DE60020220T2

DE60020220T2 - Plättchenadhäsion blockierendes protein

Info

Publication number: DE60020220T2
Application number: DE60020220T
Authority: DE
Inventors: Wolfgang Strittmatter; Detlef Güssow; Uwe Hofmann; Jürgen Hemberger; Zisi Fotev; Bernhard Scheuble
Original assignee: Merck Patent GmbH
Current assignee: Merck Patent GmbH
Priority date: 1999-03-18
Filing date: 2000-03-10
Publication date: 2006-05-24
Anticipated expiration: 2020-03-11
Also published as: CZ301524B6; CA2367457A1; AU3166200A; CZ20013341A3; SK287496B6; MXPA01009363A; NO20014506L; ES2240067T3; EP1161530B1; US20060094079A1; CN1185344C; PL350147A1; EP1161530A1; SK12902001A3; KR100788219B1; CO5241328A1; US6774107B1; DE60020220D1; ATE295883T1; RU2292351C2

Description

Kurze Darstellung der Erfindung
Ein aus dem Speichel des Blutegels Hirudo medicinalis isoliertes, natürlich vorkommendes Protein ist beschrieben, das stark an Kollagen bindet und somit als Inhibitor der natürlichen Plättchenadhäsion an Kollagen wirkt. Das Protein hat ein Molekulargewicht von etwa 12 000, einen sauren isoelektrischen Punkt und enthält sechs Cysteine. Das Protein wurde sequenziert, und das Gen wurde aus einer H. medicinalis-cDNA-Bank kloniert. Verfahren zur Herstellung eines solchen Polypeptids mittels Rekombinationstechniken sind offenbart. Das rekombinante und das natürlich vorkommende Protein sind starke Inhibitoren der kollagenabhängigen Plättchenadhäsion und eignen sich daher zur therapeutischen Behandlung verschiedener Zustände, die mit Herzerkrankung und Erkrankungen des Kreislaufsystems in Zusammenhang stehen. Ferner eignet sich das Protein zur Beschichtung natürlicher oder künstlicher Kollagenoberflächen, um diese für Zellen nicht-adhäsiv zu machen und die Aktivierung von Zellen zu verhindern.
Gebiet der Erfindung
Bei Homöostase oder Thrombose haften Plättchen an der Zell-extrazellulären Matrix eines verletzten Blutgefäßes und bedecken die Oberfläche des beschädigten Bereichs. Die Verhinderung dieses wichtigen ersten Schritts in der Pathogenese von Thrombose und Arterienverschluss sollte bei der Bestrebung, thrombotische Erkrankungen zu verhindern, von therapeutischem Nutzen sein.
Kollagen wird als die am stärksten thrombogene Oberflächenkomponente ansehen, und es wurde gezeigt, dass es ein starkes Stimulanz für Plättchenadhäsion, -aggregation und die Freisetzung ihrer Granula ist, was zur Rekrutierung (Ruggeri, Z. M. et al.; Seminars in Haematology, 1994, 31, 229–39) weiterer Plättchen in diesen Bereich führt, so dass Aggregate oder ein Thrombus gebildet werden. Der erste Kontakt der Plättchen mit der Gefäßoberfläche wird durch Kollagen-gebundenen von-Willebrand-Faktor (vWF) und einen spezifischen vWF-Rezeptor auf Plättchen, den Glycoprotein-Ib-V-IX-Komplex, vermittelt. Zusätzlich treiben ADP, Adrenalin und zirkulierende Gerinnungsfaktoren den weiteren Aktivierungsprozess von Plättchen an, während gleichzeitig ein Anstieg in der Thrombinaktivität zur Bildung des vernetzten Fibringerinnsels beiträgt. Die Plättchen-Plättchen-Aggregation unterstützt diesen Vorgang und wird hauptsächlich durch Fibrinogen als Vermittler angetrieben, der Zellen durch den Glycoprotein-IIb/IIIa-Rezeptor miteinander verbrückt.
Diese normale physiologische Antwort ist im Verlauf des pathologischen Vorgangs ziemlich entscheidend, bei dem sich Plättchen an Kollagene, die in sklerotischen Läsionen frei liegen, heften (Van der Rest M. et al.; FASEB Journal, 1991, 5, 2814–23) und damit beginnen, Okklusionen aufzubauen. Je nach der Stelle und dem Ausmaß der Okklusion können schwerwiegende Komplikationen, wie Myokardinfarkt, Schlaganfall, Entzündung oder Lungenembolie, das schwerwiegende Ergebnis dieses Vorgangs sein.
Als direkt wirkendes, anti-thrombotisches Mittel ist zurzeit Heparin, das die Thrombinaktivität blockiert und somit die Bildung fibrinreicher Thrombi verhindert, die am besten bekannte, bei anti-thrombotischen Eingriffen verwendete Arzneisubstanz. Heparin wird weitverbreitet bei Indikationen einsetzt, wie: instabile Angina und akuter Myokardinfarkt. Trotz der weitverbreiteten Verwendung verbleiben jedoch mehrere schwerwiegende Nachteile ungelöst, wie intravenöse Anwendung, Erforderlichkeit von Antithrombin-111 als Cofaktor, verringerte Affinität für gerinnselgebundenes Thrombin, seine Inaktivierung durch mehrere Plasmaproteine, die gelegentliche Induktion von Thrombozytopenie und seine biologische Heterogenität. Infolgedessen waren die Ergebnisse der Verwendung von Heparin im klinischen Umfeld bisher nicht überwältigend.
Die kürzlich erfolgte Entwicklung von niedermolekularem Heparin hat eine Version für die subkutane Applikation beigesteuert, wobei jedoch der therapeutische Nutzen gegenüber dem Standard-Heparin mäßig war.
Unglücklicherweise gilt das gleiche für die anderen direkt wirkenden Anti-Thrombine, wie Hirudin, Hirulog und Warfarin. Es stellte sich heraus, dass eines der hauptsächlichen Probleme anscheinend mit der gesteigerten Produktion von Thrombin unter anti-thrombotischer Behandlung in Zusammenhang steht (Rao, A. K et al., Circulation, 1996, 94, 389–2395).
Andere neuere Strategien konzentrierten sich daher auf den Vorgang der Prothrombin-Aktivierung, die durch Faktor Xa angetrieben wird. Die wichtigste Herausforderung ist die Gestaltung geeigneter Inhibitoren, die gegen diesen Faktor gerichtet sind. Zusammengefasst könnte man also argumentieren, dass das vollständige therapeutische Potenzial dieses Typs des Eingriffes bisher noch nicht erreicht worden ist.
Eine weitere Gruppe von Therapeutika wird durch die thrombolytischen Behandlungsschemata repräsentiert und konzentrierte sich auf die Entwicklung von Staphylokinase, Streptokinase, Urokinase-Typ-Plasminogenaktivator, Gewebetyp-Plasminogenaktivator und Anisoyl-Plasminogen-Streptokinase-Aktivatorkomplex. Die Unterschiede in der Zeit, die für die Induktion einer Reperfusion erforderlich ist, sind für jedes dieser Thrombolytika bemerkenswert unterschiedlich, der Beitrag im Hinblick auf eine Verringerung der Gesamtsterblichkeit ist jedoch für alle Produkte gleich. Außerdem sind Reokklusion oder verlängerte Blutungsdauer häufige Komplikationen. Dafür können die relativ niedrige Spezifität für Fibrin und die kurze Plasma-Halbwertszeit dieser Verbindungen verantwortlich sein. Zurzeit werden verschiedene Applikationsprotokolle und Kombinationen verschiedener fibrinolytischer Prinzipien getestet, um einige der gegenwärtigen Nachteile bei der thrombolytischen Therapie zu bewältigen. Die Verbesserung, die man erwartet, ist jedoch recht klein.
Vor kurzem trat eine neue Gruppe von Patienten auf mit Problemen, wie akutem thrombotischem Verschluss und später Restenose aufgrund von Eingriffen, wie Angioplastie, Atherektomie, Arterientransplantation oder Gefäßwand-Stent. Die möglichen therapeutischen Interventionen umfassen Anti-Plättchen-, anti-thrombotische und thrombolytische Strategien. Verschiedene andere Substanzen, wie Ticlopdine, die als ADP-Antagonisten wirken, oder der Calcium-Ionophor A-23187 und insbesondere Aspirin haben einen direkten Einfluss auf die Plättchenfunktion und wurden für die Verhinderung oder Minimierung von Plättchenaggregation vorgeschlagen. Die erfindungsgemäße neue Anti-Plättchenadhäsions-Substanz könnte ebenfalls zur Bewältigung dieser klinischen Komplikationen beitragen, wenn sie während der Operation appliziert wird.
Zu einer weiteren Komplikation in Zusammenhang mit diesem Punkt kommt es, wenn künstliche Oberflächen mit Blut in Kontakt kommen, dann besteht eine erhöhte Neigung, thrombotische Ereignisse durch Aktivierung von Plättchen und/oder Induktion der Gerinnung auszulösen. Diese Wirkungen können das Versagen von Gefäßtransplantaten, Herzklappen, Stenten, Kathetern oder jede(r/m) anderen, mit Blut in Kontakt stehenden Vorrichtung oder Material verursachen. Die Fähigkeit des hier offenbarten Proteins, nicht-thrombogene Oberflächen zu schaffen, kann daher durch Immobilisierung dieses Proteins auf den vorstehend beschriebenen Materialien und Vorrichtungen weiter genutzt werden. Eine solche Behandlung sollte solche Materialien oder Vorrichtungen biokompatibel und thrombo-resistent machen.
Aufgrund von Beschränkungen im Zusammenhang mit den verfügbaren anti-thrombotischen Substanzen besteht ein tatsächlicher Bedarf an neuen, alternativen Strategien und Therapeutika.
Hintergrund der Erfindung
Durch Ansätze, wie sie in dieser Erfindung offenbart sind, die direkt an der durch Kollagen und/oder vWF-Faktor induzierten Plättchenadhäsion angreifen, lässt sich das Potenzial für zukünftige Verbesserungen in der Behandlung kardiovaskulärer Störungen beisteuern.
Mehrere neue Inhibitoren, welche die Plättchenadhäsion verhindern, sind gegen vWF gerichtete, monoklonale Antikörper. Man hat bereits vorgeschlagen, dass Glycoprotein-IIb/IIIa-Inhibitoren für die Hemmung der Plättchenadhäsion von Vorteil sein können.
Einige dieser Inhibitoren, wie der monoklonale Ak c7E3, wurden bereits klinisch getestet, während andere, wie die KGD- und RGDF-Inhibitoren, noch weiter untersucht werden. Die Spezifität der meisten dieser neuen Inhibitoren ist jedoch nicht sehr gut untersucht, so dass das Spektrum von Nebenwirkungen, die durch Verwendung dieser Inhibitoren induziert werden, noch offen ist und eine sorgfältige Untersuchung verdient.
Eine reichhaltige Quelle für das Screening neuer Verbindungen, welche die kollageninduzierte Plättchenadhäsion stören, ist in der Natur durch blutsaugende Tiere gegeben. Mehrere Inhibitoren wurden aus der Natur isoliert, wie in der Literatur beschrieben ist: Ein als Calin bezeichnetes, aus Hirudo medicinalis isoliertes 65-kD-Protein ( US 5,587,360 , WO 92/07005) (Munro, R., et al., Blood Coagulation und Fibrinolysis, 1991, 2, 179–184) und ein aus den Speicheldrüsen des Egels Haemenferia officinalis isoliertes 16-kD-Protein (LAPP) ( US 5,324,715 ). Beide Proteine wurden als Aggregationsinhibitoren beschrieben, wie in statischen Assays der kollagenabhängigen Plättchenaggregation getestet wurde.
Trotz nachgewiesener In-vitro-Aktivität war LAPP in mehreren gut etablierten In-vivo-Modellen unwirksam (Schaffer L. W. et al., Arterioscler. Thromb., 1993, 13, 1593–1601, und Connolly T. M. et al.; Thromb. Haemostas., 1993, 69, 589). Die Lederzecke, Omithodoros moubata, enthält ebenfalls ein Anti-Plättchen-Protein (Moubatin), das bei der Verhinderung der kollagenstimulierten Plättchenaggregation wirksam ist (Waxman, L. et al.; J. Biol. Chem., 1993, 268, 5445–49). Ein weiterer Inhibitor der Plättchenaggregation aus einer blutsaugenden Wanze wurde in WO 9309137 von Noeske-Jungblut C. et al. offenbart. Smith et al. haben ein 50-kDa-Protein aus Schlangengift isoliert, und ein 19-kDa-Protein wurde aus dem Speichel von Triatoma pallidipennis, einer blutsaugenden Wanze, isoliert. Es stellte sich heraus, dass das Protein einen Faktor enthält, der spezifisch die kollageninduzierte Plättchenaggregation hemmt. Das 19-kDa-Protein namens Pallidipin hemmt die kollagenvermittelte Aggregation von Plättchen in Plasma. Es wurde keine Hemmung der Aggregation nachgewiesen, die durch andere Effektoren (ADP, Thrombin, Thromboxan-A2-Mimetikum U46619, Phorbolester) stimuliert wurde. Pallidipin hatte keine Wirkung auf die Plättchenadhäsion an Kollagen, hemmte jedoch die ATP-Freisetzung aus Plättchen. Es tritt in reversible Wechselwirkung mit Plättchen und kann mit Kollagen zusammen eine gemeinsame Zielstruktur auf diesen besitzen. Der genaue Wirkmechanismus und der therapeutische Nutzen dieses Proteins werden zurzeit untersucht. Gan et al. beschrieben Echistatin als Inhibitor, der an den Fibrinogenrezeptor GP IIa/IIIb bindet (J. Biol. Chem, 1988, 263, 19827–32).
Trotz dieser aufregenden Entwicklungen besteht weiterhin ein Bedarf an der Bereitstellung weiterer Antikoagulanzien und an Anti-Thrombin mit einer gesteigerten Wirksamkeit bei der Hemmung der Gerinnselbildung, der vWF-induzierten Plättchenaktivierung oder der Endothelzellaktivierung, die pharmazeutisch verwendet und in kommerziell machbaren Mengen hergestellt werden können.
Da keines der bisher beschriebenen Proteine sich zu einer Verbindung mit idealem therapeutischem Profil entwickelt hat, haben sich die Erfinder der vorliegenden Erfindung entschlossen, mit einer neuen Screening-Strategie vorzugehen, um mehr relevante Proteine zu entdecken.
Beschreibung der Erfindung
In dieser Erfindung ist ein aus H. medicinalis isolierter Inhibitor beschrieben, der direkt auf die Kollagen-Plättchen-Wechselwirkung einwirkt und somit die Plättchenaktivierung und die frühe Plättchen-Plättchen-Wechselwirkung hemmt.
Bisher gibt es kein positives Beispiel in der Literatur, das zeigt, dass man unter Verwendung eines Screening-Ansatzes, der Aggregationsinhibitoren sowie lytische Proteine aus einer Quelle natürlich vorkommender Verbindungen ausschließt, neue anti-adhäsive Mechanismen oder -ver-bindungen identifizieren kann. Diese Strategie wurde jedoch in dieser Erfindung verwendet. Da von mindestens sechs verschiedenen Glycoproteinen der Plättchenoberfläche bekannt ist, dass sie an der Kollagenadhäsion beteiligt sind, und zusätzlich für mehrere von Plättchen stammende Verbindungen, wie von-Willebrand-Faktor, Fibronectin und Thrombospondin, gezeigt worden ist, dass sie als direkte Mediatoren der Kollagen-Plättchen-Adhäsion beteiligt sind, gab es zu Beginn wenig Optimismus, dass neue Adhäsionsinhibitoren identifiziert werden.
Trotzdem wurde dieser Ansatz für das Screening von Hirudo medicinalis-Speichel mit der Kenntnis verwendet, dass nicht alle dokumentierten oder unbekannten mit vWF verwandten Inhibitoren sowie Verbindungen, die direkt an Plättchenrezeptoren wirken, ausgeschlossen werden konnten. Daher war das Ergebnis des Screenings eine Überraschung: Ein neues, als Saratin bezeichnetes Protein mit anti-adhäsiver Aktivität für Plättchen, das aus Geweben und Sekreten des gut untersuchten Egels der Spezies Hirudo medicinalis isoliert werden kann.
Die vorliegende Erfindung umfasst das aktive Polypeptid Saratin, das aus dem Egel Hirudo medicinalis isoliert wurde. Das Protein wurde aus Speichel durch eine Kombination aus Druckdialyse und mindestens einem Chromatographieschritt, wie Anionenaustauschchromatographie, und mindestens einem Umkehrphasen-Hochleistungschromatographie- (RP-HPLC-)Schritt isoliert. Es stellte sich heraus, dass der Druckdialyseschritt während der Gewinnung von Saratin aus Speichel absolut entscheidend war, weil die starke Konzentration von Speichel dazu beitrug, den ansonsten erheblichen Verlust an biologisch aktivem Saratin zu überwinden. Das isolierte Saratin bindet fest an mehrere Kollagene und blockiert die Adhäsion von Plättchen an kollagenbeschichtete Oberflächen auf dosisabhängige Weise.
Zur Optimierung der Screening-Kaskade wurden zurzeit verfügbare Techniken entwickelt, so dass zwischen Plättchenadhäsion und Plättchenaggregation unterschieden werden konnte: die Fähigkeit von Plättchen, den Fluss durch Fasern zu verzögern oder zu stoppen, der Beitrag von Plättchen zur In-vitro-Gerinnselbildung, Glaskugel-Adhäsionslaboratorien oder Gesamtblutflüsse durch den Filter und die Plättchenadhäsion von antikoaguliertem plättchenreichem Plasma an Filter, die aus Glasfasern oder Kollagen bestehen, unter einem gesteuerten Druckgradienten.
Das (als Saratin bezeichnete) Protein ist durch die in der Sequenz (SEQ. ID. NR. 2) dargestellten Aminosäuresequenzen charakterisiert und setzt sich aus 103 Aminosäuren zusammen, die ein theoretisches relatives Molekulargewicht von etwa 12068 Dalton ± 1 kDa ausmachen. Das Protein weist eine einzigartige Primärstruktur ohne signifikante Ähnlichkeit zu anderen, zuvor beschriebenen Sequenzen auf. Das Protein ist reich an Asparagin- und Glutaminsäure, die zu dem niedrigen isoelektrischen Punkt von pH 3,7 ± 0,5 des Moleküls, wie durch IEF-PAGE gemessen, beitragen.
SDS-PAGE-Analyse zeigte eine starke Verschiebung in der Mobilität nach Reduktion des Proteins vor der Elektrophorese, was auf posttranslationale Modifikationen hinweist. Die Sequenzierung des Polypeptids zeigte sechs Cysteinmoleküle, die posttranslationale Modifikationen des Proteins darstellen könnten. Elektrospray-Massenspektrometrie von Saratin zeigte ein tatsächliches Molekulargewicht von 12061, was darauf hindeutet, dass bis zu drei Disulfidbindungen an der Bildung der Sekundärstruktur der nativen Form des Proteins beteiligt sind.
Der erfindungsgemäße Adhäsionsinhibitor ist neu, weil er sich von bekannten, aus Egeln isolierten Aggregationsinhibitoren und insbesondere von Calin oder LAPP im Hinblick auf das Molekulargewicht, den isoelektri schen Punkt und die Aminosäuresequenz und in den biologischen Aktivitäten unterscheidet.
Die vorliegende Erfindung stellt eine gut isolierte DNA bereit, die ein Polynucleotid umfasst, das den aus Egel stammenden Plättchenadhäsionsinhibitor mit der Aminosäuresequenz, wie für das Protein gezeigt, umfasst. Die Nucleotidsequenz, die dem cDNA-Klon entspricht, ist in SEQ. ID. NR. 1 gezeigt, Position 1–63 der Nucleotidsequenz stellt eine mutmaßliche 21 Aminosäuren lange Leadersequenz dar, und Position 64–372 enthält einen offenen Leserahmen, der ein Polypeptid mit 103 Aminosäureresten und einer Aminosäuresequenz, wie für das reife Protein in SEQ. ID. NR. 2 gezeigt, codiert.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch rekombinante Vektoren, die das synthetische Gen enthalten, das den erfindungsgemäßen, aus Egel stammenden Plättchenadhäsionsinhibitor codiert, und eine Wirtszelle, welche die rekombinanten Vektoren enthält. Verfahren zur Gewinnung und Isolation der exprimierten Proteine basierten auf Tag-Technologien oder wurden aus dem für das natürlich vorkommende Saratin entwickelten Reinigungsschema adaptiert. Je nach den einzelnen Protokollen, die zur extrazellulären oder intrazellulären Expression in Hefezellen, Insektenzellen, Baby-Hamster-Nierenzellen und E. coli-Zellen, die mit den geeigneten Vektoren transformiert wurden, verwendet werden, müssen die Schritte zur Gewinnung des rekombinanten Proteins aus dem Überstand oder den Sedimenten durch dem Fachmann bekannte Techniken angepasst werden. Eine ausgezeichnete Expression wurde in E. coli als Wirt gefunden, wobei durch Insertion einer pelB-Leadersequenz eine periplasmatische Expression beigesteuert wurde. Die Gewinnung der Produkte aus Escherichia coli (E. coli) (etwa 5 mg/l) wurde nach Osmolyse und Zentrifugation erhalten. Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) (> 10 mg/l Kulturbrühe) wurde mit dem alternativen, an Hefe angepassten Vektor in einem parallelen Experiment verwendet. Das sezernierte Material wurde mittels Zentrifugation isoliert. Die Reinigung wurde durch Tangential flussfiltration und Ionenaustauschchromatographie erzielt. Bei anderen Expressionsansätzen entweder unter Verwendung von COS-Zellen oder CHO-Zellen betrug die Produktexpression etwa 750 ng/ml. Das gereinigte rekombinante Material erwies sich mittels elektrophoretischer und chromatographischer Analyse als rein und homogen sowie identisch zu dem aus Speichel stammenden Saratin, wie durch Aminosäuresequenzierung und Molekülmassenbestimmung gezeigt wurde.
Die Erfindung umfasst ferner Verfahren zur Reinigung des aktiven Proteins aus rohem Speichel des Egels und Messen seiner Aktivität gegen Plättchen mithilfe statischer und dynamischer Assayverfahren sowie die Verwendung dieses Verfahrens zur Isolation von rekombinantem Protein.
Techniken zur Herstellung von Saratin umfassen die Beispiele 6, 7, 8 und 13, wobei jedoch die zu verwendenden Expressionsverfahren nicht auf diese Beispiele beschränkt sind. Zum Beispiel können transgene Mäuse oder andere Organismen, einschließlich anderer Säuger, ebenfalls für die Expression von Saratin verwendet werden.
Erfindungsgemäße Proteine umfassen Varianten, welche die Aktivität der offenbarten Sequenzen beibehalten, einschließlich Fragmenten oder Untereinheiten, natürlich vorkommender Varianten, allelischer Varianten, zufällig erzeugter künstlicher Mutanten und absichtlicher Sequenzvariationen, wie Hinzufügung, welche die Aktivität beibehalten. Fragmente oder Untereinheiten betrifft jeden Anteil der Sequenz, der weniger Aminosäuren als das vollständige Protein enthält, z.B. partielle Sequenzen, die Anteile des N- und/oder C-Terminus des vollständigen Proteins ausschließen.
Die Erfindung erstreckt sich ferner auf Hybridproteine, wie Fusionsproteine oder Proteine, die sich aus der Expression mehrerer Gene innerhalb des Expressionsvektors ergeben, und kann ein Polypeptid mit der spezifischen Aktivität eines offenbarten Proteins, das über Peptidbindungen an ein zweites Polypeptid gebunden ist, umfassen. Insbesondere sind andere Varianten der erfindungsgemäßen Proteine mit umfasst, insbesondere alle Varianten, die sich von dem isolierten Protein nur durch konservative Aminosäuresubstitution unterscheiden. Solche konservativen Aminosäuresubstitutionen sind in Taylor et al., J. Mol. Biol., 1986, 188, 233 definiert.
Ebenfalls umfasst sind Verfahren zur Verwendung der Proteine, um die Plättchenaktivierung durch Hemmung der Kollagen-Plättchen-Wechselwirkungen zu verhindern oder zu verzögern. Das Protein eignet sich zur Verhinderung, Prophylaxe, Therapie und Behandlung thrombotischer Erkrankungen. Im Gegensatz zu all diesen zuvor beschriebenen Proteinen, die an verschiedenen Oberflächenproteinen auf dem Plättchen angreifen, hat das erfindungsgemäße Protein einen einzigartigen Wirkmechanismus. Es bindet fest an die Kollagenoberfläche, und ein Wirkmechanismus ist durch die Bedeckung spezifischer Kollagenstellen gegeben, die nicht mehr für Wechselwirkungen und die Bindung von Plättchen zur Verfügung stehen. Dieser Typ des neuen Mechanismus hat den großen Vorteil, dass die Plättchen während der Applikation des Proteins funktionell intakt bleiben, so dass man aus dieser Behandlung eine sehr niedrige oder sogar gar keine Blutungsneigung erwartet.
Ein weiteres wichtiges Einsatzgebiet ist die Behandlung verschiedener Oberflächen mit dem Protein, um diese für Plättchen nicht-adhäsiv zu machen und dadurch mit Blut kompatible Vorrichtungen herzustellen.
Wie vorstehend erwähnt, eignen sich die erfindungsgemäßen Polypeptide als pharmazeutisch wirksame Verbindungen in pharmazeutischen Zusammensetzungen und Kombinationen.
Die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Formulierungen können gegebenenfalls zusätzliche Wirkstoffe, wie Aspirin, Antikoagulantien, wie Hirudin oder Heparin, oder thrombolytische Substanzen, wie Plasminogenaktivator oder Streptokinase, enthalten.
Das erfindungsgemäße neue Polypeptid kann mit jeder nicht-toxischen organischen oder anorganischen Säure pharmazeutisch unbedenkliche Salze bilden. Anorganische Säuren sind zum Beispiel Salz-, Bromwasserstoff-, Schwefel- oder Phosphorsäure und saure Metallsalze, wie Natriummonohydrogenorthophosphat und Kaliumhydrogensulfat. Beispiele für organische Säuren sind die Mono-, Di- und Tricarbonsäuren, wie Essig-, Glycol-, Milch-, Brenztrauben-, Malon-, Bernstein-, Glutar-, Fumar-, Äpfel-, Wein-, Citronen-, Ascorbin-, Malein-, Hydroxymalein-, Benzoe-, Hydroxybenzoe-, Phenylessig-, Zimt-, Salicyl-, und Sulfonsäuren, wie Methansulfonsäure. Salze der carboxyterminalen Aminosäureeinheit umfassen die nicht-toxischen Carbonsäuresalze, die mit allen geeigneten anorganischen oder organischen Basen gebildet werden. Zu diesen Salzen gehören beispielsweise Alkalimetalle, wie Natrium und Kalium, Erdalkalimetalle, wie Calcium und Magnesium, Leichtmetalle der Gruppe IIIA, einschließlich Aluminium, und organische primäre, sekundäre und tertiäre Amine, wie Trialkylamine, einschließlich Triethylamin, Procain, Dibenzylamin, 1-Ethenamin, N,N'-Dibenzylethylendiamin, Dihydroabietylamin und N-Alkylpiperidin.
Wie hier verwendet, bedeutet der Ausdruck "pharmazeutisch unbedenklicher Träger" ein(en) inerte(s/n), nicht-toxische(s/n) feste(s/n) oder flüssige(s/n) Füllstoff, Verdünnungsmittel oder Einkapselungsmaterial, der/das mit dem Wirkstoff oder mit dem Patienten nicht nachteilig reagiert. Geeignete, vorzugsweise flüssige Träger sind im Stand der Technik bekannt, wie steriles Wasser, Kochsalzlösung, wässrige Dextrose, Zuckerlösungen, Ethanol, Glycole und Öle, einschließlich solche mit Erdöl-, tierischem, pflanzlichem oder synthetischem Ursprung, zum Beispiel Erdnussöl, Sojabohnenöl und Mineralöl.
Die erfindungsgemäßen Formulierungen können als Einheitsdosen verabreicht werden, die herkömmliche nicht-toxische pharmazeutisch unbedenkliche Träger, Verdünnungsmittel, Hilfsstoffe und Vehikel enthalten, die für die parenterale Verabreichung üblich sind.
Der Begriff "parenteral" umfasst hier subkutane, intravenöse, intraartikuläre und intratracheale Injektions- und Infusionstechniken. Auch andere Verabreichungen, wie orale Verabreichung und topische Applikation, sind geeignet. Parenterale Zusammensetzungen und Kombinationen werden am stärksten bevorzugt intravenös, entweder in einer Bolusform oder als konstante Fusion, gemäß bekannter Verfahren verabreicht.
Tabletten und Kapseln für die orale Verabreichung enthalten herkömmliche Excipienten, wie Bindemittel, Füllstoffe, Verdünnungsmittel, Tablettierhilfsmittel, Gleitmittel, Auflösemittel und Benetzungsmittel. Die Tabletten können gemäß Verfahren überzogen werden, die im Stand der Technik bekannt sind.
Orale flüssige Zubereitungen können die Form wässriger oder öliger Suspensionen, Lösungen, Emulsionen, Sirupe oder Elixiere haben oder als trockenes Produkt zum Auflösen mit Wasser oder einem anderen geeigneten Vehikel vor Gebrauch dargereicht werden. Solche flüssigen Zubereitungen können herkömmliche Zusatzstoffe, wie Suspendierungsmittel, Emulgatoren, nicht-wässrige Vehikel und Konservierungsmittel, enthalten.
Topische Applikationen können in Form wässriger oder öliger Suspensionen, Lösungen, Emulsionen, Gelees oder vorzugsweise Emulsionssalben erfolgen.
Erfindungsgemäße Einheitsdosen können täglich benötigte Mengen des erfindungsgemäßen Proteins oder mehrfache Unterteilungen davon enthalten, die die gewünschte Dosis ausmachen. Die optimale therapeutisch unbedenkliche Dosierung und Dosisrate für einen gegebenen Patienten (Säuger, einschließlich Menschen) hängen von einer Mehrzahl von Faktoren ab, wie der Aktivität des spezifischen eingesetzten Wirkstoffs, dem Alter, Körpergewicht, allgemeinen Gesundheitszustand, der Ernährung, der Zeit und dem Verabreichungsweg, der Clearancerate, dem Behandlungs objekt, d.h. Therapie oder Prophylaxe, und der Art der zu behandelnden thrombotischen Erkrankung, Anti-Plättchen- oder Antikoagulans-Aktivität.
Daher beträgt in Zusammensetzungen und Kombinationen, die sich bei einem behandelten Patienten (in vivo) als Antithrombotikum eignen, eine pharmazeutisch wirksame tägliche Dosis der erfindungsgemäßen Peptide zwischen etwa 0,01 und 100 mg/kg Körpergewicht, vorzugsweise zwischen 0,1 und 10 mg/kg Körpergewicht. Je nach der Applikationsform kann eine Einzeldosis zwischen 0,5 und 10 mg des Thrombininhibitors enthalten. Zur Erzielung einer Antikoagulanswirkung in extrakorporalem Blut beträgt eine pharmazeutisch wirksame Menge der erfindungsgemäßen Peptide zwischen 0,2 und 150 mg/l, vorzugsweise zwischen 1 mg und 20 mg/l extrakorporales Blut.
Gegenstand dieser Erfindung ist auch die Bereitstellung einer implantierbaren oder extrakorporalen medizinischen Vorrichtung für die Verwendung in Kontakt mit Körperflüssigkeiten, so dass die Oberfläche der Vorrichtung im Wesentlichen thromboresistent gemacht wird, die mit einem immobilisierten Polypeptid, wie vorstehend und in den Ansprüchen definiert, beschichtet ist. Das erfindungsgemäße Polypeptid wird auf einer medizinischen Vorrichtung immobilisiert, um die Oberfläche biokompatibel und thromboresistent zu machen. Solche Vorrichtungen haben manchmal Oberflächeneigenschaften, die gewöhnlich die Plättchenaggregation induzieren, was für ihre beabsichtigten Verwendungen in implantierbaren und extrakorporalen Vorrichtungen in Kontakt mit Blut oder anderen Körperflüssigkeiten ein Nachteil ist. Beispiele für derartige Vorrichtungen, die allgemein aus Kunststoffmaterialien und synthetischen Fasern hergestellt werden, sind Prothesen, künstliche Organe, Augenlinsen, Nähfäden, künstliche Gefäßabschnitte, Katheter, Dialysatoren, Schläuche und Blut enthaltende Gefäße.
Eine Trübung der posterioren Kapsel (posterior capsule opacification, PCO) ist trotz moderner Operationstechniken und Linsen, die für dieses Verfahren eingesetzt werden, eine häufige Komplikation nach einer Kataraktextraktion. Eine PCO wird durch Proliferation und Wanderung von Linsenepithelzellen über die posteriore Kapsel hervorgerufen, so dass die Sehschärfe verringert wird. Physikalische Behandlungen sowie chemisch modifizierte Linsen wurde zur Verringerung der Bildung von PCO vorgeschlagen. Eine Beschichtung der Linse mit Heparin oder topische Heparin-Augentropfen werden zur Verringerung von PCO eingesetzt, was zeigt, dass thrombogene Mechanismen an der Bildung von PCO beteiligt sind.
Von Saratin wurde gezeigt, dass es gegenüber Heparin signifikante Vorteile hinsichtlich der Verhinderung und Blockierung von Thrombogenität besitzt. Daher ist ein weiteres Merkmal dieser Erfindung die Bereitstellung einer Saratin umfassenden Beschichtung, welche die Thrombogenität des Linsenmaterials verringert, das für brechende Augenimplantate in die anteriore oder posteriore Kammer verwendet wird, die chirurgisch in das Auge implantiert werden können. Diese neue Art der Beschichtung vermeidet Probleme, die durch stimuliertes Zellwachstum beigetragen werden. In Kombination mit anderen Medikamenten, die beispielsweise Zelltot hervorrufen, trägt eine Saratin-Beschichtung dazu bei, eine Trübung der posterioren Kapsel vollständig zu beseitigen.
Kurze Beschreibung der Figuren
Einzelheiten der Figuren sind in den Beispielen 1 bis 10 erläutert.
1 Trennung von Speichelkomponenten. Die Elution von Saratin ist durch * markiert.

a) zeigt das Trennprofil von Speichel nach DEAE-Anionenaustausch. Saratin-Fraktionen wurden aus Maximum 3 gesammelt (Beispiel 2).
b) zeigt eine Rechromatographie vereinigter Fraktionen auf Mono Q HR5/5. Proben wurden aus dem letzten Teil des Hauptmaximums gesammelt, wie durch die Säule angegeben (Beispiel 2).
c) zeigt den letzten Chromatographieschritt auf semipräparativer analytischer RP-HPLC von Saratin-positiven Fraktionen, die von der Mono Q HR5/5 gesammelt wurden (Beispiel 2). Aktives Saratin wurde aus dem Hauptmaximum (Maximum 3) gewonnen.

2 SDS-PAGE der aus der RP-HPLC gesammelten Fraktionen. Saratin-positive Fraktionen sind mit * markiert (Beispiele 2 und 3).
3 E. coli-Expressionsvektor für Saratin (Beispiel 7).
4 Baculo-Donorplasmid für Saratin (Beispiel 8)
5 Gesamtblut wurde einer künstlichen Kollagenoberfläche ausgesetzt, und die Plättchenadhäsion wurde mittels Färbung dargestellt. Saratin wurde als Inhibitor (Protein #607) verwendet. Beispiel 9
6 Hemmung der Plättchenadhäsion auf mit Kollagen Typ III beschichteten Deckgläsern unter Scherbedingungen. Vergleich von Speichel und Saratin. Beispiel 9
7 Saratin zeigt eine dosisabhängige Hemmung der Plättchenbindungsadhäsion an mit Kollagen Typ III beschichtete Deckgläser unter Scherbedingungen. Beispiel 9
8 Hefe-Expressionsvektor für Saratin (Beispiel 13)
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Beispiel 1
Screening nach Adhäsionsinhibitoren
Die Plättchenadhäsion an Kollagen war der funktionelle Hintergrund für das Screening von Speichelkomponenten. Zusätzlich wurden vier weitere Tests, die zur Untersuchung verschiedener Wirkungen anti-thrombotischer Arzneistoffe verfügbar sind, wie der AZOCOLL-Assay, der Assay der Amidaseaktivität, der vWillebrand-abhängige Bindungsassay und der Plättchenaggregationsassay, dazu verwendet, funktionelle Eigenschaften auszuschließen, die idealerweise nicht mit einem Adhäsionsinhibitor in Verbindung stehen. Während es sich bei den meisten dieser hier verwendeten Assays um Standardassays handelt, musste der Plättchenadhäsionsassay modifiziert werden, damit er unseren speziellen Bedürfnissen entsprach. Kurz gesagt: Horm-Kollagen (Nycomed) wurde auf Platten mit 96 Vertiefungen (Nunc) unter Verwendung von angesäuertem Kollagen in einer Konzentration von 20 μg/ml und Inkubation der Platten über Nacht geschichtet. Nach 3-maligem Waschen der Platten mit PBS wurde die restliche Oberfläche der Vertiefungen mit 1% BSA blockiert. Plättchen, die frisch aus menschlichem citronyliertem Blut isoliert wurden, wurden gleichzeitig mit Fraktionen, die aus den einzelnen Säulenschritten stammten, zugegeben. Wenn erforderlich, wurden eine Präaktivierung der Plättchen durch Inkubation der Plättchen in TBS in Gegenwart zweiwertiger Magnesiumoxidionen vor der Verwendung durchgeführt. Roher Speichel, der auf eine Gesamt-Proteinkonzentration von 200 μg/ml standardisiert wurde, wurde als Standard für den Vergleich der Inhibitoraktivität verwendet. Es zeigte sich, dass der Plättcheninhibitionsassay sehr anfällig gegenüber Pufferveränderungen und erhöhten Salzkonzentrationen war. Weil alle Proben mittels Ionenaustauschchromatographie verarbeitet worden waren, erwies sich ein direkter Test der Fraktionen im Inhibitionsassay als kompliziert und unzuverlässig. Deshalb wurden alle zu testenden Proben vor der Messung einem Konzentrationsschritt auf Centricon-Basis zugeführt, der gleichzeitig die Ionenstärke verringerte und die Konzentration unterstützt.
Beispiel 2
Reinigung des natürlichen Inhibitors
Die Erfindung verwendete von H. medicinalis gesammelten Speichel, von dem bekannt ist, dass er eine Reihe biologisch aktiver Proteine, wie Hirudin, Elastase-Inhibitoren, Kollagenasen und Plättchenaggregationsinhibitoren, wie Calin (Munro, R. et al.; Blood Coagulation und Fibrinolysis, 1991, 2, 179–184) und LAPP (Schaffer, L. W. et al.; Arterioscler. Thromb., 1993, 13, 1593–1601), enthält. Neben diesen charakterisierten Proteinen ist der Großteil der etwa achtzig mittels SDS-PAGE nachweisbaren Proteine noch unbekannt. Bei der vorliegenden Erfindung wurden der fraktionierte Speichel und die Screening-Strategie, wie im Beispiel 1 beschrieben, für ein Screening nach den neuen Proteinen, die direkt die Plättchen-Kollagen-Wechselwirkung stören, verwendet.
Die Abtrennung einer Adhäsionsinhibitor-Aktivität aus rohem Speichel erwies sich als schwierige Aufgabe, hauptsächlich aufgrund des irreversiblen Verlusts des größten Teils der adhäsionshemmenden Aktivität im ersten Chromatographieschritt. Zusatzstoffe, wie 12% Ethanol und zweiwertige Kationen, wie von Munro, R. et al. empfohlen, verbesserten die Situation nicht. Die hohe Salzkonzentration im Speichel in Kombination mit der niedrigen Gesamt-Proteinkonzentration (190–250 μg/ml) erforderten jedoch einen anfänglichen Konzentrations- oder Pufferaustauschschritt. Somit wurden verschiedene Strategien für die Anreicherung, Konzentration oder den Pufferaustausch untersucht. Herkömmliche Dialyse führte zu einem vollständigen Verlust der Aktivität. Die meisten der übrigen Standardtechniken, wie Ionenaustauscher, Affinitätssäulen, Größenausschluss (Verlust erfolgte ungeachtet des Säulenharzes), versagten unabhängig von der Art der verwendeten Trenntechnologie oder des verwendeten Puffers und der verwendeten Additive. Überraschenderweise zeigte sich, dass Druckdialyse von 500 ml Speichel ein erfolgreiches Verfahren zum Konzentrieren der Speichelproteine (etwa 30–40 Mal) und gleichzeitig zum Beseitigen der ungewünschten Pufferkomponenten war. Unerwarteterweise war das auf diese Weise verarbeitete Speichelrohmaterial ein ideales Ausgangsmaterial für die weitere Reinigung, und die Gewinnung anti-adhäsiver Komponenten mit biologischer Aktivität aus dem Speichel war kein wirkliches Problem mehr. Weil sich Kationenaustauscher- oder Affinitätssäulen als unzureichender Schritt bei der Reinigung erwiesen, wurde ein schwacher Anionenaustauscher, wie DEAE-Fastflow oder EMD-DEAE-Fractogel, verwendet. Es wurden 12% Ethanol und zweiwertige Kationen getestet, die Ergebnisse waren jedoch mit oder ohne diese Zusatzstoffe ähnlich. Eine weitere Optimierung der Chromatographieschritte führte zu einer Abfolge aus DEAE-Säule, Mono-Q-Säule und einer Umkehrphasen-RP18-Säule als abschließenden Schritt. Die Optimierung der Chromatographie-bedingungen wurde an einem BiaCore-Chromatographie-system unter Verwendung von analytischen Säulen, die von Pharmacia erhältlich sind, durchgeführt. Die für den Betrieb der DEAE-Säule, der Mono-Q-Säule und der RP18-Säulen verwendeten Gradienten sind in den 1a, b, c angegeben. Die auf BiaCore basierende Trennung wurde unter Verwendung von FPLC-Techniken an einen größeren Maßstab angepasst. Die optimierten Laufbedingungen wurden nach der Anleitung des Herstellers direkt in einen semi-präparativen Trennmaßstab umgewandelt, mit Ausnahme des RP18-Säulenschritts, der mit der Biacore-Technik beibehalten wurde, um den Verlust an gereinigtem Material zu minimieren. Die Gewinnung von gereinigtem Protein aus dem letzten chromatographischen RP-Schritt erfolgte mittels Geschwindigkeitsvakuumzentrifugation. Aus dem letzten RP-Schritt gesammelte Proben wurden gesammelt und mittels SDS-PAGE analysiert (2). Anschließend wurden Proben in PBS resuspendiert und für die Durchführung analytischer sowie funktioneller Tests verwendet. Üblicherweise wurde eine Ausbeute von etwa 750 μg/l Saratin aus unverarbeitetem Speichel gewonnen.
Beispiel 3
Biochemische Charakterisierung
Die Reinigung von Saratin, wie im Beispiel 1 offenbart, führte zu einem im Wesentlichen reinen Protein mit einem apparenten Molekulargewicht von etwa 21 kDa, das unter reduzierenden Bedingungen mittels SDS-PAGE nachgewiesen wurde (2). Die vollständige Aminosäuresequenz wurde durch direktes Sequenzieren der ersten 48 Aminosäuren des gereinigten Proteins erhalten und durch Sequenzierung mehrerer interner Peptide, die durch enzymatischen Abbau erzeugt wurden, vervollständigt. Die vollständige Proteinsequenz ist in SEQ. ID. NR. 2 offenbart.
Das Protein besteht aus 103 Aminosäuren mit einem berechneten Molekulargewicht von 12067,9 und einem tatsächlichen Molekulargewicht von 12061,9, wie mittels ESI-Massenspektrometrie abgeleitet wurde. Diese Unterschiede im theoretischen und im gemessenen Molekulargewicht zeigen, dass alle sechs in Saratin identifizierten Cysteine an der Bildung von S-S-Brücken beteiligt sind. Dieser Befund wird durch die Beobachtung einer starken Veränderung in der Mobilität des Proteins bei der Chromatographie mittels SDS-PAGE unter reduzierenden oder nichtreduzierenden Bedingungen unterstützt. Ferner ist das Protein reich an sauren Säuren, wie Glu und Asp. Die isoelektrische Fokussierung unter Verwendung der IEF-PAGE- (Immobilin-) Technik ergab einen isoelektrischen Punkt von pH 3,7 ± 0,5. Bei einer Vergleichsstudie haben wir das gereinigte Egelprotein als Bezug verwendet und es mit den physikalisch-chemischen Eigenschaften von rekombinantem Saratin, das aus der Baculo-, Hefe- und E. coli-Expression stammte, verglichen. Alle drei Proteine erwiesen sich als identisch in ihren Eigenschaften.
Die Charakterisierung des Proteins mittels SDS-PAGE, wobei es durch Coomassie- (2) oder Silber-Färbung und/oder Westernblot-Analyse sichtbar gemacht wurde, zeigte, dass das Protein homogen war und in einer nicht-glycosylierten Form vorlag.
Beispiel 4
mRNA-Präparation und cDNA-Synthese
RNA wurde aus dem Blutegel, Hirudo medicinalis; unter Verwendung des Guanidiniumthiocyanat-Verfahrens präpariert. Die mRNA wurde aus der Gesamt-RNA unter Verwendung des "Oligotex-mRNA-Kits" (QIAGEN) gereinigt.
Unter Verwendung des "Marathon-cDNA-Amplifikationskits" (CLONTECH) wurde cDNA synthetisiert. Die Saratin codierende DNA-Sequenz wurde zu Beginn unter Verwendung von PCR-Oligonucletidprimern gemäß der Anleitung des Zulieferers amplifiziert. Nach der cDNA-Synthese wurde ein universeller Adaptor an beide Enden der cDNA ligiert. Die Sequenzen des universellen Adaptors und der universellen Primer AP1 oder AP2 wurden gemäß den Anleitungen des Zulieferers des Kits ausgewählt.
Beispiel 5
Amplifikation und Isolation des Saratin-Gens mittels PCR
Degenerierte Primer wurden auf der Basis des unmittelbaren N-Terminus der revers translatierten Saratin-Aminosäuresequenz synthetisiert.
Diese primer01 und primer02 wurden derart gestaltet, dass sie spezifisch an das 5'-Ende der Saratin-cDNA hybridisierten. Die Primergestaltung basierte auf der revers translatierten Aminosäuresequenz der experimentell bestimmten acht N-terminalen Aminosäuren des gereinigten Saratin-Proteins. Die zwei Primer primer01 und primer02 wurden derart synthetisiert, dass die Degeneriertheit so klein wie möglich gehalten wurde und die Primer am kritischen 3'-Ende eine Abfolge von 8 Basenpaaren mit perfekter Übereinstimmung zu der Saratin-cDNA-Sequenz erhielten, so dass eine effiziente und spezifische Amplifikation der Matrizen-cDNA sichergestellt wurde. Gemäß dem DNA-Degenerationsalphabet (IUPAC-Code) gilt: R = A oder G; M = A oder C; Y = C oder T und N = A oder G oder C oder T.
Eine 3'-RACE-PCR-Reaktion wurde unter Verwendung eines Gemischs von primer01 und primer02 und einem universellen Primer AP1 oder AP2 durchgeführt. Die PCR-Produkte wurden in den TA-Klonierungsvektor pCR2.1 oder pCR-Script-SK(+)-Vektor kloniert und sequenziert. Nach der Sequenzierung mehrerer der erhaltenen 3'-RACE-PCR-Fragmente wurde die Saratin-Gensequenz erhalten, mit Ausnahme der 5'-untranslatierten Region, der Signalpeptidsequenz und der Sequenz, die die ersten 8 Aminosäuren des N-Terminus des reifen Proteins codiert. Um die fehlende Saratin-cDNA-Sequenzinformation zu erhalten, wurde ein 5'-RACE-Experiment unter Verwendung eines genspezifischen Primers aus der Mitte der Saratin-cDNA und eines der universellen Primer AP1 oder AP2 durchgeführt. Nach der Sequenzierung mehrerer der erhaltenen 5'-RACE-PCR-Fragmente wurde die vollständige Saratin-Gensequenz erhalten. Durch Amplifikation des Saratin-Gens mittels PCR unter Verwendung genspezifischer, nicht-degenerierter Primer sowohl vom 3'-Ende als auch vom 5'-Ende des Saratin-Gens wurde ein Volllängen-Saratin-Gen erhalten. Die DNA-Sequenzierung erfolgte mit mehr als 15 verschiedenen PCR-Klonen. Es wurde jedoch nur eine signifikante Veränderung, die eine Aminosäuresequenzänderung bewirkte, in nur einem Klon gefunden. Es ist sehr wahrscheinlich, dass diese Veränderung durch die PCR hervorgerufen wurde. Weitere fünf stille Austausche, die keine Aminosäuresequenzveränderung bewirken, wurden gefunden. Es ist somit unwahrscheinlich, dass diese Veränderungen durch die PCR hervorgerufen wurden, weil die gleichen Veränderungen in verschiedenen Klonen gefunden wurden.
Der ORF des Saratin-Gens weist 372 bp auf und enthält eine 21 Aminosäuren lange Signalsequenz sowie eine 103 Aminosäuren lange Sequenz, die das reife Protein codiert. Es wurde gefunden, dass die von dem PCR-Klon abgeleitete Aminosäuresequenz identisch zu der Sequenz ist, die durch Sequenzieren des natürlichen, aus Speichel stammenden Proteins erhalten wurde.
Beispiel 6
Expression in COS-Zellen und Nachweis von exprimiertem Protein
Um das Saratin-Gen in Säugerzellen, wie COS oder CHO, zu exprimieren, wurde das Saratin-Gen aus dem Vektor pCR-Script-SK(+) unter Verwendung von XhoI + XbaI ausgeschnitten und in den Säugerzellexpressionsvektor pCI-neo (Promega) kloniert. pCI-neo wurde ausgewählt, weil es den T7- und den T3-Promoter für die In-vitro-Expression und das Neomycinresistenzgen für die G418-Selektion enthält und sowohl in COS- als auch in CHO-Zellen verwendet werden kann.
Zusätzlich zu der Signalsequenz und der reifen Proteinsequenz enthält die Insertion für eine effiziente Translation eine Koz.-Sequenz am 5'-Ende und für den Nachweis der Proteinexpression, -reinigung und -konzentration das His-Tag MRGS(H)₆ am 3'-Ende (C-Terminus). Das Plasmidkonstrukt wurde als pNC-31 bezeichnet.
pNC-31-Plasmid-DNA wurde zur Transfektion von COS-Zellen verwendet. Die in der log-Phase wachsenden COS-Zellen wurden zweimal mit PBS gewaschen und in einer Konzentration von 1 × 10⁷/ml in PBS gelöst. Dann wurden 12 μg Plasmid-DNA (weniger als 50 μl in H₂O oder TE-Puffer) zu 0,7–0,8 ml COS-Zellsuspension gegeben und in einem Elektroporationsgefäß gemischt. Die Elektroporation wurde bei 1,9 kV, 25 μFD für 10 min durchgeführt und auf eine 90-mm-Platte überführt. Nach der Zugabe von 8 ml DMEM-Medium, das 10% FCS und Antibiotika enthielt, wurden die Zellen drei Tage lang gezüchtet. Die Überstände und die Zellen wurden für die weitere Proteinisolation und den Nachweis verwendet. Das exprimierte Protein wurde durch das Westernblot-Verfahren unter Verwendung eines Anti-MRGS(H)₆-Antikörpers nachgewiesen. Die Reinigung erfolgte unter Verwendung von Chelatoren, wie NTA oder Imidoessigsäure, die an einer Säulenmatrix immobilisiert und mit Metallionen, wie Co, Ni, oder Cu, modifiziert waren.
Beispiel 7
Konstruktion des E. coli-Expressionsvektors und Expression
Aufgrund der variablen Codonverwendung in verschiedenen biologischen Systemen werden einige Codons in E. coli sehr selten verwendet. Um die Expression einer optimierten Version in E. coli zu ermöglichen, musste das Gen gemäß Standardverfahren hinsichtlich der E. coli-Codonverwendung umgewandelt werden.
Die Expression in E. coli wurde unter Verwendung einer modifizierten Version des Plasmids pASK75, das die tet-Promoterregion trägt, durchgeführt. (Skerra, A., et al. Gene, 1994, 151, 131–135). Kurz gesagt: Die Modifikation erfolgte durch Klonierung eines neuen Linkers zwischen die XbaI- und die HindIII-Stelle (3). Der neue Linker enthält die ompA-Leadersequenz, eine andere multiple Klonierungsstelle und ein 6XHis-Tag an Stelle des Strep-Tags.
Für die Konstruktion des Expressionsvektors für Saratin war es notwendig, 5'-ClaI- und 3'-Eco47III-Restriktionsstellen durch das PCR-Verfahren einzuführen.
Dafür wurden der 5'-primer03 und der 3'-primer04 verwendet. Das PCR-Produkt wurde zunächst in das PCR-II-Vektorsystem (Invitrogen) kloniert und sequenziert.
In einem zweiten Schritt wurde das Saratin-Gen unter Verwendung der Restriktionsstellen 5'-ClaI und 3'-HindIII in den modifizierten pASK75-Vektor kloniert.
Nach Expression und Nachweis der Aktivität dieses rekombinanten Saratins in einer zweiten PCR-Reaktion wurde das His-Tag entfernt, und das Startcodon des Saratin-Gens wurde direkt mit der ompA-Leadersequenz fusioniert. Der 5'-primer05 und der 3'-primer06 für diese PCR-Reaktion sind im Sequenzprotokoll angegeben.
Als Beispiel für die Expression in E. coli wurde der Expressionsvektor pRG72 (3), der das Saratin-Strukturgen, fusioniert an die ompA-Leadersequenz, enthält, in kompetente W3110-Zellen transformiert. Die Zellen wurden induziert, nachdem sie bis zur mittleren log-Phase gewachsen waren. Das rekombinante Saratin konnte 1 Stunde danach eindeutig nachgewiesen werden.
Beispiel 8
Konstruktion des Baculo-Donorplasmids und Expression
Für die Expression von Saratin im Baculovirus-Expressionssystem wurde das Bac-To-Bac^TM-Baculovirus-Expressionssystem von Gibco Life Technologies verwendet. Um ein Selektionssystem zu erhalten, wurde die Leadersequenz des Melitins der Honigbiene an das Saratin-Gen fusioniert, und um die Restriktionsstellen 5'-BamHI und 3'-KpnI einzufügen, wurde eine einzelne PCR-Reaktion unter Verwendung von 5'-primer07 und 3'-primer08 durchgeführt.
Das entsprechende PCR-Produkt wurde in den PCR-II-Vektor (Invitrogen) kloniert und sequenziert. Dann wurde die Melitin-Saratin-Fusion unter Verwendung von 5'-BamHI und 3'-KpnI in den pFastBac-Vektor kloniert, was zu pTD13 führte (4). Die Herstellung rekombinanter Baculoviren und die Saratin-Expression wurde mit dem Bac-To-Bac-Expressionssystem durchgeführt. Das Donorplasmid pTD13 wurde in kompetente DH10Bac-Zellen transformiert, die das Bacmid mit einer mini-attTn7-Zielstelle und das Helferplasmid enthalten. Das mini-Tn7-Element auf dem Donorplasmid kann in Gegenwart von Transpositionsproteinen, die auf dem Helferplasmid bereitgestellt werden, an die mini-attTn7-Zielstelle auf dem Bacmid transponieren. Kolonien, die rekombinante Bacmide enthielten, wurden durch Zerstörung des lacZ-Gens identifiziert. Minipräparations-DNA mit hohem Molekulargewicht wird aus ausgewählten E. coli-Klonen, die das rekombinante Bacmid enthalten, präpariert, und diese DNA wurde dann zur Transfektion von Insektenzellen verwendet. Eingehende Beschreibungen sind im Anleitungsblatt des Expressionskits enthalten.
Beispiel 9
Plättchenadhäsion an Kollagen unter Flussbedingungen
(dynamischer Assay)
Im Plättchenadhäsionsassay wird menschliches Gesamtblut durch eine parallele Flusskammer perfundiert, um die Adhäsionsaktivität von Plättchen an mit Kollagen beschichtete Deckgläser unter Hochscherfluss (wobei arterielle In-vivo-Bedingungen simuliert werden) zu untersuchen, wie ursprünglich von Sakariassen et al. (Meth. Enz., 1988, 169, 37–70) beschrieben. Menschliches Plazentakollagen, Typ III (Sigma), das in 50 mmol/l Essigsäure solubilisiert war, wurde auf gereinigte Glasdeck gläser (18 mm × 18 mm) mit einer Retuschierungs-Airbrush aufgesprüht. Die Deckgläser wurden bei 4°C über Nacht in PBS aufbewahrt.
Frisches menschliches Gesamtblut (das mit 20 U/ml niedermolekularem Heparin antikoaguliert war) wurde vor der Verwendung für 10 min bei 37°C vorgewärmt. Zubereitungen von erfindungsgemäßen Proteinen wurden auf die Deckgläser pipettiert (30 μl pro Deckglas) und für 10 min bei Raumtemperatur in einer Feuchtkammer inkubiert, bevor sie in die Perfusionskammer eingebracht wurden. Man ließ das Blut (für 5 min bei 37°C bei einer Scherrate von 1300 s^–1) durch die Kammer perfundieren.
Anschließend wurden die Deckgläser entnommen, in PBS gewaschen und für 30 min in 0,25% Glutaraldehyd fixiert und danach mit May-Grünwald-Giemsa gefärbt. 9 zeigt ein typisches Beispiel. Eine ausgiebige Bedeckung mit gefärbten Plättchen ist bei der unbehandelten Kontrolloberfläche zu erkennen. Eine vergleichbare, mit Saratin vorbehandelte Oberfläche zeigt eine drastisch verringerte (um 80%) Plättchenbindung. Die Plättchenadhäsion wurde, wie in 5 gezeigt, mit einem Lichtmikroskop (Vergrößerung × 1000) quantifiziert, das mit einem computerisierten Bildanalysator (Leica) verbunden war. Die Ergebnisse wurden als der Prozentsatz der Oberfläche, der mit Plättchen und Plättchenaggregaten bedeckt war, ausgedrückt.
Ein Vergleich der inhibitorischen Speichelaktivität mit dem gereinigten Protein wurde durchgeführt, wie in 6 gezeigt. Die Plättchenadhäsion auf Deckgläsern, die mit Kollagen Typ III beschichtet waren, bei einer Scherrate von 1300 s^–1 mit rohem Speichel (#616) erzeugte eine Hemmung von etwa 48% im Vergleich zur Kontrolle. Gereinigtes Protein (#607; Saratin) zeigte eine Verringerung der Plättchenablagerung von etwa 81% bei standardisierten Proteinkonzentrationen. Die durch Saratin induzierte Hemmung steigt auf dosisabhängige Weise mit höheren Konzentrationen an gereinigtem Protein, wie in 7 dargestellt.
Beispiel 10
Immunisierung und Antikörper
Sobald die erste Charge von hochgereinigtem natürlichem Protein zur Verfügung stand, wurde unmittelbar mit der Immunisierung von Tieren begonnen. Immunseren wurden in Kaninchen erzeugt, und Reagenzien mit hohem Titer waren für das weitere Screening verfügbar. Zusätzliche Antiseren waren verfügbar, als die Peptidsequenz des vollständigen Proteins zur Verfügung stand, und drei synthetische Peptide wurden synthetisiert (Aminosäuresequenz 83–103, 13–30, 58–69), die mit einem Standard-Linkerverfahren an KLH gekoppelt und für die Immunisierung verwendet wurden. Drei gegen ein N-terminales Peptidesegment gerichtete Seren und zwei für C-terminate Peptide spezifische Seren wurden etabliert. Als die Immunseren mit hohem Titer zur Verfügung standen, war es möglich, Elisa-Technologie zur Überwachung und Quantifizierung der Reinigung von natürlich gereinigtem sowie rekombinantem Protein zu verwenden. Somit konnte der zeitraubende und sehr arbeitsintensive Plättcheninhibitionsassay ersetzt werden und wurde nur zur Bestätigung des inhibitorischen Potenzials des endgültig gereinigten Proteins verwendet.
Beispiel 11
Immunassays zur Untersuchung der Saratin-Bindung
Angesäuertes Horm-Kollagen (Nycomed) wurde zur Beschichtung von Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen (Nunc) verwendet, wobei 50 μl der Kollagenlösung (20 μg/ml) wurde zur Beschichtung der Platten über Nacht verwendet wurden. Vor dem Test wurden die Platten drei Mal mit PBS gewaschen und mit einer BSA-Lösung (1%) inkubiert, um unspezifische Adhäsion zu verhindern. Es wurden 50 μl Saratin in einer Verdünnungsreihe zugegeben, und sie wurden für eine Stunde inkubiert. Die Platten wurden vor der Applikation eines Anti-Saratin-Antikörpers für den Nachweis drei Mal gewaschen. Nach einem weiteren einstündigen Inkubationsschritt wurde überschüssiger Antikörper entfernt, und ein zweiter, mit Biotin markierter Antikörper wurde für den Nachweis eingesetzt. Die Ablesung erfolgte über eine Streptavidin-POD-katalysierte Farbreaktion mit Substraten, wie ODB-Tabletten (Dako), die bei 490 nm gemessen wurde.
Beispiel 12
Kompetitionsassay für das Screening nach Inhibitoren
Rekombinantes, mit einem Tag (His-Tag) versehenes Saratin, das wie im Beispiel 7 beschrieben hergestellt wurde, wurde mit nativem Saratin ohne Tag im Hinblick auf die Kollagen-Bindung verglichen. Mit angesäuertem Horm-Kollagen (Nycomed) beschichtete Platten wurden wie im Beispiel 11 beschrieben hergestellt. Der Nachweis wurde mittels Kaninchen-Anti-Saratin-Antikörpern durchgeführt. Die Saratine mit und ohne Tag zeigten identische Bindungseigenschaften. Alternativ wurde die nicht mit einem Tag versehene Saratin-Version mittels Biotinylierung (Pierce, Biotinylierungskit) modifiziert und mit unverändertem Saratin verglichen. Die Bindungseigenschaften an Kollagen waren identisch. Ferner wurden Experimente durchgeführt, wobei das biotinylierte Saratin dazu verwendet wurde, mit unmodifiziertem Saratin, Peptiden, aus Speichel stammendem Saratin, vollständigem Speichel oder gegen Saratin gerichteten Antikörpern kreuzzukonkurrieren. Die Bindung der verschiedenen "Konkurrenten" an Kollagen wurde getestet, indem die Bindung von biotinyliertem Saratin unter Verwendung eines Streptavidin-POD-Konjugats und der ODB-Substratreaktion für den Nachweis bestimmt wurde. Dieser Assay, der biotinyliertes Saratin umfasste, wurde üblicherweise für die Bestimmung der Saratin-Konzentration in Speichel (750 μg/l), die Epitopkartierung von gegen Saratin gerichteten Antikörpern, die Untersuchung von biologisch aktivem Saratin, mutiertem Saratin verwendet. Um das Potenzial des Assays zu untersuchen, wurden blockierende sowie nicht-blockierende Anti-Saratin-Antikörper, die mit spezifischen Saratin-Peptiden erzeugt worden waren, verwendet.
Beispiel 13
Hefe-Expressionsvektor und Expression
Das Pichia-Multikopien-Expressionssystem (Invitrogen) wurde als typisches Beispiel für die Hefe-Expression verwendet. Die Konstruktion des Hefe-Expressionsvektors ist in 8 dargestellt. Zur Herstellung des Expressionsvektors für Saratin wurde das PCR-Amplifikationsverfahren dazu verwendet, Restriktionsenden (5'-EcoRI, 3'-NotI), die mit der Ligation in den geeigneten Vektor (pPIC9K) kompatibel waren, herzustellen. Die folgenden 5'-primer09 und 3'-primer10 wurden eingesetzt.
Vor der Transformation der Pichia-Sphäroplasten wurde der Expressionsvektor mit Sal I linearisiert. Ein Screening der Kolonien nach His⁺Mut⁺-positiven Mutanten wurde durchgeführt, um die Integration des Saratin-Gens sicherzustellen. Übliche Wachstumsbedingungen waren: 28–30°C bis zu einer optischen Dichte von OD 2–6. Die Induktion der Expression erfolgte nach dem Resuspendieren zentrifugierter Zellen in Medium und der Zugabe von Methanol bis auf eine Endkonzentration von 0,5% und Beibehalten dieses Zustandes für einen längeren Zeitraum, der üblicherweise 24 Stunden beträgt. Nach einem typischen Fermentationszeitraum von 6 Tagen wurde das Produkt aus dem Überstand gewonnen und mittels SDS-PAGE und ELISA analysiert.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Polypeptid, isoliert aus H. medicinalis mit einem Molekulargewicht von etwa 12000 ± 1 kD und mit der biologischen Aktivität eines Inhibitors der kollagenabhängigen Plättchenadhäsion, das über seine gesamte Länge zu mindestens 80% identisch zu der Aminosäuresequenz der SEQ. ID. NR. 2 ist.
Polypeptid nach Anspruch 1, das einen isoelektrischen Punkt von pH 3,7 ± 0,5 besitzt.
Polypeptid nach Anspruch 1 oder 2, das sechs Cystein-Moleküle besitzt, die -S-S-Brücken bilden können.
Polypeptid nach einem der Ansprüche 1–3, das aus der Aminosäuresequenz der SEQ. ID. NR. 2 besteht.
Isoliertes Polynucleotid, das ein Polypeptid der Ansprüche 1–4 kodiert.
Isoliertes Polynucleotid enthaltend eine DNA-Sequenz der SEQ. ID. NR. 2 oder eine DNA-Sequenz, die zu dieser DNA-Sequenz komplementär ist, wobei das Polynucleotid ein Polynucleotid nach Ansprüche 1–4 kodiert.
Polynucleotid nach Anspruch 6, wobei das Polynucleotid eine DNA-Sequenz enthält, die über ihre gesamte Länge zu mindestens 80% identisch zu derjenigen der SEQ. ID. NR. 1 ist.
Expressionsvektor enthaltend eine DNA-Sequenz nach den Ansprüchen 6–7.
Wirtszelle enthaltend den Expressionsvektor nach Anspruch 8.
Expressionssystem, das eine Wirtszelle nach Anspruch 9 enthält.
Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids nach Ansprüche 1–4 enthaltend einen Wirt nach Anspruch 10, Kultivieren des Wirts unter Bedingungen, die zur Herstellung des Polypeptids ausreichend sind, und Gewinnen des Polypeptids aus dem Kulturüberstand oder dem Zellrückstand.
Antikörper, der für ein Polypeptid, das aus SEQ. ID. NR. 2 ausgewählt ist, immunspezifisch ist.
Pharmazeutische Formulierung, die ein Polypeptid nach Ansprüchen 1–4 und ein pharmazeutisch unbedenklichen Träger- oder Hilfsstoff dafür enthält.
Pharmazeutischer Wirkstoff nach Anspruch 13 zur Behandlung thromboembolischer Vorgänge.
Pharmazeutische Formulierung nach Ansprüchen 13 oder 14 enthaltend zusätzliche Arzneistoffe, wobei der zusätzliche Arzneistoff aus Aspirin, Heparin oder Streptokinase oder einer Kombination davon ausgewählt ist.
Verwendung eines Polypeptids nach Ansprüchen 1–4 zur Herstellung eines Arzneimittels für die Behandlung thromboembolischer Krankheiten.
Verwendung eines Polypeptids nach Ansprüchen 1–4 zur ex vivo Beschichtung künstlicher Oberflächen.
Verwendung eines Polypeptids nach Ansprüchen 1–4 zur ex vivo Modifikation von Intraokularlinsen, um die Thrombogenität des Linsenmaterials zu verringern.
Verwendung eines Polypeptids nach Ansprüchen 1–4 zur ex vivo Kontaktierung mit der Linsenoberfläche.
Verwendung eines Polypeptids nach Ansprüchen 1–4 zur ex vivo kovalenten Vernetzung, um das Linsenmaterial zu modifizieren.
Verwendung von Antikörpern nach Anspruch 12 und Polypeptid nach Anspruch 1–4, zur ex vivo Messung von Polypeptid, das von Anspruch 11 oder einen behandelten Patienten stammt.