DE102004051014A1

DE102004051014A1 - Chemisch modifizierte Peptidanaloga

Info

Publication number: DE102004051014A1
Application number: DE102004051014A
Authority: DE
Inventors: Afroditi Dr. Kapurniotu; Jürgen Prof. Dr. Bernhagen
Original assignee: Fraunhofer Gesellschaft zur Forderung der Angewandten Forschung eV; Rheinisch Westlische Technische Hochschuke RWTH
Current assignee: Fraunhofer Gesellschaft zur Forderung der Angewandten Forschung eV; Rheinisch Westlische Technische Hochschuke RWTH
Priority date: 2004-10-20
Filing date: 2004-10-20
Publication date: 2006-04-27
Also published as: US20100221240A1; JP2008517885A; WO2006042745A2; KR20080000554A; WO2006042745A3; CA2584263A1; EP1805215A2

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft verbesserte Mittel und Verfahren zur Behandlung von Diabetes und Alzheimer-Krankheit unter Verwendung von IAPP-Peptidderivaten.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Peptidanaloga des Islet Amyloid Polypeptids (IAPP), Verfahren zum Auffinden von IAPP oder dessen Aggregaten, pharmazeutische Zusammensetzungen zur Prophylaxe und Therapie von Proteinaggregationskrankheiten, insbesondere Diabetes und Alzheimer'sche Krankheit sowie diagnostische Zusammensetzungen zum Nachweis von Proteinaggregationskrankheiten, insbesondere Diabetes und Alzheimer'sche Krankheit ebenso wie Verwendungen der genannten Peptidanaloga zu Zwecken der Diagnose und Therapie von Krankheiten oder für die Grundlagenforschung.
Diabetes ist eine Krankheit, für welche es gegenwärtig noch keine befriedigenden Therapieansätze gibt. Üblicherweise wird unterschieden zwischen der Typ I- und der Typ II-Diabetes. 90 % der Diabetiker leiden an Typ II Diabetes oder Alterdiabetes. Heutzutage gibt es weltweit mehr als 150 Millionen Typ II Diabetiker. Diabetes entsteht durch den Mangel an Insulin beziehungsweise durch den gestörten Verlauf Insulin-abhängiger biologischer Prozesse. Da einerseits die zentrale Rolle des Insulins beim Kohlenhydratstoffwechsel durch andere Moleküle nicht ersetzt werden kann und andererseits die Gabe von Insulin allein die pathologischen Konsequenzen der Krankheiten im Fall von Typ I Diabetes oder die Krankheit selbst im Fall von Typ II Diabetes nicht eliminieren kann, sind neue therapeutische Ansätze notwendig. Derartige Konzepte sollen einerseits die Sekretion, Aufnahme und die Entfaltung der biologischen Funktion des Insulin-Moleküls unterstützen und andererseits vor unerwünschten Nebenwirkungen des Insulins wie Gewichtszunahme oder Hypogly kämie schützen. Neue Moleküle, welche insbesondere zusammen mit Insulin zur Regulation des Kohlenhydratstoffwechsels beitragen, sind somit von großem biomedizinischem Interesse.

Eines dieser neuen Moleküle ist das Islet Amyloid Polypeptid (IAPP oder Amylin). IAPP ist ein aus 37 Aminosäureresten bestehendes Peptidhormon, welches in den β-Zellen des Pankreas synthetisiert wird und zusammen mit Insulin und Glukagon an der Regulation des Zuckermetabolismus beteiligt ist. IAPP ist ein Gegenspieler von Insulin. In den Bauchspeicheldrüsen von mehr als 95 % der Typ II Diabetikern findet man die sogenannten Amyloidplaques. Amyloidplaques sind Ablagerungen, die aus unlöslichen Aggregaten des Polypeptids IAPP bestehen. Ähnlich wie die Alzheimer'sche Krankheit, Parkinson, Prionen-Erkrankungen oder Huntington's Krankheit kann auch Diabetes daher als Proteinaggregationskrankheit (Ross und Poirier, Nature medicine, Juli 2004, Vol. 10 Suppl., Seiten 10-17) angesehen werden. Die Bioaktivität von IAPP wird durch seine lösliche, monomere Form über cAMP-gekoppelte Rezeptoren vermittelt. IAPP-Amyloidplaques, lösliche Oligomere und multimere Formen des IAPP-Moleküls sind jedoch zytotoxisch. Man geht davon aus, dass die durch IAPP-Amyloidbildung hervorgerufene Schädigung der β-Zellen zur Kaskade der Pathogenese des Typ II Diabetes einen erheblichen Beitrag leistet. Daher ist die Entwicklung von therapeutisch wirksamen Inhibitoren des IAPP-Amyloidbildungsprozesses von großem biomedizinischem Interesse. Darüber hinaus ist das IAPP-Molekül in seiner biologischen Funktion als Insulin-Gegenspieler und als Regulator der mit der Insulinsekretion oder -gabe assoziierten postprandialen Hypoglykämie per se ein wichtiges Polypeptidhormon, welches potentielle therapeutische Anwendungen bei der Behandlung von Typ I (zum Beispiel in Kombination mit Insulin) und Typ II Diabetes haben könnte. Die medizinische Applikation von IAPP ist jedoch aufgrund seiner Schwerlöslichkeit und seiner starken Aggregationstendenz erheblich eingeschränkt.

Bekannt ist das lösliche IAPP-Analog Pramlintide. Pramlintide (Symlin^®) entstand durch den Ersatz von 3 Aminosäureresten an den Positionen 25, 28, und 29 in der Sequenz des humanen IAPP-Moleküls durch Prolin. Diese Prolin-Substituenten kommen in der Ratten-IAPP-Sequenz vor, welche selbst keine Aggregationstendenz hat. Strukturell lässt sich die verminderte Aggregationstendenz von Prolin-enthaltenden Sequenzen dadurch erklären, dass Prolinreste nicht in der Lage sind, β-Faltblattkonformationen anzunehmen (Proline sind β-Faltblatt-"brechende" Reste). In der Tat weist das IAPP-Analog Pramlintide eine stark reduzierte Aggregationsneigung und somit ein besseres Löslichkeitsprofil als humanes IAPP auf. Klinische Studien, welche noch nicht komplett abgeschlossen sind, weisen darauf hin, dass dieses Analogon zusammen mit Insulin in der Behandlung von Diabetes Anwendung finden könnte. Dennoch verhindert die Aggregationsneigung von Pramlintide bei pH-Werten über 5 eine Formulierung und Applikation zusammen mit Insulin. Das Analogon wird daher getrennt von Insulin per s.c. Injektion verabreicht, was seine Applikation erheblich erschwert (Nyholm B. et al., Expert Opinion, Investig. Drug (2001) 10(9) 1641-1652).

Die frühe Erkennung von Diabetes zusammen mit einem frühen Einsatz therapeutischer Maßnahmen könnte den Krankheitsverlauf stark verzögern und somit positiv beeinflussen. Die Rolle von IAPP beim Typ II Diabetes ist jedoch noch nicht geklärt. Da seine Aggregation von seiner Konzentration abhängig ist, könnte es durchaus einen Zusammenhang der Konzentration von löslichem IAPP beziehungs weise der löslichen IAPP-Aggregate im Blut mit dem Auftreten der Krankheit geben. Die gängigen IAPP-RIAs können nur die vom IAPP-Antikörper erkannten IAPP-Moleküle bestimmen. Es ist jedoch bekannt, dass Proteinregionen (Antigenregionen), die für die Antigen-Antikörperwechselwirkung zuständig sind, durch die Proteinassoziation nicht mehr ohne weiteres erkannt werden können. Deswegen ist es von Bedeutung, eine laborchemische IAPP-Messmethode zu entwickeln, welche spezifisch verschiedene Assoziationsformen des IAPP-Moleküls erkennen kann. Notwendig erscheint dazu die Entwicklung eines konformationsspezifischen Antikörpers, also eines Antikörpers, der gegen ein monomeres beziehungsweise oligomeres IAPP-Molekül erzeugt wurde. Der herkömmliche IAPP-Antikörper ist nämlich nicht konformationsspezifisch.

Der vorliegenden Erfindung liegt daher das technische Problem zugrunde, Mittel und Verfahren bereitzustellen, mit deren Hilfe eine verbesserte Prophylaxe, Therapie und Diagnose von Proteinaggregationskrankheiten, insbesondere von Diabetes und/oder Alzheimer'sche Krankheit ermöglicht wird.

Die Erfindung löst dieses technische Problem durch die Bereitstellung von Peptidanaloga des Islet Amyloid Polypeptids (IAPP) mit der Fähigkeit, an natürlichen IAPP-Rezeptor zu binden, wobei das Peptidanalogon a) höchstens 38 Aminosäuren, vorzugsweise höchstens 37 Aminosäuren aufweist, von denen 37 Aminosäuren davon die Aminosäuresequenz des natürlichen IAPP in ihrer natürlichen Abfolge aufweisen, b) mindestens die Aminosäuren 19 bis 37 des natürlichen IAPP in ihrer natürlichen Abfolge aufweist, c) mindestens eine seiner Amidbindungen N-methyliert ist, d) und wobei optional in der Aminosäuresequenz des natürlichen IAPP Lys (Lysin) an Position 1 ersetzt sein kann durch Orn (Ornithin) und/oder Cys (Cystein) an Position 2 und 7 ersetzt sein kann durch Dap (2,3-Diaminopropionsäure) an Position 2 und Asp (Asparaginsäure) an Position 7 oder Asp an Position 2 und Dap an Position 7, und e) wobei die N-methylierten Peptidanaloga mit den SEQ ID Nr. 1 bis 5 ausgenommen sind, welche die Wildtyp-Aminosäuresequenz des humanen IAPP aufweisen. Insbesondere löst die vorliegende Erfindung das ihr zugrundeliegende technische Problem durch die Bereitstellung eines Peptidanalogon des Islet Amyloid Polypeptids (IAPP) als diagnostisches oder therapeutisches Mittel mit der Fähigkeit, an natürlichen Rezeptor des IAPP zu binden, wobei das Peptidanalogon a) höchstens 38 Aminosäuren, vorzugsweise höchstens 37 Aminosäuren, aufweist, von denen 37 Aminosäuren davon die Aminosäuresequenz des natürlichen IAPP in ihrer natürlichen Abfolge aufweisen, b) mindestens die Aminosäuren 19 bis 37 des natürlichen IAPP in ihrer natürlichen Abfolge aufweist, c) mindestens eine seiner Amidbindungen N-methyliert ist, und, optional, d) wobei in der Aminosäuresequenz des natürlichen IAPP Lys (Lysin) an Position 1 ersetzt sein kann durch Orn (Ornithin) und/oder Cys an Position 2 und 7 ersetzt sein kann durch Dap an Position 2 und Asp an Position 7 oder Asp an Position 2 und Dap an Position 7.

Die Erfindung stellt diese Peptidanaloga, also die modifizierten N-methylierten IAPP-Derivate vorzugsweise in isolierter, vorzugsweise in partiell oder vollständig gereinigter Form bereit.

Die vorstehend genannten Peptidanaloga sind daher durch die zwingend erforderlichen Merkmale a), b) und c) charakterisiert, wobei sie das Merkmal d) gegebenenfalls aufweisen können, das heißt in dieser optionalen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung sind die Peptidanaloga durch eine von der natürlichen Sequenz des IAPP, insbesondere des humanen IAPP, abweichende Aminosäuresequenz gekennzeichnet, insofern, als dass das in der natürlichen humanen IAPP Sequenz an Position 1 aufweisende Lysin durch die Aminosäure Ornithin und/oder die beiden Cysteine an Position 2 und 7 des natürlichen insbesondere humanen IAPP durch Dap (2,3-Diaminopropionsäure) an Position 2 und Asp an Position 7 beziehungsweise Asp an Position 2 und Dap an Position 7 ersetzt sind beziehungsweise ist. Im Folgenden wird ein erfindungsgemäßes Peptidanalogon, welches gemäß Merkmal d) ausgeführt ist, das heißt das in Abweichung von der natürlichen IAPP-Sequenz, insbesondere der humanen IAPP Sequenz, Ornithin an Position 1 (anstelle von Lysin) und/oder Asp oder Dap an Position 2 und Dap oder Asp an Position 7 (jeweils anstelle von Cystein) aufweist, als Derivat des erfindungsgemäßen Peptidanalogons bezeichnet.

Die erfindungsgemäßen Peptidanaloga, die Cys an Position 2 und 7 aufweisen, sind vorzugsweise oxidiert, dass heisst die Disulfidbrücke zwischen den Thiolresten von Cys 2 und Cys 7 ist geschlossen.

Ebenso sind die erfindungsgemäßen Peptidanaloga, die an Position 2 und 7 Dap und Asp beziehungsweise Asp und Dap aufweisen, vorzugsweise verbrückt, dass heisst die Seitenketten von Asp und Dap sind kovalent miteinander über eine Lactambrücke verbunden.

Bei allen Peptidanaloga der vorliegenden Erfindung liegt der C-Terminus in einer bevorzugten Ausführungsform als Amid vor.

Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird unter dem Begriff natürliches IAPP das IAPP verstanden, welches die Wildtyp-Aminosäuresequenz des IAPP aufweist, das heißt die Aminosäure sequenz aufweist, wie sie natürlicherweise in vivo im betreffenden Organismus, das heißt vorzugsweise im Menschen, anzutreffen ist. Verschiedene natürliche IAPP Sequenzen, insbesondere des Menschen, sind in Kapurniotu (Biopolymers (Peptide Science) 60 (2001) 438-459) veröffentlicht. SEQ ID Nr. 18 der vorliegenden Lehre zeigt die Wildtyp-Sequenz von IAPP aus dem Menschen. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung sind Positionsangaben von Aminosäuren oder Amidbindungen daher, soweit nicht anders angegeben, immer Positionsangaben, die sich auf die Aminosäuresequenz des natürlichen humanen IAPP, dargestellt in Schema 1 von Kapurniotu (vorstehend) oder in SEQ ID Nr. 18 beziehen. Ebenso wird unter dem Begriff natürlicher IAPP-Rezeptor natürlicherweise vorhandener Wildtyp-Rezeptor für IAPP, insbesondere humaner Wildtyp-Rezeptor verstanden.

Die ertindungsgemäßen Peptidanaloga weisen in einer Ausführungsform also exakt die gleiche Primärstruktur wie das natürliche, humane IAPP und in einer anderen Ausführungsform im Wesentlichen die gleiche Primärstruktur wie insbesondere humanes IAPP auf, weisen aber aufgrund der erfindungsgemäß selektiv eingeführten N-Methylgruppierungen an bestimmten Amidbindungen eine andere Konformation als IAPP und somit veränderte biologische, insbesondere biochemische und biophysikalische Eigenschaften auf, verglichen mit nativem humanem IAPP. Insbesondere zeichnen sich die ertindungsgemäßen Peptidanaloga dadurch aus, dass sie fähig sind, mit nativem IAPP, insbesondere nativem humanem IAPP zu interagieren und seine Aggregation in Amyloidfibrillen, die anschließende Amyloidplaquebildung und die damit assoziierte Zytotoxizität zu reduzieren oder zu inhibieren. Gleichzeitig weisen sie die vorteilhafte Eigenschaft auf, an natürlichen, also Wildtyp-Rezeptor, also vor zugsweise humanen IAPP-Rezeptor spezifisch binden zu können. Die erfindungsgemäßen Peptidanaloga weisen keine beziehungsweise eine stark reduzierte Fribrillbildungsfähigkeit auf. Bei einem physiologischen pH von etwa 7 zeigen sie eine besonders stark verminderte Fibrillbildungsneigung und können demgemäß in besonders vorteilhafter Weise im Gegensatz zu nativem IAPP oder Pramlintide zusammen mit Insulin formuliert und verabreicht werden. Die erfindungsgemäßen Peptidanaloga sind insbesondere bei einem physiologischen pH-Wert von etwa pH 7 bis 7.4 mindestens einhundert Mal löslicher als IAPP, was ihre vorstehend erläuterte Formulierungsfähigkeit mit Insulin ermöglicht. Ihre hohe Löslichkeit im Vergleich zu IAPP führt dazu, dass ihre biologische Aktivität während ihrer Lagerung als Lösung (1 mg/ml) nicht reduziert wird (das ist der Fall mit IAPP). Auch können sie als Zusatz zu IAPP-haltigen Lösungen dazu beitragen, dass das IAPP in löslicher und somit biologisch aktiver Form bleibt. Die erfindungsgemäßen Peptidanaloga sind im Vergleich zu IAPP gegen den Abbau durch Proteasen stabiler, was auch eine Verabreichung der Peptidanaloga der vorliegenden Erfindung in Tablettenform ermöglichen könnte. Darüber hinaus interagieren die erfindungsgemäßen Peptidanaloga mit dem β-Amyloidpeptid, das bei der Entstehung der Alzheimer-Erkrankung eine Rolle spielt. Die erfindungsgemäßen Peptidanaloga reduzieren insbesondere die Cytotoxizität des β-Amyloidpeptides und eignen sich daher auch zur Diagnose, Therapie und Prophylaxe von Alzheimer-Erkrankungen.

Die erfindungsgemäßen Peptidanaloga eignen sich insbesondere zur Prophylaxe, Therapie und Diagnose von Proteinaggregationskrankheiten, insbesondere Diabetes, besonders bevorzugt von Typ I Diabetes und/oder von Typ II Diabetes (Diabetes mellitus). Ge gebenenfalls ist in bevorzugter Ausführungsform vorgesehen, die erfindungsgemäßen Peptidanaloga zusammen mit Insulin und/oder IAPP und/oder Pramlintide zur Prophylaxe und Therapie von Diabetes, insbesondere Typ I und/oder Typ II Diabetes einzusetzen. Darüber hinaus können die erfindungsgemäß bereitgestellten konformationsstabilisierten Peptidanaloga als Antigene, zum Beispiel allein oder in Mischung mit IAPP-Monomeren oder IAPP-Oligomeren definierter Größe, eingesetzt werden, um konformationsspezifische Antikörper für zum Beispiel eine ELISA/RIA-basierte Detektion von IAPP in Körperflüssigkeiten bereitzustellen und einzusetzen und so verbesserte Diagnose- und Analyse-Verfahren bereitzustellen.

Erfindungsgemäß kann vorgesehen sein, die erfindungsgemäßen Peptidanaloga zum Beispiel für ELISA, RIA etc. zusammen mit einem Marker, zum Beispiel einem Spin-Label, Fluoreszens- oder Lumineszensmarker, insbesondere in N-terminal markierter, insbesondere N-terminal biotinilierter Form, oder N-terminal Fluorescein markierter Form oder mit anderen fluoreszierenden Markern versehen einzusetzen.

Die Erfindung sieht in einer bevorzugten Ausführungsform vor, dass das erfindungsgemäße Peptidanalogon die vollständige Aminosäuresequenz 1 bis 37 des natürlichen IAPP, insbesondere des natürlichen humanen IAPP, oder die Aminosäuren 1 bis 37 des vorgenannten Derivats davon aufweist beziehungsweise allein diese 37 Aminosäuren aufweist, d.h. aus diesen besteht. Die Erfindung sieht in besonders bevorzugter Ausführungsform also ein vorgenanntes Peptidanalogon vor, welches aus den 37 Aminosäuren des natürlichen, insbesondere humanen, IAPP oder den Aminosäuren der vorgenannten Derivate besteht, die in der Reihenfolge des natürlichen humanen IAPP angeordnet sind und wobei wenigstens eine der Amidbindungen der α-Aminogruppen der Aminosäuren dieses Peptidanalogons N-methyliert ist.

Die Erfindung stellt in besonders bevorzugter Ausführungsform die Lehre bereit, dass das erfindungsgemäße Peptidanalogon des IAPP, das die vollständige Aminosäuresequenz des natürlichen, insbesondere humanen IAPP, nämlich die Aminosäuresequenz 1 bis 37 in voller Länge oder die Aminosäuresequenz des vorgenannten Derivats davon aufweist beziehungsweise aus dieser besteht, als Rezeptoragonist von natürlichem IAPP-Rezeptor fungiert. In dieser Ausführungsform aktiviert das Peptidanalogon den IAPP-Rezeptor. Diese Lehre macht diese erfindungsgemäßen Peptidanaloga besonders geeignet zur Regulation des Zuckerstoffwechsels und anderer biologischer Wirkungen des nativen IAPP Moleküls. Gleichzeitig wirken diese Peptidanaloga als Inhibitoren der Bildung von Amyloidfibrillen und/oder Amyloidplaques, das heißt als Inhibitoren der Bildung unlöslicher zellschädigender IAPP-Aggregate und reduzieren oder inhibieren damit gleichzeitig die dadurch verursachte Zytotoxizität.

Die Erfindung sieht in einer weiteren bevorzugten Ausführungsform vor, dass das erfindungsgemäße Peptidanalogon gegenüber der Wildtyp-Sequenz verkürzt ist, insbesondere an seinem N-Terminus verkürzt ist, und mindestens die Aminosäuren 19 bis 37, vorzugsweise 8 bis 37 des natürlichen IAPP oder die Aminosäuren des vorgenannten Derivats davon aufweist beziehungsweise allein aus diesen in ihrer natürlichen Reihenfolge besteht. In dieser Ausführungsform ist also vorgesehen, dass das verkürzte Peptidanalogon mindestens die Aminosäuren 19 bis 37, vorzugsweise 8 bis 37 und höchstens die Aminosäuren 2 bis 37 des natürlichen, insbesondere humanen Wildtyp IAPP oder die Aminosäuren des vorgenannten Derivats davon aufweist beziehungsweise aus diesen besteht und mindestens eine der Amidbindungen des Peptidanalogons N-methyliert ist.

Die Erfindung stellt auch die Lehre bereit, dass die erfindungsgemäßen verkürzten Peptidanaloga, die also nicht die vollständige Aminosäuresequenz des natürlichen, insbesondere humanen IAPP oder nicht die vollständige Aminosäuresequenz des vorgenannten Derivats aufweisen, das heißt die Peptidanaloga, die die Aminosäuren von den Positionen 2 bis 37 bis Positionen 19 bis 37 oder die Aminosäuresequenz der vorgenannten Derivate davon aufweisen beziehungsweise aus diesen bestehen, ebenfalls an einen Wildtyp-Rezeptor des natürlichen IAPP binden, dort aber als Rezeptorantagonisten wirken und dadurch ebenfalls geeignet sind, als Regulatoren des Zuckerstoffwechsels zu fungieren. In dieser Ausführungsform hemmt das Peptidanalogon den IAPP-Rezeptor. Auch diese besonders bevorzugten Peptidanaloga wirken gleichzeitig als Inhibitoren der Bildung von Amyloidfibrillen und/oder von Amyloidplaques und reduzieren oder inhibieren daher die damit verbundene Zytotoxizität.

Die Erfindung erfasst also auch Ausführungsformen, das heißt Peptidanaloga des Wildtyp-IAPP, wobei diese zum Beispiel die Aminosäuren 7 bis 37, 6 bis 37, 5 bis 37, 4 bis 37, 3 bis 37 und 2 bis 37 des natürlichen, insbesondere humanen natürlichen IAPP oder die Aminosäuren des vorgenannten Derivats davon aufweisen beziehungsweise allein aus diesen bestehen und wobei in jeder dieser Ausführungsformen mindestens eine der Amidbindungen des Peptidanalogons N-methyliert ist.

Die erfindungsgemäßen Peptidanaloga weisen in bevorzugter Ausführungsform der vorliegenden Erfindung eins, zwei, drei oder vier Amidbindungen auf, die N-methyliert sind, das heißt bei denen ein Wasserstoffatom der α-Aminogruppe einer Aminosäure des Peptids durch eine Methylgruppe ersetzt ist. In bevorzugter Ausführungsform der vorliegenden Erfindung sind die Amidbindungen der erfindungsgemäßen Peptidanaloga N-methyliert, die den α-Aminogruppen der Aminosäuren an den Positionen 22 und/oder 23 und/oder 24 und/oder 25 und/oder 26 und/oder 27 und/oder 28 und/oder 29 zugeordnet sind. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform sind die N-methylierten Amidbindungen in einem Bereich des Peptidanalogons, der 4 bis 8 Aminosäuren umfasst, in ununterbrochener Reihenfolge in der Aminosäuresequenz angeordnet. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform können die N-Methylgruppen in einem Bereich des Peptidanalogons, der 4 bis 8 Aminosäuren umfasst, an jeder zweiten Amidbindung des Peptidanalogons, insbesondere den vorgenannten Aminosäurepositionen, vorhanden sein.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung Peptidanaloga, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID Nr. 1 bis 17 mit Ausnahme der Peptidanaloga, die die natürliche Aminosäuresequenz des humanen Wildtyp-IAPP aufweisen und gleichzeitig die N-Methylierung gemäß der SEQ ID Nr. 1 bis 5 aufweisen. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung Peptidanaloga für therapeutische oder diagnostische Zwecke, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID Nr. 1 bis 17. Die Erfindung stellt für die erfindungsgemäßen Peptidanaloga, insbesondere der SEQ ID Nr. 1 bis 17, daher die erstmalige Anwendung in einem Verfahren zur therapeutischen Behandlung des menschlichen oder tierischen Körpers und in einem Diagnostizierverfahren, das am menschlichen oder tierischen Körper vorgenommen wird, bereit. Die Erfindung betrifft daher auch Arznei- und Diagnostiziermittel, enthaltend die vorgenannten Peptidanaloga der Erfindung, insbesondere die Peptidanaloga ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID Nr. 1 bis 17.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung Peptidanaloga, wobei diese ausgewählt sind aus der Gruppe der erfindungsgemäßen Peptidanaloga mit den Aminosäuren 1 bis 37 des humanen Wildtyp-IAPP oder eines Derivats davon, die Amidbindungen der α-Aminogruppen der Aminosäuren an den Positionen (24 und 26), (25 und 27), (23 und 25), (26 und 27), (25 und 26 und 27), (24 und 25), (25 und 26), (22 und 24), (23 und 24), (24 und 26), (23), (24), (25), (26), (27), (28 und 29), (25 und 28 und 29) aufweisen. Diese Peptidanaloga werden im Folgenden in der vorgenannten Reihenfolge auch als IAPP-GI, IAPP-AL, IAPP-FA, IAPP-IL, IAPP-AIL, IAPP-GA, IAPP-AI, IAPP-NG, IAPP-FG, IAPP-GAIL, IAPP-F, IAPP-G, IAPP-A, IAPP-I, IAPP-L, IAPP-SS und IAPP-ASS bezeichnet, sofern sie die Aminosäuresequenz des humanen Wildtyp-IAPP aufweisen.

Selbstverständlich betrifft die Erfindung auch die vorgenannten Peptidanaloga des Wildtyp-IAPP oder dessen Derivate in Mischung, wie zum Beispiel 1:1-Mischung, mit natürlichem, unmodifiziertem IAPP und/oder β-Amyloidpeptid oder anderen bekannten Peptidanaloga des IAPP oder des β-Amyloidpeptids (A-β) oder anderen Derivaten von IAPP oder A-β, insbesondere auch zur Herstellung von Arznei- oder Diagnosemitteln sowie zu Forschungs- und Versuchszwecken.

Die Erfindung betrifft in einer weiteren bevorzugten Ausführungsform die erfindungsgemäßen Peptidanaloga, die löslich sind, insbesondere mindestens einhundertmal löslicher sind als natürliches IAPP, insbesondere humanes natürliches IAPP, insbesondere in Wasser oder physiologischer Kochsalzlösung, vorzugsweise bei einem physiologischen pH-Wert von etwa 7,0 bis 8,0, vorzugsweise pH = 7,4.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform sind die erfindungsgemäßen Peptidanaloga markiert, insbesondere an ihrer N-terminalen α-Aminogruppe, insbesondere mit einer Acetylgruppe, einem radioaktiven Marker, einem Enzymmarker, einem Fluoreszenzmarker, einem Lumineszenzmarker oder einem Spin-Label, vorzugsweise in einer Art und Weise, dass die genannten Marker über einen Spacer mit dem Peptidanalogon verbunden sind, wobei der Spacer eine Aminosäure sein kann.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist vorgesehen, dass die ertindungsgemäßen Peptidanaloga mit mindestens einer funktionellen Gruppe derivatisiert sind, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einer Acylgruppe, funktionalisierte Acylgruppe, aromatische Gruppe, einer Aminosäure, einer Glycogruppe und einer Lipidgruppe.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist vorgesehen, dass die funktionelle Gruppe über einen Spacer, zum Beispiel eine Aminosäure, sofern die funktionelle Gruppe nicht selbst eine Aminosäuregruppe ist, mit dem Peptidanalogon verbunden ist.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist vorgesehen, dass die erfindungsgemäßen Peptidanaloga auf einem Träger, zum Bei spiel einer Matrix oder an der Oberfläche eines Wells, einer Mikrotiterplatte, einer Membran, etc., immobilisiert ist.

Die erfindungsgemäßen Peptidanaloga können üblicherweise chemisch synthetisiert und/oder modifiziert werden.

Die Erfindung betrifft auch Verfahren zur Herstellung von spezifisch gegen a) IAPP oder b) einen Peptidanalogon/IAPP-Komplex oder c) spezifisch gegen ein Peptidanalogon der vorliegenden Erfindung gerichteten Antikörpern, wobei mindestens ein erfindungsgemäßes Peptidanalogon als Antigen, gegebenenfalls zusammen mit monomerem IAPP oder einem Oligomer davon, mit einem zur Antikörper-Bildung befähigten System in Kontakt gebracht wird, zum Beispiel in einen tierischen Organismus gespritzt wird, und die gebildeten Antikörper gewonnen werden. Selbstverständlich betrifft die Erfindung auch Verfahren zur Herstellung von spezifisch gegen IAPP oder einem IAPP/Peptidanalogon-Komplex oder spezifisch gegen ein Peptidanalogon der vorliegenden Erfindung gerichteten Antikörpern, wobei die Antikörper nicht nur polyclonale, sondern auch monoclonale Antikörper sein können. Die Erfindung betrifft daher auch monoclonale oder polyclonale Antikörper sowie Fragmente davon, herstellbar nach einem vorgenannten Verfahren, wobei der Antikörper oder das Fragment davon spezifisch gegen ein Peptidanalogon der vorliegenden Erfindung oder spezifisch gegen IAPP oder gegen einen Peptidanalogon/IAPP-Komplex gerichtet ist, das heißt diese spezifisch erkennen und binden können. Die Antikörper können in üblicher Weise modifiziert, zum Beispiel markiert sein. Sie können auch in immobilisierter Form auf einem Träger oder einem Kügelchen fixiert vorliegen. Die erfindungsgemäßen polyclonalen oder monoclonalen Antikörper können beispielsweise zur Analyse des Krankheitsverlaufs von zum Beispiel mit erfindungsgemäßen Peptidanaloga behandelten Patienten oder zur Isolierung und Identifizierung von weiteren therapeutisch wirksamen Peptiden dienen. Die erfindungsgemäßen Peptide erweisen sich im Rahmen ihres Einsatzes als Immunogen für die Herstellung von Antikörpern für diagnostische und therapeutische Zwecke aufgrund ihrer erheblich verbesserten Handhabbarkeit gegenüber den nativ-vorkommenden schwer löslichen Peptiden als besonders vorteilhaft. Die so hergestellten Antikörper können in einer Ausführungsform spezifisch die erfindungsgemäßen Peptide und in einer anderen Ausführungsform auch das nativ vorhandene Wildtyp-IAPP gegebenenfalls in aggregierter Form erkennen, sodass die erfindungsgemäßen Antikörper zum Beispiel zur Diagnose der Alzheimer'schen Krankheit oder von Diabetes eingesetzt werden können. Die Erfindung betrifft auch Verfahren zur Immunisierung von menschlichen oder tierischen Organismen, wobei die erfindungsgemäßen Peptidanaloga menschlichen oder tierischen Organismen appliziert und eine Immunisierung gegen IAPP beziehungsweise dessen Derivat erreicht wird.

Die Erfindung betrifft daher Verfahren zur Herstellung von spezifisch gegen ein Peptidanalogon der vorliegenden Erfindung gerichteten Antikörpern, wobei mindestens ein Peptidanalogon der vorliegenden Erfindung als Antigen mit einem zur Antikörper-Bildung befähigten System in Kontakt gebracht und die gebildeten Antikörper gewonnen werden. Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung von spezifisch gegen IAPP und ein Peptidanalogon der vorliegenden Erfindung gerichteten Antikörpern, wobei mindestens ein Peptidanaloga der vorliegenden Erfindung mit einem zur Antikörper-Bildung befähigten System in Kontakt gebracht und die gebildeten Antikörper gewonnen werden. Die Erfindung betrifft auch Verfahren zur Herstel lung spezifisch gegen Mischungen von IAPP mit einem Peptidanalogon gerichteten Antikörper, wobei Mischungen von monomerem IAPP und einem Peptidanalogon der vorliegenden Erfindung als Antigen, wobei gegebenenfalls das IAPP auch als Oligomer eingesetzt werden kann, mit einem zu Antikörper-Bildung befähigtem System in Kontakt gebracht und die gebildeten Antikörper gewonnen werden. Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung von spezifisch gegen Mischungen von β-Amyloidpeptid mit einem Peptidanalogon der vorliegenden Erfindung gerichteten Antikörpern, wobei Mischungen von monomerem oder oligomerem β-Amyloidpeptid mit mindestens einem Peptidanalogon der vorliegenden Erfindung als Antigen mit einem zu Antikörper-Bildung befähigten System in Kontakt gebracht und die gebildeten Antikörper gewonnen werden.

Die Erfindung betrifft auch die mittels der vorgenannten Verfahren hergestellten spezifischen Antikörper beziehungsweise spezifischen Fragmente davon, welche ihr Antigen spezifisch erkennen und binden, insbesondere auch zur Diagnose, Prophylaxe oder Therapie von Krankheiten, insbesondere Proteinaggregationskrankheiten, insbesondere Diabetes und/oder Alzheimer-Erkrankung. Die Erfindung betrifft daher auch die Verwendung der vorgenannten Antikörper oder spezifischen Fragmente davon zur Herstellung eines Diagnosemittels oder Arzneimittels, insbesondere zur Diagnose, Prophylaxe oder Therapie von Diabetes und/oder Alzheimer-Erkrankung.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung, wie bereits erläutert, ein Arzneimittel, enthaltend als Wirkstoff mindestens ein Peptidanalogon und/oder einen Antikörper der vorliegenden Erfindung, vorzugsweise in prophylaktisch oder therapeutisch wirksamer Menge, vorzugsweise zusammen mit mindestens einem pharmazeutisch verträglichen Träger.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist vorgesehen, dass dieses Arzneimittel zusätzlich gegebenenfalls, falls erforderlich, Trennmittel, Gleitmittel, Lösungsmittel, Dispersionsmittel, Beschichtungen, antibakterielle oder antifungizide Agentien, Konservierungsstoffe, Farbstoffe, Emulgatoren, Geschmacksstoffe oder weitere übliche Formulierungshilfsstoffe enthält. Es kann vorgesehen sein, weitere Substanzen in der pharmazeutischen Zusammensetzung einzusetzen, die zum Beispiel dem Transport im Zielorganismus, beispielsweise durch die Blut-Hirn-Schranke, dienen.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist vorgesehen, dass das Arzneimittel als Depot-Arzneimittel ausgeführt ist, das heißt eine langsame Freisetzung des Wirkstoffs, das heißt des vorliegenden Peptidanalogons ermöglicht, beispielsweise eine sogenannte "slow release"-Matrix enthält oder wobei das Arzneimittel mit einer sich im Patienten langsam auflösenden Drageedecke umhüllt ist.

In besonders bevorzugter Ausführungsform ist vorgesehen, dass das Arzneimittel der vorgenannten Art als Kombinationsarzneimittel ausgeführt ist, das heißt in der gleichen Formulierung oder in der gleichen Arzneimittelpackung zusätzlich Insulin und/oder IAPP und/oder Pramlintide enthält. Die Erfindung betrifft daher auch einen Arzneimittelkit, enthaltend a) eine Arzneimittelformulierung enthaltend wenigstens eines der vorgenannten Peptidanaloga und/oder einen Antikörper dagegen sowie b) eine Arzneimittelformulierung enthaltend Insulin und/oder IAPP und/oder Pramlintide, jeweils gegebenenfalls zusammen mit pharmazeutisch verträglichen Trägern und sonstigen Formulierungshilfsstoffen, wobei die Wirkstoffe Peptidanalogon und Insulin und/oder Pramlintide und/oder IAPP in einer prophylaktisch oder therapeutisch wirksamen Menge vorhanden sind.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform sieht die Erfindung vor, dass das Arzneimittel in Tablettenform, als Aerosol oder als Lösung, insbesondere Injektionslösung, vorliegt.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform betrifft die Erfindung die Verwendung eines erfindungsgemäßen Peptidanalogons oder eines vorgenannten Antikörpers zur Herstellung eines Arzneimittels zur Prophylaxe oder Therapie von Proteinaggregationskrankheiten, insbesondere Diabetes, vorzugsweise Diabetes vom Typ I oder Diabetes vom Typ II.

Die Erfindung betrifft auch die Verwendung eines erfindungsgemäßen Peptidanalogons oder eines vorgenannten Antikörpers zusammen mit Insulin und/oder IAPP und/oder Pramlintide zur Herstellung eines Kombinationsarzneimittelkits, zum Beispiel einer gemeinsamen Formulierung oder eines Arzneimittelkits zur gleichzeitigen oder zeitlich gestaffelten Verabreichung mit zwei voneinander getrennten Formulierungen der Wirkstoffe Peptidanalogon und/oder Insulin und/oder IAPP und/oder Pramlintide zur Prophylaxe oder Therapie von Diabetes, zum Beispiel von Typ 1 oder Typ 2.

Die vorliegende Erfindung betrifft in einer besonders bevorzugten Ausführungsform eine Verwendung eines erfindungsgemäßen Peptidanalogons, gegebenenfalls zusammen mit Insulin und/oder IAPP und/oder Pramlintide, zur Herstellung eines Arzneimittels zur Prophylaxe oder Therapie von Diabetes, zum Beispiel von Typ 1 oder Typ 2, wobei das erfindungsgemäße Peptidanalogon, insbesondere das Peptidanalogon, welches 1 bis 37 Aminosäuren des natürlichen IAPP oder die Aminosäuresequenz des Derivats davon aufweist, als Rezeptoragonist zur IAPP-Rezeptor gesteuerten Behandlung von Diabetes, insbesondere zur Aktivierung des natürlichen IAPP-Rezeptors, dient. Die erfindungsgemäße Verwendung sieht daher vor, dass im Rahmen dieser Verwendung das Peptidanalogon der vorgenannten Art an einen natürlichen IAPP-Rezeptor in vivo bindet und diesen aktiviert, sodass auf diese Art und Weise der Zuckerstoffwechsel reguliert werden kann.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist eine erfindungsgemäße Verwendung vorgesehen, wobei demgemäß ein Peptidanalogon der vorliegenden Erfindung, insbesondere ein verkürztes, insbesondere N-terminal verkürztes, Peptidanalogon, vorzugsweise ein Peptidanalogon, welches mindestens 8 bis 37 oder mindestens 19 bis 37 und höchstens 2 bis 37 Aminosäuren des natürlichen humanen IAPP aufweist oder ein vorgenanntes Derivat davon ist, zur Herstellung eines Arzneimittels, gegebenenfalls zusammen mit Insulin, und/oder IAPP und/oder Pramlintide, zur Therapie von Diabetes vorgesehen ist, wobei das Peptidanalogon als Rezeptorantagonist zur IAPP-Rezeptor-gesteuerten Behandlung von Diabetes verwendet wird, das heißt an natürlichen IAPP-Rezeptor in vivo bindet und diesen hemmt, sodass auf diese Art und Weise der Zuckerstoffwechsel und die anderen physiologischen Funktionen von IAPP reguliert werden können.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist vorgesehen, dass alle erfindungsgemäßen Peptidanaloga oder Antikörper dagegen als Inhibitoren der IAPP-Aggregation, insbesondere als Inhibitoren der IAPP-Amyloidplaquebildung verwendet werden. Die Erfindung sieht auch vor, dass die erfindungsgemäßen Peptidanaloga oder Antikörper dagegen zur Reduktion oder Inhibition der Cytotoxizität von IAPP eingesetzt werden, insbesondere zur Herstellung eines entsprechenden Arzneimittels. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist vorgesehen, dass die erfindungsgemäßen Peptidanaloga der vorliegenden Erfindung oder ein Antikörper der vorliegenden Erfindung zur Herstellung eines Arzneimittels zur gleichzeitigen a) Reduktion oder Inhibition der IAPP-Aggregation beziehungsweise der Bildung von Amyloidplaques und b) zur Regulation des Zuckerstoffwechsels, sei es als Rezeptoragonist oder als Rezeptorantagonist verwendet werden.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist eine Verwendung eines erfindungsgemäßen Peptidanalogs oder eines erfindungsgemäßen Antikörpers zur Herstellung eines Arzneimittels vorgesehen, wobei das Peptidanalogon oder der Antikörper zur gleichzeitigen a) Reduktion oder Inhibition der Zytotoxizität von IAPP beziehungsweise dessen Aggregaten und b) zur Regulation des Zuckerstoffwechsels, sei es als Rezeptoragonist oder als Rezeptorantagonist, dient.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform betrifft die Erfindung ein Peptidanalogon der vorgenannten Art und/oder einen Antikörper dagegen, wobei dieses oder dieser zur Herstellung eines Arzneimittels zur Prophylaxe oder Therapie der Alzheimer-Erkrankung oder anderer Proteinaggregationskrankheiten wie Parkinson's- oder Huntington's-Krankheit oder Prionenkrankheit dient und wobei das Peptidanalogon und/oder der Antikörper in einer therapeutisch oder prophylaktisch wirksamen Menge eingesetzt wird, insbesondere wobei das Peptidanaloga oder der Antikörper dagegen die Aggregatbildung oder Amyloidplaquebildung des β-Amyloidpeptids reduziert oder inhibiert oder dessen Cytotoxizität reduziert oder inhibiert.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Peptidanalogon der vorliegenden Art oder eines Antikörpers dagegen zur Herstellung eines Arzneimittels zur gleichzeitigen Prophylaxe oder Therapie a) der Alzheimer-Erkrankung oder anderer Proteinaggregationskrankheiten wie Prionen-Krankheit, Parkinson's-Krankheit oder Huntington's-Krankheit und b) von Diabetes, insbesondere Diabetes Typ I oder Diabetes Typ II.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist vorgesehen, dass das Arzneimittel zur Prophylaxe oder Behandlung der Alzheimer-Erkrankung oder anderer Proteinaggregationskrankheiten wie Parkinson's-Krankheit, Prionen-Krankheit oder Huntington's-Krankheit, insbesondere zur gleichzeitigen Behandlung a) der Alzheimer-Erkrankung oder anderer Proteinaggregationskrankheiten wie Prionen-Krankheit, Parkinson's-Krankheit oder Huntington's-Krankheit und b) von Diabetes, als Kombinationsarzneimittel mit Insulin, Pramlintide oder IAPP ausgeführt ist.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft diese ein Peptidanalogon oder einen Antikörper der vorliegenden Erfindung zur Herstellung eines Diagnosemittels zur Diagnose der Alzheimer-Erkrankung oder anderer Proteinaggregationskrankheiten, zum Beispiel Prionen-Krankheit, Parkinson's- und/oder Huntington's-Krankheit.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft diese ein Peptidanalogon der vorliegenden Erfindung oder einen Antikörper der vorliegenden Erfindung zur Herstel lung eines Diagnosemittels zur Diagnose von Proteinaggregationskrankheiten, insbesondere Diabetes.

Die Erfindung betrifft auch die Verwendung der vorliegenden Peptidanaloga für Forschungszwecke.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Peptidanalogon der vorliegenden Erfindung als verbessert handhabbares Immunogen für die Herstellung von Antikörpern, insbesondere monoclonalen oder polyclonalen Antikörpern für diagnostische, therapeutische und Forschungszwecke.

In einer weiteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum qualitativen und/oder quantitativen Nachweis von IAPP oder dessen Aggregaten, wobei ein mit einem Detektionsmarker versehenes Peptidanalogon der vorliegenden Erfindung oder ein mit einem Detektionsmarker versehener Antikörper der vorliegenden Erfindung als Sonde mit einer zu untersuchenden Probe in vivo, das heißt in einem menschlichen oder tierischen Organismus, oder in vitro in Kontakt gebracht und eine Bindung des Peptidanalogons oder Antikörpers mit gegebenenfalls vorhandenen IAPP oder dessen Oligomeren oder Aggregaten nachgewiesen wird.

Es gibt Hinweise, dass lösliche Oligomere aus verschiedenen amyloidogenen Polypeptiden beziehungsweise Proteinen wie das β-Amyloidpeptid, das Prion-Protein, Polyglutamin (Huntington), das α-Synuclein (Parkinson's-Krankheit) und andere eine ähnliche Raumstruktur aufweisen (Kayed et al., Science (2003) 300, 486-489). Kürzlich konnten Kayed et al. (a.a.O.) zeigen, dass ein Antikörper, welcher gegen ein Modell der löslichen oligomeren Struktur des β-Amyloidpeptids (Alzheimer-Krankheit) erzeugt wurde, in der Lage ist, lösliche und toxische Oligomere aus verschiedenen anderen Proteinen, wie zum Beispiel IAPP, α-Synuclein, Prion-Protein-Fragmente zu erkennen und ihre Zytotoxizität in vitro zu neutralisieren. Die erfindungsgemäßen Analoga beziehungsweise die Antikörper dagegen eignen sich daher auch für verschiedene Verfahren zur Veränderung der Aggregation oder zur Detektion von anderen amyloidogenen Polypeptiden wie β-Amyloidpeptid, Prion-Protein, Polyglutamin oder α-Synuclein.

Die Erfindung betrifft auch Verfahren zum Verfolgen und zur Veränderung der Aggregation, insbesondere zum qualitativen oder quantitativen Nachweis, amyloidogener Peptide, Oligomere oder Aggregate davon, insbesondere IAPP-Peptide, IAPP-Oligomere oder IAPP-Aggregate oder zur Inhibierung der Zytotoxizität von IAPP-Peptiden, Oligomeren oder Aggregaten davon, wobei die Peptidanaloga der vorliegenden Erfindung oder Antikörper dagegen in vivo oder in vitro mit den amyloidogenen Peptiden, Oligomeren oder Aggregaten davon in Kontakt gebracht werden und das Aggregationsverhalten der amyloidogenen Peptide, Oligomere oder Aggregate davon geändert wird, insbesondere die Aggregation reduziert oder inhibiert wird und/oder dadurch verfolgt werden kann (Diagnose).

Die Erfindung betrifft auch Verfahren zum Verfolgen und zur Veränderung der Aggregation, insbesondere zum qualitativen oder quantitativen Nachweis, amyloidogener Peptide, Oligomere oder Aggregate davon, insbesondere β-Amyloidpeptid, Prion-Protein, α-Synuclein oder Polyglutamin, Oligomere davon oder Aggregate davon, oder zur Inhibierung der Zytotoxizität von β-Amyloidpeptid, Prion-Protein, α-Synuclein oder Polyglutamin oder Oligomere oder Aggregate davon, wobei die Peptidanaloga der vorliegenden Erfindung oder Anti körper dagegen in vivo oder in vitro mit den amyloidogenen Peptiden, Oligomeren oder Aggregaten davon in Kontakt gebracht werden und das Aggregationsverhalten der amyloidogenen Peptide, Oligomere oder Aggregate davon geändert wird, insbesondere die Aggregation reduziert oder inhibiert wird und/oder dadurch verfolgt werden kann (Diagnose).

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Modifizierung, insbesondere Verhinderung, der Aggregatbildung von in einer Flüssigkeit vorhandenem IAPP, Polyglutamin, α-Synuclein, Prionprotein oder β-Amyloidpeptid, wobei ein Peptidanalogon der vorliegenden Erfindung mit der Flüssigkeit in Kontakt gebracht, inkubiert wird und das Aggregationsverhalten des IAPP, Prionproteins, α-Synucleins, Polyglutamins oder des β-Amyloidpeptids modifiziert wird.

Weitere Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung ergeben sich aus den Unteransprüchen.

Sequenzprotokoll:

Die SEQ ID Nummern zeigen:
SEQ ID Nr. 1 bis 17 stellen bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Peptidanaloga dar. Jede einzelne der SEQ ID Nummern stellt mehrere verschiedene Peptidanaloga der vorliegenden Erfindung dar, die sich bei gleichem N-Methylierungsmuster hinsichtlich ihrer Primärstruktur unterscheiden. Jede einzelne SEQ ID Nummer stellt daher ein bestimmtes N-Methylierungsmuster dar, wobei dieses bei verschiedenen Primärstrukturen, das heißt bei verschiedenen Aminosäuresäurensequenzen auftreten kann, zum Beispiel der natürlichen Wildtyp-Aminosäuresequenz des humanen IAPP oder einem vorstehend definierten Derivat davon, das heißt einem Derivat gemäß dem das Lysin an Position 1 und/oder die beiden Cysteinreste an Position 2 und 7 durch Ornithin (als Ersatz für Lysin) an Position 1 und/oder Asparaginsäure und Dap (als Ersatz für die beiden Cysteinreste) verwendet werden. Jede einzelne SEQ ID Nummer steht daher für einerseits die Primärstruktur des natürlichen Wildtyp-IAPP aus dem Menschen mit einem bestimmten N-Methylierungsmuster und außerdem für die vorgenannten Derivate mit dem gleichen N-Methylierungsmuster davon. Die erfindungsgemäßen Peptidanaloga, die Cys an Position 2 und 7 aufweisen, sind vorzugsweise oxidiert, dass heisst die Disulfidbrücke zwischen den Thiolresten von Cys 2 und Cys 7 ist geschlossen.

Ebenso sind die erfindungsgemäßen Peptidanaloga, die an Position 2 und 7 Dap und Asp beziehungsweise Asp und Dap aufweisen, vorzugsweise verbrückt, dass heisst die Seitenketten von Asp und Dap sind kovalent miteinander über eine Lactambrücke verbunden. Bei allen Peptidanaloga der vorliegenden Erfindung liegt in einer Ausführungsform der Erfindung der C-Terminus in einer bevorzugten Ausführungsform als Amid vor.

Aus Beispiel 8 geht eine Zuordnung der SEQ ID Nummern zu den in den folgenden Beispielen verwendeten Abkürzungen der bevorzugten Peptidanaloga hervor.

SEQ ID Nr. 18 stellt die Aminosäuresequenz des humanen, natürlichen IAPP dar.

Die Erfindung wird anhand der folgenden Beispiele und der dazugehörigen Figuren näher erläutert. Die Figuren zeigen:

1 Absorptionen von Sedimentationsassays von IAPP (bei 10 und 100 μM) und der Analoga IAPP-GI, IAPP-AL, IAPP-FA, IAPP-IL. Die Absorption bei 570 nm entspricht der Menge des Proteins (im Pellet beziehungsweise im Überstand).

2 Ergebnisse eines Fibrillbildungstests: Das Fibrillenbildungspotential von 62.5 μM IAPP versus 62.5 μM IAPP-GI, IAPP-AL, und IAPP-IL wird durch den ThT-Bindungsassay quantifiziert.

3 Ergebnisse einer EM-Untersuchung der amyloidogenen Potentiale von IAPP und der Analoga IAPP-GI, IAPP-AL und IAPP-FA. Die Inkubationen der Peptide (5 μM, 20 h) wurden durch einen EM-basierten-Aggregationstest untersucht. Von links nach rechts sind Aliquots der folgenden Inkubationen gezeigt: IAPP allein, IAPP-GI, IAPP-FA, und IAPP-AL (Balken: 100 nm).

4 Ergebnisse von MTT-Reduktionsassays zur Ermittlung der potentiellen zytotoxischen Effekte der Analoga IAPP-GI, IAPP-AL, IAPP-FA im Vergleich zu IAPP.

5 Ergebnisse eines Fibrillen-Bindungstests: Der Effekt von IAPP-GI, IAPP-AL und IAPP-FA (1/1 Mischungen) auf das Fibrillenbildungspotential von IAPP (6.25 μM) wird durch den ThT-Bindungsassay quantifiziert.

6 Ergebnisse eines Aggregationstests: Der Effekt von IAPP-GI, IAPP-AL und IAPP-FA (1/1 Mischungen) auf das Fibrillenbildungspotential von IAPP (5 μM) wird durch einen EM-basierten Aggregationsassay untersucht. Von links nach rechts sind Aliquots der folgenden Inkubationen gezeigt (20h): IAPP allein, IAPP gemischt mit IAPP-GI, IAPP gemischt mit IAPP-FA, und IAPP gemischt mit IAPP-AL.

7A Ergebnisse von MTT-Reduktionsassays zur Ermittlung der Wirkung der Analoga IAPP-GI, IAPP-AL und IAPP-FA auf die pankreatische Zytotoxizität von IAPP (RIN5fm Zelllinie).

7B Die Ermittlung der IAPP-induzierten Adoptose auf RIN5fm Zellen allein und in der Anwesenheit von IAPP-GI (1/1). Auch IAPP-GI allein wurde unter den gleichen Bedingungen getestet und es wurde keine Zytotoxizität gefunden. Die entsprechenden Mittelwerte (±SEM) aus mindestens 2 unabhängigen Assays sind gezeigt.

8A Ergebnisse von (humanen) IAPP-Rezeptor-Bindungsassays mit IAPP und den Analoga IAPP-GI, IAPP-AL und IAPP-FA an MCF-7 Zellen. Es wird die spezifische Bindung des Radioligands [125I]-rIAPP versus Ligandenkonzentration geplottet.

8B Ergebnisse von Rezeptoraktivierungsassays mit IAPP und den Analoga IAPP-GI, IAPP-AL, und IAPP-FA an MCF-7 Zellen. Die Adenylatcyclaseaktivierung (% vom Maximum) wird durch die Quantifizierung von cAMP mittels des cAMP Biotrak ELISA (Amersham) bestimmt. Als maximale AC-Aktivierung wurde diejenige, welche durch 1 μM IAPP erreicht wurde, angenommen.

9 Ergebnisse eines ELISAs: Die Zeitabhängigkeit des Rezeptoraktivierungspotentials an MCF-7 Zellen einer 250 μM IAPP Lösung (in 10 mM Natriumphosphat, pH 7,4), welche 4 Tage bei RT (Raumtemperatur) stehen bleibt, wird mit demjenigen der Analoga IAPP-GI und IAPP-LA und Mischungen der Analoga mit IAPP verglichen. Die Adenylatcyclaseaktivierung (% vom Maximum) wird durch die Quantifizierung von cAMP mittels des cAMP Biotrak ELISA (Amersham) bestimmt. Als maximale AC-Aktivierung wurde diejenige, welche durch 1 μM IAPP erreicht wurde, angenommen.

10 Ergebnisse eines MTT-Reduktionstests zur Ermittlung der Wirkung des Analogs IAPP-GI auf die Zytotoxizität von Aβ. (PC.12 Zelllinie). Die Ergebnisse sind Mittelwerte (± SEM) aus einem repräsentativen Assay (triplikate Bestimmung).

Beispiel 1
Charakterisierung der Löslichkeitseigenschaften der erfindungsgemäßen Peptidanaloga und Vergleich zu IAPP
Die Löslichkeitseigenschaften der erfindungsgemäßen Peptidanaloga verglichen zu natürlichen IAPP wurden mittels Sedimentationstests, elektronenmikroskopischen Untersuchungen und durch den Thioflavin-T Bindungstests untersucht.

a) Der Sedimentationstests wurde verwendet, um die Löslichkeit der Analoga im Vergleich zu IAPP zu überprüfen. Dabei wurde die Menge an präzipitiertem oder löslichem Peptid in Abhängigkeit von der Zeit bestimmt. In einem typischen Experiment wird zunächst eine Peptidlösung einer bestimmten Konzentration (1, 10 oder 100 μM) in 10 mM Natriumphosphat Puffer, pH 7.4 hergestellt. Bei bestimmten Zeitpunkten werden Aliquots dieser Lösung abzentrifugiert (20200 g, 20 min) und ausgefallenes Protein wird im Pellet und im Überstand mittels des BCA-Proteinbestimmungsassays (BCA steht für Bicinchonic Acid) quantifiziert. In 1 sind einige Ergebnisse aus diesem Test dargestellt. Daraus ist zu entnehmen, dass die Aggregation von IAPP bei einer Konzentration von 10 μM gleich nach der Herstellung der Lösung anfängt. Nach 20 h ist IAPP vollständig ausgefallen; dementgegen bleiben die N-methylierten Analoga IAPP-LA, IAPP-GI, und IAPP-AF löslich über 14 Tage sogar bei einer Konzentration von 100 μM. IAPP ist komplett ausgefallen nach nur 2 h unter letzteren Bedingungen (100 μM).
b) Amyloidfibrillen verschiedener Proteinspezies binden den Farbstoff ThT und führen zu einer Zunahme seines Fluoreszenz-Emissionsmaximums. Die ThT-Bindung ist deswegen ein spezifi scher Test, welcher in breiter Anwendung zur Quantifizierung der Amyloidfibrillen verwendet wird. Dieser Test wurde verwendet, um die Amyloidbildungspotentiale der Analoga im Vergleich zu IAPP zu bestimmen. Für diesen Test wurden die Analoga und IAPP in einer Konzentration von 62.5 μm in Assaypuffer inkubiert (2% HFIP, 10 mM Tris, pH 7.4). Zu bestimmten Zeitpunkten wurden 40 ml Aliquots aus diesen Inkubationen mit 160 ml einer 5 μM ThT-Lösung (in 0.1 M Glycin-NaOH Puffer, pH 8.5) versetzt, gemischt und nach Anregung bei 450 nm wurde die Emission der Lösung bei 485 nm bestimmt. Es zeigte sich dabei, dass IAPP schon bei einer Konzentration von 625 nM Fibrillen bildet. Dementgegen fibrillieren die Analoga auch noch nicht bei einer Konzentration von 62.5 μM (2).
c) Für EM-Untersuchungen wurden 5 μM Lösungen der Analoga versus IAPP (in 10 mM Natriumphosphat Puffer, pH 7.4, enthaltend 1% HFIP) etwa 20 h bei RT inkubiert. Danach wurden 10 μl der Lösungen auf EM-Plättchen aufgetragen und nach Färbung mit 1 % Uranylacetat wie beschrieben (Kayed, J. Mol. Biol. (1999) 287, 781–796) auf die Anwesenheit von Fibrillen mittels EM untersucht. Es stellte sich heraus, das im Gegensatz zu der IAPP Lösung, welche hauptsächlich aus IAPP Amyloidfibrillen besteht, die Lösungen der IAPP-Analoga keine Fibrillen enthalten (3).

Zusammen mit den ThT-Bindungsassays- und den Sedimentationsassay-Ergebnissen zeigen diese Daten, dass die Analoga nicht amyloidogen und mindestens 100-fach löslicher als IAPP sind.
Beispiel 2
Untersuchung der Cytotoxizität der Analoga im Vergleich zum IAPP
IAPP-Amyloidaggregate sind zytotoxisch für pankreatische β-Zellen und für eine Reihe anderer Zellen. Man geht davon aus, dass der zytotoxische Effekt von IAPP und anderen Amyloidpolypeptiden mit ihrer Aggregation zum Amyloid einhergeht. Daraus folgt die Annahme, dass, da die Analoga nicht amyloidogen sind, sie auch nicht zytotoxisch sein sollten. Um diese Annahme zu untersuchen, wurde der MTT-Zytotoxizitätstest verwendet, welcher auf der Reduktion des Farbstoffs 3-[4,5-Dimethylthiazol-2-yl]-2,5-Diphenyltetrazoliumbromid (MTT) durch „gesunde" Zellen mit intaktem Redoxpotential beruht (Shearman et al., J. Neurochem. (1995) 65, 218-227; Shearman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1994) 91, 1470-74). Letzteres ist ein früher Indikator von Zellviabilität oder Schädigung. Es hat sich gezeigt, dass der zytotoxische Effekt von Amyloidaggregaten, inkl. IAPP, durch diesen Test quantifiziert werden kann. Die Zelltoxizität von IAPP und der Analoga wurde anhand der pankreatischen Zelllinie RIN5fm wie beschrieben untersucht (Kapurniotu et al., J. Mol. Biol. (2002) 315, 339-350) (4). In einem typischen MTT-Test, werden Inkubationen der Peptide angesetzt (5 μM in 10 mM Natriumphosphat-Puffer mit oder ohne 1 % HFIP, pH 7.4,) und nach 20 h bei RT auf die Zellen (welche 20 h vorher in einer Zelldichte von 5 × 10⁵ Zellen/ml ausgesät wurden) gegeben. Nach etwa 20 h Inkubation mit den Zellen wird MTT dazu gegeben, und nach 2-stündiger Wirkung wird das MTT-Reduktionspotential der Zellen spektrophotometrisch bestimmt. Die Ergebnisse sind als % Zellvitalität, welches dem Prozent der Reduktion von MTT durch die Kontrollzellen (100% Reduktion von MTT entspricht 100% Vitalität) entspricht, wiedergegeben und entsprechen Mittelwerten (± SEM) aus mindestens 2 unabhängigen Tests.
Wie aus 4 zu entnehmen ist, weisen die Analoga IAPP-AL, IAPP-GI, und IAPP-FA im Gegensatz zum IAPP keine Zytotoxizität auf.
Beispiel 3
Wirkung der Analoga als Inhibitoren oder Modulatoren der Amyloidbildungsfähigkeit von IAPP
Der Effekt der Analoga auf das Amyloidbildungspotential von IAPP wurde durch EM (Elektronenmikroskop) und den ThT-Bindungstest untersucht.
In einem typischen Th-T Bindungstest Ansatz wurden Inkubationen angesetzt, welche 6.25 μM IAPP in Assaypuffer (10 mM Tris, pH 7.4 und 2% HFIP) allein oder in einer 1/1 Mischung mit einem der Analoga enthielten. Zu bestimmten Zeitpunkten wurden Aliquots der Lösungen wie oben beschrieben mit ThT versetzt und auf ihre Fluoreszenzemission überprüft. Wie aus der 5 zu entnehmen, weisen die Analoga einen stark inhibitorischen Effekt auf das Amyloidbildungpotential von IAPP auf.
In einem typischen durch EM verfolgten Aggregationstest, wurde IAPP (5 μM) allein oder in Anwesenheit eines der Analoga (in einem Verhältniss von 1/1 inkubiert (in 10 mM Natriumphosphat-Puffer, pH 7.4, enthaltend 1 % HFIP)). Nach 20 h wurden 10 μl der Lösung auf ein EM-Plättchen aufgetragen und nach Färbung mit 1 % Uranylacetat wie beschrieben (Kayed, J. Mol. Biol. (1999) 287, 781-96) auf Anwesenheit von Fibrillen mittels EM untersucht. Es stellte sich heraus, dass im Gegensatz zur IAPP-Lösung, welche hauptsächlich aus IAPP-Amyloidfibrillen bestand, in den IAPP-Analoga-Mischungen die Fibrillenbildung komplett unterdrückt war (6).
Beispiel 4
Wirkung der Analoga als Inhibitoren der Zelltoxizität von IAPP
Die Wirkung der Analoga IAPP-GI, IAPP-AL und IAPP-FA auf die β-Zell-Toxizität von IAPP-Amyloidaggregaten wurde mittels zweier verschiedener Tests untersucht. Zunächst wurde der MTT-Zellviabilitätstest verwendet (s. oben). Der Test zeigte, dass alle Analoga in einem IAPP/Peptidanalogon-Mischverhältniss von 1/1 die Zelltoxizität von IAPP signifikant hemmen können (7A). Dabei erwies sich IAPP-GI als der potenteste Inhibitor der IAPP-Zytotoxizität.
Beim zweiten Test wurde der Effekt von IAPP-GI auf den durch IAPP-Amyloid hervorgerufenen apopotischen β-Zelltod untersucht (es ist bekannt, dass der IAPP-vermittelte Zelltod hauptsächlich durch Apoptose hervorgerufen wird). Dazu wurden Lösungen von IAPP allein und in der Anwesenheit von IAPP-GI (1/1) (5 μM in 10 mM Natriumphosphat-Puffer, pH 7.4) hergestellt und mit den ausplatierten Zellen bei einer finalen Konzentration von 500 nM 20 h lang inkubiert. Danach wurde die Apoptose mittels eines kommerziellen Apoptose ELISAs (Cell Death Detection Kit von Roche) quantifiziert. Durch diesen ELISA-Assay werden die zytosolischen Nucleosomen, welche ein früher und spezifischer Nachweis von apoptotischem Zelltod sind, quantifiziert. Auch dieser Test zeigt (7B), dass IAPP-GI in der Lage ist, pankreatische β-Zellen vor dem IAPP-induzierten apoptotischen Zelltod zu schützen.
Beispiel 5
Wirkung der Analoga als IAPP Rezeptoragonisten
Um die Wirkung der Analoga als (humane) IAPP-Rezeptoragonisten zu testen, wurde zunächst ihre Rezeptorbindungsaffinität an Zellen, welche diesen Rezeptor exprimieren, getestet. Solche Zellen sind die MCF-7 Zelllinie (Zimmermann, et al. J. Endocrinology (1997), 155, 423-31) welche aus humanen Brustkrebszellen stammt. Spezifische IAPP-Rezeptoren werden in der MCF-7 Zelllinie exprimiert und diese Zelllinie findet deswegen eine breite Anwendung für das Testen von IAPP-Agonisten/Antagonisten.
Der Rezeptorbindungstest wurde analog zu demjenigen, welcher bei Zimmermann, et al. J. Endocrinology (1997) 155, 423-31 beschrieben ist, durchgeführt. Dabei wurde die Bindung der mit ¹²⁵Imarkierten Ratten-IAPP (rIAPP)-Sequenz-, welche der stärkste bis heute bekannte Rezeptorligand ist, in Anwesenheit von IAPP oder der Peptidanaloga IAPP-GI, IAPP-AL oder IAPP-FA quantitativ bestimmt. Mischungen des radioaktiv markierten Liganden rIAPP (∼80 pM) mit den entsprechenden Peptiden in verschiedenen Endkonzentrationen (8A) wurden für 1 h mit MCF-7 Zellen bei RT in kubiert. Danach wurden die Zellen mit Testpuffer (der Testpuffer bestand aus einer 1/1 Mischung von Dulbeccos MOD Eagle und F12 Nutrient Mixture (HAM) enthaltend 0.1 % BSA) gewaschen, mit NaOH (0.5 M) und anschließend mit der Szintillationsflüssigkeit versetzt und die membrangebundene Radiaktivität wurde mittels eines Szintillationszählers bestimmt. Wie aus 8A zu entnehmen, sind alle drei hier getesteten Analoga in der Lage, den IAPP-Rezeptor zu binden. Dabei erweist sich IAPP-AL als der Agonist mit der höchsten Rezeptoraffinität wobei IAPP-GI der schwächste ist (8A).
Um das agonistische Potential der Analoga zu testen, wurde anschliessend ihr Adenylatzyklaseaktivierungspotential (AC-Aktivierung) getestet. Es hat sich gezeigt, dass einige der rezeptorvermittelten biologischen Effekte von IAPP durch Adenylatzyklaseaktivierung vermittelt werden. Die AC-Aktivierung wird durch durch die Quantifizierung von cAMP, welches nach Behandlung der Zellen (15 min, 37 °C) mit verschiedenen Konzentrationen von IAPP oder den Analoga produziert wird, mittels des cAMP Biotrak ELISA (Amersham) bestimmt. Der Test wird an MCF-7 Zellen durchgeführt in Analogie zu dem Protokoll von in Zimmermann, et al. J. Endocrinology (1997) (a.a.O.). Wie aus 8B zu entnehmen, sind alle getesteten Analoga (IAPP-GI, IAPP-AL, IAPP-FA) volle IAPP-Agonisten. Dabei erweist sich IAPP-AL als der potenteste Agonist und ist ein besserer AC-Aktivierungsligand als IAPP. IAPP-AF hat das gleiche AC-Aktivierungspotential wie IAPP und IAPP-GI ist ein schwächerer Agonist als IAPP.
Die Ergebnisse des AC-Aktivierungstests sind somit im Einklang zu den Ergebnissen der Rezeptorbindungstests.
Beispiel 6
Vergleich der Stabilität in Lösung (Konzentration 1 mg/ml bei pH 7.4) und des Erhalts ihrer Bioaktivität (hormonellen Wirkung) verglichen zum IAPP: Potentielle Verwendung als Ersatz für IAPP in der Therapie
Um die potentielle Anwendbarkeit der Analoga als IAPP-oder Pramlintide-Ersatz in der Therapie von Diabetes und/oder anderen Krankheiten wurde die Stabilität Ihrer Lösungen und somit Ihrer hormoneller Wirkung im Vergleich zum leicht aggregierendem IAPP untersucht. In einem typischen Ansatz werden wässrige Lösungen von IAPP, IAPP-AL, IAPP-GI, oder 1/1 Mischungen der Analoga mit IAPP (250 μM oder 1 mg/ml) in 10 μm Natriumphosphat, pH 7.4, bei RT eingesetzt und 4 tagelang inkubiert. Das AC-Aktivierungspotential dieser Lösungen wird an verschiedenen Zeitpunkten z.B. Zeit 0, 48 h und 96 h mittels des AC-Aktivierungsassays ober beschrieben bestimmt (Endkonzentration auf Zellen 1 μM, entsprechend der max. Aktivierung) (9).
Diese Experimente zeigen, dass IAPP, wenn es unter obigen Bedingungen gelagert wird, mehr als die Hälfte seiner ursprünglichen hormonellen Wirkung verlieren kann (wahrscheinlich wegen seiner Aggregation). Im Gegensatz dazu ist die hormonelle Wirkung der Analoga und der Mischungen (1/1) IAPP/Analoga Mischungen voll erhalten. Die gewählte Konzentration von 1 mg/ml entspricht der Konzentration einer Formulierung von Symlin (Pramlintide Acetate) welches von der Fa. Amylin Pharmaceuticals für die Therapie von Diabetes in klinischen Studien eingesetzt wird.
Beispiel 7
Inhibitorischer Effekt der Analoga auf die Zytotoxizität des Alzheimer Peptides β-Amyloidpeptid (A-β): Potentielle Verwendung für die Therapie der Alzheimer Krankheit (AD)
Es wurde der Effekt vom IAPP-GI (Mischung 1/1) auf die Zytotoxizität vom A-β mittels des MTT-Tests untersucht. Dafür wurde A-β (100 μM) allein oder zusammen mit IAPP-GI 4 Tage lang in 10 mM Tris Puffer, pH 7.4, enthaltend 150 mM NaCl und 2.2% HFIP bei RT inkubiert. Die Lösungen wurden danach nach Verdünnung auf PC-12 und HTB-14 Zellen zugegeben. Beide Zelllinien werden oft für die Untersuchung der inhibitorischen Wirkung von potentiellen A-β Zytotoxizitätsinhibitoren verwendet. Es ergab sich an beiden Zelllinien, dass IAPP-GI in der Tat die Zytotoxizität des A-β-Peptides stark herabsetzen kann (10). Die Interaktion von A-β mit IAPP-GI wurde durch weitere Bindungstests bestätigt. Somit sind IAPP-GI und andere N-methylierte IAPP-Analoga besonders geeignet für die Therapie der Alzheimer-Krankheit (AD).
Die erfindungsgemäßen Peptidanaloga wurden durch einfache Chemosynthese in hoher Reinheit und guter Ausbeute nach gängigen Methoden der Festphasenpeptidsynthese auf RINK-Amid-MBHA-Harz unter Verwendung der Fmoc/tBu Strategie hergestellt (Kazantzis et al., Eur. J. Biochem. (2002) 269, 780-791). In einer typischen Synthese werden Nα-Fmoc-geschützte Aminosäuren (Seitenkettenschutz wie folgt: Lys (Boc), Cys (Tet), Arg (Pmc), Asn (Tet), His (Tet), Ser (tBu), Tyr (tBu), Thr (tBu)) verwendet. N-methylierte Fmoc-Aminosäuren werden auch in dieser Form eingesetzt (zum Beispiel Fmoc-(N-Me) Ile; Fmoc-(N-Me) Gly etc.). Die Kupplungen der Fmoc-Aminosäuren (AS) werden mit TBTU und DIEA (4-facher molarer Überschuss an AS; 4-facher Überschuss an TBTU; 6-facher Überschuss an DIEA bezüglich der molaren Menge an C-terminalen AS) in DMF und/oder NMP durchgeführt. Für die Kupplungen der N-methylierten AS oder an N-methylierte AS werden höhere Überschüsse, doppelte bis zu x-fache Kupplungen, Mischungen aus Lösungsmitteln und längere Kupplungszeiten eingesetzt. Die Abspaltung der Fmoc-Gruppe wird mittels 25% Piperidin in DMF durchgeführt. Die Abspaltung der Peptide vom Harz wird durch eine Mischung aus TFA/Wasser/Thioanisol/Ethandithiol/Phenol (83/4,5/4,5/2/6 (v/v/v/v/w)) durchgeführt (Kazantzis et al., Eur. J. Biochem. (2002) 269, 780-791). Das Harz wird durch Filtration von der Peptidlösung abgetrennt und das Rohprodukt wird nach Eindampfen des Lösungsmittels, Aufnehmen in 10% HAc, Extraktion mit Äther und Lyophilisieren der wässrigen Phase in reduzierter Form gewonnen. Die Schließung der Disulfidbrücke von Cys²/Cys⁷ erfolgt in ei ner O.1M NH₄HCO₃ Lösung (1 mg/ml Peptidkonzentration), welche 3M GdnHCl enthält, und erfordert 2-4 Stunden. Das Rohprodukt wurde nach der Oxidation wieder über Umkehrphasen-Chromatographie auf einer C¹⁸-Säule und mittels ACN-haltigem Gradienten hochgereinigt (Kazantis et al., a.a.O.). SEQUENCE LISTING

Claims

Peptidanalogon des Islet Amyloid Polypeptids (IAPP) mit der Fähigkeit, an natürlichen IAPP-Rezeptor zu binden, wobei das Peptidanalogon a) höchstens 38 Aminosäuren aufweist, von denen 37 Aminosäuren die Aminosäuresequenz des natürlichen IAPP in ihrer natürlichen Abfolge aufweisen, b) mindestens die Aminosäuren 19 bis 37 des natürlichen IAPP in ihrer natürlichen Abfolge aufweist, c) mindestens eine seiner Amidbindungen N-methyliert ist, d) wobei optional in der Aminosäuresequenz des natürlichen IAPP Lys (Lysin) an Position 1 ersetzt sein kann durch Orn (Ornithin) und/oder Cys (Cystein) an Position 2 und 7 ersetzt sein kann durch Dap (Diaminopropionsäure) an Position 2 und Asp (Asparaginsäure) an Position 7 oder Asp an Position 2 und Dap an Position 7, und e) wobei die Peptidanaloga der SEQ ID Nr. 1 bis 5 mit der Aminosäuresequenz des natürlichen humanen IAPP ausgenommen sind.
Peptidanalogon des Islet Amyloid Polypeptids (IAPP) als diagnostisches oder therapeutisches Mittel mit der Fähigkeit, an natürlichen IAPP-Rezeptor zu binden, wobei das Peptidanalogon a) höchstens 38 Aminosäuren aufweist, von denen 37 Aminosäuren die Aminosäuresequenz des natürlichen IAPP in ihrer natürlichen Abfolge aufweisen, b) mindestens die Aminosäuren 19 bis 37 des natürlichen IAPP in ihrer natürlichen Abfolge aufweist, c) mindestens eine seiner Amidbindungen N-methyliert ist, d) und wobei optional in der Aminosäuresequenz des natürlichen IAPP Lys an Position 1 ersetzt sein kann durch Orn und/oder Cys an Position 2 und 7 ersetzt sein kann durch Dap an Position 2 und Asp an Position 7 oder Asp an Position 2 und Dap an Position 7.
Peptidanalogon nach Anspruch 1 oder 2, wobei dieses die vollständige Aminosäuresequenz des natürlichen IAPP aufweist.
Peptidanalogen nach Anspruch 1, 2 oder 3, wobei dieses die Aminosäuren 8 bis 37 des natürlichen IAPP aufweist.
Peptidanalogon nach Anspruch 3, wobei dieses als Agonist des natürlichen Rezeptors des IAPP wirkt.
Peptidanalogon nach Anspruch 4, wobei dieses als Antagonist des natürlichen Rezeptors des IAPP wirkt.
Peptidanalogon nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei eine, zwei, drei oder vier Amidbindungen des IAPP N-methyliert sind.
Peptidanalogon nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die mindestens eine Amidbindung ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus den Amidbindungen der α-Aminogruppen, der Aminosäuren an den Positionen 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29.
Peptidanalogon nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Peptidanalogon ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID Nr. 1 bis 17.
Peptidanalogon nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Peptidanalogon löslich ist.
Peptidanalogon nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Peptidanalogon, insbesondere an seiner N-terminalen α-Aminogruppe markiert ist, insbesondere mit einer Acetylgruppe, ei nem radioaktiven Marker, einem Enzymmarker, einem Fluoreszenzmarker, einem Lumineszenzmarker oder einem Spin-Label.
Peptidanalogon nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Peptid mit mindestens einer funktionellen Gruppe derivatisiert ist, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Acylgruppe, funktionalisierten Alcylgruppe, aromatische Gruppe, Aminosäure, Glycogruppe und Lipidgruppe.
Peptidanalogon nach Anspruch 11 oder 12, wobei der Marker und/oder die funktionelle Gruppe über einen Spacer, insbesondere eine Aminosäure, mit dem Peptidanalogon verbunden ist.
Peptidanalogon nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei dieses auf einem Träger immobilisiert ist.
Peptidanalogon nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das IAPP human ist.
Verfahren zur Herstellung von spezifisch gegen IAPP oder spezifisch gegen ein Peptidanalogon nach einem der Ansprüche 1 bis 15 gerichteten Antikörpern, wobei mindestens ein Peptidanalogon nach einem der Ansprüche 1 bis 15 als Antigen, gegebenenfalls zusammen mit monomerem IAPP oder einem Oligomer davon mit einem zur Antikörper-Bildung befähigten System in Kontakt gebracht und die gebildeten Antikörper gewonnen werden.
Verfahren zur Herstellung von spezifisch gegen Mischungen von IAPP oder β-Amyloidpeptid mit einem Peptidanalogon nach einem der Ansprüche 1 bis 15 gerichteten Antikörper, wobei Mischungen von IAPP oder β-Amyloidpeptid, oder einem Oligomer davon jeweils mit einem Peptidanalogon nach einem der Ansprüche 1 bis 15 als Antigen mit einem zu Antikörper-Bildung befähigten System in Kontakt gebracht und die gebildeten Antikörper gewonnen werden.
Antikörper, herstellbar nach dem Verfahren nach Anspruch 17, der spezifisch gegen eine Mischung eines Peptidanalogons nach einem der Ansprüche 1 bis 15 und IAPP oder spezifisch gegen eine Mischung eines Peptidanalogons nach einem der Ansprüche 1 bis 15 und das β-Amyloidpeptid gerichtet ist und diese spezifisch bindet.
Antikörper, herstellbar nach dem Verfahren nach Anspruch 16, der spezifisch gegen ein Peptidanalogon nach einem der Ansprüche 1 bis 15 oder spezifisch gegen IAPP oder spezifisch gegen einen IAPP/Peptidanalogonkomplex gerichtet ist und diese spezifisch bindet.
Arzneimittel, enthaltend mindestens ein Peptidanalogon nach einem der vorhergehenden Ansprüche 1 bis 15 und/oder einen Antikörper nach Anspruch 18 oder 19.
Kombinationsarzneimittel, enthaltend mindestens ein Peptidanalogon nach einem der Ansprüche 1 bis 15 und/oder einen Antikörper nach einem der Ansprüche 18 oder 19 und Insulin und/oder IAPP und/oder Pramlintide.
Arzneimittel nach einem der Ansprüche 20 oder 21, enthaltend mindestens einen pharmazeutisch verträglichen Träger.
Arzneimittel nach einem der Ansprüche 20 bis 22, wobei das Arzneimittel als Depot-Arzneimittel ausgeführt ist.
Arzneimittel nach einem der Ansprüche 20 bis 23, wobei das Arzneimittels in Tablettenform, Aerosol oder als Lösung vorliegt.
Verwendung eines Peptidanalogons nach einem der Ansprüche 1 bis 15 oder eines Antikörpers nach Anspruch 18 oder 19 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Prophylaxe oder Therapie von Proteinaggregationskrankheiten, insbesondere Diabetes.
Verwendung eines Peptidanalogons nach einem der Ansprüche 1 bis 15 oder eines Antikörpers nach Anspruch 18 oder 19 zusammen mit Insulin und/oder IAPP und/oder Pramlintide zur Herstellung eines Kombinationsarzneimittels zur Prophylaxe oder Therapie von Diabetes.
Verwendung nach Anspruch 25 oder 26, wobei das Peptidanalogon als Rezeptorantagonist zur IAPP-Rezeptor-gesteuerten Behandlung von Diabetes verwendet wird.
Verwendung nach Anspruch 25 oder 26, wobei das Peptidanalogon als Rezeptoragonist zur IAPP-Rezeptor-gesteuerten Behandlung von Diabetes verwendet wird.
Verwendung nach Anspruch 25, 26, 27 oder 28, wobei das Peptidanalogon als Inhibitor der IAPP-Aggregation und der Bildung von IAPP-Plaques verwendet wird.
Verwendung eines Peptidanalogons nach einem der Ansprüche 1 bis 15 oder eines Antikörpers nach Anspruch 18 oder 19 zur Herstellung eines Arzneimittels zur gleichzeitigen a) Reduktion oder Inhibition der IAPP-Aggregation oder der Bildung von Amyloidplaques aus IAPP und b) zur Regulation des Zuckerstoffwechsels.
Verwendung eines Peptidanalogons nach einem der Ansprüche 1 bis 15 oder eines Antikörpers nach Anspruch 18 oder 19 zur Herstellung eines Arzneimittels zur gleichzeitigen a) Reduktion oder Inhibition der Cytotoxizität von IAPP oder dessen Aggregaten und b) zur Regulation des Zuckerstoffwechsels.
Verwendung eines Peptidanalogons nach einem der Ansprüche 1 bis 15 oder eines Antikörpers nach Anspruch 18 oder 19 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Reduktion oder Inhibition der β-Amyloidpeptid-Aggregation oder der Bildung von Amyloidplaques aus β-Amyloidpeptiden.
Verwendung eines Peptidanalogons nach einem der Ansprüche 1 bis 15 oder eines Antikörpers nach Anspruch 18 oder 19 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Reduktion oder Inhibition der Cytotoxizität von β-Amyloidpeptiden oder dessen Aggregaten.
Verwendung eines Peptidanalogons nach einem der Ansprüche 1 bis 15 oder eines Antikörpers nach Anspruch 18 oder 19 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Prophylaxe oder Therapie der Alzheimer-Erkrankung oder anderer Proteinaggregationskrankheiten.
Verwendung eines Peptidanalogons nach einem der Ansprühe 1 bis 15 oder eines Antikörpers nach Anspruch 18 oder 19 zur Herstellung eines Arzneimittels zur gleichzeitigen a) Prophylaxe oder Therapie der Alzheimer-Erkrankung oder anderer Proteinaggregationskrankheiten und b) Diabetes.
Verwendung nach einem der Ansprüche 25 bis 35, wobei das Arzneimittel als Kombinationsarzneimittel mit Insulin und/oder Pramlintide und/oder IAPP ausgeführt ist.
Verwendung eines Peptidanalogons nach einem der Ansprüche 1 bis 15 oder eines Antikörpers nach Anspruch 18 oder 19 zur Herstellung eines Diagnosemittels zur Diagnose der Alzheimer-Erkrankung oder anderer Proteinaggregationskrankheiten.
Verwendung eines Peptidanalogons nach einem der Ansprüche 1 bis 15 oder eines Antikörpers nach Anspruch 18 oder 19 zur Herstellung eines Diagnosemittels zur Diagnose von Proteinaggregationskrankheiten, insbesondere Diabetes.
Verwendung eines Peptidanalogons nach einem der Ansprüche 1 bis 15 als ein verbessert handhabbares Immunogen für die Herstellung von Antikörpern für diagnostische, therapeutische und Forschungszwecke.
Verfahren zum qualitativen und/oder quantitativen Nachweis von IAPP, β-Amyloidpeptid, Prion-Protein, α-Synuclein oder Polyglutamin oder deren Aggregaten, wobei ein mit einem Detektionsmarker versehenes Peptidanalogon nach einem der Ansprüche 1 bis 15 oder ein mit einem Detektionsmarker versehener Antikörper nach Anspruch 18 oder 19 als Sonde mit einer zu untersuchenden Probe in Kontakt gebracht und eine Bindung des Peptidanalogons oder Antikörpers mit gegebenenfalls vorhandenen IAPP, β-Amyloidpeptid, Prion-Protein, α-Synuclein oder Polyglutamin oder deren Aggregaten nachgewiesen wird.
Verfahren zur Modifizierung, insbesondere Verhinderung der Aggregatbildung von in einer Flüssigkeit enthaltendem IAPP, β-Amyloidpeptid, Prion-Protein, α-Synuclein oder Polyglutamin, wobei ein Peptidanalogon nach einem der Ansprüche 1 bis 15 mit der Flüs sigkeit in Kontakt gebracht, inkubiert und die Aggregatbildung modifiziert wird.
Verwendung eines Peptidanalogons nach einem der Ansprüche 1 bis 15 oder eines Antikörpers nach Anspruch 18 oder 19 für Forschungszwecke.
Mischung eines Peptidanalogons nach einem der Ansprüche 1 bis 15 mit IAPP und/oder β-Amyloidpeptid und/oder Pramlintide.