるＡβ_１−４２種の固定化が成功したことを意味する。しかし、固定化されたＡβ_１−４２の量は、種の間で異なり、その結果、実験のさらなる評価（図２）のために、Ａβ_１−４２モノマーならびにＡβ_１−４２オリゴマーおよびＡβ_１−４２フィブリルについての値の標準化が不可欠になる。

図２について：増幅した単一ファージクローンの、固定化Ａβ_１−４２モノマー、Ａβ_１−４２オリゴマーおよびＡβ_１−４２フィブリルならびにストレプトアビジンをコーティングしたプラスチック表面への結合親和性を検討した。４５０ｎｍにおける吸収を測定した。左から右にかけて、表１に対応する順序のクローン（５．６０〜６．１３５）を示し、それに続いて、試験されたが選択されなかった他のクローン（６．２６２〜６．８５）を示した。Ｙ軸の値は、モノマーＡβ_１−４２（黒）、オリゴマーおよびフィブリル状Ａβ_１−４２（濃灰色）ならびにストレプトアビジンをコーティングしたプラスチック表面（明るい灰色の縞模様）に対する単一ファージクローンの標準化された吸収値を示す。緩衝液対照の値を差し引いた後、図１に示された異なるＡβ_１−４２種の固定化効率における差に基づき、Ａβ_１−４２オリゴマーおよびＡβ_１−４２フィブリルが固定化されたウェルの吸収を、Ａβ_１−４２モノマーをコーティングしたウェルのＡβ_１−４２含有量に対して標準化した。

吸収値から、全ての試験されたファージが好ましくはモノマー状Ａβ_１−４２と結合することが明らかである。全てのファージは、Ａβ_１−４２オリゴマーおよびＡβ_１−４２フィブリルならびにＡβ_１−４２不含プラスチック表面よりもモノマー状Ａβ_１−４２に対してより高い値を有する。それに基づいて、本明細書において使用された方法において競合ステップを用いて、Ａβ_１−４２オリゴマーおよびＡβ_１−４２フィブリルと比べてモノマー状Ａβ_１−４２に対して高い特異性が達成され、同様に基材表面を切り替えて、プラスチック、ＢＳＡまたはストレプトアビジン結合性ファージの富化の減少も実現することができたと結論することができる。その際、Ｍｏｓｄ１のペプチド配列を含むクローン５．６０が、特に際立っている。このクローンは、全ての試験されたクローンのうちモノマー状Ａβ_１−４２に対して最高の吸収値を有するだけではない。このクローンは、そのうえ、モノマー状Ａβ_１−４２についての吸収値とオリゴマー状およびフィブリル状Ａβ_１−４２についての吸収値との差が最大であることで傑出している。これは、モノマー状Ａβ_１−４２に対する非常に高い特異性と同じ意味をもつ。

図３について：独立して実施されたＴｈＴ実験７回からの平均相対蛍光を標準偏差と共に示す。色素チオフラビンＴ（ＴｈＴ）は調製物中のβシート構造と結合し、それにしたがってその蛍光スペクトルを変化させる。Ａβ_１−４２が凝集する間に、増大したβシート構造が生成し、したがってその構造は、ＴｈＴ蛍光の増加により直接測定することができる。１０μＭ Ａβ_１−４２試料（黒）の相対蛍光を参照として使用した。蛍光シグナルの対数増加が定常期に移行する時点を１００％に設定した。等モル濃度の異なるペプチドの使用はＴｈＴ蛍光に影響し、それに伴って調製物中に同様に含まれるＡβ_１−４２の凝集およびフィブリル生成にもまさしくこの時点に影響した。Ａβ_１−４２だけを含む調製物（黒）と比べて、Ａβ_１−４２と、Ｍｏｓｄ１（明るい灰色）、Ｍｏｓｄ２（濃灰色）、Ｍｏｓｄ３（灰色、斜線縞模様）およびＭｏｓｄ４（灰色、斑点模様）との等モル割合の同時インキュベーションについての相対蛍光単位を図示する。

Ｍｏｓｄ２および３が、記載の時点でＴｈＴ蛍光を高める間に、これらのペプチドがβシート構造の生成を促進すると仮定することができる。一方、Ｍｏｓｄ４は、βシート構造の生成に非常にわずかな影響だけを有する。Ｍｏｓｄ１は、試料中のβシート構造の割合についての尺度である相対蛍光を減少させることができる。この試験において試験されたペプチドのどれも自己蛍光を有さないので、高まった蛍光値は、フィブリル状の、したがってβシート構造を含むＡβの生成だけに原因があると仮定することができる。そのことから、Ｍｏｓｄ１が、おそらく、Ａβモノマーの安定化または大型のＴｈＴ陰性凝集体の生成によりフィブリル状Ａβの割合を減少させると結論することができる。これに反して、ペプチドＭｏｓｄ２およびＭｏｓｄ３は、Ａβのフィブリル化を加速するように見える。フィブリル状Ａβの生成は、必須の前駆体としてのオリゴマーが平衡から取り除かれることも意味するので、これは、もちろん必ずしもマイナスに評価すべき結果ではない。

図４について：異なるサイズのＡβ_１−４２種の広く多様な混合物に及ぼす、異なるＭｏｓｄペプチドの影響を、密度勾配遠心分離、遠心分離後の勾配の分画、ならびにトリス−トリシン−ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび銀染色による画分の分析により分析した。

広域スペクトルの異なるＡβ_１−４２種を得るために、ペプチドを添加せずに８０μＭ Ａβ_１−４２を６００ｒｐｍにおいて２５℃で４．５時間インキュデコイした。続いて、ペプチドを添加して、または添加せずに、調製物をさらに４０分間インキュデコイし、続いてイオジキサノール密度勾配上にアプライした。続いて、勾配を遠心分離したが、その際、試料の内容物（異なるサイズのＡβ_１−４２種）が勾配の中でそのサイズおよび形態に対応して拡散する。遠心分離後に勾配を１５個の画分（１〜１５）に分画し、個別の画分の最初の１４個をトリス−トリシン−ＳＤＳゲル上にアプライする。画分あたりの内容物の分離を電気泳動的に行った。変性したタンパク質のバンド（Ａβ_１−４２は４．５ｋＤａ、マーカー（Ｍ）参照）を銀染色により可視化した。この手法は、定量化分析を可能にしないが、しかし、シグナルの強度はタンパク質の濃度と相関し、その結果、より強いシグナルは原則としてより高いタンパク質濃度を指し示す。

濃度４０μＭのペプチドＭｏｓｄ１〜４の影響を検討した。図は、一番上の部分で、ペプチドとの同時インキュベーションをしなかったＡβ_１−４２種の分布を示す。異なるサイズのＡβ_１−４２種の広域スペクトルが試料中にある。ペプチドＭｏｓｄ１／２および３は、高分子Ａβ_１−４２種（画分１０〜１４）の割合を高め、とりわけ、有毒と見なされるオリゴマーＡβ_１−４２種（画分４〜７）を減少させる。

図５について：異なるサイズのＡβ_１−４２種の広く多様な混合物に及ぼす異なる濃度のＭｏｓｄ１の影響を、密度勾配遠心分離、遠心分離後の勾配の分画、ならびにトリス−トリシン−ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび銀染色による画分の分析により分析した。

広域スペクトルの異なるＡβ_１−４２種を得るために、ペプチドを添加せずに８０μＭ Ａβ_１−４２を６００ｒｐｍにおいて２５℃で４．５時間インキュデコイした。続いて、Ｍｏｓｄ１を添加せずに（Ａ）または異なる濃度のＭｏｓｄ１を添加して（Ｂ＝１０μＭ Ｍｏｓｓｄ１；Ｃ＝２０μＭ Ｍｏｓｄ１；Ｄ＝４０μＭ Ｍｏｓｄ１；Ｅ＝８０μＭ Ｍｏｓｄ１）、調製物をさらに４０分間インキュデコイし、続いてイオジキサノール−密度勾配上にアプライした。続いて、勾配を遠心分離し、その際、試料の内容物（異なるサイズのＡβ_１−４２種）が勾配の中でそのサイズおよび形態に対応して拡散する。遠心分離後に勾配を分画し（１〜１５）、個別の画分をトリス−トリシン−ＳＤＳゲル上にアプライする。画分あたりの内容物の分離を電気泳動的に行った。変性したタンパク質のバンド（Ａβ_１−４２は４．５ｋＤａ、マーカー参照（Ｍ））を銀染色により可視化した。この手法は、定量的分析を可能にしないが、しかし、シグナルの強度はタンパク質の濃度と相関し、その結果、強いシグナルは原則としてより高いタンパク質濃度を指し示す。

異なる濃度のペプチドＭｏｓｄ１の影響を検討した。画像の一番上の部分（Ａ）は、ペプチドとの同時インキュベーションをしなかったＡβ_１−４２種の分布を示す。異なるサイズのＡβ_１−４２種の広域スペクトルが試料中にある。Ｍｏｓｄ１によるＡβ_１−４２種の調節は濃度依存的である（Ｂ〜Ｅ）。低濃度（ＢおよびＣ）のＭｏｓｄ１は、Ａβ_１−４２種の組成をほんのわずかだけ変化させるが、しかし、未処理のＡβ_１−４２試料と比べて毒性のオリゴマーの割合を低下させ（画分４〜７）、高分子量凝集体の割合を高める。より高い濃度のＭｏｓｄ１（ＤおよびＥ）は、小型のＡβ_１−４２種および毒性のオリゴマーの割合を明確に減少させ、高分子凝集体へのＡβ_１−４２種の調節をもたらす。

Ｍｏｓｄ１は、異なるＡβ種のプールから、存在する毒性のＡβオリゴマーを取り除き、非毒性の高分子凝集体の生成を促進することができる。この過程は濃度依存的である。２０μＭ Ｍｏｓｄ１の使用は既に、オリゴマーのバンドのシグナル強度を減少させ、未処理のＡβと比べて画分１１〜１４におけるＡβバンドのシグナルを強化する。より高い濃度はこの効果を強化するが、しかし、モノマー状Ａβに対応する画分１〜２におけるシグナル強度の低下も招く。

図６について：異なる濃度のＭｏｓｄ１が、異なるサイズのＡβ_１−４２種の広く多様な混合物に及ぼす影響を、密度勾配遠心分離、遠心分離後の勾配の分画、ならびにトリス−トリシン−ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび銀染色を用いた画分の分析により分析した（図５）。図５に示した実験からの各画分の試料を、逆相ＨＰＬＣで分離しおよび定量化した。このために、移動相（ｄｄＨ_２Ｏ中、３０％（ｖ／ｖ）アセトニトリル、０．１％（ｖ／ｖ）ＴＦＡ）に入れた試料を、高いカラム温度（８０℃）でＺｏｒｂａｘ ３００ＳＢ−Ｃ８カラムに通して変性および分離させた。各画分について、３回の相互に独立して実施した実験からの試料を平均し、標準偏差を算出した。結果は、図５のゲルの画像の結果に対応し、データの定量的分析を可能にする。画分１５は密度勾配遠心分離後のペレットに対応し、わずかな量のＡβ_１−４２を同様に含む。

ＲＰ−ＨＰＬＣによる試料の定量的分析データは、図５からの定性的内容を証明している。Ｍｏｓｄ１の濃度が上昇すると、毒性のオリゴマーを含む画分中のＡβ濃度は低下する。同様に、高分子Ａβ種（画分１１〜１４）の濃度は同時に上昇する。

図７について：前の実験は、Ａβ_１−４２とＭｏｓｄペプチド、具体的な場合にはＭｏｓｄ１との同時インキュベーションが、高分子凝集体へのＡβ_１−４２の凝集の調節につながることを指摘している。したがって、さらなる分析のために１０μＭ Ａβ_１−４２を１０μＭ Ｍｏｓｄ１と共に、およびそれなしで室温で２４時間インキュデコイし、続いてＦｏｒｍｖａｒ／炭素−銅グリッドに固定化し、酢酸ウラニルで染色した。続くＴＥＭ（１２０ｋＶ）による分析から、Ａβ_１−４２がＭｏｓｄ１不在下でインキュデコイされた場合にフィブリル構造（左の画像）が示された。Ｍｏｓｄ１との同時インキュベーションは、フィブリル構造と明白に異なる、大型の高分子凝集体の生成につながった（右の画像）。縮尺のバーは０．２５μｍに相当する。

図８について：ＰＣ−１２細胞の生存率に及ぼすＡβ_１−４２の影響を試験した。異なるＡβ_１−４２種の混合物（製造は図４参照）をＰＣ−１２細胞に加えた。追加として、図４に記載するように、Ａβ_１−４２の調製物を異なる濃度のＭｏｓｄ１と共に同時インキュデコイし、同様にＭｏｓｄ１のみを含んだ調製物も試験した。ウェルあたりの最終濃度は、１μＭ Ａβ_１−４２または１もしくは０．５μＭ Ｍｏｓｄ１であった。試料を細胞の培地に加え、細胞と共に３７℃で２４時間インキュデコイした。続いて、ＭＴＴ試験に基づき、細胞生存率の決定を行った。これに関して、代謝活性細胞（生きた細胞）によって変換され得る代謝出発物質を細胞に供給する。この変換の産物は、可溶性の着色ホルマザン結晶である。溶解後の培地の着色は、出発物質の変換率に、それゆえに細胞の生存率に対応する。未処理細胞（培地、白い方眼）は、生存対照として利用し、生存細胞の割合を１００％に定義した。他の調製物の値をこの値に対して標準化した。０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を用いた処理は、細胞毒性に関する陽性対照として利用し（明るい灰色）、生存細胞の量は、この調製物において１．５％だけであった。異なるＡβ_１−４２種の混合物は、推測通り毒性の種も含み、その結果、細胞とＡβ_１−４２混合物とのインキュベーションによって生存細胞の数は４５％に減少した（黒）。Ｍｏｓｄ１は、ＰＣ−１２細胞の生存率に影響しない。しかし、Ａβ_１−４２とＭｏｓｄ１との同時インキュベーションは、Ａβ_１−４２の毒性を濃度依存的に減少させる（灰色（１μＭ Ｍｏｓｄ１）および濃灰色（０．５μＭ Ｍｏｓｄ１））。細胞に添加する前に、Ａβ_１−４２−混合物をＭｏｓｄ１と同時インキュデコイした場合、細胞の８６％または６６％が生き残る。

これは、Ｍｏｓｄ１が、毒性の凝集体を高分子の非毒性のＡβ_１−４２種に変換するか、または毒性のＡβ_１−４２種を分解することができることを示している。

図９について：マウス神経芽腫細胞株Ｎｅｕｒｏ−２ａは、神経細胞のモデルとして役立ち、したがって、ＡＤの症状を分析するために適している。そのうえ、ヒトＡＰＰ６９５を用いたＮｅｕｒｏ−２ａ細胞の安定トランスフェクションは、ヒトＡＰＰ（アミロイド前駆体タンパク質）およびその全てのプロセシング産物、とりわけ毒性のＡβ_１−４２が細胞自体に産生されるモデルを可能にする。この方法により、自然に生成したＡβ_１−４２種の影響を神経細胞において直接検討することができる。実験では、ＡＰＰのトランスフェクションを受けたＮｅｕｒｏ−２ａ細胞と平行して、ＡＰＰなしのＮｅｕｒｏ−２ａ細胞を培養した。ＡＰＰの産生およびそのプロセシング産物は、相互にわずかな接触だけを形成している、丸くなり孤立した細胞を示す（左の画像）。しかし、１０μＭまたは１００μＭ Ｍｏｓｄ１とのインキュベーションにより、この病理表現型を覆すことができ、細胞は、野生型Ｎｅｕｒｏ−２ａ細胞に対応する生理学的表現型に適切に成長する。これは、細胞数が増加し、細胞が蓄積し、多角形形態を有し、かつ多数の細胞接触および枝を有することを意味する（中央および右の画像）。

これは、Ｍｏｓｄ１が毒性のＡβ_１−４２種を解体または改変できるだけでなく、毒性の種の生成を阻害することもできることを証明している。

Ｍｏｓｄ１について示された結果を、配列番号２〜２１のペプチドおよびポリマーについても予期することができる。したがって、実施例に示された結果は、配列番号１〜２１の全てによるペプチドと同様に、一般に本発明による方法、すなわち改変鏡像ファージディスプレイを用いて得られたペプチドに関しても、類似している。

この状況で、デコイとしてＡβオリゴマーならびに競合物質としてＡβモノマーおよび／またはＡβフィブリルを使用することによって、使用された鏡像ファージディスプレイを、ちょうど同じようにして他の方向、すなわちＡβオリゴマーのリガンドの同定のために行うことができることが指摘されよう。そのうえ、本発明による鏡像ファージディスプレイは、当然、他のデコイ競合物質ペアにも利用可能である。

Claims (18)

1. 配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０および／または配列番号２１ならびにその相同体、断片および部分、ならびに配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０および／または配列番号２１のポリマーならびにその相同体、断片および部分からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列を含む、アミロイドβ種に特異的に結合するペプチド。
2. 本質的にＤ−アミノ酸からなることを特徴とする、請求項１に記載のペプチド。
3. 環化形態で存在することを特徴とする、請求項１または２に記載のペプチド。
4. 医薬において使用するための、請求項１〜３のいずれか一つに記載のペプチド。
5. アルツハイマー病を治療または予防するための、請求項１〜４のいずれか一つに記載のペプチド。
6. 請求項１〜５のいずれか一つに記載のペプチドを含むキット。
7. 請求項１〜５のいずれか一つに記載のペプチドを含む組成物。
8. アミロイドβモノマー、アミロイドβフィブリルおよび／またはアミロイドβオリゴマーの特異的な同定、定量的決定および／または定性的決定のためのプローブとしての、請求項１〜５のいずれか一つに記載のペプチドの使用。
9. アミロイドβオリゴマーおよび／またはアミロイドβペプチド凝集体を阻害するための、請求項１〜５のいずれか一つに記載のペプチドの使用。
10. 毒性のアミロイドβオリゴマーおよび／または凝集体を無毒化するための、請求項１〜５のいずれか一つに記載のペプチドの使用。
11. アミロイドβオリゴマーおよび／または凝集体が、請求項１〜５のいずれか一つに記載のペプチドによってモノマーおよび／または非毒性の凝集体に変換されることを特徴とする、請求項１０に記載の使用。
12. Ａβモノマーへの特異的な結合のための、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０および／または配列番号２１のペプチドならびにその相同体、断片および部分、ならびに配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０および／または配列番号２１のポリマーならびにその相同体、断片および部分の使用。
13. アルツハイマー病の治療薬としてのおよびアルツハイマー病の予防のための、請求項１〜５のいずれか一つに記載のペプチドの使用。
14. 以下のステップ：
    ａ）固定化されたデコイを基材上に用意するステップ、
    ｂ）デコイとして機能する固定化された分子を、分子のライブラリーを含む溶液と接触させるステップ、
    ｃ）特異性洗浄ステップとして、分子で占有された固定化デコイを少なくとも１つの競合物質と接触させるステップ、
    ｄ）分子で占有された固定化デコイを競合物質と接触させた後に、なおもデコイと結合している分子を分離および増加させるステップ、
    ｅ）前記ステップを繰り返すステップであって、各繰り返しの際に異なる基材が使用されるステップ、
    ｆ）前記繰り返しの後に、デコイ上に留まった分子の構造を同定するステップ、
    を有する、デコイと特異的に結合するリガンドを同定するための方法。
15. 各繰り返しの際に異なる基材が使用され、かつ／またはブロッキングもしくは非ブロッキング試薬が使用されることを特徴とする、請求項１４に記載の方法。
16. 基材としてのポリスチロール、ポリプロピレンおよび／またはポリカーボネートを特徴とする、請求項１４または１５に記載の方法。
17. デコイとしてＡβモノマーならびに競合物質としてＡβオリゴマーおよび／またはＡβフィブリルが使用されるか、あるいはその逆であることを特徴とする、請求項１４〜１６のいずれか一つに記載の方法。
18. 請求項１４〜１７のいずれか一つに記載の方法を用いて同定された、デコイに、例えばＡβ種に特異的に結合するリガンド、とりわけペプチド。