WO2016150416A1 - Spezifisch amyloid-beta bindende peptide und deren verwendung für die therapie und diagnose der alzheimerschen demenz - Google Patents

Spezifisch amyloid-beta bindende peptide und deren verwendung für die therapie und diagnose der alzheimerschen demenz Download PDF

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beta
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peptide
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Dieter Willbold
Stephan Rudolph
Janine Kutzsche
Susanne Aileen Funke
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Forschungszentrum Jülich GmbH
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    • G01N2800/2821—Alzheimer

Definitions

  • amyloid beta-binding peptides and their use for the therapy and diagnosis of Alzheimer's dementia
  • the invention relates to specific amyloid-beta binding peptides and their use for the therapy and diagnosis of Alzheimer's dementia.
  • WO 02/081505 A2 discloses the D-enantiomeric peptide with the name "D3". It was identified by a mirror image phage display selection against predominantly monomeric A ⁇ (1-42) with the plan to stabilize it by binding and prevent its conversion to toxic A ⁇ aggregates. According to the current state of knowledge, D3 preferably converts the particularly toxic Aß oligomers into non-toxic, non-amyloidogenic and ThT-negative, amorphous
  • AD Alzheimer's disease
  • a ⁇ beta-amyloid peptide
  • Aß oligomers have been blamed as the main causative agents for the genesis and progress of AD.
  • Monomeric A ⁇ is constantly produced throughout our life in our body by sequential proteolysis of the precursor protein APP (amyloid precursor protein) by ⁇ - and ⁇ -secretases (Haass and Selkoe 1993) and is not toxic per se. It There is even more evidence that monomeric A ⁇ has physiological, perhaps even neuroprotective function in the brain (Puzzo and Arancio 2013).
  • a ⁇ monomers depending on their concentration (which ultimately results from rates of formation and degradation in the body), are more likely to spontaneously coexist with A ⁇ oligomers as age increases. Once formed A ⁇ oligomers could then multiply by a phono-like mechanism and ultimately lead to the disease.
  • the goal of a causal treatment should be to prevent the formation of toxic A ⁇ oligomers or preexisting ones
  • Alzheimer's dementia Used drugs are at best able to alleviate some symptoms, but can not progress the disease
  • Alzheimer's dementia is more promising not to decrease the A ⁇ concentration of the monomers but that of the A ⁇ oligomers.
  • the object of the invention is therefore A) To provide peptides for the causative therapy of Alzheimer's disease by preventing the formation of toxic amyloid ⁇ (A ⁇ ) oligomers or aggregates or their de-toxification. Furthermore, should
  • the object of the invention is achieved with ligands or peptides which bind specifically to specific A-beta species.
  • peptides are provided which are more specific as bind to oligomeric and / or fibrillar A ⁇ i-42.
  • target molecule and bait are used interchangeably.
  • peptides specifically binding amyloid beta species for the treatment of Alzheimer's dementia.
  • the specificity often referred to as selectivity, means that the ligand according to the invention or a peptide according to the invention can in principle bind different A-beta species, eg A-beta-monomer or A-beta-oligomer or A-beta-fibrils.
  • K D dissociation constant
  • K A 1 / KD
  • the specificity of the ligand for the bait over the competitor is expressed by the highest possible quotient of the affinities for the A-beta monomer and the A-beta oligomer or A-beta fibrils.
  • quotients of the KA values of the ligand for the A-beta monomer and for the A-beta-oligomer (or A-beta-fibrils) are thus formed to determine the specificity. The larger the quotient, the greater the specificity.
  • ligands are to be determined which binds particularly specifically to a species such as monomer or oligomer or fibrils.
  • the biomolecules should be suitable as therapeutic agents and remedies. The ligands obtained in this way or
  • Peptides have the desired properties and solve the object of the invention.
  • the prior art mirror image phage display also leads disadvantageously to surface or blocking reagent-binding ligands or at least to ligands which have bound both to the surface and to the bait . It should be noted that, in addition to the selection of specific monomeric binders given here, the mirror image phage display method can of course also be used to find specific oligomeric binders or even to find ligands over other species involved in protein misfolding disease.
  • the selection method according to the invention identifies, in particular, D-peptides which have one or more of the desired properties.
  • the properties include the binding specificity for Abeta monomers, the inhibition of Abeta fibril formation, the inhibition of Abeta cytotoxicity, the elimination of Abeta oligomers, the conversion of Abeta oligomers to non-toxic, non-amyloid species.
  • A-beta oligomers are used as baits, then specific ligands for A-beta oligomers can be determined by competing with A-beta monomers.
  • the peptide sequence is advantageously presented at the N-terminus of the gp3 protein of the M13 phage and is encoded in its genome.
  • the gp3 molecule also called gene product 3, is a protein that sits in the sheath of the phage and is required for contact with the host cell.
  • the DNA sequence of the p3 gene of a selected phage contains the genetic information about the corresponding peptide sequence on the gp3 molecule and can be sequenced. After sequencing, the genomic sequence can be transformed into a Amino acid sequence can be transcribed and synthesized as a D-enantiomeric peptide which binds to the physiological L-enantiomeric form of the target molecule (eg A ⁇ 1-42).
  • the phage library is contacted with a fixed target molecule, also known as bait, and binding phages are isolated from the billion-fold background of other non-binding phages.
  • the amount of phage which preferentially bind to oligomeric or fibrillar species of A ⁇ 1-42 is reduced, by reducing these species to, for example,. B. be added as counterselectants or competitors from the second panning round.
  • Phage showing an increased affinity for A ⁇ 1-42 oligomers and fibrils can be removed from the phage pool in this manner, so that e.g. B. A ⁇ 1-42 monomer-specific phage accumulate.
  • the procedure can be
  • differently treated surfaces are preferably used in all panning rounds, and a further competitive step with e.g. B. biotin, a high affinity stretpavidin binder used.
  • the selection pressure was successively increased.
  • concentration of a biotinylated target molecule eg, monomeric D-enantiomeric A ⁇ 1-42
  • concentration of the counterselectant and non-biotinylated competitors e.g. D-enantiomeric A ⁇ 1-42 oligomers and A ⁇ 1-42 fibrils.
  • polystyrene polypropylene and polycarbonate done.
  • a BSA-blocked polystyrene surface in round 1 a polypropylene surface in round 2
  • a BSA-blocked polycarbonate surface in round 3 a polystyrene surface in round
  • a BSA-blocked polypropylene surface in round 5 as well as a Polycarbonate surface can be changed in the round R6.
  • the competitors and target molecules or baits are brought into contact with the library at the same time.
  • the method is thus characterized by the following steps: a) providing an immobilized bait on a substrate. b) contacting the bait immobilized molecule with a solution containing a library of molecules. c) contacting the immobilized baits occupied with the molecules with at least one competitor as a specificity washing step. d) Separation and propagation of the after contact with the
  • Molecules of immobilized baits with competitors continue to occupy bait-bound molecules. e) repetition of said steps, wherein a different substrate is used in each repetition, f) Identification of the structure of the molecules remaining on the bait after repetition.
  • a different substrate is z. B. by changing the substrate and / or blocking or non-blocking using reagents used.
  • the bait used is a molecule from the group consisting of proteins, peptides, RNA, DNA, m-RNA and chemical compounds. In particular, various A-Beta species are used as bait.
  • z As a surface to which the bait is immobilized, z.
  • one component from the group consisting of microtiter plates, magnetic particles, agarose or sepharose beads is used.
  • Competitors are bait-like molecules whose binding sites are similar to those of the immobilized bait.
  • competitors in particular the A-beta species are used which are not used as bait.
  • the library and competitors are preferably contacted simultaneously with the immobilized bait.
  • the method may be characterized in that the immobile phase is rinsed in the specificity washing step with a solution containing competitors.
  • the method may be characterized in that in the specificity washing step the solution is exchanged with the library of molecules through a solution containing competitors.
  • the method may be characterized by adding a solution of competitors to the immobile phase in the specificity washing step.
  • the specificity washing step and the addition of the library of molecules occurs almost simultaneously. If phages in principle have an affinity for A-beta monomers and oligomers as bait and competitor, there is the possibility to bind to both targets simultaneously and not one after the other. This has the advantageous effect of enriching only those ligands which preferentially bind to the bait even when bait and competitor are exposed simultaneously.
  • the concentration of competitors is preferably increased per selection round.
  • the bait according to point a) is therefore a compound to which the biomolecule to be selected is to be bound. It is fixed to a first surface by methods known in the art.
  • proteins, peptides, RNA or DNA molecules may be mentioned as baits, in particular A-beta monomer.
  • baits in particular A-beta monomer.
  • microtiter plates, magnetic particles, agarose or sepharose beads can be used by way of example.
  • the immobilized bait is contacted with a randomized library of molecules - especially biomolecules. These biomolecules compete for binding to the bait.
  • the randomized library is a mixture of very many, for example, 10 12 , but also 10 4 or only 100 different molecules in a mixture.
  • such a library may each consist of peptides, proteins, DNA, RNA, or mRNA which are bound to certain vehicles and which can bind to baits.
  • Suitable vehicles are, for example, phages, polysomes or bacterial surfaces.
  • the library may consist of artificial or naturally isolated components or a mixture of both. By artificially within the meaning of the invention are meant, for example, compounds prepared from oligonucleotide synthesis.
  • the biomolecule-loaded immobilized bait is brought into contact with competitors in step c).
  • a specificity washing step is carried out, in which the solution is added to competitors, or the immobile phase is rinsed with a solution containing competitors, or the Solution with the library of biomolecules is preferably repeatedly replaced by a solution containing competitors.
  • the competitors are bait-like molecules whose binding sites are similar to those of the immobilized bait.
  • the competitors present in solution compete in the washing step for the library molecules already bound to the immobilized bait.
  • step d) takes place z. B. by elution of phage from the bait to multiply them.
  • the phages contain the peptides.
  • the bound biomolecules are separated from the bait and propagated by known methods.
  • phage particles obtained after steps a) to c) can be introduced into cells and propagated.
  • the separation can be carried out, for example, by changing the pH, heating or changing, in particular increasing the salt concentration.
  • step e) the concentration of the selected biomolecules in the solution fed to the bait after step a) is increased.
  • steps a) to e) are carried out. But it can also be done 1-> 10 or 1-> 20 repetitions.
  • the concentration of the competitors may initially be, for example, 1 nmol / l.
  • the concentration change of the competitors can be done in steps of doubling to tenfold or more. Typical final concentrations are 1 pmol / l.
  • these ligands specifically binding to a bait are molecules which have an increased selectivity with respect to a particular bait, that is to say that they bind to a specific bait more specifically but not necessarily more strongly than bait-like bait molecules.
  • the ligands bind exclusively to a particular bait.
  • the ligand or peptide selected by the method should preferentially bind to the target molecule.
  • a particularly relevant Spiegelblldphagendisplay provides N-terminally biotinylated D-enantiomeric A-Betai -4 2 monomer in step a), a recombinant phage library in step b) and D-enantiomeric A-beta-i -4 2 oligomers and / or D-enantiomeric A-beta ⁇ fibrils in step c) as a competitor, in addition to A-beta ⁇ - monomer as a bait.
  • the peptides according to SEQ ID NO: 1-21 can be used by the specific binding to A-beta monomers, as a possible drug against Alzheimer's dementia.
  • A-beta monomers are highly specifically bound by peptides according to the invention, in particular the peptide of SEQ ID NO: 1, whereby oligomers dissolve.
  • the peptides of the invention fulfill the task by reducing the amyloid-beta-oligomer concentration while stabilizing the amyloid-beta monomers.
  • the specificity for A-beta monomers can be demonstrated by ELISA.
  • the abovementioned ligands (or peptides) according to the invention which bind specifically to A-beta monomers prevent the formation of A-beta oligomers, without thereby leading to a reduction in the monomer concentration.
  • already-formed A-beta oligomers are removed from the dynamic equilibrium of the various aggregate species by treatment with a monomer-stabilizing active ingredient or peptide according to the invention.
  • This advantageously has the effect that the oligomers are degraded to monomers.
  • the formation of oligomers is prevented de novo as well as already formed oligomers removed and that primarily to monomers as well as to large, non-fibrillar and non-toxic aggregates.
  • the object is also achieved by a peptide containing the amino acid sequence according to SEQ ID NO: 1-21 and / or homologues, fragments and parts thereof. This peptide advantageously binds to amyloid beta monomer as well.
  • those peptides are used which bind to an A-beta monomer of at most 500 ⁇ , preferably 250, 100, 50 ⁇ , particularly preferably 25, 10, 6 ⁇ , in particular 4, 2, 1 ⁇ or sub- ⁇ binds.
  • the problem is solved in particular by polymers consisting of two or more of the abovementioned peptides according to the invention and / or their homologs or fragments and parts thereof.
  • Dimers are composed of two of the peptides according to the invention, each of which binds to amyloid-beta species.
  • similar eg two peptides of SEQ ID NO: 1
  • two different peptides according to the invention can be used (eg a dimer of the peptides according to SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2).
  • Polymers have even more peptides according to the invention.
  • inventively constructed polymers of peptides of the invention which in turn bind to A-beta monomers, advantageously show synergistic effects with respect to their specificity to the A-beta monomer.
  • the polymers according to the invention are superior to the individual peptides of which they are composed.
  • Synergetic effects in the sense of the present invention are effects which show a higher specificity with respect to the A-beta monomer.
  • the polymers and in particular dimers in the animal model experiment are advantageously more efficient than the individual peptide units.
  • those peptides or polymers are used which are attached to an A-beta monomer having a dissociation constant (K D value) of at most 500 ⁇ , preferably 250, 100, 50 ⁇ , particularly preferably 25, 10, 1 ⁇ , particularly preferably having a dissociation constant (K D value) of at most 500 nM, 250, 100, 50, particularly preferably 25, 10, 1 nM, 500 pM, 100, 50, 25, 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 pM to sub-pM binds, each intermediate value can be assumed.
  • K D value dissociation constant
  • K D value dissociation constant
  • the affinity of the binding of the peptides over the dissociation constant (K D value) is defined.
  • the dissociation constant (K D value) of a peptide according to the invention is advantageously lowered in an advantageous embodiment of the invention.
  • improved properties of the peptides according to the invention such as higher affinity of the binding and higher efficiency of the degradation and / or the prevention of the formation of toxic amyloid-beta-oligomer. This particularly but not exclusively relates to a lower K D value at the high affinity site of the A beta monomer.
  • Fragments and parts advantageously show a similar or identical effect as the peptides according to the invention.
  • the peptides according to the invention of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO. 10, SEQ ID NO. 11, SEQ ID NO. 12, SEQ ID NO.
  • SEQ ID NO: 14 SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20 and / or SEQ ID NO: 21 and homologues, fragments and parts thereof substantially, preferably at least 50%, 60%, 75%, 80%, more preferably 85%, 90%, 95%, especially 96%, 97%, 98%, 99%, 100 % of D-enantiomeric amino acids.
  • a polymer according to the invention is formed from 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 or more peptides, which bind to amyloid beta monomer per se.
  • the peptides according to SEQ ID NO: 1-21 are provided in one embodiment of the invention at the free C-terminus with an acid amide group.
  • the peptides according to the invention for example the peptides according to SEQ ID NO: 1-21, are then at the positivity. on 12 at the free C-terminus amidated. Dimers of this are amidated at position 24 at the free C-terminus, and so on.
  • the peptides according to SEQ ID NO: 1-21 are covalently linked to the free N-terminus at the free C-terminus and are then cyclized accordingly. Also by the ring closure is advantageously effected that the carboxyl group is no longer present at the free C-terminus.
  • the peptide of the invention advantageously has an amino acid sequence in which the cyclization of the linear molecule z.
  • cyclization By covalent attachment of the first to the last amino acid, e.g. via a condensation reaction, has occurred.
  • z. B. by other amino acids are linked together.
  • the linkage of the second amino acid with the last amino acid may be mentioned. Equally conceivable is every possible other linkage.
  • the corresponding cyclized peptide "cD3" linked by an amide bond between the N-terminal amino group and the C-terminal carboxyl group, is indistinguishable from the cyclized peptides prtrlhthrnrr, rtrlhthrnrrp, trihthrnrpr, rlhthrnrrprt, Ihthrnrrprtr, hthrnrrprtrl, thrnrrprtrlh , hrnrrprtrlht, mrrprtrlhth, nrrprtrlhthr, or rrprtrlhthm.
  • the cD3 can also be derived.
  • the claimed according to the invention effects of higher specificity, optionally affinity and effectiveness also occur against one, preferably even each linear binding peptide from which a cyclized or otherwise modified, inventive peptide can be derived.
  • the preparation of cyclized peptides is, moreover, state of the art, and can be carried out, for example, by the process as described in DE 102005049537 A1.
  • cyclization via the first and last amino acid of the peptide causes no "open" ends of the peptide chain to exist, which are often targets for peptide-degrading activities in cells, animals or humans, for example by aminopeptidases and carboxypeptidases ,
  • inventive cyclized peptides such as. B. Mosdl according to SEQ ID NO: 1 and is additionally advantageously effected that these cyclized peptides invention, or polymers as side effect may not be easily degraded under certain circumstances, although this effect is not crucial. He is in the
  • the polymers of identical peptides such as. B. Mosdl or from a combination of 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 different, different of the abovementioned peptides according to SEQ ID NO: 1-21, as so-called combination polymers.
  • the peptides may also be partially identical.
  • the number of identical peptides in the combination polymers is arbitrary.
  • Polymers can be prepared, for example, via chemical synthesis or peptide synthesis.
  • the peptides according to the invention are covalently linked to one another. In another embodiment, the monomers are not covalently linked together.
  • a covalent linkage of the peptide units is within the meaning of the invention, if the peptides are linearly linked head to head, tail to tail or head to tail, with or without intervening linker or linker groups.
  • a non-covalent linkage in the sense of the invention is present if the peptides are linked to one another, for example via biotin and streptavidin, in particular streptavidin tetramer.
  • the peptides can be linearly linked to one another, in particular as described above.
  • the peptides are branched together to form the polymer according to the invention.
  • a branched polymer may according to the invention be a dendrimer in which the monomers are covalently or non-covalently linked to one another.
  • the peptides may also be linked to a platform molecule (such as PEG or sugar) to form a branched polymer.
  • a platform molecule such as PEG or sugar
  • peptides and polymers according to the invention are referred to below as peptides according to the invention.
  • a variant of the invention is a peptide having the amino acid sequence according to SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO. 10, SEQ ID NO. 11, SEQ ID NO. 12, SEQ ID NO. 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20 and / or SEQ ID NO: 21 as well as homologues, fragments and parts thereof having an identity of at least 50%.
  • “Homologous sequences” or “homologues” in the context of the invention means that an amino acid sequence has an identity with one of the abovementioned amino acid sequence of the monomers of at least 50, 55, 60, 65, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76 , 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100%
  • identity the terms “homologous” or “homology” are used synonymously in this specification
  • the identity between two nucleic acid sequences or polypeptide sequences is determined by comparison with the BESTFIT program based on the algorithm of Smith, TF and Waterman, MS (Adv.
  • the identity between two nucleic acids is preferred Equations or polypeptide sequences are defined by the identity of the nucleic acid sequence / polypeptide sequence over the entire sequence length, as determined by comparison with the aid of the GAP program based on the algorithm of Needleman, S.B. and wish, CD. (J. Mol. Biol. 48: 443-453) is calculated by setting the following parameters for amino acids: gap creation penalty: 8 and gap extension penalty: 2; and the following parameters for nucleic acid gap creation penalty: 50 and gap extension penalty: 3.
  • Two amino acid sequences are identical for the purposes of the present invention if they have the same amino acid sequence.
  • homologs are to be understood as meaning the corresponding retro-inverse sequences of the abovementioned monomers.
  • the peptides according to the invention bind to parts of the amyloid beta peptide.
  • the peptides according to the invention have sequences which differ from the stated sequences by up to three amino acids.
  • sequences are also used which contain the abovementioned sequences.
  • the peptides have fragments of the abovementioned sequences or have homologous sequences to the abovementioned sequences.
  • it is a peptide for use in medicine, preferably for the treatment of Alzheimer's disease.
  • the peptide consists essentially of D-amino acids.
  • the term "essentially of D-enantiomeric amino acids" means that the monomers to be used according to the invention are at least 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, preferably 75%, 80%, particularly preferably 85%, 90%, 95%, in particular 96%, 97%, 98%, 99%, 100% of D-enantiomeric amino acids are constructed.
  • the present invention also provides a process for the de-toxification of the A-beta oligomers, aggregates or fibrils formed therefrom.
  • the invention also relates in one embodiment to peptides according to the invention which are linked to another substance.
  • the linkage is a chemical bond as defined in Römpp Chemie Lexikon, 9th edition, volume 1, page 650 et seq., Georg Thieme Verlag Stuttgart, preferably by a valence bond, in particular a covalent bond.
  • the substances are drugs or active substances, defined in accordance with the Medicinal Products Act ⁇ 2 respectively. ⁇ 4 (19), as of September 2012.
  • active substances are therapeutically active substances which are used as medicinally active substances.
  • Anti-inflammatory agents are preferably used.
  • the substances in another variant are compounds that enhance the action of the peptides.
  • such compounds are aminopyrazole and / or aminopyrazole derivatives.
  • Aminopyrazole derivatives according to the invention is 3-aminopyrazole-5-carboxylic acid or 3-nitropyrazole-5-carboxylic acid and all derivatives in which the heterocyclic CH group has been replaced by -CR- or -N- or -O- or -S- , as well as all derived peptidic dimers, trimers or tetramers, preferably aminopyrazole trimer.
  • Another alternative is compounds which improve the solubility of the peptides and / or the passage of the blood-brain barrier.
  • the peptides according to the invention have any combination of at least two or more features of the variants, embodiments and / or alternatives described above.
  • amidated and / or cyclized peptides are not modified in comparison to linear, binding peptides in which the free C-terminus, ie the C-terminal carboxyl group, is unmodified and correspondingly carries a negative charge, bind to Abeta monomer with a higher affinity.
  • the K D value in the modified peptides is lower than in the case of linear peptides in which the free C-terminus, ie the C-terminal carboxyl group, is unmodified and correspondingly carries a negative charge.
  • the affinity of binding of the inventively modified peptides without negative charge at the C terminus in comparison to linear peptides with negative charge at the C terminus but otherwise the same amino acid sequence by 1%, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, in particular 10%, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96,
  • K D value as a measure of the affinity of binding of a modified, in particular cyclized, peptide to amyloid-beta monomer is, compared to a linear, binding peptide with negative charge at the free C-terminus, by 1%, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, in particular 10%, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90
  • modified peptides can therefore be used even more efficiently as probes for diagnostic purposes than linear, negative-charge-chain binding peptides at the free C-terminus, in particular also more efficiently than their linear peptide counterparts with identical amino acid sequence.
  • they can also be used more efficiently as therapeutics than linear, binding peptides with negative charge at the free C-terminus, in particular more efficiently than their linear peptide counterparts with identical amino acid sequence.
  • the peptide according to the invention cuts better in terms of affinity and effectiveness.
  • the modified peptides in comparison to peptides with negative charge at the free C-terminus, but in particular compared to their peptide counterparts with identical amino acid sequence, in addition also with a higher efficiency or efficiency, the formation particularly prevent toxic amyloid-beta oligomers or cause their destruction and / or Endtoxifizie- tion.
  • This effectiveness is in particular around 1%, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, in particular 10%, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 99.9, particularly advantageously increased by 100%.
  • a sample with the various A-beta conformers will be tested in the simplest case z. B. fractionated.
  • various conformers such as monomers, oligomers, fibrils or higher aggregates are enriched and can then be determined exactly.
  • the term "precisely determined” includes a step of calibrating fractionation by molecules of known type and behavior, and after fractionation there is only one particular type of A-beta conformer in each fraction, such as monomers, oligomers or fibrils, and so forth
  • the conformers are fractionated according to their s-value or sedimentation coefficient: molecules of different sizes can have identical hydrodynamic radius but still have different s-values and are then separated by calibration with molecules of known s - Value are obtained by density gradient centrifugation A-Beta conformers exactly to their s-value.
  • the fractions obtained are treated with and without active ingredient and z. B. determined by RP-HPLC. In this way one can determine the effectiveness of the active ingredient.
  • Another method is presented below.
  • the so-called QIAD test can be used (quantitative determination of interference with A ⁇ aggregate size distribution).
  • the method for the quantitative analysis of the influence of an active ingredient on the particle size distribution of amyloid peptides and / or proteins in a sample has the following steps. First, A-Beta is allowed to aggregate under controlled conditions to produce different A-Beta aggregates. The conditions are chosen so that particularly many, small, especially cytotoxic A-beta oligomers were formed.
  • the substance to be examined for example one of the modified peptides according to the invention, is added to the sample.
  • the active ingredient changes the particle size distribution in the sample. This change is quantified. The change is a measure of the reduction or even complete elimination of certain toxic species of a given particle size.
  • the QIAD method measures the increase or decrease in A-Beta aggregates of a given particle size. While some A-Beta aggregates of a certain size were initially present in the sample, they are reduced or even completely eliminated under the influence of the drug. Other particle sizes increase or remain constant under the influence of the active ingredient.
  • the particles formed from the A-Beta are preferably separated from one another according to their hydrodynamic radius of the particles.
  • the particles are enriched in amyloid peptides and / or proteins of a given aggregate size.
  • This separation of the particles can be carried out by means of a density gradient centrifugation.
  • the fractions are spatially separated from each other, z. B. by pipetting.
  • the denaturation of the aggregates can, for. B. complete with 30% acetonitrile and 0.1% trifluoroacetic acid at a column temperature of 80 ° C and separated on a C8 column for hydrophobicity.
  • Eluting A-beta is detected by UV absorption at 215 nm. Peak area integration can be done using Agilent Chemstation software.
  • the offsetting of resulting values with a previously performed Calibration allows the calculation of the concentration of the A-Beta present in the respective fraction. Per fraction, the average of several z. For example, six independently performed experiments can be calculated with the resulting standard deviation.
  • the advantage of the HPLC analysis is that, regardless of the state of aggregation and a solvent, it is possible to detect very sensitively (for example, about 20 nM or 1.8 ng A ⁇ 1-42) and quantify it reliably.
  • a key advantage of the method is the coupling of density gradient centrifugation and reversed-phase HPLC, which makes a reliable quantification of A-beta oligomers possible.
  • the effect of increasing the effectiveness of the elimination (or formation) of amyloid-beta species, and in particular amyloid-beta oligomers, according to the invention can be achieved by one of these methods, but not exclusively by these methods.
  • the effects of increased specificity towards A-beta monomer and associated simultaneous effectiveness of the elimination, de-toxification of A-beta oligomers (or the formation) also occur in vitro and / or in vivo.
  • the invention further relates to a composition comprising the peptide of the invention, in particular for the treatment of Alzheimer's disease.
  • the present invention furthermore relates to a composition comprising the peptide according to the invention, in particular for the reduction of existing toxic A-beta-oligomers and prevention of the formation of toxic A-beta-oligomers.
  • composition may be, for example, a vaccine, a medicament (eg in tablet form), an injection solution, a food or nutritional supplement containing the peptide of the invention in a formulation to be prepared on the basis of expert knowledge.
  • the invention further relates to a kit containing a ligand according to the invention, or peptide.
  • the peptides of the invention may be packaged in containers with / in buffers or solutions, if necessary. All components of the kit may be packaged in the same container or separately.
  • the kit may contain instructions for its use.
  • Such a kit may contain, for example, the invention in an injection bottle with stopper and / or septum. Furthermore, it may also contain, for example, a disposable syringe.
  • the peptides of the invention may serve as probes for binding to A-beta monomer.
  • Such molecular probes contain the peptide or polymer according to the invention and optionally dyes, fluorescent dyes, radioactive isotopes, (PET etc.), gadolinium (MRI), as well as alternative substances suitable for the imaging of the probes and can be used e.g. be injected intravenously. After passage across the blood-brain barrier, the probes can bind to A-beta monomer and / or plaques.
  • the thus-labeled A-beta monomers and / or plaques can be prepared by means of imaging methods such as e.g. SPECT, PET, CT, MRI, proton MR spectroscopy, etc. are visualized.
  • the invention also relates to the use of the peptide according to the invention for the prevention of amyloid-beta-oligomers and / or amyloid-beta-peptide aggregates and / or amyloid-beta-fibrils.
  • the peptide according to the invention is also used for the de-toxification of toxic amyloid-beta oligomers and / or aggregates.
  • it is used to bind to amyloid beta monomers and to form amorphous non-toxic aggregates by shifting the equilibrium.
  • aggregates can consist of bound monomers and the equilibrium is shifted, primarily away from the oligomers. Amorphous, nontoxic aggregates can be formed, resulting in a reduction of the toxic species. Other peptides stabilize the A-beta monomers by the monomer specificity in the ELISA experiment, as shown in FIG.
  • A-beta monomers as building blocks of the A-beta oligomers, constantly arise in the human body and are presumably not toxic per se. There is even the possibility that monomers have a positive function.
  • A-beta monomers may co-store randomly depending on their concentration. The concentration depends on their rate of education and degradation in the body. If an increase in the concentration of A-beta monomers in the body takes place with increasing age, spontaneous assembly of the monomers into A-beta oligomers is more likely. The resulting A-beta oligomers could multiply analogously to the prions and ultimately lead to Alzheimer's disease.
  • prevention may possibly already be achieved by preventing the formation of the first A-beta oligomers.
  • a few, few highly specific A-beta monomer ligands are sufficient, which are at the same time less affine and selective with respect to the A-beta oligomers.
  • the formation of the A-beta oligomers from many monomers is a high-order reaction, and thus highly dependent on the A-beta monomer concentration.
  • even a small reduction in the active A-beta monomer concentration leads to a prevention of the formation of the first A-beta oligomers. This mechanism is probably based on the more preventive therapy concepts and substances that have been developed so far.
  • A-beta oligomers or possibly even larger polymers or fibrils that proliferate by prion-like mechanisms.
  • this increase is a low-order reaction and is barely dependent on the A-beta monomer concentration.
  • the aim of a treatment must be to address them with substances that are particularly efficient at eliminating them and / or prevent or detoxify their formation.
  • the peptides according to the invention specifically bind the amyloid-beta-monomers with a correspondingly low dissociation constant in the sense of the therapy. Another object is thus the use of the peptides of the invention as a therapeutic agent of Alzheimer's disease.
  • the peptides according to the invention bind particularly well to A-beta to soluble A-beta monomers.
  • the peptides according to the invention very efficiently inhibit the fibril formation of A-beta peptides, in particular the peptide having SEQ ID NO: 1 - 21, in particular the peptide according to SEQ ID NO: 1 ,
  • Another object is the use of the peptides of the invention in a method for the treatment (in vitro, ex vivo) of blood, blood products and / or organs, characterized in that the blood, the blood products and / or organs are removed from the human or animal body, and A (amyloid) -beta oligomers are removed and / or detoxified.
  • the specificity of a peptide results from the percent difference in absorbance values for the target molecule or bait (eg, A-beta monomer) to the normalized absorbance values for the competitors (eg, A-beta oligomers and fibrils ) in the single-phage ELISA.
  • the absorbance values then represent the affinity of single phage phones for a particular immobilized A-beta species.
  • the specificity is not dependent on the strength of the affinity but only on the difference in affinities between the species. The greater the percentage difference between the signal strength for the target mole- C (eg A ⁇ 1-4 2-monomer) compared to the signal strength for the so-called competitors and fibrils), the more specifically does the particular phage bind to the target molecule.
  • phages that have bound to substrate A can no longer bind their preferred binding partner substrate A in the following round X + 1 because it has been replaced by substrate B, thereby leaving substrate A binding phages lost.
  • the method according to the invention is thus advantageously particularly suitable for the identification of ligands to A-beta monomer or A-beta oligomer as bait with the respective other species as competitor.
  • an (A ⁇ i_ 2) -specific antibody eg 6E10
  • the measured absorption signal can be used as a measure of the immobilization efficiency following the experiment.
  • a possible cross-reaction of the phage-specific antibody with the immobilized molecules or the surface of the reaction trough can be investigated.
  • the phage-specific antibody is normally added to the batches in which individual phages are tested in order to bind them to the particular target structure (eg surface, A ⁇ i -4 2 monomers, and fibrils).
  • the particular target structure eg surface, A ⁇ i -4 2 monomers, and fibrils.
  • a method for normalizing the values obtained should therefore be carried out.
  • the values of the phage antibody tested for cross-reaction can be subtracted as background. This happens according to the previously immobilized species.
  • the signal values of the phage antibody can be immobilized from the reaction wells with immobilized A ⁇ 1-42 oligomers to the signal values of the individual phage clones from the reaction tubs subtracted from.
  • the procedure is analogous for A ⁇ i - 2 monomers. In this way, first of all a possible background signal of the phage antibody can be calculated out of the signals of the single-phage clones.
  • the immobilization efficiency of the different A ⁇ 1-42 species used is measured and compared on the basis of control with A ⁇ ⁇ - specific 6E10 antibody.
  • it is advantageous (see also FIG. 1) for a more effective immobilization of the mixture and fibrils towards the A ⁇ -42 - Monomers causes. Therefore, in the reaction tubs in which A ⁇ i_42 oligomers and fibrils are immobilized, more potential binding partners for the single phage clones are offered and the result is distorted. Therefore, the values of the 6E10 control from the reaction tubs in which A ⁇ 1-42 oligomers and fibrils were immobilized were normalized to the A ⁇ 1 content in the reaction tubs in which A ⁇ i 1 monomers were immobilized.
  • Figure 2 single phage ELISA.
  • Figure 3 Modulation of A ⁇ i -42 aggregation by Mosd peptides - ThT experiment.
  • Figure 4 Modulation of different Aßi -4 2 species by Mosd peptides.
  • Figure 5 Modulation of different Aßi -4 2 species by Mosdl.
  • FIG. 6 Quantification of the modulation of various A ⁇ i. Species
  • Figure 7 TEM images of 10 ⁇ A ⁇ 1-42 incubated with and without 10 ⁇
  • the target molecule was immobilized on different stretpavidin-coated plastics / surfaces alternating from round to round (polystyrene). ren / polypropylene / polycarbonate).
  • the polystyrene surfaces were washed according to the manufacturer's instructions prior to immobilization of the target molecule. In addition, alternately from one round to the next, and no blocking of the surface with 150 ⁇ 1x TBS / 0.1% (v / v) Tween-20/1% (w / v) BSA before immobilization of the target molecule for one hour at room temperature. In this way, no combination of plastic surface and blocking was used more than once during the 6 rounds of panning (see Table X). This step was performed to reduce nonspecific binding to the plastics and BSA since, for example, phage bound to BSA will not find binding partners in the subsequent panning round conducted as described above and will be removed in the washing steps accordingly become.
  • D-enantiomeric, N-terminally biotinylated Aßi -4 2 monomers were diluted in 1x TBS to a concentration of 63 nM and immobilized as a target molecule on the respective surface.
  • the monomeric state of the A ⁇ 1 -4 2 molecules was guaranteed by size exclusion chromatography.
  • the used concentration of 63 nM corresponds to the occupancy of 1/3 of all streptavidin binding sites per surface used, starting from the surface with the lowest number of free streptavidin binding sites.
  • 100 ⁇ of the monomeric A ⁇ i -42 solution adjusted to 63 nM in 1 ⁇ TBS were applied to the streptavidin-coated surface and incubated for 5 minutes at room temperature. Subsequently, the surface was washed three times with 150 ⁇ 1x TBS.
  • the still bound phage were separated by a pH step.
  • 100 .mu.l of a 0.2 M glycine / HCl solution with a pH of 2.2 were added to the surface and incubated for 10 minutes at room temperature.
  • the solution, including the phages eluted, was taken off and added to neutralize 25 ⁇ L of 1M Tris / HCl pH 9.1 and mixed.
  • the amplified phages were titrated analogously to the eluted, non-amplified phages (input titration).
  • the number of plaque forming units (pfu) per milliliter was determined taking into account the dilution factor.
  • the number of phages was adjusted to 1x10 11 phages in 100 ⁇ 1x TBS for each round on the basis of this number.
  • the amplified phages of the preliminary round were used and diluted accordingly. While the concentration of the target (bait A ⁇ -42 ) was stable at 63 nM in all rounds, the competitors were added in increasing concentration from panning round to panning round.
  • Table 1 Parameters of all 6 panning rounds.
  • This step consisted of the addition of increasing concentrations of competitors, namely A ⁇ i -4 2 oliomers and fibrils.
  • competitors namely A ⁇ i -4 2 oliomers and fibrils.
  • phages which bind nonspecifically to different A ⁇ 1-42 species should be removed so that ultimately only the phages remain which are a) specific to D-enantiomeric ⁇ -1- ⁇ and not to plastic surfaces, BSA or biotin while b) are specific for monomers, D-enantiomeric A ⁇ 1-2 . Washing rigidity was increased by increasing the number of washings per round, thereby removing very weakly binding phages to the target molecule.
  • Single phage amplification The panning rounds resulted in accumulations of various, increasingly specific phage binding to the target molecule. From these pools, individual phage clones were propagated to compare with each other (DNA sequencing and single-phage ELISA). For this purpose, individual plaque-forming units were taken from the output titer plates of the preferred rounds of the mirror image phage display (panning rounds 3-6) and multiplied. The propagation was according to a protocol of the manufacturer of the recombinant phage library.
  • Single-phage ELISA The affinity of individual phage clones for the target molecule and the competitors was examined by ELISA. For this purpose, all three species were immobilized in biotinylated form on a polystyrene surface bound to stretpavidin. Since oligomers and fibrils were added as competitors at the same time during the panning rounds, these two species were also mixed immobilized in the single-phage ELISA.
  • the A ⁇ i -42 species were purified on the same principle as in the mirror image phage display and immobilized to 320 nM (at a 1: 1 mixture of both species was prepared and immobilized at a total concentration of 320 nM).
  • reaction wells (technical term, in principle also in German: "well”: 96 of them on a polysterene (or other plastic) plate) ⁇ -42 monomers, or neither of the two approaches immobilized.
  • the streptavidin-coated microtiter plates were prewashed as indicated by the manufacturer.
  • the ⁇ -42 monomers or the and fibrils were diluted to a concentration of 320 nM each in 1x TBS.
  • Antibody 6E10 was diluted 1: 10,000 in 1X TBS / 0.1% (v / v) Tween-20. 100 ⁇ of each single phage clone dilution, one sample without phage (LB medium 1: 1 with 1 ⁇ TBS / 1% (w / v) BSA) and the antibody dilution were carried out on 2 reaction wells without immobilized A ⁇ i -42 , 2 reaction wells with immobilized monomeric A ⁇ i -4 and 2 reaction wells with immobilized oligomeric / fibrillar A ⁇ -42 were added and incubated for one hour at room temperature.
  • HRP horseradish peroxidase
  • TMB substrate
  • This reaction results in a color reaction the strength of which is proportional to the binding of the antibody to its target (phage) and, in turn, to the binding of the phage to the immobilized species or surface.
  • 100 ⁇ of a 1: 1,000 in 1x were now used in all reaction wells which had previously been incubated with the dilution of the 6E10 antibody TBS / 0.1% (v / v) Tween-20 diluted second antibody which is capable of recognizing and binding mouse-derived 6E10 antibody.
  • this antibody is HRP-coupled and thus allows a quantification of the binding of the first antibody to the immobilized target molecules or the plastic surface of the reaction trough.
  • the plate (s) was washed 10 times with 150 ⁇ L 1x TBS / 0.1% (v / v) Tween-20 per reaction well.
  • the signal was detected by adding the substrate 3,3 ', 5,5'-tetramethylbenzidine (TMB).
  • TMB is implemented by HRP, causing a color change in the solution.
  • the strength of the color reaction is a measure of the binding strength of the phage or of the antibody.
  • 50 ⁇ of the TMB solution are then applied after washing per reaction trough.
  • the color development is stopped by the addition of 50 ⁇ 2 MH 2 S0 4 as soon as the solutions in the reaction tubs turn turquoise.
  • the absorbance at 450 nm is then read out automatically.
  • clone 6.84 was not chosen for further experiments, as the specificity was given to A ⁇ i -42 monomers, but the signal strength was extremely low.
  • Table 2 single phage clones according to single phage ELISA.
  • the Spiegelfelpliagendisplay invention have been determined with Mosdl to Mosd21 specific A-beta monomer-binding peptides.
  • Table 1 Selected specific binding peptide sequences which have been selected by means of the invention competitive mirror image phage display. Clone Number Name SEQ ID NO: Amino Acid Sequence
  • the number of the particular phage clone from which the sequence was isolated is indicated by the name of the corresponding amino acid sequence of the peptide, which is also shown in the one-letter code, and the corresponding SEQ ID NO :.
  • a ⁇ i -42 monomers and a mixture of ⁇ -42 oligomers and fibrils were immobilized on all the plates used (A, B, C), which results from the increased absorption values in comparison to the values of the wells in which no A ⁇ i_4 2 has been immobilized.
  • a ⁇ 1-42 oligomers and fibrils have a higher immobilization efficiency than
  • the clones were presented in the order shown in Table 1 (5.60 - 6.135), followed by other clones tested but not selected (6.262 - 6.85).
  • the values of the Y-axis indicate the normalized absorption values of the single-phage clones against monomers A ⁇ i_42 (black), oligomeric and fibrillar ⁇ - ⁇ ⁇ (dark gray) and the streptavidin-coated plastic surface (light gray striped).
  • the adsorption of the wells immobilized with A ⁇ 1-42 oligomers and fibrils onto the A ⁇ 1 was determined by the differences in the immobilization efficiency of the different A ⁇ i -42 species as shown in FIG Content of A ⁇ 42 monomer-coated wells normalized.
  • Pleated sheet structures thus directly measured by an increase in ThT fluorescence. can be.
  • the relative fluorescence of a 10 ⁇ A ⁇ i -4 2 sample (black) served as a reference.
  • the time when the logarithmic rise of the fluorescence signal changes to a stationary phase was set to 100%.
  • the use of equimolar concentrations of various peptides influenced the ThT fluorescence and thus aggregation and fibril formation of the also present in the approach ⁇ - ⁇ ⁇ at the same time.
  • the bands of denatured proteins (A ⁇ i -42 at 4.5 kDa, see marker (M)) were visualized by silver staining.
  • the method does not allow for quantitative analysis, but the strength of the signal correlates with the concentration of proteins so that a stronger signal usually indicates a higher protein concentration.
  • the influence of the peptides Mosd1-4 in a concentration of 40 ⁇ was investigated.
  • the picture shows in the uppermost section the distribution of the A ⁇ i -42 species without co-incubation with peptide.
  • a broad spectrum of different sized A ⁇ 1-42 species is in the sample.
  • the peptides Mosd1 / 2 and 3 increase the proportions of high molecular weight A ⁇ 1-42 species (fractions 10-14) and, above all, reduce the oligomeric Aßi ⁇ species (fractions 4-7), which are considered to be toxic.
  • 80 ⁇ A ⁇ -42 was incubated without addition of peptide for 4.5 hours at 600 rpm and 25 ° C to a wide range of different to obtain.
  • the gradient was then centrifuged, with the ingredients of the sample (different sized A ⁇ i ⁇ species) diffusing into the gradient according to their size and shape.
  • the gradient is fractionated after centrifugation (1-15) and the individual fractions on a Tris-Tricine SDS gel applied. The separation of the ingredients per fraction was carried out electrophoretically.
  • the bands of denatured proteins (A ⁇ 1-42 at 4.5 kDa, see marker (M)) were visualized by silver staining.
  • the method does not allow for quantitative analysis, but the strength of the signal correlates with the concentration of proteins, so that a stronger signal usually indicates a higher protein concentration.
  • the influence of different concentrations of the peptide Mosdl was investigated.
  • the picture shows in the uppermost section (A) the distribution of the Aßi -4 2 species without co-incubation with peptide.
  • the modulation of the A ⁇ 1-42 species by Mosdl is concentration-dependent (BE).
  • Low concentrations (B & C) of Mosdl change the composition of the A ⁇ i -42 species only slightly, but they reduce the proportion of toxic oligomers (fractions 4-7) compared to the untreated ⁇ ⁇ - sample and increase the proportion of high molecular weight aggregates.
  • Higher concentrations of Mosdl (D & E) reduce the concentration of small Aß 1- 2 species and toxic oligomers significantly and result in a modulation of the Aß 1-42 species to high molecular weight aggregates.
  • Mosdl is able to remove existing toxic A ⁇ oligomers from the pool of different A ⁇ species and to promote the formation of non-toxic, high molecular weight aggregates. This process is concentration dependent. Even the use of 20 ⁇ M Mosdl reduces the signal strength of the oligomer bands and enhances the signal of the A ⁇ bands in fractions 11-14 compared to untreated A ⁇ . Higher concentrations increase this effect, but also cause a decrease in signal strength in fractions 1-2, which correspond to monomeric A ⁇ .
  • the samples were denatured in a mobile phase (30% (v / v) acetonitrile, 0.1% (v / v) TFA in ddH 2 0) on a Zorbax 300SB-C8 column at elevated column temperature (80 ° C) and separated , For each fraction, samples from 3 independent experiments were averaged and the standard deviation calculated. The results correspond to the results of the gels of Figure 5 and allow the quantitative analysis of the data. Fraction 15 corresponds to the pellet after density gradient centrifugation and also contains small amounts of A ⁇ i -42 .
  • FIG. 8 The influence of A ⁇ i -42 on the viability of PC-12 cells was tested.
  • a mixture of different A ⁇ 1-42 species (see Figure 4 for preparation) was added to PC-12 cells.
  • a ⁇ 1 mixtures were co-incubated with various concentrations of Mosdl and a mixture containing only Mosdl was tested.
  • the final concentrations per well were 1 ⁇ A ⁇ i.4 2 or 1 or 0.5 ⁇ Mosdl.
  • the samples were placed in the culture medium of the cells and incubated with the cells at 37 ° C. for 24 hours. Subsequently, the viability of the cells was determined by means of an MTT experiment.
  • the cells are supplied with a metabolite which can be converted by metabolically active cells (living cells).
  • the product of this reaction are colored formazan crystals which can be dissolved.
  • the color of the medium after solubilization corresponds to the conversion rate of the starting material and thus the viability of the cells.
  • Untreated cells (medium, white checkered) served as a live control and the proportion of vital cells was defined as 100%.
  • the values of the other approaches were normalized to this value.
  • the treatment with 0.1% TritonX-100 served as a positive control for cell toxicity (light gray), the amount of viable cells was only 1.5% in this approach.
  • the mixture of different A ⁇ i -42 species also contained, as expected, toxic species such that incubation of the cells with the A ⁇ 1-42 mixture reduced the number of viable cells to 45% (black). Mosdl does not affect the viability of PC-12 cells. Co-incubation of A ⁇ 1-42 and Mosdl, however, reduces the toxicity of A ⁇ i -42 as a function of concentration (gray (1 ⁇ Mosdl) and dark gray (0.5 ⁇ Mosdl)). 86% and 66% of the cells, respectively, survive when the A ⁇ i.4 2 mixture is co-incubated with Mosdl prior to addition to the cells.
  • the murine neuroblastoma cell line Neuro-2a serves as a model for neuronal cells and is thus suitable to analyze the symptoms of AD.
  • the stable transfection of Neuro-2a cells with human APP695 also allows a model that produces human amyloid precursor protein (APP) and all of its processing products, including the toxic A ⁇ i-4 2 , in the cell itself. In this way, the influence of naturally occurring Aßi ⁇ species can be studied directly in neuronal cells.
  • neuro-2a cells without APP were cultured in parallel to those with APP transfection.
  • results shown for Mosdl are also expected for the peptides and polymers of SEQ ID NO: 2-21.
  • the results shown in the exemplary embodiments are therefore analogous also to the peptides according to all SEQ ID NO: 1-21 as well as generally to peptides which are obtained by the method according to the invention, that is to say the modified mirror image phage display.
  • the mirror image phage display used can also be performed in the other direction, that is, to identify ligands on A-beta oligomers by using A-beta oligomers as baits and A-beta monomers as competitors and / or A-beta fibrils.
  • the mirror image phage display according to the invention is of course applicable to other bait-competitor pairs.

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Abstract

Die Erfindung betrifft spezifisch Amyloid-Beta bindende Peptide und deren Verwendung für die Therapie und Diagnose der Alzheimerschen Demenz.

Description

B e s c h r e i b u n g
Spezifisch Amyloid-Beta bindende Peptide und deren Verwendung für die Therapie und Diagnose der Alzheimerschen Demenz
Die Erfindung bezieht sich auf spezifisch Amyloid-Beta bindende Peptide und deren Verwendung für die Therapie und Diagnose der Alzheimerschen Demenz.
Stand der Technik
Aus WO 02/081505 A2 ist das D-enantiomere Peptid mit dem Namen "D3" bekannt. Es wurde durch eine Spiegelbild-Phagendisplay-Selektion gegen überwiegend monomeres Aß(1-42) identifiziert mit dem Plan, dieses durch die Bindung zu stabilisieren und seine Umwandlung in toxische Aß-Aggregate zu verhindern. Nach derzeitigem Kenntnisstand wandelt D3 bevorzugt die besonders toxischen Aß- Oligomere in nicht-toxische, nicht-amyloidogene und ThT-negative, amorphe
Aggregate um. Im Tiermodell wird selbst durch eine orale Verabreichung von D3 mit dem Trinkwasser erreicht, dass behandelte transgene AD-Mäuse deutlich weniger Plaques enthalten und signifikant verbesserte kognitive Fähigkeiten besitzen.
Noch immer existiert aber kein zugelassenes Medikament für eine ursächliche Behandlung der Alzheimerschen Demenz (AD). Typischerweise findet man in den Gehirnen von AD-Patienten post-mortem Ablagerungen des sogenannten beta- Amyloid-Peptides (Aß) in Plaques. Deshalb werden schon lange verschiedene Formen des Aß, z.B. Fibrillen, für die Entstehung und das Fortschreiten von AD verantwortlich gemacht.
Seit wenigen Jahren werden besonders die kleinen, frei diffundierbaren Aß- Oligomere als hauptsächliche Verursacher für die Entstehung und den Fortschritt der AD verantwortlich gemacht. Monomeres Aß entsteht während unseres ganzen Lebens ständig in unserem Körper durch sequentielle Proteolyse des Vorläuferproteins APP (Amyloid Precursor Protein) durch ß- und γ-Sekretasen (Haass and Selkoe 1993) und ist per se nicht toxisch. Es gibt sogar immer mehr Hinweise, dass monomeres Aß eine physiologische, vielleicht sogar neuroprotektive Funktion im Gehirn besitzt (Puzzo and Arancio 2013).
Es wird spekuliert, ob sich Aß-Monomere abhängig von ihrer Konzentration (die sich letztlich durch Bildungs- und Abbau-Raten im Körper ergibt) zufällig und damit mit zunehmendem Alter immer wahrscheinlicher spontan zu Aß-Oligomeren zusammen lagern. Einmal entstandene Aß-Oligomere könnten sich dann durch einen Phon- ähnlichen Mechanismus vermehren und letztlich zur Krankheit führen.
Aufgrund dieser Überlegungen sollte es das Ziel einer ursächlichen Behandlung sein, die Bildung toxischer Aß-Oligomere zu verhindern, bzw. bereits vorhandene
Oligomere vollständig zu eliminieren und/oder deren Prion-ähnliche Vermehrung zu verhindern und ohne dabei die Aß-Monomerkonzentration zu reduzieren.
Somit existiert kein ursächlich wirkendes Medikament für die Behandlung der
Alzheimersche Demenz. Eingesetzte Medikamente sind bestenfalls in der Lage, einige Symptome zu mildern, können aber den Krankheitsfortschritt nicht
verlangsamen, geschweige denn aufhalten.
Es existieren zwar einige Substanzen, die auf verschiedenste Art und Weise die Konzentration von Aß-Monomeren verringern, z. B. durch gamma-Sekretase- Modulatoren, Aß-bindende Liganden und so weiter. Da jedoch für monomeres Aß eine physiologische, vielleicht sogar neuroprotektive Funktion im Gehirn postuliert wird, ist es aufgrund der neuesten Erkenntnisse zum Wirkmechanismus der
Alzheimerschen Demenz erfolgsversprechender nicht die Aß-Konzentration der Monomere zu verringern, sondern die der Aß-Oligomere.
Diese Hypothese wird auch durch die bisheringen negativen Ergebnisse klinischer Studien (Phasen II und III) am Menschen mit Wirkstoffen, die die Monomer
Konzentration verringern, bestätigt.
Aufgabe der Erfindung
Aufgabe der Erfindung ist es daher A) Peptide für die ursächliche Therapie von Morbus Alzheimer durch das Verhindern der Bildung von toxischen Amyloid-ß (Aß)-Oligomeren oder Aggregaten oder deren Enttoxifizierung bereit zu stellen. Ferner sollte
B) Das aus dem Stand der Technik bekannte Spiegelbildphagendisplay-Verfahren hierzu modifiziert werden, und es sollten
C) Verwendungsmöglichkeiten der erfindungsgemäßen Peptide aufgezeigt werden. Lösung der Aufgabe
Die Aufgabe wird gelöst mit dem Peptid, dem Kit und der Zusammensetzung gemäß der Hauptansprüche sowie den Verfahren und Verwendungen gemäß den Nebenan- Sprüchen. Vorteilhafte Ausgestaltungen hierzu ergeben sich jeweils aus den hierauf rückbezogenen Patentansprüchen.
Beschreibung der Erfindung
Die Aufgabe der Erfindung wird gelöst mit Liganden bzw. Peptiden, welche spezifisch an bestimmte A-Beta-Spezies binden. Es werden insbesondere Peptide bereit gestellt, die spezifischer an
Figure imgf000004_0001
als an oligomeres und/oder fibrilläres Aßi-42 binden.
Im Weiteren werden die Begriffe Zielmolekül und Köder synonym verwendet.
Die Spezifität, oft auch Selektivität genannt, bedeutet dabei Folgendes. Bindet der zu betrachtende erfindungsgemäße Ligand bzw. das erfindungsgemäß Peptid zwei verschiedene Moleküle, die z. B. als„Köder" und„Kompetitor" bezeichnet werden, dann kann jedem Bindungspaar, das heißt Ligand-Köder und Ligand-Kompetitor, unter der Annahme eines 1 :1 -Bindemodells jeweils eine Dissoziationskonstante (KD) oder eine Assoziationskonstane (KA = 1/KD) zugeordnet werden. Je höher der KA- Wert ist, desto affiner ist die jeweilige Bindung. Die Spezifität des Liganden für den Köder gegenüber dem Kompetitor drückt sich durch einen möglichst großen Quotienten der Affinitäten zum Köder und zum Kompetitor aus. Erfindungsgemäße Liganden weisen einen Quotienten der KA-Werte des Liganden zum Köder und zum Kompetitor auf der umso größer ist, je größer die Spezifität ist.
In diesem Sinn ist von relativer Spezifität die Rede, wenn der Quotient der KA-Werte des Liganden, bzw. Peptids zur Spezies A (Köder) und des Liganden zur Spezies B (Kompetitor) mindestens größer als 1 ist, bevorzugt größer als 1 ,2, oder 1 ,5, bevorzugt größer als 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, insbesondere 10, 11 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 , 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41 , 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51 , 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61 , 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71 , 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81 , 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91 , 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, insbesondere 100, wobei als Spezies A und Spezies B die verschiedenen A-Beta-Spezies wie z. B. Monomere, Oligomere und Fibrillen angenommen werden können.
Dabei kann jeder Zwischenwert angenommen werden. Rundungen der Zahlenwerte führen zu den oben genannten Zahlenwerten. Das Modell lässt sich prinzipiell erweitern auf mehrere Kompetitoren, die sich jeweils einzeln oder im Gemisch betrachten lassen, auch wenn letzteres nicht besonders elegant ist.
Gelöst wird diese Aufgabe insbesondere durch spezifisch Amyloid-Beta-Spezies bindende Peptide für die Therapie der Alzheimerschen Demenz. Die Spezifität, oft auch Selektivität genannt, bedeutet dabei, dass der erfindungsgemäße Ligand bzw. ein erfindungsgemäßes Peptid grundsätzlich verschiedene A-Beta-Spezies, z.B. A- Beta-Monomer oder A-Beta-Oligomer oder A-Beta-Fibrillen binden kann. Jedem Bindungspaar (z. B. Ligand zu A-Beta-Monomer und Ligand zu A-Beta-Oligomer und Ligand zu A-Beta-Fibrillen) wird unter der Annahme eines 1 :1-Bindemodells jeweils eine Dissoziationskonstante (KD) oder eine Assoziationskonstane (KA= 1/KD) zugeordnet. Je höher der KA-Wert ist, desto affiner ist die jeweilige Bindung.
Die Spezifität des Liganden für den Köder gegenüber dem Kompetitor drückt sich durch einen möglichst großen Quotienten der Affinitäten zum A-Beta-Monomer und zum A-Beta-Oligomer bzw. A-Beta-Fibrillen aus. Erfindungsgemäß werden zur Ermittlung der Spezifität also Quotienten der KA-Werte des Liganden zum A-Beta-Monomer und zum A-Beta-Oligomer (bzw. A-Beta- Fibrillen) gebildet. Je größer der Quotient ist, umso größer ist die Spezifität.
Die Spezifität oder Selektivität ist dabei nicht mit der Affinität zu verwechseln, die sich aus der Bindungsstärke von Liganden an eine der Spezies ergibt. Konkurrieren verschiedene Liganden um das gleiche Zielmolekül, so kann der weniger spezifische oder selektive die größere Bindungsaffinität besitzen. Erfindungsgemäß soll derjenige Ligand ermittelt werden, welcher besonders spezifisch an eine Spezies wie Monomer oder Oligomer oder Fibrillen bindet. Die Biomoleküle sollen als therapeutische Mittel und Heilmittel geeignet sein. Die auf diese Weise erhaltenen Liganden bzw.
Peptide haben die gewünschten Eigenschaften und lösen die Aufgabe der Erfindung.
Mit Hilfe einer optimierten Spiegelbild-Phagendisplay-Selektion wurden Peptide selektiert, die z. B. spezifischer an monomeres Aß(1-42) als an oligomeres oder fibrilläres Aß(1-42) binden. Um Peptide als Liganden zu identifizieren, die möglichst spezifisch an monomeres Abeta binden, aber gleichzeitig möglichst unspezifischer für Abeta-Oligomere und/oder Fibrillen sind, wurde ein Spiegelbildphagendisplay entwickelt und
angewandt, in dem ein positiver Selektionsdruck für die Monomer-Bindung und ein negativer Selektionsdruck für die Bindung an Oligomere und Fibrillen besteht. Außerdem wurde durch abwechselnde Verwendung verschiedener
Oberflächenmaterialien und/oder durch die abwechselnde Verwendung und
NichtVerwendung von Blocking-Reagenzien dafür gesorgt, dass keine
Oberflächenkombination zweimal verwendet wurde, um das Anreichern von
Liganden zu vermeiden, die eine hohe Affinität für das Oberflächenmaterial zeigen. Im Rahmen der Erfindung wurde erkannt, dass das Spiegelbild-Phagendisplay nach dem Stand der Technik nachteilig auch zu Oberflächen- oder Blocking-Reagenz- bindenden Liganden führt oder aber zumindest zu Liganden, die sowohl als auch an die Oberfläche als auch an den Köder gebunden haben. Es sei angemerkt, dass das Verfahren zum Spiegelbildphagendisplay neben der hier angegebenen Selektion von spezifisch Monomerbindern selbstverständlich auch zum Auffinden von spezifisch Oligomerbindern oder sogar zum Auffinden von Liganden gegenüber anderen bei Proteinfehlfaltungserkrankung auftretenden Spezies genutzt werden kann.
Durch das erfindungsgemäße Selektionsverfahren werden insbesondere D-Peptide identifiziert, die eine oder mehrere der gewünschten Eigenschaften besitzen.
Die Eigenschaften sind unter anderem die Bindungsspezifität für Abeta Monomere, die Inhibition der Abeta-Fibrillenbildung, die Inhibierung der Abeta-Zytotoxizität, die Eliminierung von Abeta-Oligomeren, die Umwandlung von Abeta-Oligomeren in nicht-toxische, nicht-amyloide Spezies.
Durch die Optimierung des Spiegelbildphagendisplay mit Kompetition gegen die aggregierten Aß1-42-Spezies (Aß1-42 Oligomere, Fibrillen und hochmolekulare Aggregate) werden z. B. spezifisch A-Beta-Monomer bindende Liganden bzw.
Peptide ermittelt. Werden A-Beta-Oligomere als Köder verwendet, so kann mit einer Kompetition mit A-Beta-Monomeren spezifische Liganden für A-Beta-Oligomere ermittelt werden.
Im Spiegelbild-Phagendisplay wird z. B. eine rekombinante Bibliothek von
randomisierten Peptidsequenzen, präsentiert am gp3 Protein des M13-Phagen und codiert in dessen Genom, gegen das genaue Spiegelbild (D-enantiomer) eines natürlich vorkommenden L-enantiomeren Zielmoleküls (z. B. Aß1-42) selektiert.
Die Peptidsequenz wird vorteilhaft am N-Terminus des gp3-Proteins des M13- Phagen präsentiert und liegt codiert in dessen Genom vor.
Das gp3-Molekül auch gene product 3 genannt, ist ein Protein, welches in der Hülle des Phagen sitzt und für den Kontakt mit der Wirtszelle benötigt wird.
Die DNA-Sequenz des p3-Gens eines selektierten Phagen enthält die genetische Information über die korrespondierende Peptidsequenz am gp3-Molekül und kann sequenziert werden. Nach der Sequenzierung kann die genomische Sequenz in eine Aminosäuresequenz umgeschrieben werden und als D-enantiomeres Peptid, welches an die physiologische L-enantiomere Form des Zielmoleküls (z. B. Aß1-42) bindet, synthetisiert werden.
Es können sogenannte panning-Runden durchgeführt werden, z. B. sechs Runden. Dabei wird die Phagenbibliothek mit einem fixierten Zielmolekül, auch Köder genannt, in Kontakt gebracht und bindende Phagen aus dem milliardenfachen Hintergrund anderer, nicht-bindender Phagen isoliert.
Beispielhaft wird die Menge an Phagen reduziert, die bevorzugt an oligomere oder fibrilläre Spezies von Aß1-42 binden, indem eben diese Spezies z. B. ab der zweiten panning-Runde als Gegenselektanten bzw. Kompetitoren zugegeben werden.
Phagen, die eine erhöhte Affinität zu Aß1-42-Oligomeren und -Fibrillen zeigen, können auf diese Weise aus dem Phagenpool entfernt werden, so dass sich z. B. Aß1-42 Monomer spezifische Phagen anreichern. Das Verfahren kann
selbstverständlich in analoger Weise angepasst werden, um spezifisch A-Beta- Oligomer bindende Liganden und Peptide zu ermitteln.
Um eine Anreicherung von Plastik-, BSA- oder Streptavidin-affinen Phagen zu verringern, werden erfindungsgemäß zudem in vorzugsweise allen panning-Runden verschieden behandelte Oberflächen verwendet und ein weiterer kompetitiver Schritt mit z. B. Biotin, einem hochaffinen Stretpavidinbinder, eingesetzt. In den
aufeinanderfolgenden Selektionsrunden wurde sukzessive der Selektionsdruck erhöht. Dazu wurden, während die Konzentration eines biotinylierten Zielmoleküls (z. B. monomeres D-enantiomeres Aß1-42) stabil blieb, ab der 2. Selektionsrunde kontinuierlich höhere Konzentrationen der als Gegenselektanten fungierenden und nicht biotinylierten Kompetitoren, z. B. D-enantiomeren Aß1-42-Oligomere und Aß1- 42-Fibrillen) gegeben.
Des Weiteren wird in jeder Runde des Spiegelbildphagendisplay eine andere
Substratoberfläche angeboten. Dies kann z. B. durch verschiedene Plastik-Spezies, wie z. B. Polystyren, Polypropylen und Polycarbonat erfolgen. Beispielhaft kann zwischen einer BSA-blockierten Polystyrenoberfläche in Runde 1 , einer Polypropylen-Oberfläche in Runde 2, einer BSA-blockierten Polycarbonat- Oberfläche in Runde 3, einer Polystyren-Oberfläche in Runde, einer BSA-blockierten Polypropylen-Oberfläche in Runde 5 sowie einer Polycarbonat-Oberfläche in der Runde R6 gewechselt werden.
Es können Blockierschritte mit z. B. 1 % BSA in TBST für eine Stunde bei
Raumtemperatur vor der Immobilisierung des Zielpeptids und beispielsweise nur in Runden 1 , 3 und 5, gegebenenfalls weiteren Runden durchgeführt werden.
Der Wechsel zwischen verschiedenen Substraten und abwechselndem Blockieren und Nicht-Blockieren der Oberfläche steigert die Spezifität für das Zielmolekül bzw. den Köder, gegenüber der Oberfläche. Außerdem erfolgt neben der Kompetition mit nahe verwandten Kompetitoren auch eine Verringerung der Liganden, die unspezifisch an Plastikoberflächen oder BSA (Blockierschritt) binden.
Die Kompetitoren und Zielmoleküle bzw. Köder werden gleichzeitig mit der Bibliothek in Kontakt gebracht. Das Verfahren ist somit gekennzeichnet durch folgende Schritte: a) Bereitstellen eines immobilisierten Köders auf einem Substrat. b) In Kontakt bringen des als Köder fungierenden immobilisierten Moleküls mit einer Lösung, die eine Bibliothek von Molekülen enthält. c) In Kontakt bringen der mit den Molekülen besetzten immobilisierten Köder mit mindestens einem Kompetitor als Spezifitätswaschschritt. d) Trennung und Vermehrung der nach dem in Kontakt bringen der mit den
Molekülen besetzten immobilisierten Köder mit Kompetitoren weiterhin an den Köder gebundenen Moleküle. e) Wiederholung der genannten Schritte, wobei bei jeder Wiederholung ein unterschiedliches Substrat verwendet wird, f) Identifizierung der Struktur der nach der Wiederholung auf den Köder verbleibenden Moleküle.
Ein unterschiedliches Substrat wird z. B. durch den Wechsel der Substratart und/oder dessen Blockierung oder Nichtblockierung mittels Reagenzien genutzt. Als Köder wird ein Molekül aus der Gruppe bestehend aus Proteinen, Peptiden, RNA, DNA, m-RNA und chemischen Verbindungen eingesetzt. Als Köder werden insbesondere verschiedene A-Beta-Spezies verwendet.
Als Oberfläche, an die der Köder immobilisiert wird, wird z. B. eine Komponente aus der Gruppe bestehend aus Mikrotitterplatten, Magnetpartikel, Agarose- oder Sepha- rosekügelchen eingesetzt.
Als Kompetitoren werden vorzugsweise ein Gemisch mit mindestens einer Komponente aus der Gruppe bestehend aus Peptiden, Proteinen, RNA, DNA und m-RNA eingesetzt. Kompetitoren sind dabei köderähnliche Moleküle, deren Bindestellen Ähnlichkeiten mit denen des immobilisierten Köders aufweisen. Als Kompetitoren werden insbesondere die A-Beta-Spezies verwendet die nicht als Köder verwendet werden.
Bibliothek und Kompetitoren werden vorzugsweise gleichzeitig zum immobilisierten Köder in Kontakt gebracht.
Das Verfahren kann dadurch gekennzeichnet sein, dass die immobile Phase beim Spezifitätswaschschritt mit einer Lösung, die Kompetitoren enthält, gespült wird.
Das Verfahren kann dadurch gekennzeichnet sein, dass beim Spezifitätswaschschritt die Lösung mit der Bibliothek von Molekülen durch eine Lösung ausgetauscht wird, die Kompetitoren enthält.
Das Verfahren kann dadurch gekennzeichnet sein, dass der immobilen Phase beim Spezifitätswaschschritt eine Lösung mit Kompetitoren zugefügt wird. Der Spezifitätswaschschritt und die Zugabe der Bibliothek von Molekülen erfolgt quasi gleichzeitig. Sollten Phagen prinzipiell eine Affinität zu A-Beta-Monomeren und -Oligomeren als Köder und Kompetitoren haben, gibt es gleichzeitig und nicht erst hintereinander die Möglichkeit an beide Ziele zu binden. Dadurch wird vorteilhaft bewirkt, dass nur die Liganden angereichert, die auch bei gleichzeitiger Exposition von Köder und Kompetitor bevorzugt an den Köder binden.
Die Konzentration an Kompetitoren wird je Selektionsrunde vorzugsweise erhöht.
Bei dem Köder nach Punkt a) handelt es sich also um eine Verbindung, an die das zu selektierende Biomolekül gebunden werden soll. Er wird nach dem Stand der Technik bekannten Methoden an eine erste Oberfläche fixiert. Beispielhaft aber nicht beschränkend können als Köder Proteine, Peptide, RNA oder DNA-Moleküle genannt werden, insbesondere A-Beta-Monomer. Als mögliche Oberflächen können beispielhaft Mikrotiterplatten, Magnetpartikel, Agarose- oder Sepharosekügelchen verwendet werden. Im zweiten Schritt b) wird der immobilisierte Köder mit einer randomisierten Bibliothek von Molekülen - speziell Biomolekülen - in Kontakt gebracht. Diese Biomoleküle konkurrieren um die Bindung an den Köder. Bei der randomisierten Bibliothek handelt es sich um eine Mischung von sehr vielen, beispielsweise 1012, aber auch 104 oder nur 100 verschiedenen Molekülen in einer Mischung. Eine solche Bibliothek kann beispielsweise jeweils aus Peptiden, Proteinen, DNA, RNA oder m-RNA bestehen, welche an bestimmten Vehikeln gebunden vorliegen, und die an Köder anbinden können. Als Vehikel kommen beispielsweise Phagen, Polysomen oder Bakterienoberflächen in Betracht. Die Bibliothek kann aus artifiziellen oder aus der Natur isolierten Bestandteilen oder aus einer Mischung von beidem bestehen. Unter artifi- ziell im Sinne der Erfindung sind beispielsweise aus der Oligonukleotidsynthese hergestellte Verbindungen zu verstehen.
Erfindungsgemäß wird der mit Biomolekülen besetzte immobilisierte Köder in Schritt c) mit Kompetitoren in Kontakt gebracht. Hierzu wird in Schritt c) ein Spezifitätswaschschritt durchgeführt, bei dem der Lösung Kompetitoren zugefügt werden, bzw. die immobile Phase mit einer Lösung, die Kompetitoren enthält, gespült wird oder die Lösung mit der Bibliothek von Biomolekülen vorzugsweise wiederholt durch eine Lösung ausgetauscht wird, die Kompetitoren enthält. Bei den Kompetitoren handelt es sich um köderähnliche Moleküle, deren Bindestellen Ähnlichkeiten mit denen des immobilisierten Köders aufweisen. Die in Lösung vorliegenden Kompetitoren konkur- rieren im Waschschritt um die schon an den immobilisierten Köder gebundenen Bibliotheksmoleküle. Somit werden diejenigen Bibliotheksmoleküle, welche dem eigentlich„besten" Bibliotheksmitglied für den immobilisierten Köder ähnlich sind, jedoch besser an einen der freien Kompetitoren binden, dem immobilisierten Köder wieder entzogen. Die Schnelligkeit der Ablösungsreaktion der bindenden Biblio- theksmoleküle wird dabei hauptsächlich durch die unterschiedlichen Dissoziationskonstanten (koff-Werte) der einzelnen Moleküle bestimmt. Solche mit einem kleinen koff-Wert bleiben statistisch gesehen am längsten am immobilisierten Köder gebunden und haben damit eine geringere statistische Wahrscheinlichkeit, eine Bindung mit den angebotenen Kompetitormolekülen eingehen zu können. Solche Biblio- theksmoleküle zeigen letztendlich eine spezifische bzw. selektive Bindung an den Köder. Beispielhaft aber nicht beschränkend können Proteine, Peptide, DNA oder RNA als Kompetitoren genannt werden. Die die Kompetitoren enthaltende Flüssigkeit ist vorzugsweise wässrig und kann einen pH-Puffer enthalten.
Weitere fakultative Komponenten der Lösung für den Spezifitätswaschschritt sind Salze, Detergentien oder Reduktionsmittel.
Die Trennung in Schritt d) erfolgt z. B. durch Elution von Phagen vom Köder, um sie vermehren zu können. Die Phagen enthalten die Peptide.
Bei der nachfolgenden Vermehrung der noch am Köder verbliebenen Bibliotheksmoleküle nach dem Spezifitätswaschschritt nach Schritt d) werden die gebundenen Biomoleküle vom Köder getrennt und nach bekannten Methoden vermehrt. Hierzu können beispielsweise nach den Schritten a) bis c) gewonnene Phagenpartikel in Zellen eingebracht und vermehrt werden. Die Trennung kann beispielsweise durch Änderung des pH-Wertes, Erhitzen oder Änderung, insbesondere Erhöhung der Salzkonzentration erfolgen. Bei Schritt e) ist die Konzentration der selektierten Biomoleküle in der Lösung, die dem Köder nach Schritt a) zugeführt wird, erhöht.
Vorzugsweise werden 3 bis 6 Selektionsrunden, die die Schritte a) bis e) enthalten, durchgeführt. Es können aber auch 1- >10 oder 1- >20 Wiederholungen durchgeführt werden. Auch die dabei vorzugsweise vorgenommene Erhöhung der Kompetitoren- konzentration in Schritt c) bei zunehmender Zyklenzahl führt zu einer verbesserten Selektion. Die Konzentration der Kompetitoren kann anfangs beispielsweise bei 1 nmol/l liegen. Die Konzentrationsänderung der Kompetitoren kann in Schritten von Verdopplung bis Verzehnfachung oder mehr erfolgen. Typische Endkonzentrationen liegen bei 1 pmol/l.
Im Sinne der Erfindung sind diese spezifisch an einen Köder bindenden Liganden Moleküle, die gegenüber einem bestimmten Köder eine erhöhte Selektivität aufweisen, das heißt, an einen bestimmten Köder spezifischer jedoch nicht unbedingt stärker binden als zum Köder ähnliche Ködermoleküle. Bevorzugt binden die Liganden ausschließlich an einen bestimmten Köder. Bei Anwesenheit konkurrierender oder kompetitierender Moleküle soll der durch das Verfahren selektierte Ligand bzw. das Peptid bevorzugt an das Zielmolekül binden.
Ein besonders relevantes Spiegelblldphagendisplay sieht N-terminal biotinyliertes D- enantiomeres A-Betai-42 -Monomer in Schritt a) vor, eine rekombinante Phagenbibli- othek in Schritt b) sowie D-enantiomere A-Beta-i-42 -Oligomeren und/oder D- enantiomeren A-Beta^ -Fibrillen in Schritt c) als Kompetitor, neben A-Beta^- Monomer als Köder. Eine Eluierung als Trennschritt erfolgt z. B. über pH-Wert- Erniedrigung als Trennschritt und Phagen-Amplifikation als Vermehrung.
Auf diese Weise wurden 21 Peptide die spezifisch gegen A-Beta-Monomer binden (Mosd 1-21) entwickelt. a) "Mosdl "(freier N-terminus, amidierter C-terminus): YS YLTS YH MVWR b) "Mosd2" (freier N-terminus, amidierter C-terminus): HTWTTYDYVWRL c) "Mosd3" (freier N-terminus, amidierter C-terminus): GTMLKFSGMNLT d) "Mosd4" (freier N-terminus, amidierter C-terminus): HNWFYWTTEPYD e) "Mosd5" (freier N-terminus, amidierter C-terminus): HNWSWEWWYNPN f) "Mosd6" (freier N-terminus, amidierter C-terminus): STLHFYTAFLNK g) "Mosd7" (freier N-terminus, amidierter C-terminus): FSHSHHTWFTWN h) "Mosd8" (freier N-terminus, amidierter C-terminus): HFWSWTSLSMTR i) "Mosd9" (freier N-terminus, amidierter C-terminus): H LSWYWE KYLTS j) "MosdIO" (freier N-terminus, amidierter C-terminus): HTWTHWFSWNVP k) "Mosd11" (freier N-terminus, amidierter C-terminus): LSMNITTVHRWH I) "Mosd12" (freier N-terminus, amidierter C-terminus): VHWDFRQWWQQS m) "Mosd13" (freier N-terminus, amidierter C-terminus): YSFHFEMNMGNY n) "Mosd14" (freier N-terminus, amidierter C-terminus): EHWDFGQWWQQS o) "Mosd15" (freier N-terminus, amidierter C-terminus): GQWDFRQWWQPC p) "Mosd16" (freier N-terminus, amidierter C-terminus): DWSSRVYRDPQT q) "Mosd17" (freier N-terminus, amidierter C-terminus): ERSQWGHRDPQS r) "Mosd18" (freier N-terminus, amidierter C-terminus): DRSKGDHRITQM s) "Mosd19" (freier N-terminus, amidierter C-terminus): DLRFSSLWKLSH t) "Mosd20" (freier N-terminus, amidierter C-terminus): VHWDFRQWWQPS u) "Mosd21" (freier N-terminus, amidierter C-terminus): FSWSMVMPWPTA Diese erfindungsgemäßen Peptide werden als SEQ ID NO: 1 bis SEQ ID NO: 21 beansprucht und können auch als Doppelpeptide oder aber zyklisiert genutzt werden.
Die Peptide gemäß der SEQ ID NO: 1-21 können durch die spezifische Bindung an A-Beta-Monomere, als mögliches Medikament gegen die Alzheimersche Demenz genutzt werden.
A-Beta-Monomere werden hochspezifisch von erfindungsgemäßen Peptiden insbesondere dem Peptid der SEQ ID NO: 1 gebunden, wodurch sich Oligomere auflösen.
Im Rahmen der Erfindung wurde erkannt, dass die existierenden Aß-Monomer- bindenden Substanzen nachteilig auf die Reduktion der Aß-Monomere abzielen. Es wurde erkannt, dass es ein Ziel sein muss, spezifische Binder des Amyloid-Beta- Monomers zu entwickeln, die nicht die Konzentration des Monomers verringern, sondern eine Stabilisierung der Monomere bewirken, um deren protektive
Eigenschaften zu erhalten. Die erfindungsgemäßen Peptide erfüllen die Aufgabe, indem sie die Amyloid-Beta- Oligomer Konzentration verringern und gleichzeitig die Amyloid-Beta-Monomere stabilisieren. Die Spezifität für A-Beta-Monomere kann im ELISA gezeigt werden.
Zum einen verhindern die genannten erfindungsgemäßen Liganden (bzw. Peptide), die spezifisch an A-Beta-Monomere binden, die Bildung von A-Beta-Oligomeren, ohne dabei zu einer Reduktion der Monomerkonzentration zu führen. Zum anderen werden bereits entstandene A-Beta-Oligomere durch eine Behandlung mit einem erfindungsgemäßen Monomer stabilisierenden Wirkstoff bzw. Peptid aus dem dynamischen Gleichgewicht der verschiedenen Aggregatspezies entfernt. Dadurch wird vorteilhaft bewirkt, dass die Oligomere zu Monomeren abgebaut werden. Insbesondere wird die Bildung von Oligomeren de novo verhindert als auch schon entstandene Oligomere entfernt und zwar in erster Linie zu Monomeren als auch zu großen, nicht-fibrillären und nicht-toxischen Aggregaten. Gelöst wird die Aufgabe auch durch ein Peptid enthaltend die Aminosäuresequenz gemäß der SEQ ID NO: 1-21 und/oder Homologe, Fragmente und Teile davon. Dieses Peptid bindet vorteilhaft an ebenfalls Amyloid-Beta-Monomer.
In einer Variante der Erfindung werden solche Peptide eingesetzt, die an ein A-Beta- Monomer von höchstens 500 μΜ, bevorzugt 250, 100, 50 μΜ, besonders bevorzugt 25, 10, 6 μΜ, insbesondere 4, 2, 1 μΜ oder sub-μΜ bindet.
Gelöst wird die Aufgabe insbesondere auch durch Polymere, die aus zwei oder mehreren der oben genannten erfindungsgemäßen Peptide bestehen und/oder deren Homologe oder Fragmente und Teile davon. Dimere sind aus zwei der erfindungs- gemäßen Peptide aufgebaut, die jeweils an Amyloid-Beta-Spezies binden. Dabei können gleichartige (z. B. zwei Peptide der SEQ ID NO: 1 ) oder zwei unterschiedlich erfindungsgemäße Peptide herangezogen werden (z. B. ein Dimer aus den Peptiden gemäß SEQ ID NO: 1 und SEQ ID NO: 2). Polymere weisen noch mehr erfindungsgemäße Peptide auf. Die erfindungsgemäß aufgebauten Polymere aus erfindungsgemäßen Peptiden, die ihrerseits an A-Beta-Monomere binden, zeigen vorteilhaft synergetische Effekte in Bezug auf ihre Spezifität zu dem A-Beta-Monomer. Mit anderen Worten: Die erfindungsgemäßen Polymere sind den Einzelpeptiden, aus denen sie aufgebaut sind, überlegen. Synergetische Effekte im Sinne der vorliegenden Erfindung sind Effekte, die eine höhere Spezifität bezüglich des A-Beta-Monomer zeigen.
In einer weiteren besonders vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung wirken die Polymere und insbesondere Dimere im Tiermodellversüch (in vitro bzw. in vivo) vorteilhaft effizienter als die einzelnen Peptid-Einheiten.
In einer Variante der Erfindung werden solche Peptide oder Polymere eingesetzt, die an ein A-Beta-Monomer mit einer Dissoziationskonstante (KD-Wert) von höchstens 500 μΜ, bevorzugt 250, 100, 50 μΜ, besonders bevorzugt 25, 10, 1 μΜ, besonders bevorzugt mit einer Dissoziationskonstante (KD-Wert) von höchstens 500 nM, 250, 100, 50, besonders bevorzugt 25, 10, 1 nM, 500pM, 100, 50, 25, 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 pM bis sub-pM bindet, wobei jeder Zwischenwert angenommen werden kann.
In einer Ausgestaltung der Erfindung ist die Affinität der Bindung der Peptide über die Dissoziationskonstante (KD-Wert) definiert. Die Dissoziationskonstante (KD-Wert) eines erfindungsgemäßen Peptids ist dabei in einer vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung vorteilhaft erniedrigt. Damit verbunden sind verbesserte Eigenschaften der erfindungsgemäßen Peptide, wie höhere Affinität der Bindung und höhere Effektivität des Abbaus und / oder der Verhinderung der Bildung toxischer Amyloid-Beta-Oligomer. Dies betrifft insbesondere aber nicht ausschließlich einen niedrigeren KD-Wert an der high affinity Site des A-Beta- Monomer.
Fragmente und Teile zeigen vorteilhaft eine ähnliche beziehungsweise identische Wirkung wie die erfindungsgemäßen Peptide.
In einer Variante der Erfindung bestehen die erfindungsgemäßen Peptide der SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO. 10, SEQ ID NO. 11 , SEQ ID NO. 12, SEQ ID NO. 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20 und/oder SEQ ID NO: 21 sowie Homologe, Fragmente und Teile davon im Wesentlichen, bevorzugt mindestens 50%, 60%, 75%, 80%, besonders bevorzugt 85%, 90%, 95%, insbesondere 96%, 97%, 98%, 99%, 100% aus D-enantiomeren Aminosäuren.
Ein Polymer im Sinne der Erfindung ist gebildet aus 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 oder mehr Peptiden, die an sich an Amyloid-Beta- Monomer binden. Die Peptide gemäß der SEQ ID NO: 1-21 sind in einer Ausgestaltung der Erfindung am freien C-terminus mit einer Säureamidgruppe versehen. Die erfindungsgemäßen Peptide, beispielweise die Peptide gemäß SEQ ID NO: 1-21 sind dann an der Positi- on 12 am freien C-terminus amidiert. Dimere hieraus sind an Position 24 am freien C- terminus amidiert und so weiter.
Die Peptide gemäß der SEQ ID NO: 1-21 sind in einer weiteren Ausgestaltung der Erfindung am freien C-terminus mit dem freien N-terminus kovalent miteinander verbunden und liegen dann entsprechend zyklisiert vor. Auch durch den Ringschluss wird vorteilhaft bewirkt, dass die Carboxylgruppe am freien C-terminus nicht mehr vorhanden ist.
Das erfindungsgemäße Peptid weist vorteilhaft eine Aminosäuresequenz auf, bei der die Zyklisierung des linearen Moleküls z. B. durch eine kovalente Bindung der ersten mit der letzten Aminosäure, z.B. über eine Kondensationsreaktion, erfolgt ist. Selbstverständlich existieren weitere Möglichkeiten der Zyklisierung, z. B. indem andere Aminosäuren miteinander verknüpft werden. Lediglich beispielhaft sei die Verknüpfung der zweiten Aminosäure mit der letzten Aminosäure genannt. Genauso denkbar ist jede mögliche andere Verknüpfung.
Im Falle, dass die erste und die letzte Aminosäure des Peptids miteinander verknüpft werden, wird vorteilhaft bewirkt, dass keine offenen Enden in der Peptidkette (Aminosäuresequenz) vorliegen.
Diese Maßnahme bewirkt ferner, dass alle Peptide mit linearen Aminosäuresequenzen, die nach der Zyklisierung die gleiche, nicht mehr unterscheidbare Ami- nosäure-Reihenfolge ergeben, in diesem Sinne identisch sind.
Beispiel: Die lineare Aminosäuresequenz des bekannten Peptids D3 ist rprtrlhthrnr. Das entsprechende durch eine Amidbindung zwischen der N-terminalen Aminogrup- pe und der C-terminalen Carboxylgruppe verknüpfte, zyklisierte Peptid„cD3" ist nicht mehr zu unterscheiden von den zyklisierten Peptiden prtrlhthrnrr, rtrlhthrnrrp, trlhthrn- rrpr, rlhthrnrrprt, Ihthrnrrprtr, hthrnrrprtrl, thrnrrprtrlh, hrnrrprtrlht, mrrprtrlhth, nrrprtrlhthr, oder rrprtrlhthm. Aus jeder dieser Sequenzen lässt sich das cD3 weiterhin auch ableiten. Die erfindungsgemäß beanspruchten Effekte der höheren Spezifität, gegebenenfalls Affinität und Effektivität treten darüber hinaus gegenüber einem, vorzugsweise sogar jedem linearen, bindenden Peptid auf, aus dem sich ein zyklisiertes bzw. anderweitig modifiziertes, erfindungsgemäßes Peptid ableiten lässt. Die Herstellung zyklisierter Peptide ist im Übrigen Stand der Technik, und kann beispielweise nach dem Verfahren wie es in DE 102005049537 A1 beschrieben ist, erfolgen.
Vorteilhaft bewirkt die Zyklisierung über die erste und letzte Aminosäure des Peptids, dass keine„offenen" Enden der Peptidkette mehr existieren, die oft Angriffspunkte für Peptid-abbauende Aktivitäten in Zellen, Tieren oder Menschen sind, z. B. durch Ami- nopeptidasen und Carboxypeptidasen.
Mittels erfindungsgemäßer zyklisierter Peptide, wie z. B. Mosdl gemäß der SEQ ID NO: 1 und wird zusätzlich vorteilhaft bewirkt, dass diese erfindungsgemäßen zykli- sierten Peptide, bzw. Polymere als Seiteneffekt unter Umständen auch nicht leicht abgebaut werden, wenngleich dieser Effekt nicht ausschlaggebend ist. Er gilt im
Übrigen, wie gezeigt wurde, auch nur für den Fall einer head-to-tail- oder tail-to-head- Zyklisierung, bei dem entsprechend beide Enden des linearen Peptids miteinander verknüpft werden.
In einer weiteren Ausgestaltung der Erfindung sind die Polymere aus identischen Peptiden, wie z. B. Mosdl aufgebaut oder aus einer Kombination von 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 unterschiedlichen, verschiedenen der oben genannten Peptide gemäß der SEQ ID NO: 1-21 , als sogenannte Kombinations-Polymere. Die Peptide können auch teilweise identisch sein. Die Anzahl der identischen Peptide in den Kombinations- Polymeren ist frei wählbar. Polymere können beispielsweise über chemische Synthese bzw. Peptidsynthese hergestellt werden. In einer Ausführung der Erfindung sind die erfindungsgemäßen Peptide kovalent miteinander verknüpft. In einer weiteren Ausführung sind die Monomere nicht kovalent miteinander verbunden.
Eine kovalente Verbindung bzw. Verknüpfung der Peptid-Einheiten liegt im Sinne der Erfindung vor, falls die Peptide Kopf an Kopf, Schwanz an Schwanz oder Kopf an Schwanz linear miteinander verknüpft werden, mit oder ohne dazwischen eingefügte Linker oder Linker-Gruppen.
Eine nicht kovalente Verknüpfung im Sinne der Erfindung liegt vor, falls die Peptide beispielsweise über Biotin und Streptavidin, insbesondere Streptavidin-Tetramer miteinander verknüpft sind.
In einer Variante der vorliegenden Erfindung können die Peptide linear miteinander verknüpft sein, insbesondere wie oben beschrieben. In einer anderen Variante sind die Peptide verzweigt miteinander zu dem erfindungsgemäßen Polymer verknüpft.
Bei einem verzweigten Polymer kann es sich erfindungsgemäß um ein Dendrimer handeln, bei dem die Monomere kovalent oder nicht kovalent miteinander verknüpft sind.
Alternativ können die Peptide auch mit einem Plattform-Molekül (wie z.B. PEG oder Zucker) verknüpft sein und so ein verzweigtes Polymer bilden.
Alternativ sind auch Kombinationen dieser Optionen möglich. Die erfindungsgemäßen Peptide und Polymere daraus werden im Folgenden als erfindungsgemäße Peptide bezeichnet.
In einer Variante der Erfindung handelt es sich um ein Peptid mit der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO. 10, SEQ ID NO. 11 , SEQ ID NO. 12, SEQ ID NO. 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20 und/oder SEQ ID NO: 21 sowie Homologe, Fragmente und Teile davon mit einer Identität von mindestens 50%.
„Homologe Sequenzen" oder "Homologe" bedeutet im Sinne der Erfindung, dass eine Aminosäuresequenz eine Identität mit einer der oben genannten Aminosäuresequenz der Monomere von mindestens 50, 55, 60, 65, 70, 71 , 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81 , 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91 , 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ,100 % aufweist. Anstelle des Begriffs "Identität" werden in der vorliegenden Beschreibung die Begriffe "homolog" oder "Homologie" gleichbedeutend verwendet. Die Identität zwischen zwei Nukleinsäuresequenzen oder Polypeptidsequenzen wird durch Vergleich mit Hilfe des Programms BESTFIT basierend auf dem Algorithmus von Smith, T.F. und Waterman, M.S (Adv. Appl. Math. 2: 482-489 (1981)) berechnet unter Einstellung folgender Parameter für Aminosäuren: Gap creation penalty: 8 und Gap extension penalty: 2; und folgender Parameter für Nukleinsäuren: Gap creation penalty: 50 und Gap extension penalty: 3. Bevorzugt wird die Identität zwischen zwei Nukleinsäuresequenzen oder Polypeptidsequenzen durch die Identität der Nukleinsäuresequenz / Polypeptid- equenz über die jeweils gesamte Sequenzlänge definiert, wie sie durch Vergleich mit Hilfe des Programms GAP basierend auf dem Algorithmus von Needleman, S.B. und Wunsch, CD. (J. Mol. Biol. 48: 443-453) unter Einstellung folgender Parameter für Aminosäuren berechnet wird: Gap creation penalty: 8 und Gap extension penalty: 2; und die folgenden Parameter für Nukleinsäuren Gap creation penalty: 50 und Gap extension penalty: 3.
Zwei Aminosäuresequenzen sind im Sinne der vorliegenden Erfindung identisch wenn sie dieselbe Aminosäuresequenz besitzen. Unter Homologe sind in einer Variante die entsprechenden retro-inversen Sequenzen der oben genannten Monomere zu verstehen. Mit dem Begriff "retro-inverse Sequenz" wird erfindungsgemäß eine Aminosäuresequenz bezeichnet, die sich aus Aminosäuren in der enantiomeren Form zusammensetzt (invers: Chiralität des alpha- C-Atoms invertiert) und bei der zusätzlich die Sequenzreihenfolge zur ursprünglichen Aminosäuresequenz umgekehrt wurde (retro = rückwärts). In einer weiteren Variante binden die erfindungsgemäßen Peptide an Teile des Amyloid Beta-Peptids.
In einer weiteren Variante weisen die erfindungsgemäßen Peptide Sequenzen auf, die sich von den angegebenen Sequenzen um bis zu drei Aminosäuren unterscheiden.
Ferner werden als Peptide auch Sequenzen eingesetzt, die die oben genannten Sequenzen enthalten.
In einer weiteren Variante weisen die Peptide Fragmente der oben genannten Sequenzen auf oder weisen homologe Sequenzen zu den oben genannten Sequenzen auf.
Erfindungsgemäß handelt es sich um ein Peptid zur Verwendung in der Medizin, bevorzugt zur Behandlung der Morbus Alzheimer.
In einer Ausführung der vorliegenden Erfindung besteht das Peptid im Wesentlichen aus D-Aminosäuren.
Im Sinne der vorliegenden Erfindung bedeutet der Begriff „im Wesentlichen aus D- enantiomeren Aminosäuren", dass die erfindungsgemäß einzusetzenden Monomere mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70% bevorzugt 75%, 80%, besonders bevorzugt 85%, 90%, 95%, insbesondere 96%, 97%, 98%, 99%, 100% aus D-enantiomeren Aminosäuren aufgebaut sind.
In einer weiteren Variante handelt es sich um ein erfindungsgemäßes Peptid zur Hemmung der Fibrillenbildung von Amyloid-Beta-Oligomeren. Die erfindungsgemäßen Peptide enttoxifizieren die A-Beta-Oligomere oder daraus gebildete Polymere, sowie Fibrillen, indem sie nicht daran binden sondern an A-Beta-Monomer binden und durch des Gleichgewichts zur Reduktion der A-Beta-Oligomere führen und diese somit in nicht toxische Verbindungen überführen. Demgemäß ist Gegenstand der vorliegenden Erfindung auch ein Verfahren zur Enttoxifizierung der A-Beta- Oligomeren, daraus gebildeten Aggregaten oder Fibrillen. Gegenstand der Erfindung sind in einer Ausführung auch erfindungsgemäße Peptide, die mit einer weiteren Substanz verknüpft sind.
Bei der Verknüpfung handelt es sich im Sinne der Erfindung um eine chemische Bindung wie sie in Römpp Chemie Lexikon, 9. Auflage, Band 1 , Seite 650 ff, Georg Thieme Verlag Stuttgart definiert ist, bevorzugt um eine Hauptvalenz Bindung, insbesondere eine kovalente Bindung.
Bei den Substanzen handelt es sich in einer Variante um Arzneimittel oder Wirkstoffe, definiert gemäß Arzneimittelgesetz §2 beziehungsweise. §4 (19), Stand September 2012. In einer Alternative sind Wirkstoffe therapeutisch aktive Stoffe die als arz- neilich wirksame Stoffe verwendet werden. Bevorzugt werden Entzündungshemmer eingesetzt.
Bei den Substanzen handelt es sich in einer weiteren Variante um Verbindungen die die Wirkung der Peptide verstärken.
In einer Alternative sind solche Verbindungen Aminopyrazol und/oder Aminopyrazol- derivate. Aminopyrazolderivate im Sinne der Erfindung ist 3-Aminopyrazol-5- carbonsäure oder 3-Nitropyrazol-5-carbonsäure sowie alle Abkömmlinge, in denen die heterocyclische CH-Gruppe gegen -CR- oder -N- oder -O- oder -S- ausgetauscht wurde, sowie alle daraus abgeleiteten peptidischen Dimere, Trimere oder - Tetramere, bevorzugt Aminopyrazol-Trimer. In einer weiteren Alternative handelt es sich um Verbindungen, die die Löslichkeit der Peptide und/oder die Passage der Blut-Hirn-Schranke verbessern.
In einer Alternative haben die Peptide erfindungsgemäß jede beliebige Kombination von mindestens zwei oder mehr Merkmalen der oben beschriebenen Varianten, Ausführungen und/oder Alternativen. Im Rahmen der Erfindung wurde weiterhin erkannt, dass amidierte und/oder zyklisier- te Peptide im Vergleich zu linearen, bindenden Peptiden, bei denen der freie C- terminus, also die C-terminale Carboxylguppe, nicht modifiziert ist und entsprechend eine negative Ladung trägt, mit einer höheren Affinität an Abeta-Monomer binden. Das heißt, dass der KD-Wert bei den modifizierten Peptiden niedriger ist, als bei linearen Peptiden, bei denen der freie C-terminus, also die C-terminale Carboxylgup- pe, nicht modifiziert ist und entsprechend eine negative Ladung trägt. In einer weiteren bevorzugten Ausgestaltung der Erfindung ist daher die Affinität der Bindung der erfindungsgemäß modifizierten Peptide ohne negative Ladung am C- terminus im Vergleich zu linearen Peptiden mit negativer Ladung am C-terminus aber im Übrigen gleicher Aminosäuresequenz, um 1%, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, insbesondere 10%, 11 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 , 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41 , 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51 , 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61 , 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71 , 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81 , 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91 , 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, insbesondere 100%, 101 , 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111 , 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121 , 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131 , 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141 , 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151 , 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161 , 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171 , 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181 , 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191 , 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, insbesondere 200 %, 201 , 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211 , 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221 , 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231 , 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241 , 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251 , 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261 , 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271 , 272, 273, 274, 275, 276, 277, 278, 279, 280, 281 , 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291 , 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, insbesondere 300%, 301 , 302, 303, 304, 305, 306, 307,
308, 309, 310, 311 , 312, 313, 314, 315, 316, 317, 318, 319, 320, 321 , 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331 , 332, 333, 334, 335, 336, 337, 338, 339, 340, 341 , 342, 343, 344, 345, 346, 347, 348, 349, 350, 351 , 352, 353, 354, 355, 356, 357, 358, 359, 360, 361 , 362, 363, 364, 365, 366, 367, 368, 369, 370, 371 , 372, 373, 374, 375, 376, 377, 378, 379, 380, 381 , 382, 383, 384, 385, 386, 387, 388, 389, 390, 391 , 392, 393, 394, 395, 396, 397, 398, 399, insbesondere 400%, 401 , 402, 403, 404, 405, 406, 407, 408, 409, 410, 411 , 412, 413, 414, 415, 416, 417, 418, 419, 420, 421 , 422, 423, 424, 425, 426, 427, 428, 429, 430, 431 , 432, 433, 434, 435, 436, 437, 438, 439, 440, 441 , 442, 443, 444, 445, 446, 447, 448, 449, 450, 451 , 452, 453, 454, 455, 456, 457, 458, 459, 460, 461 , 462, 463, 464, 465, 466, 467, 468, 469, 470, 471 , 472, 473, 474, 475, 476, 477, 478, 479, 480, 481 , 482, 483, 484, 485, 486, 487, 488, 489, 490, 491 , 492, 493, 494, 495, 496, 497, 498, 499, vorteilhaft sogar 500%, 501 , 502, 503, 504, 505, 506, 507, 508, 509, 510, 511 , 512, 513, 514, 515, 516, 517, 518, 519, 520, 521 , 522, 523, 524, 525, 526, 527, 528, 529, 530, 531 , 532, 533, 534, 535, 536, 537, 538, 539, 540, 541 , 542, 543, 544, 545, 546, 547, 548, 549, 550, 551 , 552, 553, 554, 555, 556, 557, 558, 559, 560, 561 , 562, 563, 564, 565, 566, 567, 568, 569, 570, 571 , 572, 573, 574, 575, 576, 577, 578, 579, 580, 581 , 582, 583, 584, 585, 586, 587, 588, 589, 590, 591 , 592, 593, 594, 595, 596, 597, 598, 599, besonders vorteilhaft 600%, 601 , 602, 603, 604, 605, 606, 607, 608, 609, 610, 611 , 612, 613, 614, 615, 616, 617, 618, 619, 620, 621 , 622, 623, 624, 625, 626, 627, 628, 629, 630, 631 , 632, 633, 634, 635, 636, 637, 638, 639, 640, 641 , 642, 643, 644, 645, 646, 647, 648, 649, 650, 651 , 652, 653, 654, 655, 656, 657, 658, 659, 660, 661 , 662, 663, 664, 665, 666, 667, 668, 669, 670, 671 , 672, 673, 674, 675, 676, 677, 678, 679, 680, 681 , 682, 683, 684, 685, 686, 687, 688, 689, 690, 691 , 692, 693, 694, 695, 696, 697, 698, 699, besonders vorteilhaft 700%, 701 , 702, 703, 704, 705, 706, 707, 708, 709, 710, 711 , 712, 713, 714, 715, 716, 717, 718, 719, 720, 721 , 722, 723, 724, 725, 726, 727, 728, 729, 730, 731 , 732, 733, 734, 735, 736, 737, 738, 739, 740, 741 , 742, 743, 744, 745, 746, 747, 748, 749, 750, 751 , 752, 753, 754, 755, 756, 757, 758, 759, 760, 761 , 762, 763, 764, 765, 766, 767, 768, 769, 770, 771 , 772, 773, 774, 775, 776, 777, 778, 779, 780, 781 , 782, 783, 784, 785, 786, 787, 788, 789, 790, 791 , 792, 793, 794, 795, 796, 797, 798, 799, ebenfalls besonders vorteilhaft 800%, 801 , 802, 803, 804, 805, 806, 807, 808, 809, 810, 811 , 812, 813, 814, 815, 816, 817, 818, 819, 820, 821 , 822, 823, 824, 825, 826, 827, 828, 829, 830, 831 , 832, 833, 834, 835, 836, 837, 838, 839, 840, 841 , 842, 843, 844, 845, 846, 847, 848, 849, 850, 851 , 852, 853, 854, 855, 856, 857, 858, 859, 860, 861 , 862, 863, 864, 865, 866, 867, 868, 869, 870, 871 , 872, 873, 874, 875, 876, 877, 878, 879, 880, 881 , 882, 883, 884, 885, 886, 887, 888, 889, 890, 891 , 892, 893, 894, 895, 896, 897, 898, 899, ebenfalls besonders vorteilhaft 900%, 901 , 902, 903, 904, 905, 906, 907, 908, 909, 910, 911 , 912, 913, 914, 915, 916, 917, 918, 919, 920, 921 , 922, 923, 924, 925, 926, 927, 928, 929, 930, 931 , 932, 933, 934, 935, 936, 937, 938, 939, 940, 941 , 942, 943, 944, 945, 946, 947, 948, 949, 950, 951 , 952, 953, 954, 955, 956, 957, 958, 959, 960, 961 , 962, 963, 964, 965, 966, 967, 968, 969, 970, 971 , 972, 973, 974, 975, 976, 977, 978, 979, 980, 981 , 982, 983, 984, 985, 986, 987, 988, 989, 990, 991 , 992, 993, 994, 995, 996, 997, 998, 999, oder sogar um 1000 %, oder sogar um 10000% oder sogar um bis zu 100000% oder 1000000% erhöht, wobei jeder Zwischenwert angenommen werden kann. Dies betrifft insbesondere die erhöhte Affinität zu der high affinity Site des A-Beta-Monomer.
Dies wird durch einen entsprechend erniedrigten KD-Wert angezeigt. Der KD-Wert als Maß für die Affinität der Bindung eines modifizierten, insbesondere zyklisierten Peptids an Amyloid-Beta-Monomer ist im Vergleich zu einem linearen, bindenden Peptid mit negativer Ladung am freien C-terminus, um 1%, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, insbesondere 10%, 11 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 , 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41 , 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51 , 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61 , 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71 , 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81 , 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91 , 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, insbesondere 99,1 , 99,2, 99,3, 99,4, 99,5%, 99,6, 99,7, 99,8, 99,9 bis zu 99,99 oder sogar 99,999% erniedrigt, wobei jeder Zwischenwert angenommen werden kann.
Diese niedrigeren KD-Werte beziehen sich vorteilhaft insbesondere aber nicht ausschließlich auf die high affinity site von A-Beta-Spezies-Monomer. Die modifizierten Peptide können daher noch effizienter als Sonden für diagnostische Zwecke verwendet werden, als lineare, bindende Peptide mit negativer Ladung am freien C-terminus, insbesondere auch effizienter als ihre linearen Peptid-Pendants mit identischer Aminosäuresequenz verwendet werden.
Sie können aber insbesondere auch effizienter als Therapeutika verwendet werden, als lineare, bindende Peptide mit negativer Ladung am freien C-terminus, insbesondere effizienter als ihre linearen Peptid-Pendants mit identischer Aminosäuresequenz.
Im unmittelbaren Vergleich eines modifizierten Peptids zu einem Peptid mit negativer Ladung am C-terminus schneidet das erfindungsgemäße Peptid besser in Hinblick auf Affinität und Effektivität ab. Im Rahmen der Erfindung wurde weiterhin erkannt, dass die modifizierten Peptide im Vergleich zu Peptiden mit negativer Ladung am freien C-terminus, insbesondere aber im Vergleich zu ihren Peptid-Pendants mit identischer Aminosäuresequenz, zusätzlich auch mit einer höheren Effektivität bzw. Effizienz die Bildung besonders toxischer Amyloid-Beta-Oligomere verhindern oder deren Zerstörung und / oder Endtoxifizie- rung bewirken. Diese Effektivität ist insbesondere um 1%, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, insbesondere 10%, 11 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 , 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41 , 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51 , 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61 , 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71 , 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81 , 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91 , 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 99,9, besonders vorteilhaft sogar um 100% erhöht.
Eine Probe mit den verschiedenen A-Beta-Konformeren wird testweise im einfachsten Fall z. B. fraktioniert. In jeder Fraktion werden entsprechend des Fraktionierungs- schritts verschiedene Konformere, wie Monomere, Oligomere, Fibrillen oder höhere Aggregate angereichert und können sodann exakt bestimmt werden.
Der Begriff„exakt bestimmt" umfasst einen Kalibrierungsschritt bei der Fraktionierung durch Moleküle bekannter Art und Verhaltens. Nach der Fraktionierung liegt in jeder Fraktion nur eine bestimmte Art an Konformeren des A-Beta vor, z. B. Monomere, Oligomere oder Fibrillen und so weiter. Beispielweise werden die Konformere bei einer Dichtegradientenzentrifugation als Fraktionierungsschritt nach ihrem s-Wert oder Sedimentationskoeffizienten aufgetrennt. Moleküle unterschiedlicher Größe können einen identischen hydrodynamischen Radius besitzen, haben aber dennoch unterschiedliche s-Werte und werden danach auch aufgetrennt. Durch eine Kalibration mit Molekülen von bekanntem s- Wert sind die mittels Dichtegradientenzentrifugation erhaltenen A-Beta Konformere exakt nach ihrem s-Wert bestimmt.
Im Weiteren werden die erhaltenen Fraktionen mit und ohne Wirkstoff behandelt und z. B. durch RP-HPLC bestimmt. Auf diese Weise kann man die Effektivität des Wirkstoffs bestimmen. Ein weiteres Verfahren wird nachfolgend vorgestellt. Zur Quantitativen Analyse von Wirkstoffen kann der sogenannte QIAD-Test eingesetzt (quantitative determination of jnterference with Aß aggregate size distribution). Das Verfahren zur quantitativen Analyse des Einflusses eines Wirkstoffs auf die Partikelgrößenverteilung amyloider Peptide und / oder Proteine in einer Probe, weist dabei nachfolgende Schritte auf. Zunächst lässt man A-Beta unter kontrollierten Bedingungen aggregieren, so dass je verschiedene A-Beta-Aggregate entstehen. Die Bedingungen werden so gewählt, dass besonders viele, kleine, besonders cytotoxische A-Beta-Oligomere gebildet wurden. Als nächstes wird die zu untersuchende Substanz, z.B. eines der erfin- dungsgemäßen modifizierten Peptide zu der Probe zugegeben. Der Wirkstoff ändert die Partikelgrößenverteilung in der Probe. Diese Änderung wird quantitativ festgestellt. Die Änderung ist ein Maß für die Reduktion oder sogar für die vollständige Eliminierung bestimmter toxischer Spezies einer bestimmten Partikelgröße. Durch das QIAD-Verfahren wird die Zunahme oder die Abnahme von A-Beta-Aggregaten einer bestimmten Partikelgröße gemessen. Während einige A-Beta-Aggregate mit einer bestimmten Größe anfänglich in der Probe vorhanden waren, werden diese unter Einfluss des Wirkstoffs reduziert oder sogar vollständig eliminiert. Andere Partikelgrößen nehmen unter dem Einfluss des Wirkstoffs zu oder bleiben konstant. Die Partikel, die aus dem A-Beta gebildet sind, werden vorzugsweise nach ihrem hydro- dynamischen Radius der Partikel voneinander getrennt. Auf diese Weise wird vorteilhaft bewirkt, dass aus der Probe eine Mehrzahl an Fraktionen erhalten wird. In den Fraktionen sind die Partikel an amyloiden Peptiden und / oder Proteinen mit einer bestimmten Aggregatgröße angereichert. Diese Trennung der Partikel kann mittels einer Dichtegradientenzentrifugation vorgenommen werden. Die Fraktionen werden räumlich voneinander getrennt, z. B. durch Abpipettieren. Abschließend wird die
Konzentration an A-Beta in der jeweiligen Fraktion durch eine vollständige Denaturierung der A-Beta-Spezies während einer im Anschluss an die Fraktionierung durchgeführten Umkehrphasen (RP-) HPLC bestimmt. Die Denaturierung der Aggregate kann z. B. mit 30 % Acetonitril und 0,1 % Trifluoressigsäure bei einer Säulentempera- tur von 80 °C vollständig erfolgen und auf einer C8-Säule nach Hydrophobizität aufgetrennt werden. Eluierendes A-Beta wird mittels der UV-Absorption bei 215 nm detektiert. Die Peakflächenintegration kann mittels Agilent Chemstation Software erfolgen. Die Verrechnung daraus entstandener Werte mit einer zuvor durchgeführ- ten Kalibrierung erlaubt die Berechnung der Konzentration des in der jeweiligen Fraktion vorhandenen A-Beta. Je Fraktion kann der Mittelwert aus mehreren z. B. sechs voneinander unabhängig durchgeführten Experimenten mit der sich ergebenen Standardabweichung berechnet werden. Der Vorteil der HPLC-Analyse liegt darin, dass man unabhängig vom Aggregationszustand und eines Lösungsmittels sehr sensitiv detektieren (z. B. ca. 20 nM oder 1 ,8 ng Aß1-42) und zuverlässig quantifizieren kann. Ein entscheidender Vorteil des Verfahrens besteht in der Kopplung von Dichtegradientenzentrifugation und Umkehrphasen HPLC, welche eine zuverlässige Quantifizierung auch von A-Beta-Oligomeren möglich macht. Der erfindungsgemäße Effekt einer gesteigerten Effektivität der Eliminierung (bzw. der Bildung) von Amyloid-Beta-Spezies und insbesondere Amyloid-Beta-Oligomeren kann mit einem dieser Verfahren, aber nicht ausschließlich mit diesen Verfahren erfolgen.
In einer besonders bevorzugten Ausgestaltung der Erfindung treten die Effekte der gesteigerten Spezifität gegenüber A-Beta-Monomer und damit verbundene gleichzeitige Effektivität der Eliminierung, Enttoxifizierung von A-Beta-Oligomeren (bzw. der Bildung) auch in vitro und / oder in vivo auf.
Die Erfindung betrifft ferner auch eine Zusammensetzung enthaltend das erfindungsgemäße Peptid, insbesondere zur Behandlung von Morbus Alzheimer. Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ferner eine Zusammensetzung enthaltend das erfindungsgemäße Peptid, insbesondere zur Reduktion vorhandener toxischer A-Beta-Oligomere und Verhinderung der Bildung toxischer A-Beta-Oligomere.
Die erfindungsgemäße„Zusammensetzung" kann z. B. ein Impfstoff, ein Medikament (z. B. in Tablettenform), eine Injektionslösung, ein Nahrungs- oder Nahrungsergän- zungsmittel sein, enthaltend das erfindungsgemäße Peptid in einer aufgrund des Fachwissens herzustellenden Formulierung.
Die Erfindung betrifft ferner auch ein Kit enthaltend einen erfindungsgemäßen Liganden, bzw. Peptid. In einem solchen Kit können die erfindungsgemäßen Peptide in Behältern ggf. mit/in Puffern oder Lösungen verpackt sein. Alle Komponenten des Kits können in demselben Behälter oder getrennt voneinander verpackt sein. Ferner kann das Kit Anweisungen für dessen Gebrauch enthalten. Ein solches Kit kann beispielsweise die erfindungsgemäßen in einer Injektionsflasche mit Stopfen und/oder Septum enthalten. Ferner kann darin beispielsweise auch eine Einmal-Spritze enthalten sein.
Die erfindungsgemäßen Peptide können als Sonden zur Bindung an A-Beta- Monomer dienen. Solche molekularen Sonden enthalten das erfindungsgemäße Peptid bzw. Polymer und gegebenenfalls Farbstoffe, Fluoreszenzfarbstoffe, radioak- tive Isotope, (PET etc.), Gadolinium (MRI), sowie alternative Stoffe geeignet für die Bildgebung der Sonden und können den Patienten z.B. intravenös injiziert werden. Nach Passage über die Bluthirnschranke können die Sonden an A-Beta-Monomer und/oder Plaques binden. Die so markierten A-Beta-Monomere und/oder Plaques können mittels bildgebender Verfahren wie z.B. SPECT, PET, CT, MRT, Protonen- MR-Spektroskopie usw. sichtbar gemacht werden.
Ferner betrifft die Erfindung auch die Verwendung des erfindungsgemäßen Peptids zur Verhinderung von Amyloid-Beta-Oligomeren und/oder Amyloid-Beta-Peptid- Aggregaten und/oder Amyloid-Beta-Fibrillen.
Das erfindungsgemäße Peptid wird auch zur Enttoxifizierung von toxischen Amyloid- Beta-Oligomeren und/oder Aggregaten verwendet. Insbesondere wird es verwendet, um an Amyloid-Beta-Monomere zu binden und durch Verschiebung des Gleichgewichts amorphe, nicht toxische Aggregate zu bilden.
Diese Aggregate können aus gebundenen Monomeren bestehen und das Gleichgewicht wird verschoben, und zwar in erster Linie weg von den Oligomeren. Es können amorphe, nicht toxische Aggregate gebildet werden wodurch eine Reduktion der toxischen Spezies erreicht wird. Andere Peptide stabilisieren die A-Beta-Monomere durch die Monomer-Spezifität im ELISA-Versuch, wie in Figur 2 gezeigt wird.
Es wurde erkannt, dass wenn bereits A-Beta-Oligomere vorhanden sind, es das Ziel einer Behandlung sein muss, diese durch Substanzen zu adressieren, die eine mög- liehst hohe Spezifität zu A-Beta-Monomer besitzen. De facto kann die Spezifität gegenüber A-Beta-Monomer im Vergleich zu A-Beta-Oligomer gar nicht groß genug sein und das entsprechende Verhältnis ist jedenfalls größer als 1.
Es wurde im Rahmen der Erfindung erkannt, dass A-Beta-Monomere, als Bausteine der A-Beta-Oligomere, ständig im menschlichen Körper entstehen und vermutlich per se nicht toxisch sind. Es besteht sogar die Möglichkeit, dass Monomere eine positive Funktion besitzen. A-Beta-Monomere können sich in Abhängigkeit von ihrer Konzentration zufällig zusammen lagern. Die Konzentration ist abhängig von ihrer Bildungsund Abbaurate im Körper. Findet mit zunehmendem Alter eine Erhöhung der Kon- zentration an A-Beta-Monomeren im Körper statt, ist eine spontane Zusammenlagerung der Monomere zu A-Beta-Oligomeren immer wahrscheinlicher. Die so entstandenen A-Beta-Oligomere könnten sich analog zu den Prionen vermehren und letztendlich zur Morbus Alzheimer-Krankheit führen.
Es wurde ferner erkannt, dass ein wichtiger Unterschied zwischen Prävention und Behandlung oder gar Heilung der Alzheimerschen Demenz in der Tatsache liegt, dass eine Prävention möglicherweise schon durch die Verhinderung der Bildung der ersten A-Beta-Oligomere erreicht werden kann. Hierzu sind einige, wenige hochspezifische A-Beta-Monomer Liganden ausreichend, die gleichzeitig wenig affin und selektiv bezüglich der A-Beta-Oligomere sind. Die Bildung der A-Beta-Oligomere aus vielen Monomeren ist eine Reaktion hoher Ordnung und damit in hoher Potenz von der A-Beta-Monomer-Konzentration abhängig. Somit führt schon eine kleine Verringerung der aktiven A-Beta-Monomer- Konzentration zu einer Verhinderung der Bildung der ersten A-Beta-Oligomere. Auf diesem Mechanismus basieren vermutlich die bisher sich in der Entwicklung befindli- chen eher präventiven Therapie-Konzepte und Substanzen.
Bei der Behandlung der Alzheimerschen Demenz ist jedoch von einer völlig veränderten Situation auszugehen. Hier liegen A-Beta-Oligomere oder evtl. auch schon größere Polymere oder Fibrillen vor, die sich durch Prionen-ähnliche Mechanismen vermehren. Diese Vermehrung ist jedoch eine Reaktion niederer Ordnung und ist kaum noch von der A-Beta-Monomer-Konzentration abhängig. Sind also A-Beta-Oligomere bereits entstanden, muss es das Ziel einer Behandlung sein, diese durch Substanzen zu adressieren, die diese besonders effizient eliminieren und / oder die Bildung besonders effizient verhindern bzw. diese enttoxifizieren.
Diese Anforderungen in Hinblick auf die Therapie der Alzheimerschen Demenz sind mit der Bereitstellung der erfindungsgemäßen Peptide erfüllt. Die erfindungsgemäßen Peptide binden im Sinne der Therapie spezifisch die Amyloid-Beta-Monomere mit entsprechend niedriger Dissoziationskonstante. Weiterer Gegenstand ist somit die Verwendung der erfindungsgemäßen Peptide als Therapeutikum von Morbus Alzheimer. Die erfindungsgemäßen Peptide binden besonders gut an A-Beta an lösliche A-Beta- Monomere.
Mittels des Thioflavin-T-Tests kann gezeigt werden, dass die erfindungsgemäßen Peptide die Fibrillenbildung von A-Beta-Peptiden sehr effizient hemmen, besonders das Peptid mit der SEQ ID NO: 1 - 21 , insbesondere das Peptid gemäß der SEQ ID NO: 1.
Weiterer Gegenstand ist die Verwendung der erfindungsgemäßen Peptide in einem Verfahren zur Behandlung (in vitro, ex vivo) von Blut, Blutprodukten und/oder Organen, dadurch gekennzeichnet, dass das Blut, die Blutprodukte und/oder Organe dem menschlichen oder tierischen Körper entnommen werden und A-(Amyloid)-Beta- Oligomere entfernt und/oder enttoxifiziert werden.
Die Spezifität eines Peptids ergibt sich aus der prozentualen Differenz der Absorptionswerte für das Zielmolekül bzw. den Köder (z. B. A-Beta-Monomer) zu den normierten Absorptionswerten für die Kompetitoren (z. B. A-Beta-Oligomere und - Fibrillen) im Einzelphagen-ELISA. Die Absorptionswerte stellen dann die Affinität von Phagen-Einzelklone für eine jeweilige immobilisierte A-Beta-Spezies dar. Die Spezifität ist dabei nicht abhängig von der Stärke der Affinität, sondern nur von der Differenz der Affinitäten zwischen den Spezies. Je größer die prozentuale Differenz von der Signalstärke für das Zielmole- kül (z. B. Aß1-42-Monomer) gegenüber der Signalstärke für die sogenannten Kompeti- toren
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und -Fibrillen) ist, desto spezifischer bindet der jeweilige Phage an das Zielmolekül. Die Begriffe„Kompetitoren" und„Zielmolekül" bzw.„Köder" werden wie unten angegeben definiert. Peptide gelten im Sinne des oben genannten Spezifitätsbegriffs dann als spezifisch, wenn die prozentuale Differenz der normierten Absorptionswerte (mit Zielmolekül z. B. monomeres Aßi-42 = 100%) mindestens 40%, 45%, besser 50%, vorzugsweise besser als 70%, insbesondere besser als 80% oder 90%, und besonders bevorzugt 100% beträgt, wobei alle Zwischenwerte angenommen werden können. Wechselnde Substrate erhöhen zunächst die allgemeine Spezifität für das Zielmolekül aber auch„Verwandte". Mit Hilfe wechselnder Substrate und deren abwechselnder Blockierung und Nicht-Blockierung wird die Spezifität für das Zielmolekül gegenüber unspezifisch bindenden Phagen (Bindung an Substrat (Plastikoberflächen), Streptavidin oder BSA (Blockier-Reagenz)) erhöht. Durch die abwechselnde Verwendung unterschiedlicher Substrate können Phagen die zum Beispiel in Runde X an Substrat A gebunden haben in der folgenden Runde X+1 nicht mehr ihren bevorzugten Bindepartner Substrat A binden, weil dieser durch Substrat B ersetzt worden ist, dadurch gehen Substrat A bindende Phagen verloren.
Zusätzlich zu dieser ersten, groben Spezifizierung erfolgte mit Hilfe des Einsatzes der Kompetitoren, die z. B. Polymere des Zielmoleküls darstellen können, eine Steigerung der Spezifität für eine klar definierte Form des Zielmoleküls (z. B. Monomere).
Auf diese Weise konnte nicht nur die zuvor häufig aufgetretene unspezifische Bindung an Zielmolekül und Substrat oder die bevorzugte Bindung an Substrat deutlich reduziert werden, sondern es konnte die Spezifität zu einer klar definierten strukturel- len, monomeren Variante des Zielmoleküls gesteigert werden.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist somit vorteilhaft besonders geeignet zur Identifikation von Liganden gegenüber A-Beta-Monomer oder A-Beta-Oligomer als Köder mit der jeweils anderen Spezies als Kompetitor. Beispiel: Es ist nahezu unmöglich, eine gleiche Immobilisierungseffizienz für z. B. verschiedene Aßi-42-Spezies für ELISA-Experimente zu gewährleisten, weshalb auf jeder 96-well-Mikrotiterplatte eine Immobilisierungskontrolle eingesetzt werden sollte. Diese kann darin bestehen, dass statt der amplifizierten Einzelphagenklone ein (Aßi_ 2-) spezifischer Antikörper (z. B. 6E10) zu den jeweiligen Kontroll-Reaktionswannen (wells) gegeben werden kann. Das gemessene Absorptionssignal, dessen Stärke von der Bindung eines Antikörpers an die angebotene Oberfläche mit oder ohne immobilisierte Αβτ ^-Spezies abhängig ist, kann im Anschluss an das Experiment als Maß für die Immobilisierungseffizienz verwendet werden. Als weitere Kontrolle kann eine mögliche Kreuzreaktion des Phagen-spezifischen Antikörpers mit den immobilisierten Molekülen oder der Oberfläche der Reaktionswanne untersucht werden. Der Phagen-spezifische Antikörper wird normalerweise den Ansätzen zugegeben in denen Einzelphagen getestet werden, um deren Bindung an die jeweils gegebene Zielstruktur (z. B. Oberfläche, Aßi-42-Monomere,
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und -Fibrillen) zu quantifizieren. Dafür muss jedoch bekannt sein, wie stark der Phagen-spezifische Antikörper unspezifisch an andere mögliche Ziele bindet, z. B. an die oben genannten potentiellen Zielstrukturen der Phagen selbst, um diese sogenannten Kreuzreaktionen gegebenenfalls in die Interpretation der erhaltenen Daten mit einzubeziehen.
Ein Verfahren zur Normierung der erhaltenen Werte sollte daher vorgenommen wer- den. Von allen Absorptionswerten der Einzelphagenklone im Einzelphagen-ELISA können dabei die Werte des auf Kreuzreaktion getesteten Phagen-Antikörper als Hintergrund abgezogen werden. Dies geschieht entsprechend der zuvor immobilisierten Spezies. Die Signalwerte des Phagen-Antikörpers können hierzu aus den Reaktionswannen mit immobilisierten Aß1-42-Oligomeren von den Signalwerten der Einzel- phagenklone aus den Reaktionswannen mit immobilisierten
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abgezogen werden. Analog wird dann für Aßi- 2-Monomere vorgegangen. Auf diese Weise kann zunächst ein mögliches Hintergrundsignal des Phagenantikörpers aus den Signalen der Einzephagenklone herausgerechnet werden. Im Anschluss daran wird anhand der Kontrolle mit Aß^ ^-spezifischem 6E10-Antikörper die Immobilisierungs- effizienz der unterschiedlichen verwendeten Aß1-42-Spezies vermessen und verglichen. Dadurch wird vorteilhaft (siehe auch Figur 1) eine effektivere Immobilisierung des Gemisches aus
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und -Fibrillen gegenüber den Aß -42- Monomeren bewirkt. Daher werden in den Reaktionswannen, in denen Aßi_42- Oligomere und -Fibrillen immobilisiert sind, mehr potentielle Bindepartner für die Einzelphagenklone angeboten und das Ergebnis verzerrt. Daher wurden die Werte der 6E10-Kontrolle aus den Reaktionswannen in welchen Aß1-42-Oligomere und - Fibrillen immobilisiert waren auf den Gehalt an Aß^ in den Reaktionswannen in denen Aßi ^-Monomere immobilisiert waren normiert. Daraus ergibt sich für jede verwendete Mikrotiterplatte ein spezifischer Faktor, mit welchem die Werte für die Bindung an Aß -42-Oligomere und -Fibrillen jedes Einzelphagenklons multipliziert wurden. Nur so ist eine gleichwertige Interpretation der Ergebnisse vor allem in Hinblick auf die Bewertung der Spezifität der Einzelphagenklone möglich (siehe Figur 2).
Ausführungsbeispiele
Im Weiteren wird die Erfindung an Hand von Ausführungsbeispielen und der beigefügten Figuren näher erläutert, ohne dass es hierdurch zu einer Beschränkung der Erfindung kommen soll.
Es zeigen:
Figur 1 : Immobilisierungskontrolle verschiedener
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Figur 2: Einzelphagen-ELISA.
Figur 3: Modulation der Aßi-42-Aggregation durch Mosd-Peptide - ThT-Versuch.
Figur 4: Modulation verschiedener Aßi-42-Spezies durch Mosd-Peptide.
Figur 5: Modulation verschiedener Aßi-42-Spezies durch Mosdl .
Figur 6: Quantifikation der Modulation verschiedener Aßi .«-Spezies durch
Mosdl mittels RP-HPLC.
Figur 7: TEM-Aufnahmen von 10 μΜ Aß1-42 inkubiert mit und ohne 10 μΜ
Mosdl . Figur 8 MTT-Reduktionsversuch: Einfluss von Mosdl auf Aßi-42 -induzierte
Zelltoxizität.
Figur 9 Einfluss on Mosdl auf APP-exprimierende Zellen.
Kompetitives Spiegelbildphagendisplav am Beispiel von A-Beta-Monomer als Köder: Das Ziel des kompetitiven Spiegelbildphagendisplav war die Selektion spezifisch Aß^ 42-Monomer bindender Peptide. Sechs sogenannte panning-Runden wurden ausgeführt, wobei eine panning-Runde dem Prozess entspricht, in welchem die Phagenbib- liothek mit dem immobilisierten Zielmolekül/Köder, Aß1-42-Monomere, in Kontakt gebracht wird. Um die Anzahl der Phagen zu reduzieren, die eine erhöhte Spezifität zu anderen Αβι-42-Spezies, das heißt Oligomeren und Fibrillen aufweisen, wurden eben diese Spezies ab der zweiten panning-Runde als Kompetitoren eingesetzt.
Auf diese Weise konnte die Anzahl der Phagen, die eine erhöhte Affinität zu Αβ-ι^- Oligomeren und -Fibrillen aufweisen, vermindert werden und die Anzahl der Phagen mit erhöhter Spezifität für monomers Aßi- 2 gleichzeitig angereichert werden.
Mit dem weiteren Ziel, die Anreicherung Plastik-bindender Phagen sowie Phagen mit einer Spezifität für das Blockierreagenz BSA (bovines Serumalbumin) zu verringern, wurde das Zielmolekül auf unterschiedlichen, sich von Runde zu Runde abwechselnden, Stretpavidin-beschichteten Kunststoffen/Oberflächen immobilisiert (Polysty- ren/Polypropylen/Polycarbonat).
Die Polystyren-Oberflächen wurden entsprechend den Herstellerangaben vor der Immobilisierung des Zielmoleküls gewaschen. Zusätzlich erfolgte abwechselnd von einer zur nächsten Runde eine und keine Blockierung der Oberfläche mit 150 μΙ 1x TBS/0.1 % (v/v) Tween-20/1% (w/v) BSA vor der Immobilisierung des Zielmoleküls für eine Stunde bei Raumtemperatur. Auf diese Weise wurde keine Kombination aus Kunststoffoberfläche und Blockierung während der 6 panning-Runden mehr als einmal verwendet (siehe Tabelle X). Dieser Schritt wurde durchgeführt, um unspezifische Bindung an die Kunststoffe und BSA zu reduzieren, da z.B. Phagen die an BSA gebunden haben in der darauf folgenden panning-Runde, die entsprechend obiger Erklärung ohne BSA durchgeführt wird, keine Bindepartner vorfinden und dementsprechend in den Waschschritten entfernt werden.
Nach der Vorbehandlung der Oberfläche wurden D-enantiomere, N-terminal biotiny- lierte Aßi-42-Monomere in 1x TBS auf eine Konzentration von 63 nM verdünnt und als Zielmolekül auf der jeweiligen Oberfläche immobilisiert. Der monomere Status der Aß1 -42-Moleküle wurde über Größenausschlusschromatographie garantiert. Die ge- nutzte Konzentration von 63 nM entspricht der Belegung von 1/3 aller Streptavidin- Bindungsstellen pro genutzter Oberfläche, ausgehend von der Oberfläche mit der geringsten Anzahl freier Streptavidin-Bindungsstellen. 100 μΙ der auf 63 nM eingestellten Lösung von monomerem Aßi-42 in 1x TBS wurden auf die Streptavidin beschichtete Oberfläche gegeben und für 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wurde die Oberfläche dreimal mit 150 μΙ 1x TBS gewaschen.
Daraufhin wurden in der ersten panning-Runde 90 μΙ 1x TBS mit 10 μΙ der kommerziell erhältlichen, rekombinanten Phagenbibliothek auf die Oberfläche gegeben und für 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Der Überstand wurde abgenommen und durch 100 μΙ 10 μΜ Biotin in 1x TBS/0.1% (v/v) Tween-20 ersetzt. Dieser Schritt diente dem kompetitiven Verdrängen von Phagen, die an noch freie Streptavidin- Bindestellen gebunden haben, durch den hochaffinen Streptavidin-Bindepartner Biotin und wurde für 5 Minuten bei Raumtemperatur durchgeführt. Die Oberfläche wurde danach viermal mit 1x TBS/0.1% (v/v) Tween-20 gewaschen.
Die nach wie vor gebundenen Phagen wurden durch einen pH-Schritt abgetrennt. Hierfür wurden 100 μΙ einer 0.2 M Glycin/HCl Lösung mit einem pH-Wert von 2.2 auf die Oberfläche gegeben und für 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Die Lösung inklusive der eluierten Phagen wurde abgenommen und zur Neutralisation zu 25 μ1 1 M Tris/HCI mit einem pH-Wert von 9.1 gegeben und vermischt.
20 μΙ dieses Ansatzes wurden in ein neues Reaktionsgefäß überführt und dienten weiterhin zur Bestimmung des Phagentiters nach Elution (sogenannter Output-Titer). Die übrigen 105 μΙ wurden zur Amplifizierung der eluierten Phagen verwendet. Sowohl Titrierung als auch Amplifikation erfolgten nach Angaben des Herstellers der Phagenbibliothek (Stand der Technik).
Die amplifizierten Phagen wurden analog zu den eluierten, nicht amplifizierten Pha- gen titriert (Input-Titrierung). Die Anzahl Plaque-bildender Einheiten (plaque forming units = pfu) pro Milliliter wurde unter Berücksichtigung des Verdünnungsfaktors ermittelt. Die Phagenanzahl wurde anhand dieser Zahl für jede Runde auf 1x 1011 Phagen in 100 μΙ 1x TBS eingestellt. Für jede Folgerunde wurden die amplifizierten Phagen der Vorrunde verwendet und entsprechend verdünnt. Während die Konzentration des Zielmoleküls bzw. Köders (monomeres Aß -42) in allen Runden stabil bei 63 nM lag, wurden die Kompetitoren in von panning-Runde zu panning-Runde ansteigender Konzentration zugegeben. Als Kompetitoren dienten D-enantiomere Aßi-42-Oligomere (aufgereinigt, das heißt von anderen Αβϊ ^-Spezies getrennt über Größenausschlusschromatographie) und
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(aufgereinigt mittels Dichtegradientenzentrifugation). Diese Kompetitoren waren nicht biotinyliert, da sonst eine Bindung an die Oberfläche möglich wäre. Das Ziel aber war, Kompeti- toren-bindende Phagen von den Phagen, die an das immobilisierte Zielmolekül gebunden haben, zu trennen, indem sie bei den Wasch schritten abgewaschen werden. Der Anstieg der Konzentrationen war für beide Kompetitor-Spezies gleich und wie folgt: Runde 1 = 0 nM - Runde 2 = 1 nM - Runde 3 = 5 nM - Runde 4 = 10 nM - Runde 5 = 50 nM - Runde 6 = 500 nM.
Durch die Einführung des Kompetitionsschrittes wurde der oben beschriebene Ablauf einer panning-Runde ab Runde 2 angepasst: 1x 1011 Phagen aus der vorherigen Runde wurden fortan nicht in 100 μΙ 1x TBS verdünnt sondern in 60 μΙ. Die restlichen 40 μΙ wurden direkt danach mit 20 μΙ 1x TBS inklusive dem Fünffachen der oben für jede Runde angegebenen Konzentration Aß^-Oligomere sowie 20 μΙ 1x TBS inklusive dem Fünffachen der oben angegebenen Konzentration
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aufgefüllt. Die Verfünffachung der oben angegebenen Konzentrationen ergibt sich aus der Tatsache, dass die Konzentration auf das Gesamtvolumen von 100 μΙ berechnet wurden, da jeweils nur ein Fünftel des Gesamtvolumens (20 μΙ) aus Kompetitor- Lösungen bestehen, entspricht die Konzentration der Kompetitoren im Gesamtansatz den genannten Werten.
Nach 5 Minuten wurde die Lösung aus Phagen und Kompetitoren entfernt. Es folgten der schon beschriebene Kompetitionsschritt mit 10 μΜ Biotin und die Waschschritte, deren Anzahl sich ebenfalls von einer zur nächsten panning-Runde erhöhte (Runde 1 = 4 Waschschritte - Runde 2 = 6 - Runde 3 = 8 - Runde 4 = 10 - Runde 5 = 12 - Runde 6 = 15).
Tabelle 1 : Parameter aller 6 durchgeführten panning-Runden.
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Zu Tabelle 1 : Für das Spiegelbildphagendisplay wurden die nachfolgenden Parame- ter festgelegt. Innerhalb von 6 panning-Runden wurden 3 verschiedene Kunststoffe abwechselnd als Oberfläche verwendet (PS= Polystyren, PP= Polypropylen, PC= polycarbonate). Zusätzlich wurde in jeder zweiten Runde beginnend mit der ersten die Oberfläche mit BSA blockiert bevor das Zielmolekül immobilisiert wurde. Auf diese Weise sollte eine Anreicherung von Phagen mit einer Spezifität für einen der Kunststoffe oder BSA verringert werden. Nachdem die naive Phagenbibliothek (naiv heist hier, sie war bisher noch nicht mit dem Zielmolekül in Kontakt) die Möglichkeit hatte in der ersten panning-Runde an das immobilisierte Zielmolekül (Aßi-42- Monomer) zu binden, wurde ab der zweiten panning-Runde ein Kompetitionsschritt eingeführt. Dieser Schritt bestand aus der Zugabe ansteigender Konzentrationen von Kompetitoren, namentlich Aßi-42-Oliomere und -Fibrillen. Auf diese Weise sollten Phagen, die unspezifisch an verschiedene Aß1-42-Spezies binden, entfernt werden, so dass letztendlich nur die Phagen übrig bleiben, die a) spezifisch an D- enantiomeres Αβ-ι^ und nicht an Kunststoffoberflächen, BSA oder Biotin binden und dabei b) spezifisch für monomers, D-enantiomeres Aß1- 2 sind. Die Rigorosität beim Waschen wurde gesteigert, indem die Anzahl der Waschschritte pro Runde erhöht wurde, dadurch sollten sehr schwach an das Zielmolekül bindende Phagen entfernt werden.
Einzelphagenamplifikation: Aus den panning-Runden gingen Ansammlungen von verschiedenen, zunehmend spezifischer an das Zielmolekül bindenden Phagen her- vor. Aus diesen Ansammlungen wurden einzelne Phagenklone vermehrt, um diese dann untereinander zu vergleichen (Sequenzierung der DNA und Einzelphagen- ELISA). Hierfür wurden von den Output-Titerplatten der bevorzugten Runden des Spiegelbild-Phagendisplays (panning-Runden 3-6) einzeln vorliegende Plaque formende Einheiten entnommen und vermehrt. Die Vermehrung erfolgte gemäß eines Protokolls des Herstellers der rekombinanten Phagenbibliothek.
Einzelphagen-ELISA: Die Affinität einzelner Phagenklone gegenüber dem Zielmolekül und den Kompetitoren wurde mittels ELISA untersucht. Hierfür wurden alle drei Spezies in biotinylierter Form auf einer Polystyrenoberfläche an darauf gebundenes Stretpavidin immobilisiert. Da während der panning-Runden Oligomere und Fibrillen zur selben Zeit als Kompetitoren zugegeben worden sind, wurden diese beiden Spezies im Einzelphagen-ELISA ebenfalls gemischt immobilisiert. Die Aßi-42-Spezies wurden nach demselben Prinzip wie im Spiegelbild-Phagendisplay aufgereinigt und zu 320 nM immobilisiert (bei
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wurde eine 1 :1 Mischung beider Spezies mit einer Gesamtkonzentration von 320 nM hergestellt und immobilisiert). Für jeden Klon und jede im späteren Verlauf des Protokolls erwähnte Kontrolle wurden in jeweils 2 Reaktionswannen (Fachausdruck, prinzipiell auch im Deutschen: "well": 96 davon auf einer Polysteren-(oder anderer Kunststoff)-Platte) Αβι-42-Monomere,
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oder keine der beiden Ansätze immobilisiert. Die Reaktionswannen ohne immobilisiertes Aßi-42 dienten später dem Nachweis, ob die Phagen oder die zur Detektion der Phagen bzw. des Aß1-42 verwendeten Antikörper unspezifisch an die Plastikoberfläche binden. Die Streptavidin- beschichteten Mikrotiterplatten wurden wie vom Hersteller angegeben vorgewaschen. Die Αβι-42-Monomere beziehungsweise die
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und -Fibrillen wurden zu einer Konzentration von jeweils 320 nM in 1x TBS verdünnt. Zur Immobilisierung wurden pro Reaktionswanne 100 μΙ eingesetzt und für 15 Minuten bei Raum- temperatur inkubiert. Nach zweimaligem Waschen der gesamten Platte(n) mit 150 μΙ 1x TBS pro Reaktionswanne folgte ein Blockierschritt mit 150 μΙ 1x TBS/0.1% (v/v) Tween-20/1% (w/v) BSA für eine Stunde bei Raumtemperatur. Es folgten drei Waschschritte mit 150 μΙ 1x TBS/0.1 % (v/v) Tween-20 pro Reaktionswanne. Die amplifizierten Einzelphagenklone wurden 1 :1 mit 1x TBS/1 % (w/v) BSA vermischt. Der Antikörper 6E10 wurde 1 : 10.000 in 1 x TBS/0.1 % (v/v) Tween-20 verdünnt. 100 μΙ einer jeden Einzelphagenklonverdünnung, einer Probe ohne Phagen (LB-Medium 1 :1 mit 1x TBS/1% (w/v) BSA) und der Antikörperverdünnung wurden auf jeweils 2 Reaktionswannen ohne immobilisiertes Aßi-42, 2 Reaktionswannen mit immobilisiertem monomeren Aßi-42 und 2 Reaktionswannen mit immobilisiertem oligome- ren/fibrillären Aß -42 gegeben und für eine Stunde bei Raumtemperatur inkubiert.
Nach fünfmaligem Waschen mit 150 μΙ 1x TBS/0.1% (v/v) Tween-20 pro Reaktionswanne, wurden in jede Reaktionswanne 200 μΙ 1x TBS/0.1% (v/v) Tween-20 gegeben und die Platte(n) für eine Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Die Lösungen wurden abgenommen und wie folgt ersetzt. In alle Reaktionswannen, die zuvor mit Einzelphagenklon-Verdünnungen oder dem Ansatz ohne Phagen inkubiert worden sind, wurden nun 100 μΙ eines 1 :5.000 in 1x TBS/0.1% (v/v) Tween-20 verdünnten Phagenantikörpers gegeben. An diesen Antikörper ist das Enzym Merrettichperoxi- dase (horse radish peroxidase = HRP) gekoppelt, welches später der Umsetzung eines Substrates (TMB) dient. Diese Umsetzung hat eine Farbreaktion zur Folge deren Stärke proportional zur Bindung des Antikörpers an sein Ziel (Phagen) und damit wiederum zur Bindung der Phagen an die immobilisierte Spezies bzw. die Oberfläche ist. Gleichzeitig wurden in allen Reaktionswannen, die zuvor mit der Verdünnung des 6E10-Antikörpers inkubiert worden sind, nun 100 μΙ eines 1 :1.000 in 1x TBS/0.1% (v/v) Tween-20 verdünnten Zweitantikörpers gegeben, welcher in der Lage ist, den aus der Maus stammenden 6E10-Antikörper zu erkennen und zu binden. Auch dieser Antikörper ist HRP-gekoppelt und erlaubt somit eine Quantifizierung der Bindung des ersten Antikörpers an die immobilisierten Zielmoleküle bzw. die Kunst- stoffoberfläche der Reaktionswanne. Nach einer Stunde Inkubation bei Raumtemperatur wurde die Platte(n) 10 mal mit 150 μΙ 1x TBS/0.1% (v/v) Tween-20 pro Reaktionswanne gewaschen. Die Detektion des Signals erfolgte durch Zugabe des Substrates 3,3',5,5'-tetramethylbenzidin (TMB). TMB wird von HRP umgesetzt, wobei es zu einem Farbumschlag in der Lösung kommt. Die Stärke der Farbreaktion ist ein Maß für die Bindungsstärke der Phagen bzw. des Antikörpers. 50 μΙ der TMB-Lösung werden dafür nach dem Waschen pro Reaktionswanne aufgetragen. Die Farbentwicklung wird durch Zugabe von 50 μΙ 2 M H2S04 gestoppt, sobald die Lösungen in den Reaktionswannen türkis wird. Die Absorption bei 450 nm wird anschließend automatisch ausgelesen. Die im Einzelphagen-ELISA erhaltenen Werte für die Affinität zu
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und -Fibrillen wurden zunächst anhand der Ergebnisse der Immobilisierungskontrolle mit Αβι-42-spezifischem Antikörper 6E10 (siehe Figur 1 , Immobilisierungskontrolle) auf den Aß1-42-Gehalt der Aß1-42-Monomer-beschichteten Reaktionswannen normiert. Anschließend wurden für jeden Klon die Werte der Signalstärke für Aß-i-42-Monomer- beschichtete Reaktionswannen auf 100% gesetzt. Die Differenz der Signalstärke für Αβι-42-Oligomer und -Fibrillen-beschichteten Reaktionswannen zu den Werten für Αβ-ι-42-Monomer-beschichtete Reaktionswannen ist in der nachfolgenden Tabelle 2 prozentual angegeben. Je höher der Wert ist, desto größer ist die Differenz und umso spezifischer ist die Bindung an
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Es werden verschiedene Klone nach dem erfindungsgemäßen Verfahren identifiziert (Klon 5.60 - 6.135), gefolgt von weiteren getesteten, aber nicht ausgewählten Klonen (6.262 - 6.85). Klon 6.84 wurde zum Beispiel nicht für weitere Experimente gewählt, da zwar die Spezifität zu Aßi-42-Monomeren gegeben war, aber die Signalstärke extrem niedrig lag.
Tabelle 2:
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der Einzelphagenklone entsprechend Einzel- phagen-ELISA.
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Mit dem erfindungsgemäßen Spiegelbildpliagendisplay sind mit Mosdl bis Mosd21 spezifisch A-Beta-Monomer bindenden Peptide ermittelt worden.
Tabelle 1 : Ausgewählte spezifisch
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bindende Peptidsequenzen, die mittels erfindungsgemäß kompetitiven Spiegelbild-Phagen-Display selektiert wurden. Klonnummer Name SEQ ID NO: Aminosäuresequenz
>5.60 Mosdl 1 YS YLTS YH MVWR
>5.80 Mosd2 2 HTWTTYDYVWRL
>5.57 Mosd3 3 GTMLKFSGMNLT
>5.81 Mosd4 4 H NWFYWTTEPYD
>6.216 Mosd5 5 HNWSWEWWYNPN
>6.249 Mosd6 6 STLHFYTAFLNK
>6.247 Mosd7 7 FSHSHHTWFTWN
>6.227 Mosd8 8 HFWSWTSLSMTR
>6.239 Mosd9 9 HLSWYWEKYLTS
>6.242 MosdIO 10 HTWTHWFSWNVP
>6.245 Mosdl 1 11 LSMNITTVHRWH
>6.141 Mosdl 2 12 VHWDFRQWWQQS
>6.113 Mosdl 3 13 YSFHFEMNMGNY
>6.197 Mosdl 4 14 EHWDFGQWWQQS
>6.255 Mosdl 5 15 GQWDFRQWWQPC
>6.139 Mosdl 6 16 DWSSRVYRDPQT >6.240 Mosd17 17 ERSQWGHRDPQS
>6.257 Mosd18 18 DRSKGDHRITQM
>6.190 Mosd19 19 DLRFSSLWKLSH
>6.167 Mosd20 20 VHWDFRQWWQPS
>6.135 Mosd21 21 FSWSMVMPWPTA
Die Nummer des jeweiligen Phagenklons, aus welchem die Sequenz isoliert wurde ist angegeben mit dem Namen der korrespondierenden Aminosäuresequenz des Peptids, welche im Ein-Buchstaben-Code ebenfalls dargestellt ist, sowie der entsprechenden SEQ ID NO:.
Zu Figur 1 : Für ELISA-Experimente wurden biotinylierte, D-enantiomere Aßi-42- Monomere sowie eine Mischung aus biotinylierten D-enantiomeren Aß-i-42- Oligomeren und -Fibrillen in einer jeweiligen Konzentration von 320 nM auf Strep- tavidin-beschichteten 96-well Mikrotiterplatten immobilisiert. Um eine korrekte Auswertung des folgenden Einzelphagen-ELISA-Experiments gewährleisten zu können, wurde die Effizienz der Immobilisierung mittels eines fa ^-spezifischen Antikörpers (6E10) getestet. Die Absorption bei 450 nm wurde gemessen und auf der Y-Achse aufgetragen. Es wurden auf allen verwendeten Platten (A, B, C) sowohl Aßi-42- Monomere als auch eine Mischung aus Αβι-42-Oligomeren und -Fibrillen immobilisiert, was aus den erhöhten Absorptionswerten im Vergleich zu den Werten der wells hervorgeht, in denen kein Aßi_42 immobilisiert worden ist. Aß1-42-Oligomere und -Fibrillen weisen eine höhere Immobilisierungseffiezienz auf als
Figure imgf000045_0001
Dies bedeutet zum einen, dass die Immobilisierung der verschiedenen Aßi_42- Spezies erfolgreich war. Die Menge des immobilisierten Aßi-42 unterscheidet sich jedoch zwischen den Spezies, so dass für die weitere Auswertung des Experiments (Figur 2) eine Normalisierung der Werte für Aßi-42-Monomere und Aß1-42-Oligomere & -Fibrillen notwendig wird. Zu Figur 2: Amplifizierte Einzelphagenklone wurden auf ihre Bindungsaffinität für immobilisierte Aßi ^-Monomere, Aß1-42-Oligomere und -Fibrillen sowie die Streptavi- din-beschichtete Plastikoberfläche hin untersucht. Die Absorption bei 450 nm wurde gemessen. Von links nach rechts wurden die Klone der Reihenfolge entsprechend Tabelle 1 dargestellt (5.60 - 6.135), gefolgt von weiteren getesteten, aber nicht ausgewählten Klonen (6.262 - 6.85). Die Werte der Y-Achse geben die normalisierten Absorptionswerte der Einzelphagenklone gegen monomers Aßi_42 (schwarz), oligo- meres und fibrilläres Αβ-ι^ (dunkelgrau) und die Streptavidin-beschichtete Plastikoberfläche (hellgrau gestreift) an. Nach Abzug der Werte der Pufferkontrolle wurde, auf Grund der in Figur 1 aufgezeigten Unterschiede in der Immobilisierungseffizienz der unterschiedlichen Aßi-42-Spezies, die Absorption der wells die mit Aß1-42- Oligomeren und -Fibrillen immobilisiert worden sind, auf den Aß^-Gehalt der Aß 42-Monomer-beschichteten wells normalisiert.
Aus den Absorptionswerten wird ersichtlich, dass alle getesteten Phagen bevorzugt an monomeres Aß -42 binden. Alle Phagen weisen höhere Werte für monomeres Aßi. 42 auf als für Aßi-42-Oligomere und -Fibrillen sowie für die Aß1-42-freie Plastikoberfläche. Daraus ist zu schließen, dass mit dem Kompetitionsschritt im hier angewandten Verfahren sowohl eine höhere Spezifität für monomeres Aß1-42 gegenüber Aßi-42- Oligomeren und -Fibrillen erreicht worden ist als auch mit Hilfe der wechselnden Substratoberflächen eine reduzierte Anreicherung von Plastik-, BSA- oder Streptavi- din-bindender Phagen erzielt werde konnte. Klon 5.60, welcher die Peptidsequenz von Mosd enthält, sticht dabei besonders heraus. Der Klon weist nicht nur die höchsten Absorptionswerte für monomeres Aßi- 2 aller getesteten Klone auf. Er zeichnet sich außerdem durch die größte Differenz der Absorptionswerte für mono- meres Aßi_42 zu oligomerem und fibrillärem Aßi-42 aus. Das ist gleichbedeutend mit einer sehr hohen Spezifität für monomeres Αβ-ι^.
Zu Figur 3: Die gemittelte relative Fluoreszenz aus sieben unabhängig durchgeführten ThT-Experimenten mit Standardabweichung ist gegeben. Der Farbstoff Thioflavin T (ThT) bindet an ß-Faltblattstrukturen im Ansatz und ändert daraufhin sein Fluores- zenzspektrum. Im Laufe der Aggregation von Aßi-42 entstehen vermehrt ß-
Faltblattstrukturen, die somit durch einen Anstieg der ThT-Fluoreszenz direkt gemes- sen werden können. Die relative Fluoreszenz einer 10 μΜ Aßi-42-Probe (schwarz) diente als Referenz. Der Zeitpunkt indem der logarithmische Anstieg des Fluoreszenzsignals in eine stationäre Phase übergeht, wurde auf 100 % gesetzt. Der Einsatz equimolarer Konzentrationen verschiedener Peptide beeinflusste die ThT- Fluoreszenz und damit Aggregation und Fibrillenbildung des ebenfalls im Ansatz enthaltenen Αβ-ι^ zu eben diesem Zeitpunkt. Dargestellt sind die relative Fluoreszenzeinheiten für die Coinkubation von Aßi-42 mit Mosd 1 (hellgrau), Mosd2 (dunkelgrau), Mosd3 (grau, diagonal gestreift) und Mosd4 (grau, gepunktet) in equilmolaren Anteilen im Vergleich zu einem Ansatz der nur Aß1- 2 enthielt (schwarz). Während Mosd2 und 3 die ThT-Fluoreszenz am genannten Zeitpunkt erhöhen, ist davon auszugehen, dass diese Peptide die Bildung von ß-Faltblattstrukturen fördern. Dahingegen hat Mosd4 nur einen sehr geringen Einfluss auf die Entstehung von ß- Faltblattstrukturen. Mosdl ist in der Lage, die relative Fluoreszenz, die das Maß für die Anteil an ß-Faltblattstrukturen in der Probe ist, zu reduzieren. Da keines der ge- testeten Peptide in diesem Versuch Eigenfluoreszenz aufweist, ist davon auszugehen, dass die erhöhten Fluoreszenzwerte ausschließlich durch die Entstehung fib- rillären, und damit ß-Faltblattstrukturen enthaltenden, Aß zuzuschreiben ist. Daraus kann geschlossen werden, dass Mosdl den Anteil an fibrillärem Aß reduziert, womöglich durch die Stabilisierung von Aß-Monomeren oder die Bildung großer, ThT- negativer Aggregate. Die Peptide Mosd2 und Mosd3 scheinen die Fibrillierung von Aß hingegen zu beschleunigen. Das ist allerdings nicht zwangsläufig ein negativ zu bewertendes Ergebnis, da die Entstehung fibrillären Aß auch bedeutet, dass Oligo- mere, als notwendige Vorstufe aus dem Gleichgewicht entzogen werden.
Zu Figur 4: Der Einfluss verschiedener Mosd-Peptide auf eine breit gefächerte Mi- schung verschieden großer Aß -42-Spezies wurde mittels Dichtegradientenzentrifuga- tion, Fraktionierung des Gradienten nach Zentrifugation und Analyse der Fraktionen mittels Tris-Tricin-SDS-PAGE und Silberfärbung analysiert.
80 μΜ Aß1- 2 wurde ohne Zugabe von Peptid für 4.5 Stunden bei 600 rpm und 25 °C inkubiert, um ein breites Spektrum unterschiedlicher Aßi ^-Spezies zu erhalten. Anschließend wurde der Ansatz entweder mit oder ohne Zugabe von Peptid für wei- tere 40 Minuten inkubiert und im Anschluss auf einen lodixanol-Dichtegradienten aufgetragen. Der Gradient wurde anschließend zentrifugiert wobei die Inhaltsstoffe der Probe (verschieden große Aßi ^-Spezies) entsprechend ihrer Größe und Form in den Gradienten diffundieren. Der Gradient wird nach der Zentrifugation in 15 Fraktio- nen fraktioniert (1-15) und die ersten 14 einzelnen Fraktionen auf ein Tris-Tricin- SDS-Gel aufgetragen. Die Trennung der Inhaltsstoffe pro Fraktion erfolgte elektro- phoretisch. Die Banden der denaturierten Proteine (Aßi-42 bei 4.5 kDa, siehe Marker (M)) wurden mittels Silberfärbung sichtbar gemacht. Die Methode erlaubt keine quantitative Analyse, die Stärke des Signals korreliert jedoch mit der Konzentration der Proteine, so dass ein stärkeres Signal in der Regel auf eine höhere Proteinkonzentration hinweist.
Der Einfluss der Peptide Mosd1-4 in einer Konzentration von 40 μΜ wurde untersucht. Das Bild zeigt im obersten Abschnitt die Verteilung der Aßi-42-Spezies ohne Coinkubation mit Peptid. Ein breites Spektrum verschieden großer Aß1-42-Spezies befindet sich in der Probe. Die Peptide Mosd1/2 und 3 erhöhen die Anteile an hochmolekularen Aß1-42-Spezies (Fraktionen 10-14) und reduzieren vor allem die oligome- ren Aßi ^-Spezies (Fraktionen 4-7), die als toxisch gelten.
Zu Figur 5: Der Einfluss unterschiedlicher Konzentrationen von Mosdl auf eine breit gefächerte Mischung verschieden großer
Figure imgf000048_0001
wurde mittels Dichtegradi- entenzentrifugation, Fraktionierung des Gradienten nach Zentrifugation und Analyse der Fraktionen mittels Tris-Tricin-SDS-PAGE und Silberfärbung analysiert.
80 μΜ Aß -42 wurde ohne Zugabe von Peptid für 4.5 Stunden bei 600 rpm und 25 °C inkubiert, um ein breites Spektrum unterschiedlicher
Figure imgf000048_0002
zu erhalten.
Anschließend wurde der Ansatz entweder ohne (A) oder mit Zugabe von unter- schiedlichen Konzentrationen Mosdl (B = 10 μΜ Mossdl ; C = 20 μΜ Mosdl ; D = 40 μΜ Mosdl ; E = 80 μΜ Mosdl) für weitere 40 Minuten inkubiert und im Anschluss auf einen lodixanol-Dichtegradienten aufgetragen. Der Gradient wurde anschließend zentrifugiert wobei die Inhaltsstoffe der Probe (verschieden große Aßi ^-Spezies) entsprechend ihrer Größe und Form in den Gradienten diffundieren. Der Gradient wird nach der Zentrifugation fraktioniert (1-15) und die einzelnen Fraktionen auf ein Tris-Tricin-SDS-Gel aufgetragen. Die Trennung der Inhaltsstoffe pro Fraktion erfolgte elektrophoretisch. Die Banden der denaturierten Proteine (Aß1-42 bei 4.5 kDa, siehe Marker (M)) wurden mittels Silberfärbung sichtbar gemacht. Die Methode erlaubt keine quantitative Analyse, die Stärke des Signals korreliert jedoch mit der Konzent- ration der Proteine, so dass ein stärkeres Signal in der Regel auf eine höhere Proteinkonzentration hinweist.
Der Einfluss verschiedener Konzentrationen des Peptids Mosdl wurde untersucht. Das Bild zeigt im obersten Abschnitt (A) die Verteilung der Aßi-42-Spezies ohne Coinkubation mit Peptid. Ein breites Spektrum verschieden großer
Figure imgf000049_0001
befindet sich in der Probe. Die Modulation der Aß1-42-Spezies durch Mosdl ist konzentrationsabhängig (B-E). Niedrige Konzentrationen (B & C) von Mosdl verändern die Zusammensetzung der Aßi-42-Spezies nur geringfügig, jedoch verringern sie den Anteil toxischer Oligomere (Fraktionen 4-7) im Vergleich zur unbehandelten Αβι^- Probe und erhöhen den Anteil hochmolekularer Aggregate. Höhere Konzentrationen von Mosdl (D & E) reduzieren den Anteil kleiner Aß1- 2-Spezies und toxischer Oligomere deutlich und führen zu einer Modulation der Aß1-42-Spezies hin zu hochmolekularen Aggregaten.
Mosdl ist in der Lage, vorhandene toxische Aß-Oligomere aus dem Pool verschiedener Aß-Spezies zu entfernen und die Entstehung nicht toxischer, hochmolekularer Aggregate zu fördern. Dieser Prozess ist konzentrationsabhängig. Schon der Einsatz von 20 μΜ Mosdl verringert die Signalstärke der Oligomerbanden und verstärkt das Signal der Aß-Banden in den Fraktionen 11-14 im Vergleich zu unbehandeltem Aß. Höhere Konzentrationen verstärken diesen Effekt, sorgen jedoch auch für einen Abfall der Signalstärke in den Fraktionen 1-2, die mit monomerem Aß korrespondie- ren.
Zu Figur 6: Der Einfluss unterschiedlicher Konzentrationen von Mosdl auf eine breit gefächerte Mischung verschieden großer Aß1-42-Spezies wurde mittels Dichtegradi- entenzentrifugation, Fraktionierung des Gradienten nach Zentrifugation und Analyse der Fraktionen mittels Tris-Tricin-SDS-PAGE und Silberfärbung analysiert (Figur 5). Proben jeder Fraktion aus dem in Figur 5 gezeigten Experiment wurden mit mittels reversed-phase HPLC aufgetrennt und quantifiziert. Hierfür wurden die Proben in einer mobilen Phase (30% (v/v) Acetonitril, 0.1 % (v/v) TFA in ddH20) über eine Zorbax 300SB-C8-Säule bei erhöhter Säulentemperatur (80 °C) denaturiert und aufgetrennt. Für jede Fraktion wurden Proben aus 3 unabhängig voneinander durch- geführten Experimenten gemittelt und die Standardabweichung errechnet. Die Ergebnisse korrespondieren mit den Ergebnissen der Gelbilder der Figur 5 und erlauben die quantitative Analyse der Daten. Fraktion 15 entspricht dem Pellet nach Dich- tegradienten-Zentrifugation und enthält ebenfalls geringe Mengen Aßi-42.
Die Daten der quantitativen Analyse der Proben mittels RP-HPLC bestätigen die qualitativen Aussagen aus Figur 5. Die Konzentrationen von Aß in den Fraktionen, die die toxischen Oligomere enthalten sinken bei steigender Konzentration von Mosdl . Ebenso steigt die Konzentration von hochmolekularen Aß-Spezies (Fraktionen 11-14) gleichzeitig an.
Zu Figur 7: Die vorangegangenen Experimente weisen darauf hin, dass Co- Inkubation von Αβι^ mit Mosd-Peptiden, im konkreten Fall Mosdl , zu einer Modulation der Aßi-42-Aggregation hin zu hochmolekularen Aggregaten führt. Zur weiteren Analyse wurde deshalb 10 μΜ Aß1- 2 mit und ohne 10 μΜ Mosdl für 24 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert und anschließend auf ein Formvar/Kohlenstoff-Kupfergrid immobilisiert und mit Uranylacetat angefärbt. Die anschließende Analyse via TEM (120 kV) zeigte fibrilläre Strukturen (linkes Bild), wenn Aß -42 ohne Mosdl inkubiert worden war. Die Co-Inkubation mit Mosdl führte zur Entstehung großer, hochmolekularer Aggregate, die sich deutlich von den fibrillären Strukturen unterschieden (rechtes Bild). Die Maßstabsbalken entsprechen 0.25 pm.
Zu Figur 8: Der Einfluss von Aßi-42 auf die Lebensfähigkeit von PC-12-Zellen wurde getestet. Eine Mischung verschiedener Aß1-42-Spezies (Herstellung siehe Figur 4) wurde zu PC-12 Zellen gegeben. Zusätzlich wurden, wie in Figur 4 beschrieben, Ansätze von Aß^ mit verschiedenen Konzentrationen Mosdl co-inkubiert sowie ein Ansatz der nur Mosdl enthielt, getestet. Die Endkonzentrationen pro well betrugen 1 μΜ Aßi.42 beziehungsweise 1 oder 0.5 μΜ Mosdl Die Proben wurden ins Kultur- medium der Zellen gegeben und über 24 Stunden mit den Zellen bei 37 °C inkubiert. Anschließend erfolgte die Bestimmung der Lebensfähigkeit der Zellen anhand eines MTT-Versuchs. Hierbei wird den Zellen ein Stoffwechsel-Ed ukt zugeführt, welches von metabolisch aktiven Zellen (lebendige Zellen) umgesetzt werden kann. Das Produkt dieser Umsetzung sind farbige Formazan-Kristalle, die aufgelöst werden können. Die Färbung des Mediums nach Solubilisierung entspricht der Umsetzungsrate des Edukts und damit der Lebensfähigkeit der Zellen. Unbehandelte Zellen (medium, weiß kariert) dienten als Lebendkontrolle und der Anteil vitaler Zellen wurde als 100% definiert. Die Werte der anderen Ansätze wurden auf diesen Wert normalisiert. Die Behandlung mit 0.1% TritonX-100 diente als Positivkontrolle für Zelltoxizität (hell- grau), die Menge lebensfähiger Zellen betrug in diesem Ansatz lediglich 1.5%. Die Mischung verschiedener Aßi-42-Spezies enthielt, wie vermutet, auch toxische Spezies, so dass sich durch Inkubation der Zellen mit der Aß1-42-Mischung die Zahl lebendiger Zellen auf 45% verringerte (schwarz). Mosdl hat keinen Einfluss auf die Lebensfähigkeit von PC-12 Zellen. Co-Inkubation von Aß1-42 und Mosdl jedoch ver- ringert die Toxizität von Aßi-42 konzentrationsabhängig (grau (1 μΜ Mosdl) und dunkelgrau (0.5 μΜ Mosdl)). 86% beziehungsweise 66% der Zellen überleben, wenn die Aßi.42-Mischung vor Zugabe zu den Zellen mit Mosdl co-inkubiert wird.
Dies zeigt, dass Mosdl in der Lage ist, toxische Aggregate in hochmolekulare, nichttoxische Aß - 2-Spezies umzuwandeln oder die toxischen Aßi ^-Spezies aufzulösen. Zu Figur 9: Die murine Neuroblastom-Zelllinie Neuro-2a dient als Modell für neuronale Zellen und ist damit geeignet die Symptome von AD zu analysieren. Die stabile Transfektion von Neuro-2a-Zellen mit humanem APP695 erlaubt außerdem ein Modell, welches humanes APP (amyloid precursor protein) und all seine Prozessie- rungsprodukte, unter anderem das toxische Aßi-42, in der Zelle selbst produziert. Auf diese Weise kann der Einfluss natürlich entstandener Aßi ^-Spezies direkt in neuronalen Zellen untersucht werden. Im Experiment wurden Neuro-2a-Zellen ohne APP parallel zu solchen mit der APP-Transfektion kultiviert. Die Produktion von APP und seinen Prozessierungsprodukten zeigt abgerundete und vereinzelte Zellen, die untereinander nur wenig Kontakte ausbilden (linkes Bild). Durch Inkubation mit 10 μΜ oder 100 μΜ Mosdl kann dieser pathologische Phänotyp jedoch umgekehrt werden und die Zellen entwickeln sich entsprechend des physiologischen Phänotyps, der wildtypischen Neuro-2a-Zellen entspricht. Das bedeutet, die Zellenzahl steigt und die Zellen akkumulieren, haben eine polygone Gestalt und bilden zahlreiche Zellkontakte und Ausläufer (mittleres und rechtes Bild).
Dies beweist, dass Mosdl nicht nur in der Lage ist, toxische Aßi-42-Spezies ab- oder umzubauen, sondern es kann auch die Bildung toxischer Spezies verhindern.
Die für Mosdl gezeigten Ergebnisse sind auch für die Peptide und Polymere der SEQ ID NO: 2-21 zu erwarten. Die in den Ausführungsbeispielen gezeigten Ergebnisse sind daher analog auch für die Peptide nach allen SEQ ID NO: 1-21 als auch generell für Peptide die mit dem erfindungsgemäßen Verfahren, das heißt dem modi- fizierten Spiegelbildphagendisplay erhalten werden.
Es sei an dieser Stelle darauf verwiesen, dass das angewendete Spiegelbildphagendisplay genauso in die andere Richtung, das heißt zur Identifikation von Liganden an A-Beta-Oligomere ausgeführt werden kann, indem als Köder A-Beta-Oligomere und als Kompetitoren A-Beta-Monomere und/oder A-Beta-Fibrillen eingesetzt werden. Außerdem ist das erfindungsgemäße Spiegelbildphagendisplay selbstverständlich auch auf andere Köder-Kompetitoren-Paare anwendbar.

Claims

P a t e n t a n s p r ü c h e
1. Spezifisch eine Amyloid-Beta-Spezies bindendes Peptid enthaltend mindestens eine Aminosäuresequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO. 10, SEQ ID NO. 11 , SEQ ID NO. 12, SEQ ID NO. 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20 und/oder SEQ ID NO: 21 sowie Homologe, Fragmente und Teile davon sowie Polymere der SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO. 10, SEQ ID NO. 11 , SEQ ID NO. 12, SEQ ID NO. 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20 und/oder SEQ ID NO: 21 sowie Homologe, Fragmente und Teile davon.
2. Peptid nach Anspruch 1 ,
dadurch gekennzeichnet, dass
es im Wesentlichen aus D-Aminosäuren besteht.
3. Peptid nach Anspruch 1 oder 2,
gekennzeichnet dadurch, dass dieses
in zyklisierter Form vorliegt.
4. Peptid nach einem der vorangehenden Ansprüche zur Verwendung in der
Medizin.
5. Peptid nach einem der vorangehenden Ansprüche zur Behandlung oder
Prävention der Morbus Alzheimer.
6. KIT, enthaltend ein Peptid nach einem der Ansprüche 1 bis 5.
7. Zusammensetzung enthaltend ein Peptid nach einem der Ansprüche 1 bis 5.
8. Verwendung eines Peptids nach einem der Ansprüche 1 bis 5 als Sonde zur spezifischen Identifizierung, quantitativen und/oder qualitativen Bestimmung von Amyloid-Beta-Monomeren, Amyloid-Beta-Fibrillen und/oder Amyloid-Beta- Oligomeren.
9. Verwendung eines Peptids nach einem der Ansprüche 1 bis 5 zur Verhinderung von Amyloid-Beta-Oligomeren und/oder Amyloid-Beta-Peptidaggregaten.
10. Verwendung eines Peptids nach einem der Ansprüche 1 bis 5 zur
Enttoxifizierung von toxischen Amyloid-Beta-Oligomeren und/oder Aggregaten.
11. Verwendung nach Anspruch 10 dadurch gekennzeichnet, dass Amyloid-Beta- Oligomere und/oder Aggregate durch ein Peptid nach einem der Ansprüche 1 bis 5 zu Monomeren und / oder nicht toxischen Aggregaten umgewandelt werden.
12. Verwendung der Peptide SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO. 10, SEQ ID NO. 11 , SEQ ID NO. 12, SEQ ID NO. 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20 und/oder SEQ ID NO: 21 sowie Homologe, Fragmente und Teile davon sowie Polymere der SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO. 10, SEQ ID NO. 11 , SEQ ID NO. 12, SEQ ID NO. 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20 und/oder SEQ ID NO: 21 sowie Homologe, Fragmente und Teile davon zur spezifischen Bindung an A-Beta- Monomere.
13. Verwendung des Peptids nach einem der Ansprüche 1 bis 5 als Therapeutikum und zur Prävention von Morbus Alzheimer.
14. Verfahren zur Identifizierung von spezifisch an einen Köder bindenden
Liganden mit den Schritten: a) Bereitstellen eines immobilisierten Köders auf einem Substrat. b) In Kontakt bringen des als Köder fungierenden immobilisierten Moleküls mit einer Lösung, die eine Bibliothek von Molekülen enthält. c) In Kontakt bringen der mit den Molekülen besetzten immobilisierten Köder mit mindestens einem Kompetitor als Spezifitätswaschschritt. d) Trennung und Vermehrung der nach dem in Kontakt bringen der mit den Molekülen besetzten immobilisierten Köder mit Kompetitoren weiterhin an den Köder gebundenen Moleküle. e) Wiederholung der genannten Schritte, wobei bei jeder Wiederholung ein unterschiedliches Substrat verwendet wird, f) Identifizierung der Struktur der nach der Wiederholung auf den Köder verbleibenden Moleküle.
15. Verfahren nach vorherigem Anspruch 14,
gekennzeichnet dadurch, dass
bei jeder Wiederholung eine unterschiedliche Substratart verwendet wird und / oder ein Blocking oder Nichtblockingreagenz eingesetzt wird.
16. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche 14 oder 15,
gekennzeichnet durch
Polystyrol, Polypropylen und / oder Polycarbonat als Substrat.
17. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche 14 bis 16,
dadurch gekennzeichnet, dass
A-Beta-Monomer als Köder und A-Beta-Oligomer und/oder A-Beta-Fibrillen als Kompetitor verwendet wird, oder umgekehrt. Spezifisch an einen Köder, z. B. an eine A-Beta-Spezies bindender Ligand, insbesondere ein Peptid, identifiziert mit dem Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche 14 bis 17.
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