DE19900503A1 - Verwendung einer Zusammensetzung zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Erkrankungen mit erhöhten extrazellulären FasL-Titern, Verfahren zur prophylaktischen Eignungs- bzw. Qualitätskontrolle derselben, Verfahren zur Herstellung von Arzneimitteln zur Behandlung obiger Krankheiten mit gesteigerter Wirksamkeit - Google Patents
Verwendung einer Zusammensetzung zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Erkrankungen mit erhöhten extrazellulären FasL-Titern, Verfahren zur prophylaktischen Eignungs- bzw. Qualitätskontrolle derselben, Verfahren zur Herstellung von Arzneimitteln zur Behandlung obiger Krankheiten mit gesteigerter WirksamkeitInfo
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Abstract
Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung einer Zusammensetzung zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von humanen oder tierischen Erkrankungen mit pathophysiologisch erhöhten extrazellulären FasL-Titern, wobei die Zusammensetzung FasL/FasR-Interaktion inhibierende anti-Fas-Antikörper enthält. Außerdem betrifft die Erfindung Verfahren zur prophylaktischen Qualitätskontrolle einer erfindungsgemäßen Zusammensetzung für deren Verwendung als Arzneimittel ebenso wie Verfahren zur Herstellung von Arzneimitteln mit gesteigerter pharmazeutischer Wirksamkeit bei Erkrankungen, die auf erhöhten extrazellulären FasL-Titern beruhen.
Description
Die Erfindung betrifft die Verwendung von Zusammensetzun
gen zur Herstellung von Arzneimitteln zur Behandlung von
humanen oder tierischen Zuständen, Erkrankungen oder Stö
rungen mit pathophysiologisch erhöhten extrazellulären
FasL-Titern, Verfahren zur prophylaktischen in vitro Eig
nungs- bzw. Qualitätskontrolle einer Zusammensetzung für
deren spätere Verwendung zur Herstellung eines Arzneimit
tels zur Behandlung der vorgenannten Erkrankungen, patho
physiologischen Zustände bzw. Störungen sowie Verfahren
zur Herstellung eines Arzneimittels mit gesteigerter
pharmazeutischer Wirksamkeit zur Behandlung oben genann
ter Erkrankungen Störungen oder pathophysiologischer Zu
stände.
Zur Aufrechterhaltung der physiologischen Homöostase ist
eine im einzelnen fein differenzierte Kontrolle der Zell
proliferation erforderlich. Die Kontrolle der Zellproli
feration in lebenden Organismen gelingt u. a. durch den
Mechanismus des programmierten Zelltods (Apoptose). Aus
der Literatur sind zahlreiche Signaltransduktionswege be
kannt, die schließlich zum programmierten Zelltod führen.
Hierbei spielt die Interaktion von extrazellulären Ligan
den, z. B. dem Fas-Liganden (FasL), mit diversen Zellober
flächenrezeptoren, z. B. dem Fas-Rezeptor (Fas) oder dem
TRAIL-Rezeptor, eine zentrale Rolle für die Auslösung der
Apoptose. In diversen wissenschaftlichen Arbeiten wurde
ein Zusammenhang zwischen dem Erscheinungsbild verschie
denster Krankheiten und einer hierfür ursächlichen patho
logischen Fehlsteuerung der Apoptose hergestellt.
(Steller, Science 267, 1445-1449, 1995, Thompson, Science
267, 1456-1462, 1995, Nagata, Cell 88, 355-365, 1997,
Giordano et al., Science 275, 960-963, 1997, Chervonsky
et al., Cell 89, 17-24, 1997). Sowohl eine überschießende
apoptotische Reaktion als auch der Verlust extrazellulä
rer apoptotischer Signale führt zu pathophysiologischen
Zuständen, Erkrankungen oder Störungen im lebenden Orga
nismus. Dabei ist in vielen Fällen die exakte Ätiologie
der apoptotischen Fehlfunktion unklar. In einigen Fällen
wiederum wird nur ein Zusammenhang zwischen der fehlge
steuerten apoptotischen Kontrolle und dem jeweiligen Syn
drom vermutet. Eine spezifische, ursächlich ausgerichtete
medizinisch-pharmazeutische Behandlung ist hingegen in
keinem Fall gegeben.
Der vorliegenden Erfindung lag daher die Aufgabe zugrun
de, pathophysiologische Zustände, Erkrankungen und Stö
rungen zu identifizieren, die auf einer gesteigerten
apoptotischen Aktivität beruhen, und für derartige Fehl
steuerungen eine geeignete, zielgerichtete und die Ursa
chen berücksichtigende pharmazeutischen Behandlung zu
entwickeln, die schließlich auf die apoptotische Über
schußreaktion inhibierend wirkt. Diese Aufgabe löst die
vorliegende Erfindung durch die Ansprüche 1 bis 3. Dar
über hinaus lag der vorliegenden Erfindung die weitere
Aufgabe zugrunde, bei bislang zur unspezifischen und
teilweise erfolglosen Behandlung eingesetzten Substanz
mischungen, jene Bestandteile zu identifizieren, die für
den therapeutischen Erfolg ursächlich sind. Hieraus er
gibt sich weiterhin die Aufgabe, Verfahren zur Eignungs-
bzw. Qualitätskontrolle derartiger unspezifischer Sub
stanzmischungen zu entwickeln, die schließlich eine un
eingeschränkt erfolgreiche medizinische Verwendung erlau
ben. Diese Aufgabe wird durch den Anspruch 4 gelöst. Wei
terhin war es eine Aufgabe der Erfindung, derartige Sub
stanzmischungen in ihrer pharmazeutischen Wirksamkeit so
zu verbessern, daß sie zur Behandlung der vorgenannten
Erkrankungen, Störungen oder pathophysiologischen Zustän
de eine erhöhte pharmazeutische Wirksamkeit aufweisen.
Diese Aufgabe wird durch die Gegenstände der Ansprüche 10
bzw. 13 gelöst.
Die Erfinder haben gezeigt, daß die Verwendung von Zusam
mensetzungen, die gewisse gegen Fas gerichtete Antikörper
(anti-Fas-Antikörper) enthalten, zur Behandlung von huma
nen oder tierischen Zuständen mit überschießender apopto
tischer Reaktion dann geeignet sind, wenn diese gestei
gerte apoptotische Reaktion auf erhöhten extrazellulären
FasL-Titern beruht. Derartige Zusammensetzungen können
dann zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung
von Syndromen mit vorgenannter Ätiologie eingesetzt wer
den. Dabei erweisen sich Zusammensetzungen, die die
FasL/Fas-Rezeptor-Interaktion inhibierende anti-Fas-
Antikörper enthalten, dann als besonders geeignet, wenn
sie zur Behandlung von toxischer epidermaler Nekrolyse
(Lyell's Syndrom), graft-versus-host Erkrankung, Hepati
tis, fulminanter Hepatitis, Autoimmunthyroiditis
(Hashimoto's Thyroiditis), maligner Tumorerkrankungen
oder HIV eingesetzt werden. Erfindungsgemäß wurde festge
stellt, daß für die vorgenannten Erkrankungen zumindest
im wesentlichen erhöhte extrazelluläre FasL-Titer verant
wortlich sind, die schließlich sensitive humane Zellen
durch Apoptose abtöten. Die genannten Zusammensetzungen
enthalten die FasL/Fas-Rezeptor-Interaktion inhibierende
Antikörper, insbesondere anti-Fas-Antikörper. Es handelt
sich bei diesen Zusammensetzungen vorzugsweise um natür
liche Zusammensetzungen, insbesondere um Blutprodukte.
Im Fall der toxischen epidermalen Nekrolyse (TEN) wurde
darüber hinaus erfindungsgemäß erstmals ein Zusammenhang
mit einer auf apoptotischer Fehlsteuerung beruhenden
Ätiologie hergestellt. Die vorgenannte Erkrankung beruht
erfindungsgemäß auf einem massenhaften apoptotischen Tod
von Epidermiszellen. Dies führt schließlich zu einer Se
parierung von Dermis und Epidermis mit einem tödlichen
Ausgang in ungefähr 30% der betroffenen Fälle (Roujeau,
Stern, New England Journal of Medicine 331, 1272-1285,
1994). Während normalerweise die Apoptose von Keratino
zyten in der Epidermis ein seltenes Ereignis ist, ist die
Apoptose dieser Zellen bei Patienten mit toxischer epi
dermaler Nekrolyse stark erhöht. Erfindungsgemäß wurde
festgestellt, daß bei Patienten mit TEN ungewöhnlich hohe
Titer von löslichem FasL in den entsprechenden Seren vor
liegen. Aus verschiedenen Veröffentlichungen (Gutierrez-
Steil et al., Journal Clinical Investigations 101, 33-39,
1998, Berthou et al., Journal Immunology 159, 5293-5300,
1997) ist weiterhin bekannt, daß Keratinozyten gewöhnlich
nur wenig FasL exprimieren. Allerdings kann im Falle ad
äquater Stimulation die FasL-Produktion bei Keratinozyten
induziert werden (Guiterrez-Steil et al. Journal Clinical
Investigations 101, 33-39, 1998). Erfindungsgemäß wurde
weiterhin gezeigt, daß Keratinozyten von TEN-Patienten
eine hohe FasL-Expression aufweisen, während gesunde Kon
trollpersonen insoweit unauffällig waren.
Außerdem wurde erfindungsgemäß nachgewiesen, daß das bis
her unspezifische und nur im Einzelfall nur bei inflamma
torischen oder Autoimmunerkrankungen erfolgreich einge
setzte IVIG (Intravenöses Immunoglobin, das als Blutpro
dukt aus "gepooltem" Plasma von gesunden Spendern herge
stellt wird) auch zur Behandlung von humanen oder tieri
schen pathophysiologischen Zuständen mit erhöhter extra
zellulärer FasL Konzentration, insbesondere TEN, einge
setzt werden kann. Weitere erfindungsgemäße Untersuchun
gen ergaben, daß eine Wirkung von IVIG-Gemischen bei den
vorgenannten Erkrankungen, die auf erhöhten FasL-Titern
beruhen, dann festzustellen ist, wenn die IVIG-Gemische
anti-Fas-Antikörper enthalten, die die Interaktion von
Fas mit dem extrazellulären Liganden FasL blockieren.
IVIG-Gemische als natürliches Blutprodukt weisen aller
dings nur im Einzelfall jene Qualität auf, die es er
laubt, sie pharmazeutisch wirksam zur Behandlung jener
Erkrankungen oder Störungen zum Einsatz zu bringen, die
sich auf erhöhte extrazelluläre FasL-Titer zurückführen
lassen. Hierzu müssen, wie erfindungsgemäß festgestellt,
ausreichende, die FasL/Fas-Interaktion inhibierende anti-
Fas-Antikörper-Titer vorliegen. Um eine frühzeitige Eig
nungs- bzw. Qualitätskontrolle der natürlichen Blutplas
maprodukte durchführen zu können, wurden erfindungsgemäß
immunologische Verfahren zur Verfügung gestellt, die eine
Bestimmung der anti-Fas-Antikörper-Titer in beliebigen
pharmazeutischen Zusammensetzungen, insbesondere aber in
IVIG-Gemischen, erlauben. Erst nach einer derartigen Eig
nungs- bzw. Qualitätskontrolle ist eine zielgerichtete
Verwendung derartiger Zusammensetzungen zur Herstellung
eines Arzneimittels zur Behandlung von Erkrankungen, die
auf erhöhten extrazellulären FasL Konzentrationen beru
hen, möglich. Sinnvollerweise werden die immunologisch
positiv getesteten Chargen zur Behandlung eingesetzt,
während andere Chargen ohne anti-Fas-Antikörper-Aktivität
nach dem Testen mit den vorgeschlagenen, erfindungsgemä
ßen in vitro Verfahren verworfen und damit ihre Verwen
dung zur Behandlung der vorgenannten Erkrankungen bzw.
ihre Verwendung zur Herstellung eines Arzneimittels zur
Behandlung der vorgenannten Erkrankungen ausgeschlossen
wird. Hierdurch wird neben Zusammensetzungen, insbesonde
re IVIG-Gemischen, mit geringer Spezifität für die Ver
wendung als Arzneimittel zur Behandlung von Erkrankungen
mit hohen extrazellulären FasL-Titern nunmehr eine spezi
fische, durch die erfindungsgemäßen Verfahren hergestell
te und hinsichtlich ihrer Qualität und Eignung geprüfte
Zusammensetzung, insbesondere also ein geeignetes Blut
produkt, für den obigen Zweck zur Verfügung gestellt.
Erfindungsgemäß erweisen sich als geeignete Verfahren zur
prophylaktischen Eignungs- bzw. Qualitätskontrolle von
natürlichen Zusammensetzungen mit einem Inhibitionspoten
tial auf die überschießende Apoptosereaktion, insbesonde
re also solche Systeme, die die Messung von Rezep
tor/Liganden-Interaktion erlauben. Hierzu wird zunächst
in einem Verfahrensschritt (a) Fas, insbesondere dessen
extrazelluläre Domäne, als Ligand im Testsystem einge
setzt, insbesondere bevorzugt wird dabei ein Fas-Fc-
Fusionsprotein, das mit potentiell zur Behandlung der
vorgenannten Erkrankungen geeigneten Zusammensetzungen,
also beispielsweise von IVIG-Gemischen, inkubiert wird.
Anschließend wird markiertes FasL der gemäß Verfahrens
schritt (a) vorinkubierten Lösung zugesetzt und schließ
lich erfindungsgemäß der Anteil von an Fas oder bei
spielsweise an Fas-Fc-Fusionsprotein gebundenem FasL mit
Hilfe physikalischer oder chemischer Methoden bestimmt.
Besonders geeignet sind dabei spektroskopische Methoden,
insbesondere solche spektroskopischen Verfahren, die auf
Absorption oder Fluoreszenz im sichtbaren oder nahen UV-
Bereich beruhen. Hierbei stehen dem Fachmann alle ihm ge
läufigen Vorgehensweisen zur Verfügung, z. B. eine direkte
Markierung von FasL mit Chromophoren oder auch gegen FasL
gerichtete Antikörper, die dann ihrerseits z. B. mit Chro
mophoren markiert sein können. Die gegen FasL gerichteten
und markierten Antikörper können dabei natürliche Epitope
von FasL erkennen oder auch gegen Markierungen auf dem
FasL-Protein, nämlich beispielsweise eingeführte rekombi
nante Abschnitte (z. B. gegen die sog. Flag-Sequenz), ge
richtet sein.
Als weiteres für die Eignungs- bzw. Qualitätskontrolle
von Zusammensetzungen, insbesondere von IVIG-Gemischen,
der vorgenannten Art adäquates immunologisches Verfahren
wird ein Testsystem zur Verfügung gestellt, das auf dem
durch FasL/Fas vermittelten Zelltod beruht. Hierbei wer
den Zellen von Fas-sensitiven Zellinien (z. B. Jurkat-
Zellen oder die lymphoblastoide Zellinie A20) mit der zu
untersuchenden und auf ihre Eignung zu prüfenden Zusam
mensetzung vorinkubiert und anschließend dieser vorinku
bierten Präparation FasL zugesetzt (beispielsweise rekom
binantes humanes lösliches FasL). Schließlich wird die
Zahl derjenigen Fas-sensitiven Zellen ermittelt, die
durch die FasL/Fas-Interaktion im Wege der Apoptose un
tergegangen sind. Enthält die untersuchte Zusammensetzung
anti-Fas-Antikörper, die den FasL/Fas-
Transduktionsmechanismus blockieren, so werden Fas-
sensitive Zellen durch die Zusammensetzung vor der Apop
tose bewahrt. Damit erwiese sich eine Zusammensetzung als
zur Verwendung für die Herstellung eines Arzneimittels
zur Behandlung der vorgenannten Störungen geeignet. Kon
trollversuche mit gegenüber der durch Fas/FasL ausgelö
sten Apoptose resistenten Zellen vermeiden eine Fehlin
terpretation der ggf. positiven Resultate mit den Fas-
sensitiven Zellinien. Für die Bestimmung des durch die
FasL-Aktivität bewirkten Ausmaßes der Apoptose unter den
Fas-sensitiven Zellen kann beispielsweise ein Annexin-
FITC Zelltodtest, wie er von der Alexis Corporation, San
Diego, USA, vertrieben wird, oder auch ein Assay zur Be
stimmung der Zellebensfähigkeit, wie er von Boehringer,
Mannheim, Deutschland, unter der Bezeichnung WST-1 ver
trieben wird, herangezogen werden.
Darüber hinaus erweisen sich auch Immunoblotting-Methoden
als geeignet, um als Verfahren zur prophylaktischen Eig
nungs- bzw. Qualitätskontrolle von potentiell pharmazeu
tisch wirksamen Zusammensetzungen zur Behandlung der vor
genannten Erkrankungen eingesetzt werden zu können. Hier
bei werden extrazelluläre Abschnitte von Fas durch Blot
ting-Techniken mit den ggf. anti-Fas-Antikörper enthal
tenden Zusammensetzungen, z. B. auch IVIG-Gemischen, in
Berührung gebracht und daraufhin die an Fas gebundenen
Bestandteile der Zusammensetzung, also ggf. in der Zusam
mensetzung enthaltene anti-Fas-Antikörper durch gegen
diese gerichtete Sekundär-Antikörper identifiziert. Für
die Identifizierung können die Sekundär-Antikörper auf
jede dem Fachmann geläufige Weise markiert werden. Als
besonders geeignet erweisen sich neben Markierungen mit
Chromophoren auch Markierungen mit Enzymen, die quantifi
zierbar und meßbar Substrate umsetzen. Dabei kann es sich
bei den zur Markierung verwendeten Enzymen z. B. um Mee
rettich-Peroxidase handeln. Auch bei diesem Verfahren
werden durch die Markierungen am Sekundär-Antikörper jene
Chargen der Zusammensetzung (also etwa von IVIG-Gemischen
oder anderen Blutprodukten) positiv bestimmt, die zur
zielgerichteten Behandlung der vorgenannten Störungen
herangezogen werden können.
Die oben stehenden Verfahren zur prophylaktischen Eig
nungs- bzw. Qualitätskontrolle von Zusammensetzungen,
insbesondere natürlichen Blutprodukten, vor allem aber
IVIG-Gemischen, die sich grundsätzlich zur Behandlung von
Störungen oder Erkrankungen mit erhöhten FasL-Titern eig
nen, können auch Bestandteil von Verfahren sein, die der
Aufbereitung oder Verbesserung dieser Zusammensetzungen
dienen. Damit wird der Zweck verfolgt, Zusammensetzungen,
insbesondere natürliche Blutprodukte, mit gesteigerter
pharmazeutischer Wirksamkeit zur Verfügung zu stellen.
Hierzu werden in einem Verfahrensschritt (a) die Zusam
mensetzungen, also beispielsweise Blutprodukte und insbe
sondere IVIG-Gemische, zunächst biochemisch fraktioniert.
Dieser Fraktionierungsschritt erfolgt auf dem Fachmann
geläufige Art. In einem weiteren Verfahrensschritt (b)
werden die Fraktionen auf ihre Eignung bzw. Qualität,
d. h. auf das Vorliegen etwaiger anti-Fas-Antikörper hin
untersucht. Dabei werden die vorher beschriebenen Verfah
ren, also z. B. ein Rezeptor/Ligandenbindungs-Test, Blot
ting-Techniken und/oder Zelltod-Assays ausgeführt. Sie
alle dienen allein oder in Kombination zur Bestimmung der
anti-Fas-Antikörper-Titer in der jeweiligen Fraktion.
Daraufhin wird (werden) diejenige(n) Fraktion(en) iso
liert, die mit Hilfe der z. B. vorgenannten immunologi
schen Verfahren positiv auf anti-Fas-Antikörper getestet
wurden (Verfahrensschritt (c)). Schließlich wird (werden)
in einem Verfahrensschritt (d) die oder diese Frakti
on(en) aufkonzentriert, so daß pharmazeutisch wirksame
und die FasL/Fas-Interaktion inhibierende anti-Fas-
Antikörper angereichert werden. Das Produkt dieses Her
stellungsverfahrens weist eine erhöhte anti-Fas-
Antikörper-Konzentration auf, besitzt eine erhöhte phar
mazeutische Wirksamkeit und kann dann als Arzneimittel
zur Behandlung von Störungen oder Erkrankungen mit erhöh
ten extrazellulären FasL-Titern oder zur Herstellung ei
nes Arzneimittels zur Behandlung derartiger Störungen
eingesetzt werden.
Dabei umfaßt das Einsatzgebiet derartiger Arzneimittel
sowohl die Human- als auch die Veterinärmedizin.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird dabei der Ver
fahrensschritt (d) des vorbeschriebenen Verfahrens zur
Herstellung eines Arzneimittels derart durchgeführt, daß
die anti-Fas-Antikörper in aufgereinigter Form aus der
ursprünglichen Zusammensetzung, die insbesondere ein
IVIG-Gemisch ist, erhalten wird. Hierzu bieten sich ins
besondere chromatographische Verfahren an, die die Affi
nität zwischen Antigen und Antikörper für die Aufreini
gung ausnutzen. Ganz besonders bevorzugt sind daher säu
lenchromatographische Verfahren, bei denen das Antigen,
hier also das Fas-Protein, besonders vorteilhaft ein Fas-
Fusionsprotein, auf dem Träger angekuppelt wird. Die am
z. B. Fas-Fusionsprotein gebundenen anti-Fas-Antikörper
werden schließlich durch dem Fachmann geläufige Verfah
ren, z. B. durch Salzlösungen, von der Säule eluiert
(Verfahrensschritt (e)). Durch ggf. zwei oder mehrmalige
Wiederholung eines, solchen Reinigungsschritts, vorzugs
weise verbunden mit anderen biochemischen Reinigungsver
fahren, kann der Grad der Aufreinigung der für die Ver
wendung zur Herstellung eines Arzneimittels geeigneten
anti-Fas-Antikörper weiter erhöht werden.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird das
Verfahren zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behand
lung von humanen oder tierischen Erkrankungen mit erhöh
ten extrazellulären FasL-Titern derart modifiziert, daß
im Ergebnis ein hochspezifisches Arzneimittel zur Verfü
gung gestellt wird. Hierzu wird die - wie oben beschrie
ben - im wesentlichen durch chromatographische Methoden
vorgereinigte Zusammensetzung bzw. insbesondere das
"gepoolte" Blutprodukt derart weiterbehandelt, daß nur
solche anti-Fas-Antikörper als Arzneimittel Verwendung
finden, die bestimmte Epitope auf dem Fas-Protein erken
nen. Hiermit wird ausgeschlossen, daß auch ggf. die Apop
tose stimulierende anti-Fas-Antikörper als Produkt des
Reinigungs-, Herstellungs- bzw. Aufbereitungsverfahrens
für die spätere Verwendung als Arzneimittel enthalten
sind. Dieses Ziel wird dadurch erreicht, daß ein oder
mehrere affinitätschromatographische Schritt(e) der Elu
ierung der anti-Fas-Antikörper gemäß Verfahrensschritt
(e) nachgeschaltet wird (werden). Hierbei werden auf dem
Trägermaterial ausgesuchte Epitope des Fas-Proteins, die
zur Inhibierung der FasL/Fas-Bindung besonders geeignet
erscheinen, als Liganden auf dem Träger angekuppelt. Im
Ergebnis wird eine epitopspezifische anti-Fas-Antikörper-
Subfraktion durch die Verfahrensschritte (a) bis (g) iso
liert. Im einzelnen wird hierzu nach der Eluierung (gemäß
Verfahrensschritt (e)) ein Verfahrensschritt nachgeschal
tet, bei dem das gemäß (e) erhaltene Eluat über eine oder
mehrere Affinitätschromatographiesäulen geführt wird. Auf
dieser (diesen Säulen) sind Epitope auf dem Trägermateri
al angekuppelt, die etwaige gegen diese gerichtete Anti
körper binden. Die Epitope entsprechen Teilsequenzen des
FaS-Proteins, so daß spezifisch anti-Fas-Antikörper aus
dem Eluat gemäß (e) isoliert werden. Damit steht zur Be
handlung von Erkrankungen mit erhöhten extrazellulären
FasL-Titern, insbesondere TEN, ein hochspezifisches Arz
neimittel zur Verfügung.
Diese durch die Verfahrensschritte (a) bis (g) erhaltene
anti-Fas-Antikörper-Subfraktion wird vorteilhafterweise
galenisch noch dadurch aufbereitet, daß die isolierten
anti-Fas-Antikörper nach ihrer Sequenzierung mit gängigen
gentechnologischen Verfahren in humanisierter Form Ver
wendung finden. Dieser Schritt erweist sich dann als er
forderlich, wenn die den Verfahren zugrundeliegende Zu
sammensetzung nicht humanes Blutprodukt darstellt, son
dern z. B. tierischen Ursprungs ist. Die nach den oben be
schriebenen Verfahren 10 bis 12 erhaltenen Verfahrenspro
dukte werden zur Herstellung eines Arzneimittels zur Be
handlung von humanen oder tierischen Zustände mit patho
physiologisch erhöhten extrazellulären FasL-Titern, ins
besondere zur Behandlung von toxischer epidermaler Nekro
lyse, graft-versus-host disease, Hepatitis, fulminater
Hepatitis, Autoimmunthyroiditis, malignen Tumorerkrankun
gen oder HIV verwendet.
Die vorliegende Erfindung wird durch die nachstehenden
Fig. 1 bis 11, sowie durch Tabelle 1 näher erläutert:
Fig. 1 stellt einen Hautgewebeschnitt eines TEN-
Patienten dar. Zu erkennen ist, daß die Epidermis ((durch
ein Symbol markiert) sich von der darunter befindlichen
Epidermis abgelöst hat, ein charakteristisches pathologi
sches Phänomen bei TEN-Patienten.
Fig. 2 dokumentiert die charakteristisch erhöhten Serum
titer von löslichem FasL (sFasL) bei TEN-Patienten. Die
sFasL-Konzentrationen liegen oberhalb von 0,5 ng/ml in
deren Seren. Dagegen sind die Serumkonzentrationen von
gesunden Kontrollpersonen oder Patienten mit einer ande
ren Hauterkrankung (MPR: makulös-populärer Hautaus
schlag), die gleichfalls als Negativkontrolle eingesetzt
wurden, hinsichtlich der sFasL-Titer unauffällig.
Fig. 3 zeigt einen Gewebeschnitt der Haut von Ten-
Patienten nach histologischer Auswertung. Die Symbole
deuten auf apoptotische Keratinozyten hin.
Die folgenden Fig. 4 bis 7 verdeutlichen, daß eine
hochregulierte FasL-Produktion von Keratinozyten für den
Fas-vermittelten apoptotischen Untergang von Keratino
zyten (s. Fig. 3) verantwortlich ist.
Fig. 4 zeigt zur Überprüfung einen Immunoblot von mono
klonalen Antikörpern, gerichtet gegen FasL. Spur 1 ent
hält ein 293-scheintransfiziertes Zellysat, Spur 2 ein
293-FasL-transfiziertes Zellysat. Die Antikörperreaktion
ist spezifisch gegen die entsprechend transfizierten Zel
len gerichtet.
In Fig. 5 werden Abbildungen von Hautgewebeschnitten
dargestellt, die immunohistochemisch untersucht wurden.
Die Schnitte von Hautgeweben gesunder Personen und von
TEN-Patienten wurden mit anti-FasL-Antikörpern behandelt.
Zur Kontrolle wurden Kontroll-Antikörper eingesetzt, die
die unspezifische Antikörperreaktion wiedergeben. Deut
lich ist in der mittleren Darstellung der oberen Reihe
die starke Antikörperreaktion gegen FasL in der Epidermis
von TEN-Patienten zu erkennen.
Fig. 6 spiegelt das Resultat (mit statistischen Fehlern)
der Experimente mit Fas-sensitiven Jurkat-Zellen wider,
die auf Kryohautgewebeschnitte von gesunden, TEN- und
MPR-Patienten geschichtet wurden. Die Balken geben den
Prozentsatz der jeweils nach 6-stündiger Inkubation apop
totischen Jurkat-Zellen wieder, so wie durch Flußcytome
trie bestimmt. Hierbei lösen die Gewebe von TEN-Patienten
eine signifikant erhöhte apoptotische Reaktion aus. Diese
wird durch FasL-blockierende Antikörper (NOK1) stark ver
ringert (4. Balken) (Kontrolle).
Fig. 7 zeigt schließlich die Lebensfähigkeit von Jurkat-
Zellen bzw. primären humanen Keratinozyten gegenüber
rhsFasL (Alexis Corporation) nach 6- bzw. 16-stündiger
gemeinsamer Inkubation. Dabei erweisen sich auch Kera
tinozyten als FasL-sensitiv.
Die folgenden Fig. 8 bis 11 stellen die Inhibition der
Fas-vermittelten Apoptose durch anti-Fas-Antikörper dar,
die in IVIG-Gemischen enthalten sind.
Dabei gibt Fig. 8 die protektive Funktion von IVIG-
Gemischen auf verschiedene Zellinien (HEK: primäre humane
Keratinozyten, HaCaT: humane Keratinozyten, HepG2: Hepa
tocarcinomzellen, A20: Fas-sensitive lymphoblastoide Zel
linien) wieder, die sich nach Zugabe von Apoptose auslö
sendem rhsFasL ergibt. Gemessen wurde der Prozentsatz der
vor der Apoptose bewahrten Zellen (Lebensfähigkeit), be
zogen auf die Lebensfähigkeit der Zellen in Abwesenheit
von rhsFasL. Die Ergebniss der Vergleichsversuche ohne
IVIG bzw. mit Albumin (zur Beurteilung unspezifischer Re
aktionen) sind gleichfalls aufgetragen. Die protektive
Wirkung von IVIG-Gemischen (im Vergleich zu Ansätzen ohne
Zugabe von IVIG-Gemischen) ist für alle sensitiven Zelli
nien erkennbar.
Fig. 9 beschreibt die Wirkung von IVIG-Gemischen auf die
Bindung von FasL an Fas und von TRAIL (einem anderen
Apoptose auslösenden Liganden) an den Rezeptor TRAIL R2
(rechts). Die Bindung von dem Liganden an den Rezeptor
wurde so gemessen, wie bei Schneider et al., J. Exp. Med.
1197, 1-9, 1998 und Schneider et al. J, Biol. Chem. 272,
18827-18833, 1997 beschrieben. Die linke Darstellung in
Fig. 9 zeigt die inhibierende Wirkung von IVIG-Gemischen
auf die Bindung von FasL an Fas.
Fig. 10 zeigt durch immunochemische Reaktion, daß IVIG-
Gemische positiv gegenüber Fas reagieren, dagegen aber
nur eine schwache Reaktion gegenüber TNFR1 (linke Dar
stellung) zeigen. Die mittlere und die rechte Darstellung
sind Kontrollversuche. IVIG-Gemische weisen also anti-
Fas-Antikörper auf.
Fig. 11 zeigt die Lebensfähigkeit (als Prozentsatz der
Kontrollzellen) gegen rhsFasL nach Präinkubierung mit
Träger, IVIG, Fas-Fc-Fusionsprotin oder TAIL2-Fc immu
noadsorbiertem IVIG-Gemisch (als Kontrolle). Wiederum be
wahrt das IVIG-Gemisch die hier eingesetzten A20-Zellen
weitgehend vor der Apoptose. Etwaige anti-TRAIL-2-
Antikörper sind - wie durch den Kontrollversuch gezeigt -
ohne Bedeutung für die protektive Wirkung des IVIG-
Gemisches.
Tabelle 1 gibt die klinischen Daten von 10 TEN-Patienten
wieder, die mit IVIG-Gemischen behandelt wurden. Im ein
zelnen sind angegeben: (a) Alter/Geschlecht Patienten,
(b) die von Erythemata bzw. Epidermis-Ablösung betroffene
Körperoberfläche, (c) der medikamentöse Auslöser für TEN,
(d) die verabreichte Dosis des IVIG-Gemisches in g/kg/d
bzw. die Dauer der Behandlung mit IVIG in Tagen, (e) der
Zeitraum vom Beginn der klinischen Symptome bis zum Be
handlungsbeginn in Tagen, (f) der Zeitraum bis zur klini
schen Reaktion auf die Behandlung bzw. der Hautheilung.
Die vorliegende Erfindung wird durch die nachfolgenden
Ausführungsbeispiele näher erläutert.
Erfindungsgemäß wurde gezeigt, daß das Lyell's Syndrom
(TEN) in seiner Ätiologie auf erhöhten löslichen FasL-
Titern in den Seren von betroffenen Patienten beruht.
Hierzu wurden vergleichsweise Blutseren von klinisch auf
fälligen Personen mit jenen von gesunden Kontrollpersonen
verglichen. Der klinischen Auffälligkeit von TEN-
Patienten lag die Beobachtung zugrunde, daß diese an zu
sammenhängenden, häufig dunkelfarbigen Erythemen leiden,
wobei eine spontane Ablösung der Epidermis (von der Der
mis) zu beobachten ist, genauso wie im übrigen auch Muco
sa-Erytheme und Geschwüre. Die klinische auffällige Epi
dermisablösung wurde durch histologische Befunde bei al
len TEN-Fällen bestätigt. Bei allen untersuchten TEN-
Patienten betrug die Fläche der erythematösen und abgelö
sten Epidermis 60 oder mehr Prozent der gesamten Körper
oberfläche (Fig. 1).
Der Nachweis der löslichen FasL-Fraktion im Serum der un
tersuchten Patienten wurde durch ELISA geführt. Hierbei
ergab sich eine 100%ige Korrelation zwischen hohen FasL-
Titern bei TEN-Patienten und annähernd nicht nachweisba
ren Titern bei gesunden Kontrollpersonen (Fig. 2). Se
rum-Aliquots wurden Patienten mit voll ausgebildeter TEN
bzw. gesunden Kontrollpatienten entnommen und mit einem
sFasL ELISA-KIT (Medical & Biological Laboratories Ltd,
unter Einsatz der anti-FasL Antikörper mAb 4H9 und 4A5)
untersucht. Die gesunden Kontrollpatienten waren jünger
als 40 und ohne Befund in bezug auf Haut- oder systemi
sche Krankheiten.
Weiterhin wurde erfindungsgemäß gezeigt, daß bei TEN-
Patienten der klinisch auffälligen Ablösung der Epidermis
eine Apoptose der Keratinozyten vorausgeht (Fig. 3). Da
bei handelt es sich um ein früh sich morphologisch mani
festierendes Ereignis dieses Syndroms. Um festzustellen,
ob und, wenn ja, auf welche Weise es einen Zusammenhang
zwischen der Keratinozyten-Apoptose und den auffälligen
FasL-Serum-Titern gibt, wurden sowohl die Fas- als auch
die FasL-Expression in den Hautproben von TEN-Patienten
(N = 7) untersucht und mit jenen von gesunden Kontroll
personen (N = 5) verglichen (Fig. 5). Die Hautbiopsien
wurden von TEN-Patienten aus der Grenzfläche zwischen ab
gelöster und nicht-abgelöster Haut entnommen. Die Biopsi
en wurden entweder in flüssigem Stickstoff eingefroren
oder in Paraformaldehyd (4%) fixiert. Die Immunohistoche
mie wurde an den Kryoschnitten, wie bei French et al., J.
Cell Biol. 133, 335-343, 1996 beschrieben, durchgeführt.
Hierbei wurden monoklonale anti-FasL-Antikörper (All,
Alexis Corp., beschrieben bei Hahne et al. Science 274,
1363-1366, 1996) und monoklonale anti-Fas-Antikörper
(UB2, Immunotech) und isotope Kontroll-Antikörper einge
setzt. Die histologischen Hautschnitte von TEN-Patienten
zeigten eine starke Keratinozyten-Apoptose, eine nach im
munohistochemischem Nachweis mit anti-FasL-Antikörper
(mAb All), eine im Vergleich zu gesunden Kontrollpersonen
stark erhöhte FasL-Expression und eine gleichfalls, ver
glichen mit gesunden Kontrollpersonen, nahezu unveränder
te Fas-Expression auf der Zelloberfläche.
Schließlich wurde für TEN erfindungsgemäß gezeigt, daß
die für TEN charakteristische Apoptose von Keratinozyten
tatsächlich durch den FasL/Fas-Signaltransduktionsweg
ausgelöst wird. Hierzu wurde die lytische Aktivität von
kutanem FasL in vitro untersucht. Gefrierschnitte der
Haut von gesunden Kontrollpersonen (N = 5) und TEN-
Patienten (N = 3) wurden mit Fas-sensitiven Jurkat-Zellen
für die Dauer von sechs Stunden in Kontakt gebracht und
anschließend die Apoptose der Jurkat-Zellen mit Hilfe ei
nes Annexin FITC-Tests oder eines Cytochrom c-Tests be
stimmt. Erfindungsgemäß wurde hierbei festgestellt, daß
die TEN-Hautschnitte in reproduzierbarer Weise (sowohl
mit dem Annexin-FITC als auch mit dem Cytochrom c-Assay)
drei- bis vierfach so viele Jurkat-Zellen abtöten wie
entsprechende Hautschnitte von gesunden Kontrollpersonen
(Fig. 6).
Weiterhin wurde experimentell gezeigt, daß in Gegenwart
von FasL-blockierenden Antikörpern (NOK 1) die durch die
TEN-Hautgewebeschnitte induzierte Cytotoxizität bei den
Jurkat-Zellen vollständig ausgeschaltet wurde (Fig. 6).
Hierzu wurden die Gewebeschnitte für 30 Minuten mit anti-
FasL-Antikörpern (NOK 1, 2,5 µg/ml, Pharmingen) vorinku
biert, anschließend auf die Fas-sensitiven Jurkat-Zellen
(humane Leukämiezellen) gelegt, so wie bereits bei Strand
et al., Nature Medicine 2, 1361-1366, 1996 oder bei
Büchner et al., Journal Clinical Investigation 100, 2691-
2699, 1997, beschrieben. Auch hier wurde die Anzahl der
durch Apoptose lytischen Jurkat-Zellen mit Hilfe der
Flußcytometrie unter Einsatz des Annexin-FITC
(Pharmingen, so wie bei Vermes, Haanen, Steffens-Nakken,
Reutelingsperger, Journal Immunology Methods, 184, 39-51,
1995) beschrieben), gemessen. Auch die Zugabe von lösli
chem rekombinantem menschlichem FasL (rhs FasL) ergab er
findungsgemäß, daß menschliche Keratinozyten in dessen
Gegenwart apoptosesensitiv sind (Fig. 7). Hierzu wurden
mit FLAG markierte lösliche rekombinante FasL-Proteine
(Alexis Corporation) mit Jurkat-Zellen für die Dauer von
sechs bzw. sechzehn Stunden inkubiert und anschließend
die Lebensfähigkeit mit Hilfe eines Proliferationstests
(WST-1, Boehringer, Mannheim, Deutschland) bestimmt.
In diesem zweiten Ausführungsbeispiel wurde erfindungsge
mäß gezeigt, daß IVIG (intravenöses Immunglobulin) als
Blutprodukt, das aus "gepooltem" Plasma von gesunden
Spendern hergestellt wird, als Inhibitor der durch
FasL/Fas vermittelten Apoptose fungieren kann.
Hierzu wurden Keratinozyten vor ihrer Exposition gegen
über rhsFasL gemeinsam mit IVIG inkubiert. Dabei wurde
festgestellt, daß bei rhs-FasL-Konzentrationen, die eine
75%ige Keratinozyten-Apoptose zu induzieren vermögen, die
Zugabe von IVIG, nämlich 30 mg/ml (berechnet entsprechend
der täglichen Dosis für die Behandlung eines 60 kg schwe
ren Patienten) vollständig die Fas/FasL bedingte Kera
tinozyten-Apoptose inhibiert. Bei diesem Experiment wur
den Keratinozyten der Zellinie HaCaT, Hepatokarzinom-
Zellen (HepG2), Fas-sensitive Zellen A20 und Fas
resistente Lymphoblastoid-Zellinien A20R mit IVIG (und
Albumin als Kontrolle) inkubiert und schließlich lösli
ches FasL hinzugefügt (Fig. 8).
Die protektive Wirkung von IVIG ist dabei nicht auf die
zuvor genannten Keratinozyten beschränkt, sondern erfaßt
alle Fas-sensitiven Zellen. Im vorliegenden Experiment
wurde zudem nachgewiesen, daß IVIG spezifisch wirkt, da
ähnliche Konzentrationen von Albumin keine Apoptose-
Protektion bewirken.
In einem weiteren Experiment zur Aufklärung des Wirkungs
mechanismus von IVIG wurde gezeigt, daß dessen protektive
Wirkung auf einer Inhibition des Fas-vermittelten Zell
tods beruht, indem der Fas-Rezeptor, nicht aber der Fas-
Ligand (FasL) blockiert wird. Dabei wurde ein IVIG-
Gemisch mit rhsFasL präinkubiert und diese präinkubierte
Mischung schließlich mit den vorgenannten Zellinien kon
taktiert. Hierbei konnte keine lytische, d. h. apoptoti
sche Wirkung auf die Zellen dieser Zellinien festgestellt
werden.
In einem weiteren Experiment im Rahmen dieses Ausfüh
rungsbeispiels wurde schließlich nochmals mit Hilfe eines
ELISA bestätigt, daß IVIG-Gemische die Fas/FasL-
Interaktion inhibieren. Hierzu wurde die Rezeptor-
Liganden-Interaktion in An- oder Abwesenheit von IVIG be
stimmt. Im Ergebnis wurde dokumentiert, daß die Bindung
von rhsFasL an Fas-Fc-Fusionsprotein signifikant durch
IVIG inhibiert wird, während die Bindung von löslichem
TRAIL an seinem Rezeptor TRAIL R2 (hier als TRAIL R2-Fc-
Fusionsprotein eingesetzt) durch das IVIG-Gemisch nicht
blockiert wurde. Auch bei TRAIL handelt es sich um einen
die Apoptose auslösenden Liganden, auf dessen Bindungsin
hibition auch die protektive Wirkung von IVIG hätte beru
hen können. Dieses Vergleichsexperiment ergibt wiederum,
daß durch ein IVIG-Gemisch spezifisch die FasL/Fas-
Interaktion blockiert wird.
Dieses Ausführungsbeispiel dient der Bestimmung der mole
kularen Ursache für die inhibitorische Wirkung von IVIG.
Um zu zeigen, daß diese Wirkung auf in der IVIG-
Zusammensetzung natürlicherweise vorhandenen anti-Fas-
Antikörpern beruht, wurde untersucht, ob ein Bestandteil
des IVIG-Gemisches an menschliches Fas bindet und
schließlich, ob eine anti-Fas-Antikörper negative IVIG-
Fraktion dessen Fähigkeit zur Inhibition der Fas-
vermittelten Apoptose beseitigt.
Hierzu wurde auf einem Gel eine Immunodetektion vorgenom
men. Das IVIG-Gemisch wurde gegen Albumin (zur Kontrolle)
oder gegen gereinigte rekombinante Proteinkonstrukte ein
gesetzt, die aus der extrazellulären Domäne des humanen
Fas (sog. Fas-Comp) oder der extrazellulären Domäne des
Tumornekrose-Faktor-Rezeptors (TNFR1-Comp), jeweils ver
schmolzen mit einem 55 Aminosäure langen Linker, beste
hen. Hierbei bezeichnet "Comp" den Linker, wie er sich
auch bei Terskikh et al., Proceedings of the National
Academy of Science, USA, 94, 1663-1668, 1997, beschrieben
findet. Diese Experimente zeigen, daß für IVIG-Gemische
deutlich positive Signale gegenüber Fas-Comp, nicht aber
gegenüber Albumin, und nur schwache Signale gegenüber
TNFR1-Comp detektiert werden (Fig. 10). Dies läßt darauf
schließen, daß zumindest eine geringfügige anti-TNFR1-
Aktivität in IVIG-Gemischen vorhanden sein könnte. Eine
Beseitigung der anti-Fas-Antikörper aus dem IVIG-Gemisch
durch mehrmaliges Aufreinigen über Fas-Fc-Fusionsprotein-
Affinitätschromatographiesäulen beweist, daß durch den
Verlust der anti-Fas-Antikörper sowohl die Bindungsfähig
keit von IVIG an Fas-Comp als auch die Blockade des Fas-
vermittelten Zelltods beseitigt wird.
In einer offenen, nicht kontrollierten Pilotstudie wurden
10 verschiedene Patienten mit TEN in drei verschiedenen
Krankenhäusern (Genf, Lausanne und Bern) mit IVIG behan
delt, wobei die bei den Patienten eingesetzten Dosierun
gen von 0,2 bis 0,75 g/kg/d für die Dauer von vier auf
einanderfolgenden Tagen betrugen. Bei allen 10 Patienten
wurde die Progression von TEN schnell nach der IVIG-
Gemisch-Infusion (innerhalb von 24 bis 48 Stunden) unter
brochen. Gegenwirkungen stellten sich nicht in signifi
kantem Maß ein, vielmehr wurde eine schnelle Hautheilung
beobachtet (s. Tabelle 1). Damit wurde in einer klini
schen Studie die therapeutische Wirkung von IVIG bei TEN-
Patienten erfindungsgemäß erstmals gezeigt.
Claims (13)
1. Verwendung einer Zusammensetzung zur Herstellung eines
Arzneimittels zur Behandlung von humanen oder tieri
schen Erkrankungen mit pathophysiologisch erhöhten ex
trazellulären FasL-Titern, dadurch gekennzeichnet, daß
die Zusammensetzung die FasL/Fas-Rezeptor-Interaktion
inhibierende anti-Fas-Antikörper enthält.
2. Verwendung einer Zusammensetzung zur Herstellung eines
Arzneimittels nach Anspruch 1 zur Behandlung von
toxischer epidermaler Nekrolyse, graft-versus-host di
sease, Hepatitis, fulminanter Hepatitis, Autoimmunthy
roiditis, malignen Tumorerkrankungen oder HIV.
3. Verwendung einer Zusammensetzung zur Herstellung eines
Arzneimittels nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekenn
zeichnet, daß die Zusammensetzung ein IVIG-Gemisch
ist.
4. Verfahren zur prophylaktischen in vitro Eignungs- bzw.
Qualitätskontrolle einer Zusammensetzung, insbesondere
eines IVIG-Gemisches, für die Verwendung derselben zur
Herstellung eines Arzneimittels nach einem der Ansprü
che 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die FasL/Fas-
Rezeptor-Interaktion inhibierende anti-Fas-Antikörper
titer der Zusammensetzung, insbesondere eines IVIG-
Gemisches, immunologisch bestimmt werden.
5. Verfahren zur prophylaktischen Eignungs- bzw. Quali
tätskontrolle einer Zusammensetzung, insbesondere ei
nes IVIG-Gemisches, nach Anspruch 4, dadurch gekenn
zeichnet, daß
- a) Präparationen von Fas-Fc-Fusionsprotein mit einer Zusammensetzung, insbesondere einem IVIG-Gemisch, inkubiert werden,
- b) markiertes FasL der gemäß Verfahrensschritt (a) inkubierten Lösung zugesetzt wird, und
- c) der Anteil von an Fas-Fc-Fusionsprotein gebundenem FasL physikalisch oder chemisch bestimmt wird.
6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß
der Anteil von an Fas-Fc-Fusionsprotein gebundenem
FasL spektroskopisch, insbesondere photochemisch durch
Absorption im sichtbaren oder nahen UV-Bereich, be
stimmt wird.
7. Verfahren zur prophylaktischen Eignungs- bzw. Quali
tätskontrolle einer Zusammensetzung, insbesondere ei
nes IVIG-Gemisches, nach Anspruch 4, dadurch gekenn
zeichnet, daß
- a) Fas-sensitive Zellen mit einer Zusammensetzung, insbesondere einem IVIG-Gemisch, vorinkubiert werden,
- b) dieser vorinkubierten Präparation lösliches FasL zugesetzt wird, und
- c) schließlich die Anzahl der durch FasL/Fas- Interaktion apoptotischen Fas-sensitiven Zellen bestimmt wird.
8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß
die Bestimmung der Anzahl der apoptotischen Fas-
sensitiven Zellen gemäß Verfahrensschritt (c) durch
einen Annexin-FITC-Zelltodtest oder die Bestimmung der
Lebensfähigkeit mit Hilfe eines Zellproliferations
tests durchgeführt wird.
9. Verfahren zur prophylaktischen Eignungs- bzw. Quali
tätskontrolle einer Zusammensetzung, insbesondere ei
nes IVIG-Gemisches, nach Anspruch 4, dadurch gekenn
zeichnet, daß
- a) ein extrazellulärer Abschnitt von Fas durch "Western-Blotting-Techniken" mit einer Zusammen setzung, insbesondere einem IVIG-Gemisch kombi niert wird, und
- b) an den extrazellulären Abschnitt von Fas gebunde ne anti-Fas-Antikörper aus der Zusammensetzung, insbesondere dem IVIG-Gemisch, durch markierte gegen anti-Fas-Antikörper gerichtete Sekundäran tikörper identifiziert werden.
10. Verfahren zur Herstellung eines Arzneimittels mit ge
steigerter pharmazeutischer Wirksamkeit zur Behandlung
von humanen oder tierischen Erkrankungen mit erhöhten
extrazellulären FasL-Titern, dadurch gekennzeichnet,
daß
- a) eine Zusammensetzung, insbesondere ein IVIG- Gemisch, biochemisch fraktioniert wird,
- b) sämtliche gemäß Verfahrensschritt (a) erhaltenen Fraktionen nach einem Verfahren nach einem der Ansprüche 4 bis 9 untersucht und deren jeweilige anti-Fas-Antikörpertiter bestimmt werden,
- c) die Fraktion oder solche Fraktionen, die anti- Fas-Antikörper enthält (enthalten), isoliert wird (werden), und
- d) schließlich die gemäß Verfahrensschritt (c) er haltene(n) Fraktion(en) aufkonzentiert wird (werden).
11. Verfahren zur Herstellung eines Arzneimittels mit ge
steigerter pharmazeutischer Wirksamkeit nach Anspruch
10, dadurch gekennzeichnet, daß
- a) eine Zusammensetzung, insbesondere ein IVIG- Gemisch, biochemisch fraktioniert wird,
- b) sämtliche gemäß Verfahrensschritt (a) erhaltene Fraktionen nach einem Verfahren nach einem der Ansprüche 4 bis 9 untersucht und deren jeweilige anti-Fas-Antikörpertiter bestimmt werden,
- c) die Fraktion oder solche Fraktionen, die anti- Fas-Antikörper enthält (enthalten), isoliert wird (werden),
- d) anti-Fas-Antikörper in aufgereinigter Form durch Affinitätschromatographie, insbesondere durch ein säulenchromatographisches Verfahren, mittels Fas- Fusionsprotein als auf dem Träger angekuppeltem Liganden isoliert werden, und
- e) die gebundenen anti-Fas-Antikörper eluiert werden.
12. Verfahren zur Herstellung eines Arzneimittels mit ge
steigerter pharmazeutischer Wirksamkeit nach Anspruch
10 oder 11, dadurch gekennzeichnet, daß
- a) eine Zusammensetzung, insbesondere ein IVIG- Gemisch, biochemisch fraktioniert wird,
- b) sämtliche gemäß Verfahrensschritt (a) erhaltenen Fraktionen nach einem der Verfahren nach einem der Ansprüche 4 bis 9 untersucht und deren anti- Fas-Antikörpertiter bestimmt werden,
- c) die Fraktion oder solche Fraktionen, die anti- Fas-Antikörper enthält (enthalten), isoliert wird (werden),
- d) anti-Fas-Antikörper in aufgereinigter Form durch Affinitätschromatographie, insbesondere durch ein säulenchromatographisches Verfahren, mittels Fas- Fusionsprotein als auf dem Träger angekuppeltem Liganden isoliert werden,
- e) die gebundenen anti-Fas-Antikörper eluiert wer den,
- f) aus dem Eluat epitopspezifische anti-Fas- Antikörper isoliert werden, indem jeweils ein oder mehrere spezifische(s) Epitop(e), die je weils Aminosäureseguenzen auf dem Fas-Protein entsprechen, auf dem Trägermaterial der chromato graphischen Säule(n) angekuppelt werden und nach folgend das gemäß Verfahrensschritt(e) erhaltene Eluat ein- oder mehrfach die Säule(n) passiert,
- g) schließlich die gebundenen anti-Fas-Antikörper eluiert werden.
13. Verwendung eines Verfahrensprodukts, erhalten aus ei
nem der Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 12,
zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von
humanen oder tierischen Erkrankungen mit pathophysio
logisch erhöhten extrazellulären FasL-Titern, insbe
sondere zur Behandlung von toxischer epidermaler Ne
krolyse, graft-versus-host disease, Hepatitis, fulmi
nanter Hepatitis, Autoimmunthyroiditis, malignen Tu
morerkrankungen oder HIV.
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