CH695467A5 - Verfahren zum Screenen von Verbindungen, die als wirksame Bestandtteile von prophylaktischen oder therapeutischen Wirkstoffen für neurodegenerative Krankheiten nützlich sind. - Google Patents

Description

CH 695 467 A5

Beschreibung Technisches Gebiet

[0001] Die Erfindung der vorliegenden Anmeldung bezieht sich auf ein Verfahren zum Screenen von Verbindungen, die als die wirksamen Komponenten in prophylaktischen oder therapeutischen Arzneien für neurodegenerative Krankheiten nützlich sind, und auf ein Screening-Kit, das dieses Verfahren verwendet. Insbesondere bezieht sich die Erfindung auf ein Verfahren zum Screenen von Verbindungen, die die Bindung bekannter aberranter, neurodegenerative Krankheiten bewirkender Proteine an valosin-enthaltendes Protein (VCP) inhibieren, wodurch Verbindungen, die als die wirksamen Komponenten von prophylaktischen oder therapeutischen Arzneien für neurodegenerative Krankheiten nützlich sind, identifiziert werden. Die Erfindung bezieht sich des Weiteren auf ein Screening-Kit, das auf diesem Verfahren beruht.

Stand der Technik

[0002] Neurodegenerative Krankheiten wie etwa Parkinsonsche Krankheit, Alzheimer-Krankheit, Huntingtonsche Chorea und die Machado-Joseph-Krankheit treten bei jeder dieser Krankheiten in einer Häufigkeit von einer Person unter zehntausend bis dreissigtausend auf. Allein in Japan wurde die Existenz von über hunderttausend Patienten (eine Person von 1200) bestätigt (Ministerium für Gesundheit; «Journal of Health and Weifare Statistics», 1996). Daher wurde viel Aufwand für die Untersuchung präventiver und therapeutischer Verfahren betrieben (Boriongan, C.V., Koutouzis, T.K., Sanberg, P.R., Neurosci. Biobehav. Rev. 21, 289-93 [1997]; Parnetti, L., Senin, U., Mecocci, P, «The Way For-ward», Drugs 53, 752-68 [1997]; Pasinetti, G.M., Neurobiolog. Aging 17, 707-16 [1996]). Die Studien haben gezeigt, dass neurodegenerative Krankheiten einen gemeinsamen Phänotypen aufweisen. Dies bedeutet, dass bestätigt wurde, dass die Aggregation und Akkumulation aberranter Proteine, die distinktive Eigenschaften wie etwa eine verlängerte Glutaminkette, eine abnormale Konformation, Resistenz gegen Proteasen, die ß-Faltblattstruktur u.a. aufweisen, die Bildung von Vakuolen und den Zelltod von Zellen bewirken (Kakizuka, A., Trends Genet. 14, 396-402 [1998]).

[0003] Der ursprüngliche Grund, der mit der Induktion der Aggregation und Akkumulation solcher aberranter Proteine zu tun hat, die dann die Bildung von Vakuolen und den Zelltod bewirken, muss erst noch entdeckt werden, und dadurch wird die Forschung und Entwicklung von Mitteln und Prophylaktika für neurodegenerative Krankheiten verzögert.

[0004] Den Erfindern der vorliegende Anmeldung ist es mit beharrlicher Arbeit gelungen, denjenigen Faktor zu identifizieren, der den solchen neurodegenerativen Krankheiten gemeinsamen Phänotypen induziert, und sie haben gefunden, dass der Faktor valosin-enthaltendes Protein (VCP) ist.

[0005] VCP, ein Protein der Sammelgruppe der AAA-Proteine (ATPase assoziiert mit verschiedenen zellulären Aktivitäten), und das allgemein in Organismen vorkommt, die von eukaryotischen Zellen bis zum Menschen reichen, weist eine schwache ATPase-Aktivität auf, und es wurde von ihm vermutet, dass es in verschiedenen Zellfunktionen, insbesondere in der Signaltransduktion, involviert ist (Muller, J.M., Meyer, H.H., Ruhrberg, C, Stamp, G.W., Warren, G., Shima, D.T., J. Biol. Chem. 274, 10154-10162 [1999]; Zhang, L., Ashendel, C.L., Becker, G.W., Morre, D.J., J. Cell. Biol. 127, 1871-1883 [1994]). Von VCP war es jedoch nicht bekannt, dass es ein Faktor ist, der über die Bindung an aberrante Proteine neurodegenerative Krankheiten induziert.

[0006] Aufgrund dieses neuen Befundes wird erwartet, dass durch Bereitstellung eines Verfahrens zum Screenen von Verbindungen, die die Bindung von VCP und aberrantem Protein inhibieren, Verbindungen erhalten werden können, die allgemein als therapeutische oder prophylaktische Arzneien für sowohl spezifische Krankheiten als auch für eine Reihe von neurodegenerativen Krankheiten wirksam sind.

[0007] Die Erfindung der vorliegenden Anmeldung wurde in Anbetracht der oben beschriebenen Situation gemacht, und ihr Gegenstand ist es, die Probleme des Standes der Technik zu lösen und ein Verfahren zum Screenen von Verbindungen, die als wirksame Bestandteile in prophylaktischen oder therapeutischen Arzneien nützlich sind, zur Verfügung zu stellen.

Offenbarung der Erfindung

[0008] Um die oben erwähnten Probleme zu lösen stellt die vorliegende Erfindung zunächst ein Verfahren zum Screenen von Verbindungen bereit, die als wirksame Komponenten von prophylaktischen oder therapeutischen Arzneien für neurodegenerative, durch Bindung eines aberranten Proteins und eines valosin-enthaltenden Proteins bewirkten Krankheiten nützlich sind, wobei dieses Verfahren umfasst: Zur-Koexistenz-Bringen des aberranten Proteins und des valosin-enthaltenden Proteins und der Kandidatenverbindung; und Identifizieren der Verbindung, die inhibierende Wirkung auf die Bindung des aberranten Proteins und des valosin-enthaltenden Proteins zeigt.

[0009] Zweitens stellt die vorliegende Erfindung das obige Verfahren zum Screenen von Verbindungen bereit, wobei das aberrante Protein ein Protein ist, das eine verlängerte Glutaminkette enthält; drittens stellt die vorliegende Erfindung das obige Verfahren zum Screenen von Verbindungen bereit, wobei das aberrante Protein eine abnormale Konformation enthält; viertens stellt die vorliegende Erfindung das obige Verfahren zum Screenen bereit, wobei das aberrante Protein ein proteasebeständiges Protein ist; und fünftens stellt die vorliegende Erfindung das obige Verfahren zum Screenen einer Verbindung bereit, wobei das aberrante Protein eine ß-Faltblattstruktur enthält.

[0010] Des Weiteren stellt die vorliegende Erfindung sechstens das oben beschriebene Verfahren zum Screenen von Verbindungen bereit, wobei das aberrante Protein und das valosin-enthaltende Protein und die Kandidatenverbindung durch Mischen in einer Lösung zur Koexistenz gebracht werden; die vorliegende Erfindung stellt siebtens das obige Ver2

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fahren zum Screenen einer Verbindung bereit, wobei das aberrante Protein und das valosin-enthaltende Protein und die Kandidatenverbindung in einer kultivierten Zelle zur Koexistenz gebracht werden; die vorliegende Erfindung stellt achtens das Verfahren zum Screenen einer Verbindung bereit, wobei das aberrante Protein und das valosin-enthaltende Protein und die Kandidatenverbindung durch Verabreichung jeder Komponente an ein Tier zur Koexistenz gebracht werden.

[0011] Des Weiteren stellt die vorliegende Erfindung neuntens das obige Verfahren zum Screenen von Verbindungen bereit, wobei die inhibierende Wirkung detektiert wird, indem das nicht-markierte Protein auf einem Träger immobilisiert wird; das aberrante Protein und das valosin-enthaltende Protein in Anwesenheit der Kandidatenverbindung miteinander in Kontakt gebracht werden; und das durch das markierte Protein auf dem immobilisierten Träger erzeugte Signal detektiert wird.

[0012] Die vorliegende Erfindung stellt auch zehntens ein Kit zum Screenen von Verbindungen, die als wirksame Komponenten von prophylaktischen oder therapeutischen Arzneien für neurodegenerative, durch Bindung eines aberranten Proteins und eines valosin-enthaltenden Proteins bewirkten Krankheiten nützlich sind, bereit, wobei dieses Kit umfasst: Einen Träger auf dem das valosin-enthaltende Protein immobilisiert wird, und ein markiertes aberrantes Proteinreagens.

[0013] Schlussendlich stellt die vorliegende Erfindung elftens ein Kit zum Screenen von Verbindungen bereit, die als wirksame Komponenten von prophylaktischen oder therapeutischen Arzneien für neurodegenerative, durch Bindung eines aberranten Proteins und eines valosin-enthaltenden Proteins bewirkten Krankheiten nützlich sind, wobei dieses Kit umfasst: ein markiertes valosin-enthaltendes Proteinreagens; und einen Träger, auf dem das aberrante Protein immobilisiert wird.

Kurze Beschreibung der Figuren

[0014]

Fig. 1 ist eine Mikrophotographie der Fluoreszenz und eine optische Mikrophotographie, die die Lokalisierung des

VCP und des in den PC12-Zellen exprimierten Polyglutamins zeigen, wobei diese das mit Flag markierte Poly-glutamin mit 79 Repeats (Q79) durch Entfernen von Tetracyclin im Beispiel der vorliegenden Erfindung expri-mieren.

1: Intrinsisches VCP-Protein in den PC12-Zellen, (a) Fluoreszenz-Mikrophotographie, (b) optische Mikrophotographie.

2: Fluoreszenz-Mikrophotographie 48 Stunden nach Entfernung des Tetracyclins, (a) intrinsisches VCP mit einem Anti-VCP-Antikörper markiert (zweiter Antikörper = FITC-markierter Antikaninchen-Antikörper) in PC12/Q79; (b) Polyglutamin mit Anti-Flag-Antikörper markiert (zweiter Antikörper = mit Texasrot markierter An-timaus-Antikörper) und der DAPI-gefärbte Kern in PC12/Q79; (c) Überlagerung des intrinsischen VCP, markiert mit einem Anti-VCP-Antikörper (zweiter Antikörper = FITC-markierter Antikaninchen-Antikörper) und des Polyglutamins, markiert mit einem Anti-Flag-Antikörper (zweiter Antikörper = mit Texasrot markierter Antimaus-An-tikörper) in PC12/Q79; (d) optische Mikrophotographie von PC12/Q79.

3: Fluoreszenz-Mikrophotographie 96 Stunden nach der Entfernung von Tetracyclin, (a) intrinsisches VCP, markiert mit einem Anti-VCP-Antikörper (zweiter Antikörper = FITC-markierter Antikaninchen-Antikörper) in PC12/Q79; (b) Polyglutamin markiert mit einem Anti-Flag-Antikörper (zweiter Antikörper = mit Texasrot gefärbter Antimaus-Antikörper) und der DAPI-gefärbte Kern in PC12/Q79; (c) Überlagerung des intrinsischen VCP, markiert mit einem Anti-VCP-Antikörper (zweiter Antikörper = FITC-markierter Antikaninchen-Antikörper) und des Polyglutamins, markiert mit einem Anti-Flag-Antikörper (zweiter Antikörper = mit Texasrot gefärbter Antimaus-Antikörper) in PC12/Q79; (d) optische Mikro-Photographie von PC12/Q79.

Fig. 2 zeigt die Ergebnisse einer Autoradiographie zur Bestätigung, ob die Inhibition der Bindung von MJDQ79 und VCP auftritt, wenn im Beispiel der vorliegenden Erfindung ein Begleitprotein (Hsp70 oder HJD-2) mit VCP und GST-MJDQ-7 koexistiert, (a) Interaktion von GST-MJDQ79 und VCP, wenn die Menge an Hsp70 oder HJD-2, das mit GST und GST-MJDQ79 koexistiert, geändert wurde; wobei die Zugabe an VCP, Hsp70 und HJD-2 mit 1 angegeben ist. (b) Eine Darstellung, die die Spuren 7, 8, 9, 11 und 12 von Fig. 2a (Interaktion von VCP mit GST-MJDQ79) numerisch wiedergibt, (c) Interaktion von GST-VCP mit MJDQ79, wenn die Menge an Hsp70 oder HJD-2, das mit GST und GST-VCP koexistiert, geändert wurde; wobei die Zugabe an MJDQ79, Hsp70 und HJD-2 mit 1 angegeben ist. (d) Eine Darstellung, die die Spuren 10, 11 und 12 von Fig. 2c (Interaktion von GST-VCP mit MJDQ79) numerisch wiedergibt.

Fig. 3 zeigt die Ergebnisse einer Autoradiographie, die die Bindung eines Vorläuferproteins des amyloiden ß-Proteins und VCP im Beispiel der vorliegenden Erfindung anzeigt.

Fig. 4 zeigt eine Mikrophotographie der Lewy-Körper in DLB, die im Beispiel der vorliegenden Erfindung mit einem Anti-VCP-Antikörper markiert wurden (Ii).

Fig. 5 zeigt eine Mikrophotographie von ubiquitin-positiven nuklearen Einschlusskörpern, die im Beispiel der vorliegenden Erfindung markiert wurden, (a) mit Anti-Ubiquitin-Antikörper markiert; (b) mit Anti-VCP-Antikörper markiert.

Beste Art, die Erfindung auszuführen

[0015] Die Erfinder der vorliegenden Anmeldung haben durch beharrliche Arbeit gezeigt, dass neurodegenerative

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Krankheiten durch die Bindung eines aberranten Proteins an ein valosin-enthaltendes Protein (VCP) induziert wird, was die Degeneration und den Abbau von Nervenzellen bewirkt, und haben das Verfahren der vorliegenden Erfindung zum Screenen von Verbindungen, die als wirksame Komponenten in prophylaktischen oder therapeutischen Arzneien für neurodegenerative Krankheiten nützlich sind, vervollständigt.

[0016] In der Erfindung der vorliegenden Anmeldung bedeutet der Begriff «aberrantes Protein» Proteine, die sich in den Nervenzellen aggregieren und akkumulieren, wodurch Vakuolisierung und Zelltod bewirkt wird. Aberrante Proteine sch-liessen beispielsweise Proteine, die eine verlängerte Glutaminkette enthalten, Proteine, die eine abnormale Konformation enthalten, Proteine, die proteasebeständig sind, und Proteine mit einer ß-Faltblattstruktur ein.

[0017] Das Verfahren der vorliegenden Erfindung zum Screenen von Verbindungen umfasst das Zur-Koexis-tenz-Bringen eines beliebigen aberranten Proteins, einer Kandidatenverbindung und von VCP, und das Bestätigen, ob die Bindung des aberranten Proteins und des valosin-enthaltenden Proteins inhibiert wird oder nicht, wodurch die Verbindung, die die wirksame Komponente in prophylaktischen oder therapeutischen Arzneien für neurodegenerative Krankheiten werden könnte, gescreent wird.

[0018] Bei diesem Screening-Verfahren ist die Art, wie das aberrante Protein, VCP und die Kandidatenverbindung zur Koexistenz gebracht werden, nicht besonders kritisch. Es können beispielsweise ein aberrantes Protein und VCP in einer Lösung in Anwesenheit der Kandidatenverbindung gemischt werden, was sie in der Lösung zur Koexistenz bringt, oder es kann jede Komponente in Hefe oder kultivierten Zellen (einschliesslich Bakterien) inkubiert und zur Koexistenz gebracht werden. Ausserdem kann VCP in einem transgenen Tier (Wirbeltier, Nematode, Drosophila usw.), in dem ein aberrantes Protein exprimiert wird, zur Koexistenz gebracht werden, und es kann eine Kandidatenverbindung dazugegeben werden. Die Bedingungen für die Koexistenz wie etwa die Temperatur, Konzentration, pH, Zeit, usw., sind nicht besonders kritisch, solange die Bedingungen genügen, um die Bindung des aberranten Proteins an VCP und die wirksame Inhibition der Bindung durch die Kandidatenverbindung zu ermöglichen. Insbesondere ist ein beispielhaftes Verfahren, bei dem die Kandidatenverbindung über verschiedene Wege in Zellen, in denen ein aberrantes Protein und VCP koexistieren, eingeführt wird, bevorzugt.

[0019] Das Verfahren zum Bestätigen, ob die Bindung des aberranten Proteins und VCP durch eine Kandidatenverbin-dung inhibiert wird oder nicht, ist ebenfalls nicht besonders kritisch. Es kann beispielsweise ein Verfahren angewendet werden, bei dem das aberrante Protein mit einem Marker wie etwa His oder Flag oder mit Radioisotopen wie etwa 35S markiert und während einer bestimmten Zeit mit auf einem Träger immobilisiertem VCP zusammengebracht wird, wonach die Anwesenheit des markierten Signals auf dem Träger bestätigt wird, oder ein Verfahren, worin das markierte aberrante Protein und VCP gemischt und inkubiert werden, wonach die Mischung durch eine Säule geleitet wird, auf der eine spezifisch an VCP bindende Verbindung immobilisiert ist, und die Anwesenheit des markierten Signals auf der Säule oder im Eluat bestätigt wird. Des Weiteren kann als Beispiel ein Verfahren zur Bestimmung, ob die Inhibition der Bindung durch eine Kandidatenverbindung eintritt, angeführt werden, bei welchem Verfahren das Auftreten der Vakuolisierung bei Koexistenz von VCP und der Kandidatenverbindung im Cytoplasma von Zellen, die ein aberrantes Protein (beispielsweise PC12/Q79: Yasuda, S., Inoue, K., Hirabayashi, M., Higashiyama, H., Yamamoto, Y., Fuyuhiro, H., Ko-mure, O., Tanaka, F., Sobue, G., Tsuchiya, K., Hamada, K., Sasaki, H., Takeda, K., Ichijo, H., Kakizuka, A., Genes Cells 4, 743-756 [1999]) exprimieren, überprüft wird; sowie ein Verfahren zur Bestimmung der Nützlichkeit eines Kandidaten durch Beobachtung der Anwesenheit der Vakuolisierung, der Lokalisierung des aberranten Proteins und von VCP in Zellen, oder der Änderung im Fluoreszenz-Resonanz-Energietransfer (FRET), wenn VCP markiert mit einem fluoreszierenden Protein wie etwa GFP, YFP, CFP, usw., die Zellen, die das aberrante Protein exprimieren, und die Kandidatenverbindung koexistieren.

[0020] In dem Verfahren zum Screenen von Verbindungen der vorliegenden Erfindung können experimentelle Techniken wie sie in der Biochemie allgemein bekannt sind, einschliesslich des GST-Pull-Down-Assays und des Hefe-Two-Hybrid-Verfahrens, eingesetzt werden. Des Weiteren ist BIACore, bei dem das Ausmass der Bindung durch Messen der Oberflächen-Plasmonresonanz bestimmt werden kann, beim Screenen von grossen Mengen von Proben bevorzugt. Die erfindungsgemässe Verfahren zum Screenen von Verbindungen sind jedoch nicht auf die obigen Beispiele beschränkt, solange die Inhibition der Bindung eines aberranten Proteins mit VCP durch eine Kandidatenverbindung in der Koexistenz des aberranten Proteins, VCP und der Kandidatenverbindung festgestellt werden kann.

[0021] Wie oben beschrieben umfasst in der Erfindung der vorliegenden Anmeldung das Verfahren zum Screenen einer Verbindung, die als die wirksame Komponente von prophylaktischen oder therapeutischen Arzneien für neurodegenera-tive Krankheiten nützlich sind, das Bestätigen der Inhibition der Bindung eines aberranten Proteins mit VCP in der Koexistenz des aberranten Proteins, VCP und einer Kandidatenverbindung. Das oben beispielhaft beschriebene Verfahren kann unter allen Bedingungen unter Verwendung aller Zellen, Reagentien, Konzentrationen, Temperaturen, pHs, usw. durchgeführt werden.

[0022] In dem erfindungsgemässen Verfahren zum Screenen von Verbindungen kann die zu screenende Kandidatenverbindung ein natürlich vorkommendes Material wie etwa Proteine, Aminosäuren, usw. sowie künstlich synthetisierte Polypeptide und eine Vielzahl von bekannten und neuen Verbindungen wie etwa Polymere und Verbindungen von niederem Molekulargewicht sein.

[0023] Zusätzlich zu dem obigen Verfahren zum Screenen von Verbindungen stellt die vorliegende Erfindung auch ein Kit zum Screenen von Verbindungen, die als die wirksame Komponente von prophylaktischen oder therapeutischen Arzneien in neurodegenerativen Krankheiten nützlich sind, bereit. Es kann eine Vielzahl von Kits in Betracht gezogen werden; solche, die einen Träger mit immobilisiertem VCP und einem markierten aberranten Protein werden als Beispiele genannt.

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[0024] In einem solchen Kit wird eine Kandidatenverbindung, von der erwartet wird, dass sie die Bindung von VCP und dem aberranten Protein inhibiert, mit einem markierten aberranten Proteinreagens gemischt; die Mischung wird auf einen Träger mit immobilisiertem VCP gegossen und während einer gewissen Zeit stehengelassen, der Träger wird mit einem Lösungsmittel usw. gewaschen, und ob die Kandidatenverbindung tatsächlich wirksam ist oder nicht wird festgestellt, indem die Anwesenheit von Markersignalen auf dem Träger überprüft wird. Die Bildung des Markersignals auf dem Träger zeigt an, dass das aberrante Protein an das auf einem Träger immobilisierte VCP bindet, was bestätigt, dass die gescreente Kandidatenverbindung als prophylaktische oder therapeutische Arznei in neurodegenerativen Krankheiten nicht geeignet ist. Umgekehrt zeigt die Nichtbildung des Markersignals durch den Träger, dass die Bindung des VCP mit dem aberranten Protein inhibiert ist, was bestätigt, dass die Kandidatenverbindung als prophylaktische oder therapeutische Arznei in neurodegenerativen Krankheiten geeignet ist.

[0025] In einem solchen Kit zum Screenen kann der Träger mit immobilisiertem VCP aus irgendeinem Material oder in irgendeiner Form dergestalt sein, dass VCP auf ihm immobilisiert werden kann, einschliesslich von Gel, Film, Blatt, Kü-gelchen, Säulen und Ähnlichem. VCP kann auf dem Träger unter Verwendung irgendeines Mittels immobilisiert werden, und es können eine Vielzahl von Formen, wie etwa direkte chemische Bindung, Bindung über Segmente wie etwa ein Tag, physikalischen Einschluss zu Kügelchen, usw. als Beispiele aufgeführt werden. Das aberrante Proteinreagens kann ein Reagens sein, das ein Protein mit einer verlängerten Polyglutaminkette wie etwa MJQ79 (Protein, das die Machado-Joseph-Krankheit erzeugt) oder ein Protein mit einer festgestellten abnormalen Konformation enthält. Zusätzlich kann es Lösungsmittel, Puffer, Additive usw. enthalten. Das Markieren des aberranten Proteins kann erreicht werden, indem irgendeine Form eines Markers, beispielsweise verschiedene Tags wie etwa Glutathion-S-transferase (GST) oder fluoreszierende Proteine oder Radioisotope, verwendet wird. Zusätzlich zum Träger mit immobilisiertem VCP und dem markierten aberranten Proteinreagens kann das vorliegende Kit zum Screenen von Verbindungen Lösungsmittel, Puffer, Additive, verschiedene Instrumente oder Ausrüstung usw. enthalten. Das tatsächliche Verfahren, durch das die Bindung des VCP und einem aberranten Protein bestätigt wird, ist nicht auf die obigen Verfahren beschränkt und kann verschiedene experimentelle Verfahren wie etwa die Proteinsynthese, die Expression von Fusionsproteinen, die Reinigung durch Zentrifugation oder HPLC, die Elektrophorese wie etwa SDS-PAGE, das Blotting, usw. einschliessen.

[0026] Das Kit der vorliegenden Erfindung zum Screenen einer Verbindung, die als wirksame Komponente für prophylaktische oder therapeutische Arzneien für neurodegenerativen Krankheiten nützlich ist, kann ein markiertes VCP-Agens und ein aberrantes Protein, das auf einem Träger immobilisiert ist, umfassen. Indem ein solches Kit verwendet wird, kann eine Verbindung, die als Komponente für prophylaktische oder therapeutische Arzneien für neurodegenerative Krankheiten wirksam ist, mit dem selben Verfahren gescreent werden wie bei dem oben als Beispiel genannten Kit. Mit anderen Worten wird das markierte VCP-Agens mit einer Kandidatenverbindung, von der erwartet wird, dass sie die Bindung von VCP und dem aberranten Protein inhibiert, gemischt; die Mischung wird auf ein aberrantes Protein gegossen, das auf einem Träger immobilisiert ist, und wird unter geeigneten Bedingungen während einer gewissen Zeit gehalten, wonach die Lösung herausgewaschen wird; indem die Anwesenheit oder Abwesenheit des Signals aus dem Marker beobachtet wird, wird die Bindung des VCP an das aberrante Protein auf dem Träger bestätigt. Auf diese Weise kann bestätigt werden, ob die Kandidatenverbindung wie erwartet tatsächlich als prophylaktische oder therapeutische Arznei gegen neurodegenerative Krankheiten wirkt.

[0027] Die Detektion des Markersignals auf dem Träger zeigt die Bindung von VCP mit dem aberranten Protein, wodurch gezeigt wird, dass die Kandidatenverbindung die Bindung nicht inhibiert und als Komponente für prophylaktische oder therapeutische Arzneien für neurodegenerative Krankheiten nicht wirksam ist. Andererseits zeigt das Nichtbeob-achten eines Markersignals auf dem Träger, dass die Kandidatenverbindung die Bindung von VCP und dem aberranten Protein inhibiert, was zeigt, dass die Kandidatenverbindung als Komponente für prophylaktische oder therapeutische Arzneien von neurodegenerativen Krankheiten ausreichend wirkt.

[0028] Die Form und das Material des Trägers, sowie die Komponenten im Reagens, die vom markierten VCP verschieden sind, sind für ein solches Kit auch nicht kritisch. Des Weiteren ist das tatsächliche Verfahren, mittels dem die Bindung von VCP und dem aberranten Protein überprüft wird, nicht auf die oben beispielhaft erwähnten Mittel beschränkt, und können verschiedene experimentelle Verfahren wie etwa die Proteinsynthese, die Expression von Fusionsproteinen, die Reinigung durch Zentrifugation oder HPLC, die Elektrophorese wie etwa SDS-PAGE, das Blotting, usw. eingeschlossen werden. Selbstverständlich kann das Kit zum Screenen von Verbindungen der vorliegenden Erfindung Instrumente, Reagentien und Lösungsmittel enthalten, die zur Durchführung dieser Verfahren erforderlich sind.

[0029] Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung werden in weiteren Einzelheiten unter Bezugnahme auf die beigelegten Figuren beschrieben. Selbstverständlich ist die vorliegende Erfindung nicht auf die folgenden Beispiele beschränkt, und es sind verschiedene Ausführungsformen der Details verfügbar.

Beispiele

Beispiel 1 : Aggregation von Polyglutamin aufgrund der Bindung von VCP und einem Protein, das eine Polyglutaminkette enthält

[0030] PC12-Zellen wurden fixiert, unter Verwendung eines Anti-VCP-Antikörpers als ersten Antikörper und eines FITC-markierten Antikaninchen-Antikörpers als zweiten Antikörper markiert, und unter einem Fluoreszenzmikroskop beobachtet, um die Lokalisierung von intrinsischem VCP zu untersuchen. Fig. 1-1 zeigt Bilder unter einem Fluoreszenzmikroskop (a) und unter einem optischen Mikroskop (b). Es wurde so bestätigt, dass VCP von den Zellen exprimiert wurde.

[0031] Anschliessend wurde Tetracyclin aus dem Kulturmedium von PC12/Q79 entfernt, und Polyglutamin von 79 Re-

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peats (Q79) mit einem Flag-Tag wurde exprimiert. 48 und 96 Stunden nach der Eliminierung des Tetracyclins wurden die Zellen fixiert und es wurde die Lokalisierung des intrinsischen VCP und des Polyglutamins beobachtet. Die Zellen wurden mit Anti-VCP-Antikörper (FITC-markierter Antikaninchen-Antikörper wurde als zweiter Antikörper verwendet) und mit Anti-Flag-Antikörper (mit Texasrot gefärbter Antimaus-Antikörper wurde als zweiter Antikörper verwendet) markiert, und die Expression von VCP und Polyglutamin sowie ihre Lokalisierung wurden beobachtet.

[0032] Die Fluoreszenz-Mikrophotographien sind in Fig. 1, 2a-c (nach 48 Stunden), und in Fig. 1, 3a-c (nach 96 Stunden), gezeigt. Die optischen Mikrophotographien von PC12/Q79-Zellen nach Expression von Polyglutamin sind in Fig. 1-2d (nach 48 Stunden), und in Fig. 1-3d (nach 96 Stunden), gezeigt.

[0033] Aus Fig. 1-2, wurde bestätigt, dass Polyglutamin nach Induktion der Expression im Cytoplasma Aggregate bildet (Fig. 1—2b), und dass VCP mit Polyglutamin kolokalisiert (Fig. 1-2c).

[0034] Aus Fig. 1-3, wurde bestätigt, dass Polyglutamin im Verlauf der Zeit auch in den Kernen Aggregate bildet (Fig. 1 —3b), und dass VCP auch mit dem Polyglutamin in den Kernen kolokalisiert (Fig. 1-3c).

[0035] Ausserdem wurde aus Beobachtungen unter einem optischen Mikroskop bestätigt, dass mit der Expression von Polyglutamin Vakuolisierung im Cytoplasma auftrat (Fig. 1 —2d, Fig. 1-3d).

Beispiel 2: Bindung von VCP mit dem aberranten Protein MJDQ79 und Bestätigung der Inhibition der Bindung durch Begleitproteine (Hsp70, HJD-2)

[0036] (1) Als ein aberrantes Protein, das eine verlängerte Polyglutaminkette enthält, wurde das die Machado-Joseph-Krankheit bewirkende Protein MJDQ79 ausgewählt, das 79 Glutaminreste enthält.

[0037] MJDQ79 wurde als Fusionsprotein von Glutathion-S-transferase (GST) in Escherichia coli exprimiert.

[0038] VCP wurde in vitro unter Verwendung eines Lysates von Reticulocyten exprimiert und mit 35S markiert.

[0039] GST-MJDQ79, an Glutathionagarosegel-Kügelchen gebunden, und 35S-VCP wurden gemischt und langsam bei 4°C inkubiert (2 Stunden), Waschen und Zentrifugieren wurden wiederholt, und das Protein, das mit den Kügelchen gefällt wurde, wurde mit SDS-PAGE getrennt und der Autoradiographie unterzogen.

[0040] (2) Die Begleitproteine (Hsp70, HJD-2) wurden dem GST-MJDQ79 zusammen mit VCP zugegeben, um zu bestätigen, ob die Bindung von VCP und MJDQ79 inhibiert wird oder nicht.

[0041] Das Ergebnis der Autoradiographie ist in Fig. 2a gezeigt. Die Menge des Materials, die dem Reaktionsmedium zugegeben wurde, ist auf die Zugabemenge der Materialien bezogen, die mit 1 angegeben wird. Die Bedingungen für die Spuren 1 bis 13 sind in Tabelle 1 qezeiqt

Tabelle 1

Spur

Zugabe

GST

GST-MJDQ79

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

VCP

1

0

0

5

0

0

1

1

1

0

1

1

0

Hsp70

0

1

0

0

5

0

0

1

5

5

0

0

0

HJD-2

0

0

1

0

0

5

0

0

0

0

1

5

5

[0042] Die Menge an VCP in den Spuren 7, 8, 9, 11 und 12 in Fig. 1a wird numerisch in der Darstellung von Fig. 2b gezeigt. Die vertikale Achse wird auf die als 100 angenommene Zugabemenge an VCP bezogen.

[0043] Wie aus Fig. 2a ersichtlich ist, wurde die VCP-Bande schwächer, wenn bei einer exprimierten Menge VCP von 1 die Menge an Hsp70 von 0 auf 1 und 5 erhöht wurde (Fig. 2a; Spuren 7, 8 und 9). Die VCP-Bande wurde auch schwächer, wenn die Menge an HJD-2 von 0 auf 1 und 5 erhöht wurde (Fig. 2a, Spuren 7, 11 und 12). Die Abnahme der Konzentration dieser Banden wurde auch aus der Darstellung in Fig. 2b bestätigt. Mit anderen Worten wurde bestätigt, dass die Interaktion von GST-MJDQ79 und VCP abnimmt, wenn die Menge an zugegebenem Hsp70 und HJD-2 erhöht wird.

[0044] Aus den obigen Ergebnissen wurde bestätigt, dass die Bindung von VCP und MJDQ79 durch Hsp70 und HJD-2 inhibiert wird. Des Weiteren wurde vorgeschlagen, dass diese Inhibierung durch die Bindung von Hsp70 bzw. HJD-2 an GST-MJDQ79 (Fig. 2a, Spuren 10 und 13) bewirkt wird.

[0045] (3) Das MJDQ79-Protein wurde mit 35S markiert und in vitro synthetisiert. Des Weiteren wurde VCP als Fusionsprotein mit GST in Escherichia coli exprimiert.

[0046] Die Bindung von GST-VCP und 35S-MJDQ79 wurde mittels desselben Verfahrens wie in (1) beschrieben bestätigt.

[0047] Das Ergebnis der Autoradiographie ist in Fig. 2c gezeigt. Die Zugabemenge der Materialien ist als 1 ausgedrückt, und die Menge der zu dem Reaktionsmedium zugegebenen Materialien sind auf die Zugabe bezogen ausgedrückt. Die Bedingungen für die Spuren 1 und 14 sind in Tabelle 2 gezeigt.

Tabelle 2

Spur

Zugabemenge

GST

GST-VCP

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

14

6

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Spur

Zugabemenge

GST

GST-VCP

MJDQ79

1

0

0

5

0

0

1

1

1

5

5

5

0

0

Hsp70

0

1

0

0

5

0

0

5

0

0

5

0

5

0

HJD-2

0

0

1

0

0

5

0

0

5

0

0

5

0

5

[0048] Die Menge an MJDQ79 in den Spuren 10, 11 und 12 von Fig. 2c wird numerisch in Fig. 2d ausgedrückt. Die vertikale Achse wird auf die als 100 angenommene Zugabe an MJDQ7 9 bezogen.

[0049] Wie aus Fig. 2c ersichtlich ist, war die Bande, wenn Hsp70 koexistierte, schwächer im Vergleich zu der Bande, wo nur GST-VCP und MJDQ70 vorkamen (Fig. 2c, Spuren 10 und 11). Zusätzlich war auch die Bande mit MJDQ79, GST-VCP und HJD-2 schwächer als diejenige, wo nur MJDQ79 zusammen mit GST-VCP koexistierte (Fig. 2c, Spuren 10 und 12).

[0050] Solche Abnahmen in der Konzentration der Bande wurden auch aus der Darstellung in Fig. 2d bestätigt. Mit anderen Worten wurde gezeigt, dass die Interaktion von MJDQ79 und GST-VCP in einem System, in dem Hsp70 und HJD-2 zugegeben wurden, abnimmt.

[0051] Aus den obigen Ergebnissen wurde bestätigt, dass die Bindung von VCP und MJDQ79 durch Hsp70 und HJD-2 inhibiert wird. Des Weiteren wurde vorgeschlagen, dass eine solche Inhibition durch die Bindung von Hsp70 bzw. HJD-2 and GST-VCP bewirkt wurde (Fig. 2c, Spuren 13 und 14).

Beispiel 3: Relaxationsmechanismus von polyglutamin-induzierter Neurodegeneration durch Begleitproteine (Hsp70 und HJS-2)

[0052] Es wurde berichtet, dass die durch Polyglutamin bewirkte Neurodegeneration durch Überexpression von Begleitproteinen wie etwa Hsp70 oder HJD-2 (HSP40-Familie) gemildert werden kann (Warrick, J.M., Chan, H.Y., Gray-Board, G.L., Chai, Y., Paulson, H.L., Bonini, N.M., Nat. Genet. 23, 425-428 [1999]; Kazemi-Esfarijani, P, Benzer, S., Science 287, 1837-1840 [2000]; Muchowski, P.J., Schaffar, G., Sitteier, A., Wanker, E.E., Hayer-Hartl, M.K., Hartl, F.U., Proc. Nati. Acad. Sei. USA, 97, 7841-7846 [2000]). Der Mechanismus, durch den solche Proteine die Polygluta-min-Neurodegeneration inhibieren, war jedoch bis jetzt nicht bekannt.

[0053] Aus den Ergebnissen des obigen Beispiels 2 wurde angegeben, dass Hsp70 und HJS-2 unabhängig an VCP und an das polyglutaminhaltige Protein binden und mit der Bindung von VCP und aberrantem Protein konkurrieren, wodurch die Bindung in einer dosisabhängigen Weise inhibiert wird.

[0054] Entsprechend wurde ein Mechanismus, worin das Begleitprotein die Bindung von VCP an Polyglutamin inhibiert, so dass die Toxizität des Polyglutamins verringert wird, aufgeklärt.

[0055] Aus den obigen Ergebnissen ergibt sich, dass Ändern der Menge oder der Kombination von Begleitproteinen eine stärkere Inhibierung der Bindung bewirken können.

[0056] Mit anderen Worten wurde bestätigt, dass die Inhibierung der Bindung von VCP mit Polyglutamin ein wirksamer Indikator im Screenen von Verbindungen, die die Toxizität des Polyglutamins verringern, ist.

Beispiel 4: Bindung von VCP mit einem Vorläuferprotein des amyloiden ß-Proteins

[0057] Der Vorläufer des amyloiden ß-Proteins (APP: in diesem Experiment ist die Sequenz von dem Spaltungsort der ß-Secretase zum C-Terminus angegeben), das als das Protein bekannt ist, das die Alzheimer-Krankheit bewirkt, wurde in vitro synthetisiert und mit 35S markiert. GST-VCP wurde mit 35S-APP gemischt, und die Mischung wurde während 2 Stunden bei 4°C inkubiert, mittels SDS-PAGE getrennt und der Autoradiographie unterzogen.

[0058] Es wurde ein Protein, das ein verlängertes Polyglutamin enthält (MJDQ79), als positive Kontrolle verwendet, und es wurde ein Protein, das keine Domäne des Glutamingebiets enthielt (MJDAQ), als negative Kontrolle verwendet.

[0059] Die Ergebnisse der Autoradiographie sind in Fig. 3 gezeigt. Wie in der Figur gezeigt ist, zeigen die Spuren, von links nach rechts, die Zugabe (synthetisiertes Protein), das Präzipitat mit GST alleine, und das Präzipitat mit GST-VCP.

[0060] Wie in den Beispielen 1 und 2 wurde bestätigt, dass das MJD-Protein in Anwesenheit von Polyglutamin, aber nicht in Abwesenheit von Polyglutamin, zur Bindung mit VCP befähigt ist.

[0061] Gleichermassen wurde bestätigt, dass das aberrante Protein AAP an VCP bindet.

[0062] Daher wurde vorgeschlagen, dass das Screenen von Verbindungen, die die Bindung des aberranten Proteins (AAP) und VCP inhibieren, sogar der Identifikation von Verbindungen dient, die als prophylaktische oder therapeutische Arzneien für Alzheimer-Krankheit wirksam sind, die eine neuro-degenerative Krankheit ist, die durch ein Protein bewirkt ist, das keine verlängerte Polyglutaminkette enthält.

Beispiel 5: Bindung von VCP und Lewy-Körpern in Lewy-Body-Demenz (DLB)

[0063] Lewy-Körper, die aus einem Patienten gewonnen waren, der an DLB litt (einer Demenz, bei der zusätzlich zur Läsion des Stammhirns, wie bei der Parkinson-Krankheit, auch Lewy-Körper in der Hirnrinde auftreten) wurden mit einem Anti-VCP-Antikörper markiert.

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[0064] Wie in Fig. 4 gezeigt wurden die Lewy-Körper mit Anti-VCP-Antikörper markiert.

[0065] Aus diesem Ergebnis wurde die Anwesenheit von Bindung zwischen VCP und den Lewy-Körpern, die ein Phänotyp von DLB sind, bestätigt. Daher wurde vorgeschlagen, dass die Identifizierung von Verbindungen, die als die wirksame Komponente von prophylaktischen oder therapeutischen Arzneien für DLB nützlich sind, möglich ist, indem nach Verbindungen gescreent wird, die die Bindung inhibieren.

Beispiel 6: Bindung von VCP mit einem ubiquitin-positiven nuklearen Einschlusskörper der spinalen cerebralen Degeneration

[0066] Der ubiquitin-positive nukleare Einschlusskörper in einem Patienten mit spinaler cerebraler Degeneration, die in der Kindheit auftrat und rasch fortschritt, wurde mit einem Anti-Ubiquitin-Antikörper bzw. einem Anti-VCP-Antikörper markiert.

[0067] Aus Fig. 5 wurde bestätigt, dass der ubiquitin-positive nukleare Einschlusskörper mit dem Anti-Ubiquitin-Antikörper (Fig. 5a) sowie mit dem Anti-VCP-Antikörper (Fig. 5b) markiert ist.

[0068] Aus diesem Ergebnis wurde die Bindung von VCP und dem ubiquitin-positiven nuklearen Einschlusskörper der spinalen cerebralen Degeneration bestätigt. Daher wird vorgeschlagen, dass durch Screenen nach Verbindungen, die eine solche Bindung inhibieren, die Identifikation von Verbindungen, die als die wirksame Komponente von prophylaktischen oder therapeutischen Arzneien gegen spinale cerebrale Degeneration nützlich sind, möglich wäre.

Gewerbliche Anwendbarkeit

[0069] Wie oben in Einzelheiten beschrieben wurde stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Screenen nach Verbindungen, die als die wirksame Komponente von prophylaktischen oder therapeutischen Arzneien für neurodegenerative Krankheiten nützlich sind, bereit. Die Erfindung stellt auch einen Kit zum Screenen von Verbindungen, die als die wirksame Komponente von prophylaktischen oder therapeutischen Arzneien für neurodegenerative Krankheiten nützlich sind, bereit. Es wird erwartet, dass die Forschung, Entwicklung und Vermarktung von prophylaktischen oder therapeutischen Arzneien für neurodegenerative Krankheiten beschleunigt wird, indem das Screening-Verfahren und das Screening-Kit der vorliegenden Erfindung verwendet werden.

Claims (15)

Patentansprüche

1. Verfahren zum Screenen von Verbindungen, die als eine prophylaktische oder therapeutische Arznei für neurodegenerative Krankheiten, die durch die Bindung eines aberranten Proteins und eines valosin-enthaltenden Proteins (VCP) bewirkt sind, nützlich sind, umfassend:

Zur-Koexistenz-Bringen des aberranten Proteins, des VCP und der Kandidaten-Verbindung; und

Identifizieren der Verbindung, die inhibierende Wirkung auf die Bindung des aberranten Proteins und des VCP zeigt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das aberrante Protein ein Protein ist, das eine verlängerte Glutaminkette, eine abnormale Konformation oder eine ß-Faltblattstruktur enthält, oder ein proteasebeständiges Protein ist.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass das aberrante Protein, VCP und die Kandidatenverbindung durch Mischen in Lösung zur Koexistenz gebracht werden.

4. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass das aberrante Protein, VCP und die Kandidatenverbindung in einer Kulturzelle zur Koexistenz gebracht werden.

5. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass das aberrante Protein, VCP und die Kandidatenverbindung zur Koexistenz gebracht werden, indem jede Komponente einem Tier verabreicht wird.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die inhibierende Wirkung detektiert wird durch Beobachten des Auftretens der Vakuolisierung im Cytoplasma von Zellen, die ein aberrantes Protein exprimieren, oder durch die Koexistenz von VCP und der Kandidatenverbindung.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die inhibierende Wirkung detektiert wird durch:

Markieren entweder des aberranten Proteins oder des VCP;

Immobilisieren des nicht-markierten Proteins auf einem Träger;

Kontaktieren des aberranten Proteins und des VCP in Gegenwart der Kandidatenverbindung; und Detektieren des Signals, das durch das markierte Protein auf dem immobilisierenden Träger bewirkt wird.

8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass das aberrante Protein mit einem Tag wie etwa His oder Flag oder mit Radioisotopen wie etwa 5S markiert wird.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Nützlichkeit einer Kandidatenverbindung bestimmt wird, indem die Anwesenheit von Vakuolisierung, die Lokalisierung des aberranten Proteins und des VCP in Zellen oder eine Änderung im Fluoreszenz-Resonanz-Energietransfer (FRET) beobachtet wird.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Bindung von VCP und aberrantem Protein mittels eines GST-Pull-Down-Assays, eines Hefe-Two-Hybrid-Assays oder eines BIACore detektiert wird.

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11. Kit zum Screenen von Verbindungen, die als wirksame Komponenten von prophylaktischen oder therapeutischen Arzneien für neurodegenerative Krankheiten, die durch die Bindung eines aberranten Proteins und eines valosin-enthaltenden Proteins (VCP) bewirkt sind, nützlich sind, umfassend:

Einen Träger, auf dem das VCP immobilisiert ist; und ein markiertes aberrantes Proteinreagens.

12. Kit nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass das aberrante Proteinreagens ein Reagens ist, das ein Protein mit einer verlängerten Polyglutaminkette, wie etwa das Protein, das die Machado-Joseph-Krankheit bewirkt (MJQ79), enthält, oder ein Protein mit einer abnormalen Konformation.

13. Kit nach Anspruch 11 oder 12, dadurch gekennzeichnet, dass der Träger, auf dem das VCP immobilisiert ist, ein Gel, Film, Blatt, Kügelchen oder eine Säule ist.

14. Kit nach einem der Ansprüche 11 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass das markierte aberrante Protein mit Gluta-thion-S-transferase (GST), einem fluoreszierenden Protein oder einem Radioisotop markiert ist.

15. Kit zum Screenen von Verbindungen, die als wirksame Komponenten von prophylaktischen oder therapeutischen Arzneien für neurodegenerative Krankheiten, die durch die Bindung eines aberranten Proteins und eines valosin-enthaltenden Proteins (VCP) bewirkt sind, nützlich sind, umfassend:

ein markiertes VCP-Reagens; und einen Träger, auf dem das aberrante Protein immobilisiert ist.

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