SK12902001A3

SK12902001A3 - Proteín na blokovanie adhézie doštičiek

Info

Publication number: SK12902001A3
Application number: SK1290-2001A
Authority: SK
Inventors: Wolfgang Strittmatter; Detlef G�Ssow; Uwe Hofmann; J�Rgen Hemberger; Zisi Fotev; Bernhard Scheuble
Original assignee: Merck Patent Gmbh
Priority date: 1999-03-18
Filing date: 2000-03-10
Publication date: 2002-03-05
Also published as: CN1185344C; ATE295883T1; NO20014506L; DE60020220D1; US7090986B2; NO330769B1; JP2002539788A; CA2367457C; CZ20013341A3; KR20020008131A; KR100788219B1; HUP0200353A3; CO5241328A1; AR023099A1; PL200384B1; CZ301524B6; ES2240067T3; EP1161530A1; HK1045330A1; HU228068B1

Description

Oblasť techniky

Vynález sa týka proteínu na blokovanie adhézie krvných doštičiek.

Doterajší stav techniky

Pri hemostáze alebo trombóze sa doštičky prilipujú na vonkajšiu bunkovú matricu poškodenej cievy alebo pokrývajú povrch poškodenej oblasti. Preventívne zabrániť tomuto významnému počiatočnému stupni patogenézy trombózy a uzatvorenia tepien by malo mať terapeutickú výhodu pri úsilí o prevenciu trombotických ochorení. Kolagén sa považuje za najviac trombogénnu povrchovú zložku a ukázalo sa, že je silný podporovateľ adhézie doštičiek, zrážania a uvoľňovania ich granúl vedúci k navodeniu (Ruggeri, Z.M. a kol.: Seminars in Hematology, 31, str. 229 až 239, 1994) prídavných doštičiek do takej oblasti na vytváranie zrazenín a trombu. Počiatočný kontakt doštičiek s povrchom cievy je sprostredkovávaný kolagénom viazaným von Willebrandovým faktorom (vWF) a špecifickým receptorom vWF na doštičky, glykoproteínovým komplexom Ib-V-IX. Okrem toho ADP, epinefrin a cirkulujúce zrážacie faktory podporujú dalšiu aktiváciu doštičiek, pričom súčasné narastanie trombínovej aktivity prispieva k vytváraniu zositenej fibrínovej zrazeniny. Agregácia doštičiek k doštičkám podporuje tento proces a je hlavne podporovaná fibrinogénom ako sprostredkovatelom, ktorý premosťuje bunky prostredníctvom receptoru glykoproteínu Ilb/IIIa.

Táto normálna fyziologická odozva je dosť kritická v priebehu patologického procesu, ked sa doštičky prilipujú na kolagénoch obnažených v sklerotických poraneniach (Van der Rest M. a kol, FASEB Journal 5, str. 2814 až 2823, 1991) a začínajú vytvárať oklúzie. V závislosti od umiestnenia a od rozsahu môžu mat oklúzie vážne dôsledky, ako je infarkt myokardu, mŕtvica, zápal alebo embólia plúc.

Ako priamo pôsobiace protitrombické činidlo blokuje heparín aktivitu trombínu a tak zabraňuje tvoreniu trombov bohatých na fibrín a je v súčasnosti bežne najznámejšou drogou používanou v protitrombických zákrokoch. Heparín sa používa v širokej miere všade tam, kde ide o nestabilnú angínu a akútny infarkt myokardu. Avšak cez široké použitie, zostávajú dosial nevyriešené niektoré závažné problémy, ako je intravenózna aplikácia, potreba anti-trombínu-III ako kofaktoru, znížená afinita pre trombín viazaný na zhluky, jeho inaktivácia niektorými plazmovými proteínmi, prípadné vyvolanie trombocytopénie a biologická rôznorodosť. V dôsledku toho neboli dosial prekonané dôsledky používania heparínu v klinickej praxe.

Posledný vývoj heparínu s nízkou molekulovou hmotnosťou prispel k možnosti subkutánnej aplikácie, avšak terapeutická výhodnosť oproti štandardnému heparínu je mierna. To rovnaké platí i o iných priamo pôsobiacich antitrombínoch ako je Hirudin, Hirulog a Warfarin. Ako jeden z hlavných problémov sa zdá zvýšená produkcia trombínu pri antitrombotickom liečení (Rao, A.K. a kol., Circulation 94, str. 389 až 2395, 1996).

Iné nové prístupy sa preto zameriavali na proces protrombínovej aktivácie, ktorá je podporovaná faktorom Xa. Výskum sa zameral na konštrukciu vhodných inhibítorov zamerených na tento faktor. Celkovo je nutné konštatovať, že plný terapeutický potenciál intervencie tohto typu nebol dosial realizovaný.

Iná skupina terapeutik je reprezentovaná trombolytickými režimami a vývoj sa zameriava na stafylokinázy, streptokinázy, urokinázy typu plazminogénového aktivátoru, tkanivá typu plazminogénového aktivátoru a na anizoylovaný plazminogénstreptokinázový aktivátorový komplex. Rozdiely v čase, potrebnom na vyvolanie reperfúzie, sa významne líši pri každom z týchto trombolytických činidiel, avšak pokrok vyjadrený znížením celkovej úmrtnosti je rovnaký pri všetkých týchto produktoch. Okrem toho sú častými komplikáciami reoklúzia alebo predĺžené krvácanie. To môže byt spôsobené pomerne nízkou špecifickosťou pre fibrín a krátkym polčasom týchto zlúčenín v plazme. Bežne sa testujú rôzne aplikačné režimy a kombinácie rôznych fibrinolytických princípov na prekonanie niektorých bežných nedostatkov v trombolytickej terapii. Očakávané zlepšenia sú však skôr malé.

V poslednom čase sa objavila nová skupina pacientov s problémami, ako je akútna trombotická oklúzia a neskorá restenóza, spôsobenými zákrokmi ako je angioplastia, aterotómia, arteriálne štepovanie alebo stentovanie cievnej steny. Možné terapeutické zákroky zahŕňajú protidoštičkové, antitrombotické a trombolytické stratégie. Rôzne iné činidlá, ako je ticlopdin, pôsobiace ako ADP antagonista alebo ionofor vápnika A-23187, a predovšetkým aspirín majú priamy vplyv na funkciu doštičiek a boli navrhované alebo používané na prevenciu alebo na minimalizáciu zhlukovania doštičiek. Nová látka proti adhézii doštičiek podía vynálezu by mohla takisto pomôct prekonávať tieto klinické komplikácie, ked je aplikovaná počas chirurgického zákroku.

Iná komplikácia týkajúca sa tohto problému nastáva, keď sa dostanú umelé povrchy do styku s krvou. Majú potom vzrastajúcu tendenciu vyvolávať trombotické príhody aktiváciou doštičiek a/alebo vyvolávaním zrážania. Tieto javy môžu spôsobovať poruchu cievnych štepov, srdcových chlopní, stentov, katétrov alebo akéhokoívek iného zariadenia alebo materiálu prichádzajúceho do styku s krvou. Schopnosť proteínu podía vynálezu vytvárať netrombogenické povrchy môže byť preto využitá imobilizáciou tohto proteínu na materiáloch a hore uvedených zariadeniach. Také spracovanie by malo takým materiálom a zariadeniam dodať biokompatibilitu a urobiť ich tromborezistentné.

Vzhľadom na obmedzenia súvisiace s dostupnými antitrombotickými činidlami existuje aktuálna potreba nových alternatívnych stratégií a liečebných postupov.

K ďalšiemu zlepšovaniu liečby kardiovaskulárnych porúch môžu prispie-é prístupy podľa vynálezu, ktoré priamo narušujú adhéziu doštičiek vyvolanú kolagénom a alebo vWF faktorom. Niektorými novými inhibítormi, ktoré bránia adhézii doštičiek sú monoklonálne protilátky zamerané na vWF. Už je známe, že glykoproteínové inhibítory Ilb/IIIa môžu byt vhodné na inhibíciu adhézie doštičiek. Niektoré z týchto inhibítorov, ako monoklonálne Ab c7E3 boli už klinicky testované, zatial čo ostatné, ako inhibítory KGD a RGDF sa stále študujú. Avšak špecifickost väčšiny týchto nových inhibítorov nie je príliš dobre preštudovaná, takže spektrum vedľajších účinkov, ktoré budú vyvolané použitím týchto inhibítorov je stále otvorené a vyžaduje starostlivé preskúmanie.

Bohatým zdrojom na testovanie nových zlúčenín, ktoré interferujú s kolagénom vyvolanou adhéziou doštičiek, je príroda prostredníctvom živočíchov sajúcich krv. Z literatúry je známe, že bolo izolovaných niekoľko prírodných inhibítorov: proteín A 65 kD nazývaný calin, izolovaný z Hirudo medicinalis (americký patentový spis číslo 5 587360, svetový patentový spis číslo WO 92/07005) (Munro R. a kol., Blood Coagulation and Fibrinolysis 2, str. 179 až 184, 1991) a proteín 16kD (LAPP) izolovaný zo slinných žliaz pijavice Haementeria officinalis (americký patentový spis číslo 5 324715). Obidva proteíny boli opísané ako inhibítory agregácie podľa testov statickým skúmaním adhézie doštičiek spôsobovanej kolagénom.

Napriek úspešným dôkazom in vitro, zlyhalo pôsobenie LAPP v niekoľkých dobre zavedených modeloch in vivo (Schaffer L.W. a kol., Arterioscler. Thromb. 13, str. 1593 až 1601, 1993; a Connolly T.M. a kol., Thromb. Haemostas. 69, str. 589, 1993). Mäkký kliešé Ornithodoros moubata takisto obsahuje protidoš5 tičkový proteín (moubatin), ktorý pôsobí v prevencii kolagénom spôsobovanej agregácie doštičiek (Waxman L. a kol., J. Biol. Chem. 268, str. 5445 až 5449, 1993). Iný inhibítor agregácie doštičiek pri krv sajúcej ploštici objavili Noeske-Jungblut C. a kol. (svetový patentový spis číslo WO 9309137). Smith a kol. izolovali proteín 50 kDA z hadieho jedu a proteín 19 kDa bol izolovaný zo slín krv sajúcej ploštice Triatoma pallidipennis. Zistilo sa, že proteín obsahuje faktor, ktorý špecificky inhibuje kolagénom spôsobovanú agregáciu doštičiek. Proteín 19 kDa, nazývaný pallidipin, inhibuje kolagénom spôsobovanú agregáciu doštičiek v plazme. Nezistila sa žiadna inhibícia agregácie stimulovaná inými činidlami (ADP, trombín, tromboxán A2 mimetický U46619, forbolester). Pallidipin nemal žiadny účinok na adhézii doštičiek kolagénom, inhiboval však uvoľňovanie ATP z doštičiek. Bol v opačnej interakcii s doštičkami a mohol sa spojiť s kolagénom v ich spoločnom cieli. Presný mechanizmus pôsobenia a terapeutický zisk z tohto proteínu sa práve skúma. Gan a kol. opisujú eschistatin ako inhibítor viažuci receptor fibrinogénu GPIIa/IIIb (J. Biol.

Chem. 283, str. 19827 až 32, 1988).

Napriek tomuto intenzívnemu vývoju, pokračuje snaha vyvinúť ďalšie protizrážavé a protitrombínové prostriedky, ktoré majú väčšiu účinnosť pri inhibícii tvorenia zhlukov, aktivácii doštičiek vyvolanej vWF alebo aktivácii endotelových buniek a ktoré by boli použiteľné farmaceutický a ktoré by sa mohli vyrábať v priemyselne uskutočniteľných množstvách. Pretože žiadny zo známych dosiaľ opísaných proteínov nebol dosiaľ vyvinutý do podoby zlúčeniny s ideálnym terapeutickým profilom, zámeri1 sa vynález na tento problém.

Podstata vynálezu

Podstatou vynálezu je polypeptid izolovaný z H. medicinalis majúci molekulovú hmotnosť približne 12 000 ± 1 kD a bio- 6 logickú aktivitu inhibítoru adhézie doštičiek závislej od kolagénu.

Vynález sa teda týka inhibítoru izolovaného z H. medicína lis, ktorý pôsobí priamo na interakciu kolagén-doštičky, takže inhibuje aktiváciu doštičiek a časnú interakciu doštičky-doštičky.

Dosial sa v literatúre nevyskytol pozitívny príklad, ktorý by naznačil, že použitím screeningu by sa vylúčili inhibítory agregácie rovnako ako lytické proteíny zo zdrojov prírodné sa vyskytujúcich zlúčenín, ktoré by identifikovali nové antiadhezívne mechanizmy alebo zlúčeniny. Tento prístup sa však využil v tomto vynáleze. Pretože je známych najmenej šesť rôznych doštičkových povrchových glykoproteínov, ktoré sa podielajú na kolagénovej adhézii a pridávanie niekolkých zlúčenín odvodených z doštičiek, ako je Willebrandov faktor, fibronektin a trombospondin, sa ukázalo ako nepriame sprostredkovanie adhézie kolagén-doštičky, bolo len málo optimizmu v úsilí začať identifikovať nové inhibítory adhézie.

Napriek tomu, bol tento prístup použitý na screening slín Hirudo medicinalis, pričom sa vedelo, že nie všetky dokumentované alebo neznáme inhibítory odvodené z vWF rovnako ako zlúčeniny pôsobiace priamo na receptory doštičiek by mohli byť vylúčené. Preto bol výsledok screeningu prekvapením: nový proteín nazvaný Saratin s protiadheživnou aktivitou pre doštičky, ktorý je možné izolovať z tkanív a sekrétov dobre preskúmanej pijavice druhu Hirudo medicinalis.

Vynález sa týka aktívneho polypeptidu Saratinu izolovaného z pijaviek Hirudo medicinalis. Proteín bol izolovaný zo slín kombináciou tlakovanej dialýzy a aspoň jedného chromatograf ického kroku podobného anexovej chromatografii a aspoň jedného kroku vysoko výkonnej reverznej fázovej chromatografie (RP-HPLC). Ukázalo sa, že tlaková dialýza je absolútne rozhor- f*

- 7 r * dujúca počas získavania Saratinu zo slín, pretože silná koncentrácia slín napomohla k prekonaniu inak výraznej straty bioaktívneho Saratinu. Izolovaný Saratin sa viaže silne na niekolko kolagénov a blokuje adhézii doštičiek ku kolagénu potiahnutému takými povrchmi spôsobom závislým od dávky.

Na optimalizáciu bola vyvinutá testovacia kaskáda súčasne dostupných techník na rozlíšenie adhézie doštičiek a agregácie doštičiek: zisťuje sa schopnosť doštičiek spomaíovat alebo zastaviť prietok vláknami, príspevok doštičiek k vytváraniu zhlukov in vitro, adhézie na sklenených guíôčkach, alebo prietoky plné krvi cez filter a adhézia doštičiek antikoagulovanej plazmy bohatej na doštičky na filtroch skladajúcich sa zo sklenených vláken alebo z kolagénu pod regulovaným tlakovým gradientom.

Proteín (pomenovaný Saratin) je charakterizovaný sekvenciami aminokyselín vyznačenými v sekvencií (SEQ.ID.NO.2) a skladá sa zo 103 aminokyselín, ktoré zaujímajú teoretickú relatívnu molekulovú hmotnosť približne 12068 daltonov ± 1 kDa. Proteín vykazuje jedinečnú primárnu štruktúru bez významnej podobnosti s inými skôr objavenými sekvenciami. Proteín je bohatý na asparágovú a glutámovú kyselinu, ktoré prispievajú k nízkej izoelektrickej hodnote pH 3,7 ± 0,5 molekuly, merané IEF-PAGE.

Analýza SDS-PAGE preukázala silný posun mobility po redukcii proteínu elektroforézou, naznačujúci posttranslačné modifikácie. Sekvenovanie polypeptidu ukázalo šesť cysteínových molekúl, ktoré by mohli tvoriť posttranslačné modifikácie proteínu. Hmotová spektrometria Saratinu elektrónovým lúčom ukázala aktuálnu molekulovú hmotnosť 12061, čo naznačuje, že vo formovaní sekundárnej štruktúry natívnej formy proteínu sa zúčastňujú až tri disulfidické väzby. Inhibítor adhézie podía vynálezu je nový, pretože sa líši od známych inhibítorov agregácie izolovaných z pijavíc, najmä z Calin alebo LAPP moleku- <

r r r

- 8 lovou hmotnosťou, izoelektrickým bodom, sekvenciou aminokyselín a biologickými aktivitami.

Vynález sa týka rovnako izolovanej DNA zaujímajúcej polynukleotid kódujúci inhibítor adhézie doštičiek odvodený z pijavíc, majúcej sekvencie aminokyselín, ako je ukázané pre proteín. Sekvencie nukleotidov predstavujúce kloň cDNA je v SEQ.ID.NO.l. Poloha 1 až 63 sekvencie nukleotidov reprezentuje domnelú vodcovskú sekvenciu 21 aminokyselín a poloha 64 až 372 obsahuje otvorený čítací rámec kódujúci polypeptid zvyškov 103 aminokyselín a sekvenciu aminokyselín uvedenú pre prírodný proteín v SEQ.ID.NO.2.

Vynález sa týka tiež rekombinantných vektorov, ktoré obsahujú syntetický gén kódujúci inhibítor adhézie doštičiek odvodený z pijavíc podía vynálezu a hostiteíských buniek, obsahujúcich rekombinantné vektory. Spôsoby získavania a izolovania expresovaných proteínov boli založené na technológiách značenia alebo boli prevzaté z čistiacej schéma vyvinutej pre prírodné sa vyskytujúci Saratin. V závislosti od individuálnych protokolov používaných na extracelulárnu a intracelulárnu expresiu v bunkách kvasinkových, hmyzích, obličkových, v bunkách mláďat chrčkov a v bunkách E. coli transformovaných vhodnými vektormi, je potrebné upraviť kroky získavania rekombinantného proteínu zo supernatantu alebo zo sedimentov spôsobmi známymi pracovníkom v odbore. Výtečná expresia bola nájdená v E.coli ako hostiteíovi, kde periplazmatická expresia prispela začlenením vodcovskej sekvencie pelB. Bolo dosiahnuté získavanie produktov z Escherichia coli (E. coli) (približne 5 mg/1) po osmolýze a odstredení. V súbežnom experimente bolo použité Saccharomyces cerevisiae (S.cerevisiae) (kultivačný kúpeí >10 mg/1) s alternatívnym, z kvasiniek prevzatým vektorom v paralelnom pokuse. Sekretovaný materiál bol izolovaný odstredením. Čistenie bolo dosiahnuté priečnou filtráciou a ionexovou chromatografiou. Pri ostatných expresiách používajúcich buniek buď COS alebo CHO bola expresia približne 750

- 9 ng/ml. Elektroforetickou a chromatografickou analýzou bolo preukázané, že vyčistený rekombinantný materiál je čistý a homogénny a identický so Saratinom odvodenými zo slín, ak dokladá sekvenovanie aminokyselín a stanovenie molekulovej hmotnosti.

Vynález sa týka tiež spôsobu izolácie aktívneho proteínu zo surových slín pijavíc a merania jeho aktivity voči doštičkám statickými a dynamickými skúšobnými spôsobmi rovnako ako použitie týchto spôsobov na izolovanie rekombinantného proteínu.

Spôsoby výroby Saratinu objasňujú príklady 6, 7, 8 a 13, avšak použité spôsoby expresie nie sú obmedzené na tieto príklady. Na expresovanie Saratinu môžu byt rovnako použité napríklad transgénne myši alebo iné organizmy vrátane iných cicavcov.

Proteíny podlá vynálezu zahŕňajú varianty, ktoré konzervujú aktivity objavených sekvencií, vrátane fragmentov alebo subjednotiek, prírodné sa vyskytujúcich variantov, alelových variantov, náhodilo generovaných umelých mutantov a zámerných variantov sekvencií ako je adícia, ktoré konzervuje aktivitu. Fragmenty alebo subjednotky sa týkajú ktorejkolvek časti sekvencie, ktorá obsahuje menej aminokyselín ako úplný proteín, napríklad sekvencie vyraďujúcej časti N- alebo C-zakončenia úplného proteínu.

Ďalej sa vynález týka tiež hybridných proteínov, ako sú fúzne proteíny alebo proteíny pochádzajúce z expresie množstva génov v expresnom vektore a môžu zahŕňat polypeptid majúci špecifickú aktivitu objaveného proteínu riadenú peptidovými väzbami na druhý polypeptid. Menovíto vynález zahŕňa varianty proteínov, predovšetkým všetky varianty, ktoré sa líšia od izolovaného proteínu iba konzervatívnou substitúciou aminokyseliny. Také konzervatívne substitúcie aminokyselín definoval Taylor a kol. (J. Mol. Biol. str. 188 až 233, 1986).

Zahrnuté sú takisto spôsoby používania proteínov na prevenciu alebo oneskorenie aktivácie doštičiek inhibíciou interakcií kolagén/doštičky. Proteín sa hodí na prevenciu, na profylaxiu, na terapiu a na liečenie trombotických chorôb. Na rozdiel od týchto skôr opísaných proteínov, ktoré pôsobia na rôzne povrchové proteíny na doštičke, má proteín podlá vynálezu jedinečný mechanizmus pôsobenia. Viaže sa pevne na povrch kolagénu a jeden z jeho mechanizmov pôsobenia je daný pokrytím špecifických strán kolagénu, ktoré už nie sú k dispozícii pre interakcie a viazanie doštičiek. Typ nového mechanizmu má velkú prednost v tom, že počas aplikácie proteínu zostanú doštičky funkčne nedotknuté, takže z tohto ošetrovania je možné očakával velmi malé alebo dokonca žiadne krvácanie.

Inou velkou oblasťou použitia je ošetrovanie rôznych povrchov proteínom, aby sa stali neadhezívne pre doštičky a tým vytvárajú zariadenia kompatibilné s krvou.

Ako bolo hore uvedené, hodia sa polypeptidy podlá vynálezu ako farmaceutický účinné zlúčeniny pre farmaceutické prostriedky a kombinácie.

Farmaceutické prostriedky podlá vynálezu môžu prípadne obsahovať prídavné aktívne prísady ako je aspirín, protizrážavé prostriedky ako je hirudín alebo heparín alebo trombolytické činidlá ako je plazminogénový aktivátor alebo streptokináza.

Nové polypeptidy podlá vynálezu môžu vytvárať farmaceutický prijatelné soli s všetkými netoxickými, organickými alebo anorganickými kyselinami. Ako príklady anorganických kyselín sa uvádzajú kyselina chlorovodíková, bromovodíková, sírová, alebo fosforečná a kovové soli ako nátriummonohydrogenortofosfát a káliumhydrogensulfát. Ako organické kyseliny sa príkladne uvádzajú kyseliny mohokarboxylové, dikarboxylové a tri11 karboxylové, ako je kyselina octová, glykolová, mliečna, pyrohroznová, malónová, jantárová, glutárová, fumarová, jablčná, vínna, citrónová, askorbová, maleínová, hyroxymaleínová, benzoová, hydroxybenzoová, fenyloctová, škoricová, salicylová a sulfónové kyseliny, ako kyselina metánsulfónová. Soli aminokyseliny s karboxylovým zakončením zahŕňajú netoxické karboxylové kyseliny vytvorené s akoukoľvek anorganickou alebo organickou zásadou. Tieto soli zahŕňajú napríklad soli alkalických kovov, ako je sodík a draslík, kovov alkalických zemín, ako je vápnik a horčík, lahkých kovov skupiny IIIA vrátane hliníka a organických primárnych, sekundárnych a terciárnych amínov ako sú trialkylamíny vrátane trietylamínu, prokaínu, dibenzylamínu, 1-etenamínu, N,N'-dibenzyletyléndiamínu, dihydroabietylamínu a N-alkylpiperidínu.

Pojmom farmaceutický prijatelný nosič sa tu rozumie inertné netoxické alebo tekuté plnidlo, riedidlo alebo zapuzdrovací materiál, neragujúci nepriaznivo s účinnou zlúčeninou alebo s pacientom. Vhodné, s výhodou kvapalné nosiče sú v odbore dobre známe, ako sterilná voda, solanka, vodná dextróza, cukrové roztoky, etanol, glykol a oleje, vrátane minerálneho, živočíšneho, rastlinného alebo syntetického pôvodu, napríklad podzemnicového, sójového a minerálneho oleja.

Prostriedky podlá vynálezu sa môžu podávať v jednotkových dávkach obsahujúcich bežné netoxické farmaceutický prijatelné nosiče, riedidlá, pomocné činidlá a spojivá, ktoré sú typické na parenterálne podávanie.

Pojem parenterálny zahŕňa subkutánne, intravenózne, intraartikulárne a intratracheálne injekčné a infúzne techniku. Vhodné sú tiež iné spôsoby podávania, ako orálne a topické. Parenterálne prostriedky a kombinácie sú najvýhodnejšie podávané intravenózne, bud v bolusovej forme alebo ako konštantné fúzie podlá známych spôsobov.

Tablety a kapsuly na orálne podávanie obsahujú konvenčné excipienty, ako sú spojivá, plnivá, riedidlá, tabletovacie činidlá, mazadlá, dezintegračné činidlá a namáčadlá. Tablety môžu byt potiahnuté v odbore známym spôsobom. Orálne kvapalné prostriedky môžu byt vo forme vodných alebo olejových suspenzií, roztokov, emulzií, sirupov a vodičiek, alebo môžu byt podávané ako suchý produkt na zmiešanie s vodou alebo s iným vhodným nosičom pred použitím. Také tekuté prostriedky môžu obsahovat obvyklé prísady, ako suspenzačné činidlá, emulgátory, nevodné nosiče a konzervačné činidlá. Topické prostriedky môžu byt vo forme vodných alebo olejových suspenzií, roztokov, emulzií, želé a s výhodou emulzných mastí.

Jednotkové dávky podlá vynálezu môžu obsahovat denné potrebné množstvá proteínu podlá vynálezu, alebo jeho podiely na vytvorenie požadovanej dávky. Optimálna terapeuticky prijatelná dávka a rýchlost pre daného pacienta (cicavca vrátane ludí) závisí od mnohých činitelov, ako sú účinnost špecifickej použitej účinnej látky, materiál, vek, telesná hmotnost, celkový zdravotný stav, pohlavie, diéta, čas a cesta podávania, rýchlost vylučovania, aktivita enzýmu (jednotiek/mg proteínu), účel ošetrovania, to znamená terapia alebo profylaxia a povaha trombotickej ošetrovanej choroby, požadovaná protidoštičková alebo antikoagulačná aktivita.

Preto v prostriedkoch a kombináciách pre liečeného pacienta (in vivo) je farmaceutický účinná denná dávka proteínu podlá vynálezu približne 0,01 až 100 mg/kg telesnej hmotnosti s výhodou 0,1 až 10 mg/kg telesnej hmotnosti. Podlá formy podania môže jedna samotná dávka obsahovat 0,5 až 10 mg trombínového inhibítoru. Na dosiahnutie antikoagulačného účinku v mimotelovej krvi je farmaceutický účinné množstvo peptidu podlá vynálezu 0,2 až 150 mg/1, s výhodou 1 až 20 mg/1 mimotovej krve.

r r

- 13 Vynález sa tiež týka implantovatelných alebo mimotelových medicinálnych zariadení na použitie v styku s telesnými kvapalinami, pričom povrchom týchto zariadení je dodaná tromborezistencia potiahnutím imobilizovaným polypeptidom podlá vynálezu. Polypeptid podlá vynálezu sa imobilizuje na medicinálnom zariadení tak, aby bol povrch biokompatibilný a tromborezistentný. Také zariadenie má niekdy povrchové vlastnosti, ktoré navodzujú agregáciu doštičiek, čo je nevýhodné pri zámere ich použitia pre implantovatelné alebo mimotelové medicinálne zariadenia, ktoré majú prichádzať do styku s krvou alebo s inou ludskou kvapalinou. Ako príklady takých zariadení, ktoré sa spravidla vyrábajú z plastov, sa uvádzajú protézy, umelé orgány, očné šošovky, sutúry, umelé cievne segmenty, katétre, dialyzátory, rúrky a cievy na vedenie krvi.

Posteriórne zakalenie púzdra (posterior capsule opacification =PCO) je bežnou komplikáciou po extrakcii kataraktu cez moderné chirurgické spôsoby a šošovky, ktoré sa na tieto účely používajú. PCO je spôsobené proliferáciou a migráciou šošovkových epitelových buniek posteriórnym púzdrom, čím sa znižuje zraková ostrosť. Fyzikálne ošetrenia, ako tiež chemicky modifikované šošovky boli navrhnuté na zníženie PCO. Na zníženie PCO boli navrhnuté heparínové povlaky šošoviek alebo topické heparínové očné kvapky, čo naznačuje, že trombogénne mechanizmy sa podielajú na vytváraniu PCO.

Ukázalo sa, že Saratin má významné prednosti oproti heparínu v prevencii a blokovaní trombogenickosti. Vynález sa preto dalej týka povlaku obsahujúceho Saratin, ktorý zníži trombogeneckosť materiálu šošoviek, používaného na refrakčné anteriórne alebo posteriórne púzdro očných implantátov, ktoré sa môžu chirurgicky implantovať do oka. Tento nový typ povlaku čelí problémom so stimulovaným rastom buniek. V kombinácii s ostatnými liečivami, ktoré napríklad spôsobujú smrť buniek, pomáha Saratinový povlak k úplnému predchádzaniu PCO.

r - 14 Prehľad obrázkov na výkresoch

Obr.l Separácia zložiek slín. Elúcia Saratinu je vyznačená *.

a) Separačný profil slín po DEAE anexovej výmene. Frakcie Saratinu sa zberajú z piku 3. (príklad 2)

Na ose x je množstvo v ml, na ose y sú jednotky AU.

Tlmivé roztoky: A) 20 mM Tris, B) tlmivý roztok A, IM NaCl. Prietočná rýchlosť 10 ml/min

b) Rechromatografia zhromaždených frakcií na Mono Q HR5/5. Vzorky sa zhromažďujú z poslednej časti hlavného piku, ako je naznačené čarou (príklad 2)

Na ose x je množstvo v ml, na ose y je absorbancia 280 nm. Tlmivé roztoky: A) 20 mM Tris, B) tlmivý roztok A, IM NaCl. Prietočná rýchlosť 1 ml/min.

c) Posledný chromatografický krok semi-preparatívna analytická RP-HPCL pozitívnych frakcií Saratinu zhromaždených z Mono Q HR5/5 (príklad 2). Aktívny Saratin je získaný z hlavného piku (pik 3).

Na ose x je čas v min, na ose y sú jednotky AU.

Tlmivé roztoky: A: H₂0.0,1% TFA B: CH₃CN.O,1TFA

Obr.2 SDS-PAGE zhromaždených frakcií z RP-HPLC.

Pozitívne frakcie Saratinu sú označené * (príklady 2 a 3)

Obr.3 Expresný vektor E. coli pre Saratin (príklad 7)

Obr.4 Baculo donorový plazmid pre Saratin (príklad 8)

Obr.5 Plná krv bola vystavená umelému kolagénovému povrchu a adhézia doštičiek sa zviditeľnila vyfarbením. Saratin sa použil ako inhibítor (proteín #607) príklad 9 Rýchlosť šmyku: 1300 s^-1, Ľudská krv. Kolagén typu III z ľudskej placenty. 30 μΙ/sklíčko na prekrytie mikroskopickej vzorky (i na obr. 6 a 7 so sklíčkom rozumie ŕ e r * rf f sklíčko na prekrytie mikroskopickej vzorky). Prvý obrazec sa týka kontroly, druhý proteínu # 607.

Obr.6 Inhibícia adhézie doštičiek na sklíčko potiahnuté kolagénom typu III za šmykových podmienok. Porovnanie slín a Saratinu. Príklad 9.

Kolagén typu III z íudskej placenty.

Sliny # 616 0,11 mg/ml: 30 μΐ na sklíčko n=4

Proteín # 607 0,11 mg/ml: 30 μΐ na sklíčko n=2

Na ose x sú: v prvom stĺpci kontroly, v druhom stĺpci roztok, v tretom stĺpci sliny # 616, v štvrtom stĺpci proteín # 607. Percentuálny údaj v tretom a štvrtom stĺpci udáva percento inhibicie.

Na ose y je pokrytá plocha (%).

Obr.7 Saratin objasňuje na dávke závislú inhibíciu väzbovej adhézie doštičiek na sklíčkach potiahnutých kolagénom typu III za šmykových podmienok. (Príklad 9).

Proteín # 607. Kolagén typ III z íudskej placenty Prvý stĺpec sa týka roztoku

Na ose x je koncentrácia [ug/ml], na ose y je % inhibícia.

Obr.8 Kvasinkový expresný vektor pre Saratin (príklad 13). Vodcovský α-faktor Saratinu.

Vynález bližšie objasňujú, nijak však neobmedzujú nasledujúce príklady praktického uskutočnenia.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Príklad 1

Screening inhibítorov adhézie

Funkčným základom na screening štyroch zložiek slín je adhézia doštičiek na kolagéne. Štyri prídavné testy sú vhodné na posúdenie rôzneho pôsobenia antitrombotických drôg, ako je skúška AZOCOLL, skúška aktivity amidázy, von Willebrandov test viazania a skúška agregácie doštičiek, na vylúčenie funkčných vlastností, ktoré by ideálne neboli viazané na inhibítor adhézie. Pretože väčšina tu použitých testov sú štandardné skúšky, je potrebné skúšku adhézie doštičiek modifikoval:, aby vyhovovala špecifickým potrebám štúdie. Podstata testu: Horm kolagénom (Nycomed) sa potiahnu 96-jamkové doštičky (Nunc) pri použití okysleného kolagénu v koncentrácii 20 gg/ml a doštičky sa inkubujú cez noc. Po premytí doštičiek trikrát PBS sa blokuje zostávajúci povrch jamiek 1% BSA. Doštičky izolované čerstvo z íudskej citrónylovanej krvi sa pridajú súčasne s frakciami odvodenými z jednotlivých stĺpcových stupňov. Prípadne sa vykoná predbežná aktivácia doštičiek ich inkubáciou pred použitím TBS v prítomnosti horečnatých iónov. Na porovnanie inhibičnéj aktivity sa použije ako štandard surové sliny, štandardizované na celkovú koncentráciu proteínu 200 μg/ml. Ukázalo sa, že test inhibície doštičiek je veími chúlostivý na zmeny tlmivého roztoku a zvýšené koncentrácie soli. Hoci boli všetky vzorky spracované ionexovou chromatografiou, ukázalo sa, že priame testovanie frakcií v skúške inhibície je komplikované a nespoíahlivé. Preto boli všetky testované vzorky aplikované na koncentračný stupeň na Centrikonovej báze, ktorý súčasne znižuje iónovou silu a podporuje koncentráciu pred meraním.

ŕ ·

- 17 Príklad 2

Čistenie prírodného inhibítoru

Vynález používa sliny zhromaždené od H. medicinalis, o ktorých je známe, že obsahujú rad bioaktívnych proteínov ako je hirudín, elastázové inhibítory, kolagenázy a inhibítory agregácie doštičiek, ako je calin (Munro, R. a kol., Blood Coagulation and Fibrinolysis 2, str. 179 až 184, 1991) a LAPP (Schaffer L.W. a kol., Arterioskler. Thromb. 13, str. 1593 až 1601, 1993). Popri týchto charakterizovaných proteínoch zostáva stále neznáma väčšina približne 80 proteínov zistiteľných SDS-PAGE. Podľa vynálezu sú použité v príklade 1 opísané frakcionované sliny a screeningové stratégie pre nové proteíny, ktoré priamo interferujú s interakciou doštičiek a kolagénu.

Ukázalo sa, že kritickou úlohou je oddelenie aktivity inhibítoru adhézie od surových slín, hlavne pre nenávratnú stratu väčšiny inhibičnej aktivity v prvom chromatografickom stupni. Munro R.a kol. odporúča aditívum ako 12% etanol a dvojmocné katióny, čo situáciu nezlepšuje. Avšak vysoká koncentrácia soli slín v kombinácii s celkovo nízkou koncentráciou proteínu (190 až 250 μg/ml) si vyžaduje počiatočnú koncentráciu a stupeň výmeny tlmivého roztoku. Preto sa skúmali rôzne stratégie na obohatenie, koncentrácie alebo výmeny tlmivého roztoku. Tradičná dialýza viedla k úplnej strate aktivity. Väčšina ostatných štandardných techník, ako sú iónomeniče, afinitné stĺpce vylučujúce veľkosti (strata bola nezodpovedajúca živici stĺpca) zlyhali nezávisle od povahy separačnej technológie alebo tlmivého roztoku a použitých aditív. S prekvapením sa ukázalo, že tlaková dialýza 500 ml slín bola úspešnou metódou na skoncentrovanie proteínov slín (približne (30 až 40 krát), ktoré sa súčasne zbavili nežiadúcich zložiek tlmivého roztoku. Neočakávane sa stal surový materiál slín, spracovaný týmto spôsobom, ideálnym východiskovým materiálom na ďalšie čistenie a vyťaženie bioaktivity antiadhéznych zlo18 žiek zo slín už nebolo naďalej reálnym problémom. Pretože sa ukázalo, že katexy a afinitné stĺpce sú nedostatočným stupňom čistenia, použili sa slabé anexy ako DEAE-Fastflow alebo EMD-DEAE-Fraktogel. Vyskúšal sa 12% etanol a dvojmocné katióny, avšak výsledky boli podobné s týmito aditívami i bez nich. Ďalšia optimalizácia chromatografických operácií viedla k sekvencii stĺpca DEAE, Mono Q-stĺpca a ako konečný krok k stĺpci reverznej fázy RP18. Optimalizácia chromatografických podmienok sa vykonávala chromatografickým systémom BiaCore používajúcim analytické stĺpce (obchodný produkt spoločnosti Pharmacia). Gradienty na ovládanie stĺpca DEAE, Mono-Q-stĺpce a stĺpcov RP18, sú uvedené na obr. la, b, c. Separácia založená na BiaCore bola vyvážená použitím techniky FPLC. Optimalizované bežné podmienky boli priamo prevedené na poloprevádzkové meradlo separácie podľa inštrukcií výrobcu s výnimkou stupňa so stĺpcom RP18, ktorý bol zachovaný technikou Biacore na minimalizáciu strát vyčisteného materiálu. Výtažok vyčisteného proteínu z posledného chromatografického stupňa RP sa vykonal rýchlym vákuovým odstredením. Vzorky, spojené z posledného stupňa RP, sa zhromaždili a analyzovali pomocou SDS-PAGE (obr. 2). Potom sa vzorky resuspendovali v PBS a použili na vykonanie analytických i funkčných testov. Spravidla sa získalo približne 750 μg/l Saratinu z nespracovaných slín.

Príklad 3

Biochemická charakteristika

Čistenie Saratinu podía príkladu 1, viedlo v podstate k čistému proteínu so zdanlivou molekulovou hmotnosťou približne 21 kDa, ak je uskutočnené za redukčných podmienok v SDS-PAGE (obr. 2). Kompletná aminokyselinová sekvencia sa získala priamym sekvenovaním prvých 48 aminokyselín vyčisteného proteínu a bola doplnená sekvenovaním niekoľkých vnútorných peptidov r r

pochádzajúcich z enzymatickej degradácie. Úplná sekvencia proteínov je uvedená v SEQ.ID.NO.2.

Proteín sa skladá zo 103 aminokyselín s vyrátanou molekulovou hmotnosťou 12067,9 a s aktuálnou molekulovou hmotnosťou

12061,9 ako bolo doložené hmotovou spektrometriou ESl-Mass spectrometry. Tieto rozdiely teoretickej a nameranej molekulovej hmotnosti naznačujú, že všetkých šesť cysteínov, identifikovaných v Saratine, sa podielajú na tvorbe mostíkov S-S. Tento poznatok je podporovaný pozorovanou silnou zmenou mobility proteínu, keď je podrobený chromatografii v SDS-PAGE za redukčných alebo neredukčných podmienok. Proteín je okrem toho obohatený kyslými kyselinami, ako je Glu a Asp. Izoelektrické zaostrenie technikou IEF-PAGE (Immobilin) ukázalo izoelektrický bod pH 3,7 ± 0,5. V porovnávacej štúdii sa ako referenčný použil vyčistený pijavicový proteín a porovnával sa s fyzikálne-chemickými vlastnosťami rekombinovaného Saratinu, odvodeného z expresie baculo, kvasiniek a E. coli. Ukázalo sa, že všetky tri proteíny sú v svojich vlastnostiach identické. Charakterizácia proteínu pomocou SDS-PAGE, zviditelnené Coomassi (obr. 2), alebo strieborným zafarbením a/alebo analýzou Western blot ukázala, že proteín je homogénny a v neglykolyzovanej forme.

Príklad 4

Príprava mRNA a syntéza cDNA

Pripraví sa RNA z lekárskych pijavíc Hirudo medicinalis pri použití guanidíntiokyanátového spôsobu. mRNA sa čistí od RNA ako celku pri použití súpravy Oligotex mRNA kit (QIAGEN). Syntetizuje sa cDNA pri použití súpravy Marathon cDNA Amplification kit (CLONTECH). Sekvencia DNA kódujúca Saratin sa napred zosilní použitím oligonukletidových prajmerov PCR podlá odporúčania výrobcu. Po syntéze cDNA sa k obidvom koncom cDNA pripojí univerzálny adaptor. Sekvencie univerzálneho adaptoru a univerzálnych prajmerov AP1 alebo AP2 sa volia podlá inštrukcií dodávatela súpravy.

Príklad 5

Zosilnenie a izolovanie Saratinového génu pomocou PCR

Na bezprostrednom konci N-zakončenia reverznej translatovanej aminokyselinovej sekvencie Saratinu sa syntetizujú degenerované prajmery. Tieto prajmery 01 a 02 boli skonštruované na hybridizáciu špecificky na 5'-zakončení cDNA Saratinu. Konštrukcia prajmeru je založená na reverzne translatovanej sekvencii aminokyselín experimentálne určených ôsmimi aminokyselinami N-zakončenia vyčisteného proteínu Saratinu. Obidva praj mery, 01 a 02, sa syntetizujú pri pokial možné nízkej degenerácii a na dodanie prajmerom na kritickom 3'-zakončení roztiahnutia 8 párov báz perfektne súhlasiacich so sekvenciou cDNA Saratinu na zaistenie účinného a špecifického zosilnenia matrice cDNA. Podlá DNA degenerovaná abeceda (IUPAC code) R=A alebo G; M=A alebo C, Y=C alebo T a N=A alebo G alebo C alebo T. Reakcia 3'-RAČE PCR sa vykoná pri použití zmesi prajmeru 01 a prajmeru 02 a univerzálneho prajmeru AP1 alebo AP2. Produkty PCR sa klonujú do TA klonovacieho vektoru pCR2.1 alebo pCR Skript SK(+) vektor a sekvenujú sa. Ked sa po sekvenovaní získa niekolko fragmentov 3'-RAČE PCR, získa sa sekvencia génu Saratinu, s výnimkou 5' netranslatovanej oblasti, signálnej peptidovej sekvencie a sekvencie kódujúcej prvých osem aminokyselín z N-zakončenia zrelého proteínu. Na získanie tejto chýbajúcej Saratinovej cDNA sekvencovej informácie sa uskutoční experiment 5'-RAČE použitím gén špecifického prajmeru zo stredu Saratinovej cDNA a jedného z univerzálnych prajmerov AP1 alebo AP2. Po sekvenovaní niekolkých z výsledných fragmentov 5'-RAČE PCR sa získa úplná sekvencia génov Saratinu. Zosilnením génov Saratinu PCR pomocou gén-špecifických nedegenerovaných prajmerov z obidvoch 3'-zakončení a 5'-zakončení génov Saratinu sa získa plná dĺžka génu Saratinu.

r

- 21 Sekvenovanie DNA sa vykoná s viac ako 15 rôznymi klonmi PCR. Zistila sa však iba jedna významná zmena, ktorá spôsobila zmenu aminokyselinovéj sekvencie len v jednom klone. Je velmi pravdepodobné, že túto zmenu spôsobila PCR. Zistilo sa iných päť tichých zmien, ktoré nespôsobujú zmenu aminokyselinovej sekvencie. Nie je teda pravdepodobné, že boli tieto zmeny spôsobené PCR, pretože rovnaké zmeny boli nájdené v odlišných klonoch.

Gén Saratinu ORF je 372bp a obsahuje 21 aminokyselinovú signálnu sekvenciu a 103 aminokyselinovú sekvenciu kódujúcu zrelý proteín. Zistilo sa, že aminokyselinová sekvencia, odvodená z klonu PCR, je totožná so sekvenciou získanou sekvenovaním proteínu, odvodeného z prírodných slín.

Príklad 6

Expresia v bunkách COS a detekcia expresovaného proteínu

Na expresovanie génu Saratinu do cicavčích buniek ako COS alebo CHO, sa gén Saratinu odstrihne z vektoru pCR Skript SK(+) pomocou Xhol+Xbal a klonuje sa do expresného vektoru cicavčej bunky pCl neo (Promega). Zvolená bola pCl-neo, pretože obsahuje promotor T7 a T3 na expresiu in vivo a neomycínu odolávajúci gén na selekciu G418 a môže byt použitá ako v bunkách COS tak CHO. Prídavné k signálnej sekvencií a k sekvencií zrelého proteínu obsahuje inzert sekvenciu Koz na 5'-zakončení na účinnú transláciu a his-koniec (his-tag) MRGS(H)₆ na 3'-zákon čení (C-terminál) na detekciu expresie proteínu, vyčistenie a koncentráciu. Plazmidový konštrukt má názov pNC-31. Použije sa pNC-31 plazmidu DNA na transfekciu buniek COS. Bunky COS, rastúce na dlhej fáze, sa premyjú dvakrát PBS a rozpustia sa v PBS v koncentrácii lxl0⁷/ml. Pridá sa 12 μg plazmidu DNA (menej ako 50 μΐ vo vode alebo TE-tlmivý roztoku) do 0,7 až 0,8 ml suspenzie buniek COS a mieša sa v elektroporačnej kyvete.

Elektroporácia sa vykonáva 10 minút pri 1,9 kV a zmes sa prenesie na 90 mm-doštičku. Po pridaní 8 ml média DMEM obsahujúceho 10 % FCS a antibiotika sa bunky nechajú rásť 3 dni. Supernatanty a bunky sa použijú na ďalšiu izoláciu proteínu a na detekciu. Expresovaný proteín sa detekuje metódou Western blottingu pomocou protilátky anti-MRGS(H)6. Čistenie sa vykoná chelátmi ako je NTA alebo imidooctová kyselina imobilizovaná na matrici stĺpca a modifikuje sa kovovými iónmi, napríklad kobaltu, niklu alebo medi.

Príklad 7

Konštrukcia expresného vektoru E.coli a expresia

I keď je použitie variabilného kodónu v rôznych biologických systémoch, niektoré kodóny sa používajú veími zriedkakedy v E.coli. Na umožnenie expresie optimalizovanej verzie v E.coli sa gén previedol na E.coli kodón známymi spôsobmi.

Expresia E.coli sa uskutočňuje pomocou modifikovanej verzie plazmidu pASK75, ktorý nesie tet promotorovú oblasť. (Skerra A. a kol., Gene 151, str. 131 až 135, 1994). v podstate sa modifikácia vykoná klonovaním nového spojovníka medzi miestami Xbal a Hind III (obr. 3). Nový spojovník obsahuje vedúcu sekvenciu ompA, iné násobné klonovacie miesto a 6xHiskoniec miesto strep-konca.

Na konštrukciu expresného vektoru pre Saratin bolo nutné zaviesť reštrikčné miesta 5'Cla I a 3'Eco47III spôsobom PCR. Preto sa použil 5'-prajmer03 a 3'-prajmer04. Produkt PCR sa napred klonuje do vektorového systému PCR II (Invitrogen) a sekvenuje sa. V druhom kroku sa gén Saratinu klonuje do modifikovaného vektoru pASK75 pomocou reštrikčných miest 5’Clal a 3'Hind III.

r r

- 23 Po expresovaní a preukázaní aktivity tohto rekombinantného Saratinu v druhej reakcii PCR sa His-koniec vyberie a štartovací kodón Saratinového génu sa priamo fúzuje do vodcovskej sekvencie omp A. Prajmery 5'-prajmer05 a 3'-prajmer06 na túto reakciu PCR sú v zozname sekvencii.

Ako príklad na expresiu v E. coli sa expresný vektor pRG72 (obr.3), ktorý obsahuje štruktúrny gén Saratinu fúzovaný do vodcovskej sekvencie ompA transformuje do kompetentných buniek W3110. Bunky sa indukujú po raste do fázy midlog. Po jednej hodine je možné zretelne zistovat rekombinantný Saratin.

Príklad 8

Konštrukcia Baculo donorového plazmidu a expresia

Na expresiu Saratinu v expresnom systéme Baculo vírusu sa použije expresný systém Bac-To-Bac™ Baculo Expression System (spoločnosť Gibco Life Technologies). Na získanie selekčného systému bola fúzovaná vodcovská sekvencia včelieho melitinu do génu Saratinu a na zavedenie reštrikčných miest 5'BamHI a 3'Kpnl sa vykoná jediná reakcia PCR pomocou prajmerov 5'prajmer07 a 3'prajmer08. Zodpovedajúci produkt PCR sa klonuje do vektoru PCRII (Invitrogen) a sekvenuje sa. Potom sa klonuje fúzia Melitin-Saratin do vektoru pFastBac pomocou reštrikčných miest 5'BamHI a 3'Kpnl a výsledkom je pTD13 (obr.4). Generácia rekombinantných baculovírusov a expresia Saratinu sa vykoná systémom Bac-To-Bac Expression System. Donorový plazmid pTD13 sa transformuje do kompetentných buniek DHlOBac, ktoré obsahujú bacmid s cielovým miestom mini-attTn7 a pomocný plazmid. Element mini-Tn7 na donorovom plazmlde ca sa premiestni do cielového miesta mini-attTn7 na bacmide v prítomnosti transpozičných proteínov poskytnutých pomocným plazmidom. Kolónie, obsahujúce rekombinantný bacmid, sa identifikujú dizrupciou lacZ génu. Vysokomolekulárna mini-prep DNA sa pripraví zo selektovaných E. coli klonov obsahujúcich bacmid a táto DNA sa potom použije na transfektovanie hmyzích buniek. Podrobné návody sú v inštrukčnej príručke expresnej súpravy.

Príklad 9

Adhézia doštičiek ku kolagénu za prietočných podmienok (dynamická skúška)

Pri skúške adhézie doštičiek sa nechá prechádzať úplná ľudská krv komôrkou s paralélnym prietokom na skúmanie adhéznej aktivity doštičiek na kolagénom potiahnuté sklíčka na prekrytie mikroskopickej vzorky (dalej sa výrazom sklíčka rozumejú sklíčka na prekrytie mikroskopickej vzorky) pri prietoku s veľkým šmykom, (simulácia tepnových podmienok in vivo), ktorú opísali Sakariassen a kol. (Meth. Enz. 169, str. 37 až 70, 1988). Na vyčistené sklíčka (18x18 mm) sa retušovacou vzduchovou kefkou nanesie ľudský placentový kolagén typu III (Sigma) rozpustený v 50 mmol/1 octovej kyseliny. Sklíčka sa uložia v PBS pri teplote 4°C cez noc.

Čerstvá predhriata ľudská krv (opatrená antikolagénnym heparínom s nízkou molekulovou hmotnosťou, 20 U/ml) sa predhreje počas 10 minút na teplotu 37’C pred použitím. Pipetou sa na sklíčka nanesú proteínové prostriedky podľa vynálezu (30 μΐ na sklíčko) a inkubujú sa 10 minút vo vlhkej komôrke pri teplote miestnosti než sa vložia do perfúznej komôrky.

Krv sa nechá prechádzať komôrkou (pri teplote 37’C 5 minút šmykovou rýchlosťou 1300/s).

Potom sa sklíčka zložia, opláchnu sa PBS a fixujú sa 30 minút v 0,25% gluteraldehydu, potom sa vyfarbia farbivom May-Grunwald Giemse. Obr. 9 je typickým príkladom. Extenzívne potiahnutie vyfarbenými doštičkami je patrné na neošetrenom kontrolnom povrchu. Porovnávací povrch predbežne spracovaný Saratinom ukazuje dramaticky zníženú (o 80%) väzbu na doštičky.

Adhézia doštičiek sa kvantifikuje svetelným mikroskopom, ako je patrné na obr. 5 (pri 1000-násobnom zväčšení), pripojeným na počítačový analyzátor obrazu (Leica). Výsledky sú vyjadrené percentom povrchu pokrytého doštičkami a doštičkovými agregátmi.

Inhibičné pôsobenie slín je porovnané s vyčisteným proteínom (obr. 6). Adhézia doštičiek na doštičkách potiahnutých kolagénom typu III pri rýchlosti šmyku 1300/s so surovými slinami (#616) vytvára inhibíciu približne 48% v porovnaní s kontrolou. Vyčistený proteín (#607); Saratin) dokladá zníženie úsady doštičiek približne o 81 % pri štandardizovaných koncentráciách proteínu. Inhibícia vyvolaná Saratinom sa zvyšuje v závislosti od dávky s vyššími koncentráciami čisteného proteínu (obr. 7).

Príklad 10

Imunizácia a protilátky

S prvou partiou vysoko vyčisteného prírodného proteínu, ktorá bola k dispozícii, sa hneď započalo s imunizáciou zvierat Imunizačné séra sa zvýšili pri králikoch a pre ďalší screening bola k dispozícii vysoko titrované reakčné činidlá. Dostupné sa stali ďalšie antiséra, keď boli k dispozícii peptidové sekvencie úplného proteínu a syntetizovali sa tri syntetické peptidy (sekvencie aminokyselín 83-103, 13-30, 58-69) pripojené ku KLH štandardným väzbovým postupom a použili sa na imunizáciu. Ustavili sa tri séra zamerané na segment N-zakončenia peptidu a dve séra špecifické pre C-koncové peptidy. S vysoko titrovanými imunitnými sérami, ktoré boli k dispozícii, bolo možné zaviesť a použiť technológie Elisa na sledovanie a kvantifikovanie vyčistenia prírodné čisteného, rovnako ako rekombinantného proteínu. Tak mohla byť časovo náročná a dosť namáhavá skúška intenzívnej inhibície doštičiek nahradená len potvrdením inhibičného potenciálu konečne vyčisteného proteínu.

Príklad 11

Imunitné skúšky na stanovenie väzby Saratinu

Na potiahnutie 96-jamkových mikrotitračných doštičiek (Nunc) sa použije 50 μΐ okysleného Horm-kolagénu (Nycomed) a cez noc sa potiahnu roztokom kolagénu (20 μg/ml). Pred skúškou sa doštičky premyjú trikrát PBS a inkubujú sa s roztokom BSA (1%), aby sa zabránilo nešpecifickej adhézii. V sérii zriedení sa pridá 50 μΐ Saratinu a inkubuje sa 1 hodinu. Pred použitím sa doštičky omyjú trikrát protilátkou anti-Saratinu na detekciu. Po ďalšej jednohodinovej inkubácii sa prebytočná protilátka odstráni a sekundárnym biotínom značená protilátka sa použije na detekciu. Konečný záver sa vykoná cestou farebnej reakcie streptavidínom katalyzovaným POD so substrátmi ako sú tablety ODB (Dáko) meranými pri 490 nm.

Príklad 12

Konkurenčná skúška na screening inhibítorov

Rekombinantný taggovaný Saratin (His-tag) pripravený podľa príkladu 7 sa porovnáva s natívnym netaggovaným Saratinom z hľadiska väzby ku kolagénu. Spôsobom opísaným v príklade 11 sa pripravia doštičky potiahnuté okysleným Horm-kolagénom (Nycomed). Detekcia sa vykoná protilátkami králičieho anti-Sarati nu. Taggovaný a netaggovaný Saratin vykazuje totožné väzbové vlastnosti. Alternatívne sa netaggovaná verzia Saratinu modifikuje biotinyláciou (Pierce, biotinylačný kit) a porovná s nemodifikovaným Saratinom. Väzbové vlastnosti na kolagén sú totožné. Ďalej boli uskutočnené pokusy pri použití biotinylovaného Saratinu s konkurenčným nemodifikovaným Saratinom, peptidov, Saratinu odvodeného zo slín, úplných slín alebo protilátok zameraných na Saratin. Väzba rôznych konkurentov ku kolagénu bola testovaná stanovením väzby biotinylovaného Saratinu s pomocou konjugátu streptavidín-POD a ODB-substrátu

Γ r ^Γ Γ r f ‘ / ι ' “r

- 27 reakciou k detekcii. Táto skúška s biotinylovaným Saratinom sa používa spravidla na stanovenie koncentrácie Saratinu v slinách (750 μg/l), epitopového mapovania na Saratin zamerených protilátok, vyhodnocovanie bioaktívneho Saratinu, mutovaného Saratinu. Na preskúmanie potenciálu testu blokovania a neblokovania sa používajú anti-Saratinové protilátky obohatené špecifickými peptidmi Saratinu.

Príklad 13

Kvasinkový expresný vektor a expresia

Ako typický príklad expresie kvasiniek sa používa pichia multi copy expresný systém (Invitrogenu). Konštrukcia kvasinkového expresného vektoru je znázornená na obr. 8. Na vytvorenie expresného vektoru pre Saratin sa použije zosilňovacia metóda na generovanie reštrikčných zakončení (5'EcoR I, 3'Not I) kompatibilných s väzbou do príslušného vektoru PePIC9K). Nasleduje 5'prajmer09 a 3’-prajmerlO.

Pred transformovaním sféroplastov Pichia sa expresný vektor linearizuje so Sal I. Testuje sa kolónia pre His* Mut*-pozitívne mutanty na zaručenie integrácie Saratinového génu. Typickými podmienkami rastu sú: teplota 28 až 30’C až do optickej hustoty OD 2-6. Zavedenie expresie sa uskutočňuje po resuspendovaní odstredených buniek v médie a pridaní metanolu až do konečnej koncentrácie 0,5% a uchovanie týchto podmienok dlhší čas, ktorým je spravidla 24 hodín. Po typickej šestdennej fermentácii sa produkt získa zo supernatantu a analyzuje sa spôsobmi SDS-PAGE a ELISA.

Priemyselná využiteľnosť

Peptid pôsobiaci proti zrážaniu krvi vhodný na výrobu farmaceutických prostriedkov na ošetrovanie tromboembolických ochorení.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Polypeptid izolovaný z H. medicinalis majúci molekulovú hmotnosť, približne 12 000 ± 1 kD s biologickou aktivitou inhibítoru od kolagénu závislej adhézie doštičiek.
2. Polypeptid podlá nároku 1 s izoelektrickým bodom pH
3,7 ± 0,5.

3. Polypeptid podlá nároku 1 alebo 2 s šiestimi cysteínovými molekulami schopnými vytvárať S-S mostíky.
4. Polypeptid podlá nároku 1, s aminokyselinovou sekvenciou SEQ.ID.NO.l.
5. Polypeptid s aminokyslinovou sekvenciou podlá nároku 4 aspoň z 80 % totožnou s aminokyselinovou sekvenciou SEQ.ID. NO.l v celej dĺžke.
6. Izolovaný polynukleotid kódujúci polypeptid podlá nároku 1 až 5.
7. Izolovaný polynukleotid obsahujúci sekvenciu DNA SEQ. ID.N0.2 alebo sekvenciu DNA komplementárnu k sekvencii DNA kódujúcej polypeptid podlá nároku 1 až 5.
8. Polynukleotid podlá nároku 7, obsahujúci sekvenciu DNA, ktorá je aspoň z 80 % totožná so sekvenciou aminokyselín SEQ. ID.N0.1 v celej dĺžke.
9. Expresný vektor obsahujúci sekvenciu DNA podlá nárokov 6 až 8.
10. Hostiteľská bunka majúca expresný vektor podľa nároku

9.
11. Expresný systém obsahujúci hostiteľskú bunku podlá nároku 10.
12. Spôsob výroby polypeptidu podlá nároku 1 až 5, vyznačujúci sa tým, že sa hostiteľská bunka podlá nároku 10 kultivuje za podmienok postačujúcich na produkciu polypeptidu a na získanie polypeptidu zo supernatantu kultúry alebo z bunkového zvyšku.
13. Protilátka imunošpecifická pre polypeptid podlá nároku 1 až 5.
14. Farmaceutický prostriedok, vyznačujúci sa tým, že obsahuje polypeptid podlá nároku 1 až 5 a farmaceutický prijatelný nosič alebo jeho excipient.
15. Farmaceutický účinné činidlo podlá nároku 14 na liečenie tromboembolických procesov.
16. Farmaceutický prostriedok podlá nároku 14 alebo 15, vyznačujúci sa tým, že obsahuje prídavné drogy volené zo súboru zahŕňajúceho aspirín, heparín alebo streptokinázu alebo ich kombinácie.
17. Použitie polypeptidu podlá nároku 1 až 5 na výrobe liečiva na ošetrovanie tromboembolických ochorení.
18. Použitie polypeptidu podlá nároku 1 až 5 na potahovanie umelých povrchov.
19. Použitie polypeptidu podlá nároku 1 až 5 na modifikáciu vnútroočných šošoviek na zmiernenie trombogenickosti materiálu šošovky.
20. Použitie polypeptidu podlá nároku 1 až 5 na kontaktovanie povrchu šošovky.
21. Použitie polypeptidu podlá nároku 1 až 5 na kovalentné zositenie na modifikáciu materiálu šošovky.
22. Použitie protilátok podlá nároku 13 a polypeptidu podlá nároku 1 až 5 na meranie vzoriek podlá nároku 12 alebo ošetrovaného subjektu.
23. Spôsob identifikácie zlúčenín, vyznačuj úci sa t ý m, že sa inhibuje (antagonizuje) alebo agonizuje polypeptid podlá nároku 1 až 5, pozorovaním väzby alebo stimulácie alebo inhibície funkčnej odozvy.
24. Agonista identifikovaný spôsobom podlá nároku 23.
25. Antagonista identifikovaný spôsobom podlá nároku 23.