WO2000040263A1 - Herstellung und verwendung einer zusammensetzung mit ivig zur behandlung von erkrankungen mit erhöhten extrazellulären fasl-titern - Google Patents

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fasl
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E. Lars French
Isabelle Viard
Jürg TSCHOPP
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Definitions

  • the invention relates to the use of compositions for the manufacture of medicaments for the treatment of human or animal conditions, diseases or disorders with pathophysiologically increased extracellular FasL titers (soluble FasL and / or membrane-based FasL), methods for prophylactic in vitro suitability or.
  • the present invention was therefore based on the object of identifying pathophysiological conditions, diseases and disorders based on increased apoptotic activity, and of developing a suitable, targeted pharmaceutical treatment for such maladjustments, which ultimately relates to apoptotic activity Excess reaction inhibits.
  • This object is achieved by the present invention through claims 1 to 4.
  • the present invention was based on the further object of identifying those constituents which are of use in substance mixtures which have hitherto been used for unspecific and partially unsuccessful treatment are the cause of therapeutic success. This also results in the task of procedures for suitability or To develop quality control of such non-specific substance mixtures, which ultimately allow unlimited successful medical use.
  • This object is solved by claim 5.
  • This object is solved by the subject matter of claims 11 and 14, respectively.
  • compositions which contain certain anti-Fas antibodies are suitable for the treatment of human or animal conditions with an excessive apoptotic reaction if this increases the apoptotic reaction is based on increased extracellular FasL titers (soluble and / or membrane-based FasL).
  • Such compositions can then be used to produce a medicament for the treatment of syndromes with the aforementioned etiology.
  • compositions which contain the anti-Fas antibodies which inhibit the FasL / Fas receptor interaction prove to be particularly suitable when they are used to treat toxic epidermal necrolysis (Lyell's syndrome), graft-versus-host disease, hepatitis , fulminant hepatitis, autoimmune thyroiditis (Hashimoto's thyroiditis), malignant tumor diseases (e.g. melanoma) or HIV.
  • the compositions mentioned contain antibodies which inhibit the FasL / Fas receptor interaction, in particular anti-Fas antibodies. These are preferably natural compositions, in particular blood products.
  • apoptiology based on apoptotic misregistration.
  • the aforementioned disease is based on a mass apoptotic death of epidermal cells. This ultimately leads to a separation of the dermis and epidermis with a fatal outcome in approximately 30% of the affected cases (Roujeau, Stern, New England Journal of Medicine 331, 1272-1285, 1994). While apoptosis of keratinocytes in the epidermis is usually a rare event, apoptosis of these cells is greatly increased in patients with toxic epidermal necrolysis.
  • IVIG intravenous immunoglobin, which is produced as a blood product from "pooled” plasma from healthy donors
  • FasL concentration soluble and / or membrane-bound FasL
  • TEN extracellular FasL
  • an effect of IVIG mixtures in the abovementioned diseases, which are based on increased FasL titers, can be determined if the IVIG mixtures contain anti-Fas-5 antibodies, which interact with Fas and the extracellular Block ligands FasL (soluble and / or membrane-bound).
  • IVIG mixtures as a natural blood product, however, only have the quality in individual cases that allows them to be used pharmaceutically effectively for the treatment of diseases or disorders that can be attributed to increased extracellular FasL titers (soluble and / or membrane-bound) to let.
  • FasL titers soluble and / or membrane-bound
  • sufficient anti-Fas antibody titers which inhibit the FasL / Fas interaction must be present.
  • immunological methods have been made available according to the invention which allow the anti-Fas antibody titer to be determined in any pharmaceutical compositions, but in particular in IVIG mixtures.
  • compositions specifically for the production of a medicament for the treatment of diseases which are based on increased extracellular FasL concentrations (soluble and / or membrane-bound). It makes sense to use the batches tested immunologically positive for treatment, while other batches without anti-Fas antibody activity are discarded after testing with the proposed in vitro methods according to the invention and thus their use for the treatment of the aforementioned diseases or their use for the manufacture of a drug for the treatment of the aforementioned diseases.
  • compositions in particular IVIG mixtures, with low specificity for use as medicaments for the treatment of diseases with high extracellular fibers.
  • Titers soluble and / or membrane-bound
  • Titers are now provided with a specific composition, produced by the methods according to the invention and tested for their quality and suitability, in particular a suitable blood product, for the above purpose.
  • a quantification of the anti-Fas antibody titer contained in the composition can also be carried out in order to ensure a specific and sufficient administration of the composition containing anti-Fas antibody to the patient depending on the particular extracellular FasL titer.
  • Such quantitative determinations can be carried out with the aid of a dose curve, it being possible, for example, to determine administration of the composition in which 50% of the cells are protected from the apoptosis triggered by FasL.
  • Fas in particular its extracellular domain, is first used as a ligand in the test system, a Fas-Fc fusion protein is particularly preferred which contains compositions which are potentially suitable for treating the abovementioned diseases, for example IVIG Mix, incubate.
  • FasL is added to the solution preincubated according to process step (a), and finally, according to the invention, the proportion of FasL bound to Fas or, for example, to Fas-Fc fusion protein is determined with the aid of physical or chemical methods. Spectroscopic methods are particularly suitable, in particular those spectroscopic methods that are based on absorption or fluorescence in the visible or near UV range.
  • the specialist has all the available, eg direct labeling of FasL with chromophores or antibodies directed against FasL, which in turn can then be labeled, for example, with chromophores.
  • the antibodies directed and labeled against FasL can recognize natural epitopes of FasL or can also be directed against labels on the FasL protein, namely, for example, introduced recombinant sections (for example against the so-called flag sequence).
  • a test system is provided which is based on the cell death mediated by FasL / Fas.
  • Fas-sensitive cell lines eg Jurkat cells or the lymphoblastoid cell line A20
  • FasL for example recombinant human soluble FasL
  • the composition examined contains anti-Fas antibodies that block the FasL / Fas transduction mechanism, the composition protects Fas-sensitive cells from apoptosis.
  • a composition thus proved to be suitable for use in the manufacture of a medicament for the treatment of the aforementioned disorders. Control experiments with cells resistant to the apoptosis triggered by Fas / FasL avoid a misinterpretation of the possibly positive results with the barrel-sensitive cell lines.
  • an annexin-FITC cell death test for example, as sold by Alexis Corporation, San Diego, USA, or an assay for determining the cell count can be used ability like Boehringer's, Mannheim, Germany, sold under the name WST-1.
  • immunoblotting methods have also proven to be suitable for use as a method for prophylactic suitability or quality control of potentially pharmaceutically active compositions for the treatment of the abovementioned diseases.
  • extracellular sections of Fas are blotted by blotting techniques with the compositions which may contain anti-Fas antibodies, e.g. also brought into contact with IVIG mixtures and then the components of the composition bound to Fas, that is to say any anti-Fas antibodies contained in the composition, are identified by secondary antibodies directed against them.
  • the secondary antibodies can be labeled for identification in any manner familiar to the person skilled in the art.
  • labels with enzymes that convert substrates quantifiable and measurable have proven to be particularly suitable.
  • the enzymes used for labeling may e.g. are horseradish peroxidase.
  • the markings on the secondary antibody positively determine those batches of the composition (for example IVIG mixtures or other blood products) that can be used for the targeted treatment of the aforementioned disorders.
  • compositions in particular natural blood products, but especially IVIG mixtures, which are generally suitable for the treatment of disorders or diseases with elevated FasL titers (soluble and / or membrane-bound), can also be a component of processes which serve to prepare or improve these compositions.
  • the purpose of this is to provide compositions, in particular natural blood products, with increased pharmaceutical effectiveness.
  • the compositions for example blood products and in particular IVIG mixtures, are initially biochemically fractionated. This fractionation step is carried out in a manner familiar to the person skilled in the art.
  • the fractions are examined for their suitability or quality, ie for the presence of any anti-Fas antibodies.
  • the previously described methods for example a receptor / ligand binding test, blotting techniques and / or cell death assays, are carried out. All of them are used alone or in combination to determine the anti-Fas antibody titer in the respective fraction.
  • the fraction (s) which have been tested positive for anti-Fas antibodies using the immunological methods mentioned above are isolated (method step (c)).
  • the fraction (s) is (are) concentrated so that pharmaceutically active anti-Fas antibodies which inhibit the FasL / Fas interaction are enriched.
  • the product of this production process has an increased anti-Fas antibody concentration, has an increased pharmaceutical activity and can then be used as a medicament for the treatment of disorders or diseases with increased extracellular FasL titers (soluble and / or membrane-bound) or for the production of a medicament be used to treat such disorders.
  • process step (d) of the above-described process for producing a medicament is carried out in such a way that the anti-Fas antibodies are obtained in purified form from the original composition, which is in particular an IVIG mixture.
  • Chromatographic methods are particularly suitable for this purpose, which determine the affinity between antigen and antibody for the purification. exploit. Therefore, column chromatography methods are very particularly preferred in which the antigen, here the Fas protein, particularly advantageously a Fas fusion protein, is coupled to the support.
  • the anti-Fas antibodies bound to, for example, the Fas fusion protein are finally eluted from the column by methods known to the person skilled in the art, for example by salt solutions (process step (e)).
  • the degree of purification of the anti-Fas antibodies suitable for use in the manufacture of a medicament can be increased further by repeating such a purification step, if necessary two or more times, preferably in conjunction with other biochemical purification methods.
  • the process for producing a medicament for the treatment of human or animal diseases with increased extracellular FasL titers is modified in such a way that a highly specific medicament is made available as a result.
  • the composition, as described above, which has been essentially purified by chromatographic methods, or in particular the "pooled" blood product is further treated in such a way that only anti-Fas antibodies are used as medicinal products which recognize certain epitopes on the Fas protein. This excludes the possibility that anti-Fas antibodies which stimulate apoptosis may also be included as a product of the cleaning, manufacturing or preparation process for later use as a medicament.
  • This goal is achieved in that one or more affinity chromatography step (s) of the elution of the anti-Fas antibodies according to process step (e) is (are) followed.
  • selected epitopes of the Fas protein which appear to be particularly suitable for inhibiting the FasL / Fas binding, are coupled onto the support as ligands on the support.
  • an epitope-specific anti-Fas antibody sub-fraction is isolated by process steps (a) to (g). in the For this purpose, after the elution (according to process step (e)), a process step is carried out individually in which the eluate obtained according to (e) is passed over one or more affinity chromatography columns.
  • epitopes are coupled to the carrier material, which bind any antibodies directed against them.
  • the epitopes correspond to partial sequences of the FaS protein, so that specifically anti-Fas antibodies are isolated from the eluate according to (e).
  • a highly specific drug is thus available for the treatment of diseases with increased extracellular FasL titers (soluble and / or membrane-bound), in particular TEN.
  • This anti-Fas antibody sub-fraction obtained by process steps (a) to (g) is advantageously galenically processed in such a way that the isolated anti-Fas antibodies are used in humanized form after they have been sequenced using conventional genetic engineering processes.
  • This step proves to be necessary if the composition on which the method is based is not a human blood product, but is, for example, of animal origin.
  • the process products obtained by the above-described process according to one of claims 11 to 13 are used for the production of a medicament for the treatment of human or animal conditions with pathophysiologically increased extracellular FasL titers (soluble and / or membrane-compatible), in particular for the treatment of toxic epidermal neuropathy.
  • monoclonal antibodies which are directed against Fas and which have an inhibitory effect on the cell apoptosis triggered by FasL / FasR are always suitable.
  • monoclonal antibodies are preferably of human origin or humanized by genetic engineering. These antibodies can also be produced by methods which not based on isolation from naturally occurring compositions (such as blood products), but also by any method familiar to the person skilled in the art, such as e.g. B. by methods of combinatorial chemistry for antibody production.
  • Anti-Fas antibodies with the corresponding potential to inhibit apoptosis are identified by isolation methods and biological test systems.
  • Figure 1 shows a skin tissue section of a TEN patient. It can be seen that the epidermis (marked by a symbol) has detached from the underlying epidermis, a characteristic pathological phenomenon in TEN patients.
  • Figure 2 documents the characteristically increased serum titer of soluble FasL (sFasL) in TEN patients.
  • the sFasL concentrations are above 0.5 ng / ml in their sera.
  • MPR macular popular rash
  • Figure 3 shows a tissue section of the skin of Ten patients after histological evaluation. The symbols indicate apoptotic keratinocytes.
  • FIGS. 4 to 7 clarify that a highly regulated FasL production of keratinocytes is responsible for the Fas-mediated apoptotic destruction of keratinocytes (see FIG. 3).
  • FIG. 4 shows an immunoblot of monoclonal antibodies directed against FasL for checking.
  • Lane 1 contains a 293 -translated cell lysate, lane 2 a 293 -FasL-transfected cell lysate. The antibody response is specifically directed against the correspondingly transfected cells.
  • FIG. 5 shows images of skin tissue sections that have been examined immunohistochemically.
  • the sections of skin tissues from healthy people and from TEN patients were treated with anti-FasL antibodies.
  • Control antibodies which represent the non-specific antibody reaction were used as controls.
  • the strong antibody response against FasL in the epidermis of TEN patients can be clearly seen in the middle representation of the upper row.
  • FIG. 6 reflects the result (with statistical errors) of the experiments with Fas-sensitive Jurkat cells, which were layered on cryoskin sections from healthy, TEN and MPR patients.
  • the bars show the percentage of apoptotic Jurkat cells after 6 hours of incubation, as determined by flow cytometry.
  • the tissues of TEN patients trigger a significantly increased apoptotic reaction. This is greatly reduced by FasL-blocking antibodies (NOK1) (4th bar) (control).
  • FIG. 7 finally shows the viability of Jurkat cells or primary human keratinocytes compared to rhsFasL (Alexis Corporation) after 6 or 16 hours of joint incubation. Keratinocytes also prove to be FasL sensitive.
  • Figures 8 to 11 represent the inhibition of Fas-mediated apoptosis by anti-Fas antibodies, which are contained in IVIG mixtures.
  • FIG. 8 shows the protective function of IVIG mixtures on different cell lines (HEK: primary human keratinocytes, HaCaT: human keratinocytes, HepG2: hepatocarcinoma cells, A20: Fas-sensitive lymphoblastoid cells lines) again, which results after adding rhsFasL that triggers apoptosis.
  • the percentage of cells saved from apoptosis (viability) was measured, based on the viability of the cells in the absence of rhsFasL.
  • the results of the comparative experiments without IVIG or with albumin (for assessing unspecific reactions) are also plotted.
  • the protective effect of IVIG mixtures (compared to batches without the addition of IVIG mixtures) can be seen for all sensitive cell lines.
  • FIG. 9 describes the effect of IVIG mixtures on the binding of FasL to Fas and of TRAIL (another ligand which triggers apoptosis) to the TRAIL R2 receptor (right). Binding of the ligand to the receptor was measured as described in Schneider et al. , J. Exp. Med. 1197, 1-9, 1998 and Schneider et al. J. Biol. Chem. 272, 18827-18833, 1997. The left representation in FIG. 9 shows the inhibitory effect of IVIG mixtures on the binding of FasL to Fas.
  • FIG. 10 shows by immunochemical reaction that IVIG mixtures react positively towards Fas, but only show a weak reaction towards TNFR1 (left illustration). The middle and the right representation are control attempts. IVIG mixtures therefore have anti-Fas antibodies.
  • FIG. 11 shows the viability (as a percentage of the control cells) against rhsFasL after preincubation with vehicle, IVIG, Fas-Fc fusion protein or TAIL2-Fc immuno-sorbed IVIG mixture (as a control).
  • IVIG largely protects the A20 cells used here from apoptosis.
  • Any anti-TRAIL-2 antibodies are - as shown by the control experiment - of no importance for the protective effect of the IVIG mixture.
  • Table 1 shows the clinical data of 10 TEN patients treated with IVIG mixtures.
  • the following are specified: (a) age / gender of the patient, (b) the body surface affected by erythema or epidermis detachment, (c) the medicinal trigger for TEN, (d) the dose of the IVIG mixture administered in g / kg / d or the duration of treatment with IVIG in days, (e) the period from the beginning of the clinical symptoms to the start of treatment in days, (f) the period until the clinical reaction to the treatment or skin healing.
  • TEN Lyell's syndrome
  • blood sera from clinically conspicuous persons were compared with those from healthy control persons.
  • the clinical conspicuousness of TEN patients was based on the observation that they suffer from coherent, often dark-colored erythema, with spontaneous detachment of the epidermis (from the dermis) being observed, as well as also mucosal erythema and ulcers.
  • Clinically noticeable epidermal detachment was confirmed by histological findings in all TEN cases. In all examined TEN patients, the area of the erythematous and detached epidermis was 60 or more percent of the total body surface (FIG. 1).
  • FasL serum titers were both Fas and FasL expression in the skin samples from TEN patients
  • the TEN skin incisions in a reproducible manner (both with the Annexin FITC and with the cytochrome c assay) kill three to four times as many Jurkat cells as corresponding skin incisions from healthy control persons (FIG. 6).
  • FasL antibodies Pre-incubated FasL antibodies (NOK 1, 2.5 ⁇ g / ml, Pharmingen), then on the Fas-sensitive Jurkat cells
  • IVIG intravenous immunoglobulm
  • keratinocytes were incubated together with IVIG prior to their exposure to rhsFasL. It was found that at rhs-FasL concentrations that are able to induce 75% keratinocyte apoptosis, the addition of IVIG, namely 30 mg / ml (calculated according to the daily dose for the treatment of a 60 kg patient), is complete that inhibits keratinocyte apoptosis caused by Fas / FasL.
  • keratinocytes from the HaCaT cell lines, hepatocarcinoma cells (HepG2), Fas-sensitive cells A20 and Fas-resistant lymphoblastoid cell lines A20R were incubated with IVIG (and albumin as a control) and finally soluble FasL was added (FIG. 8).
  • IVIG is not limited to the aforementioned keratinocytes, but covers all Fas-sensitive cells. In the present experiment it was also demonstrated that IVIG acts specifically, since similar concentrations of albumin do not cause apoptosis protection.
  • This embodiment serves to determine the molecular cause of the inhibitory effect of IVIG. In order to show that this effect is based on anti-Fas antibodies naturally present in the IVIG composition, it was investigated whether a component of the IVIG mixture binds to human Fas and finally whether an anti-Fas antibody negative IVIG fraction eliminates its ability to inhibit Fas-mediated apoptosis.
  • the IVIG mixture was used against albumin (as a control) or against purified recombinant protein constructs which originate from the extracellular domain of the human Fas (so-called Fas-Comp) or the extracellular domain of the tumor necrosis factor receptor (TNFRl-Comp), in each case fused with a 55 amino acid linker, best- hen.
  • Fas-Comp purified recombinant protein constructs which originate from the extracellular domain of the human Fas
  • TNFRl-Comp tumor necrosis factor receptor

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Abstract

Die Erfindung betrifft die Verwendung einer Zusammensetzung zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von humanen oder tierischen Erkrankungen mit pathophysiologisch erhöhten extrazellulären FasL-Titern, Verfahren zur prophylaktischen in vitro Eignungs- bzw. Qualitätskontrolle einer Zusammensetzung, insbesondere eines IVIG-Gemisches, für die Verwendung derselben zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung der vorgenannten Erkrankungen und Verfahren zur Herstellung eines Arzneimittels mit gesteigerter pharmazeutischer Wirksamkeit zur Behandlung von humanen oder tierischen Erkrankungen mit erhöhten extrazellulären FasL-Titern.

Description

HERSTELLUNG UND VERWENDUNG EINER ZUSAMMENSETZUNG MIT IVIG ZUR BEHANDLUNG VON ERKRANKUNGEN MIT ERHÖHTEN EXTRAZELLULÄREN FASL-TITERN
Die Erfindung betrifft die Verwendung von Zusammensetzungen zur Herstellung von Arzneimitteln zur Behandlung von humanen oder tierischen Zuständen, Erkrankungen oder Störungen mit pathophysiologisch erhöhten extrazellulären FasL-Titern (lösliches FasL und/oder embranständiges FasL) , Verfahren zur prophylaktischen in vitro Eignungsbzw. Qualitätskontrolle einer Zusammensetzung für deren spätere Verwendung zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung der vorgenannten Erkrankungen, pathophy- siologischen Zustände bzw. Störungen sowie Verfahren zur Herstellung eines Arzneimittels mit gesteigerter pharmazeutischer Wirksamkeit zur Behandlung oben genannter Er- krankungen Störungen oder pathophysiologischer Zustände.
Zur Aufrechterhaltung der physiologischen Homöostase ist eine im einzelnen fein differenzierte Kontrolle der Zell- proliferation erforderlich. Die Kontrolle der Zellproli- feration in lebenden Organismen gelingt u.a. durch den Mechanismus des programmierten Zelltods (Apoptose) . Aus der Literatur sind zahlreiche Signaltransduktionswege bekannt, die schließlich zum programmierten Zelltod führen. Hierbei spielt die Interaktion von extrazellulären Ligan- den, z.B. dem Fas-Liganden (FasL), mit diversen Zeiloberflächenrezeptoren, z.B. dem Fas-Rezeptor (Fas) oder dem TRAIL-Rezeptor, eine zentrale Rolle für die Auslösung der Apoptose. In diversen wissenschaftlichen Arbeiten wurde ein Zusammenhang zwischen dem Erscheinungsbild verschie- denster Krankheiten und einer hierfür ursächlichen pathologischen Fehlsteuerung der Apoptose hergestellt. (Steller, Science 267, 1445-1449, 1995, Thompson, Science 267, 1456-1462, 1995, Nagata, Cell 88, 355-365, 1997, Giordano et al . , Science 275, 960-963, 1997, Chervonsky et al . , Cell 89, 17-24, 1997). Sowohl eine überschießende apoptotische Reaktion als auch der Verlust extrazellulärer apoptotischer Signale führt zu pathophysiologischen Zuständen, Erkrankungen oder Störungen im lebenden Organismus. Dabei ist in vielen Fällen die exakte Ätiologie der apoptotischen Fehlfunktion unklar. In einigen Fällen wiederum wird nur ein Zusammenhang zwischen der fehlge- steuerten apoptotischen Kontrolle und dem jeweiligen Syn- drom vermutet. Eine spezifische, ursächlich ausgerichtete medizinisch-pharmazeutische Behandlung ist hingegen in keinem Fall gegeben.
Der vorliegenden Erfindung lag daher die Aufgabe zugrunde, pathophysiologische Zustände, Erkrankungen und Störungen zu identifizieren, die auf einer gesteigerten apoptotischen Aktivität beruhen, und für derartige Fehl- steuerungen eine geeignete, zielgerichtete und die Ursachen berücksichtigende pharmazeutischen Behandlung zu entwickeln, die schließlich auf die apoptotische Überschußreaktion inhibierend wirkt. Diese Aufgabe löst die vorliegende Erfindung durch die Ansprüche 1 bis 4. Darüber hinaus lag der vorliegenden Erfindung die weitere Aufgabe zugrunde, bei bislang zur unspezifischen und teilweise erfolglosen Behandlung eingesetzten Substanzmischungen, jene Bestandteile zu identifizieren, die für den therapeutischen Erfolg ursächlich sind. Hieraus ergibt sich weiterhin die Aufgabe, Verfahren zur Eignungsbzw. Qualitätskontrolle derartiger unspezifischer Substanzmischungen zu entwickeln, die schließlich eine un- eingeschränkt erfolgreiche medizinische Verwendung erlauben. Diese Aufgabe wird durch den Anspruch 5 gelöst. Weiterhin war es eine Aufgabe der Erfindung, derartige Substanzmischungen in ihrer pharmazeutischen Wirksamkeit so zu verbessern, daß sie zur Behandlung der vorgenannten Erkrankungen, Störungen oder pathophysiologischen Zustände eine erhöhte pharmazeutische Wirksamkeit aufweisen. Diese Aufgabe wird durch die Gegenstände der Ansprüche 11 bzw. 14 gelöst.
Die Erfinder haben gezeigt, daß die Verwendung von Zusammensetzungen, die gewisse gegen Fas gerichtete Antikörper (anti-Fas-Antikörper) enthalten, zur Behandlung von humanen oder tierischen Zuständen mit überschießender apopto- tischer Reaktion dann geeignet sind, wenn diese gestei- gerte apoptotische Reaktion auf erhöhten extrazellulären FasL-Titern (lösliches und/oder membranständiges FasL) beruht. Derartige Zusammensetzungen können dann zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Syndromen mit vorgenannter Ätiologie eingesetzt werden. Dabei er- weisen sich Zusammensetzungen, die die FasL/Fas-Rezeptor- Interaktion inhibierende anti-Fas-Antikörper enthalten, dann als besonders geeignet, wenn sie zur Behandlung von toxischer epidermaler Nekrolyse (Lyell's Syndrom) , graft- versus-host Erkrankung, Hepatitis, fulminanter Hepatitis, Autoimmunthyroiditis (Hashimoto 's Thyroiditis) , maligner Tumorerkrankungen (z. B. Melanome) oder HIV eingesetzt werden. Erfindungsgemäß wurde festgestellt, daß für die vorgenannten Erkrankungen zumindest im wesentlichen erhöhte extrazelluläre FasL-Titer (lösliches und/oder mem- branstandiges FasL) verantwortlich sind, die schließlich sensitive humane Zellen durch Apoptose abtöten. Die genannten Zusammensetzungen enthalten die FasL/Fas- Rezeptor- Interaktion inhibierende Antikörper, insbesondere anti-Fas-Antikörper. Es handelt sich bei diesen Zusam- mensetzungen vorzugsweise um natürliche Zusammensetzungen, insbesondere um Blutprodukte.
Im Fall der toxischen epidermalen Nekrolyse (TEN) wurde darüber hinaus erfindungsgemäß erstmals ein Zusammenhang mit einer auf apoptotischer Fehlsteuerung beruhenden Ätiologie hergestellt . Die vorgenannte Erkrankung beruht erfindungsgemäß auf einem massenhaften apoptotischen Tod von Epidermiszellen. Dies führt schließlich zu einer Se- parierung von Dermis und Epidermis mit einem tödlichen Ausgang in ungefähr 30% der betroffenen Fälle (Roujeau, Stern, New England Journal of Medicine 331, 1272-1285, 1994) . Während normalerweise die Apoptose von Keratino- zyten in der Epidermis ein seltenes Ereignis ist, ist die Apoptose dieser Zellen bei Patienten mit toxischer epidermaler Nekrolyse stark erhöht. Erfindungsgemäß wurde festgestellt, daß bei Patienten mit TEN ungewöhnlich hohe Titer von löslichem FasL in den entsprechenden Seren vorliegen. Aus verschiedenen Veröffentlichungen (Gutierrez- Steil et al . , Journal Clinical Investigations 101, 33-39, 1998, Berthou et al . , Journal Immunology 159, 5293-5300, 1997) ist weiterhin bekannt, daß Keratinozyten gewöhnlich nur wenig FasL exprimieren. Allerdings kann im Falle adäquater Stimulation die FasL-Produktion bei Keratinozyten induziert werden (Guiterrez-Steil et al . Journal Clinical Investigations 101, 33-39, 1998). Erfindungsgemäß wurde weiterhin gezeigt, daß Keratinozyten von TEN-Patienten eine hohe FasL-Expression aufweisen, während gesunde Kontrollpersonen insoweit unauffällig waren.
Außerdem wurde erfindungsgemäß nachgewiesen, daß das bisher unspezifische und nur im Einzelfall nur bei inflamma- torischen oder Autoimmunerkrankungen erfolgreich eingesetzte IVIG (Intravenöses Immunoglobin, das als Blutpro- dukt aus "gepooltem" Plasma von gesunden Spendern hergestellt wird) auch zur Behandlung von humanen oder tierischen pathophysiologischen Zuständen mit erhöhter extrazellulärer FasL-Konzentration (lösliches und/oder membranständiges FasL) , insbesondere TEN, eingesetzt werden kann. Weitere erfindungsgemäße Untersuchungen ergaben, daß eine Wirkung von IVIG-Gemischen bei den vorgenannten Erkrankungen, die auf erhöhten FasL-Titern beruhen, dann festzustellen ist, wenn die IVIG-Gemische anti-Fas- 5 Antikörper enthalten, die die Interaktion von Fas mit dem extrazellulären Liganden FasL (löslich und/oder membranständig) blockieren.
IVIG-Gemische als natürliches Blutprodukt weisen allerlei dings nur im Einzelfall jene Qualität auf, die es erlaubt, sie pharmazeutisch wirksam zur Behandlung jener Erkrankungen oder Störungen zum Einsatz zu bringen, die sich auf erhöhte extrazelluläre FasL-Titer (löslich und/oder membranständig) zurückführen lassen. Hierzu müs- 15 sen, wie erfindungsgemäß festgestellt, ausreichende, die FasL/Fas-Interaktion inhibierende anti-Fas-Antikörper- Titer vorliegen. Um eine frühzeitige Eignungs- bzw. Qualitätskontrolle der natürlichen Blutplasmaprodukte durchführen zu können, wurden erfindungsgemäß immunologische 20 Verfahren zur Verfügung gestellt, die eine Bestimmung der anti-Fas-Antikörper-Titer in beliebigen pharmazeutischen Zusammensetzungen, insbesondere aber in IVIG-Gemischen, erlauben. Erst nach einer derartigen Eignungs- bzw. Qualitätskontrolle ist eine zielgerichtete Verwendung derar- 25 tiger Zusammensetzungen zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Erkrankungen, die auf erhöhten extrazellulären FasL-Konzentrationen (löslich und/oder membranständig) beruhen, möglich. Sinnvollerweise werden die immunologisch positiv getesteten Chargen zur Behand- 30 lung eingesetzt, während andere Chargen ohne anti-Fas- Antikörper-Aktivität nach dem Testen mit den vorgeschlagenen, erfindungsgemäßen in vitro Verfahren verworfen und damit ihre Verwendung zur Behandlung der vorgenannten Erkrankungen bzw. ihre Verwendung zur Herstellung eines 35 Arzneimittels zur Behandlung der vorgenannten Erkrankungen ausgeschlossen wird. Hierdurch wird neben Zusammensetzungen, insbesondere IVIG-Gemischen, mit geringer Spe- zifität für die Verwendung als Arzneimittel zur Behandlung von Erkrankungen mit hohen extrazellulären FasL- Titern (löslich und/oder membranständig) nunmehr eine spezifische, durch die erfindungsgemäßen Verfahren hergestellte und hinsichtlich ihrer Qualität und Eignung geprüfte Zusammensetzung, insbesondere also ein geeignetes Blutprodukt, für den obigen Zweck zur Verfügung gestellt.
Auch eine Quantifizierung des in der Zusammensetzung enthaltenen anti-Fas-Antikörpertiters kann vorgenommen werden, um in Abhängigkeit vom jeweiligen extrazellulären FasL-Titer beim Patienten eine spezifische und ausreichende Gabe der Zusammensetzung, die anti-Fas-Antikörper enthält, sicherzustellen. Derartige, quantitative Bestimmungen können mit Hilfe einer Dosiskurve vorgenommen werden, wobei beispielsweise Gaben der Zusammensetzung bestimmt werden können, bei denen 50% der Zellen vor der durch FasL ausgelösten Apoptose bewahrt werden.
Erfindungsgemäß erweisen sich als geeignete Verfahren zur prophylaktischen Eignungs- bzw. Qualitätskontrolle von natürlichen Zusammensetzungen mit einem quantifizierten und funktioneil bestätigten Inhibitionspotential auf die überschießende Apoptosereaktion, insbesondere also solche Systeme, die die Messung von Rezeptor/Liganden- Interaktion erlauben. Hierzu wird zunächst in einem Ver- fahrensschritt (a) Fas, insbesondere dessen extrazelluläre Domäne, als Ligand im Testsystem eingesetzt, insbesondere bevorzugt wird dabei ein Fas-Fc-Fusionsprotein, das mit potentiell zur Behandlung der vorgenannten Erkrankungen geeigneten Zusammensetzungen, also beispielsweise von IVIG-Gemischen, inkubiert wird. Anschließend wird markiertes FasL der gemäß Verfahrensschritt (a) vorinkubier- ten Lösung zugesetzt und schließlich erfindungsgemäß der Anteil von an Fas oder beispielsweise an Fas-Fc- Fusionsprotein gebundenem FasL mit Hilfe physikalischer oder chemischer Methoden bestimmt. Besonders geeignet sind dabei spektroskopische Methoden, insbesondere solche spektroskopischen Verfahren, die auf Absorption oder Fluoreszenz im sichtbaren oder nahen UV-Bereich beruhen. Hierbei stehen dem Fachmann alle ihm geläufigen Vorge- hensweisen zur Verfügung, z.B. eine direkte Markierung von FasL mit Chromophoren oder auch gegen FasL gerichtete Antikörper, die dann ihrerseits z.B. mit Chromophoren markiert sein können. Die gegen FasL gerichteten und markierten Antikörper können dabei natürliche Epitope von FasL erkennen oder auch gegen Markierungen auf dem FasL- Protein, nämlich beispielsweise eingeführte rekombinante Abschnitte (z.B. gegen die sog. Flag-Sequenz) , gerichtet sein.
Als weiteres für die Eignungs- bzw. Qualitätskontrolle von Zusammensetzungen, insbesondere von IVIG-Gemischen, der vorgenannten Art adäquates immunologisches Verfahren wird ein Testsystem zur Verfügung gestellt, das auf dem durch FasL/Fas vermittelten Zelltod beruht. Hierbei werden Zellen von Fas-sensitiven Zellinien (z.B. Jurkat- Zellen oder die lymphoblastoide Zellinie A20) mit der zu untersuchenden und auf ihre Eignung zu prüfenden Zusammensetzung vorinkubiert und anschließend dieser vorinku- bierten Präparation FasL zugesetzt (beispielsweise rekom- binantes humanes lösliches FasL) . Schließlich wird die Zahl derjenigen Fas-sensitiven Zellen ermittelt, die durch die FasL/Fas-Interaktion im Wege der Apoptose untergegangen sind. Enthält die untersuchte Zusammensetzung anti-Fas-Antikörper, die den FasL/Fas- Transduktionsmechanismus blockieren, so werden Fas- sensitive Zellen durch die Zusammensetzung vor der Apoptose bewahrt. Damit erwiese sich eine Zusammensetzung als zur Verwendung für die Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung der vorgenannten Störungen geeignet. Kontrollversuche mit gegenüber der durch Fas/FasL ausgelösten Apoptose resistenten Zellen vermeiden eine Fehlinterpretation der ggf. positiven Resultate mit den Fassensitiven Zellinien. Für die Bestimmung des durch die FasL-Aktivität bewirkten Ausmaßes der Apoptose unter den Fas-sensitiven Zellen kann beispielsweise ein Annexin- FITC Zelltodtest, wie er von der Alexis Corporation, San Diego, USA, vertrieben wird, oder auch ein Assay zur Bestimmung der Zellebensf higkeit, wie er von Boehringer, Mannheim, Deutschland, unter der Bezeichnung WST-1 vertrieben wird, herangezogen werden.
Darüber hinaus erweisen sich auch Immunoblotting-Methoden als geeignet, um als Verfahren zur prophylaktischen Eignungs- bzw. Qualitätskontrolle von potentiell pharmazeutisch wirksamen Zusammensetzungen zur Behandlung der vorgenannten Erkrankungen eingesetzt werden zu können. Hierbei werden extrazelluläre Abschnitte von Fas durch Blot- ting-Techniken mit den ggf. anti-Fas-Antikörper enthaltenden Zusammensetzungen, z.B. auch IVIG-Gemischen, in Berührung gebracht und daraufhin die an Fas gebundenen Bestandteile der Zusammensetzung, also ggf. in der Zusammensetzung enthaltene anti-Fas-Antikörper durch gegen diese gerichtete Sekundär-Antikörper identifiziert. Für die Identifizierung können die Sekundär-Antikörper auf jede dem Fachmann geläufige Weise markiert werden. Als besonders geeignet erweisen sich neben Markierungen mit Chromophoren auch Markierungen mit Enzymen, die quantifi- zierbar und meßbar Substrate umsetzen. Dabei kann es sich bei den zur Markierung verwendeten Enzymen z.B. um Mee- rettich-Peroxidase handeln. Auch bei diesem Verfahren werden durch die Markierungen am Sekundär-Antikörper jene Chargen der Zusammensetzung (also etwa von IVIG-Gemischen oder anderen Blutprodukten) positiv bestimmt, die zur zielgerichteten Behandlung der vorgenannten Störungen herangezogen werden können.
Die oben stehenden Verfahren zur prophylaktischen Eig- nungs- bzw. Qualitätskontrolle von Zusammensetzungen, insbesondere natürlichen Blutprodukten, vor allem aber IVIG-Gemischen, die sich grundsätzlich zur Behandlung von Störungen oder Erkrankungen mit erhöhten FasL-Titern (löslich und/oder membranständig) eignen, können auch Be- standteil von Verfahren sein, die der Aufbereitung oder Verbesserung dieser Zusammensetzungen dienen. Damit wird der Zweck verfolgt, Zusammensetzungen, insbesondere natürliche Blutprodukte, mit gesteigerter pharmazeutischer Wirksamkeit zur Verfügung zu stellen. Hierzu werden in einem Verfahrensschritt (a) die Zusammensetzungen, also beispielsweise Blutprodukte und insbesondere IVIG- Gemische, zunächst biochemisch fraktioniert. Dieser Frak- tionierungsschritt erfolgt auf dem Fachmann geläufige Art. In einem weiteren Verfahrensschritt (b) werden die Fraktionen auf ihre Eignung bzw. Qualität, d.h. auf das Vorliegen etwaiger anti-Fas-Antikörper hin untersucht. Dabei werden die vorher beschriebenen Verfahren, also z.B. ein Rezeptor/Ligandenbindungs-Test , Blotting- Techniken und/oder Zelltod-Assays ausgeführt. Sie alle dienen allein oder in Kombination zur Bestimmung der an- ti-Fas-Antikörper-Titer in der jeweiligen Fraktion. Daraufhin wird (werden) diejenige (n) Fraktion (en) isoliert, die mit Hilfe der z.B. vorgenannten immunologischen Ver- fahren positiv auf anti-Fas-Antikörper getestet wurden (Verfahrensschritt (c) ) . Schließlich wird (werden) in einem Verfahrensschritt (d) die oder diese Fraktion (en) au konzentriert , so daß pharmazeutisch wirksame und die FasL/Fas-Interaktion inhibierende anti-Fas-Antikörper an- gereichert werden. Das Produkt dieses Herstellungsverfahrens weist eine erhöhte anti-Fas-Antikörper-Konzentration auf, besitzt eine erhöhte pharmazeutische Wirksamkeit und kann dann als Arzneimittel zur Behandlung von Störungen oder Erkrankungen mit erhöhten extrazellulären FasL- Titern (löslich und/oder membranständig) oder zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung derartiger Störungen eingesetzt werden.
Dabei umfaßt das Einsatzgebiet derartiger Arzneimittel sowohl die Human- als auch die Veterinärmedizin.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird dabei der Verfahrensschritt (d) des vorbeschriebenen Verfahrens zur Herstellung eines Arzneimittels derart durchgeführt, daß die anti-Fas-Antikörper in aufgereinigter Form aus der ursprünglichen Zusammensetzung, die insbesondere ein IVIG-Gemisch ist, erhalten wird. Hierzu bieten sich insbesondere chromatographische Verfahren an, die die Affinität zwischen Antigen und Antikörper für die Aufreini- gung ausnutzen. Ganz besonders bevorzugt sind daher säu- lenchromatographische Verfahren, bei denen das Antigen, hier also das Fas-Protein, besonders vorteilhaft ein Fas- Fusionsprotein, auf dem Träger angekuppelt wird. Die am z.B. Fas-Fusionsprotein gebundenen anti-Fas-Antikörper werden schließlich durch dem Fachmann geläufige Verfahren, z.B. durch Salzlösungen, von der Säule eluiert (Verfahrensschritt (e) ) . Durch ggf. zwei oder mehrmalige Wiederholung eines solchen Reinigungsschritts, Vorzugs- weise verbunden mit anderen biochemischen Reinigungsverfahren, kann der Grad der Aufreinigung der für die Verwendung zur Herstellung eines Arzneimittels geeigneten anti-Fas-Antikörper weiter erhöht werden.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird das Verfahren zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von humanen oder tierischen Erkrankungen mit erhöhten extrazellulären FasL-Titern (löslich und/oder membranständig) derart modifiziert, daß im Ergebnis ein hochspezifisches Arzneimittel zur Verfügung gestellt wird. Hierzu wird die - wie oben beschrieben - im wesentlichen durch chromatographische Methoden vorgereinigte Zusammensetzung bzw. insbesondere das "gepoolte" Blutprodukt derart weiterbehandelt, daß nur solche anti-Fas- Antikörper als Arzneimittel Verwendung finden, die bestimmte Epitope auf dem Fas-Protein erkennen. Hiermit wird ausgeschlossen, daß auch ggf. die Apoptose stimulierende anti-Fas-Antikörper als Produkt des Reinigungs-, Herstellungs- bzw. Aufbereitungsverfahrens für die späte- re Verwendung als Arzneimittel enthalten sind. Dieses Ziel wird dadurch erreicht, daß ein oder mehrere affini- tätschromatographische Schritt (e) der Eluierung der anti- Fas-Antikörper gemäß Verfahrensschritt (e) nachgeschaltet wird (werden) . Hierbei werden auf dem Trägermaterial aus- gesuchte Epitope des Fas-Proteins, die zur Inhibierung der FasL/Fas-Bindung besonders geeignet erscheinen, als Liganden auf dem Träger angekuppelt. Im Ergebnis wird eine epitopspezifische anti-Fas-Antikörper-Subfraktion durch die Verfahrensschritte (a) bis (g) isoliert. Im einzelnen wird hierzu nach der Eluierung (gemäß Verfahrensschritt (e) ) ein Verfahrensschritt nachgeschaltet, bei dem das gemäß (e) erhaltene Eluat über eine oder mehrere Affinitätschromatographiesäulen geführt wird. Auf dieser (diesen Säulen) sind Epitope auf dem Trägermaterial angekuppelt, die etwaige gegen diese gerichtete Antikörper binden. Die Epitope entsprechen Teilsequenzen des FaS-Proteins, so daß spezifisch anti-Fas-Antikörper aus dem Eluat gemäß (e) isoliert werden. Damit steht zur Be- handlung von Erkrankungen mit erhöhten extrazellulären FasL-Titern (löslich und/oder membranständig) , insbesondere TEN, ein hochspezifisches Arzneimittel zur Verfügung.
Diese durch die Verfahrensschritte (a) bis (g) erhaltene anti-Fas-Antikörper-Subfraktion wird vorteilhafterweise galenisch noch dadurch aufbereitet, daß die isolierten anti-Fas-Antikörper nach ihrer Sequenzierung mit gängigen gentechnologischen Verfahren in humanisierter Form Ver- wendung finden. Dieser Schritt erweist sich dann als erforderlich, wenn die den Verfahren zugrundeliegende Zusammensetzung nicht humanes Blutprodukt darstellt, sondern z.B. tierischen Ursprungs ist. Die nach den oben beschriebenen Verfahren nach einem der Ansprüche 11 bis 13 erhaltenen Verfahrensprodukte werden zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von humanen oder tierischen Zustände mit pathophysiologisch erhöhten extrazellulären FasL-Titern (löslich und/oder membranstgändig) , insbesondere zur Behandlung von toxischer epidermaler Ne- krolyse, graft-versus-host disease, Hepatitis, fulminater Hepatitis, Autoimmunthyroiditis , malignen Tumorerkrankungen oder HIV verwendet . Für die Behandlung der vorgenannten Erkrankungen und/oder Störungen kommen also stets monoklonale Antikörper in Betracht, die gegen Fas gerich- tet sind und inhibierende auf die durch FasL/FasR ausgelöste Zellapoptose wirken. Dearartige monoklonale Antikörper sind bevorzugt humanen Ursprungs oder durch gentechnologische Verfahren humanisiert. Die Herstellung dieser Antikörper kann auch durch Verfahren erfolgen, die nicht auf der Isolierung aus natürlich auftretenden Zusammensetzungen (wie z. B. Blutprodukten) beruhen, sondern auch durch beliebige dem Fachmann geläufige Verfahren, wie z. B. durch Methoden der kombinatorischen Chemie zur Antikörperproduktion. Anti-Fas-Antikörper mit entsprechendem, die Apoptose inhibierenden Potential werden durch Isolierungsmethoden und biologische Testsysteme identifiziert .
Die vorliegende Erfindung wird durch die nachstehenden Figuren 1 bis 11, sowie durch Tabelle 1 näher erläutert:
Figur 1 stellt einen Hautgewebeschnitt eines TEN- Patienten dar. Zu erkennen ist, daß die Epidermis ((durch ein Symbol markiert) sich von der darunter befindlichen Epidermis abgelöst hat, ein charakteristisches pathologisches Phänomen bei TEN-Patienten.
Figur 2 dokumentiert die charakteristisch erhöhten Serum- titer von löslichem FasL (sFasL) bei TEN-Patienten. Die sFasL-Konzentrationen liegen oberhalb von 0,5 ng/ml in deren Seren. Dagegen sind die Serumkonzentrationen von gesunden Kontrollpersonen oder Patienten mit einer anderen Hauterkrankung (MPR: makulös-populärer Hautaus- schlag) , die gleichfalls als Negativkontrolle eingesetzt wurden, hinsichtlich der sFasL-Titer unauffällig.
Figur 3 zeigt einen Gewebeschnitt der Haut von Ten- Patienten nach histologischer Auswertung. Die Symbole deuten auf apoptotische Keratinozyten hin.
Die folgenden Figuren 4 bis 7 verdeutlichen, daß eine hochregulierte FasL-Produktion von Keratinozyten für den Fas-vermittelten apoptotischen Untergang von Keratino- zyten (s. Fig. 3) verantwortlich ist.
Figur 4 zeigt zur Überprüfung einen Immunoblot von mono- klonalen Antikörpern, gerichtet gegen FasL. Spur 1 enthält ein 293 -scheintransfiziertes Zellysat, Spur 2 ein 293 -FasL-transfiziertes Zellysat. Die Antikörperreaktion ist spezifisch gegen die entsprechend transfizierten Zellen gerichtet.
In Figur 5 werden Abbildungen von Hautgewebeschnitten dargestellt, die immunohistochemisch untersucht wurden. Die Schnitte von Hautgeweben gesunder Personen und von TEN-Patienten wurden mit anti-FasL-Antikörpern behandelt. Zur Kontrolle wurden Kontroll -Antikörper eingesetzt, die die unspezifische Antikörperreaktion wiedergeben. Deutlich ist in der mittleren Darstellung der oberen Reihe die starke Antikörperreaktion gegen FasL in der Epidermis von TEN-Patienten zu erkennen.
Figur 6 spiegelt das Resultat (mit statistischen Fehlern) der Experimente mit Fas-sensitiven Jurkat-Zellen wider, die auf Kryohautgewebeschnitte von gesunden, TEN- und MPR-Patienten geschichtet wurden. Die Balken geben den Prozentsatz der jeweils nach 6-stündiger Inkubation apop- totischen Jurkat-Zellen wieder, so wie durch Flußcytome- trie bestimmt. Hierbei lösen die Gewebe von TEN-Patienten eine signifikant erhöhte apoptotische Reaktion aus. Diese wird durch FasL-blockierende Antikörper (NOK1) stark verringert (4. Balken) (Kontrolle).
Figur 7 zeigt schließlich die Lebensfähigkeit von Jurkat- Zellen bzw. primären humanen Keratinozyten gegenüber rhsFasL (Alexis Corporation) nach 6- bzw. 16 -stündiger gemeinsamer Inkubation. Dabei erweisen sich auch Kera- tinozyten als FasL-sensitiv.
Die folgenden Figuren 8 bis 11 stellen die Inhibition der Fas-vermittelten Apoptose durch anti-Fas-Antikörper dar, die in IVIG-Gemischen enthalten sind.
Dabei gibt Figur 8 die protektive Funktion von IVIG- Gemischen auf verschiedene Zellinien (HEK: primäre humane Keratinozyten, HaCaT : humane Keratinozyten, HepG2 : Hepa- tocarcinomzellen, A20: Fas-sensitive lymphoblastoide Zel- linien) wieder, die sich nach Zugabe von Apoptose auslösendem rhsFasL ergibt. Gemessen wurde der Prozentsatz der vor der Apoptose bewahrten Zellen (Lebensfähigkeit) , bezogen auf die Lebensfähigkeit der Zellen in Abwesenheit von rhsFasL. Die Ergebniss der Vergleichsversuche ohne IVIG bzw. mit Albumin (zur Beurteilung unspezifischer Reaktionen) sind gleichfalls aufgetragen. Die protektive Wirkung von IVIG-Gemischen (im Vergleich zu Ansätzen ohne Zugabe von IVIG-Gemischen) ist für alle sensitiven Zelli- nien erkennbar.
Figur 9 beschreibt die Wirkung von IVIG-Gemischen auf die Bindung von FasL an Fas und von TRAIL (einem anderen Apoptose auslösenden Liganden) an den Rezeptor TRAIL R2 (rechts) . Die Bindung von dem Liganden an den Rezeptor wurde so gemessen, wie bei Schneider et al . , J. Exp . Med. 1197, 1-9, 1998 und Schneider et al . J. Biol . Chem. 272, 18827-18833, 1997 beschrieben. Die linke Darstellung in Figur 9 zeigt die inhibierende Wirkung von IVIG-Gemischen auf die Bindung von FasL an Fas.
Figur 10 zeigt durch immunochemische Reaktion, daß IVIG- Gemische positiv gegenüber Fas reagieren, dagegen aber nur eine schwache Reaktion gegenüber TNFR1 (linke Dar- Stellung) zeigen. Die mittlere und die rechte Darstellung sind Kontrollversuche. IVIG-Gemische weisen also anti- Fas-Antikörper auf.
Figur 11 zeigt die Lebensfähigkeit (als Prozentsatz der Kontrollzellen) gegen rhsFasL nach Präinkubierung mit Träger, IVIG, Fas-Fc-Fusionsprotin oder TAIL2-Fc immu- noa^sorbiertem IVIG-Gemisch (als Kontrolle) . Wiederum bewehre das IVIG-Gemisch die hier eingesetzten A20-Zellen weitgehend vor der Apoptose. Etwaige anti-TRAIL-2- Antikörper sind - wie durch den Kontrollversuch gezeigt - ohne Bedeutung für die protektive Wirkung des IVIG- Gemisches . Tabelle 1 gibt die klinischen Daten von 10 TEN-Patienten wieder, die mit IVIG-Gemischen behandelt wurden. Im einzelnen sind angegeben: (a) Alter/Geschlecht Patienten, (b) die von Erythemata bzw. Epidermis-Ablösung betroffene Körperoberfläche, (c) der medikamentöse Auslöser für TEN, (d) die verabreichte Dosis des IVIG-Gemisches in g/kg/d bzw. die Dauer der Behandlung mit IVIG in Tagen, (e) der Zeitraum vom Beginn der klinischen Symptome bis zum Behandlungsbeginn in Tagen, (f) der Zeitraum bis zur klini- sehen Reaktion auf die Behandlung bzw. der Hautheilung.
Die vorliegende Erfindung wird durch die nachfolgenden Ausführungsbeispiele näher erläutert.
1. Ausführunqsbeispiel
Erfindungsgemäß wurde gezeigt, daß das Lyell ' s Syndrom (TEN) in seiner Ätiologie auf erhöhten löslichen FasL- Titern in den Seren von betroffenen Patienten beruht. Hierzu wurden vergleichsweise Blutseren von klinisch auffälligen Personen mit jenen von gesunden Kontrollpersonen verglichen. Der klinischen Auffälligkeit von TEN- Patienten lag die Beobachtung zugrunde, daß diese an zusammenhängenden, häufig dunkelfarbigen Erythemen leiden, wobei eine spontane Ablösung der Epidermis (von der Dermis) zu beobachten ist, genauso wie im übrigen auch Muco- sa-Erytheme und Geschwüre. Die klinische auffällige Epi- dermisablösung wurde durch histologische Befunde bei allen TEN-Fällen bestätigt. Bei allen untersuchten TEN- Patienten betrug die Fläche der erythematösen und abgelösten Epidermis 60 oder mehr Prozent der gesamten Körperoberfläche (Figur 1) .
Der Nachweis der löslichen FasL-Fraktion im Serum der un- tersuchten Patienten wurde durch ELISA geführt . Hierbei ergab sich eine 100%ige Korrelation zwischen hohen FasL- Titern bei TEN-Patienten und annähernd nicht nachweisbarer. Titerπ bei gesunden Kontrollpersonen (Figur 2) . Se- rum-Aliquots wurden Patienten mit voll ausgebildeter TEN bzw. gesunden Kontrollpatienten entnommen und mit einem sFasL ELISA-KIT (Medical & Biological Laboratories Ltd, unter Einsatz der anti-FasL Antikörper mAb 4H9 und 4A5) untersucht. Die gesunden Kontrollpatienten waren jünger als 40 und ohne Befund in bezug auf Haut- oder systemische Krankheiten.
Weiterhin wurde erfindungsgemäß gezeigt, daß bei TEN- Patienten der klinisch auffälligen Ablösung der Epidermis eine Apoptose der Keratinozyten vorausgeht (Figur 3) . Dabei handelt es sich um ein früh sich morphologisch manifestierendes Ereignis dieses Syndroms . Um festzustellen, ob und, wenn ja, auf welche Weise es einen Zusammenhang zwischen der Keratinozyten-Apoptose und den auffälligen
FasL-Serum-Titern gibt, wurden sowohl die Fas- als auch die FasL-Expression in den Hautproben von TEN-Patienten
(N = 7) untersucht und mit jenen von gesunden Kontroll - personen (N = 5) verglichen (Figur 5) . Die Hautbiopsien wurden von TEN-Patienten aus der Grenzfläche zwischen abgelöster und nicht-abgelöster Haut entnommen. Die Biopsi- en wurden entweder in flüssigem Stickstoff eingefroren oder in Paraformaldehyd (4%) fixiert. Die Immunohistoche- mie wurde an den Kryoschnitten, wie bei French et al . , J. Cell Biol . 133, 335-343, 1996 beschrieben, durchgeführt.
Hierbei wurden monoklonale anti-FasL-Antikörper (All,
Alexis Corp., beschrieben bei Hahne et al . Science 274,
1363-1366, 1996) und monoklonale anti-Fas-Antikörper
(UB2, Immunotech) und isotope Kontroll -Antikörper einge- setzt. Die histologischen Hautschnitte von TEN-Patienten zeigten eine starke Keratinozyten-Apoptose, eine nach im- munohistochemischem Nachweis mit anti-FasL-Antikörper
(mAb All), eine im Vergleich zu gesunden Kontrollpersonen stark erhöhte FasL-Expression und eine gleichfalls, ver- glichen mit gesunden Kontrollpersonen, nahezu unveränderte Fas-Expression auf der Zelloberfläche.
Schließlich wurde für TEN erfindungsgemäß gezeigt, daß die für TEN charakteristische Apoptose von Keratinozyten tatsächlich durch den FasL/Fas-Signaltransduktionsweg ausgelöst wird. Hierzu wurde die lytische Aktivität von kutanem FasL in vitro untersucht . Gefrierschnitte der Haut von gesunden Kontrollpersonen (N = 5) und TEN- Patienten (N = 3) wurden mit Fas-sensitiven Jurkat-Zellen für die Dauer von sechs Stunden in Kontakt gebracht und anschließend die Apoptose der Jurkat-Zellen mit Hilfe eines Annexin FITC-Tests oder eines Cytochrom c-Tests bestimmt. Erfindungsgemäß wurde hierbei festgestellt, daß die TEN-Hautschnitte in reproduzierbarer Weise (sowohl mit dem Annexin-FITC als auch mit dem Cytochrom c-Assay) drei- bis vierfach so viele Jurkat-Zellen abtöten wie entsprechende Hautschnitte von gesunden Kontrollpersonen (Figur 6) .
Weiterhin wurde experimentell gezeigt, daß in Gegenwart von FasL-blockierenden Antikörpern (NOK 1) die durch die TEN-Hautgewebeschnitte induzierte Cytotoxizität bei den Jurkat-Zellen vollständig ausgeschaltet wurde (Figur 6) . Hierzu wurden die Gewebeschnitte für 30 Minuten mit anti-
FasL-Antikörpern (NOK 1, 2,5 μg/ml, Pharmingen) vorinku- biert, anschließend auf die Fas-sensitiven Jurkat-Zellen
(humane Leukämiezellen) gelegt, so wie bereits bei Strand et al . , Nature Medicine 2, 1361-1366, 1996 oder bei Büchner et al . , Journal Clinical Investigation 100, 2691- 2699, 1997, beschrieben. Auch hier wurde die Anzahl der durch Apoptose lytischen Jurkat-Zellen mit Hilfe der Flußcytometrie unter Einsatz des Annexin-FITC (Pharmingen, so wie bei Vermes, Haanen, Steffens-Nakken, Reutelingsperger, Journal Immunology Methods, 184, 39-51, 1995) beschrieben) , gemessen. Auch die Zugabe von löslichem rekombinantem menschlichem FasL (rhs FasL) ergab erfindungsgemäß, daß menschliche Keratinozyten in dessen Gegenwart apoptosesensitiv sind (Figur 7) . Hierzu wurden mit FLAG markierte lösliche rekombinante FasL-Proteine
(Alexis Corporation) mit Jurkat-Zellen für die Dauer von sechs bzw. sechzehn Stunden inkubiert und anschließend die Lebensf higkeit mit Hilfe eines Proliferationstests
(WST-1, Boehringer, Mannheim, Deutschland) bestimmt. 2. Ausführunqsbeispiel
In diesem zweiten Ausführungsbeispiel wurde erfmdungsge- maß gezeigt, daß IVIG (intravenöses Immunglobulm) als Blutprodukt, das aus "gepooltem" Plasma von gesunden Spendern hergestellt wird, als Inhibitor der durch FasL/Fas vermittelten Apoptose fungieren kann.
Hierzu wurden Keratinozyten vor ihrer Exposition gegenüber rhsFasL gemeinsam mit IVIG mkubiert . Dabei wurde festgestellt, daß bei rhs-FasL-Konzentrationen, die eine 75%ιge Keratinozyten-Apoptose zu induzieren vermögen, die Zugabe von IVIG, nämlich 30 mg/ml (berechnet entsprechend der täglichen Dosis für die Behandlung eines 60 kg schweren Patienten) vollständig die Fas/FasL bedingte Keratinozyten-Apoptose inhibiert. Bei diesem Experiment wurden Keratinozyten der Zellime HaCaT, Hepatokarzmom- Zellen (HepG2) , Fas-sensitive Zellen A20 und Fas- resistente Lymphoblastoid-Zellimen A20R mit IVIG (und Albumin als Kontrolle) mkubiert und schließlich lösliches FasL hinzugefügt (Figur 8) .
Die protektive Wirkung von IVIG ist dabei nicht auf die zuvor genannten Keratinozyten beschränkt, sondern erfaßt alle Fas-sensitiven Zellen. Im vorliegenden Experiment wurde zudem nachgewiesen, daß IVIG spezifisch wirkt, da ähnliche Konzentrationen von Albumin keine Apoptose- Protektion bewirken.
In einem weiteren Experiment zur Aufklarung des Wirkungs- mechanismus von IVIG wurde gezeigt, daß dessen protektive Wirkung auf einer Inhibition des Fas-vermittelten Zelltods beruht, indem der Fas-Rezeptor, nicht aber der Fas- Ligand (FasL) blockiert wird. Dabei wurde ein IVIG- Gemisch mit rhsFasL prä kubiert und diese prämkubierte Mischung schließlich mit den vorgenannten Zellinien kon- taktiert. Hierbei konnte keine lytische, d.h. apoptoti- sehe Wirkung auf die Zellen dieser Zellinien festgestellt werden.
In einem weiteren Experiment im Rahmen dieses Ausfüh- rungsbeispiels wurde schließlich nochmals mit Hilfe eines ELISA bestätigt, daß IVIG-Gemische die Fas/FasL- Interaktion inhibieren. Hierzu wurde die Rezeptor- Liganden-Interaktion in An- oder Abwesenheit von IVIG bestimmt. Im Ergebnis wurde dokumentiert, daß die Bindung von rhsFasL an Fas-Fc-Fusionsprotein signifikant durch IVIG inhibiert wird, während die Bindung von löslichem TRAIL an seinem Rezeptor TRAIL R2 (hier als TRAIL R2-Fc- Fusionsprotein eingesetzt) durch das IVIG-Gemisch nicht blockiert wurde. Auch bei TRAIL handelt es sich um einen die Apoptose auslösenden Liganden, auf dessen Bindungsinhibition auch die protektive Wirkung von IVIG hätte beruhen können. Dieses Vergleichsexperiment ergibt wiederum, daß durch ein IVIG-Gemisch spezifisch die FasL/Fas- Interaktion blockiert wird.
3. Ausführunqsbeispiel
Dieses Ausführungsbeispiel dient der Bestimmung der molekularen Ursache für die inhibitorische Wirkung von IVIG. Um zu zeigen, daß diese Wirkung auf in der IVIG- Zusammensetzung natürlicherweise vorhandenen anti-Fas- Antikörpern beruht, wurde untersucht, ob ein Bestandteil des IVIG-Gemisches an menschliches Fas bindet und schließlich, ob eine anti-Fas-Antikörper negative IVIG- Fraktion dessen Fähigkeit zur Inhibition der Fasvermittelten Apoptose beseitigt.
Hierzu wurde auf einem Gel eine Immunodetektion vorgenommen. Das IVIG-Gemisch wurde gegen Albumin (zur Kontrolle) oder gegen gereinigte rekombinante Proteinkonstrukte eingesetzt, die aus der extrazellulären Domäne des humanen Fas (sog. Fas-Comp) oder der extrazellulären Domäne des Tumornekrose-Faktor-Rezeptors (TNFRl-Comp) , jeweils verschmolzen mit einem 55 Aminosäure langen Linker, beste- hen. Hierbei bezeichnet "Comp" den Linker, wie er sich auch bei Terskikh et al . , Proceedings of the National Academy of Science, USA, 94, 1663-1668, 1997, beschrieben findet. Diese Experimente zeigen, daß für IVIG-Gemische deutlich positive Signale gegenüber Fas-Comp, nicht aber gegenüber Albumin, und nur schwache Signale gegenüber TNFRl-Comp detektiert werden (Figur 10) . Dies läßt darauf schließen, daß zumindest eine geringfügige anti-TNFRl- Aktivität in IVIG-Gemischen vorhanden sein könnte. Eine Beseitigung der anti-Fas-Antikörper aus dem IVIG-Gemisch durch mehrmaliges Aufreinigen über Fas-Fc-Fusionsprotein- Affinitätschromatographiesäulen beweist, daß durch den Verlust der anti-Fas-Antikörper sowohl die Bindungsfähig- keit von IVIG an Fas-Comp als auch die Blockade des Fas- vermittelten Zelltods beseitigt wird.
4. Ausführun sbβispiel
In einer offenen, nicht kontrollierten Pilotstudie wurden 10 verschiedene Patienten mit TEN in drei verschiedenen Krankenhäusern (Genf, Lausanne und Bern) mit IVIG behandelt, wobei die bei den Patienten eingesetzten Dosierungen von 0,2 bis 0,75 g/kg/d für die Dauer von vier aufeinanderfolgenden Tagen betrugen. Bei allen 10 Patienten wurde die Progression von TEN schnell nach der IVIG- Gemisch- Infusion (innerhalb von 24 bis 48 Stunden) unterbrochen. Gegenwirkungen stellten sich nicht in signifikantem Maß ein, vielmehr wurde eine schnelle Hautheilung beobachtet (s. Tabelle 1) . Damit wurde in einer klini- sehen Studie die therapeutische Wirkung von IVIG bei TEN- Patienten erfindungsgemäß erstmals gezeigt. Tabelle 1
Patient/ Erythema Causal Drug Dose of Time from Time to
Age (YR)/ '(%)/ IVIG onset to response/
Sex Detachment (g/kg/d)/ treatment skin healn
(%) * duration (d) (d) τ (d) §
1 ME/23/M 50/50 Ibuprofen 0 75/4 5 2/7
2 BG/22/F 50/30 Carbamaz- 0.75/4 4 1/7
Figure imgf000023_0001
3 ER757/F 40/20 Cipro- 0 375/4 3 2/5 floxacin
4 MP/1 1/M 70/20 Paracetamol 0 75/4 4 1/6
5 BK726/ 20/60 Cefmaxon 0 75/4 2 1 /10
6 IF/88/F 50/10 Allopuπnol 0 2/4 4 2/5
7 FD/13/ 60/40 Cefuroxim 0 45/4 2/9
8 HW/65/M 60/30 Doxycyc n 0 75/4 ά 2/12
9 CM/28/F 80/5 Undetermin 0 75/4 4 1 /4
10 PE/61 M 40/20 Phenytoin 0 75/4 4 1 /4

Claims

ANSPRÜCHE
Verwendung einer Zusammensetzung zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von humanen oder tierischen Erkrankungen mit pathophysiologisch erhöhten extrazellulären FasL-Titern, dadurch gekennzeichnet, daß die Zusammensetzung die FasL/Fas-Rezeptor-Interaktion inhibierende anti-Fas-Antikörper enthält.
Verwendung einer Zusammensetzung zur Herstellung eines Arzneimittels nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Zusammensetzung humanisierte anti-Fas- Antikörper nicht-humanen Ursprungs enthält.
3. Verwendung einer Zusammensetzung zur Herstellung eines Arzneimittels nach Anspruch 1 oder 2 zur Behandlung von toxischer epidermaler Nekrolyse, graft-versus-host disease, Hepatitis, fulminanter Hepatitis, Autoim- munthyroiditis, malignen Tumorerkrankungen oder HIV.
4. Verwendung einer Zusammensetzung zur Herstellung eines Arzneimittels nach einem der vorgenannten Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Zusammen- setzung ein IVIG-Gemisch ist.
5. Verfahren zur prophylaktischen in vitro Eignungs- bzw. Qualitätskontrolle einer Zusammensetzung, insbesondere eines IVIG-Gemisches, für die Verwendung derselben zur Herstellung eines Arzneimittels nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die FasL/Fas- Rezeptor-Interaktion inhibierende anti-Fas-Antikörper- titer der Zusammensetzung, insbesondere eines IVIG- Gemisches, immunologisch bestimmt werden.
6. Verfahren zur prophylaktischen Eignungs- bzw. Qualitätskontrolle einer Zusammensetzung, insbesondere eines IVIG-Gemisches, nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß (a) Präparationen von Fas-Fc-Fusionsprotein mit einer Zusammensetzung, insbesondere einem IVIG-Gemisch, inkubiert werden,
(b) markiertes FasL der gemäß Verfahrensschritt (a) inkubierten Lösung zugesetzt wird, und
(c) der Anteil von an Fas-Fc-Fusionsprotein gebundenem FasL physikalisch oder chemisch bestimmt wird.
7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß der Anteil von an Fas-Fc-Fusionsprotein gebundenem FasL spektroskopisch, insbesondere photochemisch durch Absorption im sichtbaren oder nahen UV-Bereich, be- stimmt wird.
8. Verfahren zur prophylaktischen Eignungs- bzw. Qualitätskontrolle einer Zusammensetzung, insbesondere eines IVIG-Gemisches, nach Anspruch 5, dadurch gekenn- zeichnet, daß
(a) Fas-sensitive Zellen mit einer Zusammensetzung, insbesondere einem IVIG-Gemisch, vorinkubiert werden,
(b) dieser vorinkubierten Präparation lösliches FasL zugesetzt wird, und
(c) schließlich die Anzahl der durch FasL/Fas- Interaktion apoptotischen Fas-sensitiven Zellen bestimmt wird.
9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Bestimmung der Anzahl der apoptotischen Fassensitiven Zellen gemäß Verfahrensschritt (c) durch einen Annexin-FITC-Zelltodtest oder die Bestimmung der Lebensfähigkeit mit Hilfe eines Zellproliferations- tests durchgeführt wird.
10. Verfahren zur prophylaktischen Eignungs- bzw. Qualitätskontrolle einer Zusammensetzung, insbesondere ei- nes IVIG-Gemisches, nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß
(a) ein extrazellulärer Abschnitt von Fas durch "Western-Blotting-Techniken" mit einer Zusammen- setzung, insbesondere einem IVIG-Gemisch kombiniert wird, und
(b) an den extrazellulären Abschnitt von Fas gebundene anti-Fas-Antikörper aus der Zusammensetzung, insbesondere dem IVIG-Gemisch, durch markierte gegen anti-Fas-Antikörper gerichtete Sekundärantikörper identifiziert werden.
11. Verfahren zur Herstellung eines Arzneimittels mit gesteigerter pharmazeutischer Wirksamkeit zur Behandlung von humanen oder tierischen Erkrankungen mit erhöhten extrazellulären FasL-Titern, dadurch gekennzeichne daß
(a) eine Zusammensetzung, insbesondere ein IVIG- Gemisch, biochemisch fraktioniert wird, (b) sämtliche gemäß Verfahrensschritt (a) erhaltenen
Fraktionen nach einem Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 10 untersucht und deren jeweilige anti-Fas-Antikörpertiter bestimmt werden,
(c) die Fraktion oder solche Fraktionen, die anti- Fas-Antikörper enthält (enthalten) , isoliert wird
(werden) , und
(d) schließlich die gemäß Verfahrensschritt (c) erhaltene (n) Fraktion (en) aufkonzentiert wird
(werden) .
12. Verfahren zur Herstellung eines Arzneimittels mit gesteigerter pharmazeutischer Wirksamkeit nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß
(a) eine Zusammensetzung, insbesondere ein IVIG- Gemisch, biochemisch fraktioniert wird,
(b) sämtliche gemäß Verfahrensschritt (a) erhaltene Fraktionen nach einem Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 10 untersucht und deren jeweilige anti-Fas-Antikörpertiter bestimmt werden, (c) die Fraktion oder solche Fraktionen, die anti- Fas-Antikörper enthält (enthalten) , isoliert wird (werden) , (d) anti-Fas-Antikörper in aufgereinigter Form durch
Affinitätschromatographie, insbesondere durch ein säulenchromatographisches Verfahren, mittels Fas- Fusionsprotein als auf dem Träger angekuppeltem Liganden isoliert werden, und (e) die gebundenen anti-Fas-Antikörper eluiert werden .
13. Verfahren zur Herstellung eines Arzneimittels mit gesteigerter pharmazeutischer Wirksamkeit nach Anspruch 11 oder 12, dadurch gekennzeichnet, daß
(a) eine Zusammensetzung, insbesondere ein IVIG- Gemisch, biochemisch fraktioniert wird,
(b) sämtliche gemäß Verfahrensschritt (a) erhaltenen Fraktionen nach einem der Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 10 untersucht und deren anti-
Fas-Antikörpertiter bestimmt werden,
(c) die Fraktion oder solche Fraktionen, die anti- Fas-Antikörper enthält (enthalten) , isoliert wird (werden) , (d) anti-Fas-Antikörper in aufgereinigter Form durch
Affinitätschromatographie, insbesondere durch ein säulenchromatographisches Verfahren, mittels Fas- Fusionsprotein als auf dem Träger angekuppeltem Liganden isoliert werden, (e) die gebundenen anti-Fas-Antikörper eluiert werden, (f) aus dem Eluat epitopspezifische anti-Fas- Antikörper isoliert werden, indem jeweils ein oder mehrere spezifische (s) Epitop(e), die je- weils Aminosäuresequenzen auf dem Fas-Protein entsprechen, auf dem Trägermaterial der chromatographischen Säule (n) angekuppelt werden und nachfolgend das gemäß Verfahrensschritt (e) erhaltene Eluat ein- oder mehrfach die Säule (n) passiert, (g) schließlich die gebundenen anti-Fas-Antikörper eluiert werden.
14. Verwendung eines Verfahrensprodukts, erhalten aus ei- nem der Verfahren nach einem der Ansprüche 11 bis 13, zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von humanen oder tierischen Erkrankungen mit pathophysio- logisch erhöhten extrazellulären FasL-Titern, insbesondere zur Behandlung von toxischer epidermaler Ne- krolyse, graft-versus-host disease, Hepatitis, fulminanter Hepatitis, Autoimmunthyroiditis, malignen Tumorerkrankungen oder HIV.
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